JP7035063B2 - phoP-phoRを過剰発現する組換えBCG - Google Patents
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Description
本発明は、結核(TB)ワクチンに関する。特に、本発明は、phoP-phoR二成分制御系を過剰発現し、結核に対する増強された防御を付与する、組換えBCGを提供する。
マイコバクテリウム・ツベルクローシス(結核菌、Mycobacterium tuberculosis(M.tb))により引き起こされる結核(TB)は、世界中の感染症による死亡の主な原因としてHIV/AIDSと並んでランク付けされている。2014年には、結核により150万人が死亡し、960万人が新たに感染した。予防ワクチンの不足、薬剤耐性結核菌株の出現、および高い結核菌/HIV同時感染率が、TBの流行を助長し続けている。カルメット・ゲラン桿菌(Bacille Calmette-Guerin(BCG))は唯一の認可TBワクチンであり、小児の播種性結核に対して有効であるが1、2、最も一般的で伝染性の結核である、成人の肺結核に対する防御は限定的である。臨床試験により、0~80%の範囲の様々な効果が示されている3~5。
本発明は、phoP-phoRの二成分制御系を過剰発現する組換えマイコバクテリア株を含む、結核ワクチンを提供する。現行のBCGワクチン株の免疫原性は、宿主において、結核に対して最適な防御を誘導するのに十分ではない。対照的に、phoP-phoRを過剰発現する本発明の遺伝子改変されたBCG株は、より免疫原性が高く、結核に対してより優れた防御を提供する。PhoP-PhoRに制御される遺伝子またはたんぱく質の2倍の(またはそれを超える)誘導を引き起こすのに十分なレベルでphoP-phoRを過剰生産する、任意の遺伝子改変されたマイコバクテリアが、本発明の実施において有利に使用され得る。本発明の組換えマイコバクテリアが哺乳動物の宿主に投与されると、CD4T細胞によるIFN-γの生産が宿主において増加し、当該組換えマイコバクテリアは結核に対する防御を提供する。
TBに対する防御には細胞性免疫が必要であり、これは完全には理解されていないが、CD4およびCD8T細胞を含む複数の成分を包含する16、32、33。BCGは、ヘルパーT細胞1(Th1)型応答を誘導し、主にCD4T細胞によるIFN-γ生産を誘導する34。伝統的に、BCGの免疫原性は、ワクチン接種前にツベルクリン陰性であった小児において、ワクチンによって誘導されるツベルクリン(PPD、結核菌の精製たんぱく体)感受性を測定することによって決定された30。ツベルクリン反応性は、防御の代替的指標としてのその使用が近年疑問視されている一方で35、36、細胞性免疫応答のためのインビボアッセイおよび免疫原性のためのマーカーとして、使用され続けている19、37。これを支持して、BCGワクチンを接種した乳児におけるツベルクリン反応性とPPD特異的IFN-γレベルの間には強い関連がある38。さらに、ツベルクリン反応性およびIFN-γ生産は、若年者における抗TB免疫の非重複(non-redundant)で補完的な指標であることが見出された39。1970年代の研究では、BCG-Pragueが、試験した他の10個のBCG株よりも、小児およびモルモットで有意に低いツベルクリン反応性を一貫して示すことがわかった28、29。その低い免疫原性に対する懸念により、30年近く使用された後の1981年にチェコスロバキアでBCG-Russiaに置き換えられた30。
修飾
本出願で開示される核酸分子DNA配列には、多くの修飾がなされてもよく、このことは、当業者には明らかであろう。本発明には、本出願で開示されているたんぱく質またはペプチドと同じ機能を有するたんぱく質またはペプチドを、細菌または哺乳動物細胞においてコードする、本出願で開示される配列(またはその断片)のヌクレオチド修飾が含まれる。修飾には、1つ以上の(例えば、1~50、1~20、1~10、1~5個の)ヌクレオチドの置換、挿入、もしくは欠失、または、1つ以上の(例えば、1~50、1~20、1~10、1~5個の)ヌクレオチドの相対的位置もしくは順序の変更が含まれる。
本発明の核酸分子にはまた、本発明の核酸分子と、少なくとも約60%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、または最も好ましくは、少なくとも99%または99.5%の同一性を有する核酸分子(またはその断片)であって、細菌または哺乳動物細胞において、核酸分子の発現が可能である核酸分子が含まれる。同一性とは、最高位の一致が得られるように整列された、2つのヌクレオチド配列の類似性を指す。同一性は、当業界で公知の方法に従い、計算される。例えば、ヌクレオチド配列(「配列A」と呼ぶ)が配列番号2の一部と90%の同一性を有する場合、配列Aは、配列番号2の参照部分のヌクレオチド100個あたり、10個の点変異(他のヌクレオチドによる置換など)を含み得ることを除いて、配列番号2の参照部分と同一であろう。
本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするために、本出願に記載される核酸分子に、十分な同一性を有する配列を有するDNAを含む(ハイブリダイゼーション技術は、当業界で周知である)。本発明はまた、配列番号2および配列番号4の配列またはそれらの相補的配列の1つ以上にハイブリダイズする核酸分子も含む。これらの核酸分子は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズする(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Most Recent Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい)。高ストリンジェンシー洗浄は、好ましくは、低塩濃度(好ましくは約0.2%SSC)および約50~65℃の温度を有する。
生組換えワクチンの調製は、当業者に知られている。一般的には、これらのワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射用として調製される;注射前に液体に溶解または懸濁するのに好適な固体形態も、調製することができる。製剤は、乳化されてもよく、あるいは、該たんぱく質がリポソームに封入されてもよい。生きた免疫原性成分は、医薬的に許容され、かつ有効成分と適合する賦形剤と、しばしば混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワクチンには湿潤剤や乳化剤、pH緩衝剤、および/またはワクチンの効果を高めるアジュバントなどの補助物質が少量含まれ得る。有効であり得るアジュバントの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない:水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルームラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(CGP11637、ノル-MDPと呼ばれる)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミル-L-アラニン-2-(1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(CGP19835A、MTP-PEと呼ばれる)、およびRIBI(2%スクアレン/Tween80(商標)エマルジョン中に、微生物から抽出した3つの化合物である、モノホスホリルリピドA、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)を含む)。
本発明の医薬組成物は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のために用いられる。本発明の医薬組成物はまた、変性疾患、障害または癌などの異常な身体状態を有する患者を治療するためにも用いられる。
T7プロモーターを含むカナマイシン耐性シャトルベクターを、以下の通りに得た。pDriveクローニングベクター(Qiagenから入手)をEcoRIで切断し、自己連結させてpDRIを作製した。pDR1をSspIで消化し、1903pbの断片産物を単離した。pMD31シャトルベクター(Wu et al., 1993, Molecular Microbiology, 7, 407-417)を、SspIで消化し、3379bp断片を単離した。2つのSspIにより作製された断片を連結して、pME(5282bp)を作製した。これは、元のpDRIVEのT7プロモーターを含む。クローニングベクターpMEを、図2に示している。
phoPおよびphoP翻訳開始部位の257bp上流領域を含む1028bp産物を、それぞれ、KpnIおよびPstI制限酵素部位(下線部)を含む、フォワードプライマーphoP-F(5’-AAAAAGGTACCGCTTGTTTGGCCATGTCAAC-3’)およびリバースプライマーphoP-R(5’-AAAAACTGCAGGCTGCCGATCCGATTAACTAC-3’)を用いて、PCRにより増幅した。これらの制限酵素部位を用いて、該PCR産物を、シャトルベクターpMEに連結させた(pME-PhoP)。同様に、phoPおよびphoR(並びに、2つの遺伝子の遺伝子間領域、phoP開始コドンの177bp上流、およびphoR終止コドンの78bp下流)を含有する2501bpのPCR産物を、pMEにクローニングすることにより、phoP-phoRオペロンを発現するベクター(pME-PhoPR)を構築した。該PCR産物は、BCG-PasteurゲノムDNAから、それぞれ、KpnIおよびPstI部位(下線部)を含む、フォワードプライマーphoPR-F(5’-AAAAAGGTACCGGTCGCAATACCCACGAG-3’)およびリバースプライマーphoPR-R(5’-AAAAACTGCAGCCTCAGTGATTTCGGCTTTG-3’)を用いて、PCRにより増幅した。構築物を、DNA配列決定により確認した。
雌C57BL/6マウスを、Charles River Laboratoriesから購入し、各実験内で週齢を一致させた(6週齢)。グループ当たり4匹のマウスに、0.2ml PBS/0.01% Tween80中のおよそ5×104CFUのBCG株を、首筋に皮下接種した。コントロールマウスには、0.2mlのPBS/0.01%Tween80を与えた。8週間後に、マウスを安楽死させ、脾細胞を単離した。IFN-γ生産の定量測定値は、OptEIA Mouse IFN-γELISAセット(BD Biosciences)を用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて、決定した。ELISAに用いたサンプルは、PPD(10μg/ml)により、72時間刺激された脾細胞由来の上清であった。手短に言えば、捕捉抗体でプレコートされた96ウェル平底プレート(Nunc MaxiSorp)にサンプルを3連で添加し、以下の製造元のプロトコールに従い測定を実施した。吸光度をマイクロプレートリーダーにより、450nmで読み取った(TECAN infinite M200)。IFN-γレベルは、IFN-γスタンダードを用いて作成した検量線に基づいて計算した。結果を図4aおよび図4bに示す。PPD刺激なしのサンプルからの読み値を差し引いた後、データを平均値±SEMとして示す。図4aにおいて、両側独立スチューデントt検定を行った;図4bにおいて、一元配置ANOVAおよびボンフェローニ多重比較検定を実施した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
11匹の雌ハートレイ系モルモット(200~250g)のグループを、Charles River Laboratoriesから購入し、0.2mlPBS/0.01%Tween80中の、pME(rBCG-Japan/pME)、pME-PhoPR(rBCG-Japan/PhoPR)を含有するBCG-Japanを、5×104CFUで、または、コントロールとしてPBS/0.01%Tween80単独を、皮下にワクチン接種した。ワクチン接種後8週目に、モルモットを、GlasColネブライザーを使用したエアロゾル経路で、1,000CFUの結核菌H37Rvを負荷した。モルモットを、人道的なエンドポイントで安楽死させ、カプラン・マイヤー法を用いて生存曲線をプロットした。結果を図5aに示す。ログランク検定を行い、生存曲線の各対を比較した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.0001。
図4に記載の実験から6匹のモルモットを、組織学的分析のために選択した。これらには、それぞれ25、27、および39週目に人道的なエンドポイントに到達した各グループからの1匹のモルモットが含まれる(図6a~図6c)。pME(図6b)およびPhoPR(図6c)のモルモットは、各グループから安楽死させた6番目のモルモットを表す(中央値)。pMEグループの唯一の生存動物(図6d)およびPhoPRグループのランダムに選ばれた1匹の生存動物(図6e)が、含まれた。各モルモットについて、左肺の下葉および上葉の切片を、ヘマトキシリン―エオシン染色により解析した。手短に言えば、ホルマリン固定組織をパラフィンブロックに包埋した。連続切片(5μm厚)を調製し、それらを、キシレンを3回交換して(各3分)、脱パラフィン処理を行い、その後4回のアルコール洗浄(100%、100%、95%、70%、各3分)で再水和した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン(EMD Chemicals)で染色して、Cytation(商標)5(BioTek)を用いて調べた。
短期間細菌負荷アッセイ:雌Fox Chase CB17 SCIDマウス(Charles River Laboratories)は、週齢を一致させた(7週齢)。12匹のマウスのグループに、0.2mLのPBS/0.01%Tween80中の105CFUのrBCG-Japan/pME、rBCG-Japan/PhoP、またはrBCG-Japan/PhoPRを、あるいは、コントロールとしてPBS/0.01%Tween80単独を、外側尾静脈を介して静脈内に感染させた。感染後1週目、3週目、および6週目に、マウス(各時点でn=4)を安楽死させて、肺および脾臓を回収し、PBSでホモジナイズして、7H11寒天培地にプレーティングして、肺(図7a)および脾臓(図7b)における細菌負荷量を決定した。データは、平均値±SDとして示す。二元配置ANOVAおよびボンフェローニ多重比較検定を行った。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
Claims (19)
- 過剰発現できる核酸であって、PhoPおよびPhoRたんぱく質をコードする核酸を含む、生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株。
- PhoPおよびPhoRたんぱく質が、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビス由来である、請求項1に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株。
- 核酸が、
(i)配列番号1で示されるアミノ酸配列;または
(ii)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を有する、PhoPたんぱく質、
(iii)配列番号3で示されるアミノ酸配列;または
(iv)配列番号3で示されるアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を有する、PhoRたんぱく質、
をコードする、請求項1に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株。 - 核酸が、
(i)配列番号2で示されるヌクレオチド配列;
(ii)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(i)のヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列;または
(iii)配列番号2で示されるヌクレオチド配列と、少なくとも90%の配列同一性を有する配列、
(iv)配列番号4で示されるヌクレオチド配列;
(v)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(iv)のヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列;または
(vi)配列番号4で示されるヌクレオチド配列と、少なくとも90%の配列同一性を有する配列、
を含む、請求項1に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株。 - 核酸分子が修飾されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株。
- マイコバクテリウム・ボビス―BCG株が現存するBCG株から選択され、現存するBCG株が、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Russia(ATCC番号:35740)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Moreau(ATCC番号:35736)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Japan(ATCC番号:35737)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Sweden(ATCC番号:35732)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Birkhaug(ATCC番号:35731)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Prague(ATCC番号:35742)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Glaxo(ATCC番号:35741)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Denmark(ATCC番号:35733)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Tice(ATCC番号:35743、27289)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Frappier(ATCC:35746、SM-R;ATCC:35747、INH-R)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-コンノート(ATCC:35745)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Phipps(ATCC番号:35744)、マイコバクテリウム・ボビス-BCG-Pasteur(ATCC番号:35734)およびBCG-Mexican(ATCC番号:35738)を含むが、これらに限定されない、請求項1~5のいずれか一項に記載の、生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株を含む、医薬組成物。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株を含む、マイコバクテリアによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のための、ワクチンまたは免疫原性組成物。
- マイコバクテリアが、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスである、請求項8に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
- さらに、医薬的に許容される担体を含む、請求項7または8に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
- さらに、アジュバントを含む、請求項7または8に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
- さらに、1つ以上の他の病原菌由来の免疫原性物質を含む、請求項8~11のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のための組成物。
- 哺乳動物がウシである、請求項13に記載の組成物。
- 哺乳動物がヒトである、請求項13に記載の組成物。
- さらに、アジュバントを含む、請求項13に記載の組成物。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―BCG株を含む、癌に対する哺乳動物の治療または予防のための組成物。
- さらに、アジュバントを含む、請求項17に記載の組成物。
- 癌が膀胱癌である、請求項17または18に記載の組成物。
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