CN111518738B - 重组卡介苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组卡介苗及其制备方法和应用。本发明构建了能够在卡介苗表面表达FimH蛋白的穿梭质粒，将表达FimH蛋白的基因片段转化入野生型卡介苗内，从而获得重组卡介苗。经验证，该重组卡介苗可以在卡介苗表面表达FimH蛋白，因此该卡介苗能够特异性地与对FimH蛋白具有选择结合的对象结合，并且能够增强BCG诱导的局部先天性免疫效应和适应性免疫效应，外周血单个核细胞的抗肿瘤效果，并显著提高BCG抗膀胱肿瘤的效果，治疗膀胱肿瘤。

Description

重组卡介苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种重组卡介苗，特别涉及一种重组之后能够表达FimH蛋白的重组卡介苗及其制备方法和应用。
背景技术
膀胱尿路上皮癌是泌尿系统中常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌(浅表性)和肌层浸润性膀胱癌，其中浅表性膀胱癌约占75％-80％。目前，临床标准的膀胱癌治疗方案是经尿道切除后进行膀胱灌注治疗，因为手术切除复发率高，所以后期的膀胱灌注是延长病人寿命的关键。临床上最有效的免疫疗法是灌注卡介苗，通过激活免疫细胞，来杀伤肿瘤。卡介苗作为中高危表浅性膀胱癌首选的膀胱灌注药物，其发挥抗肿瘤作用依赖于对膀胱上皮细胞的黏附，进一步被巨噬细胞吞噬，诱发系列免疫反应来杀伤肿瘤细胞。提高卡介苗的剂量可以增强其抗膀胱肿瘤效应，但也会引起局部炎症反应，导致显著的尿频、尿急、尿痛等局部刺激症状，不良反应的严重程度同卡介苗的剂量正相关。目前利用灌注卡介苗治疗膀胱癌的最大问题是，卡介苗黏附膀胱肿瘤细胞和上皮细胞的能力不足而且选择性低，有可能导致免疫反应低下不利于抗肿瘤，如果单纯增加剂量可能会显著加重不良反应，包括尿频、尿急、尿痛、发热甚至全身感染等黏附。
2017年《Nature》上的一篇文章(Selective depletion of uropathogenicE.coli from the gut by a FimH antagonist,Caitlin N.Spaulding,Roger D.Klein,Ségolène Ruer,Andrew L.Kau,Henry L.Schreiber,Zachary T.Cusumano,Karen W.Dodson,Jerome S.Pinkner,Daved H.Fremont,James W.Janetka,Han Remaut,Jeffrey I.Gordon&Scott J.Hultgren,Nature volume 546,pages528–532(2017))，讲述了大肠杆菌的FimH蛋白可特异性识别甘露糖。FimH蛋白能够通过TLR4通路，提高树突状细胞抗原递呈能力。膀胱癌细胞表面富含甘露糖残基，而膀胱肿瘤细胞既是卡介苗诱导的杀伤性淋巴细胞的靶细胞，也可以作为抗原递呈细胞参与免疫活动。所以，选择对野生型卡介苗进行改造，使FimH蛋白能够在卡介苗表面表达，可以提高卡介苗黏附上皮细胞和肿瘤细胞的能力，从而提高卡介苗的抗肿瘤效果，增强卡介苗对膀胱肿瘤的靶向性，提高卡介苗抗肿瘤效果，同时减低卡介苗剂量，降低其不良反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组卡介苗及其制备方法和应用，通过对野生型卡介苗进行改造获得重组了FimH蛋白的重组卡介苗。该重组卡介苗可以更好地黏附于膀胱上皮和膀胱癌细胞上，从而可以提高卡介苗灌注治疗的效果，或者在同等或类似效果下降低卡介苗灌注剂量。为了获得上述重组卡介苗，本发明应用基因工程技术构建了能够在卡介苗表面表达FimH蛋白的穿梭质粒，并用电穿孔法将其转化野生型卡介苗。所述野生型卡介苗来源于：
Figure GDA0002535205490000021
35734，为公众可自由获得的资源。本申请解决了现有技术中的不足。
本发明的上述目的可采用下列技术方案来实现：
本发明的一个发明点为提供一种全新的重组卡介苗，其能够在其自身表面表达FimH蛋白。该重组卡介苗已保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为19540，保藏日期：2020年4月17日，分类名为牛分枝杆菌，拉丁文名Mycobacterium bovis。
进一步地，所述重组卡介苗通过其表面表达的FimH蛋白与具有FimH蛋白结合特性的对象(该对象即为能够和FimH蛋白结合的物质)进行特异性结合。
进一步地，具有与FimH蛋白结合特性的对象包括肿瘤细胞，优选地，所述肿瘤细胞包括但不限于膀胱癌肿瘤细胞。
进一步地，所述重组卡介苗为将表面含有FimH蛋白表达基因的质粒转化至野生型卡介苗中所得的新型卡介苗。
进一步地，所述FimH蛋白表达基因通过19ss信号肽表达基因插入所述质粒中；优选地，所述的19ss信号肽的序列为：TATGAAGCGTGGACTGACGGTCGCGGTAGCCGGAGCCGCCATTCTGGTCGCAGGTCTTTCCG。
本发明的另一个发明点为提供一种重组卡介苗的制备方法，该方法包括以下步骤：S1：将质粒作为载体，将FimH蛋白表达基因与19ss信号肽表达基因融合，融合后一起插入所述载体中，则19ss信号肽表达基因便将FimH蛋白表达基因携带到菌体的表面，形成新的质粒；S2：将S1中获得的新的质粒转化进野生型卡介苗中。
进一步地，在S1中，所述质粒为pMV261；S1中所述的FimH蛋白表达基因来自大肠杆菌；且S1中需加入酶和酶切引物，该酶的酶切位点为BamHI和HandIII，以使FimH蛋白表达基因与19ss信号肽表达基因的插入BamHI和HandIII中间；所述酶切引物为：
F:5'CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTGCTGT
R:5'AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAAACTGGAAATCATCGCTGTTATAGTTGTT。
本发明的又一个发明点为提供一种膀胱肿瘤抑制物，所述抑制物为以上任意一段所述的重组卡介苗，该重组卡介苗为能够特异性结合膀胱细胞以抑制膀胱肿瘤以及能够增强外周血单个核细胞的抗膀胱肿瘤效应实现肿瘤治疗的卡介苗，如，可通过与膀胱癌上的甘露糖残基特异性结合实现与膀胱癌的结合，从而实现膀胱癌细胞的抑制或治疗。
本发明的又一个发明点为提供一种免疫效应促进剂，所述免疫效应促进剂包括能够增强BCG诱导的局部先天性免疫效应和适应性免疫效应的促进剂，该促进剂包括以上任意一段所述的重组卡介苗。
本发明最后一个发明点为提供一种新型卡介苗在制备治疗药物中的应用，所述新型卡介苗为以上任意一段所述的能够表面表达FimH蛋白的重组卡介苗，所述药物包括抗肿瘤药物和增强免疫效应的药物。
进一步地，所述抗肿瘤药物包括抗膀胱癌药物，所述增强免疫效应的药物包括增强BCG诱导的局部先天性免疫效应的药物和增强适应性免疫效应的药物。
上述创新工作具有以下几个层面的效果：
1、本发明创造性的将FimH蛋白融合至能够在表面表达蛋白的卡介苗中，从而获得了一种全新的重组卡介苗菌株，其能够很好的在表面表达的FimH蛋白，并且能够与具有和FimH蛋白结合特性的对象特异性地结合，如其能够与膀胱癌细胞上的甘露糖残基特异性结合。
2、本发明获得的重组卡介苗对膀胱上皮细胞的高黏附内化力，对膀胱肿瘤细胞的黏附力和内化力增强，且具有更长的滞留时间，有利于抑制或消灭肿瘤。
3、重组卡介苗相较于普通卡介苗，对膀胱癌细胞具有更强黏附力这一现象在加入D-甘露糖进行竞争性抑制后会降低黏附量，说明重组卡介苗rBCG-S.FimH是通过FimH蛋白与膀胱癌细胞表面甘露糖残基的结合提高了与之的黏附力。
4、重组卡介苗具有增强外周血单个核细胞的抗肿瘤效应。
5、重组卡介苗能够显著增强BCG诱导的局部先天性免疫效应和适应性免疫效应(Th1效应)，其增强效应显著优于FimH蛋白和传统BCG，且重组卡介苗与FimH的作用机理也不同。更重要的是，重组卡介苗通过增强免疫效应并增强杀伤肿瘤细胞效应。
6、重组卡介苗rBCG-S.FimH可以有效降低膀胱癌细胞的重量，而且通过多次试验获知，在采用本申请的重组卡介苗治疗后，有将近40％的肿瘤可完全消失，因此，其具有更强的抗肿瘤效应，对于膀胱癌的治疗具有优于目前常规治疗方法的效果。
7、还需要说明的是，本申请不仅对于膀胱癌等癌细胞具有消除作用，对于其他的癌症也具有较佳的疗效。
总之，本申请构建的重组卡介苗，在体内、体外黏附和内化进入癌细胞的能力强于未经本发明类似方式改造的卡介苗，并且增强免疫效应杀伤肿瘤细胞。且本发明的重组卡介苗能够同时通过与膀胱癌等肿瘤进行特异性结合、通过增强免疫以及通过增强外周血单个核细胞的抗肿瘤效应等实现抗膀胱癌等肿瘤的作用，多种方式协同作用，大大增加了该重组卡介苗的抗肿瘤效应，实现治疗肿瘤的作用。故该重组卡介苗具有极佳的潜在临床应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为膀胱癌细胞表面结构示意图。
图2为FimH蛋白和D-甘露糖结合的共结晶示意图。
图3为卡介苗和重组卡介苗表达验证图。
图4为重组卡介苗的RT-PCR凝胶电泳图。
图5A为rBCG-S.EGFP、rBCG-S.FimH-EGFP在荧光下的图。
图5B为提取BCG荚膜蛋白，验证其是否表达在膜上的图。
图5C为采用EGFP抗体检测rBCG-S.EGFP、BCG-S.FimH-EGFP的western blot图。
图6A和6B均为重组卡介苗rBCG-s.EGFP和rBCG-S.FimH-EGFP与膀胱癌细胞孵育4小时后结合情况荧光图。
图6C和6D均为重组卡介苗rBCG-S.EGFP和rBCG-S.FimH-EGFP与膀胱癌细胞孵育4小时后结合情况柱状图。
图7A为rBCG-S.EGFP和rBCG-S.FimH-EGFP分别与不同膀胱癌细胞孵育10小时后结合情况荧光图。
图7B为rBCG-s.EGFP和rBCG-S.FimH-EGFP分别与不同膀胱癌细胞和正常尿路上皮细胞孵育10小时后结合情况的柱状图。
图8A为C57/BL6小鼠膀胱种植肿瘤细胞(MB49)使用不同BCG灌注治疗三周后活体成像效果对照图。
图8B为小鼠膀胱标本大小对比图。
图8C为小鼠膀胱切片组织对比图。
图8D为小鼠活体成像体内荧光值的量化柱状对比图。
图8E为小鼠膀胱肿瘤重量柱状对比图。
图9A为不同组别对膀胱正常上皮细胞的黏附内化力图。
图9B为不同组别对膀胱肿瘤细胞的黏附内化力图。
图9C为4小时后不同组别对正常膀胱上皮细胞的黏附内化荧光量化图。
图9D为4小时后不同组别对膀胱肿瘤的黏附内化荧光量化图。
图9E为4小时后不同组别对膀胱肿瘤的黏附内化倾向性的量化图。
图9F为8小时后不同组别对膀胱肿瘤的黏附内化倾向性的量化图。
图9G为小鼠膀胱肿瘤冰冻切片24小时荧光值的量化。
图9H为不同时间后不同组别对膀胱肿瘤的黏附内化倾向性的量化图。
图10A为不同组别先天性免疫效应的细胞因子表达图。
图10B为通过灰度分析得出图10A的结果量化图。
图11A为RT-PCR检测发现rBCG-S.FimH小鼠膀胱灌注较BCG增强适应性免疫效应图。
图11B为图11A的灰度分析结果量化图。
图12A为rBCG-S.FimH和BCG在增强人PBMC抗膀胱肿瘤细胞的效力和分泌IL-2的水平的对比图。
图12B为rBCG-S.FimH刺激PBMC分泌IL-2的能力对比图。
图12C为将图12B中的各组膀胱肿瘤KU7-EGFP细胞进行荧光显微计数图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
一种重组卡介苗，能够在其表面表达FimH蛋白，从而利用在其表面表达的FimH蛋白与具有和FimH蛋白结合特性的对象特异性地结合。因此该重组卡介苗理论上能够在任何需要卡介苗通过FimH蛋白与作用对象特异性结合的场合发挥积极的、显著的作用。
该重组卡介苗能够在表面表达FimH蛋白，使其能够更好的特异性结合膀胱癌。如图1所示，膀胱癌细胞表面则富含甘露糖残基，重组卡介苗表面表达的FimH蛋白可以与甘露糖残基结合，从而增强重组卡介苗与膀胱癌细胞结合的特异性，并提升免疫疗效。图2为FimH与甘露糖残基的蛋白共晶结构，圈中部分为FimH识别甘露糖残基的结构域。
制备所述的重组卡介苗的具体实施方案如下：
S1：选择具有卡那霉素抗性的pMV261质粒(即为pMV261载体)，加入酶、酶切引物、19ss锚定蛋白(即19ss信号肽)表达基因和FimH蛋白表达基因，构建pMV261-S.FimH质粒，即新的质粒；
在该步骤中，19ss锚定蛋白的基因先与FimH蛋白的基因融合，然后19ss锚定蛋白在启动子HSP60后面插入，从而将FimH蛋白携带到细菌的表面，实现了BCG表面表达FimH蛋白的特性；
S2：将S1中得到的新的质粒用电穿孔法转化进野生型卡介苗中，即构建重组卡介苗rBCG-S.FimH。
为了能便于荧光检测，按照同等方法，构建出同时带EGFP标签的野生型卡介苗和带EGFP标签并融合了表面表达FimH蛋白的重组卡介苗，分别描述为rBCG-S.EGFP和rBCG-S.FimH-EGFP。增加EGFP的目的是可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光，而不改变该BCG的其他功能。故rBCG-S.EGFP和rBCG-S.FimH-EGFP可以在荧光显微镜下发绿光，便于荧光检测，如图3所示。
在上述制备过程中，涉及的关键信息如下：
S1中的酶切位点为BamHI和HandIII，19ss锚定蛋白表达基因与FimH蛋白表达基因一同合成，然后作为一体插入到两个酶切位点之间。19ss锚定蛋白表达基因来自于BCG。
酶切引物为：
F:5'CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTGCTGT
R:5'AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAAACTGGAAATCATCGCTGTTATAGTTGTT
19ss信号肽序列为：TATGAAGCGTGGACTGACGGTCGCGGTAGCCGGAGCCGCCATTCTGGTCGCAGGTCTTTCCG
本发明人创造性的将FimH融合于卡介苗中，从而获得了一种全新的、可表面表达FimH蛋白的重组FimH蛋白的卡介苗菌株，该重组的卡介苗菌株已经已于2020年保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号：19540，分类名为牛分枝杆菌，拉丁文名Mycobacterium bovis。
利用RT-PCR凝胶电泳证明上述重组卡介苗可以成功转录成mRNA，如图4所示，图4为重组卡介苗的RT-PCR凝胶电泳图，可以看出，重组卡介苗可以成功转录成mRNA。并通过western blot和TritonX-114膜提取试剂，验证大部分蛋白可以被表达在卡介苗(BCG)膜表面，如图5B所示。
进一步地研究表面，本发明构建的重组卡介苗，在体内、体外黏附和内化进入癌细胞的能力强于未经本发明类似方式改造的卡介苗，因此本发明的重组卡介苗能够招募更多单核/巨噬细胞浸润癌细胞，进一步加强局部免疫疗效，提高其抗肿瘤效果。
实施例2：
构建荚膜表面表达FimH蛋白的rBCG-S.FimH，即选择具有卡那霉素抗性的pMV261质粒，在启动子HSP60后面插入19ss锚定蛋白，分别构建pMV261-S.EGFP，pMV261-S.FimH-EGFP，pMV261-S.FimH等质粒，采用电转染构建rBCG-S.EGFP，rBCG-S.FimH-EGFP，rBCG-S.FimH。卡那霉素抗性筛选单克隆最佳菌株，在绿色荧光显微镜下观察重组质粒的荧光情况；通过RT-PCR实验，验证在cDNA水平上重组质粒的转录情况；通过western blot实验，在蛋白水平上验证重组BCG的蛋白表达情况。参见图2、4和5，图5A为在488nm荧光激发下，rBCG-S.EGFP、rBCG-S.FimH-EGFP均能发出绿色荧光；图5B为提取BCG荚膜蛋白，发现大部分重组蛋白均能表达在膜上，间接证明S.FimH蛋白表达在BCG的荚膜上。图5C可知，质粒转入卡介苗的蛋白可以在卡介苗中正常表达。图2为FimH与D-甘露糖的蛋白共晶结构，圈中部分为FimH识别甘露糖残基的结构域；图4为RT-PCR实验中，rBCG-S.EGFP、rBCG-S.FimH-EGFP、rBCG-S.FimH均能转录质粒所插入的蛋白。
本实施例成功构建了荚膜表面表达FimH蛋白的rBCG-S.FimH。
实施例3：
将卡介苗rBCG-S.EGFP和重组卡介苗rBCG-S.FimH-EGFP分别与人膀胱癌细胞系5637孵育4小时，或者在rBCG-S.FimH-EGFP中加入D-甘露糖竞争性抑制，4小时后弃去培养基，固定并用DAPI染核，共聚焦拍照。其中重组卡介苗rBCG-S.EGFP和rBCG-S.FimH-EGFP按照发明内容部分的方法获得，人膀胱癌细胞系5637来源于中国科学院上海生命科学研究院。如图6A和6C所示，图6A和6C为卡介苗rBCG-S.EGFP和重组卡介苗rBCG-S.FimH-EGFP分别与人膀胱癌细胞系5637孵育4小时，或加入D-甘露糖竞争性抑制后的结合情况荧光图。从图6A和6C可以看出，重组卡介苗rBCG-S.FimH-EGFP具有更强的荧光量点和黏附力，当用D-甘露糖进行竞争性抑制，则可以降低重组卡介苗rBCG-S.FimH-EGFP的黏附量，说明重组卡介苗rBCG-S.FimH-EGFP可以与膀胱癌细胞表面甘露糖残基结合。
同时可参见表1，实验数据显示，重组卡介苗rBCG-S.FimH-EGFP对膀胱癌细胞具有更强黏附力。加入D-甘露糖进行竞争性抑制则会降低黏附量。
表1 5637细胞在不同孵育条件下的荧光值(即黏附内化在细胞中BCG的数量)
Figure GDA0002535205490000101
上述结果说明重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP是通过转入的FimH蛋白与膀胱癌细胞表面甘露糖残基的结合，显著提高了卡介苗与膀胱癌细胞的黏附力。
实施例4：
将卡介苗rBCG-S.EGFP和重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP分别与小鼠膀胱癌细胞系MB49孵育4小时，或加入D-甘露糖竞争性抑制，4小时后弃去培养基，固定并用DAPI染核，共聚焦拍照。其中卡介苗rBCG-S.EGFP和重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP按照发明内容部分的方法获得，小鼠膀胱癌细胞系MB49来源于ATCC。如图6B和6D所示，其为卡介苗rBCG-S.EGFP和重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP与膀胱癌细胞孵育4小时后结合情况荧光图。将卡介苗rBCG-S.EGFP和重组重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP分别与小鼠膀胱癌细胞系MB49膀胱癌细胞孵育4小时，或加入D-甘露糖竞争性抑制。从图6B和6D可以看出，重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP具有更强的荧光量点和黏附力，当用D-甘露糖进行竞争性抑制，则可以降低重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP的黏附量，说明重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP可以与膀胱癌细胞表面甘露糖残基结合。
同时参见表2，实验数据显示，重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP对膀胱癌细胞具有更强黏附力，而加入D-甘露糖进行竞争性抑制则会降低黏附量，说明重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP是通过转入的FimH蛋白与膀胱癌细胞表面甘露糖残基的结合，来提高卡介苗与膀胱癌细胞的黏附力。
表2 MB49细胞在不同孵育条件下的荧光值(即细黏附内化在细胞中BCG的数量)
Figure GDA0002535205490000111
实施例5：
将卡介苗rBCG-S.EGFP和重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP分别与人膀胱癌细胞系5637、小鼠膀胱癌细胞系MB49、T24和svhuc-1共孵育10小时后，DAPI染细胞核，通过高通量荧光随机拍取区域。其中rBCG-S.EGFP和rBCG-S.Fimh-EGFP按照发明内容部分的方法获得，人膀胱癌细胞系5637来源于中国科学院上海生命科学研究院，小鼠膀胱癌细胞系MB49来源于ATCC，小鼠膀胱癌细胞系MBT-2来源于ATCC。如图7A和7B所示，其为rBCG-S.EGFP和rBCG-S.Fimh-EGFP分别与不同的膀胱癌细胞系孵育10小时后结合情况荧光图。
实验结果显示，重组卡介苗rBCG-S.Fimh-EGFP相对于重组卡介苗rBCG-S.EGFP来说对膀胱癌细胞，具有显著增强的抑制生长作用。
实施例6：
建立小鼠膀胱癌原位模型，实验对象为小鼠膀胱癌细胞系MB49-luc原位植瘤C57小鼠，每组8只。实验设对照组、FimH组、卡介苗组和重组卡介苗组。对照组灌PBS 50μl，FimH组灌注量为5ugFimH蛋白融入50ul的PBS，、卡介苗组灌OD值为0.15的卡介苗50μl，重组卡介苗组灌OD值为0.15的重组卡介苗rBCG-S.FimH50μl，每周灌药两次，持续3周。三周后对实验对象进行测试。
第三周，对四组小鼠IVSI拍活体成像图，小鼠活体成像发现rBCG-S.FimH较BCG组明显降低肿瘤的大小和成瘤率，而BCG组明显优于FimH组，FimH与PBS组相近，如图8A所示。解剖三组小鼠，取膀胱拍照并称重，图8B为三组小鼠肿瘤大小(膀胱大小)对比图，由图可知，rBCG-S.FimH组的肿瘤见效率极其明显，效果显著优于另外两组。图8C为小鼠膀胱HE切片后的图，结果显示，rBCG-S.FimH组中有3只小鼠膀胱的组织正常，显示无肿瘤，无瘤率为3/8*100％＝37.5％，而其他三组均为肿瘤组织，则rBCG-S.FimH组(37.5％)相对BCG组(0％)和FimH组(0％)具有更高的无瘤率。图8D为小鼠活体成像体内荧光值的量化，rBCG-S.FimH组重量远远低于BCG组(p<0.01)，FimH组与对照组PBS组基本一致，两组小鼠膀胱的重量均远高于BCG组，当然，更高于rBCG-S.FimH组。图8E表明rBCG-S.FimH组小鼠膀胱肿瘤重量低于BCG组(p<0.01)，FimH组与对照组PBS组基本一致，BCG组优于FimH组。同时，可参见表3～表4。此外，在C57/BL6小鼠膀胱灌注卡介苗，每组3只，实验设对照组、卡介苗组和重组卡介苗组，检测BCG膀胱灌注4小时后膀胱组织的荧光值(即BCG4小时后能黏附和内化在膀胱组织上的数量)，结果显示重组卡介苗组小鼠膀胱可以黏附和内化更多的卡介苗，参见表5。
实验结果表明：卡介苗组和FimH组均与重组卡介苗组之间具有显著性差异(P＜0.05)。
表3四组小鼠膀胱肿瘤活体成像的荧光值
对照组 FimH组 卡介苗组 重组卡介苗组
1 579000 563000 515000 180000
2 412000 393000 325000 132000
3 341000 315000 156000 98000
4 304000 274000 198000 63000
5 367000 301000 98000 76000
6 334000 258000 183000 0
7 104000 102000 65000 0
8 120000 98000 55000 0
表4四组小鼠膀胱重量(单位：mg)
对照组 FimH组 卡介苗组 重组卡介苗组
1 479 475 315 180
2 412 406 325 132
3 441 431 256 98
4 404 389 198 63
5 367 338 98 76
6 334 301 83 37
7 204 121 45 25
8 120 99 55 29
表5三组小鼠BCG膀胱灌注4小时后膀胱组织的荧光值
对照组 卡介苗组 重组卡介苗组
1 363 2063 5958
2 241 1198 7012
3 402 2147 6213
从肿瘤消除上看，对照组和卡介苗组的肿瘤滞留率为100％，消除率为0％，而重组卡介苗组的肿瘤只剩下62.5％，即彻底消除率为37.5％。
由上所示的小鼠膀胱原位植瘤灌注实验证实rBCG-S.FimH抗肿瘤效应强于BCG，rBCG-S.FimH组小鼠膀胱重量显著低于BCG组、FimH组和PBS组，肿瘤荧光强度显著低于BCG组、FimH组和PBS组，治疗结束后无瘤率高于BCG组、FimH和PBS组。通过表4、图8A、8C、8D表3-5可毫无疑义的获知，FimH组的抗肿瘤效果低于BCG组，与PBS组接近。因此，在很多实验中，发明人重点是将rBCG-S.FimH组与效果更优的BCG组进行比对，更有意义。
实施例7
采用小鼠膀胱灌注实验，来说明重组卡介苗rBCG-S.FimH-EGFP对膀胱上皮细胞的高黏附内化力、对膀胱肿瘤细胞的黏附内化倾向性。灌注后排尿并取膀胱，制作冰冻切片，共聚焦成像来进行研究。图9显示，rBCG-S.FimH对小鼠膀胱具有更强的黏附力和滞留时间。具体地，图9A为小鼠膀胱分别灌注PBS、rBCG-S.EGFP、rBCG-S.FimH-EGFP，4小时后解剖取膀胱制作冰冻切片，结果rBCG-S.FimH-EGFP组比rBCG-S.EGFP组对膀胱正常上皮细胞具有更强的黏附内化力(p<0.01)。图9B为小鼠膀胱癌原位植瘤一周，分别灌PBS、rBCG-S.EGFP、rBCG-S.FimH-EGFP，4h后解剖取膀胱肿瘤制作冰冻切片，结果rBCG-S.FimH-EGFP组比rBCG-S.EGFP组对膀胱肿瘤细胞具有更强的黏附内化能力(p<0.01)。图9C为小鼠正常膀胱冰冻切片4小时后荧光值的量化。图9D为小鼠膀胱肿瘤冰冻切片4小时后荧光值的量化，由图可知rBCG-S.FimH-EGFP的荧光值远远优于另外两组。图9E为相对rBCG-S.EGFP，rBCG-S.FimH-EGFP对膀胱肿瘤具有更强的黏附内化倾向性；图9F为小鼠膀胱肿瘤冰冻切片8小时荧光值的量化；图9G为小鼠膀胱肿瘤冰冻切片24小时荧光值的量化；图9H为小鼠膀胱肿瘤冰冻切片rBCG-S.EGFP、rBCG-S.FimH-EGFP组在4小时，8小时，12小时，24小时后荧光值定量，由此可知，rBCG-S.FimH对小鼠膀胱具有更强的黏附力和滞留时间。总之，通过这些柱状图也可清晰发现，rBCG-S.FimH-EGFP对膀胱上皮细胞和肿瘤细胞具有更强的黏附力和滞留时间。
实施例8
采用C57/BL6小鼠膀胱原位植瘤(MB49-Luc)模型，将其分成4组，各组数量一样，四组分别灌注PBS、FimH、BCG、rBCG-S.FimH，三周后取小鼠膀胱组织进行RT-PCR实验，结果表明rBCG-S.FimH相对于其他三组而言，先天性免疫效应的细胞因子IL-6、TNF-α和GM-CSF表达明显上调(P<0.05)，FimH组与PBS组远低于BCG组，且看不出明显作用；如图10所示，图10A为不同组别先天性免疫效应的细胞因子表达图；图10B为通过灰度分析，对图10A的结果量化图(*P<0.05,**P<0.01)。
总之，通过实验，可明确得出本申请的重组卡介苗具有增强先天性免疫效应的功效。
实施例9
采用C57/BL6小鼠膀胱原位植瘤(MB49-Luc)模型，将其分成4组，各组数量一样，四组分别灌注PBS、FimH、BCG、rBCG-S.FimH，三周后取小鼠膀胱组织进行RT-PCR检测，结果表明rBCG-S.FimH组Th1效应细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ表达上调，效果明显高于BCG组，PBS组和FimH组作用不明显；如图11所示，图11A为RT-PCR检测发现rBCG-S.FimH小鼠膀胱灌注较BCG增强适应性免疫效应图；图11B为图11A的灰度分析结果量化图(*P<0.05,**P<0.01)。
总之，通过实验，可明确得出本申请的重组卡介苗具有增强适应性免疫效应的功效。
实施例10
如图12所示，为测试rBCG-S.FimH和BCG在是否增强人PBMC抗膀胱肿瘤细胞的效力和分泌IL-2的水平，发明人做了多组实验数据。具体地，图12A为提取4个健康志愿者的外周血PBMC，分别与BCG、FimH、rBCG-S.FimH共孵育，48小时后收集上清检测IL-2蛋白的表达量，rBCG-S.FimH组刺激PBMC产生IL-2的能力强于BCG和FimH。图12B为将各组BCG、PBMC与膀胱肿瘤KU7-EGFP细胞共培养，72小时收集上清，ELISA方法检测IL-2蛋白的浓度，发现膀胱肿瘤KU7-EGFP细胞进一步提高rBCG-S.FimH刺激PBMC分泌IL-2的能力。图12C为将图12B中的各组膀胱肿瘤KU7-EGFP细胞进行荧光显微计数(*P<0.05,**P<0.01)。
总之，通过实验，可明确得出本申请的重组卡介苗具有增强人PBMC抗膀胱肿瘤细胞的效力和分泌IL-2的水平。
在本发明中，重组卡介苗能够通过多种作用方式或机理实现协同作用效应，使其具有优异的抗膀胱癌效应。FimH单独作用时，增强免疫效应极低，且其主要是在抗微生物感染的过程中调节免疫，机理与本发明不同，且其几乎没有抗肿瘤疗效，因此，FimH无论是抗肿瘤效应还是增强免疫效应，其效果远远低于BCG，故在上述实施例中，发明人重点是将重组卡介苗与效果高于FimH的BCG组进行对比，且重组卡介苗的各方面功效均显著优于BCG。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 徐州海润生物科技有限公司
<120> 重组卡介苗及其制备方法和应用
<130> 2000072-I
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatgaagcgt ggactgacgg tcgcggtagc cggagccgcc attctggtcg caggtctttc 60
cg 62
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggtgccgc gcggcagcca tatgatgaaa cgagttatta ccctgtttgc tgt 53
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtggtggtg gtggtggtgc tcgagaaact ggaaatcatc gctgttatag ttgtt 55

Claims (13)

1.一种重组卡介苗，其特征在于：其为能够在自身表面表达FimH蛋白的卡介苗，所述重组卡介苗保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为19540。
2.根据权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于：所述重组卡介苗通过其表面表达的FimH蛋白与具有FimH蛋白结合特性的对象进行特异性结合。
3.根据权利要求2所述的重组卡介苗，其特征在于：具有与FimH蛋白结合特性的对象包括肿瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于：所述重组卡介苗为将表面含有FimH蛋白表达基因的质粒转化至野生型卡介苗中所得的新型卡介苗。
5.根据权利要求4所述的重组卡介苗，其特征在于：所述FimH蛋白表达基因通过19ss信号肽表达基因插入所述质粒中。
6.根据权利要求3所述的重组卡介苗，其特征在于：所述肿瘤细胞包括但不限于膀胱癌肿瘤细胞。
7. 根据权利要求5所述的重组卡介苗，其特征在于：所述的19ss信号肽的序列为：TATGAAGCGTGGACTGACGGTCGCGGTA GCCGGAGCCGCCATTCTGGTCGCAGGTCTTTCCG。
8.一种重组卡介苗的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
S1：将质粒作为载体，将FimH蛋白表达基因与19ss信号肽表达基因融合，融合后一起插入所述载体中，则19ss信号肽表达基因便将FimH蛋白表达基因携带到菌体的表面，形成新的质粒；
S2：将S1中获得的新的质粒转化进野生型卡介苗中。
9.根据权利要求8所述的重组卡介苗的方法，其特征在于：在S1中，所述质粒为pMV261；
且S1中需加入酶和酶切引物，该酶的酶切位点为BamHI和HandIII，以使FimH蛋白表达基因与19ss信号肽表达基因的插入BamHI和HandIII中间；所述酶切引物为：
F:5'CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTGCTGT
R:5'AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAAACTGGAAATCATCGCTGTTATAGTTGTT。
10.一种膀胱肿瘤的抑制物，其特征在于：所述抑制物为权利要求1-9中任意一项所述的重组卡介苗，该重组卡介苗为能够特异性结合膀胱细胞以抑制膀胱肿瘤以及能够增强外周血单个核细胞的抗肿瘤效应综合实现更佳的膀胱肿瘤治疗效果。
11.一种免疫效应促进剂，其特征在于：所述免疫效应促进剂包括能够增强BCG诱导的局部先天性免疫效应和适应性免疫效应的促进剂，该促进剂包括权利要求1-9中任意一项所述的重组卡介苗。
12.一种新型卡介苗在制备治疗药物中的应用，其特征在于：所述新型卡介苗为如权利要求1-9中任意一项所述的能够表面表达FimH蛋白的重组卡介苗，所述药物包括抗肿瘤药物和增强免疫效应的药物。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物包括抗膀胱癌药物，所述增强免疫效应的药物包括增强BCG诱导的局部先天性免疫效应的药物和增强适应性免疫效应的药物。
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