CN110882384A

CN110882384A - 猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗及制备方法

Info

Publication number: CN110882384A
Application number: CN201911307713.1A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 杜久斌; 潘毅平; 唐慧芬; 范斌; 张慧敏
Original assignee: Tiankang Biology (shanghai) Co Ltd; Tiankang Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Tiankang Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN110882384B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种猪流行性腹泻‑猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗及制备方法。本发明提供的猪流行性腹泻‑猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗，该疫苗包括灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白两种抗原，以及疫苗佐剂和口服佐剂。该疫苗使得猪同时获得猪流行性腹泻病毒抗体和猪产气荚膜梭菌β毒素抗体，避免猪感染流行性腹泻和梭菌性肠炎。同时，该疫苗以口服的途径进行给药，改变了免疫途径，减少机体免疫应激，副作用小，有效提高了疫苗的免疫效果。本发明提供的上述口服疫苗的制备方法简单易操作，并不需要特殊的生产设备，该口服疫苗的生产成本较低。

Description

猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗及制备方法。

背景技术

猪流行腹泻病毒(PEDV)，属于冠状病毒科，冠状病毒属。猪流行性腹泻是由病毒引起的仔猪和育肥猪的一种急性肠道传染病。本病与传染性胃肠炎很相似，在我国多发生在每年12月份至翌年1-2月，夏季也有发病的报道。可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率高。各种年龄的猪都能感染发病。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15-90％。病猪是主要传染源。

梭菌性肠炎俗称仔猪红痢，是由C型和/或A型产气荚膜梭菌引起的1周龄内仔猪高度致死性的肠毒血症，以出血性腹泻、病程短、病死率高、小肠后端的弥漫性出血或坏死性变化为特征。C型产气荚膜梭菌产生的主要致死性毒素为α与β毒素。β毒素被认为是C型对人和动物起主要致病作用的毒素。目前预防本病最有效的办法是通过给妊娠母猪注射疫苗，仔猪出生后吸吮母猪初乳可获得被动免疫。梭菌毒素疫苗已在一些发展中国家试用成功，但目前无商品化制剂。

目前的猪流行性腹泻病毒与猪产气荚膜梭菌β毒素的感染防御都是通过分批次分别注射疫苗进行的，重复性操作过多，成本较大同时免疫效果也不是很理想。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗，以缓解现有技术中需要分别注射两种疫苗，免疫效果差并且免疫动物刺激应激大的技术问题。

本发明的第二目的在于提供上述猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗的制备方法，该制备方法简单易操作，没有要求特殊设备。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗，所述口服疫苗包括免疫抗原、疫苗佐剂和口服佐剂；

所述免疫抗原包括灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白。

在优选地实施方式中，所述灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在优选地实施方式中，所述灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

在优选地实施方式中，所述疫苗佐剂包括GEL佐剂、氢氧化铝胶佐剂、ISM佐剂、251C佐剂或VG佐剂，优选为GEL佐剂。

在优选地实施方式中，所述口服佐剂包括角鲨烯、黄原胶或葡聚糖中的至少一种；

优选地，所述口服佐剂还包括香味剂和/或免疫增强剂。

在优选地实施方式中，每ml单位的免疫抗原中含有20-80μg灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和20-80μg灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白，优选为30-60μg灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和30-60μg灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白，进一步优选为50μg灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和50μg灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白。

在优选地实施方式中，疫苗佐剂的用量为免疫抗原体积的10v/v％-80v/v％，优选为20v/v％-60v/v％，进一步优选为30v/v％。

在优选地实施方式中，口服佐剂的用量为疫苗佐剂和免疫抗原的体积总和的10v/v％-90v/v％，优选为20v/v％-70v/v％，进一步优选为50v/v％。

上述口服疫苗的制备方法，将免疫抗原依次与疫苗佐剂和口服佐剂乳化混合，得到猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗。

在优选地实施方式中，灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的灭活方法均独立地包括：利用灭活剂在2℃-8℃混合灭活22-26h，然后36-38℃混合水解1-3h，再经除菌得到灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白或灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗，该疫苗包括灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白两种抗原，将这两种抗原与疫苗佐剂制备成疫苗后，又与口服佐剂制备成了口服疫苗。该疫苗使得猪同时获得猪流行性腹泻病毒抗体和猪产气荚膜梭菌β毒素抗体，避免猪感染流行性腹泻和梭菌性肠炎，避免了二次免疫，利用上述二种蛋白制备得到的灭活疫苗杂蛋白少，每批疫苗批间差异小。同时，该疫苗与口服佐剂配伍，以口服的途径进行给药，改变了免疫途径，减少机体免疫应激，副作用小，肠道黏膜免疫应答，机体产生黏膜抗体高，有效提高了疫苗的免疫效果，利用灭活疫苗免疫动物，动物主要产生中和抗体(IgG)，发明人研究发现，血清IgG对PED的免疫保护效果不理想，肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体；虽然注射产气荚膜梭菌梭菌灭活疫苗可有效的保护猪只抵抗产气荚膜梭菌的感染，但注射免疫刺激性大，注射部位易出现脓包，影响猪肉品质，而口服免疫所产生的保护效果与注射免疫相当。目前针对流行性腹泻和梭菌性肠炎的防控都是注射疫苗，免疫效果较差、副反应大、免疫困难。因此，选择安全无毒、能够通过胃酸进入肠道传递抗原物质的疫苗，从而有效地刺激黏膜免疫系统产生黏膜免疫应答对流行性腹泻和梭菌性肠炎的防控和动物福利具有重要意义。

本发明提供的上述口服疫苗的制备方法简单易操作，并不需要特殊的生产设备，该口服疫苗的生产成本较低。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗，所述口服疫苗包括免疫抗原、疫苗佐剂和口服佐剂，其中，免疫抗原包括灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白。

该疫苗包括灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白两种抗原，将这两种抗原与疫苗佐剂制备成疫苗后，又与口服佐剂制备成了口服疫苗。该疫苗使得猪同时获得猪流行性腹泻病毒抗体和猪产气荚膜梭菌β毒素抗体，避免猪感染流行性腹泻和梭菌性肠炎，避免了二次免疫，利用上述二种蛋白制备得到的灭活疫苗杂蛋白少，每批疫苗批间差异小。同时，该疫苗与口服佐剂配伍，以口服的途径进行给药，改变了免疫途径，减少机体免疫应激，副作用小，肠道黏膜免疫应答，机体产生黏膜抗体高，有效提高了疫苗的免疫效果，灭活疫苗免疫动物，动物主要产生中和抗体(IgG)，发明人研究发现，血清IgG对PED的免疫保护效果不理想，肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体；虽然注射产气荚膜梭菌梭菌灭活疫苗可有效的保护猪只抵抗产气荚膜梭菌的感染，但注射免疫刺激性大，注射部位易出现脓包，影响猪肉品质，而口服免疫所产生的保护效果与注射免疫相当。目前针对流行性腹泻和梭菌性肠炎的防控都是注射疫苗，免疫效果较差、副反应大、免疫困难。因此，选择安全无毒、能够通过胃酸进入肠道传递抗原物质的疫苗，从而有效地刺激黏膜免疫系统产生黏膜免疫应答对流行性腹泻和梭菌性肠炎的防控和动物福利具有重要意义。

在优选地实施方式中，灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MKSLTYFWLFLPVLSTLSLPQDVTRCSANTNFRRFFSKFNVQAPAVVVLGGYLPIGENQGVNSTWYCAGQHPTASGVHGIFVSHIRGGHGFEIGISQEPFDPSGYQLYLHKATNGNTNATARLRICQFPSIKTLGPTANNDVTTGRNCLFNKAIPAHMSEHSVVGITWDNDRVTVFSDKIYYFYFKNDWSRVATKCYNSGGCAMQYVYEPTYYMLNVTSAGEDGISYQPCTANCIGYSANVFATEPNGHIPEGFSFNNWFLLSNDSTLVHGKVVSNQPLLVNCLLAIPKIYGLGQFFSFNQTIDGVCNGAAVQRAPEALRFNINDTSVILAEGSIVLHTALGTNFSFVCSDSSDPHLATFAIPLGAIQVPYYCFLKVDTYNSTVYKFLSVLPPTVREIVITKYGDVYVNGFGYLHLGLLDAVTINFTGHGTDDDVSGFWTIASTNFVDALIEVQGTAIQRILYCDDPVSQLKCSQVAFDLDDGFYPISSRNLLSHEQPISFVALPSFNDHSFVNITVSASFGGHSGANLIASDTTINGFSSFCVDTRQFTISLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLASACTIDLFGYPEFGSGVKFTSLYFQFTKGELITGTSKPLEGVTDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSFLAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVDDDIVGVISSLSSSTFNSTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVPSQSGQVKIAPTVTGNISIPTNFSMSIRTEYLQLYNTPVSVDCATYVCNGNSRCKQLLTQYTAACKTIESALQLSARLESVEVNSMLTISEEALQLATISSFNGDGYNFTNVLGVSVYDPASGRVVQKRSFIEDLLFNKVVTNGLGTVDEDYKRCSNGRSVADLVCAQYYSGVMVLPGVVDAERLHMYSASLIGGMVLGGFTSAAALPFSYAVQARLNYLALQTDVLQRNQQLLAESFNSAIGSTTSAFESVKEAISQTSKGLNTVAHALTKVQEVVNSQGAALTQLTVQLQHNFQAISSSIDDIYSRLDILSADVQVDRLITGRLSALNAFVAQTLTKYTEVRASRKLAQQKVNECVKSQSQRYGFCGGDGEHIFSLVQAAPQGLLFLHTVLVPGDFVDVIAIAGLCVNDEIALTLREPGLVLFTHELQNHTATEYFVSSRRMFEPRKPTVSDFVQIESCVVTYVNLTRDQLPDVIPDYIDVNKTLDEILASLPNRTGPSLPLDVFNATYLNLTGEIADLEQRSESLRNTTEELQSLIYNINNTLVDLEWLNRVETYIKWPWWVWLIIFIVLIFVVSLLVFCCISTGCCGCCGCCCACFSGCCRGPRLQPYEVFEKVHVQ(SEQ ID NO.1)。

在优选地实施方式中，猪流行性腹泻病毒S蛋白的制备包括如下：将猪流行性腹泻病毒S基因克隆到表达载体构建重组质粒，将重组质粒转染到CHEK293细胞表达，纯化后得到猪流行性腹泻病毒S蛋白。

在优选地实施方式中，灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

MKKKFISLVIVSSLLNGCLLSPTLVYANDIGKTTTITRNKTSDGYTIITQNDKQIISYQSVDSSSKNEDGFTASIDARFIDDKYSSEMTTLINLTGFMSSKKEDVIKKYNLHDVTNSTAINFPVRYSISILNESINENVKIVDSIPKNTISQKTVSNTMGYKIGGSIEIEENKPKASIESEYAESSTIEYVQPDFSTIQTDHSTSKASWDTKFTETTRGNYNLKSNNPVYGNEMFMYGRYTNVPATENIIPDYQMSKLITGGLNPNMSVVLTAPNGTEESIIKVKMERERNCYYLNWNGANWVGQVYSRLAFDTPNVDSHIFTFKINWLTHKVTAI(SEQ ID NO.2)。

在优选地实施方式中，猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的制备包括如下：将猪产气荚膜梭菌β毒素基因克隆到表达载体构建重组质粒，将重组质粒转染到CHEK293细胞表达，纯化后得到猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白。

在优选地实施方式中，疫苗佐剂包括GEL佐剂、氢氧化铝胶佐剂、ISM佐剂、251C佐剂或VG佐剂，优选为GEL佐剂。GEL佐剂用于疫苗制备工艺更为简单，得到的猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位疫苗性状更好。

在优选地实施方式中，口服佐剂包括角鲨烯、黄原胶或葡聚糖中的至少一种。发明人研究发现角鲨烯、黄原胶和葡聚糖均可作为口服佐剂用于制备口服疫苗，并且效果较为显著。口服佐剂例如但不限于为角鲨烯、黄胶原、角鲨烯和葡聚糖，或者，角鲨烯和黄胶原和葡聚糖，等等。

葡聚糖作为营养补充的健康食品，常用于功能性饮料、口服液、医药及化妆品配料，及其他抗衰老、抗辐射等功能性食品。能提高机体免疫力，是一种生物营养物质。在本发明中，将葡聚糖添作为口服佐剂，可以提高口服疫苗的免疫性能。

黄原胶，是由野油菜黄单胞杆菌以碳水化合物为主要原料(如玉米淀粉)经发酵工程生产的一种作用广泛的微生物胞外多糖。它具有独特的流变性，良好的水溶性、对热及酸碱的稳定性、与多种盐类有很好的相容性，作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂，可广泛应用于食品、石油、医药等20多个行业，是目前世界上生产规模最大且用途极为广泛的微生物多糖。在本发明中，将黄胶原作为口服佐剂，可以提高口服疫苗的免疫性能。

角鲨烯，是一种开链三萜类化合物，因最初从鲨鱼肝油中提取得到，故得名鲨烯。随后发现鲨鱼卵油及其他鱼中也含有它，现在发现它的分布比预想的要广泛许多，真菌及人耳垢中也含有少量。角鲨烯是胆固醇生物合成中间体之一，是所有类固醇类物质的生物合成前体。在本发明中，将角鲨烯作为口服佐剂，可以提高口服疫苗的免疫性能。

在优选地实施方式中，口服佐剂除了角鲨烯、黄原胶或葡聚糖中的至少一种，还可以包括香味剂和/或免疫增强剂。香味剂可以为从植物提取的浓缩物或人工合成的香味原料如脂肪酸类化合物或醇类化合物等；免疫增强剂可以为QUiL-A、皂角、干扰素等等。

需要说明的是，将灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白作为水相时与疫苗佐剂混合前，每ml单位的免疫抗原中二种蛋白的含量质量比为(20-80μg)：(20-80μg)，优选为(30-60μg)：(30-60μg)，进一步优选为50μg:50μg。

本发明又提供上述口服疫苗的制备方法，将免疫抗原依次与疫苗佐剂和口服佐剂乳化混合，得到猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗。该制备方法简单易操作，并不需要特殊的生产设备，该口服疫苗的生产成本较低。

灭活剂可以为β-丙内酯，灭活剂与蛋白的用量为1:4000体积比，灭活剂也可以为甲醛或BEI。

在优选地实施方式中，口服疫苗的免疫应空腹口服，采食前1-2小时，疫苗免疫效果更好。

在优选地实施方式中，口服疫苗的免疫剂量为5ml-60ml；更优选为10ml-40ml；进一步优选为20ml。

在优选地实施方式中，灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白含量为20μg-200μg/头份；更优选为40μg-150μg/头份；进一步优选为100μg/头份。

在优选地实施方式中，灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白含量为10μg-200μg/头份；更优选为30μg-120μg/头份；进一步优选为60μg/头份。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

本实施例提供了一种灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达方法，包括如下步骤：

(a)、猪流行性腹泻病毒S蛋白密码子优化及合成，猪流行性腹泻病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，猪流行性腹泻病毒PEDV-S基因密码子优化及合成委托合成公司合成。

(b)、peD-NA3-S重组质粒的构建及鉴定，在真核表达载体peD-NA3.1(+)插入PEDV-S蛋白基因，获得重组质粒peD-NA3-S。

(c)、细胞的转染，按细胞密度2×10⁵个/ml，接种六孔板，每孔2ml，放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜；当细胞交汇度达到80％-90％时开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12；用OPTI-MEM培养基稀释peD-NA3-S线性化质粒，室温静置5分钟；用OPTI-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX，室温静置5分钟；将稀释好的Lipofectamine LTX缓慢加入质粒中轻轻混匀，室温放置5分钟，然后逐滴均匀加入六孔板；37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4-6小时，然后更换成DMEM/F12(含10％FBS，1％双抗)。

(d)、单克隆筛选，用选择培养基DMEM/F12(含10％FBS，1％双抗，5μg/mlpuromycin)加压筛选，当阴性对照细胞死亡达到90％以上时，开始单克隆筛选。调整活细胞浓度至5个/ml，接种96孔板，每孔200μl，放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4-6小时，然后置于倒置显微镜下观察，记录单个细胞集落孔，待96孔板中单个细胞株扩增至50％以上时，将细胞消化并转移至48孔板，待48孔板长满时，取上清，ELISA检测单克隆细胞株S蛋白的表达产量。

(e)、CHEK293-S细胞株驯化，将高效表达的细胞株驯化成适应EX-CELL 302培养基悬浮培养的细胞株。接种细胞于摇瓶中，体积为30ml，细胞密度为5×10⁵个/ml，37℃，5％CO₂，100r/min摇床培养，每24小时检测细胞密度及活力。当第一轮驯化细胞存活率达到94％，细胞密度达8×10⁵个/ml时，进行第二轮驯化培养，培养基为50％(DMEM/F12+10％FBS)+50％EX-CELL 302，细胞接种密度为5×10⁵个/ml。第二轮驯化细胞传代培养2代，细胞存活率大于94％时，进行第三轮驯化培养，所用培养基为25％(DMEM/F12+10％FBS)+75％EX-CELL 302。第三轮驯化细胞培养3代后，进行第四轮细胞驯化培养，以同样的方式，一直驯化培养至第六轮。将第六轮驯化细胞再传3代，当细胞密度达到1×10⁶个/ml，同时细胞存活率达到94％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。

(f)、猪流行性病毒S蛋白的表达，接种细胞于合适体积的培养基中(60％Dynamis+40％EX-CELL 302)，细胞密度为0.2-0.4×10⁶VC/ml，37℃，5％CO₂恒温摇床中培养，转速为100r/min；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖低于2.5g/L时，补充葡萄糖至3-4g/L；发酵第4日和第9日补料，添加体积为原始培养基的10％；发酵第5日降温至32℃；第12日，收集细胞发酵液。

(g)、纯化，用1×PBS清洗中空纤维超滤系统，将细胞发酵液加入换液池中，开启搅拌器和循环泵，设定剪切速率为4000s^-1，循环一定时间后经0.2μm中空纤维微滤柱过滤，收集第一批透过液。将1×PBS加入换液池中残留的细胞发酵液中，其中1×PBS与细胞发酵液的体积比为1:1；开启搅拌器和循环泵，设定剪切速率为4000s^-1，收集透过液，得到第一批洗滤液，待用；重复此步骤2次，共得到三批洗滤液。将上述透过液和三批洗滤液混合均匀，即得澄清后的细胞上清。将澄清后的细胞上清加入至中空纤维超滤系统的换液池中，开启搅拌器和循环泵，设定剪切速率为6000s^-1，循环一定时间后用30kDa中空纤维超滤柱对细胞上清进行浓缩；然后对浓缩后的细胞上清进行换液，以与透过端相同的流速将1×PBS泵入换液池中，收集透过端液体，置2～8℃保存。

(h)、灭活，取无菌β-丙内酯按照1∶4000(v∶v)的终浓度加入到S蛋白纯化溶液中，于2-8℃低速搅拌灭活24小时，再经37℃水浴低速搅拌水解2小时。灭活完成后通过0.2μm低蛋白吸附膜过滤除菌。置2-8℃保存备用。

实施例2

本实施例提供了一种灭活仔猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的表达方法，包括如下步骤：

(a)、猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白密码子优化及合成，猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，猪产气荚膜梭菌β毒素CNE-β基因密码子优化及合成委托合成公司合成。

(b)、peD-NA3-β重组质粒的构建及鉴定，在真核表达载体peD-NA3.1(+)插入CNE-β蛋白基因，获得重组质粒peD-NA3-β。

(c)、细胞的转染，按细胞密度2×10⁵个/ml，接种六孔板，每孔2ml，放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜；当细胞交汇度达到80％-90％时开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12；用OPTI-MEM培养基稀释peD-NA3-β线性化质粒，室温静置5分钟；用OPTI-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX，室温静置5分钟；将稀释好的Lipofectamine LTX缓慢加入质粒中轻轻混匀，室温放置5分钟，然后逐滴均匀加入六孔板；37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4～6小时，然后更换成DMEM/F12(含10％FBS，1％双抗)。

(d)、单克隆筛选，用选择培养基DMEM/F12(含10％FBS，1％双抗，5μg/mlpuromycin)加压筛选，当阴性对照细胞死亡达到90％以上时，开始单克隆筛选。调整活细胞浓度至5个/ml，接种96孔板，每孔200μl，放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4～6小时，然后置于倒置显微镜下观察，记录单个细胞集落孔，待96孔板中单个细胞株扩增至50％以上时，将细胞消化并转移至48孔板，待48孔板长满时，取上清，ELISA检测单克隆细胞株β毒素蛋白的表达产量。

(e)、CHEK293-β细胞株驯化，将高效表达的细胞株驯化成适应EX-CELL 302培养基悬浮培养的细胞株。接种细胞于摇瓶中，体积为30ml，细胞密度为5×10⁵个/ml，37℃，5％CO₂，100r/min摇床培养，每24小时检测细胞密度及活力。当第一轮驯化细胞存活率达到94％，细胞密度达8×10⁵VC/ml时，进行第二轮驯化培养，培养基为50％(DMEM/F12+10％FBS)+50％EX-CELL 302，细胞接种密度为5×10⁵个/ml。第二轮驯化细胞传代培养2代，细胞存活率大于94％时，进行第三轮驯化培养，所用培养基为25％(DMEM/F12+10％FBS)+75％EX-CELL 302。第三轮驯化细胞培养3代后，进行第四轮细胞驯化培养，以同样的方式，一直驯化培养至第六轮。将第六轮驯化细胞再传3代，当细胞密度达到1×10⁶个/ml，同时细胞存活率达到94％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。

(f)、仔猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的表达，接种细胞于合适体积的培养基中(60％Dynamis+40％EX-CELL 302)，细胞密度为0.2～0.4×10⁶个/ml，37℃，5％CO₂恒温摇床中培养，转速为100r/min；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖低于2.5g/L时，补充葡萄糖至3～4g/L；发酵第4日和第9日补料，添加体积为原始培养基的10％；发酵第5日降温至32℃；第12日，收集细胞发酵液。

(g)、纯化，用1×PBS清洗中空纤维超滤系统，将细胞发酵液加入换液池中，开启搅拌器和循环泵，设定剪切速率为4000s^-1，循环一定时间后经0.2μm中空纤维微滤柱过滤，收集第一批透过液。将1×PBS加入换液池中残留的细胞发酵液中，其中1×PBS与细胞发酵液的体积比为1:1；开启搅拌器和循环泵，设定剪切速率为4000s^-1，收集透过液，得到第一批洗滤液，待用；重复此步骤2次，共得到三批洗滤液。将上述透过液和三批洗滤液混合均匀，即得澄清后的细胞上清。将澄清后的细胞上清加入至中空纤维超滤系统的换液池中，开启搅拌器和循环泵，设定剪切速率为6000s-1，循环一定时间后用10kDa中空纤维超滤柱对细胞上清进行浓缩；然后对浓缩后的细胞上清进行换液，以与透过端相同的流速将1×PBS泵入换液池中，收集透过端液体，置2～8℃保存。

(h)、灭活，取无菌β-丙内酯按照1∶4000(v∶v)的终浓度加入到S蛋白纯化溶液中，于2～8℃低速搅拌灭活24小时，再经37℃水浴低速搅拌水解2小时。灭活完成后通过0.2μm低蛋白吸附膜过滤除菌。置2～8℃保存备用。

实施例3

本实施例提供了一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

将实施例1和实施例2所得蛋白定量，调整混合液中PEDV-S蛋白和CNE-β毒素蛋白的含量各为100μg/ml，按体积比加入30％的水性佐剂GEL搅拌乳化得到猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位疫苗。

实施例4

本实施例提供了一种疫苗口服佐剂的制备方法，包括如下步骤：

将葡聚糖、黄原胶、爱迪香、角鲨烯、QUiL-A按质量比为5：3：1.5：0.25：0.25混合搅拌，制成疫苗口服佐剂。

实施例5

本实施例提供了一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗的制备方法，包括如下步骤：

将实施例3按体积比1:1的比例加入实施例4混合均匀，既得猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗。

试验例

对比例1：本对比例是将实施例3中的疫苗直接颈部肌肉注射猪只；

对比例2：本对比例是将实施例4的口服佐剂使用口服投服器给猪只口服。

实验例一无菌检验：按“兽用生物制品规程”(2015版)附录对实施例3、实施例4、实施例5进行无菌检验，应符合规定。

实验例二疫苗检验

1、安全检验。

选取猪流行性腹泻抗原阴性，中和抗体不高于1∶4的健康易感产前12日怀孕母猪8头，将实验用猪分成4组，3组作为免疫组，每组2只，免疫组分别颈部肌肉注射对比例1及口服对比例2和实施例5提供的猪流行性腹泻、仔猪产气荚膜梭菌二联亚单位灭活口服疫苗，另取2头作为对照组，注射和口服生理盐水，观察三周，无任何临床症状，无死亡。

2、效力检验。

选取猪流行性腹泻抗原阴性，中和抗体不高于1∶4的健康易感产前12日怀孕母猪8头，将实验用猪分成4组，3组作为免疫组，每组2只，免疫组分别颈部肌肉注射对比例1及口服对比例2和实施例5提供的猪流行性腹泻、仔猪产气荚膜梭菌二联亚单位口服疫苗，另取2头作为对照组，注射和口服生理盐水，母猪生产后，每组仔猪选取10头，于4日龄分别攻击攻击强毒(毒株为分离株XJ-HM株(KM386647.1)，剂量为1×10^2.0TCID₅₀/mL/头，攻毒方式：口服)，攻毒后观察7天；猪产气荚膜梭菌β毒素80MLD(小鼠)，攻毒后观察24小时。结果见表1、表2。

表1猪流行性腹泻病毒攻毒保护结果

组别	免疫剂量	免疫方式	被动免疫攻毒保护	结果
					实施例5	20mL	口服	5/5	合格
对比例1	20mL	肌肉注射	2/5	不合格
					对比例2	20mL	口服	0/5	不合格
对照组	N		0/5	对照成立

表2猪产气荚膜梭菌β毒素攻毒保护结果

组别	免疫剂量	免疫方式	被动免疫攻毒保护	结果
					实施例5	20mL	口服	5/5	合格
对比例1	20mL	肌肉注射	5/5	合格
					对比例2	20mL	口服	0/5	不合格
对照组	N		0/5	对照成立

由表1数据结果表明，应用本发明实施例5提供的猪流行性腹泻、猪产气荚膜梭菌二联亚单位口服疫苗相对于对比例1提供的猪流行性腹泻、猪产气荚膜梭菌二联亚单位疫苗对猪流行性腹泻病毒的保护效果好，说明添加口服佐剂，通过口服方式免疫，对猪流行性腹泻病毒的保护优于通过肌肉注射免疫方式。

由表2数据结果表明，应用本发明实施例5提供的猪流行性腹泻、猪产气荚膜梭菌二联亚单位口服疫苗相对于对比例1提供的猪流行性腹泻、猪产气荚膜梭菌二联亚单位疫苗对猪产气荚膜梭菌β毒素的保护效果相当，说明添加口服佐剂，通过口服方式免疫，或通过肌肉注射均对猪产气荚膜梭菌有效。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物股份有限公司

天康生物(上海)有限公司

<120> 猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗及制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1386

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe

20 25 30

Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val

35 40 45

Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr

50 55 60

Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile

65 70 75 80

Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser

85 90 95

Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala

100 105 110

Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe

115 120 125

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130 135 140

Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu

145 150 155 160

His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe

165 170 175

Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val

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260 265 270

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Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg

305 310 315 320

Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val

325 330 335

Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asp Ser

340 345 350

Ser Asp Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Ile Gln

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405 410 415

Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp

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Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp

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Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu

485 490 495

Gln Pro Ile Ser Phe Val Ala Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe

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Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn

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Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val

530 535 540

Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu

565 570 575

Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr

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Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu

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Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys

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Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Ser Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp

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Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu

705 710 715 720

Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr

725 730 735

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740 745 750

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770 775 780

Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr

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Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val

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Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe

885 890 895

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1385

<210> 2

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Lys Lys Phe Ile Ser Leu Val Ile Val Ser Ser Leu Leu Asn

1 5 10 15

Gly Cys Leu Leu Ser Pro Thr Leu Val Tyr Ala Asn Asp Ile Gly Lys

20 25 30

Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp Gly Tyr Thr Ile Ile

35 40 45

Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Ser Val Asp Ser Ser

50 55 60

Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile Asp Ala Arg Phe Ile

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe Met Tyr Gly Arg Tyr

225 230 235 240

Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro Asp Tyr Gln Met Ser

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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Claims

1.一种猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗，其特征在于，所述口服疫苗包括免疫抗原、疫苗佐剂和口服佐剂；

2.根据权利要求1所述的口服疫苗，其特征在于，所述灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的口服疫苗，其特征在于，所述灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的口服疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂包括GEL佐剂、氢氧化铝胶佐剂、ISM佐剂、251C佐剂或VG佐剂，优选为GEL佐剂。

5.根据权利要求1所述的口服疫苗，其特征在于，所述口服佐剂包括角鲨烯、黄原胶或葡聚糖中的至少一种；

优选地，所述口服佐剂还包括香味剂和/或免疫增强剂。

6.根据权利要求1所述的口服疫苗，其特征在于，每ml单位的免疫抗原中含有20-80μg灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和20-80μg灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白，优选为30-60μg灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和30-60μg灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白，进一步优选为50μg灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和50μg灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白。

7.根据权利要求6所述的口服疫苗，其特征在于，疫苗佐剂的用量为免疫抗原体积的10v/v％-80v/v％，优选为20v/v％-60v/v％，进一步优选为30v/v％。

8.根据权利要求7所述的口服疫苗，其特征在于，口服佐剂的用量为疫苗佐剂和免疫抗原的体积总和的10v/v％-90v/v％，优选为20v/v％-70v/v％，进一步优选为50v/v％。

9.权利要求1-8任一项所述的口服疫苗的制备方法，其特征在于，将免疫抗原依次与疫苗佐剂和口服佐剂乳化混合，得到猪流行性腹泻-猪梭菌性肠炎二联亚单位的口服疫苗。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白和灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白的灭活方法均独立地包括：利用灭活剂在2℃-8℃混合灭活22-26h，然后36-38℃混合水解1-3h，再经除菌得到灭活猪流行性腹泻病毒S蛋白或灭活猪产气荚膜梭菌β毒素蛋白。