CN100436594C - 发酵制造s-腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents

发酵制造s-腺苷甲硫氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种分泌S-腺苷甲硫氨酸的微生物菌株，该微生物菌株的cmr(mdfA)基因产物的活性是增强的。

Description

发酵制造S-腺苷甲硫氨酸的方法
技术领域
本发明涉及发酵制造S-腺苷甲硫氨酸的方法。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为代谢中最重要的甲基供体，且在制药方面，用于治疗抑郁症、肝病和关节炎。现有的制造SAM的方法，包括在前体甲硫氨酸存在的情况下培养酵母(Schlenk及DePalma，J.Biol.Chem.229，1037-1050页(1957)，Schlenk等人，Enzymologia 29，283-298页(1965)，Shiozaki等人，J.Biotechnol.4，345-354页(1986)，Shiozaki等人，Agric.Biol.Chem.53，3269-3274页(1989))且自细胞溶胞产物提取后，层析纯化所制的SAM(美国专利US562149)。用酵母制造SAM的特征为在细胞内制造及储存SAM。为进一步加工SAM，细胞首先必须裂解，例如在欧洲专利EP162323(实施例2)或德国专利DE3329218(实施例1)中所述。除了化学裂解法以外，尚有利用法式压榨或高压均质化或热加方法(详欧洲专利EP1091001(实施例1))。
与用酵母制造SAM比，现有技术描述了利用大肠杆菌(E.Coli)制造细菌SAM的方法，其中细菌将由细胞制得的SAM输出到培养基中(欧洲专利EP 1457569 A1)。与目前的酵母法比较，此种发酵制造SAM的方法具有显著优点，因为依该方法，将所制得SAM选择性分泌至培养物上清液中，藉此可简化纯化方法。该培养物上清液只含有少数物质，因此分泌SAM已成为纯化的第一步骤，且使进一步处理变得容易得多。细胞外制造SAM的方法使用SAM合成酶。
发明内容
本发明的目标是提供一种微生物菌株，与现有技术相比，该种微生物菌株可提高SAM的产量。另一目标是提供一种以本发明的微生物菌株制造SAM的方法。
以分泌S-腺苷甲硫氨酸的微生物菌株可以达成上述目标，所述微生物菌株的cmr(mdfA)基因产物的活性是增强的。
本发明的微生物菌株可由起始菌株制得，且与所述起始菌株相比，其cmr(mdfA)基因产物的活性是增强的。
优选地，与含有cmr(mdfA)基因产物的野生型微生物菌株的细胞相比，如果一微生物菌株的cmr(mdfA)基因产物的活性增强至少2倍、优选地至少5倍，则该微生物菌株与起始菌株相比，其cmr(mdfA)基因产物的活性是增强的。量测cmr(mdfA)基因产物活性的实验可参见科学文献(Edgar及Bibi，J.Bacteriol.179，2274-2280页)。
1996(Nilsen等人，J.Bacteriol，178，3188至3193页)，大肠杆菌的cmr(mdfA)基因被鉴定为氯霉素-输出-蛋白质Cmr。在1997，重新鉴定该cmr(mdfA)基因为具有广谱底物的多种药物-溢出-蛋白质(multidrugefflux protein)，MdfA(Edgar及Bibi，J.Bacteriol.179，2274-2280页)。该Cmr(mdfA)蛋白质属于MF(S)[主要促进剂(超家族)]转运蛋白质，其不仅转运亲脂性、不带电荷的底物(举例言之，如氯霉素或红霉素)而且通过与细胞外的H+离子交换而转运亲脂性、带正电荷的底物(举例言之，如溴乙锭、阿霉素或Benzaikonium)(参阅Review by Bibi等人，J.Microbiol.Biotechnol.3，171-177页(2001))。虽然该Cmr(mdfA)蛋白质具有广谱的底物，但由于SAM与目前已公开的底物无结构共同之处，因此Cmr(MdfA)可用作SAM输出蛋白质这一点对本发明所属技术领域的普通技术人员来说是出乎意料的。再者，cmr(mdfA)的核酸序列及Cmr(mdfA)蛋白质的氨基酸序列二者均未显示任何与已公开的源于酵母及人类的SAM-转运基因及SAM转运蛋白质具有同源性。此外，由于转运机制大部分不清楚，亦无法预料一种物质是否可作为Cmr(mdfA)蛋白质的底物。再者，令本发明所属技术领域的普通技术人员完全惊奇的是，本发明微生物菌株的细胞以具有高度亲水性、带正电荷且同时也是内源性的一种分子来输出SAM。
所以，本发明还涉及cmr(mdfA)基因产物作为输出蛋白质在制造SAM中的用途。
cmr(mdfA)基因及cmr(mdfA)基因产物(Cmr(mdfA)蛋白质)分别以SEQ ID No.1及SEQ ID No.2为特征。本发明范畴内，cmr(mdfA)基因亦想要包括编码具有氯霉素-输出或多种药物-溢出-活性的蛋白质的基因，且所述基因与SEQ ID No.1具有大于30％的序列相同性，使用的是BESTFIT算法(GCG威斯康辛套装软件，遗传学电脑群(GCG)麦迪生，美国威斯康辛州)，优选地与SEQ ID No.1具有大于50％的序列相同性，更优选地与SEQ ID No.1具有大于70％的序列相同性。
同样地，Cmr(mdfA)蛋白质亦想要包括具有氯霉素-输出或多种药物-溢出活性的蛋白质，且所述蛋白质与SEQ ID No.2具有大于15％的序列相同性，使用的是BESTFIT算法(GCG威斯康辛套装软件，遗传学电脑群(GCG)麦迪生，美国威斯康辛州)，优选地与SEQ ID No.2具有大于30％的序列相同性，更优选地与SEQ ID No.2具有大于60％的序列相同性。
所以，cmr(mdfA)基因亦意指cmr(mdfA)基因的等位基因变异体，特别是因核苷酸的缺失、插入或置换而自上述SEQ ID No.1描述的序列衍生的功能性变异体，可是至少必须保持特定基因产物的酶活性。
本发明的微生物可利用分子生物学标准技术制造。
原则上，任何具有SAM生物合成途径的微生物均适于作为起始菌株，可采用重组法及可通过发酵作用培养。此种微生物可为真菌、酵母或细菌。优选地为真细菌系统发生群的细菌。更加优选地是肠杆菌科的微生物，且特别是大肠杆菌。
举例言之，可通过加强表达cmr(mdfA)基因以增强本发明微生物中cmr(mdfA)基因产物的活性。在这方面，可提高微生物中cmr(mdfA)基因的拷贝数及/或可经由合适的启动子加强cmr(mdfA)基因的表达。此处，加强表达优选地指的是cmr(mdfA)基因表达的强度至少高于起始菌株表达的强度二倍。提高cmr(mdfA)基因的拷贝数优选地指的是与起始菌株比，使用了cmr(mdfA)基因的至少一个额外的染色体拷贝及/或质粒-编码拷贝。
本发明所属技术领域普通技术人员可用熟知方法提高微生物中cmr(mdfA)基因的拷贝数。所以，可能例如按照每个细胞(即大肠杆菌的pUCl9、pBR322、PACYCl84)多个拷贝将cmr(mdfA)基因克隆入质粒载体，并从而引入微生物内。亦可将cmr(mdfA)基因的多个拷贝整合入微生物的染色体。可利用的整合法为具有温和噬菌体、整合性质粒或经由同源重组而整合的熟知系统。
优选地，通过将cmr(mdfA)基因克隆入质粒载体，置于启动子调控下，以提高拷贝数。特别优选地，通过克隆pACYC衍生物内的cmr(mdfA)基因以提高大肠杆菌的拷贝数。
用于表达质粒编码的cmr(mdfA)基因的调控区可为该基因的自然启动子及操纵基因区。
然而，亦可通过其他启动子加强cmr(mdfA)基因的表达。适当的启动子系统，例如：大肠杆菌中gapA基因的组成型GAPDH启动子或诱导型lac、tac、trc、lambda、ara或tet启动子，为本发明所属技术领域普通技术人员所熟知。此种构建体可以熟知的方式用于质粒或染色体。
可通过将翻译起始信号例如基因的核糖体结合位点或起始密码子置于特定构建体的优化序列中而进一步实现加强表达，或者根据密码子使用法，通过以时常出现的密码子置换稀有密码子而进一步实现加强表达。
本发明的优选具体实施方式为具有上述修饰的微生物菌株。
将cmr(mdfA)基因克隆入质粒载体内，例如：通过聚合酶链反应的特异性扩增，该聚合酶链反应使用覆盖全部cmr(mdfA)基因的特异性引物，随后与载体DNA片段连接。
克隆cmr(mdfA)基因的优选载体为质粒，其含有用于加强表达的启动子，例如：大肠杆菌gapA基因的组成型GAPDH启动子。
其他更加优选者为已含有基因/等位基因的载体，所述基因/等位基因导致SAM生物合成的提高，例如：大鼠肝SAM合成酶(RLSS)等位基因，metK基因(详见欧洲专利EP 0 647 712 A1及EP 1457 569 A1)或组合多种SAM合成酶。当然，亦可使用含有多拷贝SAM合成酶基因的质粒。此类型载体可自任何微生物菌株直接制得具有高度SAM超量生产的本发明微生物菌株。
因此，本发明的内容亦与质粒有关，所述质粒包括置于启动子调控下的SAM合成酶基因及cmr(mdfA)基因。此种质粒亦可包括各种生物的SAM合成酶基因的组合或一种SAM合成酶基因的多个拷贝。
通过常用的转化法(例如电穿孔)将含cmr(mdfA)的质粒引入微生物，及例如，通过抗生素抗性筛选携带质粒的克隆。
所以，本发明的内容亦与制造本发明微生物菌株的方法相关，其特征为将本发明的质粒引入起始菌株内。
可用本发明的质粒进行转化的菌株优选地是那些已具有可同样有利于SAM制造的等位基因的菌株，所述等位基因例如为：
-具有改进SAM制造的作用的等位基因，例如：RLSS-等位基因或metK基因(详欧洲专利EP 1457569 A1所述)，
-或具有改进甲硫氨酸摄入的作用的基因，例如：大肠杆菌metNIQ操纵子(Merlin等人，J.Bacteriol.184，5513-5517页(2002)；Gal等人，J.Bacteriol.184，4930-4932页(2002)；Zhang等人，Arch.Microbiol.180，88-100页(2003))，
-或有利于改善内源性甲硫氨酸合成的基因，如：改进的高丝氨酸-转琥珀酰酶基因(日本专利JP2000139471A、德国专利DE-A-10247437、DE-A-10249642)。
借助于本发明微生物菌株，可在发酵罐内用熟知的方法制造SAM。
所以，本发明亦涉及一种制造SAM方法，其特征为，在培养基内发酵本发明的微生物菌株，其中SAM分泌至该发酵培养基中。优选地将制得的SAM自发酵混合物中分离。
在发酵罐中培养微生物菌株，作为连续培养、分批培养或优选地补料-分批-培养。特别优选地，在发酵期间连续定量加入碳源。
所用碳源优选地为糖、糖醇或有机酸。特别优选地，本发明的方法所用的碳源为葡萄糖、乳糖或甘油。
发酵期间，优选地定量加入碳源，以保证发酵罐内碳源含量保持在0.1至50克/升范围内。特别优选地在0.5至10克/升范围内。
本发明方法所用氮源优选地是氨、铵盐或蛋白质水解产物。当用氨来校正pH时，在发酵过程中连续将此氮源按时定量加入。
可添加的其他培养基添加物为元素磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙、铁的盐，及微量(亦即微摩尔浓度)的元素钼、硼、钴、锰、锌及镍的盐。
此外，可添加至培养基者为有机酸(例如：乙酸、柠檬酸)、氨基酸(例如：异亮氨酸)及维生素(例如：B1、B12)。
可使用的复合营养素源为，例如，酵母提取物、玉米浸液、豆粉或麦芽提取物。
此外可在培养基中添加L-甲硫氨酸或D/L-甲硫氨酸作为SAM合成的特异前体、浓度在0.05及25克/升间。以添加浓度在1及7克/升间的L-甲硫氨酸或D/L-甲硫氨酸为佳。
另外，在特别优选的本发明方法中，在培养期间，培养基内连续定量加入营养基L-甲硫氨酸或D/L-甲硫氨酸。优选地以每小时0.05克至10克连续定量加入L-甲硫氨酸或D/L-甲硫氨酸。特别优选地以每小时0.1克至2克连续加入L-甲硫氨酸或D/L-甲硫氨酸。
嗜温微生物的保温温度优选地在15至45℃，特别优选地在30至37℃。
发酵作用优选地是在需氧生长条件下实施。经由压缩空气或纯氧将氧引入发酵罐中。
发酵期间，发酵培养基的pH值优选地在5.0至8.5范围内，特别优选地为7.0。
该菌株优选地在需氧培养条件下保温16至150小时，且在特定菌株的最适生长温度范围内。培养时间特别优选地为介于20及48小时。
可通过本发明所属技术领域普通技术人员所熟知的方法将培养基与SAM分离，如离心培养基以去除细胞、交叉流动过滤将蛋白质分离，及随后对产品进行层析纯化、浓缩、配制或复合。
本发明方法制造的SAM可通过例如层析术(例如：高效液相层析)进行检测及量化。
以下结合附图和实施例进一步说明本发明。
附图说明
图1：质粒pFL242的构建示意图。
图2：质粒pFL274的构建示意图。
具体实施方式
实施例1：质粒pFL242的构建
为克隆GAPDH-启动子-RLSS-片段，通过限制性内切核酸酶SspI将质粒pKP504线性化。质粒pKP504的制造详于欧洲专利EP-A-1 457 567，实施例4。然后，通过碱性磷酸酶(Roche，Mannheim，Germany)实施线性化质粒脱磷酸作用。最后，依据厂商说明书，使用QIA快速移除核苷酸试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)在连接之前纯化该线性化载体。
通过限制性内切酶Ecl136II及StuI，自SAM生产性质粒pMSRLSSk(欧洲专利EP 1457569 A1)中分离GAPDH-启动子-RLSS-片段。经由琼脂糖电泳与随后的凝胶提取(QIA快速凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden，Germany)纯化该片段后，依据厂商说明书，通过T4-DNA连接酶(Roche，Mannlheim，Germany)连接该GAPDH-启动子-RLSS-片段与该SspI-线性化载体pKP504。
菌株DH5α(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)大肠杆菌细胞以本发明所属技术领域普通技术人员熟知的电穿孔，用连接添加物转化。转化混合物涂布在LB-四环素琼脂板上(10克/升的胰蛋白胨，5克/升的酵母提取物，5克/升NaCl，15克/升的琼脂，20毫克/升的四环素)及在37℃下保温过夜。
通过QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)分离质粒后，用限制性分析鉴定所需的转化体。然后可将其他基因克隆入以此方式制得的质粒(pFL242，图1)中，置于大肠杆菌gapA基因的组成型GAPDH启动子调控下。实施例所用的质粒pFL242依照布达佩斯条约，于2005年2月17日保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心，布伦瑞克，德国)，编号为DSM 17142。
实施例2：质粒pFL274的构建
A.cmr(mdfA)基因的扩增
依据本发明所属技术领域普通技术人员熟知的经验，用Taq-DNA-聚合酶，通过聚合酶链反应(PCR)的方式，扩增大肠杆菌cmr(mdfA)基因。用大肠杆菌-野生型菌株W3110(ATCC 27325)的染色体DNA作为模板。所用引物为具有以下序列(SEQ ID No：3)的寡核苷酸cmr for：
5’-AAA AGG CCT TGC ATG CAAAAT AAA TTA GCT TC-3’
StuI
及具有以下序列(SEQ ID No：4)的cmr rev：
5’-CCC TTA ATT AAA CCA GAT TGA CGA CCA TCA C-3’
PacI
依照厂商说明书，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)的小DNA-吸附柱纯化PCR所制得的约1.3kb的DNA片段。
B.将cmr(mdfA)基因克隆入pFL242载体
二个限制性内切核酸酶StuI及PacI的裂解位点经由引物cmr for及cmr rev引入PCR片段。在厂商提供的条件下，用限制性内切核酸酶StuI(Roche，Mannheim，Germany)及PacI(New England Biolabs，Frankfurt amMain，Germany)切割纯化PCR片段，在琼脂凝胶上分离，且随后在厂商提供的条件下，使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)自该琼脂凝胶将其分离。
在厂商提供的条件下，用限制性内切核酸酶StuI及PacI切割pFL242载体，以克隆cmr(mdfA)基因。然后，用碱性磷酸酶(Roche，Mannheim，Germany)在5’端处将该质粒脱磷酸化，随后用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)如同PCR片段实施纯化。在厂商提供的条件下用T4 DNA连接酶(Roche，Mannheim，Germany)连接该PCR片段与切割的脱磷酸化的载体。通过本发明所属技术领域普通技术人员熟知的电穿孔法，用连接混合物转化该菌株W3110(ATCC 27325)大肠杆菌细胞。转化混合物涂布在LB-四环素琼脂板上(10克/升的胰蛋白胨，5克/升的酵母提取物，5克/升NaCl，15克/升的琼脂，20毫克/升的四环素)及在37℃下保温过夜。
通过QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)分离质体后，用限制分析鉴定所需的转化体，且用序列分析确定结果的正确性。
以此方式制得的质粒pFL274(图2)中，cmr(mdfA)基因是由GAPDH-启动子调控。
实施例3：制造S-腺苷甲硫氨酸生产菌
实施例2所述pFL274质粒通过CaCl2法，转化大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27325)，在含20毫克/升四环素LB琼脂板上选择后，该质粒从一转化体再分离出来，通过限制性内切核酸酶裂解及核对。该菌株为W3110/pFL274，且其适合制造SAM。
实施例4：发酵制造S-腺苷甲硫氨酸
A.制造SAM
利用菌株W3110/pFL274发酵制造SAM。为比较，所用菌株，一方面，为W3110(ATCC 27325)野生型菌株无质粒，另一方面，菌株W3110/pMSRLSSK是在相同条件下培养。类似实施例3，W3110/pMSRLSSK由W3110及质粒pMSRSSK制得。下列培养基用作培养：1升培养基：0.0147克CaCl2×2H2O、0.3克MgSO4×7H2O、0.15毫克Na2MoO4×2H2O、2.5毫克H3BO3、0.7毫克CoCl2×6H2O、0.25毫克CuSO4×5H2O、1.6毫克MnCl2×4H2O、0.3毫克ZnSO4×7H2O、3.0克KH2PO4、12克K2HPO4、5克(NH4)2SO4、0.6克NaCl、0.002克FeSO4×7H2O、1克Na3柠檬酸×2H2O、15克葡萄糖、1克胰蛋白胨、0.5克酵母提取物。
为培养W3110/pMSRLSSK及W3110/pFL274，培养基添20μg/ml四环素。此外，该培养基还添加0.5克/升L-甲硫氨酸。首先，3毫升培养基在玻璃试管内用特定菌株接种，并于一振荡器内在150转/分钟及温度37℃的情况下保温16小时，以制得发酵用之预培养物。最后，20毫升相同的培养基，用以此法制得的细胞，在100毫升的三角瓶内接种，至OD600(在600纳米处吸收)为0.1。该生产性培养物于一振荡器内在150转/分钟及温度37℃的情况下保温达48小时。在24小时及48小时后，取出试样，并通过离心作用将细胞与培养基中分离。
B.定量化所制造的SAM
通过高效液相层析法，使用DevelosilRP-AqueousC30柱，5微米，250*4.6毫米(费诺门奈克斯公司，阿夏芬堡，德国)将所得培养物上清液分级，且通过等度洗脱，使用3毫升85％浓度H3PO4洗脱液加上1升水，0.5毫升/分钟的流速，在室温下分馏10微升培养物上清液，且通过二极体阵列侦检器在波长260纳米处定量化。培养物上清液内所得SAM含量如表1所示。
表1：
Figure C20061005886000131
序列表
<110>电化学工业有限公司(国际)
<120>发酵制造s-腺苷甲硫氨酸的方法
<130>Co10431
<140>
<141>
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>1233
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>qene
<222>(1)..(1230)
<300>
<301>Edgar，Rotem
<302>MdfA，an Escherichia coli multidrug resistance protein
     with an extraordinarily broad spectrum of drug
     recognition
<303>J.Bacteriol.
<304>179
<305>7
<306>2274-2280
<400>1
atgcaaaata aattagcttc cggtgccagg cttggacgtc aggcgttact tttccctctc  60
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gcagcgatct cctttttcgg tctgcaacga gccatgcctg aaaccgccac gcgtataggc  600
gagaaactgt cactgaaaga actcggtcgt gactataagc tggtgctgaa gaacggccgc  660
tttgtggcgg gggcgctggc gctgggattc gttagtctgc cgttgctggc gtggatcgcc  720
cagtcgccga ttatcatcat taccggcgag cagttgagca gctatgaata tggcttgctg  780
caagtgccta ttttcggggc gttaattgcg ggtaacttgc tgttagcgcg tctgacctcg  840
cgccgcaccg tacgttcgct gattattatg ggcggctggc cgattatgat tggtctattg  900
gtcgctgctg cggcaacggt tatctcatcg cacgcgtatt tatggatgac tgccgggtta  960
agtatttatg ctttcggtat tggtctggcg aatgcgggac tggtgcgatt aaccctgttt  1020
gccagcgata tgagtaaagg tacggtttct gccgcgatgg gaatgctgca aatgctgatc  1080
tttaccgttg gtattgaaat cagcaaacat gcctggctga acgggggcaa cggactgttt  1140
aatctcttca accttgtcaa cggaattttg tggctgtcgc tgatggttat ctttttaaaa  1200
gataaacaga tgggaaattc tcacgaaggg taa                               1233
<210>2
<211>410
<212>PRT
<213>Escherichia coli
<300>
<301>Edgar，Rotem
<302>MdfA，an Escherichia coli multidrug resistance protein
     with an extraordinarily broad spectrum of drug
     recognition
<303>J.Bacteriol.
<304>179
<305>7
<306>2274-2280
<313>1 TO 410
<400>2
Met Gln Asn Lys Leu Ala Ser Gly Ala Arg Leu Gly Arg Gln Ala Leu
  1               5                  10                  15
Leu Phe Pro Leu Cys Leu Val Leu Tyr Glu Phe Ser Thr Tyr Ile Gly
             20                  25                  30
Asn Asp Met Ile Gln Pro Gly Met Leu Ala Val Val Glu Gln Tyr Gln
         35                  40                  45
Ala Gly Ile Asp Trp Val Pro Thr Ser Met Thr Ala Tyr Leu Ala Gly
     50                  55                  60
Gly Met Phe Leu Gln Trp Leu Leu Gly Pro Leu Ser Asp Arg Ile Gly
 65                  70                  75                  80
Arg Arg Pro Val Met Leu Ala Gly Val Val Trp Phe Ile Val Thr Cys
                 85                  90                  95
Leu Ala Ile Leu Leu Ala Gln Asn Ile Glu Gln Phe Thr Leu Leu Arg
            100                 105                 110
Phe Leu Gln Gly Ile Ser Leu Cys Phe Ile Gly Ala Val Gly Tyr Ala
        115                 120                 125
Ala Ile Gln Glu Ser Phe Glu Glu Ala Val Cys Ile Lys Ile Thr Ala
    130                 135                 140
Leu Met Ala Asn Val Ala Leu Ile Ala Pro Leu Leu Gly Pro Leu Val
145                 150                 155                 160
Gly Ala Ala Trp Ile His Val Leu Pro Trp Glu Gly Met Phe Val Leu
                165                 170                 175
Phe Ala Ala Leu Ala Ala Ile Ser Phe Phe Gly Leu Gln Arg Ala Met
            180                 185                 190
Pro Glu Thr Ala Thr Arg Ile Gly Glu Lys Leu Ser Leu Lys Glu Leu
        195                 200                 205
Gly Arg Asp Tyr Lys Leu Val Leu Lys Asn Gly Arg Phe Val Ala Gly
    210                 215                 220
Ala Leu Ala Leu Gly Phe Val Ser Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ile Ala
225                 230                 235                 240
Gln Ser Pro Ile Ile Ile Ile Thr Gly Glu Gln Leu Ser Ser Tyr Glu
                245                 250                 255
Tyr Gly Leu Leu Gln Val Pro Ile Phe Gly Ala Leu Ile Ala Gly Asn
            260                 265                 270
Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Arg Arg Thr Val Arg Ser Leu Ile
        275                 280                 285
Ile Met Gly Gly Trp Pro Ile Met Ile Gly Leu Leu Val Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Ala Thr Val Ile Ser Ser His Ala Tyr Leu Trp Met Thr Ala Gly Leu
305                 310                 315                 320
Ser Ile Tyr Ala Phe Gly Ile Gly Leu Ala Asn Ala Gly Leu Val Arg
                325                 330                 335
Leu Thr Leu Phe Ala Ser Asp Met Ser Lys Gly Thr Val Ser Ala Ala
            340                 345                 350
Met Gly Met Leu Gln Met Leu Ile Phe Thr Val Gly Ile Glu Ile Ser
        355                 360                 365
Lys His Ala Trp Leu Asn Gly Gly Asn Gly Leu Phe Asn Leu Phe Asn
    370                 375                 380
Leu Val Asn Gly Ile Leu Trp Leu Ser Leu Met Val Ile Phe Leu Lys
385                 390                 395                 400
Asp Lys Gln Met Gly Asn Ser His Glu Gly
                405                 410
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：
     Oligonucleotide cmr for
<400>3
aaaaggcctt gcatgcaaaa taaattagct tc    32
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：
     Oligonucleotide cmr rev
<400>4
cccttaatta  aaccagattg acgaccatca  c    31

Claims (8)

1、一种分泌S-腺苷甲硫氨酸的大肠杆菌(E.coli)，其cmr基因产物的活性与含有cmr基因产物的野生型大肠杆菌菌株相比增强至少2倍。
2、如权利要求1的大肠杆菌，其cmr基因产物的活性与含有cmr基因产物的野生型大肠杆菌菌株相比增强至少5倍。
3、如权利要求1或2的大肠杆菌，其中cmr基因产物具有氨基酸序列SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2的序列相同性大于60％。
4、一种质粒，其包含SAM合成酶基因和cmr基因以及一启动子。
5、一种制造如权利要求1至3中任一项的大肠杆菌的方法，其包含将权利要求4的质粒引入起始菌株。
6、一种制造SAM方法，其包含在发酵培养基中发酵如权利要求1至3中任一项的大肠杆菌，其中SAM被分泌至该发酵培养基内。
7、如权利要求6的方法，其中将SAM自发酵培养基移出。
8、cmr基因产物作为输出蛋白质在制造SAM中的用途。
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