CN109694839A

CN109694839A - 大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株及其构建方法

Info

Publication number: CN109694839A
Application number: CN201711001699.3A
Authority: CN
Inventors: 周敏; 王坤; 卢颖洪
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2019-04-30

Abstract

本发明公开了一株大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株及其构建方法。所述构建方法利用λRed同源重组技术将大肠杆菌E.coli DH5α染色体上编码甲硫氨酸‑tRNA转甲酰化酶的基因fmt和编码肽去甲酰基酶的基因def同时进行基因敲除，经PCR产物电泳和测序鉴定证实，确定所获得的菌株为基因敲除突变株。本发明构建方法简单，且未改变基因组上其他蛋白的表达框，通过氯霉素抗性基因的敲入替换，便于菌株的保藏且有利于后续应用。构建的大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株从基因层面完全消除了PDF的影响，可以作为研究甲酰化‑去甲酰化这一生理过程的原始材料，为蛋白质组学和代谢组学等提供了样品。

Description

大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α的甲酰化基因盒(def-fmt)敲除突变株及其构建方法。

背景技术

大肠杆菌DH5α(简称E.coli DH5α)是一种重要的模式工程菌株，是分子克隆技术中常用的受体细胞大肠杆菌K-12的衍生菌株，在分子生物学、微生物学、细胞生物学及遗传学等研究领域中起着重要的作用。

在工程菌的基因敲除工艺中常用的是同源重组技术，而同源重组与非同源重组相比频率要低得多。目前常用的敲除目的基因的手段是依赖λ噬菌体的Red重组系统，其由gam、bet、exo三个基因组成。gam基因产物为Gam蛋白，分子量为16KD，它能够抑制大肠杆菌内的RecBCD蛋白复合体的核酸外切酶活性，防止线性DNA片段被降解。 bet基因的产物Beta蛋白是一个单链结合蛋白，分子量为28KD，它可以和单链结合促进互补链的退火形成新的双链分子。exo基因的产物为Exo蛋白，该蛋白具有5’-3’方向的核酸外切酶活性，可以从5’端开始降解双链DNA，从而产生一个3’的突出末端。Beta 蛋白和Exo蛋白共同促进线性DNA完成重组过程。同时，表达Red重组系统蛋白的质粒pKD46具有温敏型复制子，当敲除完成时可以简单的通过提高培养温度(37℃)消除重组质粒。

在所有细胞中，翻译起始信号通常为一个甲酰化基修饰的甲硫氨酸(formylated-Met， N-fMet)，它区别于中间延伸的甲硫氨酸(Met)。同样，细菌蛋白的翻译需要N-formylMet-tRNA作为蛋白质合成的起始。这一过程由fmt基因编码的转甲酰酶(Methionyl-tRNAformyltransferase)催化。N-formyl甲硫氨酸的甲酰基团在翻译开始后很快就被水解，由def基因编码的肽去甲酰基酶(Peptide deformylase，PDF)去除N端甲酰化基团。有学者发现N-fMet可以作为蛋白的降解信号，提出fMet/N-degron的存在，并暗示其是细菌多肽链合成速度远高于真核生物的主要原因。然而，对于这一耗能的生理过程(甲酰化-去甲酰化)，至今还未有直接的证据证明其生理学意义。Bienvenut等(Proteomics 2015,15, 2503–2518)对大肠杆菌蛋白质氨基酸的N端进行了蛋白质组学分析，然而其使用的是 PDF抑制剂，并未从根本上消除PDF对蛋白质N端的影响，所得到的结果具有偶然性。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株及其构建方法。

实现本发明目的的技术解决方案如下：

大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株，其是通过以大肠杆菌DH5α的基因组为模版，克隆def基因上游同源臂(Donor A)和fmt下游同源臂(Donor B)；以pKD3 质粒为模版，克隆氯霉素抗性基因片段(cat)；分别回收三个片段并通过Overlap PCR 反应将其连接形成Donor A-cat-Donor B线性打靶片段；将pKD46质粒转化到大肠杆菌 DH5α中，培养并用L-阿拉伯糖诱导制成电转感受态；将线性打靶片段电转上述感受态；用氯霉素抗性的LB固体平板筛选克隆；用PCR筛选出阳性克隆，并培养进行稀释涂板，获得纯合的敲除菌株；对敲除菌进行基因组提取，并用高保真酶对基因组敲除区域进行 PCR扩增，测序验证敲除情况，37℃培养退去pKD46质粒，得到甲酰化基因盒(def-fmt) 敲除突变株。

本发明进一步提供上述大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株的构建方法，具体步骤如下：

步骤1，提取大肠杆菌DH5α的基因组，以其为模版，扩增def基因上游同源臂DonorA，扩增fmt下游同源臂Donor B，以pKD3为模版，扩增氯霉素抗性基因cat，回收纯化三个片段，并进行Overlap PCR将三个片段融合为Donor A-cat-Donor B线性打靶片段；

步骤2，将pKD46质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑单克隆培养并用L-阿拉伯糖诱导制成电转感受态，将线性打靶片段电转上述感受态并用氯霉素抗性的LB固体平板筛选克隆；

步骤3，进行菌落PCR，筛选出阳性克隆，并在含有氯霉素抗性的LB液体培养，再进行稀释涂板，获得纯合的敲除菌株，对敲除菌进行基因组提取，并用高保真酶以敲除菌株的基因组为模版，进行PCR扩增，对PCR片段测序验证敲除情况，37℃培养退去pKD46质粒，得到甲酰化基因盒(def-fmt)敲除突变株。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：

(1)利用λRed同源重组技术敲除大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒(def-fmt)，该方法操作简单，对其他基因的敲除有指导意义；

(2)由于基因fmt下游基因rsmB基因的启动子位于fmt基因内部，做fmt基因的完全敲除势必会影响rsmB基因的表达，本发明采取的框内敲除方法，得到大肠杆菌 DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株，保证了rsmB基因元件的完整性，未引起基因组上其他基因及其表达元件的改变，另外引入氯霉素抗性基因，有利于菌株的分离和保藏；

(3)本发明的大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株从基因层面完全消除了PDF的影响，可以作为研究甲酰化-去甲酰化这一生理过程的原始材料，为蛋白质组学和代谢组学等提供了样品。

附图说明

图1为def-fmt基因盒及其上下游基因相对位置图。

图2为def-fmt基因敲除氯霉素基因(cat)敲入设计图。

图3为Donor A/B和cat基因PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

图4为Donor A/B和cat基因Overlap PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

图5为大肠杆菌DH5αdef-fmt基因敲除突变株的PCR鉴定结果图。

图6为纯合敲除菌株DH5α的PCR鉴定结果图。

图7为纯合敲除菌株pKD46质粒退去PCR鉴定图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例中所用材料如下：

1.细胞来源

大肠杆菌DH5α细胞购自武汉淼灵生物公司。

2.质粒来源

pKD46和pKD3质粒购自武汉淼灵生物公司

3.引物来源

合成引物均来自南京擎科生物科技有限公司

4.主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、甘油、L-阿拉伯糖均购自Sigma公司；Taq mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；高保真phusion酶购自Thermo Scientific公司；0.2cm电转杯购自伯乐(Bio-Rad)公司。

实施例1

1、线性打靶片段构建方法：

a)根据def-fmt基因盒在大肠杆菌DH5α基因组中的位置和其上下游基因及其基因元件相对位置关系(如图1所示)，决定采取框内敲除的方式。设计的打靶片段如图2 所示。根据大肠杆菌DH5α基因组序列和武汉淼灵生物所购得的pKD3质粒序列，设计 3对引物如表1所示。分别以大肠杆菌DH5α基因组和pKD3质粒为模板，经PCR反应，得到Donor A/B和cat片段。PCR反应体系配置如表2所示。

表1线性打靶片段构建所需引物表

表2PCR反应体系配制表

试剂名称	储备液浓度	加入PCR反应体系的体积(μL)
			5×HF Buffer	5×	10
dNTP Mix	10mmol/L	1
			Forward primer	10μmol/L	2.5
Reverse primer	10μmol/L	2.5
			Phusion酶	5U/μL	0.5
DNA模板	50ng/μL	2
			MilliQ H<sub>2</sub>O		31.5
总反应体积		50

PCR结果如图3所示。第一道为Marker，第二道为Donor A片段，长度为551bp；第三道为cat抗性基因，长度为1055bp；第四道为Donor B片段，长度为532bp。

b)回收三个片段，进行Overlap PCR，其反应体系如表3所示。

表3

c)以上Overlap PCR产物进行凝胶电泳，回收大小在2051bp处的片段作为模版重新进行PCR，PCR产物用Dpn I消化后进行凝胶电泳，纯化并回收作为线性打靶片段，终浓度在200ng/μL以上，具体如图4所示。

2、大肠杆菌DH5α电转化感受态的制备：

a)将质粒pKD46转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，30℃孵育1h后涂含氨苄抗生素(amp，100μg/mL)的LB平板中。。

b)挑取上述平板中的单克隆到含氨苄抗生素(amp，100μg/mL)的LB液体培养基中，30℃，230rpm过夜培养。次日按1：100接种到50mL新鲜的LB液体培养基(amp， 100μg/mL)中，相同培养条件继续培养。测OD600＝0.1左右(大约培养100min左右)，加入新鲜配置预过滤除菌的L-阿拉伯糖至终浓度为20mM，诱导Red重组系统蛋白的表达；继续培养至OD600＝0.5左右(大约2h左右)，停止培养，冰上预冷10min。

c)以上预冷的培养液在4℃，4000rpm下离心10min，沉淀所有菌体，倒去上清液，加入预冷的10％甘油(预灭菌)35mL，用枪头重悬菌体，4℃，4000rpm下离心10min。再重复用甘油洗涤菌体3次。最后将所有菌体重悬在500μL10％的甘油里，做成电转化感受态。

d)取100μL上述电转化感受态，加入4uL线性打靶片段(总量1μg左右)，轻轻用枪头混匀，全部加到0.2cm的Bio-Rad电转杯中。电转参数设置为2.5KV，电转时间5ms，进行打靶片段的电转。

e)将上述电转完的感受态迅速加入1mL LB液体培养基，置于37℃摇床，在160rpm下孵育1h，再在4000rpm转速下离心1min后，除去大部分上清，留100μL左右；用移液器轻轻吹起沉菌，然后涂布在含有氯霉素(30μg/mL)的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养4天。

3、PCR筛选阳性克隆及测序验证：

a)4天后上述平板长出1-2mm大小的克隆，根据def-fmt上下游序列，为了减少假阳性，分别在Donor A上游100bp位置设计引物P_A，在Donor B下游100bp处设计引物 P_B，其序列如下表4所示；挑取15个单克隆菌落作为模版进行菌落PCR，筛选敲除阳性克隆。菌落PCR反应如表4所示；

表4

试剂名称	加入PCR反应体系的体积(μL)
		Forward primer	1
Reverse primer	1
		Taq mix	10
Milli Q water	8
		Total	20

b)取上述PCR产物进行凝胶电泳，结果如图5所示，第一道为DNA marker，第二道为负对照，以转化pKD46的大肠杆菌DH5α单菌落为模版；第三道没有加任何模版，作为PCR反应的一个对照；第四到第十八道为选取的1-15号单克隆。由图可知，1号克隆可能为打靶片段单插入的突变，2-15号克隆为阳性克隆，由于氯霉素起到的是抑菌的效果，大部分克隆都会有少量未敲除的DH5α污染，其中2号克隆比较纯；

c)挑取2号克隆，接种到含有30μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在200rpm、37℃下培养3-4天。对菌液分别用LB进行10⁵，10⁶，10⁷的梯度稀释，用稀释过的菌液涂含有氯霉素(30μg/mL)的LB固体平板，37℃培养4天，用长出来的小克隆进行上述菌落PCR，结果如图6所示，前三道同上，后面的空道为纯合的阳性克隆；

d)接种上述单菌落到含有30μg/ml氯霉素的LB液体培养基，在200rpm、37℃下培养4天左右；提取其基因组，用引物P_A，P_B高保真扩增中间区域，PCR反应体系如表1所示，PCR产物送往南京擎科生物科技有限公司进行测序，测序引物为P_A，P_B；测序结果和构建的打靶片段比对结果相似度为100％；

e)对于上述平板，用pKD46特异性引物进行菌落PCR验证pKD46质粒退去情况，结果如图7所示，第一道为DNA marker，第二道为pKD46转化的大肠杆菌DH5α单菌落，后面为纯合的阳性克隆，结果表明pKD46已经从敲除菌株中退去。

序列表

<110> 南京理工大学

<120> 大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株及其构建方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(18)

<400> 1

cgctcgccat accatgaa 18

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(45)

<400> 2

ctccagccta cacaatcgct ccggaatatg taacacttgc aaaac 45

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(45)

<400> 3

gttttgcaag tgttacatat tccggagcga ttgtgtaggc tggag 45

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(42)

<400> 4

caacagcgcg tcgagattcc tccttagttc ctattccgaa gt 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(42)

<400> 5

acttcggaat aggaactaag gaggaatctc gacgcgctgt tg 42

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<400> 6

ccagttgttt caacgtggtg a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<400> 7

taaggctgct ttatgcgcta c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 8

gccgaaagtg accagtcaat 20

<210> 9

<211> 1472

<212> DNA

<213> 大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1472)

<223> def-fmt基因盒的DNA编码序列

<400> 9

atgtcagttt tgcaagtgtt acatattccg gacgagcggc ttcgcaaagt tgctaaaccg 60

gtagaagaag tgaatgcaga aattcagcgt atcgtcgatg atatgttcga gacgatgtac 120

gcagaagaag gtattggcct ggcggcaacc caggttgata tccatcaacg tatcattgtt 180

attgatgttt cggaaaaccg tgacgaacgg ctagtgttaa tcaatccaga gcttttagaa 240

aaaagcggcg aaacaggcat tgaagaaggt tgcctgtcga tccctgaaca acgtgcttta 300

gtgccgcgcg cagagaaagt taaaattcgc gcccttgacc gcgacggtaa accatttgaa 360

ctggaagcag acggtctgtt agccatctgt attcagcatg agatggatca cctggtcggc 420

aaactgttta tggattatct gtcaccgctg aaacaacaac gtattcgtca gaaagttgaa 480

aaactggatc gtctgaaagc ccgggcttaa ggataagaac taacgtgtca gaatcactac 540

gtattatttt tgcgggtaca cctgactttg cagcgcgtca tctcgacgcg ctgttgtctt 600

ctggtcataa cgtcgttggc gtgttcaccc agccagaccg accggcagga cgcggtaaaa 660

aactgatgcc cagcccggtt aaagttctgg ctgaggaaaa aggtctgccc gtttttcaac 720

ctgtttccct gcgtccacaa gaaaaccagc aactggtcgc cgaactgcag gctgatgtta 780

tggtcgtcgt cgcctatggt ttaattctgc cgaaagcagt gctggagatg ccgcgtcttg 840

gctgtatcaa cgttcatggt tcactgctgc cacgctggcg cggtgctgca ccaatccaac 900

gctcactatg ggcgggtgat gcagaaactg gtgtgaccat tatgcaaatg gatgtcggtt 960

tagacaccgg tgatatgctc tataagctct cctgcccgat tactgcagaa gataccagtg 1020

gtacgctgta cgacaagctg gcagagcttg gcccacaagg gcttatcacc acgttgaaac 1080

aactggcaga cggcacggcg aaaccagaag ttcaggacga aactcttgtc acttacgccg 1140

agaagttgag taaagaagaa gcgcgtattg actggtcact ttcggcagca cagcttgaac 1200

gctgcattcg cgctttcaat ccatggccaa tgagctggct ggaaattgaa ggacagccgg 1260

ttaaagtctg gaaagcatcg gtcattgata cggcaaccaa cgctgcacca ggaacgatcc 1320

ttgaagccaa caaacaaggc attcaggttg cgactggtga tggcatcctg aacctgctct 1380

cgttacaacc tgcgggtaag aaagcgatga gcgcgcaaga cctcctgaac tctcgtcggg 1440

aatggtttgt tccgggcaac cgtctggtct ga 1472

<210> 10

<211> 551

<212> DNA

<213> 大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(551)

<223> def-fmt上游Donor A DNA序列，包括和氯霉素基因片段上游重叠的20bp

<400> 10

cgctcgccat accatgaatg cgcccgactc cccactacgg caagctgaaa tgaatgcagc 60

gcgtgcagtt ctccttcaac aaacagtgcg ccggggtaat ctgtcgtcgc cagaagttga 120

ggaggataaa attcgctgtc cgcaggaatt aaatgatggt tgggttgctc caaccaacaa 180

agtgagcttt cgatactctt tcgtggaaat gaaagaaagc gttgtgcctg ccgcaatgta 240

agccctgttt gctgcaatac aaccgcatca atatgcgact gttttgccac ccagtgagcg 300

atacggacca tatcatcgcc gtacaagctg ctgatactca ttaaacgcag ccaaatttct 360

gtatcgacca tccttatctc cctgccataa gcagccttag caatctttgc gattggtcag 420

tgatgctgtc aatcagaggg ggatttgtct agaatagaag aaataatctt tctaactcct 480

gaacacatct ctggagattt atgtcagttt tgcaagtgtt acatattccg gagcgattgt 540

gtaggctgga g 551

<210> 11

<211> 532

<212> DNA

<213> 大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(532)

<223> def-fmt下游Donor B DNA序列，包括和氯霉素基因片段下游重叠的25bp

<400> 11

acttcggaat aggaactaag gaggaatctc gacgcgctgt tgtcttctgg tcataacgtc 60

gttggcgtgt tcacccagcc agaccgaccg gcaggacgcg gtaaaaaact gatgcccagc 120

ccggttaaag ttctggctga ggaaaaaggt ctgcccgttt ttcaacctgt ttccctgcgt 180

ccacaagaaa accagcaact ggtcgccgaa ctgcaggctg atgttatggt cgtcgtcgcc 240

tatggtttaa ttctgccgaa agcagtgctg gagatgccgc gtcttggctg tatcaacgtt 300

catggttcac tgctgccacg ctggcgcggt gctgcaccaa tccaacgctc actatgggcg 360

ggtgatgcag aaactggtgt gaccattatg caaatggatg tcggtttaga caccggtgat 420

atgctctata agctctcctg cccgattact gcagaagata ccagtggtac gctgtacgac 480

aagctggcag agcttggccc acaagggctt atcaccacgt tgaaacaact gg 532

<210> 12

<211> 1013

<212> DNA

<213> pKD3质粒(plasmid pKD3)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1013)

<223> 编码氯霉素抗性基因（Chloromycetin resistance gene）的DNA序列

<400> 12

agcgattgtg taggctggag ctgcttcgaa gttcctatac tttctagaga ataggaactt 60

cggaatagga acttcattta aatggcgcgc cttacgcccc gccctgccac tcatcgcagt 120

actgttgtaa ttcattaagc attctgccga catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa 180

cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga 240

aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca 300

cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca 360

ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt 420

cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac 480

aagggtgaac actatcccat atcaccagct caccgtcttt cattgccata cgtaattccg 540

gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat 600

ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg ttataggtac 660

attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg gatatatcaa 720

cggtggtata tccagtgatt tttttctcca ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg 780

acaactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc 840

ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa 900

cagggacacc aggatttatt tattctgcga agtgatcttc cgtcacaggt aggcgcgccg 960

aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaactaagga gga 1013

<210> 13

<211> 2051

<212> DNA

<213> 大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2051)

<223> 氯霉素抗性基因取代def-fmt基因盒后PCR鉴定产物的测序结果

<400> 13

cgctcgccat accatgaatg cgcccgactc cccactacgg caagctgaaa tgaatgcagc 60

gcgtgcagtt ctccttcaac aaacagtgcg ccggggtaat ctgtcgtcgc cagaagttga 120

ggaggataaa attcgctgtc cgcaggaatt aaatgatggt tgggttgctc caaccaacaa 180

agtgagcttt cgatactctt tcgtggaaat gaaagaaagc gttgtgcctg ccgcaatgta 240

agccctgttt gctgcaatac aaccgcatca atatgcgact gttttgccac ccagtgagcg 300

atacggacca tatcatcgcc gtacaagctg ctgatactca ttaaacgcag ccaaatttct 360

gtatcgacca tccttatctc cctgccataa gcagccttag caatctttgc gattggtcag 420

tgatgctgtc aatcagaggg ggatttgtct agaatagaag aaataatctt tctaactcct 480

gaacacatct ctggagattt atgtcagttt tgcaagtgtt acatattccg gagcgattgt 540

gtaggctgga gctgcttcga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg 600

aacttcattt aaatggcgcg ccttacgccc cgccctgcca ctcatcgcag tactgttgta 660

attcattaag cattctgccg acatggaagc catcacaaac ggcatgatga acctgaatcg 720

ccagcggcat cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg 780

cgaagaagtt gtccatattg gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc acccagggat 840

tggctgagac gaaaaacata ttctcaataa accctttagg gaaataggcc aggttttcac 900

cgtaacacgc cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg ccggaaatcg tcgtggtatt 960

cactccagag cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa 1020

cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acgtaattcc ggatgagcat 1080

tcatcaggcg ggcaagaatg tgaataaagg ccggataaaa cttgtgctta tttttcttta 1140

cggtctttaa aaaggccgta atatccagct gaacggtctg gttataggta cattgagcaa 1200

ctgactgaaa tgcctcaaaa tgttctttac gatgccattg ggatatatca acggtggtat 1260

atccagtgat ttttttctcc attttagctt ccttagctcc tgaaaatctc gacaactcaa 1320

aaaatacgcc cggtagtgat cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc 1380

gatcaacgtc tcattttcgc caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac 1440

caggatttat ttattctgcg aagtgatctt ccgtcacagg taggcgcgcc gaagttccta 1500

tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaactaagg aggaatctcg acgcgctgtt 1560

gtcttctggt cataacgtcg ttggcgtgtt cacccagcca gaccgaccgg caggacgcgg 1620

taaaaaactg atgcccagcc cggttaaagt tctggctgag gaaaaaggtc tgcccgtttt 1680

tcaacctgtt tccctgcgtc cacaagaaaa ccagcaactg gtcgccgaac tgcaggctga 1740

tgttatggtc gtcgtcgcct atggtttaat tctgccgaaa gcagtgctgg agatgccgcg 1800

tcttggctgt atcaacgttc atggttcact gctgccacgc tggcgcggtg ctgcaccaat 1860

ccaacgctca ctatgggcgg gtgatgcaga aactggtgtg accattatgc aaatggatgt 1920

cggtttagac accggtgata tgctctataa gctctcctgc ccgattactg cagaagatac 1980

cagtggtacg ctgtacgaca agctggcaga gcttggccca caagggctta tcaccacgtt 2040

gaaacaactg g 2051

Claims

1.大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，提取大肠杆菌DH5α的基因组，以其为模版，扩增def基因上游同源臂Donor A，扩增fmt下游同源臂Donor B，以pKD3为模版，扩增氯霉素抗性基因cat，回收纯化三个片段，并进行Overlap PCR将三个片段融合为Donor A-cat-Donor B线性打靶片段；

步骤3，进行菌落PCR，筛选出阳性克隆，并在含有氯霉素抗性的LB液体培养，再进行稀释涂板，获得纯合的敲除菌株，对敲除菌进行基因组提取，并用高保真酶以敲除菌株的基因组为模版，进行PCR扩增，对PCR片段测序验证敲除情况，37℃培养退去pKD46质粒，得到甲酰化基因盒敲除突变株。

2.根据权利要求1所述的方法构建的大肠杆菌DH5α的甲酰化基因盒敲除突变株。