CN102559628A

CN102559628A - 一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法

Info

Publication number: CN102559628A
Application number: CN2012100353362A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 马建龙; 刘松; 陈康康; 张娟; 张东旭; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种添加IPTG、低温策略诱导提高重组Escherichia Coli(大肠杆菌)BL21(DE3)发酵生产pro-TGase(谷氨酰胺转胺酶酶原)的方法。本发明采用分泌性表达载体pET22b重组Escherichia Coli BL21(DE3)为发酵菌株，初始生长阶段控制温度为37℃，当菌体生长至一定菌体浓度时进行降温诱导，添加终浓度为0.4mM的IPTG，降温至20℃，诱导pro-TGase的表达。通过在发酵过程中降低诱导阶段温度，最终实现了提高pro-TGase产量的目标。本发明的优点是能有效地提高pro-TGase的产量及生产强度，并减少发酵液中杂蛋白的含量，提高了下游提取时的效率，增加了产品纯度，并且减少了能耗，有利于工业化大规模生产。

Description

一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法

技术领域

本发明涉及一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，特别是一种利用诱导物低温控制策略诱导提高重组Escherichia Coli BL21(DE3)发酵生产pro-TGase(谷氨酰胺转胺酶酶原)的方法。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13全称R-glutaminyl-peptide：amine-γ-glutayle-transferase简称TGase)，又称转谷氨酰胺酶或谷胺酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基转移酶，具有多种催化功能。它能够通过催化蛋白质分子间或分子内形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键，引起蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。TGase具有的独特催化功能，使其在许多领域发挥着重要的作用。目前该酶广泛用于食品工业，大量的研究报道来自TGase改善各类食品蛋白质的功能性质和营养价值，应用范围包括肉制品、水产品、乳制品、植物蛋白制品、可食性包装等。通过TGase对食品蛋白的作用机理的研究，人们发现TGase催化蛋白交联表现出一定的底物特异性。对底物蛋白进行一定的变性处理(如化学改性、加热、蛋白酶处理或物理方法)，可使TGase更易接近底物，显著提高酶的催化活性

目前，国内有关TGase的研究主要集中在链霉菌TGase的生产方面，包括筛选野生型产生菌、构建基因工程菌及产酶条件研究和酶的应用等方面。国内除了泰兴一鸣精细化工有限公司有较为成熟的产品外，其他还处于实验室研究阶段。中科院微生物研究所、华南理工大学及本研究室相继开展了TGase重组菌的构建研究。但是对TGase基因工程菌的构建及发酵过程优化仍处于起步阶段。Escherichia Coli作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前Escherichia Coli是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。在前期研究中，本研究室在分离筛选得到一株TGase高产菌株Streptomyces hygroscopicus的基础上，扩增出编码pro-TGase的基因，并成功表达于Escherichia Coli BL21(DE3)中。此菌株通过摇瓶初步发酵优化后在体外加入蛋白酶活化后酶活最高可达5U/mL，如何提高酶的产量是一个长期困扰我们的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，以解决谷氨酰胺转胺酶酶原分泌量低的技术问题。

本发明技术方案为：以含有pET22b(+)-proTGase重组质粒的Escherichia Coli BL21(DE3)为生产菌株(The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretionby Escherichia coli，FEMS Microbiology Letters，2011，324，98-105)，从甘油管中接50μL菌液于50mL LB中，过夜8-10h培养后将100mL的种子接入3L全自动发酵罐，搅拌转速为400rpm，培养温度37℃，通气量为1vvm。当菌体浓度OD₆₀₀＝8时，开始加入0.4mM的IPTG并降温至20℃培养诱导pro-TGase的表达。

所述改良TB培养基成分为(g/L)：蛋白胨12，酵母膏24，甘油4-12g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/L K2HPO4，其中优选TB培养基中，甘油浓度为8g/L。

谷氨酰胺转胺酶酶活测定方法

pro-TGase的活化

活化蛋白酶(dispase，12mg/mL)：0.86mg dispase溶于500μL标准活化缓冲液(50mMTris-HCl，300mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM GSH，pH 7.0)。活化过程：将4uL活化蛋白酶添加至100uL pro-TGase溶液中，37℃温育2h。活化胞外pro-TGase时，13,000r/min离心5min，取上清液即可进行活化过程。活化胞内pro-TGase时，取5OD₆₀₀样品离心，沉淀用500μL50mmol/L Tris-HCl pH 8.0重悬。超声破碎后，13,000r/min离心5min，取上清液进行活化。

比色法测定酶活参照程力硕士学位论文(吸水链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的发酵条件优化[D].无锡：江南大学生物工程学院，2007.)。

残余甘油浓度测定见参照(张永生等，克拉维酸发酵液中碳源——甘油含量的比色法测定，天津科技大学学报，2006，21(1)：14-17)

采用本发明提供的方法，在添加IPTG低温诱导策略在3L罐上发酵达到较高水平，比原来发酵提高了约100％，具有很好的应用前景。

附图说明

图1不同诱导OD₆₀₀下对应的菌体生长以及产酶变化

图2不同初始甘油浓度下对应的菌体生长，产酶变化及残余甘油浓度

图3初始甘油浓度为8g/L时对应的发酵过程中菌体生长，产酶变化以及残余甘油浓度

具体实施方式

实施例1：

对数生长期控制温度为37℃，当菌体生长至OD₆₀₀分别为4，6，8，10时降温至20℃添加终浓度为0.4mM的IPTG以促进pro-TGase高效表达。直至发酵结束，得到诱导OD₆₀₀＝8时酶活最高为6.22U/mL，生产强度为0.16U/mL/h(图1)。

实施例2：

改变初始甘油浓度分别为4g/L，8g/L和12g/L，在OD₆₀₀＝8时诱导。培养条件同例1，直至发酵结束(图2)。初始甘油浓度为8g/L时酶活最高为9.92U/mL，生产强度为021U/mL/h，较之前的生产强度提高了31.25％(图3)。

Claims

1.一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，其特征在于：以含有pET22b(+)-proTGase重组质粒的Escherichia Coli BL21(DE3)为生产菌株，活化后制备种子液，接种入3L改良TB培养基，采用全自动发酵罐发酵，控制搅拌转速为400rpm，培养温度37℃，通气量为1vvm；当菌体浓度达到OD₆₀₀＝8，时降温至20℃同时并添加终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导表达产谷氨酰胺转胺酶酶原。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于改良TB培养基成分为(g/L)：蛋白胨12，酵母膏24，甘油4-12g/L，17mmol/L KH2PO4，72mmol/L K2HPO4。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述TB培养基中，甘油浓度为8g/L。