CN102085363B - 一种霍乱弧菌o139荚膜多糖结合疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗，其包含霍乱弧菌O139荚膜多糖与蛋白载体的偶联物，其中所述蛋白载体优选为霍乱毒素B亚单位。本发明还提供所述结合疫苗的制备方法，包括将质量比0.2～3∶1的霍乱弧菌O139荚膜多糖和载体蛋白进行偶联。本发明提供的霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗经皮下注射免疫小鼠，可激发小鼠机体产生抗霍乱弧菌O139抗体和抗霍乱毒素抗体，能使杀弧菌抗体滴度升高2倍以上，抗霍乱毒素抗体(IgG和IgA)滴度升高4倍以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗及其制备方法。具体而言，本发明涉及一种霍乱弧菌O139荚膜多糖的纯化以及后续的结合疫苗的制备方法
背景技术
霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，疾病通过被粪便污染的水和食物传播。人是霍乱弧菌的天然宿主，感染后会出现水样腹泻，严重者可造成血容量减少性休克、肾衰竭、低血钾、酸中毒，最终导致死亡。目前，霍乱依然是严重的公共卫生事件，要彻底的消除霍乱对人类社会的威胁，改进个人卫生、食品安全和卫生设施是长效的控制机制；然而，霍乱流行地区在短期内很难在这些方面取得显著进展，所以同时还急需有效的霍乱疫苗作为预防霍乱的一项公共卫生措施。
目前，国际上已经有两种口服疫苗上市，一种由灭活的霍乱弧菌O1型细菌菌体和霍乱毒素B亚单位联合组成(WC/BS)。该灭活疫苗耐受性好，2岁以上的志愿者免疫两次后，可产生高水平的保护力(85-90％)，5岁以上的受试者在免疫3年后保护水平仍为约50％，不过还未在2岁以下的婴幼儿进行相关的临床试验；另一种疫苗是基于DNA重组的方法构建的霍乱弧菌减毒活疫苗V.cholerae O1 CVD 103-HgR.。在美国的成人志愿者中接种该疫苗，免疫3个月后保护力达60-100％，3个月的幼儿也有很好的免疫原性和免疫耐受性，然而，此减毒活疫苗可能与野生株进行基因重组获得失去的毒力基因，从而恢复强感染性。
用化学方法提取细菌多糖，制备多糖疫苗是20世纪疫苗发展的重要成就之一，伤寒Vi多糖疫苗则开创了多糖疫苗的历史。临床试 验结果表明，多糖疫苗可激发高滴度的抗菌抗体，副反应罕见，然而多糖分子质量小，以霍乱弧菌为例其O-SP仅4～5kDa，空间结构也简单，表现为12～15个重复单位的线性多聚体，因此在免疫学上属Th细胞不依赖性抗原(Ti-Ag)，刺激机体产生的免疫应答弱且抗体仅为IgM，就霍乱弧菌来说，单一的多糖组分不能被研制发展为疫苗。但考虑到免疫学上蛋白质具有“载体效应”这一特性，加之，受B型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗的成功研制的启发，将O-SP和一种载体蛋白用化学的方法共价结合后制备成一种多糖-蛋白质结合疫苗。结合上蛋白质后的多糖其抗原属性被改变，成为一种Th细胞依赖性抗原(Td-Ag)，免疫原性也因此被大大增强，能刺激机体产生保护性水平的免疫应答。目前细菌性多糖-蛋白质结合疫苗(polysaccharide-protein conjugate vaccine)已成为疫苗研制领域中的一个新方向。由美国国立卫生研究院(NIH)陈孝生等人研制的霍乱弧菌O1型多糖结合疫苗经过I、II期临床观察证实是安全有效的，正进行III期的扩大人体试验。
尽管在霍乱流行区，卫生当局在个人卫生、食品安全和卫生设施等方面有了长足的改进，但饮水与卫生条件在一时或长期都不可能根本改善。抗生素和补水疗法虽可挽救很多病人，却无力控制疾病的发生和传播，且治疗费用非常昂贵，因此廉价、副作用小、给药简单霍乱疫苗的研制势在必行。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗及其制备方法。
本发明提供的霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗，包含霍乱弧菌O139荚膜多糖与蛋白载体的偶联物，所述的疫苗可为喷雾剂型、液体剂型、胶囊剂型、片剂和丸剂中的任何一种。
其中，所述蛋白载体为霍乱毒素B亚单位(CTB)、白喉类毒素 (DT)，优选的蛋白载体为霍乱毒素B亚单位。
本发明提供的霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗，还包括乳糖，优选的乳糖含量为10-16mg/ml疫苗。
本发明还提供霍乱弧菌O139的荚膜多糖的制备方法，包括如下步骤：
1)向霍乱弧菌O139培养物中加入甲醛，进行杀菌；
2)离心去菌体，收集上清；
3)加入乙醇至体积终浓度为30-50％离心，去除色素、核酸；
4)加入乙醇至体积终浓度为60-80％离心，收集沉淀；
5)重新溶解沉淀，加入苯酚至体积终浓度50％-75％，以去除蛋白；
6)加入乙醇至体积终浓度为60％-80％；
7)离心，收集沉淀物，获得纯化的霍乱弧菌荚膜多糖。
本发明的另一个目的在于提供所述结合疫苗的制备方法，包括用溴化氰活化纯化后的荚膜多糖，以乙二酰肼为间隔剂，碳二亚胺为连接剂，将霍乱弧菌O139荚膜多糖和载体蛋白按质量比0.2～3∶1的比例，优选质量比为0.2-1∶1，最优选为0.75∶1的比例进行偶联，偶联后去除偶联物的内毒素。
本发明提供的所述结合疫苗的制备方法，还包括加入10-16mg/ml疫苗的乳糖，混合均匀，进行分装。
本发明的另一个目的在于提供所述的结合疫苗在预防或治疗霍乱弧菌O139诱发的疾病的药物中的应用。
本发明提供的霍乱弧菌O139多糖结合疫苗经皮下注射免疫后，可激发机体产生抗霍乱弧菌O139菌体抗体和抗霍乱毒素抗体，能使杀弧菌抗体滴度升高2倍以上，抗霍乱毒素抗体(IgG和IgA)滴度升高4倍以上。
附图说明
图1为CTB离子交换层析谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 霍乱弧菌O139荚膜多糖的制备
取霍乱弧菌O139(V.cholerae，CMCC 93-3)(购自中国医学细菌保藏管理中心)冻干工作种子批菌种，用普通肉水悬浮后，37℃震荡培养5h，用接种环取活化的液体菌种，划线接种到固体平皿上分离单个菌落，37℃培养16-18h后，随机挑取菌落作玻片凝集试验；挑取凝集良好的菌落，小量的液体培养，再转入小型发酵罐制备种子液，然后用无菌操作注入大培养罐内，其中，发酵培养基采用胰酶消化液-厚金格尔培养基，接种量为5％～10％，培养温度为30-35℃，通气搅拌，pH值维持在7.6-8.0左右。种子罐培养4～8h，大罐培养6～10h。培养至pH值不受补料限制，上升时停止培养，加入终浓度为1.2％-1.5％的甲醛溶液杀菌。培养物涂片做革兰氏染色镜检应为阴性短小弧形杆菌，若镜检发现有杂菌生长应废弃。
取上述含霍乱弧菌O139荚膜多糖的培养液4000g，4℃，离心15min，取上清。纯化和精制多糖加入乙醇至体积终浓度的30％，离心去除色素、核酸；加入加入乙醇至体积终浓度为60％，离心，收集沉淀。注射用水重新溶解沉淀，加入苯酚至体积终浓度50％％，以去除蛋白。加入乙醇至体积终浓度为60％，离心，收集沉淀物，获得纯化的霍乱弧菌O139荚膜多糖(Capsular polysaccharides，CPS)。
实施例2 霍乱弧菌B亚单位工程菌的构建
1、根据NCBI公布的霍乱弧菌B亚单位编码基因(GenBank登录号：EU854477.1)设计引物，上游引物CTB-F：GATAT 
ATGATTAAATTAAAATTTG(SEQ ID No.1)，下游引物CTB-R：CCG 
TTAATTTGCCATACTAATTGC(SEQ ID No.2)；
2、以霍乱弧菌O1菌株V.cholerae CMCC 569B(购自中国医学细菌保藏管理中心)基因组DNA为模板，经PCR扩增获得375bp的霍乱弧菌B亚单位的编码基因片段；
3、将该目的基因片段用Bgl II和Xho I进行双酶切，与用相同核酸内切酶酶切的表达载体pET-22b进行连接，导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，经筛选得到高效分泌表达霍乱毒素B亚单位的工程菌株，命名为：E.coli MHCTB03；
4、按照“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的要求，进行霍乱毒素B单位表达菌株三级菌种库的建立。
实施例3 霍乱弧菌B亚单位制备
霍乱B亚单位的制备分为几个阶段：种子液制备、大罐培养、离心、浓缩纯化、过滤除菌和低温保存。
先将实施例2制备的工作种子批菌种接种于含终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基，32℃培养过夜制备种子液，供发酵罐接种用，发酵培养可选择适宜大肠杆菌生长的培养基。在发酵罐中，当细菌生长到OD600＝20时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导，继续培养6～8h后，停止培养，调节发酵液pH至6.5，8000rpm，4℃连续离心，收集上清液，不大于10kD的超滤膜浓缩CTB溶液、离子交换层析纯化，用含2mol/L NaCl的Tris缓冲液洗脱目标蛋白，在280nm波长下检测层析峰，收集目标峰(图1)，得到CTB溶液。纯化后的CTB溶液进行除菌过滤，分装于大瓶中，于2～8℃保存。
实施例4 霍乱弧菌O139荚膜多糖与霍乱毒素B亚单位偶联物的制备
将霍乱弧菌O139荚膜多糖用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释，按多糖与溴化氰以质量比1∶1进行混合，用NaOH调节pH至 10.5，室温孵育1h；调节pH至8.5，加入终浓度为0.1mol/L己二酰肼反应10～20min，4℃静置过夜。次日，用含5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液(pH7.5)超滤换液，衍生后的多糖与载体蛋白CTB按质量比0.75∶1混合，调pH至5.5，加入碳二亚胺室温下孵育2～4h。用Sepharose 4FF凝胶层析，纯化荚膜多糖-CTB偶联物，收集VO峰，再经0.22μm滤膜除菌过滤，获得CPS-CTB偶联物。参照《中华人民共和国药典》(2010年版)规定的方法检定蛋白含量、磷或唾液酸含量、多糖含量、多糖/蛋白比值、游离多糖含量、游离蛋白含量、分子大小、多糖回收率、鉴别试验、内毒素含量及无菌试验等，项目合格后储存于2-8℃备用。
实施例5 霍乱弧菌O139荚膜多糖与白喉类毒素偶联物的制备
将霍乱弧菌O139荚膜多糖用注射用水稀释，按多糖与溴化氰以质量比1∶1进行混合，用NaOH调节pH至10.5，室温孵育45min；调节pH至8.5，加入终浓度为0.1mol/L己二酰肼反应25min，4℃静置过夜。次天，用含5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液(pH7.5)超滤换液，衍生后的多糖与载体蛋白白喉类毒素(DT)按质量比0.5∶1混合，调pH至5.5，加入碳亚二胺室温下孵育2～4h。用Sepharose 4FF凝胶层析，纯化荚膜多糖-DT偶联物，收集VO峰，再经0.22μm滤膜除菌过滤，获得CPS-DT偶联物。参照《中华人民共和国药典》(2010年版)规定的方法检定蛋白含量、磷或唾液酸含量、多糖含量、多糖/蛋白比值、游离多糖含量、游离蛋白含量、分子大小、多糖回收率、鉴别试验、内毒素含量及无菌试验等，项目合格后储存于2-8℃备用。
实施例6 霍乱弧菌O139多糖结合疫苗的制备
用0.005mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)稀释实施例4制备的CPS-CTB偶联物，加入氯化钠以及乳糖，使得成品组分及含量为：CPS-CTB偶联物按多糖含量计算均为2.5±2.5×30％μg/ml，氯化钠含量为 8mg/ml，乳糖含量为11.25mg/ml，调节pH至7.2。
实施例7 霍乱弧菌O139多糖结合疫苗的制备
用0.005mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)稀释实施例5制备的CPS-DT偶联物，加入氯化钠以及乳糖，使得成品组分及含量为：CPS-DT偶联物按多糖含量计算均为4.0±4.0×30％μg/ml，氯化钠含量为7.5mg/ml，乳糖含量为15.6mg/ml，调节pH至7.2。
实验例1
将体重为16-18g雌性BALB/c小鼠随机分组，每组10只，分别用上述实施例6制备的霍乱弧菌O139与霍乱毒素B亚单位的偶联物CPS-CTB、实施例1制备的未偶联的荚膜多糖与实施例3制备的CTB单一的或它们混合的抗原生理盐水进行免疫，同时设生理盐水对照组。按1mg/kg(CPS/体重)给药，皮下注射三次，每次注射间隔1周，间隔6周后眼眶放血制备血清。TTC法检测杀弧菌抗体，ELISA试验检测抗毒抗体。试验方法参照霍乱防治手册(第五版)。
杀弧菌抗体滴度提高4倍或更高具有临床意义；抗毒抗体结果判断：用生理盐水注为阴性对照，进行酶联免疫吸附试验，测得的OD值求平均。
结合疫苗的抗毒结果(表1)显示，所有组分都可以激发小鼠抗毒抗体的产生，其中多糖-蛋白质结合疫苗产生的抗体滴度升高尤其明显。以霍乱弧菌O139型菌株，V.cholerae CMCC 93-3为指示菌株，进行杀弧菌抗体试验，结果(表2)显示，结合疫苗仍然激发产生了显著的杀弧菌抗体滴度，多糖虽然也可产生部分抗菌抗体，但不足以保护细菌的侵袭。
表1 ELISA方法检测霍乱弧菌O139疫苗激发的抗毒抗体
表2 TTC法检测霍乱弧菌O139疫苗激发的抗菌抗体
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗，其特征在于，包含霍乱弧菌O139荚膜多糖与蛋白载体的偶联物，还包括含量为10-16mg/ml疫苗的乳糖，所述疫苗为喷雾剂型、液体剂型、胶囊剂型、片剂和丸剂中的任何一种，所述的蛋白载体为霍乱毒素B亚单位；
其中，所述霍乱弧菌O139荚膜多糖结合疫苗的制备方法包括分离纯化霍乱弧菌O139荚膜多糖，用溴化氰活化霍乱弧菌O139荚膜多糖，以乙二酰肼为间隔剂，碳二亚胺为连接剂，将霍乱弧菌O139荚膜多糖和载体蛋白按质量比0.2～3：1的比例进行偶联，偶联后去除偶联物的内毒素，加入10-16mg/ml疫苗的乳糖，混合均匀，进行分装。
2.制备权利要求1所述的结合疫苗的方法，其特征在于，包括分离纯化霍乱弧菌O139荚膜多糖，用溴化氰活化霍乱弧菌O139荚膜多糖，以乙二酰肼为间隔剂，碳二亚胺为连接剂，将霍乱弧菌O139荚膜多糖和载体蛋白按质量比0.2～3：1的比例进行偶联，偶联后去除偶联物的内毒素，加入10-16mg/ml疫苗的乳糖，混合均匀，进行分装。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的霍乱弧菌O139荚膜多糖和载体蛋白按质量比0.2-1:1进行偶联。
4.权利要求1所述的结合疫苗在制备预防或治疗霍乱弧菌O139诱发的疾病的药物中的应用。
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