CN102586369B - 一种利用重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的方法，包括以下阶段：（1）通过分批培养或补料分批培养大量获得表达外源性双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌细胞，所述双功能谷胱甘肽合成酶指同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性的蛋白；（2）过量表达阶段（1）所述双功能谷胱甘肽合成酶；（3）加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种前体氨基酸实现谷胱甘肽的高效发酵法生产。本发明利用表达外源双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌菌株发酵生产谷胱甘肽，不仅具有高GSH合成能力，而且不受GSH反馈抑制，具有反应快、谷胱甘肽的产量和得率高、生产周期短的优点。

Description

一种利用重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种利用重组大肠杆菌高效发酵生产谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽（GSH）是一种具有重要生理功能的由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。谷胱甘肽广泛分布于动物、植物、微生物中，参与蛋白质和核糖核酸的合成，氧及营养物质的运输，维持内源酶的活力，体内三羧酸循环及糖代谢，清除体内过多自由基等。临床上谷胱甘肽用于抗辐射、抗肿瘤、抗氧中毒、抗衰老和协调内分泌的治疗。此外谷胱甘肽也被用作食品添加剂，用来延长食品的保质期和强化食品中的氨基酸成分。

谷胱甘肽主要的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法和酶法。其中发酵法生产谷胱甘肽将菌体培养和谷胱甘肽合成在一个过程中完成，能有效解决谷胱甘肽合成时ATP供应的问题，相关的报道和应用较多，发酵水平也在逐渐提高，采用的菌株主要为酵母菌，如酿酒酵母和假丝酵母，或基因工程菌，如大肠杆菌和毕赤酵母等。利用基因工程方法构建GSH高产菌株的研究，主要是将来源于大肠杆菌或酿酒酵母的谷氨酰基半胱氨酸合成酶（GCS）和谷胱甘肽合成酶（GS）基因在宿主菌中过量表达，是提高发酵法生产水平的主要途径。例如：陈坚等 (Letters in Applied Microbiology (2006) 43: 211–214)在大肠杆菌中过量表达大肠杆菌中的GCS和GS，重组菌JM109 (pVB03) 的GSH生产水平可以达到34.8 mg /g湿菌体；陈少欣等（Bioprocess Biosystem Engineering (2009) 32：729－735）在毕赤酵母中表达酿酒酵母中的GCS和GS，用重组菌毕赤酵母GS115（pGAPZHGSH）进行高密度发酵，菌体浓度达98.15g(干重)/L，GSH的浓度达到4.15 g/L，单位菌体生产水平为42 mg/g 干菌体。许善峰等构建了既包含谷胱甘肽合成酶，同时又表达半胱氨酸合成相关酶系的甲醇酵母。金大勇等进一步开发了该菌株的发酵工艺，发酵88小时GSH的浓度达到6.58 g/L，菌体浓度大于300OD。

以上生产方法的周期较长，单位菌体的生产水平仍然偏低，需要进一步提高生产强度和单位菌体生产水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反应快、谷胱甘肽的产量和得率高的利用重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的方法。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种利用重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的方法，包括以下阶段：

（1）通过分批培养或补料分批培养大量获得表达外源性双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌细胞，所述双功能谷胱甘肽合成酶指同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性的蛋白；

（2）过量表达阶段（1）所述双功能谷胱甘肽合成酶；

（3）加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种前体氨基酸实现谷胱甘肽的高效发酵法生产。

阶段（1）中所述重组大肠杆菌为BL21/pET28a-gshF或者JM109/pTrc99a-gshF。

阶段（3）中三种前体氨基酸的加入方式为一次性加入、多次分批加入或缓慢流加。

发酵过程中使用的发酵碳源为葡萄糖、乳糖、甘油和乙酸中的一种或几种。

该重组大肠杆菌菌株可通过常规方法进行高密度培养实现双功能谷胱甘肽合成酶的高表达，如斜面培养活化菌种、种子培养，采用各种培养基进行高密度发酵，包括基本培养基或复合培养基。通过补料培养基或底物流加提高菌体密度，并对温度、pH、溶氧等进行控制。

本发明的技术思路如下：

（1）种子培养：斜面种子（斜面培养基——蛋白胨10g/L、酵母提取物 5g/L、氯化钠 10 g/L、琼脂20 g/L）活化后接入种子培养基（蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、氯化钠 10 g/L），37℃培养过夜。

（2）发酵和产物合成：种子培养液以2-10%的接种比例接入发酵培养基中，开始分批培养，发酵温度28～37℃，搅拌转速300～1000rpm，通气量0.5～2vvm，pH6.0～8.0，DO 10％以上，调节转速及通气量维持发酵液的溶氧水平不低于10％，在碳源消耗完后，向发酵培养基中流加补料培养基。菌体达到较高浓度后过量表达双功能合成酶，当其活性达到足够高后，添加三种前体氨基酸，其浓度为10～60 mmol/L。继续培养至单位体积谷胱甘肽不再增加。

（3）谷胱甘肽分析：发酵液加入10%的三氯乙酸，混合均匀，4℃放置一小时，离心取上清液，采用HPLC方法测定谷胱甘肽。

本发明的优点在于：本发明利用表达外源双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌菌株发酵生产谷胱甘肽，不仅具有高GSH合成能力，而且不受GSH反馈抑制，具有反应快、谷胱甘肽的产量和得率高、细胞培养时间和生产周期短、单位菌体谷胱甘肽生产水平高的优点。该重组大肠杆菌采用发酵法直接生产GSH的方法，避免了采用生物转化法时需供应ATP的问题，有利于降低谷胱甘肽的生产成本。

附图说明

图1为实施例1的PCR产物电泳图。

图2为重组大肠杆菌JM109/pTrc99A-gshF的构建。

图3为重组大肠杆菌BL21/pET28a-gshF的构建。                            

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。

实施例1：双功能谷胱甘肽合成酶的基因克隆。

以嗜热链球菌Streptococcus thermophilus基因组DNA为模板，利用引物CGGCGAATTCACGATGACATTAAACCA和GGCAAGCTTTTAAGTTTGACCAGCCACT，进行PCR扩增，得到长度为2.3kb左右的DNA片断（基因序列号为GU138096）。PCR产物电泳图如图1所示。

实施例2：表达外源性双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌的构建。

将实施例1中PCR扩增的gshF基因片断和表达载体pTrc99A用限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ 于37℃ 酶切过夜，电泳回收目的条带，两片段在T4连接酶的作用下，16℃连接反应12小时，得到pTrc99A-gshF质粒。并转化大肠杆菌JM109，获得重组大肠杆菌JM109/pTrc99A-gshF（图2）。

将质粒pTrc99A-gshF和质粒pET28a用EcoRⅠ和 Hind Ⅲ在37℃酶切过夜，电泳回收，连接酶切好的目的片断gshF与载体片断pET28a，16℃过夜，得pET28a-gshF。将重组质粒pET28a-gshF转入大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-gshF（图3）。

实施例3：自诱导培养基发酵。

所用菌株为BL21/pET28a-gshF，由实施例2所述方法构建。将过夜培养的种子培养液以5%的接种量接入到装有3L复合培养基（蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、50 mM 磷酸缓冲液pH 7.6、氯化铵 50 mM、硫酸钠 5 mM、硫酸镁 2 mM、0.2 mL微量元素、甘油20 g/L、葡萄糖0.6 g/L、α-乳糖2 g/L）的5L发酵罐中，发酵温度为30℃，通过控制空气流量和转速，维持溶氧在20%以上。流加氨水控制pH 7.0。菌体OD为30时，添加三种氨基酸，继续培养2小时，谷胱甘肽含量为3.20 g/L，单位菌体生产水平为240 mg/g 干菌体，生产强度为165 mg/L/h。

实施例4：葡萄糖为碳源发酵。

所用菌株同实施例3。将过夜培养的种子培养液以5%的接种量接入到装有3L基本培养基（葡萄糖5 g，磷酸氢二钠 15.12 g，磷酸二氢钾 3 g，氯化铵2-5 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，氯化钙 0.011 g，0.2mL微量元素，1%维生素B1 0.2 mL）的5L发酵罐中，发酵温度为37 ℃。5h开始流加补料培养基（葡萄糖500 g/L，硫酸镁25 g/L），控制残糖基本为零，通过控制空气流量和转速，维持溶氧在10%以上。流加氨水控制pH 7.0。发酵10小时，添加诱导物IPTG，浓度为1 mmol/L。菌体OD为45时，添加三种氨基酸，继续培养3小时，谷胱甘肽含量为3.40 g/L，单位菌体生产水平为226 mg/g 干菌体，生产强度为 262 mg/L/h。

实施例5：葡萄糖为碳源发酵。

除分批阶段添加蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L外，其他条件与实施例4相同。谷胱甘肽含量为4.50 g/L，单位菌体生产水平为218 mg/g 干菌体，生产强度为 285 mg/L/h。

实施例6：甘油为碳源发酵。

除用甘油替代葡萄糖，其他条件与实施例4相同。谷胱甘肽含量为3.00 g/L，单位菌体生产水平为236 mg/g 干菌体，生产强度为 182 mg/L/h。

实施例7：葡萄糖和甘油为碳源发酵。

除在流加阶段用甘油替代葡萄糖，其他条件与实施例4相同。谷胱甘肽含量为3.10 g/L，单位菌体生产水平为206 mg/g 干菌体，生产强度为 194 mg/L/h。

实施例8：葡萄糖和甘油为碳源并以乳糖诱导。

除在流加阶段用甘油替代葡萄糖，添加诱导物用乳糖代替IPTG，浓度为5g/L，其他条件与实施例4相同。谷胱甘肽含量为3.30 g/L，单位菌体生产水平为210 mg/g 干菌体，生产强度为185 mg/L/h。

实施例9：乙酸为碳源发酵。

除用乙酸替代葡萄糖，其他条件与实施例4相同。谷胱甘肽含量为3.05 g/L，单位菌体生产水平为218 mg/g 干菌体，生产强度为152 mg/L/h。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1. 一种利用重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下阶段：

（1）通过分批培养大量获得表达外源性双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌细胞，所述双功能谷胱甘肽合成酶指同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性的蛋白；

（2）过量表达阶段（1）所述双功能谷胱甘肽合成酶；

（3）加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种前体氨基酸实现谷胱甘肽的高效发酵法生产；

阶段（1）中所述重组大肠杆菌为BL21/pET28a-gshF或者JM109/pTrc99a-gshF；

阶段（3）中三种前体氨基酸的加入方式为一次性加入、多次分批加入或缓慢流加；

发酵过程中使用的发酵碳源为葡萄糖、乳糖、甘油和乙酸中的一种或几种。

Images