CN110506108A - 过表达phoP-phoR的重组BCG - Google Patents
过表达phoP-phoR的重组BCG Download PDFInfo
- Publication number
- CN110506108A CN110506108A CN201780089047.1A CN201780089047A CN110506108A CN 110506108 A CN110506108 A CN 110506108A CN 201780089047 A CN201780089047 A CN 201780089047A CN 110506108 A CN110506108 A CN 110506108A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bcg
- mycobacterium bovis
- phop
- bacterial strain
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 claims abstract description 87
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 23
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 24
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 16
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 15
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 14
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 13
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 7
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 7
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010072039 Histidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 2
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010231 histologic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTLYMKDSHNWQKD-UHFFFAOYSA-N (2,4,5-trichlorophenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl FTLYMKDSHNWQKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710088335 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85A Proteins 0.000 description 1
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000221775 Hypocreales Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000187492 Mycobacterium marinum Species 0.000 description 1
- 101100030428 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) PPE18 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000026681 Paratuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000261236 bacterium 1.1 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 101150086609 groEL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 108700007621 mifamurtide Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N pentatriacontane-17,18,19-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCC ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150028857 phoP gene Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 208000010707 pulmonary consolidation Diseases 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940085605 saccharin sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N trehalose 6,6'-dimycolate Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)C(CCCCCCCCCCC3C(C3)CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)O2)O)O1)O)OC(=O)C(C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)CCCCCCCCCCC1CC1CCCCCCCCCCCCCCCCCC XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229960002109 tuberculosis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/32—Mycobacterium
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供活的重组牛分枝杆菌‑BCG菌株和结核病(TB)疫苗或免疫原性组合物，其包含能够过表达的核酸，所述核酸编码PhoP和PhoR蛋白。本发明还提供使用所述菌株治疗或预防哺乳动物免受结核分枝杆菌或牛分枝杆菌的攻击的方法。
Description
发明领域
本发明涉及结核病(TB)疫苗。特别是，本发明提供一种重组BCG，其过表达phoP- phoR双组分调控系统并赋予针对结核病的增强防护。
发明背景
由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(M. tb)引起的结核病(TB)与HIV/AIDS并列为全球感染性疾病死亡率的主要原因。2014年，TB导致150万人死亡和960万新感染。缺少防护性疫苗、耐药M. tb菌株的出现以及高比率的M. tb/HIV合并感染继续助长TB流行。卡介苗(Bacille Calmette-Guérin) (BCG)为唯一获得许可的TB疫苗，并且尽管其对儿童中传播形式的TB有效1,2，但BCG对成人肺部TB (该疾病的最常见和最具传染性的形式)的防护作用有限。临床研究表明，可变功效范围为0-80%3-5。
解释BCG可变功效的一个假设涉及BCG菌株的异质性6。BCG源自从1908-1921年通过体外传代的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的毒力菌株。随后的全世界分布和连续传代直到20世纪60年代导致了许多BCG亚株。BCG菌株之间的遗传差异，包括基因组区的缺失和重复以及单核苷酸多态性(SNP)，已被充分记录7-12。这些差异是否影响BCG对TB的有效性是一个有争议的问题6,13，并且目前没有足够的数据来推荐一种特定菌株，因为缺乏直接比较多种BCG菌株的临床试验14。
目前改进TB疫苗的策略包括开发亚单位和活的减毒疫苗15,16。然而，没有一种亚单位疫苗在动物模型中被证明优于BCG。在最近的临床试验中，在接种BCG的婴儿中MVA85A(最先进的亚单位疫苗)缺少防护功效17进一步强调了活疫苗研究的重要性18。已经探索了许多方法来开发活疫苗，包括产生重组BCG和减毒的M.tb菌株。其中，仅有少数已经证明在动物模型中优于BCG，包括已进入临床试验的3种活疫苗(rBCG30、VPM1002和MTBVAC)16。rBCG30为过表达抗原Ag85B的重组BCG-Tice菌株。与用亲本BCG免疫的那些相比较，豚鼠接种rBCG30随后M.tb攻击导致细菌负荷减少0.5-1.0 log10并延长存活19,20。然而，这种效应对BCG-Tice为特异性的，因为BCG-Connaught中Ag85B的过表达并未改善防护作用20。VPM1002为表达单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素的重组BCG。这种疫苗的基本原理为以下概念：李斯特菌溶胞素可促进BCG的吞噬体逃逸到巨噬细胞的细胞溶质中，从而增加抗原呈递21。与亲本菌株相比较，用VPM1002接种的BALB/c小鼠显示M.tb负荷减少0.5-1.0 log10 21,22，然而，在豚鼠模型中没有观察到这种防护作用的改善23。将M.tb的phoP缺失突变体作为候选疫苗进行评估，其原因是与BCG相比，减毒M.tb可能与M.tb的临床菌株共具更多抗原24。M.tb ΔphoP在小鼠中提供与BCG类似的防护作用，但在豚鼠中对M.tb攻击具有更好的防护作用24,25。为了确保安全性，缺失fadD26以进一步减毒菌株(MTBVAC)，其在SCID小鼠中显示出与BCG-Pasteur或BCG-Danish相当的安全性特征26。
发明概述
本发明提供结核病疫苗，其包含过表达phoP-phoR (一种双组分调控系统)的重组分枝杆菌(mycobacterium)菌株。目前的BCG疫苗株的免疫原性不足以诱导宿主中针对结核病的最佳防护作用。相比之下，过表达phoP-phoR的本发明基因工程BCG菌株具有更高的免疫原性并提供更好的针对结核病的防护作用。以足以引起PhoP-PhoR调控的基因或蛋白的2(或更多)倍诱导的水平过度产生phoP-phoR的任何基因工程分枝杆菌可有利地用于本发明的实践中。当将本发明的重组分枝杆菌给予哺乳动物宿主时，在宿主中通过CD4+ T细胞的IFN-γ产生增加，并且该重组分枝杆菌提供针对结核病的防护作用。
已有十多项研究比较了在人类中由不同BCG菌株诱导的免疫反应14,27。然而，在大多数这些研究中仅包括两种或三种BCG菌株。研究设计的差异(比如BCG菌株的选择、免疫的年龄和群体大小)导致了不确定的结果14。尽管如此，这些研究中最大的一项研究，其由WHO在20世纪70年代领导，在儿童中比较了11种BCG菌株28。BCG-Prague被发现为异常值，呈现出比其他BCG菌株(包括BCG-Danish、-Pasteur、-Glaxo、-Japan、-Russia和-Moreau)更低的结核菌素反应性28,29。对其免疫原性低的担忧导致它在几乎30年的使用后于1981年在捷克斯洛伐克由BCG-Russia取代30。BCG-Prague的结核菌素反应性低的原因尚不清楚。然而，本发明人发现BCG-Prague中的phoP为假基因，含有破坏C-末端DNA结合结构域的1-bp插入9。该突变对于BCG-Prague为特异性的，因为所有其他BCG菌株均含有野生型(WT) phoP。PhoP为PhoP-PhoR双组分系统的反应调控因子，并且正调节M. tb中的40多种基因，包括两种已用于构建亚单位疫苗的T细胞抗原(Ag85A, PPE18)16,31。因此，本发明人假设BCG-Prague的免疫原性低为phoP突变的结果9，并且BCG中phoP的过表达可提供增强免疫原性的有效手段，并因此提供保护功效。一致地，本发明人在WO2011/130878A1中显示BCG-Prague与WT phoP的互补或者BCG-Japan中phoP的过表达增加了IFN-γ的产生。
本发明基于发明人的发现，即BCG菌株比如BCG-Japan中phoP-phoR的过表达增强了其免疫原性和防护功效，表明这可能是改善BCG的一般适用方法。在本发明中证实，与亲本BCG相比，用重组菌株rBCG-Japan/PhoPR接种C57BL/6小鼠诱导通过CD4+ T细胞的更高水平的IFN-γ产生。与用亲本BCG免疫的动物相比较，用rBCG-Japan/PhoPR接种的豚鼠更好地受到防护免受结核分枝杆菌的攻击，显示出存活时间显著更长、细菌负荷减少和病理学更不严重。总之，已证实过表达phoP-phoR的本发明的重组BCG比目前的BCG赋予增强的针对结核病的防护作用。
PhoP的示例性的氨基酸序列如图1A [SEQ ID NO: 1]所示，和编码它的示例性的核苷酸序列如图1B [SEQ ID NO: 2]所示。PhoR的示例性的氨基酸序列如图1C [SEQ IDNO: 3]所示，和编码它的示例性的核苷酸序列如图1D [SEQ ID NO: 4]所示。这些序列代表来自BCG-Pasteur的PhoP和PhoR，如巴斯德研究所网站(http://genodb.pasteur.fr/cgi-bin/WebObjects/GenoList)上可获得的基因组序列所示。
本发明涉及重组牛分枝杆菌BCG，其过表达编码PhoP [SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2]和PhoR [SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4]的DNA。
本发明涉及包含能够过表达的核酸的重组牛分枝杆菌BCG，该核酸编码PhoP [SEQID NO:1; SEQ ID NO:2]和PhoR [SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4]。
在一个实施方案中，重组牛分枝杆菌-BCG菌株选自牛分枝杆菌-BCG- Russia、牛分枝杆菌-BCG-Moreau、牛分枝杆菌-BCG- Japan、牛分枝杆菌-BCG-Sweden、牛分枝杆菌-BCG -Birkhaug、牛分枝杆菌- BCG-Prague、牛分枝杆菌-BCG-Glaxo、牛分枝杆菌-BCG-Denmark、牛分枝杆菌-BCG-Tice、牛分枝杆菌-BCG-Frappier、牛分枝杆菌-BCG-Connaught、牛分枝杆菌-BCG- Phipps、牛分枝杆菌-BCG-Pasteur和牛分枝杆菌BCG-China。
另外，本发明的重组分枝杆菌(mycobacteria)不必局限于BCG菌株。本领域的技术人员将认识到也可使用其他分枝杆菌菌株，包括M.tb的减毒菌株。
在又一个实施方案中，本发明的疫苗可为亚单位或DNA疫苗。在一些实施方案中，疫苗经肺病原体传递。例如，编码PhoP和PhoR的DNA序列可存在于肺病原体(比如减毒的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或其他已知的减毒真菌或病毒)的染色体或染色体外核酸中。或者，编码PhoP和PhoR调节子的核酸可通过本领域技术人员已知的其他方法传递，例如经脂质体、腺病毒载体等。
本发明的另一方面为药用组合物，其包含含有能够过表达的核酸的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，该核酸编码PhoP [SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2]和PhoR [SEQ ID NO:3;SEQ ID NO:4]。
在本发明的另一方面，存在用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌攻击的疫苗或免疫原性组合物，其包含含有能够过表达的核酸的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，该核酸编码PhoP [SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2]和PhoR [SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4]。
本发明的另一方面涉及用于治疗或预防哺乳动物免受结核分枝杆菌或牛分枝杆菌攻击的方法，该方法包括给予哺乳动物本发明的疫苗或免疫原性组合物。在一个实施方案中，哺乳动物为牛。在另一个实施方案中，哺乳动物为人。在又一个实施方案中，疫苗或免疫原性组合物在存在佐剂的情况下给予。
本发明的另一方面为用于治疗或预防哺乳动物免受癌症的方法，该方法包括给予哺乳动物本发明的疫苗或免疫原性组合物。在一个实施方案中，癌症为膀胱癌。在另一个实施方案中，疫苗或免疫原性组合物在存在佐剂的情况下给予。
附图简述
图1显示PhoP-PhoR序列。(a) BCG-Pasteur的PhoP的氨基酸序列；(b) BCG-Pasteur的phoP的DNA序列；(c) BCG-Pasteur的PhoR的氨基酸序列；(d) BCG-Pasteur的phoR的DNA序列。
图2显示克隆载体pME。
图3显示用于phoP和phoP-phoR的构建的表达载体。
图4显示与亲本BCG相比，rBCG-Japan/PhoPR诱导通过CD4+ T细胞的更多IFN-γ产生。
图5显示rBCG-Japan/PhoPR延长感染有M.tb的豚鼠的存活。
图6显示rBCG-Japan/PhoPR减少感染有M.tb的豚鼠的肺病理学。
图7显示rBCG-Japan/PhoPR在SCID小鼠中为安全的。
发明详述
针对TB的防护作用需要细胞介导的免疫，其尚未完全了解，但涉及多种成分，包括CD4+和CD8+ T细胞16,32,33。BCG诱导T辅助细胞1 (Th1)型反应，主要是通过CD4+ T细胞的IFN-γ产生34。传统上，BCG的免疫原性通过在接种疫苗之前为结核菌素阴性的儿童中测量疫苗诱导的结核菌素(PPD，M.tb的纯化蛋白衍生物)敏感性来确定30。尽管近年来结核菌素反应性作为防护作用的代替度量的用途受到质疑35,36，但结核菌素反应性继续被用作细胞介导的免疫反应的体内测定和免疫原性的标志物19,37。支持这一点，在BCG接种的婴儿中，结核菌素反应性与PPD特异性IFN-γ水平之间存在密切关联38。进一步地，发现结核菌素反应性和IFN-γ产生为年轻人中抗TB免疫力的非冗余的补充度量39。20世纪70年代的研究发现，BCG-Prague在儿童和豚鼠中的结核菌素反应性始终呈现出显著低于其他10种测试的BCG菌株28,29。对其免疫原性低的担忧导致它在几乎30年的使用后于1981年在捷克斯洛伐克由BCG-Russia取代30。
BCG-Prague的结核菌素反应性降低的原因尚不清楚。我假设在我们先前的研究9中发现的BCG-Prague中的phoP突变有助于其免疫原性降低。
为了验证这一假设，我们首先用完整的phoP基因补充BCG-Prague，并确定其对免疫原性的影响。将来自BCG-Pasteur的WT phoP基因克隆到多拷贝穿梭载体pME中并引入到BCG-Prague (rBCG-Prague/PhoP)。用重组BCG-Prague菌株接种C57BL/6小鼠，并通过ELISA测量PPD特异性IFN-γ的产生。始终地，rBCG-Prague/PhoP在C57BL/6小鼠中诱导更高水平的PPD特异性IFN-γ释放，这是用亲本菌株免疫的小鼠的~2.4倍(图4a, p<0.05)。
为了测试phoP的过表达是否可用作改善BCG免疫原性的一般适用方法，我们在另一种BCG菌株BCG-Japan中构建了过表达phoP的重组BCG并产生了rBCG-Japan/PhoP。PhoR为一种组氨酸激酶，其感知未知的细胞外信号并使PhoP磷酸化31。由于BCG-Japan具有在其基因组中被共转录的完整的phoP-phoR，我们还产生了rBCG-Japan/PhoPR，其过表达phoP和phoR两者以维持该双组分系统的功能比。
与BCG-Prague获得的结果一致，rBCG-Japan/PhoP和rBCG-Japan/PhoPR两者在C57BL/6小鼠中诱导比亲本菌株显著更高水平的PPD特异性IFN-γ产生(图4b)。有趣的是，在这3种菌株中，rBCG-Japan/PhoPR诱导了最高水平的IFN-γ。
为了确定重组BCG菌株诱导的IFN-γ的来源，我们还进行了细胞内细胞因子染色和FACS分析。我们发现CD4+ T细胞可能是IFN-γ释放增强的原因(图4c)。用rBCG-Japan/PhoPR接种的小鼠中产生IFN-γ的CD4+ T细胞的频率为用亲本菌株接种的小鼠中的~3.5倍，这与这两组之间总IFN-γ产生的倍数差异(~2.6倍)一致(图4b, c)。
相比之下，与假免疫的对照相比较，重组BCG-Japan菌株均未诱导强烈的CD8+ T细胞反应。未检测到重组BCG-Japan菌株对其他细胞因子(IL-2、TNF、IL-12、IL-4、IL-5和IL-10)的显著诱导。
总之，这些结果表明phoP突变为BCG-Prague的免疫原性低的部分原因。更重要的是，BCG-Japan中phoP-phoR的过表达进一步促进了通过CD4+ T细胞的IFN-γ产生，表明这可能是增强BCG的防护功效的一般适用方法。
为了检查phoP-phoR的过表达是否改善BCG介导的针对M.tb感染的防护作用，我们进行了长期(10个月)的豚鼠存活实验。豚鼠(每组11只)接种rBCG-Japan/PhoPR、亲本菌株或PBS，并在接种后8周用1000 CFU/肺的M.tb H37Rv产气攻击。在人道终点对豚鼠实施安乐死，并使用Kaplan-Meier分析绘制存活曲线。
PBS、亲本和rBCG-Japan/PhoPR组的中位存活时间分别为18、27和39周(图5a)。对数秩分析显示，rBCG-Japan/PhoPR组的存活时间明显长于亲本BCG组(p<0.05)和PBS组(p<0.0001)。亲本组的存活时间也明显长于PBS组(p<0.01)。
与未接种疫苗的动物相比较，亲本BCG使豚鼠的存活延长了9周，而rBCG-Japan/PhoPR使豚鼠的存活延长了21周(比亲本组提高了133%)。在实验终止时攻击后第43周，与rBCG-Japan/PhoPR组中的4只动物相比较，亲本组中仅有一只豚鼠存活。PBS组中的所有动物到第25周时死于感染。
在人道或实验终点对动物实施安乐死之后，进一步分析豚鼠肺和脾。与先前的观察类似，rBCG-Japan/PhoPR组在肺中的M.tb计数比亲本BCG组低~1.7 log10 (图5b, p<0.05)。rBCG-Japan/PhoPR组的脾中的M.tb负荷也比亲本BCG组低~1.0 log10，并且这种差异接近显著性(p = 0.066)。始终地，与其他两组相比较，rBCG-Japan/PhoPR组的肺和脾重量最低(图5d, e)。
对5只动物的肺进行组织学分析。它们包括来自每组达到人道终点的一只动物、亲本组的唯一幸存者以及第43周时rBCG-Japan/PhoPR组的4名幸存者之一。有趣的是，豚鼠的死亡率似乎与尾叶组织损伤的程度相关。在实验结束之前实施安乐死的3只动物除了在前叶中广泛实变之外，在尾叶中也有广泛(图6a)或部分实变(图6b, c)。相比之下，两只幸存者似乎在尾叶中具有健康组织，尽管来自亲本组的那只在前叶中也具有广泛的组织损伤(图6d)。引人注目的是，rBCG-Japan/PhoPR组的幸存者似乎肺部正常，任一肺叶都没有明显的肺实变(图6e)。
PhoP被认为是M. tb的毒力因子24，部分原因为其正调控EsxA (M. tb毒力的重要效应物)的分泌40。因此，可能的是，BCG中过表达phoP-phoR可能增加毒力并危及安全性。另一方面，由于esxA为所有BCG菌株的基因组中不存在的差异区域1 (RD1)的一部分12，phoP- phoR的过表达有助于BCG毒力的程度仍不清楚。
为了解决这个问题，我们首先用重组BCG-Japan菌株感染SCID小鼠并监测靶器官中的细菌生长长达6周。有趣的是，在实验过程期间，rBCG-Japan/PhoPR和亲本BCG在肺或脾中的生长之间没有显著差异(图7a, b)。然而，与亲本菌株和rBCG-Japan/PhoPR两者相比较，单独phoP的过表达增加SCID小鼠中BCG-Japan的复制。
接下来，我们进行了长期SCID小鼠存活实验。BCG-Pasteur为毒力最强的BCG菌株之一41，也包括在本实验中用于比较。感染有BCG-Pasteur、rBCG-Japan/PhoP和rBCG-Japan/PhoPR的SCID小鼠的中位存活时间分别为7、14和19周(图7c)。当实验终止时，用亲本菌株或PBS感染的所有SCID小鼠存活至第20周。对数秩分析显示，rBCG-Japan/PhoP组与rBCG-Japan/PhoPR组(p＝0.02)和亲本组(p<0.001)相比较，存活显著减少，这与在短期感染实验中这组观察到的细菌负荷较高一致(图7a, b)。与亲本组相比较，rBCG-Japan/PhoPR组也显示存活减少(p＝0.02)。重要的是，rBCG-Japan/PhoPR和rBCG-Japan/PhoP两者在SCID小鼠中的毒力显著低于BCG-Pasteur (p<0.001)。总之，这些结果表明，BCG-Japan中phoP-phoR的过表达不增加其在SCID小鼠中的复制，并且仅引起毒力的适度增加。
总之，我们证实了过表达phoP-phoR的重组BCG赋予增强的针对结核病的防护作用。rBCG-Japan/PhoPR的优异防护作用在豚鼠中得到证实，通过显著的存活延长和病理学减少得以证明，这是在动物模型中测试新型疫苗的标志。豚鼠为测试TB疫苗功效的“金标准”动物模型20。疾病的发病机制、病理损伤和对BCG疫苗接种的反应与在人类中描述的那些类似。
人们一致认为，新型TB候选疫苗必须符合从发现阶段进入临床前开发的标准。这些标准包括强烈的IFN-γ诱导、比BCG更好的防护功效，以及在已建立的动物模型中与BCG相当的安全性概况42。rBCG-Japan/PhoPR菌株已经满足这些标准，并因此是未来临床开发的有希望的候选者。
牛分枝杆菌(M. bovis)BCG还用于治疗膀胱癌。许多随机对照临床试验表明，BCG的膀胱内给予可预防或延迟肿瘤复发43。BCG如何发挥这种作用的细节仍有待确定。然而，抗肿瘤反应需要完整的T细胞反应，并涉及Th1型细胞因子的表达增加44。因此，证明Th1细胞因子IFN-γ增加的BCG菌株比如rBCG-Japan/PhoPR可提供增强的抗肿瘤活性。
总之，我们使用过表达phoP-phoR的重组BCG菌株作为疫苗来预防TB和其他分枝杆菌感染。这些重组BCG疫苗诱导更好的针对结核病的防护性免疫。
在本发明的基因工程(即重组)分枝杆菌中，PhoP和PhoR蛋白过表达，即这两种蛋白的表达水平超过合适的对照生物体，比如尚未经基因工程改造以过表达PhoP和PhoR的相同分枝杆菌。本领域的技术人员熟知蛋白活性的比较测量和进行这种测量的合适标准和对照的使用。
可通过本领域已知的任何合适的方法进行分枝杆菌中PhoP和PhoR蛋白的过表达。通常，所述方法包括使编码PhoP和PhoR蛋白的核酸序列连接于在自然中与phoP和phoR基因不连接的表达调控序列。本领域的技术人员将认识到，许多这种表达调控序列为已知的并且适合用于本发明。例如，如果期望phoP和phoR基因的组成型表达，则表达调控序列(例如启动子和相关序列)包括(但不限于)：分枝杆菌最佳启动子：hsp65、ace或msp 12启动子，T7启动子等。或者，phoP和phoR的过表达可为诱导型的，例如，在四环素诱导型启动子下。
根据本发明编码的蛋白质、多肽或肽包括天然存在的蛋白质、多肽或肽，或者具有与天然存在的蛋白质、多肽或肽相同功能的其同源物。这种同源物包括与天然存在的蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少60%，优选地约70%或更多、80%或更多，和最优选地90%或更多，例如95%、96%、97%、98或99%同源性的蛋白质、多肽或肽。这种同源物包括在天然存在的蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列中(例如在SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中)具有一个或多个(例如1-50、1-20、1-10、1-5个)氨基酸残基的取代、添加和缺失的蛋白质、多肽或肽。这种同源物尤其包括具有保守氨基酸取代的蛋白质、多肽或肽。
本文使用的术语“PhoP”和“PhoR”是指双组分调控系统PhoP-PhoR。PhoP为一种反应调控因子和PhoR为一种组氨酸激酶。根据本发明编码的PhoP或PhoR包括天然存在的功能性PhoP和PhoR (例如来自分枝杆菌属，优选地来自结核分枝杆菌或牛分枝杆菌)或如上所述的其同源物。PhoP和PhoR的示例性的氨基酸序列如图1a中的SEQ ID NO: 1和图1c中的SEQ ID NO: 3所示。
本文使用的术语“过表达(overexpress)”、“过表达(overexpressing)”或“过表达(overexpression)”是指在重组细菌中表达的靶基因的蛋白水平高于在非重组的初始细菌中表达的相同蛋白的水平。例如，在重组细菌中表达的感兴趣的蛋白为非重组细菌的1.1、1.5、2、4、10、20、50、100、500、1000或更多倍。过表达可通过基因工程进行，比如使用多拷贝质粒和/或使用强启动子。
核酸分子的变化
修饰
可对本申请中公开的核酸分子DNA序列进行许多修饰，并且这些修饰对于本领域的技术人员为显而易见的。本发明包括本申请中公开的序列(或其片段)的核苷酸修饰，其在细菌或哺乳动物细胞中编码与本申请中公开的蛋白质或肽具有相同功能的蛋白质或肽。修饰包括一个或多个(例如1-50、1-20、1-10、1-5个)核苷酸的取代、插入或缺失，或者改变一个或多个(例如1-50、1-20、1-10、1-5个)核苷酸的相对位置或顺序。
核酸分子可编码PhoP和PhoR蛋白中的保守氨基酸变化。本发明包括编码保守氨基酸变化并在PhoP和PhoR蛋白中产生沉默氨基酸变化的功能等同的核酸分子。用于根据经验鉴定保守氨基酸取代组的方法为本领域熟知的(参见例如Wu, Thomas D. “DiscoveringEmperically Conserved Amino Acid Substitution Groups in Databases of ProteinFamilies” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgicmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8877523&dopt=Abstract)。
核酸分子可编码phoP和/或phoR基因中的非保守氨基酸取代、添加或缺失。本发明包括功能等同的核酸分子，其在PhoP和PhoR蛋白的氨基酸序列内产生非保守氨基酸变化。功能等同的核酸分子包括DNA和RNA，其编码具有非保守氨基酸取代(优选地化学上相似的氨基酸的取代)、添加或缺失，但还保留与本申请中公开的PhoP和PhoR蛋白质或肽相同或相似的功能的肽、肽和蛋白质。本发明包括编码PhoP和PhoR蛋白的片段或变体的DNA或RNA。
片段可用作免疫原和用于免疫原性组合物中。
通过如下所述的测定鉴定这种片段和变体的PhoP和PhoR样活性。
序列同一性
本发明的核酸分子还包括与本发明的核酸分子具有至少约60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性，至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或最优选地至少99%或99.5%同一性并且能够在细菌或哺乳动物细胞中表达核酸分子的核酸分子(或其片段)。同一性是指经比对使得获得最高级匹配的两个核苷酸序列的相似性。根据本领域已知的方法计算同一性。例如，如果核苷酸序列(称为“序列A”)与SEQID NO: 2的一部分具有90%同一性，则除了序列A可包括SEQ ID NO: 2的参考部分的每100个核苷酸中最多10个点突变(比如用其他核苷酸取代)以外，序列A将与SEQ ID NO: 2的参考部分相同。
序列同一性(每个构建体优选地没有编码核酸分子插入物)优选地设定为与SEQID NO: 2中提供的序列或其互补序列具有至少约70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或最优选地至少99%或99.5%同一性。序列同一性优选地用来自Bioinformatics (University of Wisconsin)的GCG程序计算。其他程序也可用于计算序列同一性，比如Clustal W程序(优选地使用默认参数; Thompson, JD et al., Nucleic Acid Res. 22:4673-4680)；BLAST P、BLAST X算法；The Institute for Genomic Research (http:tigrblast.tigr.org/)的鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium) BLASTN；Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/)的牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG (Pastuer)、海分枝杆菌(M. marinum)、麻风分枝杆菌(M. leprae)、结核分枝杆菌(M. tuberculosis)BLASTN；Institute Pasterur (Tuberculist) (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)的结核分枝杆菌BLAST搜索；Institute Pasterur (Leproma) (http://genolist.pasteur.fr/Leproma/)的麻风分枝杆菌BLAST搜索；明尼苏达大学MicrobialGenome Project (http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/Ptb/和http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/AGAC/Mptb/Mptbhome.html)的副结核分枝杆菌(M.Paratuberculosis) BLASTN；National Center for Biotechnology Information - USA(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的各种BLAST搜索和GenomeNet(Bioinformatics Center - Institute for Chemical Research) (http://blast.genome.ad.jp/)的各种BLAST搜索。
由于遗传密码为简并的，SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4中的核酸序列不是可编码具有PhoP和PhoR活性的多肽的唯一序列。本发明包括具有与SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4描述的核酸分子相同的基本遗传信息的核酸分子。与本申请所述的序列相比较具有一个或多个核酸变化并且导致产生SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3所示的多肽的核酸分子(包括RNA)处于本发明的范围内。
可使用常规DNA-DNA或DNA-RNA杂交技术分离编码PhoP和PhoR蛋白的核酸的其他功能等同形式。
杂交
本发明包括与本申请所述的核酸分子具有足够同一性的序列，以在严格杂交条件下杂交的DNA (杂交技术为本领域熟知的)。本发明还包括与[SEQ ID NO: 2]和SEQ ID NO: 4中的一个或多个序列或其互补序列杂交的核酸分子。这种核酸分子优选地在高严格条件下杂交(参见Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 最新版本, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。高严格洗涤优选地具有低盐(优选地约0.2% SSC)和约50-65℃的温度。
疫苗
本领域的技术人员知道活的重组疫苗的制备。一般地，这种疫苗作为可注射的液体溶液剂或混悬剂制备；也可制备适合于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可被乳化，或将蛋白质包封在脂质体中。活的免疫原性成分经常与药学上可接受并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果期望，疫苗可含有少量辅助物质，比如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗有效性的佐剂。可能有效的佐剂的实例包括(但不限于)：氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其含有在2%角鲨烯/Tween 80™乳液中的从细菌中提取的3种组分，即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
佐剂的有效性可通过测量从给予还包含各种佐剂的活的重组牛分枝杆菌-BCG疫苗产生的针对含有结核分枝杆菌抗原序列的免疫原性多肽的抗体的量来确定。
疫苗常规通过注射(例如皮下或肌内)经胃肠外给予。适用于其他给予方式的另外制剂包括栓剂，并且在一些情况下包括口服制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可由含有0.5%-10%，优选地1%-2%范围内的活性成分的混合物形成。口服制剂包括通常使用的赋形剂，比如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂的形式，并且含有10%-95%，优选地25%-70%的活性成分。
疫苗以与剂量制剂相容的方式和以预防和/或治疗有效的量给予。
疫苗可以单剂量时间表，或优选地以多剂量时间表给予。多剂量时间表为这样的时间表，其中接种疫苗的主要过程可为1-10个单独剂量，接着以维持和/或加强免疫反应所需的后续时间间隔给予的其他剂量，例如以1-4个月给予第二剂量，并且如果需要，几个月之后给予后续剂量。剂量方案还将至少部分地根据个体的需要确定，并且取决于从业者的判断。
另外，活的重组牛分枝杆菌-BCG疫苗连同其他免疫调节剂(例如免疫球蛋白)一起给予。
本发明的主题还为一种多价疫苗配方，其包含作为混合物或待混合的如上定义的活的重组牛分枝杆菌-BCG疫苗与另一种疫苗，并且特别是如上定义的另一种重组活的重组牛分枝杆菌-BCG疫苗，这些疫苗包含不同的插入序列。
药用组合物
本发明的药用组合物可用于治疗或预防哺乳动物免受结核分枝杆菌或牛分枝杆菌的攻击。本发明的药用组合物还用于治疗患有退行性疾病、障碍或异常身体状态比如癌症的患者。
药用组合物可通过方法比如片剂、气雾剂给予、气管内滴注和静脉内注射，给予人或动物。
实施例
实施例1：克隆载体pME
如下获得含有T7启动子的卡那霉素抗性穿梭载体。用EcoRI切割pDrive克隆载体(得自Qiagen)并自连接以产生pDRI。用SspI消化pDRI并分离1903 bp片段产物。用SspI消化pMD31穿梭载体(Wu et al., 1993, Molecular Microbiology, 7, 407-417)并分离3379 bp片段。将两个SspI产生的片段连接以产生pME (5282 bp)，其含有pDRIVE的初始T7启动子。克隆载体pME如图2所示。
实施例2：用于phoP和phoP-phoR的表达载体的构建
使用分别含有KpnI和PstI限制性位点(下划线)的正向引物phoP-F (5'-AAAAAGGTACCGCTTGTTTGGCCATGTCAAC-3')和反向引物phoP-R (5'-AAAAACTGCAGGCTGCCGATCCGATTAACTAC-3')，通过PCR扩增含有phoP以及phoP翻译起始位点的257 bp上游区域的1028 bp产物。使用这些限制性位点，使PCR产物连接于穿梭载体pME (pME-PhoP)。类似地，通过将含有phoP和phoR (以及两个基因之间的基因间区域，phoP起始密码子上游177bp和phoR终止密码子下游78 bp)的2501 bp PCR产物克隆到pME中构建表达phoP-phoR操纵子的载体(pME-PhoPR)。使用分别含有KpnI和PstI位点(下划线)的正向引物phoPR-F (5'-AAAAAGGTACCGGTCGCAATACCCACGAG-3')和反向引物phoPR-R (5'-AAAAACTGCAGCCTCAGTGATTTCGGCTTTG-3')，通过PCR从BCG-Pasteur基因组DNA扩增该产物。构建体通过DNA测序确认。
将构建体以及空载体pME分别电穿孔到BCG-Prague和BCG-Japan中。如下完成重组BCG的产生：通过电穿孔用质粒pME-PhoP或pME-PhoPR转化牛分枝杆菌BCG-Japan (ATCC35737)和牛分枝杆菌BCG-Prague (ATCC 35742)的细胞，并将电穿孔的细胞铺展到补充有10% OADC (Difco)和25 μg/ml卡那霉素的7H11培养基平板上。在37℃下温育4周之后，选择单个菌落并在补充有10% ADC (Difco)和25 μg/ml卡那霉素的7H9液体培养基中生长。在该培养基中培养3周之后，分离来自所选克隆的质粒DNA并通过DNA测序进行确认。随后通过将1 ml培养物与1 ml 50%无菌甘油溶液混合来制备重组BCG菌株的冷冻储液，并在-80℃下储存。
构建的用于phoP和phoP-phoR的表达载体如图3所示。
实施例3：rBCG-Japan/PhoPR比亲本BCG诱导更多的通过CD4+ T细胞的IFN-γ产生
雌性C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories并且在每个实验中年龄匹配(6周)。每组4只小鼠以0.2 ml PBS/0.01% Tween 80中约5×104 CFU的BCG菌株在颈背部上皮下接种。对照小鼠给予0.2 mL PBS/0.01% Tween 80。8周之后，对小鼠实施安乐死，分离脾细胞。使用OptEIA小鼠IFN-γ ELISA套盒(BD Biosciences)，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定IFN-γ产生的定量测量。用于ELISA的样品为来自由PPD (10 μg/ml)刺激72小时的脾细胞的上清液。简言之，将样品一式三份加入到预先包被有捕获抗体的96孔平底板(Nunc MaxiSorp)中，并按照制造商的方案进行测量。在微板阅读器(TECAN infiniteM200)上于450 nm处读取吸光度。基于使用IFN-γ标准产生的标准曲线计算IFN-γ水平。结果如图4a和4b所示。减去来自没有PPD刺激的样品的读数之后，数据显示为平均值±SEM。在图4a中，进行了双尾未配对student t检验；在图4b中，进行单向ANOVA和Bonferroni多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
为了确定由重组BCG菌株诱导的IFN-γ的来源，我们还进行了细胞内细胞因子染色和FACS分析。简言之，将脾细胞一式三份以2×106个细胞/孔接种于100 μl中，并用2.5 μg/孔的纯化蛋白衍生物(PPD) (Statens Serum Institute, Denmark)或作为对照的完全RPMI (cRPMI; RPMI/10% FBS/1% L-谷氨酰胺/1%青霉素/链霉素)刺激，并在37℃和5% CO2下进行温育。刺激19小时之后，以1:1000最终稀释度加入GolgiPlug (BD Biosciences)并且再温育5小时。在刺激总共24小时之后，将板在4℃下以1400 rpm离心5分钟。去除上清液，并将细胞沉淀在200 μl FACS缓冲液(0.5% BSA/PBS)中洗涤，且重悬于在FACS缓冲液中稀释(1:400)的Fc Block (eBiosciences)中，并在黑暗中于冰上温育15分钟。加入另外150 μl FACS缓冲液，混合，并将板在4℃下以1400 rpm离心5分钟。去除上清液，并对细胞外T细胞表面标志物进行细胞染色：在FACS缓冲液中稀释CD3-PE、CD4-FITC和CD8a-PercyPCy5.5(BD Biosciences)，并在黑暗中于冰上温育30分钟。细胞外标志物染色后，用150 μl FACS缓冲液洗涤细胞，并用1X CytoFix/CytoPerm (BD Biosciences)渗透和固定20分钟。然后用1X PermWash (BD Biosciences)洗涤细胞，并与IFN-γ-APC (BD Biosciences)一起温育30分钟以对细胞内IFN-γ进行染色。如上离心细胞，重悬于200 μl FACS缓冲液中，并在BD FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。在淋巴细胞门中收集每个样品总共300000个事件，并使用FlowJo V7.6进行分析。用于分析的门基于同种型对照设定。减去来自没有PPD刺激的样品的读数之后，数据显示为平均值±SEM。结果如图4c所示，并且进行单向ANOVA和Bonferroni多重比较检验以进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实施例4：rBCG-Japan/PhoPR延长感染有M.tb的豚鼠的存活
多组11只雌性Hartely豚鼠(200-250 g)购自Charles River Laboratories，并用在0.2 ml PBS/0.01% Tween80中5×104 CFU的含有pME (rBCG-Japan/pME)、pME-PhoPR(rBCG-Japan/PhoPR)的BCG-Japan或仅PBS/0.01% Tween80作为对照进行皮下接种。在接种后8周，使用GlasCol雾化器通过气雾剂途径用1000 CFU的M.tb H37Rv攻击豚鼠。在人道终点对豚鼠实施安乐死，并使用Kaplan-Meier法绘制存活曲线。结果如图5a所示。进行对数秩检验以比较每对存活曲线。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。
收获在人道终点实施安乐死的豚鼠的肺和脾。将脾和整个右肺分别均质化并铺展在7H11琼脂上以量化各器官中的M.tb负荷。在37℃下温育3周之后计数菌落。结果如图5b和5c所示。测量每组中所有动物的器官重量，并且结果如图5d和5e所示。图5b-5e中的数据显示为平均值±SEM，并且进行单向ANOVA和Bonferroni多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实施例5：rBCG-Japan/PhoPR减少感染有M.tb的豚鼠的肺病理学
选择来自图4所述的实验的6只豚鼠进行组织学分析。这些包括来自每组的1只豚鼠，其分别在第25、27和39周达到人道终点(图6a-6c)。pME (图6b)和PhoPR (图6c)豚鼠代表每组中被实施安乐死的第6只动物(中位数)。pME组的唯一幸存者(图6d)和PhoPR组的一只随机选择的幸存者(图6e)被包括在内。对于每只豚鼠，通过苏木精-伊红染色分析左肺的尾叶和前叶的切片。简言之，将福尔马林固定的组织包埋在石蜡块中。制备连续切片(5 μm厚)并且其经历脱蜡过程，其中3次更换二甲苯(每次3分钟)，之后用4次醇洗涤(100%、100%、95%、70%，每次3分钟)再水化。切片用苏木精和伊红(EMD Chemicals)染色，并使用CytationTM 5(BioTek)检查。
实施例6：rBCG-Japan/PhoPR在SCID小鼠中是安全的
短期细菌负荷测定：雌性Fox Chase CB17 SCID小鼠(Charles River Laboratories)进行年龄匹配(7周龄)。用在0.2 mL的PBS/0.01% Tween80中105 CFU的rBCG-Japan/pME、rBCG-Japan/PhoP或rBCG-Japan/ PhoPR或仅PBS/0.01% Tween80作为对照，经侧尾静脉静脉内感染各组12只小鼠。在感染后第1、3和6周对小鼠(每个时间点n = 4)实施安乐死，并收获肺和脾，在PBS中均质化，且在7H11琼脂上铺展以确定肺(图7a)和脾(图7b)中的细菌负荷。数据显示为平均值±SD。进行双向ANOVA和Bonferroni多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
长期存活测定：来自Charles River Laboratories的多组10只年龄匹配的雌性SCID小鼠(7周龄)用107 CFU的BCG-Pasteur、3种上述重组BCG-Japan菌株或PBS/0.01%Tween80经侧尾静脉进行静脉内感染，如上所述的。在感染后第1天对来自每组的3只小鼠实施安乐死(用于评价感染剂量)，同时每周监测剩余的小鼠直至它们达到人道终点(减轻20%最大体重)。使用Kaplan-Meier方法绘制存活曲线。结果如图7c所示。进行对数秩检验以比较每对存活曲线。*p<0.05，***p<0.001。
参考文献
1. Colditz, G.A., et al. The efficacy of bacillus Calmette-Guerinvaccination of newborns and infants in the prevention of tuberculosis: meta-analyses of the published literature. Pediatrics 96, 29-35 (1995).
2. Trunz, B.B., Fine, P. & Dye, C. Effect of BCG vaccination on childhoodtuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysisand assessment of cost-effectiveness. Lancet 367, 1173-1180 (2006).
3. Brewer, T.F. Preventing tuberculosis with bacillus Calmette-Guerinvaccine: a meta-analysis of the literature. Clin Infect Dis 31 Suppl 3, S64-67 (2000).
4. Colditz, G.A., et al. Efficacy of BCG vaccine in the prevention oftuberculosis. Meta-analysis of the published literature. JAMA 271, 698-702(1994).
5. Fine, P.E. Variation in protection by BCG: implications of and forheterologous immunity. Lancet 346, 1339-1345 (1995).
6. Behr, M.A. BCG--different strains, different vaccines Lancet InfectDis 2, 86-92 (2002).
7. Behr, M.A. & Small, P.M. A historical and molecular phylogeny of BCGstrains. Vaccine 17, 915-922 (1999).
8. Brosch, R., et al. Genome plasticity of BCG and impact on vaccineefficacy. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 5596-5601 (2007).
9. Leung, A.S., et al. Novel genome polymorphisms in BCG vaccine strainsand impact on efficacy. BMC Genomics 9, 413 (2008).
10. Garcia Pelayo, M.C., et al. A comprehensive survey of singlenucleotide polymorphisms (SNPs) across Mycobacterium bovis strains and M.bovis BCG vaccine strains refines the genealogy and defines a minimal set ofSNPs that separate virulent M. bovis strains and M. bovis BCG strains. InfectImmun 77, 2230-2238 (2009).
11. Mahairas, G.G., Sabo, P.J., Hickey, M.J., Singh, D.C. & Stover, C.K.Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG andvirulent M. bovis. J Bacteriol 178, 1274-1282 (1996).
12. Behr, M.A., et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 284, 1520-1523 (1999).
13. Horwitz, M.A., Harth, G., Dillon, B.J. & Maslesa-Galic, S. Commonlyadministered BCG strains including an evolutionarily early strain andevolutionarily late strains of disparate genealogy induce comparableprotective immunity against tuberculosis. Vaccine 27, 441-445 (2009).
14. Ritz, N., Hanekom, W.A., Robins-Browne, R., Britton, W.J. & Curtis,N. Influence of BCG vaccine strain on the immune response and protectionagainst tuberculosis. FEMS Microbiol Rev 32, 821-841 (2008).
15. Skeiky, Y.A. & Sadoff, J.C. Advances in tuberculosis vaccinestrategies. Nat Rev Microbiol 4, 469-476 (2006).
16. Andersen, P. & Kaufmann, S.H. Novel vaccination strategies againsttuberculosis. Cold Spring Harb Perspect Med 4(2014).
17. Tameris, M.D., et al. Safety and efficacy of MVA85A, a newtuberculosis vaccine, in infants previously vaccinated with BCG: arandomised, placebo-controlled phase 2b trial. Lancet (2013).
18. Developing whole mycobacteria cell vaccines for tuberculosis:Workshop proceedings, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin,Germany, July 9, 2014. Vaccine 33, 3047-3055 (2015).
19. Horwitz, M.A., Harth, G., Dillon, B.J. & Maslesa-Galic, S.Recombinant bacillus calmette-guerin (BCG) vaccines expressing theMycobacterium tuberculosis 30-kDa major secretory protein induce greaterprotective immunity against tuberculosis than conventional BCG vaccines in ahighly susceptible animal model. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13853-13858(2000).
20. Horwitz, M.A. & Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affordsgreater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pigmodel of pulmonary tuberculosis. Infect Immun 71, 1672-1679 (2003).
21. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis ofrecombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secretelisteriolysin. J Clin Invest 115, 2472-2479 (2005).
22. Desel, C., et al. Recombinant BCG DeltaureC hly+ induces superiorprotection over parental BCG by stimulating a balanced combination of type 1and type 17 cytokine responses. J Infect Dis 204, 1573-1584 (2011).
23. Williams, A., et al. Evaluation of vaccines in the EU TB VaccineCluster using a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis.Tuberculosis (Edinb) 85, 29-38 (2005).
24. Martin, C., et al. The live Mycobacterium tuberculosis phoP mutantstrain is more attenuated than BCG and confers protective immunity againsttuberculosis in mice and guinea pigs. Vaccine 24, 3408-3419 (2006).
25. Aguilar, D., et al. Immunological responses and protective immunityagainst tuberculosis conferred by vaccination of Balb/C mice with theattenuated Mycobacterium tuberculosis (phoP) SO2 strain. Clin Exp Immunol147, 330-338 (2007).
26. Arbues, A., et al. Construction, characterization and preclinicalevaluation of MTBVAC, the first live-attenuated M. tuberculosis-based vaccineto enter clinical trials. Vaccine 31, 4867-4873 (2013).
27. Ritz, N., et al. The influence of bacille Calmette-Guerin vaccinestrain on the immune response against tuberculosis: a randomized trial. Am JRespir Crit Care Med 185, 213-222 (2012).
28. Vallishayee, R.S., Shashidhara, A.N., Bunch-Christensen, K. & Guld,J. Tuberculin sensitivity and skin lesions in children after vaccination with11 different BCG strains. Bull World Health Organ 51, 489-494 (1974).
29. Ladefoged, A., Bunch-Christensen, K. & Guld, J. Tuberculinsensitivity in guinea-pigs after vaccination with varying doses of BCG of 12different strains. Bull World Health Organ 53, 435-443 (1976).
30. Milstien, J.B. & Gibson, J.J. Quality control of BCG vaccine by WHO:a review of factors that may influence vaccine effectiveness and safety. BullWorld Health Organ 68, 93-108 (1990).
31. Walters, S.B., et al. The Mycobacterium tuberculosis PhoPR two-component system regulates genes essential for virulence and complex lipidbiosynthesis. Mol Microbiol 60, 312-330 (2006).
32. Cooper, A.M. Cell-mediated immune responses in tuberculosis. Annu RevImmunol 27, 393-422 (2009).
33. North, R.J. & Jung, Y.J. Immunity to tuberculosis. Annu Rev Immunol22, 599-623 (2004).
34. Black, G.F., et al. BCG-induced increase in interferon-gamma responseto mycobacterial antigens and efficacy of BCG vaccination in Malawi and theUK: two randomised controlled studies. Lancet 359, 1393-1401 (2002).
35. Comstock, G.W. Identification of an effective vaccine againsttuberculosis. Am Rev Respir Dis 138, 479-480 (1988).
36. Fine, P.E., Sterne, J.A., Ponnighaus, J.M. & Rees, R.J. Delayed-typehypersensitivity, mycobacterial vaccines and protective immunity. Lancet 344,1245-1249 (1994).
37. Castillo-Rodal, A.I., et al. Mycobacterium bovis BCG substrainsconfer different levels of protection against Mycobacterium tuberculosisinfection in a BALB/c model of progressive pulmonary tuberculosis. InfectImmun 74, 1718-1724 (2006).
38. Lalor, M.K., et al. Population differences in immune responses toBacille Calmette-Guerin vaccination in infancy. J Infect Dis 199, 795-800(2009).
39. Gallant, C.J., et al. Tuberculin skin test and in vitro assaysprovide complementary measures of antimycobacterial immunity in children andadolescents. Chest 137, 1071-1077 (2010).
40. Frigui, W., et al. Control of M. tuberculosis ESAT-6 secretion andspecific T cell recognition by PhoP. PLoS Pathog 4, e33 (2008).
41. Zhang, L., et al. Variable Virulence and Efficacy of BCG VaccineStrains in Mice and Correlation With Genome Polymorphisms. Mol Ther 24, 398-405 (2016).
42. Barker, L., Hessel, L. & Walker, B. Rational approach to selectionand clinical development of TB vaccine candidates. Tuberculosis (Edinb) 92Suppl 1, S25-29 (2012).
43. Lamm, D.L. Efficacy and safety of bacille Calmette-Guerinimmunotherapy in superficial bladder cancer. Clin Infect Dis 31 Suppl 3, S86-90 (2000).
44. Prescott, S., Jackson, A.M., Hawkyard, S.J., Alexandroff, A.B. &James, K. Mechanisms of action of intravesical bacille Calmette-Guerin: localimmune mechanisms. Clin Infect Dis 31 Suppl 3, S91-93 (2000)。
Claims (19)
1.一种活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其包含能够过表达的核酸，所述核酸编码PhoP和PhoR蛋白。
2.权利要求1的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述PhoP和PhoR蛋白来自结核分枝杆菌或牛分枝杆菌。
3.权利要求1的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述核酸编码
(i) SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列；或
(ii) 在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失的PhoP蛋白；
(iii) SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列；或
(iv) 在SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失的PhoR蛋白。
4.权利要求1的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述核酸包含
(i) SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列；
(ii) 在严格杂交条件下与(i)的核苷酸序列杂交的序列；
(iii) 与SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的序列；
(iv) SEQ ID NO: 4中所示的核苷酸序列；
(v) 在严格杂交条件下与(iv)的核苷酸序列杂交的序列；
(vi) 与SEQ ID NO: 4中所示的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的序列。
5.权利要求1-4中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述核酸分子已经历过修饰。
6.权利要求1-7中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述牛分枝杆菌-BCG菌株选自现有的BCG菌株，包括但不限于：牛分枝杆菌-BCG-Russia (ATCC编号:35740)、牛分枝杆菌-BCG-Moreau (ATCC编号: 35736)、牛分枝杆菌-BCG-Japan (ATCC编号: 35737)、牛分枝杆菌-BCG-Sweden (ATCC编号: 35732)、牛分枝杆菌-BCG-Birkhaug(ATCC编号: 35731)、牛分枝杆菌-BCG-Prague (ATCC编号: 35742)、牛分枝杆菌-BCG-Glaxo (ATCC编号: 35741)、牛分枝杆菌-BCG-Denmark (ATCC编号: 35733)、牛分枝杆菌-BCG-Tice (ATCC编号: 35743, 27289)、牛分枝杆菌-BCG-Frappier (ATCC: 35746, SM-R;ATCC: 35747, INH-R)、牛分枝杆菌-BCG-Connaught (ATCC: 35745)、牛分枝杆菌-BCG-Phipps (ATCC编号: 35744)、牛分枝杆菌-BCG-Pasteur (ATCC编号: 35734)、BCG-Mexican(ATCC编号: 35738)和牛分枝杆菌-BCG-China (上海生物制品研究所)。
7.一种药用组合物，其包含权利要求1-6中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株。
8.一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌的攻击的疫苗或免疫原性组合物，其包含权利要求1-6中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株。
9.权利要求8的疫苗或免疫原性组合物，其中所述分枝杆菌为结核分枝杆菌或牛分枝杆菌。
10.权利要求7或8的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
11.权利要求7或8的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
12.权利要求8-11中任何一项的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含来自一种或多种其他病原体的免疫原性物质。
13.一种用于治疗或预防哺乳动物免受结核分枝杆菌或牛分枝杆菌的攻击的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物权利要求1-6中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株。
14.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物为牛。
15.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物为人。
16.权利要求13的方法，其中所述活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株在存在佐剂的情况下给予。
17.一种用于治疗或预防哺乳动物免受癌症的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物权利要求1-6中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株。
18.权利要求17的方法，其中所述活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株在存在佐剂的情况下给予。
19.权利要求17或18的方法，其中所述癌症为膀胱癌。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2017/079665 WO2018184188A1 (en) | 2017-04-07 | 2017-04-07 | RECOMBINANT BCG OVEREXPRESSING phoP-phoR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110506108A true CN110506108A (zh) | 2019-11-26 |
| CN110506108B CN110506108B (zh) | 2023-10-24 |
Family
ID=63712906
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780089047.1A Active CN110506108B (zh) | 2017-04-07 | 2017-04-07 | 过表达phoP-phoR的重组BCG |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11717565B2 (zh) |
| JP (1) | JP7035063B2 (zh) |
| CN (1) | CN110506108B (zh) |
| GB (1) | GB2572903B (zh) |
| RU (1) | RU2760580C2 (zh) |
| WO (1) | WO2018184188A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201904705B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110079490A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-08-02 | 石河子大学 | 一种卡介苗PhoPR基因过表达菌株的构建及其用途 |
| CN110408640A (zh) * | 2019-07-02 | 2019-11-05 | 石河子大学 | 一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用 |
| CN111269857A (zh) * | 2020-02-19 | 2020-06-12 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | Rv0253蛋白在分离结核分枝杆菌中的应用 |
| CN114748615A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-15 | 成都安永鼎业生物技术有限公司 | 一种治疗用重组卡介苗的冻干制剂及其制备方法和用途 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102260116B1 (ko) * | 2018-11-19 | 2021-06-04 | 중앙대학교 산학협력단 | 항균 펩타이드 회피 유전자를 포함하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝균의 방광암 항암 치료용 약학적 조성물 |
| CN111518738B (zh) * | 2020-05-08 | 2022-02-08 | 徐州海润生物科技有限公司 | 重组卡介苗及其制备方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2523084A1 (en) * | 2003-04-23 | 2004-11-04 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | Tuberculosis vaccine with improved efficacy |
| WO2006102767A1 (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Mcgill University | Tuberculosis vaccine and method for making same |
| CN102439134A (zh) * | 2010-04-22 | 2012-05-02 | 刘军 | 包含过表达PhoP和/或PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株的结核疫苗 |
| CN104685054A (zh) * | 2012-09-27 | 2015-06-03 | 成都永安制药有限公司 | Lsr2活性降低或敲除的改良BCG菌株及包含该菌株的药物组合物 |
| CN106237317A (zh) * | 2015-06-15 | 2016-12-21 | 复旦大学 | 由结核分枝杆菌抗原组成的结核疫苗 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7195757B2 (en) * | 2002-04-15 | 2007-03-27 | Washington University | Modulation of immune responses to foreign antigens expressed by recombinant attenuated bacterial vectors |
| JP5324420B2 (ja) | 2006-03-24 | 2013-10-23 | ユニバーシダード デ ザラゴザ | 結核ワクチン |
| JP5994127B2 (ja) * | 2011-09-13 | 2016-09-21 | 日本ビーシージー製造株式会社 | 新規な組換えｂｃｇワクチン |
| BR102012021809B1 (pt) * | 2012-08-30 | 2021-09-21 | Universidade Federal De Pelotas | Utilização de mycobacterium bovis bcg auxotrófico superexpressando ag85b como agente terapêutico e/ou imunoterapêutico para câncer de bexiga |
-
2017
- 2017-04-07 CN CN201780089047.1A patent/CN110506108B/zh active Active
- 2017-04-07 GB GB1909993.6A patent/GB2572903B/en active Active
- 2017-04-07 JP JP2019538338A patent/JP7035063B2/ja active Active
- 2017-04-07 WO PCT/CN2017/079665 patent/WO2018184188A1/en active Application Filing
- 2017-04-07 US US16/500,934 patent/US11717565B2/en active Active
- 2017-04-07 RU RU2019130941A patent/RU2760580C2/ru active
-
2019
- 2019-07-17 ZA ZA2019/04705A patent/ZA201904705B/en unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2523084A1 (en) * | 2003-04-23 | 2004-11-04 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | Tuberculosis vaccine with improved efficacy |
| WO2006102767A1 (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Mcgill University | Tuberculosis vaccine and method for making same |
| CN102439134A (zh) * | 2010-04-22 | 2012-05-02 | 刘军 | 包含过表达PhoP和/或PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株的结核疫苗 |
| CN104685054A (zh) * | 2012-09-27 | 2015-06-03 | 成都永安制药有限公司 | Lsr2活性降低或敲除的改良BCG菌株及包含该菌株的药物组合物 |
| CN106237317A (zh) * | 2015-06-15 | 2016-12-21 | 复旦大学 | 由结核分枝杆菌抗原组成的结核疫苗 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ESTHER BROSET等: "Evolutionary Landscape of the Mycobacterium tuberculosis Complexfrom the Viewpoint of PhoPR: Implications for Virulence Regulationand Application to Vaccine Development", 《MBIO》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110079490A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-08-02 | 石河子大学 | 一种卡介苗PhoPR基因过表达菌株的构建及其用途 |
| CN110408640A (zh) * | 2019-07-02 | 2019-11-05 | 石河子大学 | 一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用 |
| CN111269857A (zh) * | 2020-02-19 | 2020-06-12 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | Rv0253蛋白在分离结核分枝杆菌中的应用 |
| CN114748615A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-15 | 成都安永鼎业生物技术有限公司 | 一种治疗用重组卡介苗的冻干制剂及其制备方法和用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7035063B2 (ja) | 2022-03-14 |
| US20200254080A1 (en) | 2020-08-13 |
| GB201909993D0 (en) | 2019-08-28 |
| RU2760580C2 (ru) | 2021-11-29 |
| CN110506108B (zh) | 2023-10-24 |
| ZA201904705B (en) | 2022-02-23 |
| JP2020508640A (ja) | 2020-03-26 |
| US11717565B2 (en) | 2023-08-08 |
| RU2019130941A3 (zh) | 2021-05-07 |
| RU2019130941A (ru) | 2021-05-07 |
| GB2572903B (en) | 2022-10-12 |
| WO2018184188A1 (en) | 2018-10-11 |
| GB2572903A (en) | 2019-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110506108A (zh) | 过表达phoP-phoR的重组BCG | |
| Titball et al. | Yersinia pestis (plague) vaccines | |
| KR101329323B1 (ko) | 엔도솜을 이탈하는 능력이 보강된 재조합 비씨지 균주 | |
| Jia et al. | A Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) mutant with a deletion in capB, encoding a putative capsular biosynthesis protein, is significantly more attenuated than LVS yet induces potent protective immunity in mice against F. tularensis challenge | |
| Delogu et al. | The quest for a new vaccine against tuberculosis | |
| Sander et al. | Deletion of zmp1 improves Mycobacterium bovis BCG-mediated protection in a guinea pig model of tuberculosis | |
| Cardona et al. | Extended safety studies of the attenuated live tuberculosis vaccine SO2 based on phoP mutant | |
| Yang et al. | Vaccination with a ΔnorD ΔznuA Brucella abortus mutant confers potent protection against virulent challenge | |
| CN102439134B (zh) | 包含过表达PhoP和/或PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株的结核疫苗 | |
| Dorneles et al. | Protection against leptospirosis conferred by Mycobacterium bovis BCG expressing antigens from Leptospira interrogans | |
| Nadolinskaia et al. | Vaccines against tuberculosis: Problems and prospects | |
| Fan et al. | DNA vaccine encoding ESAT‐6 enhances the protective efficacy of BCG against Mycobacterium tuberculosis infection in mice | |
| Yin et al. | Protective immunity induced by a LLO‐deficient Listeria monocytogenes | |
| KR101066951B1 (ko) | 재조합 세포내 병원체 면역원성 조성물 및 사용 방법 | |
| AU2009207480B2 (en) | Vaccines | |
| CA2647287A1 (en) | Mycobacterium tuberculosis complex with inactivated phop and without dim production for tuberculosis vaccine | |
| AU2019221709B2 (en) | Compositions for use as a prophylactic agent to those at risk of infection of tuberculosis, or as secondary agents for treating infected tuberculosis patients | |
| Liu et al. | Heterologous boosting with Listeria-based recombinant strains in BCG-primed mice improved protection against pulmonary mycobacterial infection | |
| JP5994127B2 (ja) | 新規な組換えｂｃｇワクチン | |
| Redden et al. | Q fever–immune responses and novel vaccine strategies | |
| AU2011343008A1 (en) | Vaccine | |
| Warner | DNA metabolism in mycobacteria | |
| Zhang | Vaccine-induced-immunity-mediated Competition Between Endemic Bordetellae and Host Immunity Against Them | |
| MX2007006551A (en) | Recombinant bcg strains with enhanced ability to escape the endosome |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230925 Address after: No. 97, Feihu Road, Heshan street, Pujiang County, Chengdu City, Sichuan Province Applicant after: Chengdu anyong Dingye Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No. 7, Upper Section of Industrial Avenue, Heshan Town, Pujiang County, Chengdu City, Sichuan Province, 611630 Applicant before: CHENGDU YONGAN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Applicant before: Liu Jun |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |