CN110408640A - 一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用 - Google Patents

一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法及应用。基于融合PCR技术以及T载体克隆技术，首次构建并鉴定PhoP/PhoR基因的置换型缺失突变载体T‑PhoPR，利用电转化技术使得重组的PhoP/PhoR基因缺失突变载体进入结核分枝杆菌感受态细胞，通过染色体同源重组以及多重筛选、鉴定，首次获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。本发明构建的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，同时敲除了参与调控MTB感受宿主微环境变化的PhoP基因和PhoR基因，可降低MTB的耐药性，使其对抗结核药物恢复敏感性，为探索MTB PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制提供一定的帮助，为进一步寻找新的抗结核药物作用靶点奠定基础提供依据。

Description

一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用
技术领域
本发明属于重组基因、基因缺失突变菌株构建技术领域，涉及结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用。
背景技术
结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝核杆菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB) 感染引起的慢性传染病。其可侵及多种脏器，以肺部结核感染最为常见，排菌者为其重要的传染源，是一种严重危害人类健康的世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。目前，耐药结核病仍然是许多国家关注的主要公共卫生问题，世界卫生组织发布的《2018年全球结核病控制报告》公布的新数据显示：2017年，全球估计新发耐利福平结核病（RR-TB）患者55.8万例（范围：48.3-63.9万），56万人中有46万人为多重耐药结核病（MDR-TB），其比例高达82%。随着近年来结核分枝杆菌单纯耐一线抗结核药物以及多重耐药等现象日益严峻，致使中国结核病流行现状趋向复杂化, 然而结核分枝杆菌的耐药机制尚未明确，这给结核病的有效防治造成了极大困难。
结核分枝杆菌双组分系统(two-component system, TCS)广泛存在于MTB中，与MTB应对外界环境刺激发生相应的适应性变化明显相关。结核分枝杆菌PhoP/PhoR双组分系统是MTB全基因组所编码的12个完整的TCS之中最重要、最基本的双组分系统。该系统可调控MTB感受宿主微环境变化，并产生相应的细胞反应，使之能够更好地适应宿主微环境的变化，帮助MTB逃避宿主的免疫监视，同时对结核分枝杆菌在宿主体内的生长、分化、代谢、渗透调节、繁殖、毒性、趋化性、变异性、致病性等方面发挥着重要的调控作用。
结核分枝杆菌PhoP/PhoR双组分系统可分为感受器PhoR和效应器PhoP两部分。PhoR基因与PhoP基因是相互作用的同源对，基因结构关系密切，上游的PhoP基因突变对下游PhoR基因的表达有影响作用，可能的原因是PhoP/PhoR基因是共转录的。当致病性MTB侵入机体并被巨噬细胞吞噬，MTB对宿主微环境的感知主要是通过PhoR感受器实现的，而目前在临床上对致病性MTB引起的结核病的治疗，主要是通过使用一线抗结核药物来杀伤MTB以达到治疗目的。抗结核药物及其药物浓度的不同对结核分枝杆菌生存的微环境来说也是一种环境刺激因素，并且抗结核药物成为PhoR调节MTB适应外界环境的一个重要刺激因子。但由于临床上病人对抗结核药物治疗的依从性不高，使得药物对MTB的杀伤作用不彻底，这有可能是由于MTB的PhoR对自身细胞壁或细胞膜结构的调节抵抗抗结核药物的杀伤作用的结果。PhoP 基因是MTB的一种重要调节因子，可正向调节毒力因子多腺脂和二腺脂。有研究表明，与野生型MTB H37Rv菌株相比，MTB PhoP突变株对万古霉素以及氯唑西林更敏感，因此认为MTB PhoP/PhoR双组分系统在MTB耐药性的产生中具有重要作用，并且进一步推测MTB耐药的机制可能是PhoP/PhoR双组分系统通过调控一个或多个药物外排泵基因的表达以及调控其菌壁通透性，使药物外排或不能进入细胞发挥作用，最终导致MTB耐药。
基因敲除技术是基因功能研究中常用的方法之一，通过特定技术使得生物体某个基因精确失活或缺失，与野生型生物体表型进行比对，并依据其变化而认识该基因的功能。而PhoP/PhoR双组分系统对MTB耐药性的调控机制尚未明确，基于此，我们提出利用基因敲除技术构建一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，具有以下有优势：
第一，与MTB相比，敲除了可调控MTB感受宿主微环境变化的相关基因即PhoP基因和PhoR基因。
第二，通过检测结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株中蛋白PhoP和PhoR的表达量，可分析两种蛋白对菌株在耐药性、耐酸性和渗透性变化上的差异其相应功能特点。
第三，为探索MTB PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制提供一定的帮助，为寻找新的抗结核药物作用靶点提供可能。
发明内容
发明的目的在于提供一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法及其应用，针对多重耐药性结核分枝杆菌的不断出现，结核病的防治以及抗结核药物的研发的迫切性，同时敲除参与调控MTB感受宿主微环境变化的PhoP基因和PhoR基因可降低MTB的耐药性，使其对抗结核药物恢复敏感性，为探索MTB PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制提供一定的帮助，为进一步寻找新的抗结核药物作用靶点奠定基础提供依据。
本发明的目的一是提供一种构建、鉴定、及纯化结核分枝杆菌 PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体的方法， 其利用SOE-PCR技术和T载体克隆技术构建缺失突变片段以及进一步构建缺失突变载体，经基因测序将鉴定成功的MTB PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体命名为T-PhoPR，并利用质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，用DNA凝胶电泳鉴定，同时用紫外分光光度计测定质粒的浓度及纯度。
本发明的目的二是提供一种构建、筛选及鉴定结核分枝杆菌 PhoP/PhoR双组分系统基因缺失突变菌株（命名为：结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株）的方法，其通过电转化技术使得T-PhoPR进入结核分枝杆菌感受态细胞，利用染色体同源重组以及多重筛选、鉴定获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。
其技术方案如下：
结核分杆菌 PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体的构建及鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1、结核分枝杆菌国际标准强毒株（H37Rv菌株）的培养
将H37Rv菌株复苏并别接种于改良罗氏固体培养基中，在隔水式37℃恒温培养箱中培养3-4周，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长，对生长状况不良、污染菌株进行及时的清除。
步骤2、 结核分枝杆菌国际标准强毒株（H37Rv菌株）基因组DNA的制备
用无菌接菌环挑取一满环生长状态良好的菌落置于含有300μl 1×TE buffer溶液的无菌 EP管（2ml）内，经80℃恒温水浴锅中灭活30min，于涡旋震荡器上震荡30min制成菌悬液，利用细菌DNA提取试剂盒提取H37Rv菌株的基因组，取少量溶液经浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并利用紫外分光光度计检测分析DNA的浓度及纯度，其余置于-20℃冰箱中贮存备用。
步骤3、PCR引物设计与合成
从GenBank下载H37Rv菌株PhoP基因、PhoR基因序列及各基因上、下游同源臂序列，使用primer premier 5. 0软件自行设计引物，引物由上海生物工程有限责任公司测序合成。
步骤4、PhoP、PhoR基因上、下游同源臂序列及卡那霉素抗性基因序列PCR扩增与纯化
以提取并鉴定成功的H37Rv菌株基因组DNA为PCR反应模板，分别利用PhoP-N-F、PhoP-N-R、PhoP-C-F、PhoP-C-R、PhoR-N-F、PhoR-N-R、PhoR-C-F、PhoR-C-R引物扩增PhoP基因和PhoR基因的N端同源臂及对应的的C端同源臂。分别取PCR扩增产物5μL经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并将其命名为PhoP-N和PhoP-C、PhoR-N和PhoR-C。以稀释后的PUC19K质粒基因组DNA为PCR反应模板，分别用Kan- F、Kan- R引物扩增卡那霉素抗性基因，取PCR扩增产物5μL经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并将其命名为Kan；利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）对PhoP、PhoR基因上、下游同源臂序列片段以及卡那霉素抗性基因片段进行回收与纯化。
步骤5、基因缺失突变片段PhoPR-K的合成及鉴定
PhoP-N、Kan、PhoR-C按照1:2:1混合作为SOE-PCR反应的模板，在未加入引物的前提下进行首轮循环，随后加入2μl PhoP-N-F、2μl PhoR-C-R进行第二轮循环。取SOE-PCR扩增产物5μl经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并将其命名为PhoPR-K。
步骤6、PhoP/PhoR基因缺失突变载体T-PhoPR的构建与鉴定
将纯化回收的PhoPR-K与T-Vector pMD™19、高效连接液Solution I、去离子水混合作为实验组；T-Vector pMD™19、高效连接液Solution I混合作为阴性对照组1；去离子水、高效连接液Solution I混合作为阴性对照组2。3组分别进行TA连接后，将各组连接产物转入E. coli DH5α感受态，涂布于含有卡那霉素及氨苄霉素的LB双抗固体培养基培养，次日用无菌接菌环挑取各组单个阳性转化子接种于含有卡那霉素及氨苄霉素的LB双抗液体培养基，37℃摇床震荡过夜培养。取菌液作为反应模板行菌液PCR检测，并送至上海生物工程有限责任公司测序，将鉴定成功的载体命名为T-PhoPR。
结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及筛选方法，包括以下步骤：
步骤1、缺失突变载体T-PhoPR的提取与纯化
将含有缺失突变载体T-PhoPR的菌液取10μl，涂布于卡那霉素及氨苄霉素的LB双抗固体培养基培养，挑取单个阳性转化子接种于卡那霉素及氨苄霉素的LB双抗液体培养基，37℃摇床震荡过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，用DNA凝胶电泳鉴定，同时用紫外分光光度计测定质粒的浓度及纯度。
步骤2、结核分枝杆菌菌株感受态细胞的制备
用无菌接种环分挑取适量对数生长期的MTB菌株置于结核分枝杆菌磨菌管，涡旋混合器震摇充分打碎菌膜；将菌液移至无菌离心管中，冰上静置30min，4℃离心，弃上清；无菌去离子水重悬菌体，冰上静置5 min，4℃离心，弃上清，重复3次；加入2ml 10% 预冷甘油重悬菌体，与标准麦氏比浊管比浊后使菌悬液的细菌数约为1.0×108个/ml。
步骤3、缺失突变载体T-PhoPR电转化至MTB菌株构建其缺失突变菌株
将10μl缺失突变载体T-PhoPR与100μl新鲜制备的MTB感受态细胞加入无菌2mlEP管混匀，同时取110μl不加任何质粒的MTB感受态细胞作为空白对照，冰上静置30min后，分别转移到预冷的电击杯中，并分别在电转化仪不同的电压条件下脉冲后迅速转至含卡那霉素的改良罗氏培养基中，37℃培养3-4周后观察菌株生长状况。
步骤4、结核分枝杆菌菌株缺失突变株的筛选、鉴定
利用电转化技术将T-PhoPR电转至MTB菌株中，并利用卡那霉素作为抗生素筛选标记初步筛选阳性克隆，提取阳性克隆基因组DNA作为反应模板，以PhoP、PhoR基因上、下游引物扩增缺失突变菌株，检测待缺失基因片段，从而鉴定缺失突变菌株是否构建成功。
本发明所述结核杆菌感受态细胞的制备及结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株中的结核杆菌适用于临床各种耐药菌株。
本发明的有益效果：
本发明基于融合PCR技术、T载体克隆技术以及电转化技术首次获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，其同时敲除了结核杆菌的PhoP基因和PhoR基因，可降低MTB的耐药性，使其对抗结核药物恢复敏感性，为探索MTB PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制提供一定的帮助，为进一步寻找新的抗结核药物作用靶点奠定基础提供依据。
附图说明
图1：目的基因N端、C端同源臂PCR扩增；
M: DNA markerⅠ; 1: PhoP-N扩增目的片断; 2:PhoP-C扩增目的片断; 3: PhoR-N 扩增目的片断; 4: PhoR-C 扩增目的片断;
图2：Kan抗性基因片段扩增；
M:DNA marker Ⅲ; 1:Kan基因扩增目的片断；
图3：SOE-PCR合成缺失突变片段；
M:DNA marker Ⅲ; 1: PhoP-K缺失突变片段; 2: PhoR-K缺失突变片段; 3: PhoPR-K缺失突变片段；
图4：氨苄霉素/卡那霉素抗性平板培养的缺失突变片段PhoPR-K转化菌；
图5：PhoP/PhoR基因缺失突变载体测序图；
图6： MTB PhoPR基因缺失突变菌株筛选；
1：Control；2：INH-MTB△PhoPR；3：RFP-MTB△PhoPR；4：SM-MTB△PhoPR；5：EB-MTB△PhoPR； 6：MDR-MTB△PhoPR；7：Drug-sensitive-MTB△PhoPR；
图7：PhoPR基因缺失的突变株各组阳性菌落PCR；
M:DNA marker Ⅲ； 1：INH-MTB△PhoPR；2：RFP-MTB△PhoPR；3：SM-MTB△PhoPR；4：EB-MTB△PhoPR； 5：MDR-MTB△PhoPR；6：Drug-sensitive-MTB△PhoPR；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1 结核分枝杆菌PhoP/PhoR双组分系统基因置换型缺失突变载体的构建及鉴定
1. 材料与方法
1.1 主要试剂材料
1.1.1 主要材料：结核分枝杆菌国际标准强毒株（H37Rv）购自中国药品生物制品检定所，由本实验室保存；结核分枝杆菌药物敏感菌株（Drug-sensitive-MTB）、单纯耐异烟肼的结核分枝杆菌临床分离株(INH-MTB)、单纯耐利福平的结核分枝杆菌临床分离株（RFP-MTB）、单纯耐链霉素的结核分枝杆菌临床分离株(SM-MTB)、单纯耐乙胺丁醇的结核分枝杆菌临床分离株(EB-MTB)、耐多药的结核分枝杆菌临床分离株(MDR-MTB) 株由本实验室采集样本、鉴定及保存；E.coli Competent Cells DH5α及T-Vector pMD™19 (Simple)购自宝生物工程有限公司(大连TaKaRa公司)；
TE缓冲液、PCR引物购自上海生物工程有限责任公司；50×TAE缓冲液、卡那霉素、氨苄青霉素购自北京索莱宝科技有限公司；SDS（十二烷基硫酸钠）、Tris 、氯仿、RNase A 、Resazurin sodium salt 购自美国Sigma 公司；2×Pfu Master Mix、2×Taq Master Mix、DP209 DNA凝胶回收试剂盒（离心柱型）、Marker I、 Marker II、 Marker III、TIANpureMidi Plasmid Kit购自天根生化科技（北京）有限公司；电击杯购自德国Eppendorf公司。
1.1.2 主要仪器设备：由新疆石河子大学医学院《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室提供
Research可调式单道移液器购自德国Eppendorf公司；MLS3750型高压灭菌器购自日本三洋公司；普通离心机产自长沙湘仪离心机仪器有限公司；电转仪购自德国Eppendorf公司；SCS-24摇床购自上海市离心机械研究所；DYY-4 型电泳仪购自北京六一厂；Bio-Rad梯度PCR仪、 Bio-Rad 凝胶成像仪购自美国伯乐公司；170S型CO2培养箱购自英国Galaxy公司； 2-16K高速冷冻离心机购自德国Sigma公司； Millipore超纯水装置来源于美国Millipore公司；SYNYO低温冰箱购自日本 SYNYO 公司；Thermo Scientific 1300型二级生物安全柜、Nanodrop 2000型紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.2 实验方法
1.2.1结核分枝杆菌国际标准强毒株（H37Rv菌株）的培养
H37Rv菌株购自中国药物生物制品检定所，由本实验室培养传代保存。将H37Rv菌株复苏并别接种于改良罗氏固体培养基中，在隔水式37℃恒温培养箱中培养3-4周，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长，对生长状况不良、污染菌株进行及时的清除。以上实验操作均需在二级生物安全柜内进行操作，并严格遵守结核病实验室操作的基本规程。
1.2.2结核分枝杆菌国际标准强毒株（H37Rv菌株）基因组DNA的制备
用一次性无菌接菌环挑取一满环生长状态良好的菌落置于含有300μl 1×TE buffer溶液的无菌 EP管（2ml）内，并放入80℃恒温水浴锅中灭活30min，将取的EP管置于涡旋震荡器上震荡30min制成菌悬液，利用细菌DNA提取试剂盒提取H37Rv菌株的基因组，取少量溶液经浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并利用紫外分光光度计检测分析DNA的浓度及纯度，其余置于-20℃冰箱中贮存备用。
1.2.3 PCR引物设计与合成
从GenBank下载H37Rv菌株PhoP基因、PhoR基因序列及各基因上、下游同源臂序列，使用primer premier 5. 0软件自行设计引物(表1)，引物由上海生工生物工程公司合成。
表1 PCR引物
1.2.4 PhoP、PhoR基因上、下游同源臂序列及卡那霉素抗性基因序列PCR扩增与纯化
以提取并鉴定成功的H37Rv菌株基因组DNA为PCR反应模板，分别用PhoP-N-F、PhoP-N-R、PhoP-C-F、PhoP-C-R、PhoR-N-F、PhoR-N-R、PhoR-C-F、PhoR-C-R引物扩增PhoP基因和PhoR基因的N端同源臂及对应的C端同源臂。PhoP基因和PhoR基因均为50μl反应体系：2xPfu PCRMasterMix 12. 5μl，Forward Primer1 μl，Reverse Primer 1 μl，Template DNA 3 μl，ddH2O up to 25 μl；PhoP基因上下游同源臂基因的PCR扩增的反应条件为，PhoP-N ：94℃预变性3 min，94℃变性30 s， 63℃退火30 s，72℃延伸1 min， 72℃最终延伸5 min，共30个循环；PhoP-C：94℃预变性5 min，94℃变性40 s， 62℃退火30 s，72℃延伸1 min， 72℃最终延伸7 min，共30个循环。PhoR基因上下游同源臂基因的PCR扩增的反应条件为，PhoR-N ：94℃预变性3 min，94℃变性30 s， 65.7℃退火30 s，72℃延伸1 min， 72℃最终延伸5min，共30个循环；PhoR-C ：94℃预变性3 min，94℃变性30 s， 65℃退火30 s，72℃延伸1min， 72℃最终延伸5 min，共30个循环。分别取PCR扩增产物5μl经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并将其命名为PhoP-N和PhoP-C、PhoR-N和PhoR-C。以稀释后的PUC19K质粒基因组DNA为PCR反应模板，分别利用引物Kan- F、Kan- R扩增卡那霉素抗性基因，反应体系同上；反应条件： 94℃预变性3 min，94℃变性30 s， 57℃退火30 s，72℃延伸2 min，72℃最终延伸5 min，共30个循环，取PCR扩增产物5μl经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并将其命名为Kan；将鉴定成功的片段均利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）对PhoP、PhoR基因上、下游同源臂序列片段以及卡那霉素抗性基因片段进行回收与纯化。
结果：以H37Rv基因组DNA为模板，使用各自引物分别扩增得到PhoP-N(373bp)、PhoP-C(476bp)、PhoR-N(366bp)、PhoR-C(464bp)，并经DNA凝胶电泳分析，其大小与预期一致（图1）。以pUC19K质粒DNA为模板，使用引物扩增得到1093bp的卡那霉素抗性基因Kan，并经DNA凝胶电泳分析，其大小与预期一致（图2）。
1.2.5 基因缺失突变片段PhoPR-K的合成及鉴定
PhoP-N、Kan、PhoR-C按照1:2:1混合作为SOE-PCR反应的模板，在未加入引物的前提下进行首轮循环，随后加入2μl PhoP-N-F、2μl PhoR-C-R进行第二轮循环。反应体系为104 μl：首轮循环PhoP-N 10μl，PhoR-C 10μl，Kan 20μl，2×Taq PCR MasterMix 50μl，2×TaqPCR MasterMix50 μl，第二轮循环PhoP-N-F 2μl，PhoR-C-R 2μl；反应条件：首轮循环94℃预变性5 min，94℃变性30 s，45℃退火30 min，72℃延伸3 min， 72℃最终延伸10 min，1个循环，第二轮循环94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸2 min， 72℃最终延伸5 min， 30个循。取SOE-PCR扩增产物5μl经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并将其命名为PhoPR-K。
结果：SOE-PCR合成缺失突变片段如图3所示。
1.2.6 PhoP/PhoR基因缺失突变载体T-PhoPR的构建与鉴定
将纯化回收的PhoPR-K与T-Vector pMD™19 (Simple)、高效连接液Solution I、去离子水混合作为实验组；将T-Vector pMD™19 (Simple)、高效连接液Solution I混合作为阴性对照组1，用以检测pMD 19-T Vector是否发生自连；将去离子水,、高效连接液SolutionI混合作为阴性对照组2，用以检测卡那霉素以及氨苄霉素的抗生素活性，反应体系及反应条件见下表
3组均于16℃分别进行TA连接30min后，分别将各组连接产物转入E.coli DH5α感受态，涂布于含有卡那霉素（100μg/ml）及氨苄霉素（50μg/ml）的LB双抗固体培养基，37 ℃恒温过夜培养。于次日用一次性无菌接菌环挑取各组单个阳性转化子接种于含有卡那霉素（100μg/ml）及氨苄霉素（50μg/ml）的LB双抗液体培养基，37℃摇床震荡过夜培养。取菌液作为反应模板行菌液PCR检测。反应体系：T-PhoPR菌液5μl，PhoP -N-F1μl，PhoR -C-R1 μl，2xTaqPCR MasterMix 12.5μl，ddH2O 5.5μl；反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min， 72℃最终延伸5 min，共30个循环；取5μl PCR扩增产物经1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送至上海生物工程有限责任公司测序，将鉴定成功的载体命名为T-PhoPR。最后将鉴定成功的含缺失突变载体T-PhoPR的菌液与甘油以7：3的比例混合后，置于-80℃超低温冰箱内贮存备用。
结果：氨苄霉素/卡那霉素抗性平板培养的PhoPR-K缺失突变片段转化菌，经培养得到若干阳性克隆（图4） 挑取单个阳性克隆接种于卡那霉素及氨苄霉素的LB双抗液体培养基，37℃摇床震荡过夜培养，以其菌液为模板，使用引物PhoP-N-F、PhoR-C-R进行菌落PCR扩增，得到扩增产物PhoPR-K，提取质粒送至基因公司测序，测序结果与预期一致，因此缺失突变载体构建成功，分别命名为T-PhoPR（图5）。
实施例2 结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及筛选方法
1.实验方法
1.1 缺失突变载体T-PhoPR的提取与纯化
将保存于-80℃冰箱的含有缺失突变载体T-PhoPR的菌液取10μl，涂布于卡那霉素（100μg/ml）及氨苄霉素（50μg/ml）的LB双抗固体培养基，37℃倒置过夜培养。挑取单个阳性转化子接种于卡那霉素（100μg/ml）及氨苄霉素（50μg/ml）的LB双抗液体培养基，37℃摇床震荡过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，用DNA凝胶电泳鉴定，同时用紫外分光光度计测定质粒的浓度及纯度。纯化后的质粒放置于-20℃保存备用
1.2结核分枝杆菌菌株感受态细胞的制备
用一次性无菌接种环分别挑取适量对数生长期的结核分枝杆菌菌株置于结核分枝杆菌磨菌管，涡旋混合器6倍转速震摇30min以保证充分打碎菌膜，将菌液移至无菌2ml离心管中，冰上静置30min，4℃ 8000r/min离心10 min，弃上清；500 μl预冷无菌去离子水重悬菌体，冰上静置5 min，4℃ 8000r/min离心10 min，弃上清，重复3次；加入2ml 10% 预冷甘油重悬菌体，与标准麦氏比浊管比浊后使菌悬液的细菌数约为1.0×108个/ml，放置于-20 ℃低温冰箱内贮存备用。
1.3 缺失突变载体电转化各耐药结核分枝杆菌菌株构建其缺失突变菌株
将10μl缺失突变载体T-PhoPR与100μl新鲜制备的结核分枝杆菌感受态细胞加入无菌2mlEP管混匀，同时取110μl不加任何质粒的结核分枝杆菌感受态细胞作为空白对照，冰上静置30min后，分别转移到预冷的1mm电击杯中，并分别在电转化仪电压条件为1700V、1800V、1900V、2000V、2100V、2200V、2300V、2400V、2500V脉冲后迅速转至含卡那霉素（50μg/ml）的改良罗氏培养基中，37℃培养3-4周后观察菌株生长状况。
结果：我们用本方法分别成功构建了新疆地区流行的临床各耐药结核杆菌PhoPR缺失突变菌株包括（INH-MTB△PhoPR；RFP-MTB△PhoPR； SM-MTB△PhoPR； EB-MTB△PhoPR；MDR-MTB△PhoPR； Drug-sensitive-MTB△PhoPR）。即将重组的各缺失突变载体电转化至各耐药结核分枝杆菌菌株感受态中（以不含任何质粒的感受态原始耐药菌菌株作为空白对照），通过各目的基因两侧同源序列进行基因置换型同源重组。结果显示，空白对照组培养基均无结核分枝杆菌生长，重组结核分枝杆菌组的培养基均筛选得到数量不等的结核分枝杆菌特异型阳性菌落(图6)。
1.4 结核分枝杆菌菌株缺失突变株的筛选、鉴定
利用T-Vector pMD™19 (Simple)载体自身的特点，即其仅能在大肠埃希菌菌属的细菌中复制，其自身作为自杀载体应用于结核分枝杆菌目的基因缺失株的构建，随后将含缺失突变片段的各个质粒载体通过电转化技术进入结核分枝杆菌菌株中，并利用卡那霉素作为抗生素筛选标记初步筛选阳性克隆。提取阳性克隆基因组DNA作为反应模板，以PhoP、PhoR基因上、下游引物扩增各缺失突变菌株，检测待缺失基因片段，从而鉴定缺失突变菌株是否构建成功。
结果：分别以提取PhoPR基因缺失的各组结核分枝杆菌阳性菌落基因组DNA为模板，缺失目的基因PhoP/PhoR的上、下游引物进行菌落PCR，未见相应的PCR扩增条带（图7）。
实施例3 MTB PhoPR TCS基因缺失突变对耐药MTB耐药性产生的调控作用及机制的初步研究
1.实验方法
1.1构建PhoPR双组分系统基因缺失突变（包括PhoP、PhoR和PhoP/PhoR基因缺失突变）的各组结核分枝杆菌临床分离株（主要包括新疆地区流行的Drug-sensitive-MTB、INH-MTB、RFP-MTB、SM-MTB、EB-MTB、MDR-MTB）：利用本发明实验方法即基于融合PCR技术以及T载体克隆技术，构建并鉴定各基因的置换型缺失突变载体T-PhoP、T-PhoR和T-PhoPR；利用电穿孔技术将各基因的置换型缺失突变载体分别电转化至各组结核分枝杆菌临床分离株，并鉴定。
1.2利用刃天青显色法检测原始结核分枝杆菌菌株、缺失突变结核分枝杆菌菌株最小抑菌浓度（MIC），依据各药物临界浓度判断菌株是否耐药。
1.3 结果与结论：
1.3.1成功构建PhoP基因缺失突变菌株：Drug-sensitive-MTB△PhoP、INH-MTB△PhoP、RFP-MTB△PhoP、SM-MTB△PhoP、EB-MTB△PhoP和MDR-MTB△PhoP；PhoR基因缺失突变菌株：Drug-sensitive-MTB△PhoR、INH-MTB△PhoR、RFP-MTB△PhoR、SM-MTB△PhoR、EB-MTB△PhoR和MDR-MTB△PhoR；PhoP/PhoR基因缺失突变菌株：Drug-sensitive-MTB△PhoPR、INH-MTB△PhoPR、RFP-MTB△PhoPR、SM-MTB△PhoPR、EB-MTB△PhoPR和MDR-MTB△PhoPR；。
1.3.2与原始耐药结核分枝杆菌菌株相比，缺失突变菌株的各组耐药结核分枝杆菌MIC值均呈现不同程度降低，其中以PhoP基因缺失突变和PhoPR基因缺失突变的结核分枝杆菌临床分离株MIC值的降低程度最为显著。
1.3.3 结核分枝杆菌PhoPR双组分系统对新疆地区广泛流行的耐药结核分枝杆菌的耐药性具有调控作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、结核分枝杆菌 PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体的构建及鉴定方法
通过SOE-PCR技术、琼脂糖凝胶回收试剂盒及琼脂糖凝胶电泳法纯化、构建并鉴定结核分枝杆菌缺失突变片段PhoPR-K，通过T载体克隆技术及基因测序技术将构建鉴定成功的结核分杆菌PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体命名为T-PhoPR，并利用质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，用DNA凝胶电泳鉴定，同时用紫外分光光度计测定质粒的浓度及纯度；
步骤2、结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及筛选方法
通过电转化技术使得10μl T-PhoPR进入100μl新鲜制备的MTB感受态细胞，同时取110μl不加任何质粒的结核分枝杆菌感受态细胞作为空白对照，利用染色体同源重组以及多重筛选、鉴定获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。
2.根据权利要求1所述的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤1中，结核分枝杆菌缺失突变片段PhoPR-K、结核分杆菌PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体T-PhoPR的构建及鉴定。
3.根据权利要求1所述的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤2中，构建的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株敲除了参与调控MTB感受宿主微环境变化的PhoP基因和PhoR基因。
4.权利要求1所述的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，其特征在于，在研究结核分枝杆菌PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制应用。
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