CN102766591A - 一种赖氨酸高产菌株的筛选方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种赖氨酸高产菌株的筛选方法及其应用，该方法包括配制固体培养基，将多株赖氨酸发酵菌株接种至固体培养基中进行培养，然后筛选出高产菌株，其特征在于，所述固体培养基为添加了指示剂的固体培养基且所述指示剂的变色pH范围为5.5-8；并通过观察固体培养基中指示圈的大小筛选出所述高产菌株。通过上述技术方案，在赖氨酸发酵菌株的培养过程中，随着营养物质的消耗，会逐渐在固体培养基上形成指示圈，操作人员根据该指示圈的大小便可直观地筛选出高产量的赖氨酸高产菌株，且本发明方法的筛选结果可靠。
Description
技术领域
本发明涉及一种赖氨酸高产菌株的筛选方法及其在发酵产赖氨酸中的应用。
背景技术
现有技术中，一般通过赖氨酸摇瓶发酵筛选赖氨酸高产菌株，具体操作步骤包括：分别将赖氨酸发酵菌株接种至液体培养基中进行摇瓶发酵，发酵结束后测定发酵液中的赖氨酸含量并计算转化率从而筛选出高产量菌株。
而在摇瓶发酵的过程中，随着营养物质的消耗，发酵液的pH值会不断下降，所以需要人工定时取样检测pH值并添加氨水或液氨来控制pH值在适当范围内以保证菌种的正常生长代谢。因此，摇瓶发酵筛选菌株的操作过程繁琐，即每次添加氨水或液氨时至少需要进行2次pH值的测定，而且在添加氨水或液氨时容易使发酵液染杂菌，存在导致筛选失败的风险。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简单且结果可靠的赖氨酸高产菌株筛选方法及其应用。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种赖氨酸高产菌株的筛选方法，该方法包括配制固体培养基，将多株赖氨酸发酵菌株接种至固体培养基中进行培养，然后筛选出高产菌株，其特征在于，所述固体培养基为添加了指示剂的固体培养基且所述指示剂的变色pH范围为5.5-8；并通过观察固体培养基中指示圈的大小筛选出所述高产菌株。
另一方面，本发明提供了上述方法在发酵产赖氨酸中的应用。
通过上述技术方案，在赖氨酸发酵菌株的培养过程中，随着营养物质的消耗，会逐渐在固体培养基上形成指示圈，操作人员根据该指示圈的大小便可直观地筛选出高产量的赖氨酸高产菌株。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明中，在未作相反说明的情况下，术语“指示剂的变色pH范围”指的是指示剂的变色pH点所在的范围。
本发明提供的赖氨酸高产菌株的筛选方法包括配制固体培养基，将多株赖氨酸发酵菌株接种至固体培养基中进行培养，然后筛选出高产菌株，其特征在于，所述固体培养基为添加了指示剂的固体培养基且所述指示剂的变色pH范围为5.5-8，优选为6-7.4；并通过观察固体培养基中指示圈的大小筛选出所述高产菌株。
其中，所述多株赖氨酸发酵菌株优选至少为8株赖氨酸发酵菌株。所述赖氨酸发酵菌株可以是商购获得的产赖氨酸菌株，也可以是人工筛选获得的产赖氨酸菌株。
本领域技术人员所公知的是：指示剂一般以溶液的形式使用，可以直接商购获得，也可以购买粉末状产品再配制成溶液使用，且配制时使用的溶剂为常规试剂，配制方法为常规方法，例如，溴百里酚蓝一般以0.1-0.3重量%浓度的溶液形式使用，配制方法包括先将0.1-0.3克溴百里酚蓝溶于60ml浓度为100%的乙醇中，再加水至100ml。
根据本发明，相对于每千克的固体培养基，所述指示剂的添加量优选为0.002-0.012克。当指示剂的添加量在上述优选范围内时，显色明显且不会对赖氨酸发酵产生影响。
需要说明的是，本发明中，指示剂的添加量以指示剂的干重计，即当所述指示剂以溶液形式使用时，指示剂的添加量不包括其中溶剂的量。
根据本发明，只要所述指示剂的变色pH范围在上述范围内即可实现本发明的目的，优选地，所述指示剂为溴百里酚蓝、溴酚蓝、中性红、酚红、苯酚红和石蕊中的一种。
根据本发明，如前所述，在赖氨酸发酵菌株的培养过程中，随着营养物质的消耗，会逐渐在固体培养基上形成指示圈，指示圈越大，说明赖氨酸发酵菌株产生的赖氨酸的量越多，因此可以直接选用形成的指示圈直径最大和/或形成的指示圈的直径为直径最大的指示圈的直径的98%以上的菌株作为高产菌株。本领域技术人员能够理解的是，指示圈的颜色与使用的指示剂的类型有关，故在此不再详述。
根据本发明，所述固体培养基可以为本领域常规使用的能够培养赖氨酸发酵菌株并添加了指示剂的培养基，优选情况下，所述固体培养基为添加了指示剂的赖氨酸发酵固体培养基、胰蛋白大豆琼脂固体培养基或LB固体培养基。使用上述优选的培养基能够获得更易于观测的指示圈。
进一步优选情况下，所述固体培养基为添加了溴酚蓝的赖氨酸发酵固体培养基；或者所述固体培养基为添加了溴百里酚蓝的胰蛋白大豆琼脂固体培养基。本发明的发明人发现，使用这两种固体培养基最终获得的指示圈更大且边缘更明显，故更适于观测。
本发明中，所述赖氨酸发酵固体培养基可以通过往常规的赖氨酸发酵液体培养基中添加琼脂而获得，所述赖氨酸发酵液体培养基为本领域常规使用的发酵制赖氨酸的培养基。所述LB固体培养基可以通过往常规的LB液体培养基中添加琼脂而获得。通过添加琼脂来配制固体培养基是本领域技术人员所公知的，因此琼脂的添加量可以为本领域常规使用的量，例如，相对于每千克的固体培养基，所述琼脂的添加量为15-30g，优选为15-25g。
对于赖氨酸发酵固体培养基，一般地，相对于每千克的赖氨酸发酵固体培养基，葡萄糖的用量为30-50g，优选为35-45g；糖蜜的用量为0-40g，优选为15-25g；玉米浆（干重为20-50重量%）用量为10-40g，优选为15-25g；磷酸氢二钾的用量为0.5-1.5g，优选为0.75-1.25g；硫酸镁的用量为0.4-2g，优选为0.8-1.5g；硫酸铵的用量为5-20g，优选为10-15g；苏氨酸的用量为0.05-0.6g，优选为0.1-0.3g；蛋氨酸的用量为0.05-0.6g，优选为0.1-0.4g；谷氨酸的用量为0.2-0.6g，优选为0.3-0.5g；甜菜碱的用量为1-5g，优选为2-4g；pH值为6.8-7.4，优选为7-7.2。
对于胰蛋白大豆琼脂固体培养基，可以通过商购获得，一般地，相对于每千克的胰蛋白大豆琼脂固体培养基，胰蛋白大豆琼脂的用量为30-50g，优选为35-45g，pH值为6.8-7.4，优选为7-7.2。
对于LB固体培养基，可以自行配制，也可以通过商购获得，一般地，相对于每千克的LB固体培养基，蛋白胨的用量为5-15g，优选为8-12g；酵母膏的用量为2-8g，优选为4-6g；氯化钠的用量为2-8g，优选为4-6g；pH值为6.8-7.4，优选为7-7.2。
根据本发明，所述赖氨酸发酵菌株可以为本领域常规使用的赖氨酸发酵菌株，例如可以为选自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、大肠杆菌（Escherichia Coli）和黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)中的一株。
根据本发明，对所述培养的条件没有特殊限定，优选情况下，所述培养的条件包括温度为30-38℃，时间为50-80h。
本发明还提供了上述方法在发酵产赖氨酸中的应用。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，黄色短杆菌菌种（菌株原种FB42购自江南大学）；将培养的黄色短杆菌菌种用无菌水稀释1010倍，制得菌悬液；pH值的检测使用梅特勒DeLTA320pH计；发酵液中赖氨酸的含量参照标准GB10794-89。
以下实施例中，所用固体培养基的具体成分及其含量如下表1所示：
表1
以下实施例中，所用液体培养基的成分与SM2的相同，不同的是，不添加琼脂和指示剂，且分装在500ml的三角烧瓶中，每瓶25ml。
实施例1
在培养皿的固体培养基SM1上涂布1mL的菌悬液，并将培养皿置于37℃的培养箱中培养72h，得到多个菌落，选取9个产生的指示圈较大的菌落并分别测量各个菌落产生的指示圈的大小，并将各个菌落进行编号，测量结果如下表2所示。
将选取的9个菌落的各个菌株接种至装有液体培养基的三角烧瓶中，将三角烧瓶置于摇床上进行摇瓶发酵32h，控制摇瓶发酵温度为37℃，摇床的转速为190r/min，每隔1小时检测发酵液的pH值并往发酵液中添加氨水（浓度为6.25重量%）以调节pH值为6.8。
摇瓶发酵获得的发酵液中赖氨酸的含量如下表2所示，形成的指示圈最大的菌株摇瓶发酵获得的发酵液中赖氨酸的含量也最高，因此，筛选出的Bf9为赖氨酸高产菌株。
表2
实施例2
按照实施例1的方法筛选赖氨酸高产菌株，不同的是，所用的固体培养基为SM2，结果表明形成的指示圈最大的菌株摇瓶发酵获得的发酵液中赖氨酸的含量最高。
实施例3
按照实施例1的方法筛选赖氨酸高产菌株，不同的是，所用的固体培养基为SM3，结果表明形成的指示圈最大的菌株摇瓶发酵获得的发酵液中赖氨酸的含量最高。
实施例4
按照实施例1的方法筛选赖氨酸高产菌株，不同的是，所用的固体培养基为SM4，各个菌落产生的指示圈的大小及发酵结果如下表3所示，结果表明形成的指示圈最大的菌株摇瓶发酵获得的发酵液中赖氨酸的含量最高，但是产生的指示圈的直径相对实施例1中产生的指示圈的直径小。另外，表3中的Bf-8形成的指示圈直径为Bf-9形成的指示圈直径的99.1%，因此Bf-8也可以作为高产菌株。
表3
从以上实施例和对比例可以看出，本发明的方法能够简单直观地筛选出赖氨酸高产菌株且结果可靠。
Claims (9)
1.一种赖氨酸高产菌株的筛选方法，该方法包括配制固体培养基，将多株赖氨酸发酵菌株接种至固体培养基中进行培养，然后筛选出高产菌株，其特征在于，所述固体培养基为添加了指示剂的固体培养基且所述指示剂的变色pH范围为5.5-8；并通过观察固体培养基中指示圈的大小筛选出所述高产菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂的变色pH范围为6-7.4。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每千克的固体培养基，所述指示剂的添加量为0.002-0.012克。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述指示剂为溴百里酚蓝、溴酚蓝，中性红、酚红、苯酚红和石蕊中的一种。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述固体培养基为添加了溴酚蓝的赖氨酸发酵固体培养基。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述固体培养基为添加了溴百里酚蓝的胰蛋白大豆琼脂固体培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述赖氨酸发酵菌株为选自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、大肠杆菌（Escherichia Coli）和黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）中的一株。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养的条件包括温度为30-38℃，时间为50-80h。
9.权利要求1-8中任意一项所述的方法在发酵产赖氨酸中的应用。
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