KR102260116B1 - 항균 펩타이드 회피 유전자를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 방광암 항암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항균 펩타이드 회피 유전자를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 방광암 항암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 방광암세포의 억제 효과가 우수하고, 방광내 BCG 주입시 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있으므로, 방광암의 항암 치료 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

항균 펩타이드 회피 유전자를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 방광암 항암 치료용 약학적 조성물{Chemotherapeutic and Pharmaceutical Compositions of Recombinant Bacillus Calmette-Guerin (BCG) including biosynthetic genes to avoid antimicrobial peptides for the Bladder Cancer therapy}
본 발명은 항균 펩타이드 회피 유전자를 포함한 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 방광암에 대한 항암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
방광암은 전 세계적으로 11번째 발생빈도를 가진 암으로서, 모든 악성종양 환자의 3 내지 4%를 차지한다. 전 세계적으로 매년 약 20만 명 이상의 새로운 환자가 발생하며, 이 중에서 15만 명 이상이 남성이다. 방광암은 암의 진행경과에 따라 표재성 방광암, 침윤성 방광암 및 전이성 방광암으로 구분된다.
그 중, 표재성 방광암은 TNM 병기에서 Ta, CIS(carcinoma in situ), T1에 해당하는 방광암으로, 전체 방광암의 70 내지 80%를 차지하며, 약 70%는 Ta 병변이며 나머지 30%가 T1 병기로 진단되는데, 이 중 약 30%가 악성도가 높은 grade 3에 해당한다. 표재성 방광암은 50 내지 75%의 환자에서 재발하며, 재발한 암의 20 내지 30%는 보다 높은 병기나 분화도가 나쁜 종양으로 진행되는 것으로 보고되고 있다.
표재성 방광암의 치료를 위하여, 경요도절제술에 따른 병기 확인 후, 재발 및 진행의 위험도에 따라 경요도절제술 및 방광 내 BCG 주입법이 일반적으로 시행되고 있다. 바실러스 칼메트-게렝균(Bacillus Calmette-Guerin: BCG)은 Mycobacterium bovis(M.bovis)를 약독화한 생백신으로서, 1976년 Morales 등이 처음으로 방광 내 주입으로 방광암의 재발률을 줄였다는 보고 이후, 비특이적 면역요법제로 널리 사용되고 있다.
현재까지 BCG의 방광 내 주입요법이 어떠한 작용기전을 통해 항암작용을 나타내는지 명확한 작용기전은 밝혀져 있지 않으나, T cell이 매개하는 면역반응에 의해 발생되는 육아종성 염증반응이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, BCG 방광내 주입시, 방광에서는 BCG를 병원체로 인식하고 이를 저지하기 위하여 선천면역계가 활성화되어 이를 방어하며, 특히 항균 펩타이드인 베타-디펜신(beta-defensin) 2,3 및 카텔리시딘(cathelicidin)의 발현이 증가되어 BCG의 사멸을 유도하는 것으로 여겨지고 있다.
다만, 방광에 주입하는 BCG의 양은 1회에 약 천만(107)개의 CFU이나 실제로 방광표피에 내재화되는 양은 그 중 1% 미만으로 관측되며, 이는 선천면역계의 역할로 BCG의 효용성은 상당히 낮은 것으로 알려져 있다. 즉, 방광내 상피세포의 방어장벽을 극복하기 위하여 생결핵균인 BCG를 과량으로 방광내 주입해야 하기 때문에, BCG 주입요법시 60 내지 80%의 환자에서 경미한 부작용이, 5%의 환자에서 생명을 위협할 수 있는 심각한 부작용이 발생하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 부작용으로 인하여 환자의 치료 순응도가 낮아져, 충분한 횟수의 치료를 시행하지 못하고 중도에 치료가 중단되는 일이 빈번하게 발생한다.
또한, 방광내 BCG 주입요법을 시행한 환자 중 50 내지 90%의 환자에서 재발이 발생하고, 20%의 환자에서 근육침윤성 방광암으로 진행하는 것으로 보고되고 있으나, BCG 주입요법이 실패한 환자에 대한 2차 치료법은 아직 개발되지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 내재화율이 높은 BCG를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2007-0101855호
본 발명의 하나의 목적은 dltA(d-alanyl carrier protein ligase) 유전자를 발현하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균(Bacillus Calmette-Guerin: BCG)을 포함하는 방광암 항암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 dltA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 전기천공(electroporation)하여 바실러스 칼메트-게렝균에 도입하는 단계를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 dltA(d-alanyl carrier protein ligase) 유전자를 발현하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균(Bacillus Calmette-Guerin: BCG)을 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 dltA 유전자를 발현하는 재조합 BCG는 항균펩티드인 HBD-2, HBD-3 및 CAMP의 항균작용을 회피할 수 있고, 방광암 세포에 대해 높은 내재화율을 나타낼 뿐만 아니라, 항암 사이토카인의 분비를 증가시킬 수 있으므로, 방광암 치료 효능 증대 및 재발 방지에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 방광암의 치료 및 재발 방지에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 방광암의 치료와 재발 방지를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구, 구체적으로 방광내 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 및 동결건조제제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 치료제의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가만을 요구하는 동결-건조 조건하에 저장할 수 있다. 즉석의 사용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방광암은 표재성 방광암일 수 있다.
방광내 BCG 주입 요법은 표재성 방광암의 대표적인 치료 방법이나, 현재 사용되는 BCG는 내재화율이 낮고 항균펩티드에 의한 내성이 낮아, 과량으로 처리해야하므로 부작용의 발생 빈도가 높다. 본 발명의 dltA 유전자를 발현하는 재조합 BCG는 방광암 세포에 대해 높은 내재화율을 나타내고, 항균펩티드에 대한 내성이 우수하므로, 종래 BCG 주입요법시 사용되는 용량보다 낮은 용량으로 BCG의 처리가 가능하여 부작용의 발생을 최소화 할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 dltA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 전기천공(electroporation)하여 바실러스 칼메트-게렝균에 도입하는 단계를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 벡터는 pMV306hsp일 수 있다.
본 발명의 dltA 유전자를 발현하는 재조합 BCG의 제조에 있어서, dltA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pMV306hsp 벡터를 전기천공법에 의하여 BCG에 도입할 경우, 재조합 BCG의 제조 수율이 특히 우수하다.
항균 펩타이드 회피 유전자를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 방광암 항암 치료용 약학적 조성물에 따르면, 방광암세포의 억제 효과가 우수하고, 방광내 BCG 주입시 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있으므로, 방광암의 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 dltA(d-alanyl carrier protein ligase) 유전자를 발현하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균(Bacillus Calmette-Guerin: BCG)을 제조하기 위하여 사용한 재조합 발현 벡터를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 재조합 BCG에서 RNA 추출 후 cDNA를 합성하여 dltA 유전자의 발현을 확인한 사진이다.
도 3은 항균 펩타이드에 대한 본 발명의 재조합 BCG의 생존율을 생존/사멸 검정법에 따라 확인한 사진이다.
도 4는 생존/사멸 검정법에 따라 확인한 항균 펩타이드에 대한 본 발명의 재조합 BCG의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 방광암세포주인 5637 및 T24 세포에 대한 본 발명의 재조합 BCG의 내재화를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 재조합 BCG의 내재화 속도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 재조합 BCG의 THP-1 세포 이동성 증가 활성을 확인한 세포 이동 분석 결과 및 이동된 THP-1 세포를 나타낸 그래프이다.
도 8은 방광암세포주인 5637 및 T24에 대한 본 발명의 재조합 BCG의 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 방광암세포주인 5637에 대한 본 발명의 재조합 BCG의 억제 활성을 나타낸 사진이다.
도 10은 방광암세포주인 5637에 대한 본 발명의 재조합 BCG의 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 정위성 방광암 마우스 모델에서 BCG와 본 발명의 재조합 BCG의 방광암 내재화율을 비교한 그래프이다.
도 12는 정위성 방광암 마우스 모델에서 마우스 방광암 세포에 대한 본 발명의 재조합 BCG의 내재화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 마우스 방광암 조직에 대한 생체 내 발광 측정에 따른 본 발명의 재조합 BCG의 억제 활성을 나타낸 사진이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 BCG(rBCG) 제조 및 재조합 BCG의 방광암 세포 억제 효과 분석 방법
1-1. 세포 배양 및 시약 처리
5637 및 T24 인간 방광암 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 37℃ 및 5% CO2의 항온항습 배양기에서 세포를 배양하였고, 2 내지 3일 마다 영양분을 공급하였으며, 컨플루언스(confluence)에 도달한 세포를 사용하였다. 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)(Gibco Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) 및 1% 암포테리신(amphotericin) B/스트렙토마이신(streptomycin)/페니실린(penicillin)(Gibco Laboratories)으로 보충된 권장 배지(recommended medium)에서 배양하였다. 세포주를 PCR 기반 검출 키트(Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)로 평가한 결과, 마이코플라스마(mycoplasma) 오염이 없는 것으로 확인되었다.
1-2. 플라스미드 구조
DltA(d-alanyl carrier protein ligase)(GenBank: D86240.2)를 코딩하는 DNA를 합성 및 클로닝하였다(Macrogen, Seoul, Korea). EcoRI 및 HpaI 제한효소를 사용하여 pMV306 벡터에서 dltA 발현 벡터를 제작하였다(도 1). 클로닝에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
벡터 프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
pMV306hsp dltA forward CGGGCTGCAGGAATTCATGACAGATATTATTAAC 서열번호 1
reverse GATCGTACGCTAGTTAACTCATCCGTTAATTACCTC 서열번호 2
1-3. BCG 배양
Middlebrook 7H9 액체 배지는 7H9 분말(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)을 dH2O 및 0.2% 글리세롤(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 혼합하여 제조하였다. 배지를 오토클레이브하고 완전히 냉각시킨 후, 필터-살균된 0.05% Tween 80(Sigma-Aldrich), 및 10% OADC Enrichment(Sigma-Aldrich) 또는 10% ADC Enrichment(Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 약 15일 동안 37℃의 7H9 배지에서 OD600의 광학 밀도가 2.0에 도달할 때까지 BCG를 배양하였다. 그 후, BCG 세포를 PBS(phosphate buffered saline)에서 100의 감염다중도(multiplicity of infection: MOI)를 나타내는 1×107cells/㎖로 희석하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
1-4. 전기천공법에 따른 재조합 BCG의 제조
BCG 세포를 실온에서 7분 동안 3,000×g로 원심분리하여 수득하고, PBS로 2회 세척하였다. 2mm gap cuvette(BTX, Holliston, MA, USA)은 약 30분 동안 얼음에서 미리 냉각시켜 준비하였다. 1000 MOI의 BCG를 OADC(Sigma-Aldrich)가 함유된 7H9 액체 배지 100㎕에 현탁시켰다. 다음으로, BCG를 오토클레이브된 에펜도르프 튜브에서 2㎍의 플라스미드 DNA와 부드럽게 혼합한 다음, 혼합물을 준비한 gap cuvette에 첨가하고 2500V(BTX)에서 ECM®399 Electroporation 시스템을 사용하여 전기천공하여 dltA 유전자가 재조합된 BCG(rBCG-dltA)를 제조하였다. 그 후, 재조합 BCG를 ADC 및 가나마이신(kanamycin)(10㎍/㎖)을 함유하는 7H9 배지에 재현탁시키고, 37℃에서 2일 동안 배양하였다.
1-5. 역전사 PCR에 의한 cDNA 합성
실시예 1-4에서 제조한 재조합 BCG를 37℃에서 3시간 배양한 다음, 실온에서 7분 동안 3,000xg로 원심분리하여 수득하고, PBS로 1회 세척하였다. TRIzol®Max Bacterial RNA Isolation Kit(Ambion, Austin, TX, USA)를 사용하여 재조합 BCG 균주에서 총 RNA를 분리하였고, 흡광도 정량 분석방법을 통해 총 RNA의 양을 측정하였다.
분리된 총 RNA중에서 0.5㎍의 총 RNA를 하기 표 2의 프라이머를 사용하여 역전사 PCR(RT-PCR)에 의해 cDNA를 합성하였으며, 결과는 제조자의 지시(Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)에 따라 분석하였다. 재조합 BCG의 효율성 측정을 위하여, 합성한 cDNA 중 25ng을 실시예 1-6의 실시간 PCR에서 주형으로 사용하였다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
dltA forward CAATGGCTTAACCAAGCGCC 서열번호 3
reverse TGGGAAACGGCTCACTAACG 서열번호 4
16S rRNA forward TCCCGGGCCTTGTACACA 서열번호 5
reverse CCACTGGCTTCGGGTGTT 서열번호 6
1-6. 전기천공법에 따라 제조된 재조합 BCG의 효율성 측정
실시예 1-4에서 제조된 재조합 BCG 내에 발현된 dltA 유전자의 양을 측정하기 위하여, 실시간 PCR을 기반으로 하는 정량 방법을 수행하였으며, 표 2의 dltA 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 재조합 BCG에서 발현된 dltA 유전자의 양을 측정하였다.
PCR 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 1×PCR 버퍼(0.2mM dNTP, 2.5mM MgCl2, 1㎎/㎖ BSA, 0.5×SYBR Green I 염료(SIGMA S9430), 0.25U Ex Taq HS), 0.4μM 정방향 프라이머, 0.4μM 역방향 프라이머 및 25ng의 주형 DNA. 재조합 BCG의 DNA 증폭은 95℃에서 2분 및 98℃에서 5초 후, 98℃에서 10초, 65℃에서 15초 및 72℃에서 40초를 42사이클 반복하여 수행하였다. DNA 증폭은 각 샘플에 대하여 96-웰 광학 플레이트에서 3회 수행되었다. 실시간 PCR은 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-rad Laboratories, Hercules, California)를 사용하여 수행하였다. 주형 DNA가 없는 대조군과 양성 대조군 DNA를 각 검사에 포함시켰다. dltA 유전자에 대한 표준 곡선 작성을 위하여, 플라스미드 DNA를 연속 희석(10배)하여 각 반응에서 1pg 내지 100ng의 DNA를 포함하는 6-포인트 표준 곡선을 작성하였다. 재조합 BCG의 표준 곡선 작성을 위해 BCG의 상보 DNA를 연속 희석(10배)하여 각 반응에서 1pg 내지 100ng의 DNA를 포함하는 6-포인트 표준 곡선을 작성하였다. 두 표준 곡선의 R2 상관관계(correlation)는 0.99였다. 전기천공법의 효율성은 실시간 PCR에 사용된 총 상보 DNA 25ng 대비 dltA 유전자의 양으로 계산하였으며, dltA 유전자의 표준 곡선을 사용하여 재조합 BCG안에 dltA 유전자에 대한 발현량을 결정하였다. 전기천공법의 효율성 측정을 위해 실시간 PCR을 10번 실험하여 평균값을 통해 결정하였고, 표준 오차(S.E)는 1.65로 확인되었다.
1-7. BCG 내재화 분석
CG 처리된 실시예 1-1의 방광암 세포를 수확하고, 0.2% 알부민, 0.02% Na-EDTA 및 0.01% NaN3을 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. BCG가 내재화된 세포와 BCG가 표면 결합된 세포를 구별하기 위하여, polyclonal rabbit anti-Mycobacterium tuberculosis antibody(1:100)와 함께 4℃에서 30분 동안 세포를 배양하였다. 배양 후, 세포를 세척하고 cyanine 5(Cy-5)-conjugated goat anti-rabbit antibody(1:50)와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 봉입제(mounting medium)를 함유하는 커버 슬라이드 상에 마운트하였다. 핵을 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 대조염색하고 덮개유리를 덮은 후, Zeiss LSM 510 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 형광을 관찰하였다. 각각의 실험에서, DAPI로 염색된 핵(청색)을 가진 세포 100개를 1000×에서 계수하였다.
1-8. 세포 생존율 및 콜로니 형성 분석
96-웰 플레이트에 웰당 5×103개의 실시예 1-1의 세포를 접종하고 다양한 농도의 실시예 1-4의 재조합 BCG 또는 BCG로 처리하였다. 48시간 후, D-PlusTM CCK 키트(Dongins, Seoul, Korea)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 세포 생존율을 분석하였다. 콜로니 형성 분석은 재조합 BCG(rBCG-dltA) 처리 후, 30 MOI에서 수행되었다. 1×103개의 세포를 12-웰 플레이트에 3회 재접종하고 14일 동안 완전 배지(complete medium)에서 배양하여 콜로니가 형성되도록 하였다. 그 후, 4% 파라포름알데히드(Biosesang, Seongnam, Korea)로 콜로니를 고정시키고 0.1% 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich)으로 염색한 다음, 콜로니의 수를 시각적으로 평가하고, 50㎛ 이상의 크기를 갖는 콜로니를 계수하였다.
1-9. 세포 이동 분석
실시예 1-1의 세포를 10% FBS 및 1% 항생제를 함유하는 완전 배지에서 5×104cells/웰로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 접종 24시간 후에, 세포를 10 MOI의 실시예 1-4의 재조합 BCG로 8시간 동안 감염시켰다. 이어서, BCG를 제거하고 무혈청 배지를 첨가하였다. 무혈청 배지에서 THP-1 세포(3×105)를 트랜스 웰(Corwell, Corning, NY, USA)의 상부 챔버에 첨가하고 2시간 동안 배양 하였다. THP-1 세포를 트랜스 웰의 상부 챔버에 첨가하기 전에, 챔버를 무혈청 배지에서 1시간 동안 평형시켜 사용하였다. 플레이트 및 하부 챔버의 세포를 4% 파라포름알데히드(Biosesang)로 고정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich)으로 염색한 후, 이동 세포를 확인하였다.
1-10. ELISA
R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 IL-6(D6050), IL-12(D1200), TNF-α(DTA00C) 및 INF-γDuo-set ELISA 키트(HBD-2(cat# 201-12-1937; SunRed Bio, Shanghai, China), HBD-3(cat# CSB-E14187h; CUSABIO, Houston, TX, USA), CAMP(cat# 201-12-3404; SunRed Bio))를 구입하여 사용하였다. 60mm 세포 배양 접시에 3×105cells/웰로 세포를 접종하였다. 24시간 후, 30 MOI의 BCG 및 실시예 1-4의 재조합 BCG로 각각 세포를 감염시키고, 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 배양 상등액을 수득하고, 4℃에서 10분 동안 2000 내지 3000rpm(1000×g)으로 원심분리 하였다. 수득한 샘플은 즉시 또는 -80℃에 보관하였다가 제조사의 지시에 따라 분석하였으며, 마이크로 플레이트 판독기(SpectraMax i3x, Molecular Devices)를 사용하여 웰의 OD450을 측정하였다.
1-11. 생존/사멸 검정법
2×107cells/100㎕ 밀도의 BCG 또는 실시예 1-4의 재조합 BCG가 처리된 세포에 HBD-2(0.1ng/㎖), HBD-3(0.5ng/㎖) 및 CAMP(0.5ng/㎖)를 1시간 동안 처리한 후, 세포 생존력을 제조사의 지침에 따라 bacterial live and dead assay kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.
1-12. 통계분석
모든 데이터는 3회 이상의 분리된 3반복 실험의 평균±표준편차(SD)로 나타내고, Student's t-test를 이용하여 데이터를 비교하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2. 동물모델에서 재조합 BCG의 방광암 내재화 분석 방법
2-1. 방광암 동물모델 구축 및 재조합 BCG 처리
방광암 동물모델을 이용한 재조합 BCG의 내재화를 평가하기 위하여, 국립암센터에 의뢰하여 방광암 동물모델을 구축하고, BCG와 실시예 1-4의 재조합 BCG의 내재화를 비교하였다. 방광암 동물모델은 BALB/c 마우스를 이용하여 구축하였다. 재조합 BCG, BCG, 대조군 각각 3개의 군으로 각 군마다 20마리의 마우스에 방광암을 유발시키고, 그 중, 방광암이 생성된 마우스에 1주일에 2번씩, 3주에 걸쳐 실시예 1-4의 재조합 BCG 또는 BCG를 처리하였다. 3주간의 처리 후에 방광암 조직을 수득하여 재조합 BCG의 내재화 및 방광암의 억제 여부를 평가하였다. 한편, 실험기간 동안 마우스의 체중에 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
2-2. 마우스 방광암 조직에서 DNA 추출
PureLink™ Genomic DNA mini kit(invitrogen™, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 마우스 방광암 조직에서 총 게놈 DNA를 분리하였고, 결과는 제조자의 지시에 따라 분석하였다. 흡광도 정량 분석방법을 통해 총 게놈 DNA의 양을 측정하였으며, 정량된 DNA 50ng을 실시간(real-time) PCR에서 주형으로 사용하였다.
2-3. 마우스 방광암 조직에서 재조합 BCG의 내재화 측정
실시예 2-3의 DNA에 대하여 정량적 실시간 PCR 기반 방법을 수행하여, 마우스 방광암 조직에서 내재화된 BCG의 양을 결정하였다. 방광암 조직에서 BCG를 검출하기 위하여, 열충격 단백질 유전자(hsp65)를 기반으로 제작한 BCG 특이적 프라이머를 사용하였다. BCG의 DNA를 증폭하기 위하여, hsp65 단편을 표적으로 하였고, 마우스 방광암조직 DNA를 증폭하기 위하여, 마우스 GAPDH 유전자를 표적으로 하였다. 표 3의 GAPDH 특이적 프라이머(250bp 산물)는 Primer-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)로 디자인하였다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
GAPDH forward GCTTAGGTTCATCAGG 서열번호 7
reverse TTCTTCGGTAGTGACA 서열번호 8
PCR 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 1×PCR 버퍼, 0.2mM dNTP, 2.5mM MgCl2, 1㎎/㎖ BSA, 0.5×SYBR Green I 염료(SIGMA S9430), 0.25U Ex Taq HS, 0.4μM 정방향 프라이머, 0.4μM 역방향 프라이머 및 50ng 주형 DNA. BCG의 DNA 증폭은 95℃에서 2분 및 98℃에서 5초 후, 98℃에서 10초, 60℃에서 15초 및 72℃에서 40초를 42사이클 반복하여 수행하였다. 마우스 암조직 DNA 증폭은 95℃에서 2분 및 98℃에서 5초 후, 98℃에서 10초, 45℃에서 10초 및 72℃에서 40초를 42사이클 반복하여 수행하였다. DNA 증폭은 각 샘플에 대하여 96-웰 광학 플레이트에서 3회 수행되었다. 실시간 PCR은 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-rad Laboratories, Hercules, California)를 사용하여 수행하였다. 주형 DNA가 없는 대조군과 양성 대조군 DNA를 각 검사에 포함시켰다. BCG에 대한 표준 곡선 작성을 위하여, BCG DNA 스톡을 연속 희석(10배)하여 각 반응에서 1pg 내지 100ng의 DNA를 포함하는 6-포인트 표준 곡선을 작성하였다. 마우스 방광암조직의 표준 곡선 작성을 위해 무처리 방광암조직군의 DNA를 연속 희석(10배)하여 각 반응에서 1pg 내지 100ng의 DNA를 포함하는 6-포인트 표준 곡선을 작성하였다. 두 표준 곡선의 R2 상관관계(correlation)는 0.99였다. 게놈 DNA 카피 수는 DNA의 양 및 게놈 크기를 사용하여 계산하였으며, 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 마우스 방광암조직에 대한 BCG 세포 수의 비율을 결정하였다.
2-4. 방광암 동물모델에서 방광암 조직의 발광 측정
D-루시페린(Promega)을 Ca2+ 및 Mg2+을 포함하지 않는 DPBS(Welgene) 15㎎/㎖에 용해시키고, 여과 후 0.22㎛ 주사기 필터(BD)를 사용하여 스톡 용액을 제조 하였다. 루시페린 용액(DPBS 중 150㎎/㎏)을 각 마우스(200㎕/마우스)에 복강 내 주사하였다. 5분 후, 이소플루란(JW Pharma)을 사용하여 마우스를 5분 동안 마취시켰다. 발광 신호는 IVIS200(exposure time: auto, binning: 8, F/stop: 1)을 사용하여 판독되었다. 신호 강도 및 체중을 3일 내지 4일 마다 측정하여 ROI 강도를 모니터링하였다. 발광 이미지는 평균 광도(p/sec/cm2/sr)로 표현된 신호 강도와 함께 광자 모드로 표시되었다. Living Image 소프트웨어(Caliper, PerkinElmer)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
실시예 3. 재조합 BCG의 확인
BCG에 실시예 1-2의 플라스미드를 전기천공법으로 도입하여 실시예 1-4의 재조합 BCG를 제조하였다. 재조합 BCG(rBCG-dltA)가 DltA를 발현하는지 확인하기 위하여, 실시예 1-5를 수행하여, 재조합 BCG에서 총 mRNA를 추출하고, 재조합 DNA의 발현을 측정하였다. 또한, 실시예 1-6을 수행하여 실시예 1-4의 재조합 BCG에서 발현된 dltA 유전자의 발현량을 측정하였다.
그 결과, dltA 유전자에 상응하는 cDNA 단편이 검출되었으며(도 2), dltA 유전자의 발현량은 25.7%인 것으로 확인되어, 재조합 BCG의 효율성을 확인하였다.
실시예 4. 재조합 BCG의 항균펩티드에 대한 내성 확인
재조합 BCG가 항균펩티드(antimicrobial peptide: AMP)에 내성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1-11에 따라 항균펩티드인 HBD-2, HBD-3 또는 CAMP를 처리한 후, 재조합 BCG의 생존율을 분석하였다.
그 결과, HBD-2, HBD-3 또는 CAMP를 처리한 BCG의 생존율은 재조합 BCG의 생존율 대비 유의하게 낮음을 확인하여, BCG 균주 대비 재조합 BCG의 높은 AMP 내성을 확인하였다(도 3 및 도 4).
실시예 5. 방광암 세포에서 재조합 BCG의 내재화 확인
BCG 내재화를 평가하기 위하여, 실시예 1-7을 수행하였다. 5637 및 T24 세포에 10 MOI의 BCG 또는 재조합를 처리하고, 8시간 후에 내재화를 평가하였다. 세포 외 BCG는 형광 염료(FITC, 녹색 및 Cy-5, 적색, 병합, 황색)로 표지되고, 세포 내 BCG는 FITC(녹색)로 표지되었다.
그 결과, 내재화 수준은 BCG 대비 재조합 BCG에서 더 높음을 확인하였다(도 5).
또한, 방광암 세포에서 BCG 내재화 속도를 결정하기 위하여, 실시예 1-5를 수행하여 BCG 16S mRNA의 발현을 측정하였다. 내재화 속도는 인간 세포에 대한 BCG 세포의 비율로 결정되었다.
그 결과, BCG 및 재조합 BCG(10 또는 30 MOI)의 내재화 속도를 도 6과 같이 확인하였다. 10 MOI BCG(평균±SD, 0.09±0.01)에서의 비율은 10 MOI rBCG-dltA(1.82±0.185, p<0.01)보다 낮아, 재조합 BCG의 내재화 속도가 빠름을 확인하였다. 10 MOI rBCG dltA의 비율은 30 MOI BCG(1.87±0.185)의 비율과 유사하였다. 또한, 30 MOI rBCG dltA(3.45±0.142, p<0.05)의 비율은 30 MOI BCG 보다 높아, 재조합 BCG의 내재화 속도가 빠름을 확인하였다.
실시예 6. 사이토카인 생성에 대한 재조합 BCG의 영향 확인
암세포에 대한 재조합 BCG의 내재화가 증가하는지 확인하기 위하여, 사이토카인의 발현 증가 여부를 실시예 1-10을 수행하여 분석하였다.
BCG 및 재조합 BCG 처리 후, 방광암 세포에서 IL-6, IL-12, TNF-α 및 INF-γ의 수준을 측정한 결과, 하기 표 4와 같이, rBCG-dltA 처리된 5367 및 T24 세포에서, BCG 처리된 세포 대비 높은 수준의 사이토카인 분비를 확인하였다(모든 사이토킨에 대해 p<0.01).
구분 5637 T24
BCG rBCG-dltA BCG rBCG-dltA
사이토카인 수준
(평균±표준편자)		 IL-6(pg/㎖) 120.51±0.14 255.89±5.05 85.44±1.25 214.13±15.92
IL-12(pg/㎖) 115.68±2.01 164.26±19.09 91.13±1.09 128.87±2.24
TNF-α(pg/㎖) 62.50±2.26 87.09±0.74 129.35±17.94 178.12±0.45
INF-γ(pg/㎖) 83.86±5.00 154.67±1.14 93.29±5.57 121.71±3.81
항균펩티드 수준
(평균±표준편자)		 HBD-2(ng/㎖) 4.08±0.20 6.33±0.12 3.54±0.01 4.91±0.01
HBD-3(ng/㎖) 11.25±0.05 14.12±0.42 10.62±0.03 13.51±0.42
CAMP(pg/㎖) 15.77±0.48 18.41±0.29 14.35±0.17 18.24±0.06
실시예 7. 주화성에 대한 재조합 BCG의 영향 확인
방광암 세포에서 rBCG의 AMP-촉진 효과를 측정하기 위해, rBCG-dltA로 처리된 5637 및 T24 세포에서 항균펩티드인 HBD-2, HBD-3 및 CAMP의 수준을 측정한 결과, rBCG-dltA 처리 세포에서 HBG-2, HBD-3 및 CAMP의 분비가 BCG 처리 세포보다 유의하게 높음을 확인하였다.
또한, 주화성(chemotaxis)에 대한 재조합 BCG의 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-9를 수행하여 단핵구로 분화하기 전인 THP-1 세포의 이동성을 평가하였다.
그 결과, BCG 처리된 5637 세포 대비 재조합 BCG가 처리된 5637 세포에서 THP-1 세포의 더 높은 이동 속도를 확인하였다. 이동 세포의 수는 대조군(18.88±2.90, p<0.05) 대비 BCG 그룹(43.12±2.90, p<0.05)에서 높았고, rBCG-dltA(61.63±3.07, p<0.05) 그룹은 BCG 그룹보다 더 높은 이동을 나타냄을 확인하였다(도 7).
실시예 8. 재조합 BCG 유도 방광암 세포의 감소된 생존력 확인
재조합 BCG의 방광암 세포 억제 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-8을 수행하여 세포 생존율을 평가하였다.
그 결과, 재조합 BCG 처리된 5637 및 T24 방광암 세포의 생존율은 10 및 30 MOI에서 용량-의존적으로 현저히 감소한 반면, BCG 처리된 세포의 생존율은 용량-의존적인 차이를 보이지 않음을 확인하였다(도 8).
실시예 9. 재조합 BCG 유도 방광암 세포의 감소된 콜로니 형성 확인
재조합 BCG의 방광암 세포 억제 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-8을 수행하여 재조합 BCG 또는 BCG 처리된 5637 세포의 콜로니 형성 능력을 분석하였다.
그 결과, 처리 16일 후에 형성된 콜로니의 수 및 크기는 BCG 처리 세포 대비 rBCG-dltA 처리 세포에서 현저히 감소함을 확인하였다(도 9 및 도 10). 재조합 BCG 및 BCG는 5637 세포의 콜로니 형성능(고배율(high power field) 당 콜로니 수, 평균±표준 편차)에 대해 용량-의존적 억제 효과를 보였으나, 10 MOI의 rBCG-dltA(74±8.23[대조군] vs. 28.75±2.87[rBCG-dltA], p<0.05)는 대조군 및 30 MOI의 BCG(67.83±9.39[대조군] vs. 18.25±2.38[BCG], p=0.54) 대비 현저한 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 10. 방광암 조직 내에서 재조합 BCG의 발현 확인
재조합 BCG가 방광암 조직 내에서 dltA를 발현하는지 확인하기 위하여, 방광암 세포 내로 실시예 1-4에서 재조한 재조합 BCG(rBCG-dltA)를 전기천공법을 통하여 형질전환 시킨 후, 실시예 1-5 및 실시예 1-6과 동일한 방법으로 RNA를 추출하여 cDNA 합성하고 표 5의 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 진행하여 mRNA 수준을 측정하였으며, 10반복으로 수행하였다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
pMV306-dltA forward CAATGGCTTAACCAAGCGCC 서열번호 9
reverse GCCAACGACTGAAGTTACGG 서열번호 10
그 결과, dltA 유전자가 방광암 조직 내에서 일정하게 발현되는 것으로 확인되어(표 6), 본 발명에서 유전자를 삽입시키는 전기천공방법의 기술의 신뢰도를 확인하였고, 재조합 유전자가 방광암 조직 내에서 발현되어 기능을 수행할 수 있음을 확인하였다.
Quantity(ng) persentage(%)
13.70336463 27.40672925 ± 1.136
13.93220178 27.86440356 ± 1.144
13.68518233 27.37036466 ± 1.136
14.54683605 29.0936721 ± 1.162
8.218682828 32.87473131 ± 0.914
8.184839526 32.73935811 ± 0.913
7.411041811 29.64416724 ± 0.869
6.840539079 27.36215632 ± 0.835
5.238504126 20.9540165 ± 0.719
4.935108947 19.74043579 ± 0.693
실시예 11. 정위성 방광암 마우스 모델에서 재조합 BCG의 방광암 내재화 확인
마우스의 방광 내에 방광암이 형성되도록 하여 보다 정밀한 정위성 방광암 동물모델로서 정위성 방광암 마우스(Orthotopic Bladder Cancer Mouse Model)를 이용하여 방광암의 생체 환경과 유사한 in vivo 에서 재조합 BCG의 효능을 보다 정밀하게 관찰하였다.
정위성 방광암 마우스 모델에서 BCG의 방광암의 형성 억제 효과를 발휘하기 위한 조직내 BCG 및 재조합 BCG의 투과를 확인하기 위하여, 실시예 2-3에 따라 마우스 방광암 조직에 대한 BCG 세포 수의 비율을 측정하여, 재조합 BCG의 방광암 내재화 수준을 평가하였다.
그 결과, 시간이 지날수록 내재화 수준은 BCG 대비 재조합 BCG(rBCG-dltA)에서 DNA의 탐지되는 속도가 빠른 결과를 보여, 재조합 BGC 투여군에서 기존 BCG와 비교하여 방광암 내로의 내재화가 증가됨을 확인하였다(도 11). 즉, 재조합 BCG의 방광암으로의 내재화가 기존 BCG 보다 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 12. 정위성 방광암 마우스 모델에서 재조합 BCG의 방광암 억제 효과 확인
정위성 방광암 마우스 모델에서 재조합 BCG의 방광암 억제 효과 확인하기 위하여, 실시예 2-4에 따라 실시예 2-1의 방광암 동물모델에서 방광암 조직의 발광을 BCG 투여 후 4일, 7일, 11일, 14일 및 18일째에 측정하여, 방광암의 크기를 분석하였다.
그 결과, PBS 투여군 및 BCG 투여군에서는 처리하지 않은 대조군에 비하여 방광암의 증가율이 낮았으나, 재조합 BCG(rBCG-dltA) 투여군에서는 유의적으로 방광암의 증식이 억제된 것으로 확인되었다(도 12 및 도 13). 즉, 재조합 BCG의 방광암으로의 내재화가 기존 BCG 보다 우수하여 방광암을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 본 발명의 dltA 유전자가 재조합된 BCG는 AMP의 작용 회피 및 방광암 세포에 대한 향상된 내재화 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 항암 사이토카인의 분비를 증가시킨다는 점에서, 본 발명의 재조합 BCG 균주는 기존의 BCG 대비 더 적은양으로도 방광암 치료 효과를 나타낼 수 있어, BCG 요법시 문제되는 부작용을 최소화할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Chemotherapeutic and Pharmaceutical Compositions of Recombinant Bacillus Calmette-Guerin (BCG) including biosynthetic genes to avoid antimicrobial peptides for the Bladder Cancer therapy <130> PN180407-P1 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMV306hsp_dltA_forward <400> 1 cgggctgcag gaattcatga cagatattat taac 34 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMV306hsp_dltA_reverse <400> 2 gatcgtacgc tagttaactc atccgttaat tacctc 36 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dltA_forward <400> 3 caatggctta accaagcgcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dltA_reverse <400> 4 tgggaaacgg ctcactaacg 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA_forward <400> 5 tcccgggcct tgtacaca 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA_reverse <400> 6 ccactggctt cgggtgtt 18 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_forward <400> 7 gcttaggttc atcagg 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_reverse <400> 8 ttcttcggta gtgaca 16 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMV306-dltA_forward <400> 9 caatggctta accaagcgcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMV306-dltA_reverse <400> 10 gccaacgact gaagttacgg 20

Claims (4)

  1. DltA(d-alanyl carrier protein ligase) 유전자를 발현하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균(Bacillus Calmette-Guerin: BCG)을 포함하는, 내재화가 향상된 방광암 항암 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 방광암은 표재성 방광암인 것인, 내재화가 향상된 방광암 항암 치료용 약학적 조성물.
  3. DltA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 전기천공(electroporation)하여 바실러스 칼메트-게렝균에 도입하는 단계
    를 포함하는, 내재화가 향상된 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 벡터는 pMV306hsp인 것인, 내재화가 향상된 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 제조방법.
KR1020190149132A 2018-11-19 2019-11-19 항균 펩타이드 회피 유전자를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 방광암 항암 치료용 약학적 조성물 KR102260116B1 (ko)

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