CN109929869B - 一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合成谷胱甘肽的基因工程菌，其制备方法及其应用,具体而言，本发明对整合有双功能酶的γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶‑谷胱甘肽合成酶(GshF)的基因工程菌株进行适应性实验室进化，提高了菌株谷胱甘肽产量；然后敲除进化菌株中参与合成L‑高半胱氨酸途径中胱硫醚β‑裂解酶基因，对参与半胱氨酸生物合成途径中的胱硫醚γ‑裂解酶和胱硫醚β‑合酶基因进行高表达调节，再组合表达一个具有多种生物活性的蛋白二硫键异构酶基因，从而获得了具有较高谷胱甘肽产量的基因工程菌株。本发明采用的策略为谷胱甘肽工程菌的遗传操作提供了一种技术借鉴。

Description

一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及利用合成生物学技术构建一种具有高产谷胱甘肽的基因工程菌及其应用。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是细胞内含量最多的非蛋白质类巯基化合物，在由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经过酶催化反应合成。其因γ-羰基和游离的巯基而具有很多生物活性，如抗氧化，脱毒，免疫调节等。体内谷胱甘肽缺失与多种疾病有关，如夸休可尔症、癫痫、阿尔茨海默病等。因此，谷胱甘肽被广泛应用于药品、食品和化妆品等行业。目前，谷胱甘肽在国内主要用于药物领域，作为肝病和癌症治疗后的修复损伤的辅助用药，谷胱甘肽片(商品名：阿拓莫兰)和注射用还原型谷氨酸钠(商品名：古拉丁)，在国外则以食品添加剂及保健品为主。有人预测至2019年，全球谷胱甘肽需求量将达200-300吨。

目前，谷胱甘肽生产的主要方法是酵母发酵法。由于野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)细胞中谷胱甘肽含量较高(0.1-1％)，且二者在廉价的营养贫乏的培养基中也能产生较高生物量，因此谷胱甘肽的生物合成主要在它们中间进行，且已经应用于工业生产中。

谷胱甘肽产量的提高主要依赖于提高细胞内谷胱甘肽含量和提高细胞生物量，细胞内谷胱甘肽含量的提高主要通过菌株的选育进行。为得到谷胱甘肽产量较高的菌株，在经典筛选策略中，物理和化学诱变剂成功用于提高目标菌株(酿酒酵母或产朊假丝酵母)的基因组多样性。经过多次循环的突变和筛选，可以得到谷胱甘肽含量在3-5％之间的菌株。另外一个获得谷胱甘肽高产菌株的有效策略为基因工程的方法，其主要是通过以下方面提高细胞内谷胱甘肽含量：提高谷胱甘肽生物合成途径的潜能、减少谷胱甘肽的降解、促进谷胱甘肽的分泌、对硫同化途径进行代谢工程改造、提高ATP的利用率、调节参与谷胱甘肽生物合成途径中相关酶的转录水平。其中针对谷胱甘肽生物合成途径的调控主要集中在经典的两个酶催化途径，即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS,GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GS,GSH II)催化的两步依赖于ATP的酶催化反应，但在谷胱甘肽的合成过程中，γ-GCS受到终产物GSH的反馈抑制，以避免过度积累，且γ-GC的形成为该途径的限速步骤。最近有研究表明，在一些致病性的革兰氏阳性细菌中，如：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、李斯特菌(Listeria Monocytogenes)、巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)存在一种谷胱甘肽合成酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶(γ-GCS-GS，GshF)，该酶为一双功能酶，同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的催化活性，可以单独催化谷胱甘肽的生成(Janowiak BE,Griffith OW.Glutathione synthesisin Streptococcus agalactiae.One protein accounts for gamma-glutamylcysteinesynthetase and glutathione synthetase activities.J Biol Chem,2005,280:11829-11839；Stout J,De Vos D,Vergauwen B,Savvides SN.Glutathione biosynthesis inbacteria by bifunctional GshF is driven by a modular structure featuring anovel hybrid ATP-grasp fold.J Mol Biol,2012,416:486-494；Vergauwen B,De Vos D,Van Beeumen JJ.Characterization of the bifunctional gamma-glutamate-cysteineligase/glutathione synthetase(GshF)of Pasteurella multocida.J Biol Chem,2006,281:4380-4394；Yang J,Li W,Wang D,Wu H,Li Z,Ye Q.Characterization ofbifunctional L-glutathione synthetases from Actinobacillus pleuropneumoniaeand Actinobacillus succinogenes for efficient glutathione biosynthesis.ApplMicrobiol Biotechnol,2016,100:6279-6289；Wang D,Wang C,Wu H,Li Z,YeQ.Glutathione production by recombinant Escherichia coli expressingbifunctional glutathione synthetase.Ind Microbiol Biotechnol,2016,43:45-53)。GshF功能蛋白的大小与γ-GCS和GS这两个酶的酶蛋白大小之和类似，因此在生物进化上存在着一定的进化关系；但该酶对GSH的反馈抑制不敏感，GSH生物合成的反应过程也类似于上述2个独立的功能蛋白酶催化的反应过程。但在研究中发现在酵母细胞内整合表达GshF能较大幅度地提高细胞内合成GSH的合成，但为了进一步提高GSH产量，尝试进行多重转化，希望通过提高GshF整合基因的拷贝数，即提高基因表达促进GSH的合成，没有获得成功；于是组合了其它两条生物合成途径，使得GSH的合成有了进一步提高(Tang L,Wang W,ZhouW,Cheng K,Yang Y,Liu M,Cheng K,Wang W.Three-pathway combination forglutathione biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae.Microb Cell Fact,2015,14:139)，尽管获得的工程菌具有较高的GSH合成能力，但还不能应用于大规模发酵。

通过基因工程策略得到的菌株谷胱甘肽含量范围为1-2％，比通过经典筛选策略得到的菌株水平低，这种情况的发生可能是由于细胞内谷胱甘肽含量的水平受到复杂调控系统的控制，包括γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的反馈抑制、底物利用度的限制和细胞内氧化还原状态。细胞内调控过于复杂而限制了合理改造谷胱甘肽合成的能力。

对菌株进行基因工程改造，需要全面了解菌株调节谷胱甘肽生物化学和基因调控的信息，与之不同的是，在缺失基因信息的情况下，适应性实验室进化就能够全面推动细胞向某一特定表型发生改变。适应性实验室进化已成功地运用在高产谷胱甘肽菌株的选育中，其中最成功的例子是在双倍体菌株中利用丙烯醛为筛选剂获得谷胱甘肽含量为6％的菌株(Patzschke A,Steiger MG,Holz C,Lang C,Mattanovich D,Sauer M.Enhancedglutathione production by evolutionary engineering of Saccharomycescerevisiae strains.Biotechnol.J.10(11),1719-1726.)，但是其生物量大大降低到出发菌株的50％，谷胱甘肽的高产不仅取决于较高的细胞合成水平，也与生物量直接相关。无论是与基因工程结合，还是独立进行，适应性进化都是一种有效的提高酵母细胞工业上重要特性的策略。

丙烯醛是一种简单的α,β-不饱和醛类，是一种普遍存在的环境污染物，是体内经过调节代谢和氧化应激产生的一种内源性致癌物。亚致死浓度下，进化细胞逐渐积累期望的表型，即对丙烯醛的耐受，同时细胞内谷胱甘肽得到积累。越来越多的证据表明细胞内谷胱甘肽通过直接与丙烯醛反应产生丙烯醛-谷胱甘肽加成产物来减弱丙烯醛对细胞的毒性。

基于以上考虑，针对酵母细胞基因表达的密码子偏好性重新合成GshF基因进行整合转化，在此基础上以丙烯醛为筛选剂进行适应性进化，在筛选得到的谷胱甘肽高产菌株中进行基因工程操作，将胱硫醚γ-裂解酶(CYS3)和胱硫醚β-合酶(CYS4)在进化菌株中高表达，使细胞内合成谷胱甘肽的氨基酸前体半胱氨酸含量升高，从而促进谷胱甘肽产量的提高。但是酿酒酵母细胞中存在胱硫醚γ-合酶(STR2)和胱硫醚β-裂解酶(STR3)，可以将半胱氨酸通过胱硫醚转化为同型半胱氨酸，其中胱硫醚β-裂解酶(STR3)是关键酶，这个转化过程阻碍了谷胱甘肽的生物合成。同时，在过度表达重组蛋白可能会在细胞内产生非折叠蛋白反应，对细胞生长和谷胱甘肽生物合成造成不良影响，导致细胞生物量降低，并且谷胱甘肽产量下降。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种谷胱甘肽高产的基因工程菌，其制备过程主要包括以下步骤：1.将营养缺陷型菌株恢复为原养型；2.整合表达生物催化合成谷胱甘肽的双功能酶；3.以丙烯醛为筛选剂进行适应性实验室进化；4.降低或消除宿主细胞内源性的胱硫醚β-裂解酶活性；5.通过提高宿主细胞参与半胱氨酸生物合成的两个酶，即胱硫醚γ-裂解酶和胱硫醚β-合酶的表达，提高细胞内半胱氨酸的合成，从而提高谷胱甘肽含量；6.在宿主细胞中转入蛋白二硫键异构酶(PDI)，降低过度表达重组蛋白引起的非折叠蛋白反应，即获得具有高谷胱甘肽含量且生物量高的工程菌株。

本发明的一个目的是解决营养缺陷型的基础工程菌株在简单的无机盐培养基中不能生长的问题。提供了一种回复为原养型的，可以利用简单的无机盐培养基生长至一定生物量的酿酒酵母细胞。

本发明的另一个目的是解决酿酒酵母细胞中谷胱甘肽水平受到复杂调控系统控制的问题，提供一种以构建的基础工程菌株为出发菌株，以丙烯醛为筛选剂进行两轮适应性实验室进化筛选得到的工程菌株，因为宿主细胞控制谷胱甘肽含量的调节系统过于复杂，不利于生物合成的工程菌株构建。

本发明的另一个目的通过对进化菌株和基础菌株的代谢产物分析，确定了提高宿主细胞合成谷胱甘肽潜能的分子机制，即促进了半胱氨酸合成途径中含巯基中间体的积累，进而促进了谷胱甘肽的合成。

本发明的另一个目的是解决酿酒酵母细胞存在胱硫醚γ-合酶和胱硫醚β-裂解酶将半胱氨酸通过胱硫醚转化为同型半胱氨酸的问题，其中胱硫醚β-裂解酶为关键酶。提供一种降低或消除宿主细胞内半胱氨酸转化为同型半胱氨酸的关键酶―胱硫醚β-裂解酶的酿酒酵母工程细胞。半胱氨酸是酿酒酵母细胞生物合成谷胱甘肽的关键前体，半胱氨酸转化为同型半胱氨酸不利于谷胱甘肽的积累。

本发明的另一个目的是解决酿酒酵母细胞内大量积累的同型半胱氨酸和胱硫醚转化为半胱氨酸的问题。提供一种高表达半胱氨酸生物合成途径中两个关键酶胱硫醚γ-裂解酶和胱硫醚β-合酶的酿酒酵母工程细胞。

本发明的另一个目的是解决过度表达同源蛋白导致影响细胞生长的未折叠蛋白反应。提供一种表达由弱启动子调控的蛋白二硫键异构酶的酿酒酵母工程菌株。

本发明以构建的工程菌株为出发菌株，通过适应性实验室进化，整体优化酿酒酵母细胞合成谷胱甘肽系统。

本发明提供了一个获得具有高产谷胱甘肽功能的酿酒酵母细胞，该细胞能稳定高效合成具有生物活性的谷胱甘肽

本发明通过在宿主细胞内降低或失活胱硫醚β-裂解酶，同时高表达胱硫醚γ-裂解酶和胱硫醚β-合酶，提高细胞代谢池内半胱氨酸的浓度。半胱氨酸是生物合成谷胱甘肽的重要前体，体外添加谷胱甘肽的前体：谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸，尤其添加半胱氨酸对细胞内谷胱甘肽含量的影响最大。通常状态下，与谷氨酸相比，细胞内半胱氨酸的浓度很低，为提高细胞代谢池半胱氨酸的浓度并防止其转化为同型半胱氨酸，本发明采用整合型表达载体pδGAP′g、pδGAPh(Tang L,Wang W,Zhou W,Cheng K,Yang Y,Liu M,Cheng K,WangW.Three pathway combination for glutathione biosynthesis in Saccharomycescerevisiae.Microb cell fact,2015,14:139)和强启动子酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(GAP)或巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子GAP′的构建融合表达质粒，通过转化实现目的基因整合到宿主基因组，从而实现胱硫醚γ-裂解酶和胱硫醚β-合酶在细胞中高表达；同时失活胱硫醚β-裂解酶，从而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进谷胱甘肽的合成。

本发明通过在经过适应性实验室进化和一系列基因工程改造后所得的融合宿主细胞中表达蛋白二硫键异构酶，提高菌株的生物量，进而提高谷胱甘肽的产量。很多蛋白质折叠的成熟过程是在内质网中进行的，并受到非折叠蛋白反应的调节。非正确折叠的蛋白质的积累会激活内质网效应，对细胞的生长造成严重影响，阻碍谷胱甘肽的积累。本发明在强启动子酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子GAP或巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子GAP′调控下融合表达了参与谷胱甘肽生物合成的双功能酶GshF、参与半胱氨酸生物合成的胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4；为增加融合蛋白质的正确折叠，在弱启动子酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因启动子PGK的控制下表达蛋白二硫键异构酶PDI1，从而促进蛋白质的正确折叠，减少内质网应激，增加细胞生物量，提高谷胱甘肽的产量。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明的技术方案之一是提供的一种构建具有较高谷胱甘肽产量的基因工程菌的技术方法，其制备过程包括：

i)对基础菌株的营养缺陷型基因进行回复突变；

ii)整合转化酵母细胞密码子偏好优化合成谷胱甘肽的双功能酶GshF基因，获得基础工程菌株；

iii)对构建的基础工程菌株进行以丙烯醛为筛选压力的适应性实验室进化；

iv)敲除宿主菌内源性的胱硫醚β-裂解酶(STR3)基因；

v)提高宿主菌中内源性胱硫醚γ-裂解酶(CYS3)基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进半胱氨酸的生物合成；

vi)提高宿主菌中内源性胱硫醚β-合酶(CYS4)基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进半胱氨酸的生物合成；

vii)在宿主菌内转入二硫键异构酶基因。

所述iv)、v)、vi)、vii)以任意顺序操作完成后即得到所述具有较高谷胱甘肽产量的基因工程菌，其中筛选标记可以利用Cre-loxP重组系统表达Cre重组酶，重组切除基因组中loxP-marker-loxP结构中loxP位点间的筛选标记(Marker)基因，留下一个loxP位点，从而实现Marker可再重复使用(Güldener U,Heck S,Fielder T,Beinhauer J,HegemannJH.A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast[J].Nucleic Acids Research.1996,24(13):2519-2524.)；所述的ii)可重复多次整合转化酵母细胞密码子偏好优化合成谷胱甘肽的双功能酶GshF基因，获得更高产的工程菌株。

在本发明的实施方案中,采用的宿主菌是酿酒酵母，宿主细胞自身具有较高的谷胱甘肽含量，为提高宿主细胞谷胱甘肽产量，将营养缺陷型菌株回复为原养型，进行以丙烯醛为选择压力的适应性实验室进化，高表达编码优化的双功能酶GshF(SEQ ID NO.1)，通过同源重组的方法敲除胱硫醚β-裂解酶STR3基因，同时高表达胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4基因。

本发明的一个实验方案中提供了一个利用丙烯醛为选择压力筛选高产谷胱甘肽酿酒酵母菌株的技术方法。丙烯醛是简单的α,β-不饱和醛类，为亲电子试剂，其对细胞的主要毒性表现为与蛋白质中巯基结合，使蛋白质失去活性。丙烯醛可以用作筛选高产谷胱甘肽酿酒酵母的选择压力。用亚硝基胍处理与不处理的两种菌株(用亚硝基胍进行诱变处理的菌株命名为W303-1b/GshF^PTm，没有用亚硝基胍诱变处理的菌株为W303-1b/GshF^PT)，以丙烯醛为选择压力，在添加与不添加低浓度亚硝基胍两种条件下进行适应性实验室进化(适应性进化过程中添加低浓度的亚硝基胍标记为AM，没有添加低浓度亚硝基胍标记为A)，经过第一轮进化实验，筛选得到谷胱甘肽高含量菌株W303-1b/GshF^PT-6，经过第二轮进化实验，筛选得到谷胱甘肽高含量菌株W303-1b/GshF^PT-6-18。

本发明的一个实施方案中提供了一个敲除胱硫醚β-裂解酶STR3基因所使用的具有SEQ ID NO.2所示碱基序列的同源双交换整合框。利用含有与胱硫醚β-裂解酶STR3基因同源片段的引物STR3_H1和STR3_H2，以质粒pδGAPz模板，使用PCR方法获得如SEQ ID NO.2所示的含有STR3同源片段、酿酒酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子GAP、酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因终止子Tpgk、筛选标记基因Zeocin的同源双交换整合框。其中，第1-45和2205-2249碱基序列为STR3同源片段、第46-718碱基序列为酿酒酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子GAP、第719-1003为酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因终止子Tpgk、第1004-2204包括Zeocin基因启动子、开放阅读框和终止子的整个表达框，通过LiAc转化法将同源双交换整合框整合至酿酒酵母基因组中，实现胱硫醚β-裂解酶STR3基因的敲除。

本发明的一个实施方案中提供了一个提高宿主细胞代谢池内半胱氨酸合成的技术方法。首先利用同源双交换整合框敲除胱硫醚β-裂解酶STR3基因，再以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用PCR反应和DNA连接的基因克隆方法获得编码胱硫醚γ-裂解酶基因CYS3(SEQ ID NO.3)和胱硫醚β-合酶基因CYS4(SEQ ID NO.4)的DNA片段，然后分别亚克隆到含有酿酒酵母和毕赤酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子(Tang L,Wang W,Zhou W,Cheng K,Yang Y,Liu M,Cheng K,Wang W.Three pathway combination for glutathionebiosynthesis in Saccharomyces cerevisiae.Microb cell fact,2015,14:139)，即获得了2个整合型的表达载体pδGAPh-CYS3和pδGAP′g-CYS4，然后利用限制性内切酶Not I线性化后通过LiAc转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组的δ位点中，通过潮霉素和遗传霉素即可筛选获得阳性克隆，这样获得工程菌具有较高的合成半胱氨酸潜能的工程菌株W303-1b^PT-6-18/ΔSTR3、W303-1b^PT-6-18/CYS3/CYS4和W303-1b^PT-6-18/ΔSTR3/CYS3/CYS4，再与双功能酶GshF基因组合表达，实现了谷胱甘肽的高效合成。

本发明的另一个实施方案中也提供了一个提高宿主细胞生物量的技术方法。首先以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用PCR反应和DNA连接的基因克隆方法获得蛋白二硫键异构酶基因(PDI1)的DNA片段，然后亚克隆到含有酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因的启动子(组成型启动子(PGK))的整合型表达载体pδPGKz中，其中质粒载体pδPGKz是用酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因的启动子PGK置换pδGAP′z中毕赤酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子GAP′的衍生载体，即获得了整合型的表达载体pδPGKz-PDI,然后利用限制性内切酶Not I线性化后通过LiAc转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组的δ位点中，通过博来霉素即可筛选获得阳性克隆。

本发明技术方案之二是提供了本发明技术方案之一的制备方法制备得到的基因工程菌。所述的基因工程菌的保藏编号为CGMCC NO.13102。

在本发明的实施方案中，获得1株具有较高谷胱甘肽产量的基因工程酿酒酵母细胞，生物材料样品保藏信息：

分类命名：酿酒酵母；拉丁学名：Saccharomyces cerevisiae；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC NO.13102，其保藏日期分别为：2016年10月12日。

本发明技术方案之三是提供了本发明技术方案之二的基因工程菌在高产合成谷胱甘肽中的应用。

相比现有技术，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明基于回复原养型的单倍体工程酵母细胞实现了利用丙烯醛为选择压力的适应性实验进化，并获得了高产谷胱甘肽的工程菌株；

2.本发明通过对进化菌株的代谢产物分析，确定了促进谷胱甘肽合成的分子和代谢基础，为提高半胱氨酸的合成和促进谷胱甘肽积累提供遗传操作方案；

3.本发明通过蛋白二硫键异构酶的表达，降低多基因组合表达的非折叠蛋白效应，从而促进了功能蛋白的表达，从而提高谷胱甘肽的合成；

4.使用本发明的方法获得基因工程菌，能大大提高原料利用效率，降低生产成本，可适用于高密度工业放大发酵生产。

附图说明

图1.整合有双功能酶GshF的原养性型和缺陷性型工程菌株阳性克隆的PCR鉴定。

A.泳道1-5是缺陷型阳性克隆W303-1b/GshF；B.泳道1-5是原养型阳性克隆W303-1b/GshF^PT；CK为阳性质粒对照。

图2.适应性实验室进化示意图。

图3.敲除酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶同源重组质粒的构建以及同源替换基因组的示意图。

图4.质粒pδGAPh-CYS3，pδGAPh-CYS4，pδPGKz-PDI构建示意图。a.质粒质粒pδGAPh-CYS3；b.质粒pδGAPh-CYS4；c.质粒pδPGKz-PDI。

图5.同源重组敲除酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶基因工程酵母菌的PCR鉴定。CK^-，没有敲除胱硫醚β-裂解酶基因的酿酒酵母基因组PCR扩增结果；CK+，构建测序正确但没有转入酿酒酵母基因组的阳性质粒PCR扩增结果。

图6.同源整合酿酒酵母胱硫醚γ-裂解酶、胱硫醚β-合酶、蛋白二硫键异构酶因工程酵母菌的PCR鉴定。CK^-，没有敲除胱硫醚β-裂解酶基因的酿酒酵母基因组PCR扩增结果；CK+，构建测序正确但没有转入酿酒酵母基因组的阳性质粒PCR扩增结果。

图7.工程菌株W303-1b/GshFPPT-6-18/△STR3/CYS3/CYS4/PDI的谷胱甘肽生物合成途径

具体实施方式

本发明公开了构建一个具有高产量谷胱甘肽的工程菌。其中所述的胱硫醚β-裂解酶、胱硫醚γ-裂解酶、胱硫醚β-合酶、蛋白二硫键异构酶等基因，简介如下：

1.本发明中编码胱硫醚β-裂解酶的多核苷酸

酿酒酵母细胞中有胱硫醚γ-合酶和胱硫醚β-裂解酶，将半胱氨酸通过胱硫醚转化为同型半胱氨酸，其中胱硫醚β-裂解酶为关键酶。在实施例中工程化的酿酒酵母基因组中有胱硫醚β-裂解酶STR3基因，其相应的同源DNA片段是直接从质粒pδGAPz中利用PCR方法扩增获得的，通过同源替换的方式整合到酿酒酵母基因组中，使得酿酒酵母中的胱硫醚β-裂解酶基因失活。

2.本发明中编码酵母胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4的多核苷酸

在实施例中工程化的酿酒酵母细胞内高表达CYS3、CYS4基因，其相应的多核苷酸是直接从宿主细胞酿酒酵母W303-1b基因组中利用常规Nested-PCR方法扩增获得的，然后与酿酒酵母GAP启动子或毕赤酵母GAP′启动子和酿酒酵母PGK终止子构建成融合基因，再通过同源替换的方式到整合到酿酒酵母基因组中，目的是促进细胞代谢通路向着半胱氨酸合成方向进行，进而提高细胞谷胱甘肽的水平；对这2个功能酶基因而言，它们不仅限于细胞自身的功能基因，本发明的保护范围只受权利要求书的限制。将实施例中所使用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其它组成型表达的启动子(如ADH1启动子、TPI启动子等)或诱导型启动子(如GAL1启动子)和表达载体，或这2个功能基因也可以用相同功能的其它多核苷酸替换，这是本领域工作人员所能够理解并实现的。

3.本发明中酿酒酵母蛋白二硫键异构酶PDI的多核苷酸

在实施例中工程化的酿酒酵母细胞内表达的二硫键异构酶PDI基因，其相应的多核苷酸是直接从酿酒酵母基因组中利用常规PCR方法扩增获得的，然后与酿酒酵母磷酸甘油酸激酶PGK启动子和PGK终止子构建成融合基因，再通过同源替换的方式到整合到酿酒酵母基因组中，其他伴侣蛋白也能促进蛋白质的正确折叠；说明这个功能基因也可以用相同功能的其它多核苷酸替换，这是本领域工作人员所能够理解并实现的。

通过以下的实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于实施例。

需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法。

实施例1：营养缺陷型菌株的回复突变

步骤一：营养缺陷型酿酒酵母菌株的回复

参考文献(周文龙，唐亮，成凯，刘忞之，杨燕，王伟.CRISPR/Cas9介导的高产谷胱甘肽原养型酵母工程菌的构建.生物工程学报，2017,33(12):1-10)报道的方法进行宿主菌w303-1b的5个营养缺陷型基因的回复突变。其实验操作过程涉及到两个常规的实验操作方法如下：

酿酒酵母感受态细胞制备及LiAc转化方法

(1)挑单克隆接菌于25mL液体YPD培养基中，30℃，250rpm培养16-18h至OD₆₀₀约为0.8-1.0。

(2)将菌液分装于数个1.5mL EP管中(4管为一次转化的感受态量)，每管1.5mL，1500rpm离心5min，弃上清，750μL灭菌水清洗后1500rpm离心5min，弃去上清。

(3)每管用30μL，100mM LiAc重悬并将4管合并为一管，12000rpm离心15s，弃上清，用50μL 100mM LiAc重悬即为感受态细胞(现用现做)。

(4)将2mg/mL的单链鲑鱼精载体DNA(ssDNA)煮沸5min，迅速置于冰上冷却。

(5)感受态细胞12000rpm离心15s，弃上清。.

(6)按顺序加入240μL 500g/L PEG(PEG 3350)，36μL LiAc(1M)，25μL ssDNA，50μL质粒(2-3μg，若线性化整合则需10-20μg线性化质粒)，漩涡剧烈混匀1min。

(7)30℃静置孵育30min，42℃水浴热击60min，其间颠倒混匀数次。

(8)离心弃上清，加入YPD培养基复性2h。

(9)离心弃去部分上清，吹打混匀，涂于含有相应抗生素平板或缺陷性筛选标记的平板上筛选，30℃培养3d。

(10)将获得的菌株转接于含高浓度抗生素或缺陷性筛选标记的平板上进行高拷贝整合阳性克隆复筛。

酿酒酵母基因组DNA提取：采用北京康为世纪生物科技有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作步骤如下：

(1)挑单克隆接菌于10mL液体YPD(10g/L yeast extract,20g/L tryptone，20g/Lglucose)培养基中，30℃，250rpm培养15-20h(对数期)。

(2)12000rpm，1min多次离心收集菌体于1.5mL EP管中(4-5次)，离心弃上清。

(3)酵母细胞壁的去除：向菌体中加入600μL Lyticase Working Buffer(使用前加入β-巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，并加入5μL Lyticase(10U/μL)，充分混匀，30℃处理30min，4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。

(4)向沉淀中加入200μL Buffer GTL，加入40mg玻璃珠(Glass Beads)，涡旋5min，12000rpm离心5min，将上清移到一个新的离心管中。

(5)加入20μL Proteinase K，混匀，55℃振荡水浴1h，温育期间每20-30min颠倒混匀一次，然后加入10μL浓度为20mg/mL的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。

(6)13000rpm离心5min，小心吸取上清至新离心管中。

(7)加入200μL Buffer GL，充分混匀。70℃孵育10min，其间颠倒混匀数次。

(8)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心，使管壁和管盖上的液体集中到管底。

(9)将步骤8所得溶液和沉淀全部加入到已装入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(10)向吸附柱中加入500μL Buffer GW1，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(11)向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(12)12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

(13)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入100μLBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

目的基因转化进入工程菌后都需要提取酿酒酵母基因组，通过PCR鉴定酵母基因组的方式确定目的基因是否转入酿酒酵母工程菌中，PCR鉴定完成后以各基因的引物测序进一步进行鉴定。

步骤二、双功能酶基因GshF的转化

根据酵母基因编码的偏好性，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成编码GshF的基因(SEQ ID NO.1)，即插入到克隆载体pGH上，即质粒pGH-GshF，然后用引物对GshF_1/GshF_3和GshF_2/GshF_3和质粒为模板PCR扩增目的基因，然后分别插入到pδGAPh和pδGAP'g中，即得到pδGAPh-GshF和pδGAP'g-GshF。首先使用质粒pδGAPh-GshF参照上述酵母转化方法转化酵母细胞，利用潮霉素平板进行筛选，对生长的阳性克隆进行PCR鉴定并纯化扩增的DNA片段测序确定，获得阳性克隆命名为W303-1b/GshF，图1是其中5个阳性克隆的鉴定结果。

步骤三、营养缺陷型及原养型菌株的培养

(1)挑取筛选得到的阳性克隆W303-1b/GshF^PT，与营养缺陷型菌株W303-1b/GshF接菌至含有10mL YPD培养基的100mL三角瓶中，30℃，220rpm培养12-20h。

(2)将培养液转移至含有50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀＝0.2，30℃，220rpm培养，培养过程间隔取样。

步骤四、菌株生物量的测定

菌株生物量的测定方法用干重法和光密度值法两种方法。

(1)干重法：取5mL培养液，8000rpm离心5min,弃掉上清液，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)漂洗两次，100℃烘干24h。

(2)测量菌体重量；光密度值法：取培养液稀释适当倍数，检测其在600nm处的吸光度值。

步骤五、菌株谷胱甘肽产量的测定

谷胱甘肽产量的测定采用衍生化HPLC法：

(1)取1mL菌液，8000rpm离心3min，弃掉上清液。

(2)用40％(v/v)乙醇30℃萃取菌体2h。

(3)取25μL萃取液，加入25μL 0.1％5-磺酸基水杨酸二水化合物溶液，混匀后30℃孵育5min，

(4)加入100μL硼酸盐缓冲液和30μL 0.1％ABD-F溶液，混匀后孵育10min。

(5)加入50μL 2M HCl溶液终止反应，0.22μm滤膜过滤后进行HPLC分析。

步骤六、原养型菌株与营养缺陷型菌株的生物量和谷胱甘肽产量分析

原养型菌株W303-1b/GshF^PT在48h时生物量及谷胱甘肽产量达到最大，生物量为9.2g/L，谷胱甘肽产量为216mg/L；营养缺陷型菌株在96h时生物量及谷胱甘肽产量才达到最大，生物量为9.3g/L(表1)，谷胱甘肽产量为215mg/L(表2)。总之，两种菌株的生物量及谷胱甘肽产量没有明显差别，但回复为原养型后菌株生长至生物量及谷胱甘肽产量到最大需要的时间缩短至48h，培养周期大大缩短。

表1原养型菌株生物量及谷胱甘肽产量随时间的变化

表2营养缺陷型菌株生物量及谷胱甘肽产量随时间的变化

实施例2：酿酒酵母适应性实验室进化

步骤一、酿酒酵母亚硝基胍诱变处理

为提高适应性实验中出发菌株的基因多样性，使用化学诱变剂亚硝基胍处理酿酒酵母菌株W303-1b/GshF^PT，采取产生90％致死率的50μg/mL亚硝基胍处理菌株W303-1b/GshF^PT，亚硝基胍处理获得的菌株为W303-1b/GshF^PTm。

步骤二、第一轮适应性进化

适应性实验室进化示意图如图2所示

为提高酿酒酵母中GSH产量，对本实验之前构建的工程菌株W303-1b/GshF^PT及其亚硝基胍处理菌株W303-1b/GshF^PTm进行以丙烯醛为选择压力的适应性进化实验，共进行以下4组实验：

(1)W303-1b/GshF^PT+A

(2)W303-1b/GshF^PT+A+M

(3)W303-1b/GshF^PTm+A

(4)W303-1b/GshF^PTm+A+M

其中，A代表在进化实验过程中添加0.2mM丙烯醛，并逐渐提高丙烯醛浓度；M代表在进化实验过程中添加5μg/mL亚硝基胍。

(1)将W303-1b/GshF^PTm和W303-1b/GshF^PT接菌至含有10mL WMVIII培养基的100mL三角瓶中，30℃，220rpm培养12-20h。

(2)将培养液转移至新的培养基中，初始OD₆₀₀＝0.2，初始丙烯醛浓度为0.2mM，设置一个实验组添加5μg/mL亚硝基胍。

(3)培养液生长至对数期中期(OD₆₀₀＝15-30)，将培养液转移至新的培养基中，提高丙烯醛浓度0.01mM，亚硝基胍浓度保持不变。根据酿酒酵母繁殖的方式及生物量的变化，每次转接菌株繁殖5代。

(4)重复(3)20次，每隔5次取样品检测生物量和谷胱甘肽产量(表3)。

表3第一轮适应性进化不同实验菌株GSH产量的变化(mg/L)

步骤三、单克隆谷胱甘肽产量分析

(1)将谷胱甘肽产量最高的传代菌体稀释涂布与YPD固体平板上，30℃培养2d。

(2)挑取20个单克隆于WMVIII培养基中，30℃，220rpm培养48h，检测生物量和谷胱甘肽产量。

适应性进化过程中，不同的突变得到保留，细胞内GSH水平不尽相同，为得到GSH产量最高的单克隆菌株，对进化实验中GSH产量提高最多的W303-1b/GshF^PT+A组100代和W303-1b/GshF^PTm+A组75代菌株进行单克隆GSH水平分析，每组挑选20个单克隆，分析结果如表4。

表4第1轮进化菌株的单克隆胞内GSH的含量(mg/L)

步骤四、第二轮适应性进化

(1)挑取GSH合成能力较强的菌株W303-1b/GshF^PT-6接菌至含有10mL WMVIII培养基的100mL三角瓶中，30℃，220rpm培养12-20h。

(2)将培养液转移至新的培养基中，初始OD₆₀₀＝0.2，初始丙烯醛浓度为0.4mM，培养液生长至对数期中期(OD₆₀₀＝15-30)，将培养液转移至新的培养基中，提高丙烯醛浓度0.02,0.04,0.06mM，选择能在含有最高丙烯醛浓度的培养基中生长的菌株进行下一次转接。

(3)每转接5次取样品检测生物量和谷胱甘肽产量，共转接20次。当菌株谷胱甘肽产量不再增加或开始降低时，停止转接，进化实验结束，结果如表5。

表5第二轮进化菌株GSH产量的变化(mg/L)

步骤五：进化菌株与出发菌株的谷胱甘肽产量比较

(1)将谷胱甘肽产量最高的传代菌体稀释涂布与YPD固体平板上，30℃培养2d。

(2)挑取20个单克隆于WMVIII培养基中，30℃，220rpm培养48h，检测生物量和谷胱甘肽产量，发现单克隆菌株的谷胱甘肽产量差别不大，大约为246mg/L，选择生物量较高的W303-1b/GshF^PT-6-18为最终的进化菌株。

(3)挑取出发菌株W303-1b/GshF^PT及筛选得到进化菌株W303-1b/GshF^PT-6-18接菌至含有10mL WMVIII培养基的100mL三角瓶中，30℃，220rpm培养12-20h。

(4)将培养液转移至含有50mL WMVIII培养基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀＝0.2，30℃，220rpm培养。

(5)分别于培养12h、24h、36h、48h、60h取样用于检测菌体生物量及谷胱甘肽产量。

(6)每个时间点取出的1ml样品离心后使用40％(v/v)乙醇萃取2h，进行衍生化反应，0.22μm滤膜过滤后样品后HPLC分析。培养到48h时，出发菌株和进化菌株生物量和谷胱甘肽产量都达到最大，出发菌株生物量为8.1g/L，谷胱甘肽产量为108mg/L(表6)；最终筛选得到的进化菌株W303-1b/GshF^PT-6-18，其生物量为7.0g/L，谷胱甘肽产量为246mg/L(表7)。

表6菌株W303-1b/GshF^PT生物量及谷胱甘肽产量随时间的变化

表7菌株W303-1b/GshF^PT-6-18生物量及谷胱甘肽产量随时间的变化

实施例3进化菌株W303-1b/GshF^PT-6-18的代谢产物分析

步骤一、菌株代谢物萃取

菌株在WMVIII培养基中培养，初始OD₆₀₀＝0.2。分别于12h，24h，36h，48h，60h取30mL培养液，快速置于冰上冷却。用磷酸缓冲液(0.5mM，pH＝7.5)漂洗菌体两次。用沸腾乙醇法萃取酵母代谢产物，最终溶解于500μL无菌水中。

步骤二、代谢物LC-MS/MS分析

液相条件：流动相：A相ddH₂O，B相甲醇；流速：0.35mL/min；柱温：40℃

进样量：1μL

洗脱方式：0-1.4min：0％B相；3.5min：25％B相；7.5min：35％B相；10.3min：95％B相；13.7min：95％B相；13.8min：0％B相；17min：停止。本实验适用细胞培养方法包对不同时间点的细胞代谢萃取物进行成分测定。该方法包可对95种成分进行半定量分析，其中包括5种糖类、38种氨基酸、17种维生素、18种核苷酸类物质和17种其他代谢物，见表8。

表8代谢组分析的化合物

质谱条件

离子化模式：ESI(+/-)；加热气：空气10.0L/min；雾化气：氮气3.0L/min；干燥气：氮气10.0L/min；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；扫描模式：多反应检测(MRM)

步骤三、数据处理

计算机采集到了原始数据经过T检验分析，选取P<0.05的数据进行数据标准化：标准化的信号强度＝每个代谢物的m/z信号强度/内参标准的信号强度÷DCW(干重)，然后进行细胞内代谢物相对水平的计算：相对浓度倍比＝进化菌株代谢物的信号强度/基础菌株代谢物的信号强度。最终得到的代谢物的数据见表9，每行代表菌株不同生长时期一种代谢物在进化菌株W303-1b/GshF^PT-6-18与出发菌株W303-1b/FGP^PT的相对浓度比值，每列代表某一特定生长时期不同代谢物的相对浓度比值。

表9进化菌株代谢物的分析

表9续

表9续

进化菌株中，谷胱甘肽生物合成的三种前体氨基酸(谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)的相对水平均有提高。在菌株生长至48h时，细胞内GSH水平达到最高，此时进化菌株中，半胱氨酸相对水平增加11.3倍，甘氨酸增加5.2倍，谷氨酸增加1.1倍。

GSH合成的关键氨基酸半胱氨酸生物合成的前体代谢物相对水平也都有提高，在菌株生长至48h时，细胞内GSH水平达到最高，此时胱硫醚的相对水平是出发菌株细胞内的9.9倍，同型半胱氨酸为3.8倍，同型丝氨酸为2.0倍。细胞生长初期，进化菌株中天冬氨酸水平与出发菌株水平相当，而随着菌株的生长，在进化菌株中相对水平逐渐降低，说明其转化为半胱氨酸的代谢能力强。上述这些半胱氨酸生物合成途径中的前体或中间体是进行遗传操作进一步提高谷胱甘肽合成的分子基础。

实施例4：酿酒酵母工程菌的构建

酿酒酵母STR3基因克同源双交换整合框的构建

以基因数据库GenBank注册号为NM_001181049的核酸序列为基础设计合成PCR反应引物(表10)：

表10酵母STR3同源整合片段的扩增引物

其中横线部分为与STR3基因同源的碱基序列

以质粒pδGAPz为模板，用引物STR3_H1和STR3_H2进行PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，3min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。得到一条长为2249bp的DNA片段(SEQ ID NO.2)。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段。即得到含有STR3基因同源片段的同源双交换整合框。

为实现STR3基因敲除后便于筛选，选择筛选标记Zeocin。图3是构建同源双交换整合框的示意图

酿酒酵母CYS3基因克隆和同源整合载体pδGAPh-CYS3的构建

以GenBank注册号为NM_001178157的核酸序列为基础设计合成PCR反应引物(表11)：

表11酵母CYS3基因的扩增引物

以酿酒酵母W303-1b的基因组DNA为模板，用引物CYS3_1和CYS3_4进行第一轮PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物CYS3_2和CYS3_3进行Nested-PCR扩增(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1185bp的DNA片段(SEQ ID NO.3)。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后与用内切酶Nde I和Nhe I酶切的载体pδGAPh进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌Trans1-T1，筛选获得阳性克隆，使用测序引物GAP_S2和PGK1_1进行测序验证，即得到含有CYS3基因同源片段的质粒pδGAPh-CYS3。

为实现CYS3基因整合后的筛选鉴定，选择A1114筛选标记。质粒pδGAPh-CYS3用NotI线性化后通过LiAc转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。图4a是构建的质粒图及同源重组的示意图。

酿酒酵母CYS4基因的克隆和整合表达载体pδGAP′g-CYS4的构建

以基因数据库GenBank注册号为NM_001181284的核酸序列为基础设计合成PCR反应引物(表12)：

表12酵母CYS4基因的扩增引物

以酿酒酵母W303-1b的基因组DNA为模板，用引物CYS4_1和CYS4_4进行第一轮PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物CYS4_2和CYS4_3进行Nested-PCR扩增(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1524bp的DNA片段(SEQ ID NO.4)。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后与用内切酶Nde I和NheI酶切的载体pδGAP′g进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌Trans1-T1，筛选获得阳性克隆，使用测序引物GAP_P1和PGK1_1进行测序验证，即得到含有CYS4基因同源片段的质粒pδGAP′g-CYS4。

为实现CYS4基因整合后的筛选鉴定，选择UG6筛选标记。质粒pδGAP′g-CYS4用NotI线性化后通过LiAc转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。图4b是构建的质粒图及同源重组的示意图。

酿酒酵母PDI1基因的克隆和整合表达载体pδPGKb-PDI的构建

以GenBank注册号NM_001178688的核酸序列为基础设计合成PCR反应引物(表13)：

表13酵母PDI1基因的扩增引物

以酿酒酵母W303-1b的基因组DNA为模板，用引物PDI1_1和PDI1_4进行第一轮PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物PDI1_2和PDI1_3进行Nested-PCR扩增(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1566bp的DNA片段(SEQ ID NO.5)。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后与用内切酶Nde I和NheI酶切的载体pδPGKb进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌Trans1-T1，筛选获得阳性克隆，使用测序引物GAP_P1和PGK1_1进行测序验证，即得到含有PDI1基因同源片段的质粒pδPGKb-PDI1。

为实现PDI1基因整合后的筛选鉴定，选择Blastcidin筛选标记。质粒pδPGKb-PDI1用Not I线性化后通过LiAc转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。图4c是构建的质粒图及同源重组的示意图。

酵母胱硫醚β-裂解酶STR3基因的的敲除

酿酒酵母W303-1b基因组中胱硫醚β-裂解酶STR3基因敲除过程如下：首先采用LiAc转化法将STR3双交换同源表达框转化进入酿酒酵母细胞，利用抗性筛选标记Zeocin进行阳性克隆筛选。提取阳性克隆的基因组，再利用引物STR3_H1/H2分别对被敲除STR3基因的阳性工程菌株进行PCR扩增鉴定。图5是胱硫醚β-裂解酶STR3基因敲除后的PCR扩增DNA片段的电泳分析，结果表明都能扩增出预期的整合DNA片段，再纯化PCR产物进行测序验证。

敲除胱硫醚β-裂解酶后对谷胱甘肽积累的分析

以胱硫醚β-裂解酶基因敲除菌株W303-1b/GshF^PT-6-18/△STR3为实验组，原始菌W303-1b/GshF^PT-6-18为对照组鉴定胱硫醚β-裂解酶敲除完成后对细胞内谷胱甘肽的积累情况以及对细胞生长的影响。具体做法如下：

(1)转化生成的工程菌单克隆接种于WMVIII液体培养基中，30℃，220rpm，培养至12-20h。

(2)将培养液转接到含有50mLWMVIII培养基的250mL三角瓶中，30℃，220rpm培养约48h。

(3)取样品检测生物量和谷胱甘肽产量。

结果如表14所示敲除胱硫醚β-裂解酶基因对菌株谷胱甘肽产量从246mg/L增加至261mg/L，生物量从7.0g/L降低至5.7g/L。

表14敲除STR3基因对工程菌GSH合成的影响

实施例5：酿酒酵母代谢途径中CYS3和CYS4基因对谷胱甘肽积累的影响

以原始菌W303-1b/GshF^PT-6-18为基础通过LiAc转化法获得分别高表达胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4的工程菌W303-1b/GshF^PT-6-18/CYS3和W303-1b/GshF^PT-6-18/CYS4，以及CYS3和CYS4共同高表达的工程菌W303-1b/GshF^PT-6-18/CYS3/CYS4。图6a是整合酿酒酵母胱硫醚γ-裂解酶CYS3基因工程菌PCR扩增DNA片段的电泳分析，图6b是整合酿酒酵母胱硫醚β-合酶CYS4基因工程菌PCR扩增DNA片段的电泳分析结果表明都能扩增出预期的整合DNA片段，再纯化PCR产物进行测序验证。以菌株W303-1b/GshF^PT-6-18为对照鉴定胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4高表达前后谷胱甘肽积累的变化，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于WMVIII液体培养基中，30℃，220rpm，培养12-20h。

(2)将培养液转接到含有50mLWMVIII培养基的250mL三角瓶中，每种工程菌3个平行实验，初始OD₆₀₀＝0.2，30℃，220rpm培养约48h。

(3)取样品检测菌株生物量和谷胱甘肽产量。结果如表15所示高表达胱硫醚γ-裂解酶对谷胱甘肽的产量从对照245mg/L增加至264mg/L，高表达胱硫醚β-合酶对谷胱甘肽的产量从对照245mg/L增加至260mg/L，同时高表达胱硫醚γ-裂解酶和胱硫醚β-合酶对谷胱甘肽的产量从对照245mg/L增加至272mg/L，生物量从7.0g/L降低至6.3g/L。

表15表达CSY3和CYS4基因对工程菌GSH合成的影响

实施例6：酿酒酵母蛋白二硫键异构酶PDI1基因对工程菌谷胱甘肽积累的影响

以工程菌W303-1b/GshF^PT-6-18为基础，通过LiAc转化法获得表达重组二硫键异构酶的工程菌株W303-1b/GshF^PT-6-18/PDI。图6c是整合酿酒酵母二硫键异构酶基因工程菌PCR扩增DNA片段的电泳分析结果表明都能扩增出预期的整合DNA片段，再纯化PCR产物进行测序验证以菌株W303-1b/GshF^PT-6-18为对照鉴定蛋白二硫键异构酶表达对谷胱甘肽积累的影响，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于WMVIII液体培养基中，30℃，220rpm，培养12-20h。

(2)将培养液转接到含有50mLWMVIII培养基的250mL三角瓶中，每种工程菌3个平行实验，初始OD₆₀₀＝0.2，30℃，220rpm培养约48h。

(3)取样品检测菌株生物量和谷胱甘肽产量。结果如表16所示重组表达蛋白二硫键异构酶PDI对谷胱甘肽的产量从对照245mg/L增加至276mg/L，生物量从7.0g/L增加至7.7g/L。

表16表达PDI1基因对工程菌GSH合成的影响

实施例7：敲除胱硫醚β-裂解酶的工程菌转入胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4对谷胱甘肽产量的影响

以工程菌W303-1b/GshF^PT-6-18/△STR3为基础，通过LiAc转化法获得同时高表达胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4的工程菌W303-1b/GshF^PT-6-18/△STR3/CYS3/CYS4。以W303-1b/GshF^PT-6-18/△STR3为对照，鉴定敲除胱硫醚β-裂解酶后转入胱硫醚γ-裂解酶CYS3和胱硫醚β-合酶CYS4对谷胱甘肽产量的影响，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于WMVIII液体培养基中，30℃，220rpm，培养12-20h。

(2)将培养液转接到含有50mLWMVIII培养基的250mL三角瓶中，每种工程菌3个平行实验，初始OD₆₀₀＝0.2，30℃，220rpm培养约48h。

(3)取样品检测菌株生物量和谷胱甘肽产量。结果如表17所示

表17敲除STR3基因和同时高表达CYS3和CYS4基因对工程菌GSH合成的影响

实施例8：工程菌株W303-1b/GshF^PT-8-12/△STR3/CYS3/CYS4表达酿酒酵母二硫键异构酶PDI1对谷胱甘肽产量的影响

以工程菌W303-1b/GshF^PT-8-12/△STR3/CYS3/CYS4为基础，通过LiAc转化法获得表达酿酒酵母二硫键异构酶PDI1的工程菌W303-1b/GshF^PT-8-12/△STR3/CYS3/CYS4/PDI，如图7所示该工程菌即完成了STR3基因的敲除和3个基因(CYS3、CYS4和PDI1)的共同高表达。以W303-1b/GshFP^PT-8-12/△STR3/CYS3/CYS4为对照，鉴定表达酿酒酵母二硫键异构酶对谷胱甘肽产量的影响，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于WMVIII液体培养基中，30℃，220rpm，培养12-20h。

(2)将培养液转接到含有50mLWMVIII培养基的250mL三角瓶中，每种工程菌3个平行实验，初始OD₆₀₀＝0.2，30℃，220rpm培养约48h。

(3)取样品检测菌株生物量和谷胱甘肽产量。结果如表18所示

表18敲除STR3基因和高表达CYS3、CYS4和PDI1基因对工程菌合成GSH的影响.

实施例9：10-L发酵罐放大培养生产谷胱甘肽

工程菌为W303-1b/GshFP^PT-6-18/△STR3/CYS3/CYS4/PDI，培养基为WMVIII，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于WMVIII液体培养基中，30℃，220rpm，培养12-20h。

(2)将培养液转接到新鲜的WMVIII培养基中，初始OD600＝0.2，30℃，220rpm培养约24h。

(3)按1％的接种量至含4-L SC培养基的10-L发酵罐中。

(4)发酵条件为：温度为30℃，溶氧为30％，pH为5.5。

(5)分别于发酵6h、16h、24h、30h、40h取样用于检测菌体生物量及谷胱甘肽产量。

(6)每个时间点取出的1ml样品离心后使用40％(v/v)乙醇萃取2h，进行衍生化反应，0.22μm滤膜过滤后样品后HPLC分析。结果如表19所示发酵放大后谷胱甘肽产量能从摇瓶转化产量的296mg/L提高到了331mg/L。

表19工程菌株W303-1b/GshFP^PT-6-18/△STR3/CYS3/CYS4/PDI的稳定性培养

实施例10：工程菌株在添加氨基酸的培养基YPD发酵培养

工程菌为W303-1b/GshFP^PT-6-18/△STR3/CYS3/CYS4/PDI，培养基为YPD，并在培养过程中添加L-半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于YPD液体培养基中，30℃，220rpm，培养12-20h。

(2)将培养液转接到新鲜的PYD培养基中，初始OD600＝0.2，30℃，220rpm培养约24h。

(3)按1％的接种量至含4-L YPD培养基的10-L发酵罐中。

(4)发酵条件为：温度为30℃，溶氧为30％，pH为5.5。

(5)培养24h后，添加200ml 50mM的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的混合液；继续培养，在48h再次添加200ml 50mM的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的混合液。

(6)每个时间点取出的1ml样品离心后使用40％(v/v)乙醇萃取2h，进行衍生化反应，0.22μm滤膜过滤后样品后HPLC分析。结果如表20所示氨基酸的添加能较大幅度地提高细胞合成谷胱甘肽的活性，在发酵培养72h时谷胱甘肽的胞内含量提高到了1151mg/L。

表20工程菌株W303-1b/GshFP^PT-6-18/△STR3/CYS3/CYS4/PDI在添加氨基酸的YPD培养基中发酵培养

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中国医学科学院药物研究所

<120> 一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌、其制备方法及其应用

<130> P17073B

<150> 201711351178.0

<151> 2017-12-15

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaattac aacaactgat taaaactcat catttgggtt tattatttca acaaggtaaa 60

tttggtattg aaaaagaatc tcaaagaatt gataacaaag gtaatattgt tactactgct 120

catccttctg tttttggtaa cagatcttat catccttata ttcaaactga ttttgctgaa 180

tctcaattag aattaattac tcctccaaat gatacattgg aagatactta tagatggtta 240

tctgctattc atgaagttac tttaagatct ttgcctgatg atgaatatat ttttccattt 300

tctatgcctg ctggtttacc tccagaattt gaaattaaag aagctcaatt agataatgaa 360

tgggatgtta aatatagaga acatttgtct gctatttatg gtaaatataa acaaatggtt 420

tctggtattc attataattt tcaaatttct gaagaatttg ttgaatctac atttgcttta 480

caaactgaat atagagataa aattgctttt aggaatgctt tatatatgga attagctaat 540

aactttttaa gatatcaatg gattttagtt tatttgttag ctgcaactcc aactgttgaa 600

gctcaatatt ttggtaaaaa ttctcctttg gctgaaggtc aattagttag atcattaaga 660

tctggtcctt atggttatgt aaatgctcca catattgtta ttaatcacga ttctttgcaa 720

caatatgttg aatctttaga acattttgta gcaactggtg atttgttggc agaaaaagaa 780

ttttattcaa acgttagatt aaggggtgct aaaaaagcaa gaaaattgtt agagaaaggt 840

gttaaatatg ctgaatttag attatttgat ttaaatcctt tttctcctta tggtattgaa 900

ttagctgatg ctaaatttat tcatttgttt ttattggcta tgttgtggat ggatgaaaca 960

tctggtcaaa gagaagttga aattggtaca caaaaattat atcaagttgc tttagaagat 1020

cctagatctc atactgcttt tcaagcagag ggtgaggcta ttttaaactt gatgttggca 1080

atgttggatg atttatctgt accacaaaac gagaaagatt tattacaaca aaaattggca 1140

caatttgctg atccttctca aactgtaaac ggtagattat tagctgcagt tgaacaagct 1200

ggttcttata aagctttggg tgcacaactt gctcaacaat ataaagcgca agcatttgaa 1260

agattttatg ctatttctgc tttcgataat atggaattat ctactcaggc tttgttattt 1320

gatgctattc aacaaggttt acagattgaa ttgttagatg aaaatgatca gtttttagca 1380

ttgaaattcg gtgatcattt agaatatgtg aaaaacggta atatgacttc tcatgatcaa 1440

tatatttctc cattaattat ggaaaacaaa gttgtaacta aaaaagtttt ggctaaagct 1500

ggttttaatg tgcctaaatc tgttgaattt acttctgtag aacaagctgt tgcacattat 1560

cctttatttg aaggtaaagc tgttgtaatt aaacctaaat caactaatta cggtttaggt 1620

attacaattt tccagcaagg tgtgactgat aaagctgatt ttgctaaagc tattgaaatt 1680

gcgttcagag aagataaaga agtgatggtg gaagattatt tagttggtac tgaatataga 1740

ttttttgttt taggtgatga aacattggct gtattgttaa gagtgcctgc aaatgtgaaa 1800

ggtgattgta ttcatactgt tagagaattg gttgaagcta aaaattctga tcctttaaga 1860

ggtgatggtt ctagatcacc attgaagaaa attgctttgg gtgatattga attgttacag 1920

ttgaaagagc aaggtttaac tcctgattct attcctgctg atggtcaaat tgtacaatta 1980

agagctaact ctaatatttc tactggtggt gattcaattg atatgactga tcaaatgcat 2040

gacagttata aacaattagc tgttggtatt gctaaagaga tgggtgcaaa agtttgtggt 2100

gtggatttaa ttattcctga tttaactaaa gctgctgagc cttctttgag atcatggggt 2160

gtgattgaag caaactttaa tcctatgatg atgatgcata tttttcctta tcaaggaaaa 2220

tctagaaggt taactaaagc tgttttaaaa atgttgttcc cagaattgcc ttaa 2274

<210> 2

<211> 2249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagttgattg tgttcttcta gagtctccga ccaatccgct ttgcatttat cattatcaat 60

actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120

tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180

tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240

aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300

aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360

gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420

tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480

ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540

gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600

gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660

tttagtttta agacaccaag aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacatatgat 720

tgaattgaat tgaaatcgat agatcaattt ttttcttttc tctttcccca tcctttacgc 780

taaaataata gtttatttta ttttttgaat attttttatt tatatacgta tatatagact 840

attatttact tttaatagat tattaagatt tttattaaaa aaaaattcgt ccctcttttt 900

aatgcctttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg tttcagcgta 960

ttttaagttt aataactcga aaattctgcg ttcgttaaag cttaacccca cacaccatag 1020

cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc cgcgcatcgc 1080

cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt tccctctttc ttcctctagg 1140

gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc ctcgtttctt 1200

tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt gaaatttttt 1260

tttttagttt ttttctcttt cagtgacctc cattgatatt taagttaata aacggtcttc 1320

aatttctcaa gtttcagttt catttttctt gttctattac aacttttttt acttcttgtt 1380

cattagaaag aaagcatagc aatctaatct aaggggcggt gttgacaatt aatcatcggc 1440

atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac 1500

cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga 1560

ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga 1620

cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg 1680

ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa 1740

cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga 1800

gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg 1860

acacgtccga cggcggccca cgggtcccag gcctcggaga tccgtccccc ttttcctttg 1920

tcgatatcat gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg ccctcccccc acatccgctc 1980

taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag 2040

ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac 2100

gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga 2160

aggctttaat ttgcaagctc ctattacatt atcaatcctt gcgtctcgaa gctttacttt 2220

gtcattaatt ctacaggagc tggattatc 2249

<210> 3

<211> 1185

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

atgactctac aagaatctga taaatttgct accaaggcca ttcatgccgg tgaacatgtg 60

gacgttcacg gttccgtgat cgaacccatt tctttgtcca ccactttcaa acaatcttct 120

ccagctaacc ctatcggtac ttacgaatac tccagatctc aaaatcctaa cagagagaac 180

ttggaaagag cagttgccgc tttagagaac gctcaatacg ggttggcttt ctcctctggt 240

tctgccacca ccgccacaat cttgcaatcg cttcctcagg gctcccatgc ggtctctatc 300

ggtgatgtgt acggtggtac ccacagatac ttcaccaaag tcgccaacgc tcacggtgtg 360

gaaacctcct tcactaacga tttgttgaac gatctacctc aattgataaa ggaaaacacc 420

aaattggtct ggatcgaaac cccaaccaac ccaactttga aggtcaccga catccaaaag 480

gtggcagacc ttatcaagaa gcacgctgcc ggccaagacg tgatcttggt tgtcgacaac 540

accttcttgt ccccatatat ctccaatcca ttgaacttcg gtgcagacat cgttgtccac 600

tccgctacaa agtacatcaa cggtcactca gacgttgtgc tcggtgtcct ggccactaat 660

aacaagccat tgtacgagcg tctgcagttc ttacaaaacg ccattggtgc tatcccatct 720

cctttcgatg cttggttgac ccacagaggt ttgaagactt tgcatctacg tgtcagacaa 780

gctgccctca gcgccaacaa aatcgctgaa ttcttggcag cagacaagga aaacgttgtc 840

gcagtcaact acccaggttt gaagacacac cctaactacg acgtagtgtt aaagcaacac 900

cgtgatgccc ttggtggtgg tatgatctcc ttcagaatca agggtggtgc tgaagctgct 960

tccaagttcg cctcctccac aagactgttc acattggccg aatcccttgg tggtatcgaa 1020

tctctattgg aagtgcccgc tgtgatgacc cacggtggta tcccaaagga ggccagagag 1080

gcctctggtg tttttgacga cttggttaga atctctgtcg gtattgaaga cactgacgat 1140

cttttggaag acatcaagca agccttgaaa caagccacca actaa 1185

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

atgactaaat ctgagcagca agccgattca agacataacg ttatcgactt agttggtaac 60

accccattga tcgcactgaa aaaattgcct aaggctttgg gtatcaaacc acaaatttat 120

gctaagctgg aactatacaa tccaggtggt tccatcaaag acagaattgc caagtctatg 180

gtggaagaag ctgaagcttc cggtagaatt catccttcca gatctactct gatcgaacct 240

acttctggta acaccggtat cggtctagct ttaatcggcg ccatcaaagg ttacagaact 300

atcatcacct tgccggaaaa aatgtctaac gagaaagttt ctgtcctaaa ggctctgggt 360

gctgaaatca tcagaactcc aactgctgct gcctgggatt ctccagaatc acatattggt 420

gttgctaaga agttggaaaa agagattcct ggtgctgtta tacttgacca atataacaat 480

atgatgaacc cagaagctca ttactttggt actggtcgcg aaatccaaag acagctagaa 540

gacttgaatt tatttgataa tctacgcgct gttgttgctg gtgctggtac tggtgggact 600

attagcggta tttccaagta cttgaaagaa cagaatgata agatccaaat cgttggtgct 660

gacccattcg gttcaatttt agcccaacct gaaaacttga ataagactga tatcactgac 720

tacaaagttg agggtattgg ttatgatttt gttcctcagg ttttggacag aaaattaatt 780

gatgtttggt ataagacaga cgacaagcct tctttcaaat acgccagaca attgatttct 840

aacgaaggtg tcttggtggg tggttcttcc ggttctgcct tcactgcggt tgtgaaatac 900

tgtgaagacc accctgaact gactgaagat gatgtcattg ttgccatatt cccagattcc 960

atcaggtcgt acctaaccaa attcgtcgat gacgaatggt tgaaaaagaa caatttgtgg 1020

gatgatgacg tgttggcccg ttttgactct tcaaagctgg aggcttcgac gacaaaatac 1080

gctgatgtgt ttggtaacgc tactgtaaag gatcttcact tgaaaccggt tgtttccgtt 1140

aaggaaaccg ctaaggtcac tgatgttatc aagatattaa aagacaatgg ctttgaccaa 1200

ttgcctgtgt tgactgaaga cggcaagttg tctggtttag ttactctctc tgagcttcta 1260

agaaaactat caatcaataa ttcaaacaac gacaacacta taaagggtaa atacttggac 1320

ttcaagaaat taaacaattt caatgatgtt tcctcttaca acgaaaataa atccggtaag 1380

aagaagttta ttaaattcga tgaaaactca aagctatctg acttgaatcg tttctttgaa 1440

aaaaactcat ctgccgttat cactgatggc ttgaaaccaa tccatatcgt tactaagatg 1500

gatttactga gctacttagc ataa 1524

<210> 5

<211> 1569

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 5

atgaagtttt ctgctggtgc cgtcctgtca tggtcctccc tgctgctcgc ctcctctgtt 60

ttcgcccaac aagaggctgt ggcccctgaa gactccgctg tcgttaagtt ggccaccgac 120

tccttcaatg agtacattca gtcgcacgac ttggtgcttg cggagttttt tgctccatgg 180

tgtggccact gtaagaacat ggctcctgaa tacgttaaag ccgccgagac tttagttgag 240

aaaaacatta ccttggccca gatcgactgt actgaaaacc aggatctgtg tatggaacac 300

aacattccag ggttcccaag cttgaagatt ttcaaaaaca gcgatgttaa caactcgatc 360

gattacgagg gacctagaac tgccgaggcc attgtccaat tcatgatcaa gcaaagccaa 420

ccggctgtcg ccgttgttgc tgatctacca gcttaccttg ctaacgagac ttttgtcact 480

ccagttatcg tccaatccgg taagattgac gccgacttca acgccacctt ttactccatg 540

gccaacaaac acttcaacga ctacgacttt gtctccgctg aaaacgcaga cgatgatttc 600

aagctttcta tttacttgcc ctccgccatg gacgagcctg tagtatacaa cggtaagaaa 660

gccgatatcg ctgacgctga tgtttttgaa aaatggttgc aagtggaagc cttgccctac 720

tttggtgaaa tcgacggttc cgttttcgcc caatacgtcg aaagcggttt gcctttgggt 780

tacttattct acaatgacga ggaagaattg gaagaataca agcctctctt taccgagttg 840

gccaaaaaga acagaggtct aatgaacttt gttagcatcg atgccagaaa attcggcaga 900

cacgccggca acttgaacat gaaggaacaa ttccctctat ttgccatcca cgacatgact 960

gaagacttga agtacggttt gcctcaactc tctgaagagg cgtttgacga attgagcgac 1020

aagatcgtgt tggagtctaa ggctattgaa tctttggtta aggacttctt gaaaggtgat 1080

gcctccccaa tcgtgaagtc ccaagagatc ttcgagaacc aagattcctc tgtcttccaa 1140

ttggtcggta agaaccatga cgaaatcgtc aacgacccaa agaaggacgt tcttgttttg 1200

tactatgccc catggtgtgg tcactgtaag agattggccc caacttacca agaactagct 1260

gatacctacg ccaacgccac atccgacgtt ttgattgcta aactagacca cactgaaaac 1320

gatgtcagag gcgtcgtaat tgaaggttac ccaacaatcg tcttataccc aggtggtaag 1380

aagtccgaat ctgttgtgta ccaaggttca agatccttgg actctttatt cgacttcatc 1440

aaggaaaacg gtcacttcga cgtcgacggt aaggccttgt acgaagaagc ccaggaaaaa 1500

gctgctgagg aagccgatgc tgacgctgaa ttggctgacg aagaagatgc cattcacgat 1560

gaattgtaa 1569

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acacataaac aaacaaacat atgaaattac aacaactgat taaaa 45

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaacaactat caaaacacat atgaaattac aacaactgat taaaa 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caattcaatt caatgctagc ttaaggcaat tctgggaaca acatt 45

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagttgattg tgttcttcta gagtctccga ccaatccgct ttgcatttat cattatcaat 60

actgccattt 70

<210> 10

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gataatccag ctcctgtaga attaatgaca aagtaaagct tcgagacgca aggattgata 60

atgtaatagg 70

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaggcctata cacatagaca tttgc 25

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acacataaac aaacaaacat atgactctac aagaatctga taaat 45

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caattcaatt caatgctagc ttagttggtg gcttgtttca aggcttg 47

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaggtccggt cgaaggcaga gacgtgg 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgttgtaggc cacttgctca aagga 25

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acacataaac aaacaaacat atgactaaat ctgagcagca agccg 45

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caattcaatt caatgctagc ttatgctaag tagctcagta aatccat 47

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aatgacggat tttgcttcta tgtttgc 27

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gccaagctct acataaagaa aaacata 27

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttacaacaaa tataaaacat atgaagtttt ctgctggtgc cgtcctg 47

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttcaattcaa ttcaatgcta gcttacaatt catcgtgaat ggcatcttc 49

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caactattgt gtttgaattt taacgttta 29

Claims (6)

1.一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：

i）把酿酒酵母w303-1b营养缺陷型宿主菌进行回复突变；

ii）转化经密码子优化的能催化合成谷胱甘肽的双功能酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶基因进入宿主菌，并使其高表达；

iii）对构建的工程菌株进行以丙烯醛为筛选压力的适应性实验室进化；

iv）敲除宿主菌内源性的胱硫醚b-裂解酶基因；

v）提高宿主菌中内源性胱硫醚g-裂解酶基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进谷胱甘肽的生物合成；

vi）提高宿主菌中内源性胱硫醚b-合酶基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进谷胱甘肽的生物合成；

vii）在宿主菌内转入蛋白二硫键异构酶基因；

所述iv）、v）、vi）、vii）以任意顺序操作完成后即得到高产谷胱甘肽的基因工程菌；所述的ii）可重复多次转化获得更高产的工程菌株；

所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶、胱硫醚g-裂解酶、胱硫醚b-合酶和蛋白二硫键异构酶基因通过整合型方式高表达；

所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶、胱硫醚g-裂解酶、胱硫醚b-合酶和蛋白二硫键异构酶基因通过使用酵母高拷贝的整合位点δ序列实现其整合型方式高表达；所述的整合型方式是指将所述基因整合入宿主菌基因组的方式；

所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码；所述谷胱硫醚g-裂解酶由SEQ ID NO.3的核苷酸序列编码；所述胱硫醚b-合酶由SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列编码；所述蛋白二硫键异构酶由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列编码；

所述胱硫醚b-裂解酶基因通过基因同源重组进行敲除；所述基因同源重组使用具有SEQ ID NO.2所示DNA序列的同源双交换整合框。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述i）、ii）、iii）、iv）、v）、vi）、vii）中的宿主菌选自酿酒酵母；所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶、胱硫醚g-裂解酶、胱硫醚b-合酶和蛋白二硫键异构酶基因由组成型启动子启动表达。

3.如权利要求2的制备方法，其特征在于，所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶、胱硫醚g-裂解酶和胱硫醚b-合酶基因由组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAP启动子启动表达；所述编码蛋白二硫键异构酶基因由组成型磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子启动表达。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到基因工程菌。

5.根据权利要求4的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌的保藏编号为CGMCCNO. 13102。

6.权利要求4-5任一项所述基因工程菌在高产合成谷胱甘肽中的应用。

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