CN101245363A

CN101245363A - 一种谷胱甘肽的生产发酵工艺

Info

Publication number: CN101245363A
Application number: CNA2008100197616A
Authority: CN
Inventors: 金大勇; 许善峰; 蔡宇杰
Original assignee: NANJING HUAJIN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: NANJING HUAJIN BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2008-08-20

Abstract

本发明公开了一种谷胱甘肽的生产发酵工艺，采用CCTCC M 207192的为发酵菌株，接种于种子培养基摇瓶培养后，再接种于富含硫酸盐的发酵培养基中进行培养，在通气，搅拌下，28～30℃，发酵培养一定时间后再补加一定量L－半胱氨酸、L－甘氨酸、L－谷氨酸的前体以提高产品谷胱甘肽的合成速度和产量。本发明的谷胱甘肽的生产发酵工艺具有培养成本低、生物积累量高的优点，大规模发酵可以得到极高的细胞密度和生物转化率，这将大大有利于实现发酵法制备谷胱甘肽的产业化。

Description

一种谷胱甘肽的生产发酵工艺

技术领域

本发明涉及工业微生物领域，具体涉及谷胱甘肽生产菌株发酵工艺。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，由于其具有多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用，在临床医药、食品工业、体育运动及有关生物研究领域有着广泛的用途(Sies H(1999).Glutathione and its role in cellular functions.Free Rad Biol Med.27，916-921；郑云朗.(1995).谷胱甘肽的生物学功能.生物学通报30，22-24)。自20世纪70年代起，国外发酵生产GSH方面进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关的专利(陈坚，卫功元，李寅等(2004)微生物发酵法生产谷胱甘肽，无锡轻工大学学报，23.104108；US Patent 6902912；US Patent 4598046；US Patent 4582801；JP19890032584；WO2004/003217 A1；EP1539982；US Patent 20050239164)。但在实际的发酵生产中，性能优良的菌种仅仅是一个开始；获得可以得到培养低成本、生物积累量高，大规模发酵极高的细胞密度和生物转化率的工艺，同样是实现GSH工业化生产所需要解决的关键问题；而这方面的研究大都是从20世纪90年代以后开始的，主要包括营养与环境条件优化、发酵过程控制以及前体物质的添加等内容(陈坚，卫功元，李寅等(2004)微生物发酵法生产谷胱甘肽，无锡轻工大学学报，23.104108)。发酵生产GSH一般在发酵过程中添加三种氨基酸前体以提高产量(陈坚，卫功元，李寅等(2004)微生物发酵法生产谷胱甘肽，无锡轻工大学学报，23.104108)。三种氨基酸前体之一的半胱氨酸最为重要，它的供应与利用直接影响GSH的产量(Catalino G.A.，Akihisa K.，Toru S.et al.(1991)Appl Microbiol Biotechnol.，6：538-540；WEN，S.，T.ZHANG and T.TAN(2004)Enzyme Microb.Technol.35：501-507)。半胱氨酸与甘氨酸、谷氨酸相比价格较贵。GSH的生产中如果增加细胞内的半胱氨酸含量、就可以减少外源半胱氨酸添加量，生产成本将会大大降低。因此，增加细胞内的半胱氨酸含量，减少发酵GSH前体添加量，获得培养低成本、生物积累量高，大规模发酵极高的细胞密度和生物转化率的工艺是发酵发酵生产谷胱甘肽产业化的前提。

为此，我们做了很多这方面的研究，开发了一种谷胱甘肽生产菌株，其导入了GSH相关合成酶γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶基因GSH I与谷胱甘肽合成酶基因GSH II，以及半胱氨酸相关合成酶胱硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚-γ-裂解酶CYS4基因。该菌株是甲醇利用型酵母，它的种属为Pichia pastoris，基因型为GS115[cbs::(cys3、cys4、kan^r)，his⁺，aox1::(gsh1、gsh2)]，菌株保藏号为：CCTCC M 207192，日期2007年12月6日；保藏地点为：武汉，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。并申请了专利“一种谷胱甘肽生产菌株及其构建方法”(200710192345.1)。该菌株具有细胞内能够产生大量GSH相关合成酶、半胱氨酸相关合成酶，增加半胱氨酸在细胞体内合成量的途径，从而使细胞内合成大量GSH的特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用上述甲醇利用型酵母CCTCC M207192生产谷胱甘肽的高产量、低成本的发酵工艺。

为解决上述技术问题，本发明的思路是甲醇利用型酵母CCTCC M 207192具有细胞内能够产生大量GSH相关合成酶、半胱氨酸相关合成酶，增加半胱氨酸在细胞体内合成量的途径，从而使细胞内合成大量GSH的特点。因此，发酵培养选择在硫酸盐含量丰富培养基中培养，有可能使酵母菌细胞内硫元素的同化代谢流流向半胱氨酸的合成，提高胞内半胱氨酸的含量，减少外源半胱氨酸的供给量，降低GSH的合成生产成本，同时选择合适的时机添加GSH前体可以提高谷胱甘肽的合成速度和产量。

具体技术方案如下：

一种谷胱甘肽的生产发酵工艺，采用甲醇利用型酵母CCTCC M 207192为发酵菌株，经种子培养和预发酵培养后，接种在富含硫酸盐的发酵培养基中，在DO 20～40％、28～30℃、pH 5.0～6.0、发酵培养基中的甘油的重量百分比为1～2％的条件下进行发酵罐培养，当发酵OD达到250～350时，补加谷胱甘肽的前体L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，控制发酵液中谷胱甘肽每种前体的浓度为5～40mmol/L，继续培养到单位体积谷胱甘肽量不再增加为止。

其中，所述的富含硫酸盐的发酵培养基组成为：10g/L酵母抽提物，10g/L玉米浆、10g/L甘油，10～30g/L硫酸铵，6g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，5g/L硫酸镁，2mL/L微量元素溶液，pH 5.0～6.0。其中，所述的微量元素溶液按如下方式配制：1L的微量元素溶液是将0.07g MnSO₄·H₂O，0.4g CoC₁₂·6H₂O，0.2g FeSO₄H₂O，0.2g ZnCl₂，0.1gCuSO₄·5H₂O，0.05g H₃BO₄，1.5g CaCl₂溶解于浓硫酸中。

其中，发酵罐培养过程中的接种量为5～10％(v/v)。

其中，通过调节通气量1.0～2.5m³/h、搅拌转速400～900rpm、罐压0.05～0.08Mpa等控制DO为20～40％。

其中，通过流加氨水控制pH值。

其中，发酵中后期流加谷胱甘肽的前体为：L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，每种前体流加液浓度为4mol/L。

以上，调节本发明DO值和pH值的操作为本技术领域常规技术，任何本技术领域技术人员都可实现。

有益效果：本发明的谷胱甘肽的生产发酵工艺利用甲醇利用型酵母CCTCC M207192具有培养低成本、生物积累量高、大规模发酵可以得到极高的细胞密度和生物转化率的特点，通过工艺控制使细胞内合成大量GSH。本发明在富含硫酸盐的发酵基质中培养CCTCC M 207192，并流加L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸等前体，GSH产量达到6.5g/L以上，达细胞干重的3％以上(图1)，明显具有工业化的前景。

附图说明

图1为GSH含量随发酵时间的变化曲线。

具体实施方式：

本发明可以通过下述实施例进一步阐明。

实验材料和方法简要说明：

1、菌株以及主要试剂

菌株为甲醇酵母CCTCC M 207192；蛋白胨(Tryptone)、酵母抽提物(Yeast Extract)购自Oxoid公司；工业级酵母抽提物购于安琪酵母股份公司；HPLC使用试剂购于江苏汉邦，其余试剂为国产试剂。

2、发酵液中甘油含量测定

(1)试剂与标准溶液的配制

Nash试剂：精确称取乙酸按150g，蒸馏水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酞丙酮，定容至1000mL。

0.015mol/L高碘酸钠溶液：精确称取高碘酸钠3.2g，溶于0.12mol/L的HCl，定容至1000mL。

0.1％L-鼠李糖：精确称取L-鼠李糖0.1g溶于蒸馏水，定容至100mL。

甘油标准溶液的配制：先配制0.1g/L的母液，再根据需要稀释成不同浓度的甘油溶液。

以上所用试剂均为分析纯。

(2)发酵液中甘油含量比色法测定

①比色法测定

取一定浓度的标准品甘油溶液和样品稀释液各1mL，分别置于不同比色管中，然后分别加入1mL 0.015mol/L高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，然后加入2mL0.1％L一鼠李糖溶液，以除去过多的高碘酸盐，混匀后加入4mL新鲜配制的Nash试剂，在53℃水浴中加热15min，侧其充分呈色，然后以试剂空白作参比，在412nm波长测定吸光度。

②标准曲线的绘制

取不同浓度的标准品甘油溶液各1mL，按上述最大吸收波长的测定方法操作，显色后在412nm下测其吸光度，绘制标准曲线。

③样品的测定

取不同时间的发酵液，3500rpm，离心2min，取上清液，稀释至适当浓度，然后按标准曲线绘制方法进行测定，以试剂空白作参比。

3、高效液相色谱测定GSH含量

待测样品的制备：取一定量的培养液加入终体积的3.3％的高氯酸，4℃剧烈震荡5分钟，12000g离心20分钟后上清液过滤，过滤液待上样。色谱条件：色谱柱：C18(4.6×250mm)；流动相：磷酸盐溶液(取磷酸二氢钾6.8克，庚烷磺酸钠2.2克，加水溶解使成1000ml，用磷酸调节PH值至3.0)-甲醇(97∶3体积比)；流速：1ml/min，检测波长210nm。进样量为5微升，GSH在16分钟左右出峰。

4、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸含量分析

待测样品的制备：取一定量的培养液离心去除细胞，取上清进行含量分析。L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸含量分析采用苯异硫氰酸与α-氨基酸反应(即Edman反应)生成苯异硫氰氨基酸衍生物，然后采用高效液相色谱进行测定。分析柱：氨基酸分析专用柱；柱箱温度：38℃；流动相：乙腈-水；梯度洗脱；流速：1mL/min；检测器：分光光度检测器；检测波长：254nm。

实施例1：种子培养

(1)种子斜面培养基配置

10g/L酵母抽提物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，20g/L琼脂粉，121℃，灭菌20分钟。

(2)摇瓶种子培养基(YPD培养基)配置

10g/L酵母抽提物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，121℃，灭菌20分钟。

(3)种子培养

取甘油管甲醇酵母CCTCC M 207192划线于种子斜面培养基，30℃，36～48小时后接种于摇瓶种子培养基中，30℃，200～240rpm，培养20～24小时。

实施例2：预发酵种子培养

(1)预发酵培养基(BMGY培养基)配置

10g/L酵母抽提物、20g/L蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液，pH 6.0，1.34g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，10g/L甘油；121℃，灭菌20分钟。

注：100mmol/L磷酸缓冲液，pH 6.0要单独灭菌；13.4g/L YNB、4×10^-4g/L生物素过滤除菌。

(2)预发酵种子培养

将制得的摇瓶种子按照10％(v/v)接种量接入预发酵培养基中，30℃，200～240rpm，培养20～24小时。

实施例3：发酵培养

发酵培养基组成为：10g/L酵母抽提物，10g/L玉米浆、10g/L甘油，30g/L硫酸铵，6g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，5g/L硫酸镁，2mL/L微量元素溶液，pH 5.0。其中，所述的微量元素溶液按如下方式配制：1L的微量元素溶液是将0.07g MnSO₄·H₂O，0.4gCoC₁₂·6H₂O，0.2g FeSO₄H₂O，0.2g ZnCl₂，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.05g H₃BO₄，1.5g CaCl₂溶解于浓硫酸中。

将制得预发酵种子10％(v/v)接种量接入有15L发酵培养基的30L发酵罐中，通气量1.0～2.5m³/h，搅拌转速150～900rpm，罐压0.05～0.08Mpa，通过调节通气量、搅拌转速、罐压等控制DO30％，培养温度30℃，流加氨水控制pH 5.0。发酵甘油消耗低于1％含量时，流加50％(w/w)甘油，控制发酵液中甘油含量1～2％。当发酵48小时左右，OD300时，流加GSH前体L-半胱氨酸盐酸盐、L-甘氨酸、L-谷氨酸溶液(每种氨基酸浓度都为4mol/L)，控制发酵液中GSH每种前体浓度为5～40mmol/L，继续培养到单位体积GSH量不在增加为止。发酵时间在88小时，GSH产量达到6.58g/L，达细胞干重的3％以上。

实施例4：发酵培养

发酵培养基组成为：10g/L酵母抽提物，10g/L玉米浆、10g/L甘油，30g/L硫酸铵，6g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，5g/L硫酸镁，2mL/L微量元素溶液，pH 6.0。其中，所述的微量元素溶液按如下方式配制：1L的微量元素溶液是将0.07g MnSO₄·H₂O，0.4gCoC₁₂·6H₂O，0.2g FeSO₄H₂O，0.2g ZnCl₂，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.05g H₃BO₄，1.5g CaCl₂溶解于浓硫酸中。

将制得预发酵种子10％(v/v)接种量接入有18L发酵培养基的30L发酵罐中，通气量1.0～2.5m³/h，搅拌转速150-900rpm，罐压0.08Mpa，通过调节通气量、搅拌转速等控制DO 20％，培养温度30℃，流加氨水控制pH 6.0。发酵甘油消耗低于1％含量时，流加50％(w/w)甘油，控制发酵液中甘油含量1-2％。当发酵56小时左右，OD 350时，流加GSH前体L-半胱氨酸盐酸盐、L-甘氨酸、L-谷氨酸溶液(每种氨基酸浓度都为4mol/L)，控制发酵液中GSH每种前体浓度为5～40mmol/L，继续培养到单位体积GSH量不在增加为止。发酵时间在80小时，GSH产量达到6.42g/L。

实施例5：发酵培养

发酵培养基组成为：10g/L酵母抽提物，10g/L玉米浆、10g/L甘油，10g/L硫酸铵，6g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，5g/L硫酸镁，2mL/L微量元素溶液，pH 6.0。其中，所述的微量元素溶液按如下方式配制：1L的微量元素溶液是将0.07g MnSO₄·H₂O，0.4gCoC₁₂·6H₂O，0.2g FeSO₄H₂O，0.2g ZnCl₂，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.05g H₃BO₄，1.5g CaCl₂溶解于浓硫酸中。

将制得预发酵种子5％(v/v)接种量接入有18L发酵培养基的30L发酵罐中，通气量1.0～2.5m³/h，搅拌转速150～900rpm，罐压0.05～0.08Mpa，通过调节通气量、搅拌转速、罐压等控制DO 20％，培养温度28℃，流加氨水控制pH 6.0。发酵甘油消耗低于1％含量时，流加50％(w/w)甘油，控制发酵液中甘油含量2％。当发酵40小时左右，OD 250时，流加GSH前体L-半胱氨酸盐酸盐、L-甘氨酸、L-谷氨酸溶液(每种氨基酸浓度都为4mol/L)，控制发酵液中GSH每种前体浓度为5～40mmol/L，继续培养到单位体积GSH量不在增加为止。发酵时间在92小时，GSH产量达到6.09g/L。

Claims

1、一种谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于采用甲醇利用型酵母CCTCC M207192为发酵菌株，经种子培养和预发酵培养后，接种在富含硫酸盐的发酵培养基中，在DO 20～40％、28～30℃、pH 5.0～6.0、发酵培养基中的甘油的重量百分比为1～2％的条件下进行发酵罐培养，当发酵液OD达到250～350时，补加谷胱甘肽的前体L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，控制发酵液中谷胱甘肽每种前体的浓度为5～40mmol/L，继续培养到单位体积谷胱甘肽量不再增加为止。

2、根据权利要求1所述的谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于所述的富含硫酸盐的发酵培养基组成为：10g/L酵母抽提物，10g/L玉米浆、10g/L甘油，10～30g/L硫酸铵，6g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，5g/L硫酸镁，2mL/L微量元素溶液，pH 5.0～6.0。

3、根据权利要求2所述的谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于所述的微量元素溶液按如下方式配制：1L的微量元素溶液是将0.07g MnSO₄·H₂O，0.4g CoC₁₂·6H₂O，0.2gFeSO₄H₂O，0.2g ZnC1₂，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.05g H₃BO₄，1.5g CaCl₂溶解于浓硫酸中。

4、根据权利要求1所述的谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于发酵罐培养过程中的接种量为5～10％。

5、根据权利要求1所述的谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于通过调节通气量、搅拌转速和罐压控制DO为20～40％。

6、根据权利要求5所述的谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于通气量为1.0～2.5m³/h，搅拌转速为150～900rpm，罐压为0.05～0.08Mpa。

7、根据权利要求1所述的谷胱甘肽的生产发酵工艺，其特征在于通过流加氨水控制pH值。