JPH05199863A - システインおよびその誘導体の高生産微生物 - Google Patents
システインおよびその誘導体の高生産微生物Info
- Publication number
- JPH05199863A JPH05199863A JP6757091A JP6757091A JPH05199863A JP H05199863 A JPH05199863 A JP H05199863A JP 6757091 A JP6757091 A JP 6757091A JP 6757091 A JP6757091 A JP 6757091A JP H05199863 A JPH05199863 A JP H05199863A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- cysteine
- cystathionine
- enhancing
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 シスタチオニンβ−シンターゼ活性を増強す
る遺伝子を微生物細胞内に導入し、細胞内のシスタチオ
ニン合成酵素の活性を増強することにより得られる、シ
ステインおよびその誘導体の高生産微生物である。 【効果】 本発明によれば、細胞内のシスタチオニンβ
−シンターゼ活性を増強する遺伝子を微生物に導入する
ことができたので、この微生物を使ってシステインおよ
びその誘導体の生産性を高めることが可能である。
る遺伝子を微生物細胞内に導入し、細胞内のシスタチオ
ニン合成酵素の活性を増強することにより得られる、シ
ステインおよびその誘導体の高生産微生物である。 【効果】 本発明によれば、細胞内のシスタチオニンβ
−シンターゼ活性を増強する遺伝子を微生物に導入する
ことができたので、この微生物を使ってシステインおよ
びその誘導体の生産性を高めることが可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、システインおよびその
誘導体を高生産する微生物に関する。
誘導体を高生産する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】シス
テインはＳＨ基を含み、反応性が高いので応用範囲が広
く、生理的意義の大きいアミノ酸である。そのためシス
テインの効率的生産は産業上有益であり、従来から他の
アミノ酸同様、微生物を利用した発酵生産法の開発研究
が行われてきた。しかし、システインの生合成系が複雑
なため、現在まで産業上有効なシステインの発酵生産法
は開発されていない。
テインはＳＨ基を含み、反応性が高いので応用範囲が広
く、生理的意義の大きいアミノ酸である。そのためシス
テインの効率的生産は産業上有益であり、従来から他の
アミノ酸同様、微生物を利用した発酵生産法の開発研究
が行われてきた。しかし、システインの生合成系が複雑
なため、現在まで産業上有効なシステインの発酵生産法
は開発されていない。
【０００３】一方、システイン誘導体のうちグルタチオ
ンは、生体内に最も多く存在するＳＨ化合物で、グルタ
ミン酸、システイン、およびグリシンからなるトリペプ
チドで、肝疾患の治療薬として、また試薬として汎用さ
れる重要な化合物であり、従来から発酵法によって、そ
の商業的生産が行われてきた。しかし、発酵法によって
グルタチオンを生産する際にも、細胞内システイン含量
が、ある段階以上になるとグルタチオン生合成の律速と
なり、従って菌体内システイン含量の一層の向上が望ま
れている。
ンは、生体内に最も多く存在するＳＨ化合物で、グルタ
ミン酸、システイン、およびグリシンからなるトリペプ
チドで、肝疾患の治療薬として、また試薬として汎用さ
れる重要な化合物であり、従来から発酵法によって、そ
の商業的生産が行われてきた。しかし、発酵法によって
グルタチオンを生産する際にも、細胞内システイン含量
が、ある段階以上になるとグルタチオン生合成の律速と
なり、従って菌体内システイン含量の一層の向上が望ま
れている。
【０００４】本発明者らは、微生物細胞内のシスタチオ
ニンβ−シンターゼ活性を増強する遺伝子を、遺伝子組
み換え手法により微生物に導入して細胞内の同酵素活性
を強めることにより細胞内システイン含量が増加し、そ
の結果、細胞内グルタチオン含量をも向上させ得ること
を見出し、本発明を完成するに至った。
ニンβ−シンターゼ活性を増強する遺伝子を、遺伝子組
み換え手法により微生物に導入して細胞内の同酵素活性
を強めることにより細胞内システイン含量が増加し、そ
の結果、細胞内グルタチオン含量をも向上させ得ること
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、シスタチオニ
ンβ−シンターゼ活性を増強する遺伝子を微生物細胞内
に導入し、細胞内のシスタチオニン合成酵素の活性を増
強することにより得られる、システインおよびその誘導
体の高生産微生物である。システイン誘導体としてはグ
ルタチオンが好ましく挙げられる。
ンβ−シンターゼ活性を増強する遺伝子を微生物細胞内
に導入し、細胞内のシスタチオニン合成酵素の活性を増
強することにより得られる、システインおよびその誘導
体の高生産微生物である。システイン誘導体としてはグ
ルタチオンが好ましく挙げられる。
【０００６】シスタチオニン合成酵素の活性を増強する
遺伝子は、その塩基配列が化５〜化８で示される。 （塩基配列）
遺伝子は、その塩基配列が化５〜化８で示される。 （塩基配列）
【０００７】
【化５】
【０００８】
【化６】
【０００９】
【化７】
【００１０】
【化８】
【００１１】システインは酵母等の微生物細胞内でシス
タチオニンまたはＯ−アセチルセリンを直接の前駆体と
して生合成される。本発明は、このシステインの前駆体
であるシスタチオニンを、ホモシステインとセリンを基
質として１段階の酵素反応で合成する酵素、すなわちシ
スタチオニンβ−シンターゼを増強して細胞内システイ
ン含量を増加させるものである。
タチオニンまたはＯ−アセチルセリンを直接の前駆体と
して生合成される。本発明は、このシステインの前駆体
であるシスタチオニンを、ホモシステインとセリンを基
質として１段階の酵素反応で合成する酵素、すなわちシ
スタチオニンβ−シンターゼを増強して細胞内システイ
ン含量を増加させるものである。
【００１２】具体的には、先に報告されている酵母の硫
化水素抑制遺伝子ＮＨＳ５（日本発酵工学会大会 講演
要旨集 第５頁（昭和63年）、醸造におけるバイオテク
ノロジー 産調出版（1990）第82頁）の細胞内での生化
学的意義を解明するための研究を行った。その結果、Ｎ
ＨＳ５が酵母細胞内でシスタチオニンβ−シンターゼ活
性を増強する遺伝子であること、及び、ＮＨＳ５を導入
された酵母の菌体内システイン、グルタチオン含量が共
に増加することを見出した。そして、これらの知見か
ら、システインおよびその誘導体を効率的に生産する微
生物を育種することに成功した。
化水素抑制遺伝子ＮＨＳ５（日本発酵工学会大会 講演
要旨集 第５頁（昭和63年）、醸造におけるバイオテク
ノロジー 産調出版（1990）第82頁）の細胞内での生化
学的意義を解明するための研究を行った。その結果、Ｎ
ＨＳ５が酵母細胞内でシスタチオニンβ−シンターゼ活
性を増強する遺伝子であること、及び、ＮＨＳ５を導入
された酵母の菌体内システイン、グルタチオン含量が共
に増加することを見出した。そして、これらの知見か
ら、システインおよびその誘導体を効率的に生産する微
生物を育種することに成功した。
【００１３】なお本発明に用いられる微生物は、シスタ
チオニンをシステイン合成の中間体とする微生物である
限り酵母以外どのような微生物を用いてもよい。シスタ
チオニンβ−シンターゼ増強遺伝子も微生物に対し、例
示のＮＨＳ５と同様の効果を示す限りどのような微生物
由来の遺伝子でも良い。またシステインのみを更に効率
よく生産するためにシステインの資化経路をブロックし
て更に生産性を上げることも可能である。一方、グルタ
チオンの生産性を更に上げるために、システインからグ
ルタチオンへの合成系の酵素、例えばγ−グルタミルシ
ステインシンターゼを増強することも可能である。
チオニンをシステイン合成の中間体とする微生物である
限り酵母以外どのような微生物を用いてもよい。シスタ
チオニンβ−シンターゼ増強遺伝子も微生物に対し、例
示のＮＨＳ５と同様の効果を示す限りどのような微生物
由来の遺伝子でも良い。またシステインのみを更に効率
よく生産するためにシステインの資化経路をブロックし
て更に生産性を上げることも可能である。一方、グルタ
チオンの生産性を更に上げるために、システインからグ
ルタチオンへの合成系の酵素、例えばγ−グルタミルシ
ステインシンターゼを増強することも可能である。
【００１４】
【発明の効果】本発明によれば、細胞内のシスタチオニ
ンβ−シンターゼ活性を増強する遺伝子を微生物に導入
することができたので、この微生物を使ってシステイン
およびその誘導体の生産性を高めることが可能である。
ンβ−シンターゼ活性を増強する遺伝子を微生物に導入
することができたので、この微生物を使ってシステイン
およびその誘導体の生産性を高めることが可能である。
【００１５】
【実施例】以下、実施例につき本発明を具体的に説明す
る。実施例１ではＮＨＳ５のＤＮＡ塩基配列とアミノ酸
配列の決定を、実施例２ではＮＨＳ５を酵母に導入する
ためのプラスミドの作製を、実施例３では作製したプラ
スミドの酵母への導入について、実施例４ではＮＨＳ５
を導入された酵母と親株のシスタチオニンβ−シンター
ゼ活性について、実施例５ではそれらの株のシステイ
ン、グルタチオン含量について、より詳細に説明する。
る。実施例１ではＮＨＳ５のＤＮＡ塩基配列とアミノ酸
配列の決定を、実施例２ではＮＨＳ５を酵母に導入する
ためのプラスミドの作製を、実施例３では作製したプラ
スミドの酵母への導入について、実施例４ではＮＨＳ５
を導入された酵母と親株のシスタチオニンβ−シンター
ゼ活性について、実施例５ではそれらの株のシステイ
ン、グルタチオン含量について、より詳細に説明する。
【００１６】実施例１に示す塩基配列は、それが前記化
５〜８のＡからＢまでに示されたアミノ酸配列をコード
し、かつそのアミノ酸配列を持つタンパク質が酵母内で
発現する限りどのような塩基配列であっても良い。特に
遺伝子の転写翻訳を制御する塩基配列部分は既知のもの
を適宜組み合わせて使っても良い。また化５〜８に示さ
れたアミノ酸配列も酵母内で当該遺伝子がシスタチオニ
ンβ−シンターゼ活性を増強する限り、アミノ酸のいく
つかについて欠失、置換、付加等があってもよい。
５〜８のＡからＢまでに示されたアミノ酸配列をコード
し、かつそのアミノ酸配列を持つタンパク質が酵母内で
発現する限りどのような塩基配列であっても良い。特に
遺伝子の転写翻訳を制御する塩基配列部分は既知のもの
を適宜組み合わせて使っても良い。また化５〜８に示さ
れたアミノ酸配列も酵母内で当該遺伝子がシスタチオニ
ンβ−シンターゼ活性を増強する限り、アミノ酸のいく
つかについて欠失、置換、付加等があってもよい。
【００１７】次に実施例２で遺伝子を酵母に導入するた
めに用いたプラスミドは、例示の３種以外にも遺伝子が
酵母に導入され安定に保持される限りどのようなプラス
ミドであっても良く、また遺伝子を酵母の染色体に組み
込む場合にも、どのような組み込み方であっても良い。
例えば遺伝子の両端に既知の酵母遺伝子を付加しても良
いし、遺伝子そのものだけを組み込んでも良い。形質転
換のための選択マーカーは実施例２で示したＧ418 を用
い、その薬剤に対する耐性遺伝子としては、大腸菌由来
のＧ418 耐性遺伝子中の構造遺伝子部分の前後に酵母ア
ルコールデシドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子の転写プロ
モーター、終結シグナルを連結した遺伝子を用いること
が、形質転換頻度やプラスミドの安定性の観点から望ま
しいが、他の選択マーカーとその耐性遺伝子の組み合わ
せで行っても良い。また栄養要求マーカーを用いても良
いことは言うまでもない。
めに用いたプラスミドは、例示の３種以外にも遺伝子が
酵母に導入され安定に保持される限りどのようなプラス
ミドであっても良く、また遺伝子を酵母の染色体に組み
込む場合にも、どのような組み込み方であっても良い。
例えば遺伝子の両端に既知の酵母遺伝子を付加しても良
いし、遺伝子そのものだけを組み込んでも良い。形質転
換のための選択マーカーは実施例２で示したＧ418 を用
い、その薬剤に対する耐性遺伝子としては、大腸菌由来
のＧ418 耐性遺伝子中の構造遺伝子部分の前後に酵母ア
ルコールデシドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子の転写プロ
モーター、終結シグナルを連結した遺伝子を用いること
が、形質転換頻度やプラスミドの安定性の観点から望ま
しいが、他の選択マーカーとその耐性遺伝子の組み合わ
せで行っても良い。また栄養要求マーカーを用いても良
いことは言うまでもない。
【００１８】なお、酵母のシステイン、グルタチオン含
量をシスタチオニンβ−シンターゼ活性を増強すること
により増加させ得ることは、本発明者によってはじめて
確認されたことであるが、使用したプラスミドの作製
法、形質転換法、その他の遺伝子操作法は分子生物学、
生物学において用いられる慣用法、例えばモレキュラー
クローニング（Molecular Cloning, Cold Spring Harbo
r Laboratory, 1982）記載の方法を用いて差し支えな
い。
量をシスタチオニンβ−シンターゼ活性を増強すること
により増加させ得ることは、本発明者によってはじめて
確認されたことであるが、使用したプラスミドの作製
法、形質転換法、その他の遺伝子操作法は分子生物学、
生物学において用いられる慣用法、例えばモレキュラー
クローニング（Molecular Cloning, Cold Spring Harbo
r Laboratory, 1982）記載の方法を用いて差し支えな
い。
【００１９】実施例１ 先に報告（日本発酵工学会大会 講演要旨集 第５頁
（昭和63年）、醸造におけるバイオテクノロジー 産調
出版（1990）第82頁）されている、プラスミドｐＨＳＧ
５に含まれている酵母由来のＤＮＡ断片上のどこにシス
タチオニンβ−シンターゼ増強遺伝子があるかを調べる
ために、より詳細な制限酵素地図の作製とサブクローニ
ング実験を行った。図１にその結果を示す。制限酵素地
図に示すようにＮＨＳ５は約1.5Kb のＸbaＩ−ＨpaＩ断
片上に存在することが判った。そこでX-2180株由来のＤ
ＮＡ断片中のＢglII切断部位周辺の塩基配列をダイデオ
キシ法（プロシーディングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンセス オブ ザ ユナイテ
ッド ステイツ オブ アメリカ Proc. Natl. Acad.Sc
i. U. S. A. 74, 5463, 1977)によって決定したとこ
ろ、この部分には、1344bpからなるオープンリーディン
グフレームが見出された。このオープンリーディングフ
レームによりアミノ酸448 残基からなる分子量49,588の
タンパク質がコードされていることが判った。
（昭和63年）、醸造におけるバイオテクノロジー 産調
出版（1990）第82頁）されている、プラスミドｐＨＳＧ
５に含まれている酵母由来のＤＮＡ断片上のどこにシス
タチオニンβ−シンターゼ増強遺伝子があるかを調べる
ために、より詳細な制限酵素地図の作製とサブクローニ
ング実験を行った。図１にその結果を示す。制限酵素地
図に示すようにＮＨＳ５は約1.5Kb のＸbaＩ−ＨpaＩ断
片上に存在することが判った。そこでX-2180株由来のＤ
ＮＡ断片中のＢglII切断部位周辺の塩基配列をダイデオ
キシ法（プロシーディングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンセス オブ ザ ユナイテ
ッド ステイツ オブ アメリカ Proc. Natl. Acad.Sc
i. U. S. A. 74, 5463, 1977)によって決定したとこ
ろ、この部分には、1344bpからなるオープンリーディン
グフレームが見出された。このオープンリーディングフ
レームによりアミノ酸448 残基からなる分子量49,588の
タンパク質がコードされていることが判った。
【００２０】実施例２ ＮＨＳ５をＹＥｐタイプのベクターを用いて酵母に導入
して培養試験を行い、ＮＨＳ５のシステイン、グルタチ
オン増加効果を確認するため、ＮＨＳ５を酵母の形質転
換に好適なベクターに導入した。具体的には、まず、公
知のプラスミドベクターであるＹＥｐ24をＢamHIとＳal
Ｉで切断し、ベクター由来の約290bp のＢamHI−ＳalＩ
断片を除去し、代わりに尾形らによって報告（日本発酵
工学会大会 講演要旨集 第109 頁（昭和63年))されて
いるＧ418 耐性遺伝子（大腸菌のトランスポゾン由来の
Ｇ418 耐性遺伝子の前後に酵母アルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子のプロモータ部分と酵母チトクロームＣ遺伝
子のターミネーターを連結した約2.5Kb の両端にＢamH
I、ＳalＩ切断部位を持つＤＮＡ断片）をベクターのＢa
mHI−ＳalＩ切断部位に挿入してベクターＹＥｐＡＧ24
を作製した。ＮＨＳ５を含むＤＮＡ断片としては、図１
に示したｐＨＳ５を制限酵素ＢamHIで切断し、続いて切
断末端からエキソヌクレアーゼＢal31で、約２Kb分解し
て生じた末端にＢamHIリンカーを付加し、その後ＨpaＩ
で再度切断して得られるＮＨＳ５を含む2.5Kb のＤＮＡ
断片を、先に作製したＹＥｐＡＧ24のＢamHI−ＥcoRV切
断部位に挿入してＹＥｐＡＧ−５ＳＳを作製した。こう
して得られたＹＥｐＡＧ−５ＳＳを図２に示す。
して培養試験を行い、ＮＨＳ５のシステイン、グルタチ
オン増加効果を確認するため、ＮＨＳ５を酵母の形質転
換に好適なベクターに導入した。具体的には、まず、公
知のプラスミドベクターであるＹＥｐ24をＢamHIとＳal
Ｉで切断し、ベクター由来の約290bp のＢamHI−ＳalＩ
断片を除去し、代わりに尾形らによって報告（日本発酵
工学会大会 講演要旨集 第109 頁（昭和63年))されて
いるＧ418 耐性遺伝子（大腸菌のトランスポゾン由来の
Ｇ418 耐性遺伝子の前後に酵母アルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子のプロモータ部分と酵母チトクロームＣ遺伝
子のターミネーターを連結した約2.5Kb の両端にＢamH
I、ＳalＩ切断部位を持つＤＮＡ断片）をベクターのＢa
mHI−ＳalＩ切断部位に挿入してベクターＹＥｐＡＧ24
を作製した。ＮＨＳ５を含むＤＮＡ断片としては、図１
に示したｐＨＳ５を制限酵素ＢamHIで切断し、続いて切
断末端からエキソヌクレアーゼＢal31で、約２Kb分解し
て生じた末端にＢamHIリンカーを付加し、その後ＨpaＩ
で再度切断して得られるＮＨＳ５を含む2.5Kb のＤＮＡ
断片を、先に作製したＹＥｐＡＧ24のＢamHI−ＥcoRV切
断部位に挿入してＹＥｐＡＧ−５ＳＳを作製した。こう
して得られたＹＥｐＡＧ−５ＳＳを図２に示す。
【００２１】実施例３ 作製した２種のプラスミドを用い、サッカロマイセス
セレビシエ９Ｂの形質転換を行った。プラスミドの酵母
への導入は親株を200ml の坂口フラスコで0.2−１×105
cells/ml まで培養後、冷水で洗浄し、0.2ml の１モル
ソルビトール溶液に懸濁し、この懸濁液60μl にプラス
ミド１μg (5μl)を加え0.2cm のキュベットに移し、ジ
ーンパルサー（バイオラッド社製）を用い、エレクトロ
ポレーション法（ヌクレイック アシッド リサーチ
Nucl. Acids. Res., 16, 6127(1988))で 7.5KV/cm 、25
μF の導入条件で形質転換を行った。形質転換株の選択
にはＧ418 (100μg/ml) を含むＹＰＤ（イーストエキス
トラクト１％、ペプトン１％、グルコース２％）寒天培
地を用いた。
セレビシエ９Ｂの形質転換を行った。プラスミドの酵母
への導入は親株を200ml の坂口フラスコで0.2−１×105
cells/ml まで培養後、冷水で洗浄し、0.2ml の１モル
ソルビトール溶液に懸濁し、この懸濁液60μl にプラス
ミド１μg (5μl)を加え0.2cm のキュベットに移し、ジ
ーンパルサー（バイオラッド社製）を用い、エレクトロ
ポレーション法（ヌクレイック アシッド リサーチ
Nucl. Acids. Res., 16, 6127(1988))で 7.5KV/cm 、25
μF の導入条件で形質転換を行った。形質転換株の選択
にはＧ418 (100μg/ml) を含むＹＰＤ（イーストエキス
トラクト１％、ペプトン１％、グルコース２％）寒天培
地を用いた。
【００２２】実施例４ 実施例３で得られた形質転換株９Ｂ／ＹＥｐＡＧ−５Ｓ
Ｓと親株の計２株を用いて、菌体内シスタチオニンβ−
シンターゼ活性の測定を行った。酵母の粗抽出液として
はＧ418 (100μg/ml) を含むＹＰＤ液体培地を使って、
30℃一夜振盪培養により得られた菌体を、遠心分離で集
菌し洗浄後、これをガラスビーズで破砕し再度遠心分離
を行い、得られた上清を使用した。シスタチオニンβ−
シンターゼ活性の測定は、粗抽出液を基質（ホモシステ
インとセリン）とピリドキサールリン酸、硫酸銅の存在
下で反応させ、生成したシスタチオニンを酸性条件下の
ニンヒドリンの特異的発色により比色定量するカシワマ
タら（バイオキミカ エトバイオフィジカ アクタ（Bi
ochim. Biophys. Acta.), 212, 488-500(1970)）の方法
に従って行った。その結果を下表に示す。 シスタチオニンβ−シンターゼ活性 （μmol/hr/mg protein) 形質転換株 ９Ｂ／ＹＥｐＡＧ−５ＳＳ 13.1 対照（親株）９Ｂ／ＹＥｐＡＧ24 1.0 上記結果から明らかな通り、形質転換株９Ｂ／ＹＥｐＡ
Ｇ−５ＳＳのシスタチオニンβ−シンターゼ活性は、対
照９Ｂ／ＹＥｐＡＧ24のそれに比べ高い活性を示してい
た。
Ｓと親株の計２株を用いて、菌体内シスタチオニンβ−
シンターゼ活性の測定を行った。酵母の粗抽出液として
はＧ418 (100μg/ml) を含むＹＰＤ液体培地を使って、
30℃一夜振盪培養により得られた菌体を、遠心分離で集
菌し洗浄後、これをガラスビーズで破砕し再度遠心分離
を行い、得られた上清を使用した。シスタチオニンβ−
シンターゼ活性の測定は、粗抽出液を基質（ホモシステ
インとセリン）とピリドキサールリン酸、硫酸銅の存在
下で反応させ、生成したシスタチオニンを酸性条件下の
ニンヒドリンの特異的発色により比色定量するカシワマ
タら（バイオキミカ エトバイオフィジカ アクタ（Bi
ochim. Biophys. Acta.), 212, 488-500(1970)）の方法
に従って行った。その結果を下表に示す。 シスタチオニンβ−シンターゼ活性 （μmol/hr/mg protein) 形質転換株 ９Ｂ／ＹＥｐＡＧ−５ＳＳ 13.1 対照（親株）９Ｂ／ＹＥｐＡＧ24 1.0 上記結果から明らかな通り、形質転換株９Ｂ／ＹＥｐＡ
Ｇ−５ＳＳのシスタチオニンβ−シンターゼ活性は、対
照９Ｂ／ＹＥｐＡＧ24のそれに比べ高い活性を示してい
た。
【００２３】実施例５ 実施例３で得られた形質転換株と親株の計２株を用いて
システイン、ホモシステイン、γ−グルタミルシステイ
ン、グルタチオンの定量を行った。形質転換株をＧ418
(100μg/ml) を含む100ml ＹＰＤ液体培地(500ml坂口フ
ラスコ使用）に接種し、30℃で一夜振盪培養を行った。
培養液を遠心分離して集菌し菌体を水で洗浄後、再度水
に懸濁し、湯浴上で100 ℃にて５分間加熱処理を行い、
システイン、グルタチオンを抽出した後、遠心分離を行
い、得られた上清のシステイン、グルタチオン濃度を測
定した。システイン、グルタチオンの定量法は抽出液を
逆相カラム（Ｃ18）を使って分離するＨＰＬＣ法を使
い、検出器はアマルガム電極による電気化学検出器を使
った。ＮＨＳ５を保持する株の、親株に対するシステイ
ン、グルタチオン含量の増加率を下表に示す。 システイン グルタチオン 形質転換株 ９Ｂ／ＹＥｐＡＧ−５ＳＳ 200％ 130％ 対照（親株）９Ｂ／ＹＥｐＡＧ24 100％ 100％ 上記の結果から明らかな通り、形質転換株９Ｂ／ＹＥｐ
ＡＧ−５ＳＳは、システイン含量が約２倍に増加し、グ
ルタチオン含量が約３割増加した。
システイン、ホモシステイン、γ−グルタミルシステイ
ン、グルタチオンの定量を行った。形質転換株をＧ418
(100μg/ml) を含む100ml ＹＰＤ液体培地(500ml坂口フ
ラスコ使用）に接種し、30℃で一夜振盪培養を行った。
培養液を遠心分離して集菌し菌体を水で洗浄後、再度水
に懸濁し、湯浴上で100 ℃にて５分間加熱処理を行い、
システイン、グルタチオンを抽出した後、遠心分離を行
い、得られた上清のシステイン、グルタチオン濃度を測
定した。システイン、グルタチオンの定量法は抽出液を
逆相カラム（Ｃ18）を使って分離するＨＰＬＣ法を使
い、検出器はアマルガム電極による電気化学検出器を使
った。ＮＨＳ５を保持する株の、親株に対するシステイ
ン、グルタチオン含量の増加率を下表に示す。 システイン グルタチオン 形質転換株 ９Ｂ／ＹＥｐＡＧ−５ＳＳ 200％ 130％ 対照（親株）９Ｂ／ＹＥｐＡＧ24 100％ 100％ 上記の結果から明らかな通り、形質転換株９Ｂ／ＹＥｐ
ＡＧ−５ＳＳは、システイン含量が約２倍に増加し、グ
ルタチオン含量が約３割増加した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１で作製した制限酵素地図を示す図。
【図２】 実施例２で作製したプラスミドＹＥｐＡＧ−
５ＳＳの制限酵素地図を示す図。
５ＳＳの制限酵素地図を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (5)
- 【請求項１】 シスタチオニンβ−シンターゼ活性を増
強する遺伝子を微生物細胞内に導入し、細胞内のシスタ
チオニン合成酵素の活性を増強することにより得られ
る、システインおよびその誘導体の高生産微生物。 - 【請求項２】 誘導体がグルタチオンである請求項１記
載の微生物。 - 【請求項３】 サッカロマイセス セレビシエ由来のシ
スタチオニン合成酵素の活性を増強する遺伝子を、同遺
伝子が発現可能なベクターにより導入することによっ
て、細胞内のシスタチオニン合成酵素の活性を増強する
請求項１または２記載の微生物。 - 【請求項４】 シスタチオニン合成酵素の活性を増強す
る遺伝子が、化１〜化４に示す塩基配列を有する請求項
３記載の微生物。 （塩基配列） 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 - 【請求項５】 請求項４記載の化１〜化４のＡからＢま
でに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
るＤＮＡ断片を導入し、これにより菌体内シスタチオニ
ン合成酵素活性が上昇した請求項３記載の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6757091A JPH05199863A (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | システインおよびその誘導体の高生産微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6757091A JPH05199863A (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | システインおよびその誘導体の高生産微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05199863A true JPH05199863A (ja) | 1993-08-10 |
Family
ID=13348749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6757091A Pending JPH05199863A (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | システインおよびその誘導体の高生産微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05199863A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003095959A (ja) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Kokuritsu Seishin Shinkei Center | ホモシステイン血症治療剤 |
| JP2011103789A (ja) * | 2009-11-13 | 2011-06-02 | Kirin Holdings Co Ltd | グルタチオン高生産酵母及びその利用 |
| WO2012133823A1 (ja) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | 独立行政法人海洋研究開発機構 | 新規有用深海細菌 |
| WO2015166845A1 (ja) * | 2014-05-01 | 2015-11-05 | 株式会社島津製作所 | 細胞の分化状態の評価方法 |
-
1991
- 1991-03-08 JP JP6757091A patent/JPH05199863A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003095959A (ja) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Kokuritsu Seishin Shinkei Center | ホモシステイン血症治療剤 |
| JP2011103789A (ja) * | 2009-11-13 | 2011-06-02 | Kirin Holdings Co Ltd | グルタチオン高生産酵母及びその利用 |
| WO2012133823A1 (ja) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | 独立行政法人海洋研究開発機構 | 新規有用深海細菌 |
| WO2015166845A1 (ja) * | 2014-05-01 | 2015-11-05 | 株式会社島津製作所 | 細胞の分化状態の評価方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Siebert et al. | Ubiquinone biosynthesis Cloning of the genes coding for chorismate pyruvate-lyase and 4-hydroxybenzoate octaprenyl transferase from Escherichia coli | |
| IT9022514A1 (it) | Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati | |
| CN111434773A (zh) | 一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用 | |
| JP2001525682A (ja) | 改良された性質を有する形質転換微生物 | |
| Spannagel et al. | The subunit f of mitochondrial yeast ATP synthase: Characterization of the protein and disruption of the structural gene ATP17 | |
| EP0248637A2 (en) | Induction of galactose regulated gene expression in yeast | |
| KR100493538B1 (ko) | 페르라산탈탄산효소 | |
| CN114196715A (zh) | 一种化学酶法合成假尿苷的方法 | |
| CN109913380A (zh) | 生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 | |
| CN113249239A (zh) | 一种高产藏红花酸的酿酒酵母及其构建方法和应用 | |
| JPH05199863A (ja) | システインおよびその誘導体の高生産微生物 | |
| KR102129379B1 (ko) | 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법 | |
| CN114891707B (zh) | 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法 | |
| CN114525215B (zh) | 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用 | |
| CN116286421A (zh) | 一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| EP1174499B1 (en) | Novel amidase gene | |
| KR101551533B1 (ko) | 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법 | |
| CN113583925A (zh) | 一种代谢工程大肠杆菌发酵制备广藿香醇的方法 | |
| JPH0753102B2 (ja) | グルタチオン高含有酵母及びその製造法 | |
| CN109929869B (zh) | 一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌、其制备方法及其应用 | |
| JP7495083B2 (ja) | ペルオキシダーゼの組換え生産 | |
| WO2020213374A1 (ja) | ペルオキシダーゼの組換え生産 | |
| CN117925430A (zh) | 一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用 | |
| JPH09220093A (ja) | イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法 | |
| JP3496640B2 (ja) | 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子、同酵素遺伝子含有形質転換体および同酵素の製造方法 |