CN101220338A - 一种谷胱甘肽生产菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷胱甘肽生产菌株，导入了GSH相关合成酶γ－L－谷氨酰－L－半胱氨酸合成酶基因GSH I与谷胱甘肽合成酶基因GSH II，以及半胱氨酸相关合成酶胱硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚－γ－裂解酶CYS4基因。本发明的谷胱甘肽生产菌株具有高密度、低成本的优点。

Description

一种谷胱甘肽生产菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种谷胱甘肽生产菌株及其构建方法。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，由于其具有多种重要的生理功能，不仅在医学和化妆品等领域有着广泛的应用，而且也广泛运用于食品加工的各个领域，如调味食品、乳制品、口服保健品等[Sies H.(1999)Free Rad Biol Med.27，916-921；郑云朗(1995)生物学通报30，22-24]。谷胱甘肽的工业生产主要为化学合成法，酶法和生物发酵等法。化学法存在的旋光性、环境方面的问题。生物法合成GSH主要有两种途径：酶转化法和发酵法。二者的共同特点是首先要有性能良好的微生物，然后再利用细胞中的高活性酶系在较为温和的条件下来实现GSH的合成；二者最主要的区别在于酶法需要提供三种底物氨基酸和ATP，而发酵法只要供给微生物生长代谢所需的营养物质(碳源、氮源和无机盐等)即可实现GSH在胞内的积累。酶法有成本高等缺点，使得发酵法合成依然具备替代其成为主要生产方法[李华钟，林金萍，李寅等(2000)中国医药工业杂志31，236-239]。

国外发酵法生产谷胱甘肽的研究开展得比较早，早在七十年代开始就开始对生物法合成GSH进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关专利[US Patent6902912；US Patent 4598046；US Patent 4582801；JP19890032584；WO2004/003217 A1；EP1539982；US Patent 20050239164]。一些大公司(如协和发酵)利用酵母发酵生产的GSH更是早在1985年就取得了中国卫生部的原料药进口许可文号，基本垄断了中国市场。我国对GSH的研究尚处于起步阶段，虽然从八十年代末期至今，曾开展过利用酿酒酵母、大肠杆菌等菌种生产GSH的研究，但由于生产菌株中GSH含量较低，成本过不了关，故一直未能实现工业化生产。

目前国内外生物法合成GSH研究的菌种的改良主要集中在对酿酒酵母、大肠杆菌等菌种的改良。改良方法由常规诱变育种方法选育高产菌株发展到利用基因重组技术代谢育种。由于GSH合成与其两个合成酶密切相关，因此在育种方面主要集中在利用基因重组技术使微生物细胞增加相关基因GSH I和GSH II的酶活[Kimura A.(1986)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，33，1-51]。Nanjo、Tezuka、Christine、王绍校和饶志明等人分别对酵母的分子育种进行了研究，主要思路是将含编码GSHI和(或)GSH II基因的重组质粒转化进入S.cerevisiae或Pichia pastoris从而提高了谷胱甘肽的胞内含量[Nanjo，H.，Yamashita，K.，et.，al(1986)公开特许公报61-52299；Tezuka，H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al(1987)公开特许公报62-275685；Christine，L.，Ulf，S.(1989)Eur.Pat.Appl.EP 300168；王绍校，(2005).中国学位论文全文数据库；饶志明，艾丽静等(2007).应用与环境生物学报，13：257-260；饶志明，艾丽静，沈微等(2007).食品与发酵工业.33：1-4]。但是他们报道的工程菌产量与工业化要求相比仍然有所距离。Gushima等人构建了同时带有GSH I和GSH II基因的质粒转化后的大肠杆菌细胞表现出较高的谷胱甘肽生产活性[Gushima H，Miya T，Mutara K et al.(1983)J Appl Biochem，5：43-52]。Perone Gabriel G.等人通过表达GSH I和GSH II基因和突变相关基因使得酵母菌发酵生产GSH分泌到细胞外[WO2004/003217 A1；EP1539982；US Patent 20050239164]；李华钟等人构建了带有GSH I和GSH II基因的质粒转化后的大肠杆菌细胞，通过发酵处理使得生产GSH分泌到细胞外，发酵产量高达7g/L[李华钟，李寅，陈坚等(2001)微生物学报，41：16-23]。虽然他们构建的工程菌发酵生产GSH是目前报道最高的产量，但是GSH的发酵生产是分泌到胞外，GSH在胞外容易被氧化，而且发酵过程还需要添加甲苯、肌醇等化合物，不利于工业化。因此，如何提高细胞内GSH的量和在发酵时提高菌的浓度对于GSH工业化生产来说，仍然十分重要。

生物GSH的合成是与两个合成酶gshI与gshII含量密切相关，而且它们的基因转录与翻译是受高度调节的，两个相关合成酶的比例是协调的。但是，一般基因工程或代谢工程手段是加入外源基因或宿主自身基因，一般改变了原来调控启动子或仍使用原基因的启动子但改变了拷贝数，由于事先未深入研究GSH I与GSH II基因含量的比例关系而无法有目的地调节细胞内GSHI与GSHII的表达量，其结果并不一定能达到GSHI、GSH II高效、协调表达的目的[尧辉.魏东芝，周宇荀等(2002).华东理工大学学报，28：144-148]。Wantanabe K等人在构建得到了具有很高的谷胱甘肽合成能力生产菌，但他们却是经过大量研究才发现GSHI和GSH II基因拷贝数在1∶3的重组质粒PGS501-13的基因工程大肠杆菌具有较高产量[Watanabe K，Yamata Y，Murata K.(1986)，Appl Microbiol Biotechnol，24：375-378]。因此，通过基因工程或代谢工程手段来育种时，如何使得构建的工程菌具有GSHI和GSH II基因合适的比例数和相应合适的拷贝数，使得构建的工程菌能达到GSHI、GSH II高效、协调表达的目的是非常必要的。

发酵生产GSH一般在发酵过程中添加三种氨基酸前体以提高产量。三种氨基酸前体之一的半胱氨酸最为重要，它的供应与利用直接影响GSH的产量[Catalino G.A.，Akihisa K.，Toru S.et al.(1991)Appl Microbiol Biotechnol.，6：538-540；Wen，S.，T.Zhangand T.Tan(2004)Enzyme Microb.Technol.35：501-507]。半胱氨酸与甘氨酸、谷氨酸相比价格较贵。GSH的生产中增加细胞内的半胱氨酸含量、减少外源半胱氨酸添加量可以大大降低生产成本。酵母菌拥有各种同化含硫化合物的酶系统，能利用多种含硫化合物合成各种含硫氨基酸[Beffa，T.，(1989)In Proceeding of the 48^th annual congress，SwissSociety of Microbiology，p71]。胱硫醚合酶(cystathione beta synthase，CBS)胱硫和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathione gamma lyase，CSE)是半胱氨酸合成代谢的关键酶，它们的活力或表达量与半胱氨酸合成代谢密切相关[http://www.yeastgenome.orggi-bin/searchtextSearch？query＝cysteine&type＝pathway；Dong-yang Li，Xin-song JiZhong-yi Yuan，et.al(2001)Acta Biochimica et Biophysica Sinica 33，600-606]。增加胱硫醚合酶和胱硫醚-γ-裂解酶的活力或量，在硫酸盐含量丰富培养基中培养，可以使酵母菌细胞内硫元素的同化代谢流流向半胱氨酸的合成，提高胞内半胱氨酸的含量，减少外源半胱氨酸的供给量，降低GSH的合成生产成本[Bun-Ichiro Ono，Kazuhide Naito，Yoh-IchiShirahige et al.(1991)Yeast，7，843-848；Bun-Ichiro Ono，Toshiya Hazu，Sayaka Yoshida.et al.(1999)Yeast，15，1365-1375；Alexandra Lafaye，Christophe Junot，Yannick Pereira.et al.(2005)J.Biol.Chem.，280，24723-24730；Jaspreet Kaur and Anand K.Bachhawat(2007)Genetics，176，877-890]。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种高密度、低成本的发酵特点的胞内高产谷胱甘肽的工程菌株。

本发明的另一目的是提供上述谷胱甘肽生产菌株的构建方法。

技术方案：本发明的谷胱甘肽生产菌株，导入了GSH相关合成酶γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶基因GSH I与谷胱甘肽合成酶基因GSH II，以及半胱氨酸相关合成酶胱硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚-γ-裂解酶CYS4基因。

其中，所述菌株为甲醇利用型酵母，优选Hansenula、Candida、Pichia或Tomlopsis种属的酵母，更优选Pichia pastoris种属菌株。

其中，所述GSH I、GSH II基因和CYS3、CYS4基因源于酵母或人工合成的相关酶的突变体。

本发明的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，包括以下步骤：

1、构建重组半胱氨酸相关合成酶基因CYS3、CYS4表达载体；

2、构建重组GSH相关合成酶基因GSH I、GSH II表达质粒集合；

3、转化步骤1得到的表达CYS3、CYS4基因表达载体PCR产物到宿主菌株中，用抗性平板筛选得到表达CYS3、CYS4基因的菌株；

4、将步骤2得到的质粒集合经过限制性内切酶线性化后转化到步骤3得到的菌株中；

5、筛选步骤4得到的菌株，得到高产谷胱甘肽的菌株。

其中，步骤1所述的构建重组半胱氨酸相关合成酶基因CYS3、CYS4表达载体包括如下步骤：

1、G418抗性基因和宿主菌胱硫醚合酶CBS基因的克隆；

2、CYS3、CYS4基因的克隆；

3、将步骤2得到的基因分别插入甲醇利用型酵母表达质粒中；

4、将G418抗性基因和上述3带有启动子的CYS3、CYS4基因片段连接并插入到来源于宿主菌CBS基因序列中。

其中，步骤2所述的构建重组GSH相关合成酶基因GSH I、GSH II表达质粒集合包括如下步骤：

1、GSH I和GSH II基因的克隆；

2、将GSH I和GSH II基因分别插入甲醇利用型酵母表达质粒中；

3、将步骤2得到的质粒或步骤2 GSH I、GSH II基因PCR产物，采用相同限制性内切酶或同尾酶，酶切分别得到带有启动子的GSH I的基因片段或带有启动子的GSH II的基因片段；

4、将带有启动子的GSH I的基因片段插入到与步骤3相同限制性内切酶酶切的GSHII表达载体之中，或者将带有启动子的GSH II的基因片段插入到与步骤3相同限制性内切酶酶切的GSH I表达载体之中，得到GSH I与GSH II基因数的比例随机的表达载体的集合；

5、以上述表达载体为模板，扩增获得带有启动子的GSH I-GSH II片段；

6、将GSH I-GSH II片段PCR产物和质粒pAO815去除表达框的PCR产物采用相同限制性内切酶或同尾酶酶切后再连接，得到GSH I、GSH II基因数的比例随机，且GSH I-GSH II片段的拷贝数随机的表达质粒集合。

上述的GSHI与GSHII基因、胱硫醚合酶CYS3和胱硫醚-γ-裂解酶CYS4基因是分别被装入表达载体中，而且它们分别都有连接可以在甲醇利用型酵母细胞内发生作用的启动子序列之后。启动子可以是组成型pGAP启动子，也可以是诱导型AOX启动子或其他可以在甲醇利用型酵母细胞内发挥作用的启动子。

通过本发明的谷胱甘肽生产菌株的构建方法筛选出的谷胱甘肽高产菌株为甲醇利用型酵母，它的种属为Pichia pastoris，基因型为GS115[(cys3、cys4、kan^r)，his⁺，aox1::(gsh1、gsh2)]，菌株保藏号为：CCTCC M 207192，日期2007年12月6日；保藏地点为：武汉，中国典型培养物保藏中心。

在不少情况下，外源基因整合的高拷贝数蛋白表达量大于低拷贝或单拷贝的菌株[Clare J J et al.，1991)Gene，105：205-212]。因此甲醇利用型酵母中外源蛋白表达的优化，常常包括分离多拷贝的工程菌株，如可以用G418或Zeocin抗性筛选。但本发明却不同，本发明是构建得到GSH I、GSH II基因数的比例可以是随机，GSH I-GSH II片段的拷贝数也是随机的表达质粒集合再来转化甲醇利用型酵母，对上述的转化整合的表达菌株直接用产量为标准来筛选到高产本发明菌株。此菌株基因整合的拷贝数可能为高拷贝或低拷贝或单拷贝。

在含有较高硫酸铵含量的BMGY培养基中培养工程菌GS115(his^-、cbs::(cys3、cys4、kan^r))，与对照菌相比表达外源CYS3、CYS4基因，促进了细胞GSH的合成。在含有一定量的L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸前体的BMGY培养基中培养工程菌GS115[cbs::(cys3、cys4、kan^r)，his⁺，aox1::(gsh1、gsh2)]，细胞在可以利用培养基中L--半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸做底物，在γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶gsh1和谷胱甘肽合成酶gsh2催化下，大量合成GSH。通过比对照菌株(没有转化表达外源GSH I、GSH II基因的甲醇利用型酵母)可以确证外源GSH I、GSH II基因的表达促进了细胞内GSH产量的提高

有益效果：本发明克服了现有研究生产GSH的方法中，大肠杆菌或酿酒酵母工程菌内GSH含量高但单位发酵体积中菌体含量低的缺点，利用甲醇利用型酵母具有培养低成本、生物积累量高，大规模发酵可以得到极高的细胞密度和生物转化率的特点，运用在甲醇利用型酵母的细胞内表达来源于酿酒酵母的GSH合成酶的技术路线，通过将其置于强的组成型启动子的调控之下，使细胞内能够产生大量GSH相关合成酶，从而使细胞内合成大量GSH。本发明同时解决了如何使得构建的工程菌能达到GSHI、GSHII高效、协调表达问题和达到了表达外源CYS3、CYS4基因，增加半胱氨酸在细胞体内合成量的途径，以降低GSH的合成生产成本的目的。通过筛选我们得到GSHI和GSHII为一定比例的和GSHI-GSH II片段为一定拷贝数的转化子，与野生型甲醇利用型酵母相比其细胞的GSH含量也相应提高了18倍。在摇瓶条件下，该菌的GSH产量达到0.462g/L，达细胞干重的3％以上(表2)。

附图说明

生物材料保藏情况：日期2007年12月6日，单位中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，编号M207192。

图1为重组表达pPICG1G2质粒的构建示意图；

图2为CYS3、CYS4基因表达载体的构建示意图；

图3为重组菌的GSH生产曲线。

具体实施方式

本发明可以通过下述实施例进一步阐明。

实验材料和方法简要说明：

1、酶以及主要试剂

菌株GS 115、质粒pGAPZA、pAO815、pPIC3.5K，Saccharomyces cerevisiae strainS288c，E.coli top10来自于本实验室。所用的酶(内切酶、Taq、Ex Taq、Pyrobest以及T₄连接酶等)购自Takara公司。蛋白胨(Tryptone)、酵母抽提物(Yeast Extract)购自Oxoid公司；HPLC使用试剂购于江苏汉邦。

2、常规的分子生物学操作

酵母和质粒DNA的提取、纯化，PCR反应，DNA酶切、连接均参考《分子克隆实验指南》、《酵母遗传学方法实验指南》以及试剂盒产品说明书。

实施例1：重组GSH相关合成酶表达pAOG1G2质粒的构建(示意图1)

1、酿酒酵母基因组DNA的提取

按照《酵母遗传学方法实验指南》提取酿酒酵母基因组DNA。接种酿酒酵母S288c于4ml YPD培养基中(1％酵母膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，28-30℃ 16-18小时。取培养液离心沉降细胞(3000rpm，10min)，然后以冷的、等体积的无菌蒸馏水洗涤再离心，将细胞沉淀转移到1.5ml离心管，在200μl裂解缓冲液(2％(v/v)Triton X-100，1％(v/v)SDS，100mM NaCl，10mM Tris碱(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))中重悬浮，然后加入约300μl酸洗的玻璃珠和200μl的1∶1苯酚：氯仿混和液，漩涡摇匀1-2min，加入200μl的TE缓冲液(10mM Tris碱(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))，倒置混合6-10次。在离心机中以13000rpm的速度离心样品5min。将上层的水相转移到干净的微量离心管中，加入1体积(400μl)氯仿并翻转混合，13000rpm的速度离心5min。将上层的水相转移到新的微量离心管中加1ml乙醇，翻转混匀，13000rpm离心2min，弃上清液，用1ml的70％乙醇洗涤沉淀。完全弃去上清液，并将沉淀在室温下干燥。沉淀在400μl含有最后浓度为2μg/ml的核糖核酸酶的TE缓冲液中重悬，37℃10min后，加1ml乙醇，翻转混匀，13000rpm离心2min，弃上清液，用1ml的70％乙醇洗涤沉淀。完全弃去上清液，并将沉淀在室温下干燥，然后沉淀在50μl TE中重悬。

2、GSH I和GSH II基因克隆

根据酿酒酵母基因组数据库中GSH1和GSH2基因(GneBank D90220.1和854108)设计合成了引物：

GSH I上游引物(5′sense primer)pgsh1-1 GAAGCTCGAGATGGGACTCTTAGCTTTGGGCACGCC、GSH1下游引物(3′anti-sense primer)gsh1-2 TCCTCGGGGCCCAATGGTCACGGCGTCTGGCTACG。

GSH II上游引物pgsh2-1 CCTACTCGAGATGGCACACTATCCACCTTCCAAGG、GSH2下游引物gsh2-2 GTACATGGGCCCTTAGTAAAGAATAATACTGTCCAAAC。

以本实施例1方法提取Saccharomyces cerevisiae strain S288c染色体DNA为模板，用Pyrobest聚合酶扩增获得GSH I和GSH II基因。

在设计GSH I、GSH II上游引物和下游引物分别都引入xho1和apa1限制性内切酶。

将引物对pgsh1-1、pgsh1-2和pgsh2-1、pgsh2-1以提取获得的酿酒酵母基因组DNA为摸板扩增获得的GSH I和GSH II。

3、重组GSH相关合成酶表达pAOG1G2质粒的构建

将引物对pgsh1-1、pgsh1-2和pgsh2-1、pgsh2-1扩增获得的GSH I和GSH II基因用限制性内切酶xho1和apa1酶切并连接到相同的酶处理的质粒pGAPZA上得pGAPG1和pGAPG2(示意图1)。将pGAPG2用BglII和BamH1酶切回收带有GSH2基因片段GAPG2。将pGAPG1用BglII酶切用并碱性磷酸酶处理最终得到DNA片段GAPG1。用T4连接酶连接GAPG1和GAPG2得到质粒pGG1G2(示意图1)。

根据质粒pGG1G2设计克隆GSH I-GSH II片段引物，在远离GAP启动子和AOXITT的上下游设计引物，上游引物(5′sense primer)pGG-1：GATCGCGGCCGCGGGGTCTGACGCTCAGTGGAAC，下游引物(3′anti-sense primer)pGG-2：AGTGCGGCCGCGATGCGCGGA GTCCGAGAAAATCTG。上下游引物都引入NotI酶切位点。

以质粒pGG1G2为模板，上述引物对pGG-1、pGG-2为引物，用Pyrobest聚合酶扩增获得GSH1-GSH2片段。

根据质粒pAO815设计上下游引物，上游引物(5′sense primer)TTGTGCGGCCGCTAATGCGGTAGTTTATCACAG，下游引物(3′anti-sense primer)TGTCAAGCGGCCGCAGTCGCAATTATGAAAGTAAG。上下游引物都引入NotI酶切位点。

以质粒pAO815为模板，上述引物对为引物，用Ex Taq聚合酶扩增获得pAO815(去除表达框)片段。

用NotI酶切GSH I-GSH II和pAO815 PCR片段，质粒pAO815(去除表达框)PCR片段NotI酶切后再用碱性磷酸酶处理防止自连接。用T4连接酶连接两片段，得到一个表达pAOG1G2质粒的集合(示意图1)。

实施例2：CYS3、CYS4基因表达载体的构建

1、宿主菌Pichia pastoris GS115基因组的提取

方法同实施例1中酿酒酵母基因组DNA的提取。

2、G418抗性基因和CBS基因的克隆

根据质粒pPIC3.5K设计上下游引物，上游引物(5′sense primer)pkan-1TGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGC，下游引物(3′anti-sense primer)pkan-2GGGGTGTTATGAGCCATATTCAACG。

以质粒pPIC3.5K为模板，上述引物对为引物，用Pyrobest聚合酶扩增获得来源于大肠杆菌转座子Tn903 G418抗性基因Kan片段。

根据GS115菌株基因组CBS基因(GenBank No.AF367364)设计上下游引物，上游引物(5′sense primer)pCBS-1 AGAAATACATACTATGTCAGACAACAACC，下游引物(3′anti-sense primer)pCBS-2 AGATAGTGTATGCCTAGATGGTACGCAGGC。

以GS115菌株基因组为模板，上述引物对为引物，用Pyrobest聚合酶扩增获得CBS基因片段。

3、酿酒酵母cys3、cys4基因的克隆

根据酿酒酵母基因组数据库(www.yeastgenome.org)cys3、cys4基因信息设计合成了引物：

5′sense primer pcys3-1 AGACTCGAGATGACTCTACAAGAATCTGATAAATTTGC，3′sense primer CTTGGGCCCTTAGTTGGTGGCTTGTTTCAAGGCTTG；5′sense primerpcys4-1 TCACTCGAGATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCCG，3′sense primer pcys4-2CTTGGGCCCTTATGCTA AGTAGCTCAGTAAATCCATC。

在设计CYS3和CYS4上游引物和下游引物分别都引入xho1和apa1限制性内切酶。

将引物对pcys3-1、pcys3-2和pcys4-1、pcys4-2为引物，以提取获得的酿酒酵母基因组DNA为摸板扩增获得的CYS3和CYS4。

4、CYS3、CYS4基因表达载体的构建

将扩增获得的CYS3、CYS4基因用酶xho1和apa1限制性内切酶酶切分别连接于相同酶切的质粒pGAPZA中，得载体pGAPCYS3和pGAPCYS4。

在pGAPCYS4的pGAP上游设计引物pGAP-1 TGCATGAAGATCTTTTTTGTAGAAATG。以pGAP-1与pcys4-2为引物对，以pGAPCYS4为模板PCR得带pGAP启动子的CYS4基因序列。以pGAPCYS3的pGAP上游较远处设计引物pGAP-2CTCACGTTAAGGGATTTTGGTCA。以pGAP-2与pcys3-2为引物对，以pGAPCYS3为模板PCR得带pGAP的CYS3基因序列。

再设计CYS4上游引物pcys4-3 CAAGCCTTGAAACAAGCCACCAACTAATGCATGAAGATCTTTTTTGTAG，其下划线序列带pGAP的CYS3基因3′部分序列。根据以上述pcys4-3与pcys4-2为引物，pGAP的CYS4基因序列为模板扩增获得带CYS3基因3’部分序列的CYS4基因pGAPCYS4-1。再以引物pGAP-2和pcys4-2为引物对，pGAPCYS4-1基因片段和带pGAP的CYS3基因序列为模板扩增获得带pGAP启动子的串联CYS3-CYS4基因序列(图2)。

根据CYS3-CYS4设计CYS4下游引物pcys4-4GCTCTCATCAACCGTGGCTCCCT CATTATGCTAAGTAGCTCAGTAAATCCATC，其划线序列与G418抗性基因5′部分序列同。以引物pGAP-2和pcys4-4为引物对，以CYS3-CYS4基因序列为模板扩增获得CYS3-CYS4-2；以G418抗性基因、CYS3-CYS4-2 PCR产物为模板，以pGAP-2、pkan-2为引物PCR扩增获得pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan基因序列(图2)。

根据CBS基因片段，设计两引物，pCBS-3：TGACCAAAATCCCTTAACGTGAGGAAGAGCTAGAATGGAACCATGAGGATCA，pCBS-4：CGTTGAATATGGCTCATAAC ACCCCGATGAAAGTGCTGTAGTTGTTGTCG。pCBS-3、pCBS-4 5′端都分别带有pGAPCYS3 5′部分序列、G418抗性基因3′端部分片段。

以上述的CBS PCR产物为模板，以引物pCBS-1和pCBS-3、pCBS-2与pCBS-4为引物对扩增得5′和3′端CBS基因部分片段5′CBS和3′CBS。

以5′CBS和pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan片段为模板，以引物pCBS-1和pkan-2为引物对，PCR扩增得5′CBS-pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan基因序列片段；以3′CBS和5′CBS-pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan片段为模板，以引物pCBS-1和pCBS-2为引物对，PCR扩增得5′CBS-pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan-3′CBS的CBS基因的整合表达载体(示意图2)。

实施例3：表达外源胱硫醚合酶和胱硫醚-γ-裂解酶基因重组细胞的构建

1、电转巴斯德毕赤酵母细胞准备

将GS115菌株接种于2ml YPD培养基，30℃培养12～20小时，以1∶100比例接种于100ml YPD培养基中，30℃培养至OD₆₀₀＝1.3～1.5，4℃，1500g离心10min，沉淀用预冷的无菌水悬浮洗涤2次，4℃，1500g离心10min，再用预冷的1mol/L D-山梨醇悬浮洗涤沉淀2次，4℃，1500g离心10min后，所得GS115重悬于0.3ml预冷的1mol/LD-山梨醇中，冰上放置待用。

2、表达外源胱硫醚合酶和胱硫醚-γ-裂解酶基因重组细胞的构建

用PCR产物胶回收试剂盒抽提相当于3-4个小抽量的上示例4的上述5′CBS-pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan-3′CBS的CBS基因的整合表达载体PCR产物约10ug以备转化。每管取感受态GS115 80μl，分别加入5-20μg DNA(于5-10μl TE中)，小心混匀，加入电转化杯(电极间距0.2cm)，冰浴5min后。电转条件：1.5kv，25uF，200Ω，5ms。电极化后的细胞加200μl预冷的1mol/L D-山梨醇，混匀后铺YPD G418平板，30℃倒置培养3～5天，得到GS115(his^-，cbs::(cys3、cys4、kan^r))菌株。

实施例4：表达外源的GSH I和GSH II合成酶重组细胞的构建

1、电转巴斯德毕赤酵母细胞准备

将GS115(his^-，cbs::(cys3、cys4、kan^r))菌株接种于2ml YPD培养基，30℃培养12～20小时，其余同上实施例1。

2、重组表达质粒pAOG1G2电转巴斯德毕赤酵母细胞

用质粒抽提试剂盒抽提相当于3-4个小抽量的P.pastoris表达质粒pAOG1G2约10ug，限制性内切酶SacI酶切线性化后，2倍以上的无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤两次，晾干后以10μl TE缓冲液溶解，以备转化。每管取感受态GS115(his^-，cbs::(cys3、cys4、kan^r))80μl，分别加入5-20μg线性化的DNA(于5-10μl TE中)，小心混匀，加入电转化杯，冰浴5min后。电转条件：1.5kv，25uF，200Ω，5ms。电极化后的细胞加200μl预冷的1mol/L D-山梨醇，混匀后铺RDB平板，30℃倒置培养3～5天。

实施例5高产菌株的筛选

挑选单克隆菌株，接入于3ml含0.05％半胱氨酸、0.05％谷氨酸和0.05％甘氨酸的BMGY培养基中，30℃、240r/m 48小时，检测胞内GSH含量。

实施例6高效液相色谱测定GSH含量

待测样品的制备：取一定量的培养液加入终体积的3.3％的高氯酸，4℃剧烈震荡5分钟，12000g离心20分钟后上清液过滤，过滤液待上样。色谱条件：色谱柱：C18(4.6×250mm)，磷酸盐溶液(取磷酸二氢钾6.8克，庚烷磺酸钠2.2克，加水溶解使成1000ml，用磷酸调节PH值至3.0)-甲醇(97∶3体积比)流速：1ml/min，检测波长210nm。进样量为5微升，GSH在16分钟左右出峰。

实施例7摇瓶培养重组甲醇酵母

挑取筛选的工程菌GS115(his^-，cbs::(cys3、cys4、kan^r))单克隆于3ml YPD培养基中，30℃培养20小时后，以1:100比例接种于50ml BMGY培养基中，30℃培养24小时后，检测GSH含量，与对照菌相比，表达外源CYS3、CYS4基因促进了细胞GSH的合成(表1)。

表1.野生型与重组菌GSH产量的比较^*

	P.pastoris X33	GS115(his-，cbs::(cys3、cys4、kanr))
			GSH产量	18.6mg/L	31.2mg/L
GSH含量	1.55mg/g dry cell	2.60mg/g dry cell

^*：培养基为BMGY

挑取筛选的工程菌GS115[cbs::(cys3、cys4、kan^r)，his⁺，aox1::(gsh1、gsh2)]单克隆于3ml YPD培养基中，30℃培养20小时后，以1∶100比例接种于50ml BMGY培养基中，30℃培养24小时后，每天补加0.05％添加半胱氨酸、0.05％谷氨酸0.05％甘氨酸和1％甘油，再连续培养4天，第72小时后GSH产量达最高，达0.462g/L(见示意图3)，达细胞干重的3.85％，与对照菌P.pastoris X33相比产量提高18倍(表2)。

表2.野生型与重组菌GSH产量的比较^*

	P.pastoris X33	GS115(cbs::(cys3、cys4、kanr)，his+，aox1::(gsh1、gsh2))
			GSH产量	25.4mg/L	462.0mg/L
GSH含量	2.11mg/g dry cell	38.50mg/g dry cell

^*：培养基为BMGY(0.05％半胱氨酸、0.05％谷氨酸0.05％甘氨酸)

需要说明的是，本实施例的巴斯德毕赤酵母在发酵时是个高耗氧的过程，在摇瓶发酵并没有完全发挥其高生物积累量的优势(其发酵罐中最高可超过130克干细胞/升)，在本实施例中，菌体摇瓶干重最高达12.0克/升。因此将本发明的方法运用于工业生产中，工程菌的GSH产量还会大大增加。

Claims (10)

1.一种谷胱甘肽生产菌株，其特征在于所述菌株导入了GSH相关合成酶γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶基因GSH I与谷胱甘肽合成酶基因GSH II，以及半胱氨酸相关合成酶胱硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚-γ-裂解酶CYS4基因。

2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽生产菌株，其特征在于所述菌株为甲醇利用型酵母。

3.根据权利要求2所述的谷胱甘肽生产菌株，其特征在于所述菌株种属为Pichiapastoris。

4.根据权利要求1、2或3所述的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，其特征在于所述GSH I、GSH II基因和CYS3、CYS4基因源于酵母或人工合成的相关酶的突变体。

5.权利要求1所述的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建重组半胱氨酸相关合成酶基因CYS3、CYS4表达载体；

(2)构建重组GSH相关合成酶基因GSH I、GSH II表达质粒集合；

(3)转化步骤(1)得到的表达CYS3、CYS4基因表达载体PCR产物到宿主菌株中，用抗性平板筛选得到表达CYS3、CYS4基因的菌株；

(4)将步骤(2)得到的质粒集合经过限制性内切酶线性化后转化到步骤(3)得到的菌株中；

(5)筛选步骤(4)得到的菌株，得到高产谷胱甘肽的菌株。

6.根据权利要求5所述的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，其特征在于步骤(1)所述的构建重组半胱氨酸相关合成酶基因CYS3、CYS4表达载体包括如下步骤：

(1)抗性基因和宿主菌胱硫醚合酶CBS基因的克隆；

(2)CYS3、CYS4基因的克隆；

(3)将步骤(2)得到的基因分别插入甲醇利用型酵母表达质粒中；

(4)将上述(1)的抗性基因和上述(3)带有启动子的CYS3、CYS4基因片段连接并插入到来源于宿主菌CBS基因序列中。

7.根据权利要求5所述的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，其特征在于步骤(2)所述的构建重组GSH相关合成酶基因GSH I、GSH II表达质粒集合包括如下步骤：

(1)GSH I和GSH II基因的克隆；

(2)将GSH I和GSH II基因分别插入甲醇利用型酵母表达质粒中；

(3)将步骤(2)得到的质粒或步骤(2)GSH I、GSH II基因PCR产物，采用相同限制性内切酶或同尾酶，酶切分别得到带有启动子的GSH I的基因片段或带有启动子的GSH II的基因片段；

(4)将带有启动子的GSH I的基因片段插入到与步骤(3)相同限制性内切酶酶切的GSH II表达载体之中，或者将带有启动子的GSH II的基因片段插入到与步骤(3)相同限制性内切酶酶切的GSH I表达载体之中，得到GSH I与GSH II基因数的比例随机的表达载体的集合；

(5)以上述表达载体为模板，扩增获得带有启动子的GSH I-GSH II片段；

(6)将GSH I-GSH II片段PCR产物和带有甲醇利用型酵母表达质粒pAO815去除表达框的PCR产物采用相同限制性内切酶或同尾酶酶切后再连接，得到GSH I、GSH II基因数的比例随机，且GSH I-GSH II片段的拷贝数随机的表达质粒集合。

8.根据权利要求5、6或7所述的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，其特征在于构建的所述菌株为甲醇利用型酵母。

9.根据权利要求5、6或7所述的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，其特征在于所述GSH I、GSH II基因和CYS3、CYS4基因源于酵母或人工合成的相关酶的突变体。

10.根据权利要求6或7所述的谷胱甘肽生产菌株的构建方法，其特征在于所述的启动子为组成型pGAP启动子或诱导型AOX启动子。

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