CN103409331B - 一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌及其制备方法与应用 - Google Patents

一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产3‑甲硫基丙醇(Methionol)的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用，属于食品香料生物制造技术领域。以Saccharomyces cerevisiae S288c为出发菌株，设计构建Methionol合成代谢途径中氨基转移酶基因(ARO9)、脱羧酶基因(ARO10)的耦合过量表达及甲硫基裂解酶基因(CY3)敲除的工程菌，增强主合成途径中2种关键酶基因表达，减弱或消除副反应途径中CY3基因表达，选育的工程菌(转化子)经多次传代，遗传稳定，优化了Methionol生物合成的代谢网络和代谢途径，Methionol的代谢通量及产量明显提高。工程菌发酵转化制备的Methionol香料，构型、手性单一，香气品质高。

Description

一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌及其制备方法与应用，属于食用香料生物制造领域，制备的天然3-甲硫基丙醇香料可用于多种食用香精调配，广泛应用于食品、医药、日化等行业。
背景技术
3-甲硫基丙醇(Methionol，又称菠萝醇)是一种重要食用香料，天然存在于葡萄酒、啤酒、黄酒、威士忌、白兰地、酱油、豆酱、奶酪、腊肉、黑麦面包等多种发酵食品，是芝麻香型白酒、红葡萄酒、酱油的重要风味物质，在番茄、土豆和海鲜中也有存在。3-甲硫基丙醇的香气阈值低，在食品中建议用量为0.1-10mg／kg，其风味依次呈现麦芽香味、香油味和熟土豆味。美国食用香料与提取物制造者协会已将其认定为一种安全、允许使用的食用香料(FEMA编号为3415)。3-甲硫基丙醇的衍生物，如3-甲硫基丙醛(3-Methylthio-propionaldehyde)、3-甲硫基丙酸乙酯(Ethyl-3-methylthio-propionate，EMTP)、3-甲硫基丙酸甲酯(Methyl-3-methylthio-propionate，MMTP)等，也是应用广泛的食用香料。3-甲硫基丙醛具有醇厚的酱香、洋葱香和红烧肉香，在马铃薯香精中起头香和体香作用，在调配热带水果、番茄、洋葱、坚果、面包、海鲜、奶酪、蔬菜等食品香精中经常使用；EMTP和MMTP具有浓烈的菠萝特征风味，可应用于调配菠萝、柑橘、辣根、番茄、洋葱等果蔬香精，猪肉、牛肉、鸡肉等肉味香精，巧克力香精及酒用香精。
目前，3-甲硫基丙醇的生产方法主要通过化学合成，如以丙醇和甲硫醇钠为原料，在相转移催化剂四甲基溴化铵的作用下催化合成。尽管化学合成3-甲硫基丙醇的成本廉价，但存在诸如原料毒性高、合成过程污染大、有毒副产物难于完全去除等问题。随着生活水平的提高和对健康的关注，人们更加崇尚“天然”、“绿色”，食品、化妆品等生产也越来越倾向于使用天然香料。但由于受资源、成本等限制，天然香料更为昂贵。微生物转化制备的硫醇类香料，构型单一，香气品质高，是近年天然香料制备的重要发展方向。
研究发现多种微生物，如Saccharomyces cerevisia、Geotrichum candidum、Brevibacteriumlinens、Candida albicans、Oenococcus oeni、lactic acid bacteria等都可代谢L-蛋氨酸生成3-甲硫基丙醇及其衍生物，这些代谢反应正是奶酪、白酒、红葡萄酒、酱油中3-甲硫基丙醇等风味成分的主要来源。
关于3-甲硫基丙醇的S.cerevisiae合成途径、调控酶及其基因已有一些研究。Philippe等研究3-甲硫基丙醇的酿酒酵母(S.cerevisiae)代谢途径和调控酶，发现L-蛋氨酸(methionine，L-Met)在氨基转移酶(aminotransferase)作用下先通过转氨反应生成α-酮-γ-(甲硫基)-丁酸(α-KMBA)，然后在脱羧酶作用下脱羧生成3-甲硫基丙醛，最后在还原酶作用下还原生成3-甲硫基丙醇。在L-蛋氨酸诱导下，S.cerevisiae可产生甲硫基裂解酶(lyase)和去甲硫基酶(demethiolase)，将蛋氨酸和α-KMBA生成甲硫醇，同时生成2-氨基-丁酸和2-酮丁酸。
Lucie等认为氨基转移酶(aminotransferase)是S.cerevisiae蛋氨酸代谢中第一步转氨反应的关键限速酶，是ARO9基因的表达产物。Philippe等研究发现脱羧酶(Aro10p)可催化α-酮-γ-(甲硫基)-丁酸(α-KMBA)的脱羧反应生成3-甲硫基丙醛，ARO10是脱羧酶Aro10p的基因。有研究者发现S.cerevisiae能将L-蛋氨酸转化为甲硫醇、2-氨基-丁酸和氨气，是3-甲硫基丙醇合成的主要副反应途径，该反应由甲硫基裂解酶(lyase)催化完成。Lee等发现瑞士乳杆菌在以蛋氨酸为底物时，过量表达lyase基因的工程菌比野生型或lyase缺失突变株产生更多的甲硫醇。因此认为转氨反应、脱羧反应、去甲硫基反应是S.cerevisiae利用L-蛋氨酸合成代谢3-甲硫基丙醇的3个关键步骤，分别由氨基转移酶(Aro9p)、脱羧酶(Aro10p)、甲硫基裂解酶(lyase)所调节。增强S.cerevisiae氨基转移酶基因(ARO9)、脱羧酶基因(ARO10)的拷贝与表达，有利于增强目的产物3-甲硫基丙醇的代谢流量和产量；敲除甲硫基裂解酶基因(CY3)，阻断或减弱副反应途径中甲硫基裂解酶表达，有利于增强目的产物3-甲硫基丙醇的代谢流量与积累。
综合上述分析，本申请专利从上述3个关键步骤的关键限速酶调节入手，通过对ARO9、ARO10的基因克隆与过量表达，以及CY3基因敲除，构建高产3-甲硫基丙醇工程菌，在S.cerevisiae同时集成表达，提高目的产物3-甲硫基丙醇的代谢流量及产量，揭示L-蛋氨酸分解代谢的分子调控机制。通过上述S.cerevisiae工程菌发酵L-蛋氨酸转化制备的3-甲硫丙醇香料，构型、手性单一，香气品质高，为天然3-甲硫丙醇香料制备提供了新思路和支持。
发明内容
本发明提供一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌及其制备方法与应用。以Saccharomyces cerevisiae S288c为出发菌株，设计构建3-甲硫基丙醇合成代谢途径中关键酶基因(AR09、AR10)耦合过量表达及CY3基因敲除的代谢工程菌，增强主途径的关键酶基因表达，减弱或消除副反应途径的酶基因表达；通过上述技术集成构建的工程菌(转化子)Par109-Dcys3经多次传代，遗传性稳定，3-甲硫基丙醇的代谢通量与产量有明显提高；工程菌Par109-Dcys3，在以蛋氨酸为主要原料的发酵培养基中高效生产天然3-甲硫基丙醇香料。
生物材料样品保藏相关情况的说明
生物材料样品保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
保藏日期：2012年12月11日。
保藏编号：CGMCC No.6949。
分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Par109-Dcys3。
具体实施方式
本发明是一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌及其制备方法与应用，具体实施方式(技术方案)：
(1)通过PCR技术从酿酒酵母DNA中扩增ARO9和ARO10基因，连接到穿梭质粒表达载体，再分别将重组载体导入S.cerevisiae S288c，使ARO9和ARO10基因分别过量表达，检测其基因转录活性，分析转氨酶、脱羧酶表达水平、代谢流量。
(2)将ARO9、ARO10基因同时连接到穿梭质粒表达载体，然后将重组质粒导入S.cerevisiae S288c，筛选阳性转化子，使ARO9和ARO10基因耦合过量表达。
(3)通过PCR技术克隆S.cerevisiae S288c中CY3基因，通过同源重组的方法，将CYS3与G418融合拼接的DNA片段再整合到阳性转化子基因组中，敲除CY3基因，削弱或阻断CY3基因表达水平，构建高产3-甲硫基丙醇的S.cerevisiae工程菌。
(4)分析工程菌的转氨酶、脱羧酶和甲硫基裂解酶的基因转录与表达水平、代谢流量，明确关键代谢节点，解析分子调控机制。
(5)以蛋氨酸为主要原料，优化工程菌的发酵培养基和发酵条件，利用发酵罐(生物反应器)发酵生产天然3-甲硫基丙醇香料。
技术效果
通过调控3-甲硫基丙醇合成代谢途径的转氨反应、脱羧反应和去甲硫基反应等关键限速酶的功能基因单独过量表达、耦合过量表达以及副反应途径关键酶基因敲除，优化了3-甲硫基丙醇生物合成的代谢途径和代谢流量，在优化发酵培养基和发酵条件下，选育的工程菌较野生型S.cerevisiae S288c菌株在目的产物3-甲硫基丙醇的转化率及产量有较大提高，工程菌构建的优化策略、技术效果明显。

Claims (2)

1.一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌，其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Par109-Dcys3，其保藏编号为CGMCC No.6949。
2.利用权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌发酵生产的方法，其特征在于：以天然L-蛋氨酸和葡萄糖为主要发酵底物，以选育的S.cerevisiae Par109-Dcys3工程菌为发酵菌种，控制发酵罐的pH 4.0--7.5、发酵温度22℃--38℃、通气量0.1vvm--3.8vvm、搅拌转速50rpm--500rpm，在24h-100h多次补充适量葡萄糖，发酵36-120h制备天然3-甲硫基丙醇香料。
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