CN102439134B - 包含过表达PhoP和/或PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株的结核疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含能过表达核酸的重组牛分枝杆菌BCG活菌株和结核(TB)疫苗或免疫原性组合物，所述核酸编码PhoP蛋白和/或一种或多种phoP调节子蛋白。本发明还提供用所述菌株为哺乳动物治疗或预防结核杆菌或牛分枝杆菌攻击的方法。

Description

包含过表达PhoP和/或PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株的结核疫苗

发明领域

本发明涉及结核(tuberculosis，TB)疫苗。具体而言，本发明提供了重组BCG(卡介苗)菌株，所述菌株以足以引起phoP调节子被诱导的水平过表达转录因子PhoP。

发明背景

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)引起的，一直是全球性健康紧急事件。世界卫生组织(WHO)的最新监测数据显示，2006年有920万新病例和170万人死于结核病。结核预防、病例检测和治疗的挑战与结核杆菌的易于传播形成鲜明对比。结核病控制的其它威胁包括多抗药性结核病(MDR-TB)的蔓延、广谱耐药性结核病(XDR-TB)的出现和结核病/艾滋病毒(HIV)合并感染的破坏性影响。由于这些情况，迫切需要替代抗生素的有效方法来控制结核病。根据全球结核病控制计划(theGlobalPlantoStopTB)(2006-2015年)，引入新的有效的结核病疫苗将是到2050年消除结核病的任何策略的基本组成部分。

卡介苗(BacilleCalmette-Guérin，BCG)是牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)减毒菌株，其为目前唯一可用于预防结核病的疫苗。自1974年以来，BCG接种已被列入WHO扩大免疫计划[1]。据估计，已有超过30亿人接种了BCG，每年BCG的接种量超过1亿剂，使它成为人类使用最广泛的疫苗[1]。在动物感染模型中，已证明接种BCG诱导抵抗结核分枝杆菌攻击的保护性免疫[2]。在人类中，已经证明接种BCG一致保护人类抵抗包括结核性脑膜炎和粟粒性结核在内的儿童结核病形式[3]。然而，由于其保护成年人肺结核疗效的不一致性，BCG接种是有争议的[4-6]。20世纪40年代和50年代在发达国家如英国、丹麦和北美进行的试验表明，该疫苗是高效(70-80％)的。然而，20世纪70年代发生在印度的一次最大的临床试验中，有超过265,000人参与，BCG接种未能提供抗结核病的可检测的保护。几种关于BCG保护功效变化的解释已经被提出[7]，所述解释包括在临床研究中使用的疫苗菌株的差异、试验人群暴露于环境分枝杆菌、人群的营养或遗传差异、试验方法的差异、以及临床结核分枝杆菌菌株的变化[5，8-11]。这些解释不是相互排斥的，都有可能导致疫苗功效的异质性。

这一问题的关键方面涉及BCG的免疫原性。目前，许多BCG菌株用作商业疫苗。它们都是1909年至1921年期间由Calmette和Guérin经过230次传代的原始牛分枝杆菌分离菌株的后代。后来世界各地不同实验室条件下的体外传代一直延续到20世纪60年代，当时建立了冷冻种子批次。据认为，因为过多的体外传代(某些菌株超过1600次)，目前的BCG菌株可能被过度弱化而不具有足以提供有效保护的免疫原性[12]。

目前很清楚，BCG不是理想的疫苗，只能在有限的时期提供保护。开发新型有效的结核疫苗的目的是提供长期保护[13，14]。现有的BCG疫苗在儿童中赋予抗结核病表现的保护作用，但其效力在10至15年期间减弱了，推测是因为BCG诱导的免疫保护逐渐丧失[13]。目前，科学界一致认为，新一代结核疫苗使用异源初免-加强策略来加强BCG诱导的免疫应答，效果将最佳[15]。这种“初免-加强”策略将包括在婴儿、幼儿暴露于结核之前给予其新的重组BCG(rBCG)作为“初免”，接着用不同的疫苗(蛋白/肽或DNA)进行“加强”接种，或作为年轻成年人的单独加强免疫，或作为化疗的辅助治疗[15]。

第一个重组BCG实例是rBCG30，这是过表达(约5倍)Ag85B的重组BCG-Tice菌株[16]，Ag85B是分泌蛋白，属于包含Ag85A、Ag85B和Ag85C的分枝菌酰基(mycolyl)转移酶家族。第二个重组BCG实例是rBCG::ΔureC-llo⁺，其为BCG-巴斯德(BCG-Pasteur)脲酶缺陷型菌株，表达单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的李斯特菌溶胞素O(listeriolysinO)[17]。使脲酶缺失是为李斯特菌溶胞素功能提供最适pH的手段，李斯特菌溶胞素损害吞噬体膜，使BCG渗漏入细胞质，增加将可获得的抗原提呈给CD8⁺T细胞的量。其他人业已尝试通过弱化结核杆菌制备新的活疫苗，理由是这将最近似地模拟结核分枝杆菌感染后的自然免疫。实例包括结核分枝杆菌的phoP突变体[18]和非复制型结核分枝杆菌突变菌株(ΔlysAΔpanCD)，后者为赖氨酸和泛酸营养缺陷型[19]。

抗结核保护需要细胞介导的免疫应答，这一过程还不完全清楚，但涉及到多种组分，包括CD4⁺和CD8⁺T细胞、非传统的T细胞如γδT细胞和CD1限制的αβT细胞[20，21]。已证明γ-干扰素(IFN-γ)在控制小鼠和人类结核中发挥至关重要的作用[22-25]。因而，主要由CD4⁺T细胞产生的抗原特异性IFN-γ已广泛用作保护性免疫和疫苗效力的度量[26]。鉴定诱导强IFN-γ产生的结核分枝杆菌抗原，一直是用于发现亚单位疫苗的主要策略。这通过结核分枝杆菌蛋白混合物(特别是培养物滤液蛋白)的生化分级分离来实现[27-30]。利用这种方法鉴定了几种抗原，包括分泌性小蛋白ESAT-6(EsxA)、ESAT-6样蛋白TB9.8(EsxG)和Mtb9.9A(EsxN)、CFP-10(EsxB)、抗原85复合物(Ag85A、B、C)以及几个PE/PPE家族蛋白(如PPE18、PPE14)[31-36]。基于这些研究，构建了三种融合蛋白Ag85B-ESAT-6、Ag85B-TB10.4(EsxH)和Mtb72f(PPE18-Rv0125)，它们是目前最先进的基于蛋白质的亚单位疫苗[36-39]。

亦已开发了基于DNA的亚单位疫苗，其使用复制缺陷型病毒载体例如腺病毒或痘苗病毒来递送以刺激更多的CD8识别所表达抗原。实例包括：MAV-85A，这是表达Ag85A的痘苗病毒[40]；和Aeras-402，这是表达Ag85A、Ag85B和EsxH的腺病毒-35[41]。

发明概述

本发明提供结核疫苗，所述结核疫苗包含过表达转录调控蛋白PhoP从而诱导PhoP调节子表达的重组结核分枝杆菌菌株。本发明还包括过表达PhoP调节子中的一个或多个基因的重组BCG菌株。目前BCG菌株的免疫原性不足以诱导宿主产生抗结核病的最佳保护。然而，过表达PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白的通过基因工程构建的BCG菌株具有更好的免疫原性，并将提供更好的保护。在本发明实施中可有利地使用过表达PhoP的任何通过基因工程构建的结核分枝杆菌，所述过表达以足以引起2倍(或更多)phoP调节子基因或蛋白质诱导作用的水平进行。当将本发明的重组结核分枝杆菌给予哺乳动物宿主时，引发针对所诱导的phoP调节子基因编码的蛋白质的免疫应答，这将为哺乳动物宿主提供抗结核病的保护。

BCG疫苗的效价传统上是通过测量结核菌素(tuberculin)敏感性(迟发型超敏反应，DTH或PPD反应)来测定，这种反应由所述疫苗在接种前呈结核菌素阴性的儿童中诱导产生[42]。如果所检测的疫苗诱导的结核菌素敏感性低于其它菌株诱导的，则认为该疫苗弱。还可通过进行皮内接种部位的皮肤损伤或疤痕测定。传统认为结核菌素反应是效力的替代标志，并在BCG历史中发挥了重要作用，所述作用包括为国家免疫计划选择BCG菌株。结核菌素反应一直用作细胞介导免疫应答的体内测定，并用作免疫原性的标志[16，43]。在英国发现在BCG接种婴儿中结核菌素反应和PPD特异性IFN-γ水平之间有强烈的关联性[44]，在结核流行地区的另一最新研究发现，在未成年人中结核菌素反应和IFN-γ释放(水平和频率)二者是抗分枝杆菌免疫的互补测量，并非多余的测量[45]，这些支持上述说法。BCG菌株诱导结核菌素反应的能力差异已经在豚鼠和儿童中被证明[46，47]。在所检测的12株BCG菌株中，与其它BCG菌株比较，BCG-布拉格(BCG-Prague)始终展示出最低的结核菌素反应。因此，捷克斯洛伐克在1951年至1980年间使用的BCG-布拉格，于1981年被BCG-俄罗斯(BCG-Russia)取代。造成BCG-布拉格结核菌素反应低下的分子因素一直不清楚。但是，本人实验室最近的工作发现，BCG-布拉格由于其phoP基因的基因突变而导致无功能的PhoP蛋白[48]。BCG-布拉格phoP基因内部的移码突变，消除了C-末端DNA结合域的大部分，这使BCG-布拉格成为天然phoP突变体(图1)。PhoP是PhoP-PhoR双组分调节系统的应答调节蛋白，对结核分枝杆菌毒力很重要[49-51]。本人推测BCG-布拉格结核菌素的极低转化可通过phoP突变明确解释。在结核分枝杆菌phoP缺失突变菌株中，超过40个基因(定义为phoP调节子)被抑制[49，51，52]，其中一些是免疫原性蛋白。这些蛋白质很可能有助于结核菌素反应。在BCG-布拉格中，由于菌株的phoP突变，这些免疫原性蛋白不能在BCG-布拉格中正常表达，从而消除了诱导结核菌素反应的能力。两者合起来，本人推测PhoP的功能直接负责BCG的结核菌素反应。因而，过表达phoP的重组BCG菌株将引起phoP调节子的过表达，并增强结核菌素反应，这也将引起宿主更好的抗结核分枝杆菌的保护。目前这个推测已经由实验证据证实(见表1和图4)。另外，PhoP正向调控超过40个基因(phoP调节子)。过表达一个或多个PhoP调节子基因的重组BCG菌株将产生更强的免疫原性。所述BCG菌株将具有更好的抗结核分枝杆菌的保护效力。

本发明所使用的PhoP可以是天然存在的功能性PhoP，所述功能性PhoP例如来自分枝杆菌属(Mycobacterium)，优选来自结核分枝杆菌或牛分枝杆菌，或其同源物。图2A呈现了PhoP的例示性氨基酸序列SEQIDNO：1，图2B呈现了编码这一氨基酸序列的例示性核苷酸序列SEQIDNO：2。这些序列代表来自结核分枝杆菌H37RvphoP基因的PhoP，其如在巴斯德研究所的TubercuList网站(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/index.html)可获得的基因组序列中所呈现。

本发明涉及重组牛分枝杆菌BCG，其过表达编码SEQIDNO：1中所示PhoP的DNA。优选所述DNA包含SEQIDNO：2中的核苷酸序列或由其组成。

本发明涉及包含能过表达核酸的重组牛分枝杆菌BCG，所述核酸编码SEQIDNO：1中所示PhoP。优选所述核酸包含SEQIDNO：2中的核苷酸序列。

本发明还涉及包含能过表达核酸的重组牛分枝杆菌BCG活菌株，所述核酸编码至少一种选自由以下组成的组(PhoP调节子)的蛋白质或多肽：Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rv1057、Rv1180、Rv1182、Rv1183、Rv1184c、Rv1185c、Rv1195、Rv1196、Rv1361c、Rv1639c、Rv1931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c和Rv3825c。其蛋白质序列可在巴斯德研究所的TubercuList网站(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/index.html)上获得。

优选核酸包含选自以下的至少一种核酸分子的全部或部分：Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rv1057、Rv1180、Rv1182、Rv1183、Rv1184c、Rv1185c、Rv1195、Rv1196、Rv1361c、Rv1639c、Rv1931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c和Rv3825c。其核苷酸序列可在巴斯德研究所的TubercuList网站(http://genolist.pasteur.ft/TubercuList/index.html)上获得。

在一个实施方案中，重组牛分枝杆菌BCG活菌株选自现有的BCG菌株。本领域技术人员将认识到，存在几种适用于本发明实施的适宜的BCG，所述BCG包括但不限于：牛分枝杆菌BCG-俄罗斯(ATCC编号：35740)、牛分枝杆菌BCG-Moreau(ATCC编号：35736)、牛分枝杆菌BCG-日本(BCG-Japan，ATCC编号：35737)、牛分枝杆菌BCG-瑞典(BCG-Sweden，ATCC编号：35732)、牛分枝杆菌BCG-比克海于格(BCG-Birkhaug，ATCC编号：35731)、牛分枝杆菌BCG-布拉格(ATCC编号：35742)、牛分枝杆菌BCG-葛兰素(BCG-Glaxo，ATCC编号：35741)、牛分枝杆菌BCG-丹麦(BCG-Denmark，ATCC编号：35733)、牛分枝杆菌BCG-Tice(ATCC编号：35743、27289)、牛分枝杆菌BCG-Frappier(ATCC：35746，SM-R；ATCC：35747、INH-R)、牛分枝杆菌BCG-Connaught(ATCC：35745)、牛分枝杆菌BCG-Phipps(ATCC编号：35744)、牛分枝杆菌BCG-巴斯德(ATCC编号：35734)、BCG-墨西哥(BCG-Mexican，ATCC编号：35738)和牛分枝杆菌BCG-中国(上海生物制品研究所)。

另外，本发明的重组结核分枝杆菌不必限于BCG菌株。本领域技术人员会认识到，也可使用包括结核分枝杆菌减毒菌株在内的其它分枝杆菌菌株。

在再一实施方案中，本发明疫苗可为亚单位疫苗或DNA疫苗。在某些实施方案中，疫苗经由肺病原体递送。例如，可在肺病原体的染色体或染色体外核酸中荷有编码PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白的DNA序列，所述肺病原体例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)减毒菌株，或其它已知的减毒真菌或病毒。作为选择，可通过本领域技术人员已知的其它方法递送编码PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白的核酸，所述方法例如经由脂质体、腺病毒载体等。

本发明另一方面是包含重组牛分枝杆菌BCG活菌株的药物组合物，所述菌株包含能过表达的核酸，所述核酸编码功能性PhoP，例如SEQIDNO：1所示的PhoP。该核酸例如在SEQIDNO：2中显示。

本发明还涉及包含能过表达核酸的重组牛分枝杆菌BCG活菌株，所述核酸编码选自以下的至少一种蛋白质或多肽：Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rv1057、Rv1180、Rv1182、Rv1183、Rv1184c、Rv1185c、Rv1195、Rv1196、Rv1361c、Rv1639c、Rv1931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c和Rv3825c。

本发明的再一方面是包含重组牛分枝杆菌BCG活菌株的药物组合物，所述菌株包含能过表达的核酸，所述核酸包含选自以下的至少一种核酸分子的全部或部分：Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rv1057、Rv1180、Rv1182、Rv1183、Rv1184c、Rv1185c、Rv1195、Rv1196、Rv1361c、Rv1639c、Rv1931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c和Rv3825c。

在再一实施方案中，本发明疫苗可为亚单位疫苗或DNA疫苗。在某些实施方案中，疫苗将经由肺病原体递送。例如，可在肺病原体的染色体或染色体外核酸中荷有编码PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白的DNA序列，所述肺病原体例如铜绿假单胞菌减毒菌株，或其它已知的减毒真菌或病毒。作为选择，可通过本领域技术人员已知的其它方法递送编码PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白的核酸，所述方法例如经由脂质体、腺病毒载体等。

本发明的另一方面是用于哺乳动物治疗或预防分枝杆菌攻击的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或组合物包含重组牛分枝杆菌BCG活菌株，所述菌株包含能过表达的核酸，所述核酸编码PhoP，例如在SEQIDNO：1中所示的PhoP。优选所述核酸包含SEQIDNO：2中所示的核苷酸序列或由其组成。

本发明另一方面为用于哺乳动物治疗或预防分枝杆菌攻击的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或组合物包含重组牛分枝杆菌BCG活菌株，所述菌株包含能过表达的核酸，所述核酸编码选自以下的至少一种蛋白质或多肽：Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rv1057、Rv1180、Rv1182、Rv1183、Rv1184c、Rv1185c、Rv1195、Rv1196、Rv1361c、Rv1639c、Rv1931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c和Rv3825c。

本发明再一方面为用于哺乳动物治疗或预防分枝杆菌攻击的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或组合物包含重组牛分枝杆菌BCG活菌株，所述菌株包含能过表达的核酸，所述核酸包含选自以下的至少一种核酸分子的全部或部分：Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rv1057、Rv1180、Rv1182、Rv1183、Rv1184c、Rv1185c、Rv1195、Rv1196、Rv1361c、Rv1639c、Rv1931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c和Rv3825c。

在优选实施方案中，疫苗或免疫原性组合物用于哺乳动物治疗或预防结核分枝杆菌的攻击。在另一优选实施方案中，本发明疫苗或免疫原性组合物另外包含药物上可接受的载体。在又一优选实施方案中，疫苗或免疫原性组合物进一步包含佐剂。在另一实施方案中，疫苗或免疫原性组合物进一步包含来自一个或多个其它病原体的免疫原性物质。

本发明另一方面涉及用于哺乳动物治疗或预防结核分枝杆菌或牛结核杆菌攻击的方法，所述方法包括给予哺乳动物本发明的疫苗或免疫原性组合物。在一个实施方案中，哺乳动物为牛。在另一个实施方案中，哺乳动物为人。在又一实施例中，疫苗或免疫原性组合物在佐剂存在下给予。

本发明另一方面为用于治疗或预防哺乳动物癌症的方法，所述方法包括给予哺乳动物本发明的疫苗或免疫原性组合物。在一个实施方案中，癌症为膀胱癌。在另一个实施方案中，疫苗或免疫原性组合物在佐剂存在下给予。

本发明另一方面为本发明疫苗或免疫原性组合物在用于治疗或预防哺乳动物抗癌的药物中的用途。在一个实施方案中，癌症是膀胱癌。

附图简述

图1.显示BCG-布拉格的phoP基因内部的单核苷酸(G)插入的DNA测序色谱图。这一突变已通过重复PCR扩增和DNA测序证实。

图2.A.结核分枝杆菌H37Rv的PhoP氨基酸序列；B.结核分枝杆菌H37Rv的phoPDNA序列。

图3.pME穿梭载体的构建。

图4.phoP克隆到穿梭载体pME中。用分别含有KpnI和PstI限制性酶切位点(下划线部分)的正向引物(5’-AAAAAGGTACCGCTTGTTTGGCCATGTCAAC-3’)和反向引物(5’-AAAAACTGCAGGCTGCCGATCCGATTAACTAC-3’)从结核分枝杆菌基因组DNA扩增1028个碱基对的产物。利用这些限制性酶切位点，用KpnI和PstI位点将该PCR产物克隆到穿梭载体pME中，以产生pME:phoP。克隆的区域含有phoP起始位点上游的257个碱基对。

图5.BCG中phoP的过表达增强免疫原性。过表达phoP的BCG菌株实例(BCG-日本和BCG-布拉格)与对照BCG相比提高了免疫原性。分别用5×10⁵CFU的标明的重组BCG(BCG-日本/pME:phoP、BCG-布拉格/pME:phoP)、相应的对照BCG(BCG-日本/pME、BCG-布拉格/pME)或PBS(首次接受试验的小鼠)，来免疫C57BL/6小鼠(每组4只)。接种八周后，将小鼠处死，制备脾细胞。(A)IFN-γ产生的ELISA分析。脾细胞在进行ELISA分析之前，使用或不使用PPD((10μg/ml))孵育72小时。结果来自每组4只小鼠，并且扣除了无抗原刺激的同样样品的读数(平均值±标准差)。(B)CD4⁺T细胞细胞因子应答的细胞内细胞因子染色分析。使用或不使用PPD将脾细胞孵育24小时，随后进行表面标记(CD3-太平洋蓝、CD4-PE-Cy-7)和细胞内细胞因子(分别为IFN-γ-PE、TNF-PE、IL-2-PE)染色。用FACSCalibur分析样品。测定了CD4⁺T细胞产生细胞因子的频率，计算并提交了每一脾的细胞总数。图5表明，过表达phpP的BCG菌株所诱导的免疫应答提高。

发明详述

本发明提供了疫苗或免疫刺激组合物，所述疫苗或组合物包括一种或多种基因工程分枝杆菌，所述基因工程分枝杆菌过表达PhoP这种转录调节蛋白(转录因子)和/或一种或多种phoP调节子蛋白。

BCG是牛分枝杆菌(M.bovis)减毒活菌株。人们早就知道，给予死BCG菌株引起微弱而短暂的免疫应答。然而，人们认识到当前BCG活菌株的免疫原性也并非最佳，这解释了当前的BCG菌株为何不能提供有效的保护。目前已尝试各种策略来提高BCG的免疫原性，例如通过过表达抗原85(85A或85B)，或通过在BCG中表达李斯特菌溶胞素，以允许BCG逃进受感染巨噬细胞的细胞质，以便更好地进行抗原提呈[15]。这两种重组BCG菌株都已经进入临床试验或接受临床前研究用于开发为新的结核疫苗[15]。

然而，结核分枝杆菌含有的基因超过4,000个，其中许多为免疫原性蛋白。很显然，对于有待在BCG中表达以提高其免疫原性的抗原的选择工作远远没有完成，为此目的的抗原选择往往缺乏一个明确的原理。因此，科学界的研究人员继续寻找可在BCG中过表达的新抗原或重要基因。例如，为此目的，目前正在开发参与潜伏(‘DosR调节子’)和再激活/复苏的抗原[53]。

结核菌素反应继续作为一种方便有效的方法用于评估候选疫苗的免疫原性[16，43]。支持结核菌素反应性和保护效力之间呈正相关的证据包括对BCG-Tice的研究。Horwitz及同事已经将BCG-Tice作为宿主菌用于过表达抗原85B。这样产生了命名为rBCG30的重组菌株，该菌株表现出优于BCG-Tice的保护效果，目前正作为候选疫苗在人临床试验中进行评估[16，28，54，55]。rBCG30Tice菌株比基于BCG-Connaught的rBCG30菌株对结核分枝杆菌攻击显示出更为显著强烈的免疫应答和更好的保护。在最近的包括BCG-巴斯德、BCG-Frappier、BCG-Moreau、BCG-丹麦、BCG-瑞典、BCG-Connaught、BCG-比克海于格、BCG-Phipps和BCG-墨西哥在内的BCG菌株比较研究中，BCG-Tice显示出最强的诱导小鼠结核菌素反应的能力[56]，这解释了其优于BCG-Connaught的效果。

本发明基于我们最近的发现(BCG-布拉格含有遭破坏的phoP)以及本人所发现的BCG-布拉格phoP突变体与其诱导结核菌素反应能力下降之间的关联。历史上已充分认识到，BCG菌株诱导儿童结核菌素反应的能力是变化的。但是，隐含的分子机制尚不清楚。本人实验室最近的研究发现，一种BCG菌株即BCG-布拉格为天然phoP突变体[48](图1)。PhoP是结核分枝杆菌的重要毒力因子，它正向调控超过40个基因的表达[49，51，57]。因此，phoP突变是造成BCG-布拉格进一步弱化的原因。然而，本人推测phoP突变也是造成BCG-布拉格另一个重要临床特性的原因，该特性就是诱导结核菌素反应的能力极低。以往的研究表明，在检测的所有BCG菌株中，BCG-布拉格在动物模型和儿童中表现出最低的诱导结核菌素反应的能力[46，47]。其结核菌素反应极低的原因尚不清楚。本人首次提出phoP突变是造成BCG-布拉格结核菌素反应性低的原因，且PhoP功能直接负责BCG的结核菌素反应性或免疫原性。因此，在BCG菌株中过表达PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白，将增强其作为疫苗的免疫原性并提高保护效力。这些新理念是有意义的，因为迄今为止PhoP只被认为是一种毒力因子，因此，结核分枝杆菌phoP缺失突变体被认为是一种新的候选疫苗[50]。这是首次将在BCG菌株中过表达PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白作为新的疫苗策略来考虑。过表达PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株将诱导更强的免疫应答，并将提供更有效的疫苗以预防结核病。这一推测得到了我们的实验数据的证实。微阵列分析表明，BCG-布拉格/pME:phoP的45个基因被上调了(≥2倍)，这些基因包括属于PhoP调节子的7个基因(表1)。低程度的重叠可能是由于这些研究中不同的PhoP水平所致；以往的研究比较了结核分枝杆菌phoP突变体与野生型菌株，而我们的试验比较了BCG-布拉格(phoP突变体)和过表达phoP的BCG-布拉格。与本专利申请相关的一个重要发现是：BCG中phoP的过表达，不仅增加了Ag85A和PPE18的表达，还增加了10种ESAT-6/CFP-10样蛋白(EsxI、J、K、L、M、N、O、P、V、W)和7种其它PE/PPE蛋白的表达(表1)，其中许多是已知的有效T细胞抗原，其中的几个已开发为亚单位疫苗的组分(如Ag85A、PPE18、EsxN)[35，38，40，41]。这些结果支持本人的推测，即BCG中phoP的过表达提高了多种有效T细胞抗原的表达。我们的结论进一步得到了直接证据的支持，即在BCG菌株如BCG-日本中过表达phoP，诱导提高的CD4⁺T细胞应答；与对照BCG(BCG-日本)比较，无论是PPD诱导的IFN-γ产生的量级(ELISA测定)，还是PPD特异性的产生IFN-γ的CD4⁺T细胞的数量(通过细胞内细胞因子染色和流式细胞仪测定)，都显著增加(2倍，P＜0.001)(图5)。由于IFN-γ在控制结核病中发挥关键作用[22-25]，并一直是最常用的筛选结核疫苗的生物标志[26]，因此这一结果表明，过表达PhoP的重组BCG菌株比目前的BCG菌株具有更好的保护效力。观察到过表达phoP的BCG-布拉格有类似的结果(图5)。这些结果支持本人的推测，即BCG-布拉格的phoP突变是造成其免疫原性低的原因，因为在BCG-布拉格中phoP过表达使其水平恢复到BCG-日本的水平。BCG-日本中更多抗原蛋白的存在可以解释由BCG-日本/pME:phoP诱导的应答水平高于BCG-布拉格/pME:phoP水平的原因，即BCG-日本是比“晚期”菌株如BCG-布拉格含有更少基因组缺失的“早期”BCG菌株[58，59]。这些结果进一步支持了本人发明的关键理念，即在BCG菌株或其它分枝杆菌株中phoP的过表达将增强免疫原性。

牛分枝杆菌BCG还用于膀胱癌的治疗。许多临床随机对照试验表明，BCG膀胱内给药可以预防或延缓肿瘤复发[60]。BCG如何发挥这种作用的详细情况仍有待确定。然而，抗肿瘤应答需要完整的T细胞应答，并涉及提高包括TNF-α和IL-6在内的Th1型细胞因子的表达[61]。因此，证明免疫原性提高的BCG菌株可提供提高的抗肿瘤活性。

总之，我们用过表达PhoP和/或一种或多种PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株作为疫苗，预防结核和其它分枝杆菌感染。这些重组BCG菌株将诱导更好的针对结核的免疫保护。

在本发明基因工程(即重组)分枝杆菌中，PhoP蛋白被过表达，即该蛋白表达水平超过了合适的对照生物体的表达水平，所述对照生物体例如未进行基因工程改造以过表达PhoP的同样的分枝杆菌。本领域的技术人员非常熟悉蛋白质活性的比较测量法，及用于所述测量的适当标准和对照。

可通过本领域技术已知的任何合适方法实施分枝杆菌的PhoP或PhoP调节子蛋白的过表达。通常所述方法应包括将编码PhoP或PhoP调节子蛋白的核酸序列连接到表达调控序列，该调控序列在自然界不与phoP基因或PhoP调节子基因连接。本领域的技术人员会认识到，许多这样的表达调控序列是已知的，并适合用于本发明。例如，如果需要phoP或PhoP调节子基因的组成型表达，那么表达调控序列(例如启动子及相关序列)包括但不限于：分枝杆菌最适启动子(optimalpromoter)：hsp65、ace或msp12启动子、T7启动子等等。作为选择，phoP过表达可为诱导型的，例如在四环素诱导型启动子控制下的诱导型。

根据本发明编码的蛋白质、多肽或肽包括天然存在的蛋白质、多肽或肽，或具有与天然存在的蛋白质、多肽或肽相同功能的其同源物。所述同源物包括与天然存在的蛋白质、多肽或肽(例如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列)具有以下同源性的的蛋白质、多肽或肽：至少60％，优选约70％或更多、80％或更多，最优选90％或更多，例如95％、96％、97％、98或99％。所述同源物包括在天然存在的蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列中(例如在SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中)，含一个或多个(例如1-50、1-20、1-10、1-5)氨基酸残基的取代、添加或缺失的蛋白质、多肽或肽。所述同源物尤其包括具有一个或多个保守氨基酸取代的蛋白质、多肽或肽。

本文所用术语“PhoP”或“PhoP蛋白”，指双组分调节系统PhoP-PhoR中的应答调节蛋白PhoP，其亦为转录因子。根据本发明编码的PhoP包括天然存在的功能性的PhoP，例如来自分枝杆菌属，优选来自结核分枝杆菌或牛分枝杆菌的功能性PhoP，或如上所述的其同源物。PhoP的例示性氨基酸序列在图2ASEQIDNO：1中显示。

本文所用术语“PhoP调节子”指由PhoP正向调控的基因。

本文所用术语“过表达”指目的基因的蛋白质水平为细菌中内源性同种蛋白的2倍或更多倍，可以通过基因工程如使用多拷贝质粒和/或强启动子来实现过表达。

核酸分子变异

修饰

可对本申请揭示的核酸分子DNA序列进行多种修饰，这些修饰对本领域的技术人员显而易见。本发明包括本申请所揭示序列(或其片段)的核苷酸修饰，所述修饰在细菌或哺乳动物细胞中编码与本申请揭示的蛋白质或肽具有相同功能的蛋白质或肽。修饰包括一个或多个(例如1-50、1-20、1-10、1-5)核苷酸的取代、插入或缺失，或改变一个或多个(例如1-50、1-20、1-10、1-5)核苷酸的相对位置或顺序。

核酸分子可编码PhoP或PhoP调节子蛋白中的保守氨基酸变化。本发明包括编码PhoP和PhoP调节子蛋白中的保守氨基酸变化及产生沉默氨基酸变化的功能等同的核酸分子。用于凭经验鉴别保守氨基酸取代组的方法为本领域所熟知(参见例如Wu，ThomasD.“DiscoveringEmpericallyConservedAminoAcidSubstitutionGroupsinDatabasesofProteinFamilies”(“在蛋白家族数据库中凭经验发现保守氨基酸取代组”)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&d b＝PubMed&list_uids＝8877523&dopt＝Abstract)。

核酸分子可编码PhoP和/或PhoP调节子基因的非保守氨基酸的取代、添加或缺失。本发明包括产生PhoP和/或PhoP调节子蛋白的氨基酸序列内的非保守氨基酸变化的功能等同的核酸分子。功能上等同的核酸分子包括DNA和RNA，其编码具有非保守氨基酸取代(优选化学上相似的氨基酸的取代)、添加或缺失的肽及蛋白质，所述肽及蛋白质仍保留本申请揭示的PhoP和PhoP调节子蛋白或肽的相同或类似功能。本发明包括编码PhoP和PhoP调节子蛋白的片段或变体的DNA或RNA。

所述片段可用作免疫原并用于免疫原组合物中。

所述片段和变体的PhoP和PhoP调节子样活性通过下述测定来鉴别。

序列同一性

本发明的核酸分子还包括与本发明的核酸分子具有至少大约以下同一性的核酸分子(或其片段)：60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性，或最优选至少99％或99.5％同一性，其为能够在细菌或哺乳动物细胞中表达的核酸分子。同一性指经比对以获得最高等级匹配的两个核苷酸序列的相似性。同一性根据本领域已知的方法来计算。例如，如果一个核苷酸序列(称为“序列A”)与SEQIDNO：2的一部分有90％的同一性，那么序列A除了可能包括SEQIDNO：2中所述部分的每100个核苷酸多达10个点突变(例如用其它核苷酸取代)外，应与SEQIDNO：2的所述部分相同。

序列同一性(每个构建体优选没有编码核酸分子插入)优选设定为与SEQIDNO：2中提供的序列或其互补序列至少约以下同一性：70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性，或最优选至少99％或99.5％同一性。序列同一性优选用来自Bioinformatics(威斯康星大学(UniversityofWisconsin))的GCG程序进行计算。其它程序也可用于计算序列同一性，所述其它程序例如：ClustalW程序(优选用默认参数，Thompson，JD等，NucleicAcidRes.22：4673-4680)；BLASTP；BLASTX算法；基因组研究所(TheInstituteforGenomicResearch)的鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)BLASTN(http:tigrblast.tigr.org/)；WellcomeTrustSangerInstitute的牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG(巴斯德)、海分枝杆菌(M.mastarinum)、麻风病杆菌(M.leprae)、结核分枝杆菌BLASTN(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/)；巴斯德研究所的结核分枝杆菌BLAST搜索(Tuberculist)(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)；巴斯德研究所(InstitutePasteur)的麻风病杆菌BLAST搜索(Leproma)(http://genolist.pasteur.fr/Leproma/)；明尼苏达大学(UniversityofMinnesota)微生物基因组计划的副结核分枝杆菌(M.Paratuberculosis)BLASTN(http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/Ptb/和http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/AGAC/Mptb/Mptbhome.html)；美国国家生物技术信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation-USA)的各种BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)；和GenomeNet的各种BLAST搜索(BioinformaticsCenter-InstituteforChemicalResearch)(http://blast.genome.ad.jp/)。

因为遗传密码具有简并性，所以SEQIDNO：2中的核酸序列不是唯一能编码具有PhoP活性的多肽的序列。本发明包括具有与SEQIDNO：2所述的核酸分子相同的基本遗传信息的核酸分子。与本申请中所述序列比较有一个或多个核酸改变并导致产生SEQIDNO：1中所示的多肽的核酸分子(包括RNA)落入本发明范围内。

可用常规DNA-DNA或DNA-RNA杂交技术分离编码PhoP和PhoP调节子蛋白的核酸的其它功能等同物形式。

杂交

本发明包括具有足以在严谨杂交条件下与本申请所述核酸分子杂交(杂交技术在本领域众所周知)的同一性的序列的DNA。本发明还包括与SEQIDNO：2中的一个或多个序列或其互补序列杂交的核酸分子。所述核酸分子优选在高严谨条件下杂交(参见Sambrook等.MolecularCloning：ALaboratoryManual，最新版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.)。高严谨洗涤优选低盐(优选约0.2％的SSC)和约50-65℃的温度。

疫苗

本领域的技术人员知道重组活疫苗的制备。通常将所述疫苗制备为注射剂，作为液体溶液剂或混悬剂；也可制备为适合在注射前溶于液体中的溶液剂或混悬剂的固体形式。亦可乳化所述制剂，或将蛋白质包裹在脂质体中。通常让活免疫原性成分与药物上可接受并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要，疫苗可包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗效力的佐剂。可能有效的佐剂实例包括但不限于：氢氧化铝、N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(CGP11637，称为nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)和RIBI，RIBI含有在2％角鲨烯/Tween80^TM乳液中的从细菌中提取的三种组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。

可通过测量因给予重组牛分枝杆菌BCG活疫苗而产生的针对免疫原性多肽的抗体的量来测定佐剂的有效性，所述免疫原性多肽含有结核分枝杆菌抗原序列，所述疫苗还含有各种佐剂。

疫苗通过注射(例如皮下或肌肉注射)常规胃肠外给予。适于其它给药方式的另外的制剂包括栓剂及在某些情况下的口服制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；所述栓剂可由含有0.5％-10％、优选1％-2％活性成分的混合物形成。口服制剂包括通常采用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物制成溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂的形式，并含有10％-95％的活性成分，优选25％-70％的活性成分。

疫苗以与剂量制剂相容的方式给予并以有效预防和/或治疗的量给予。

疫苗可以以单剂量方案给予，或优选以多剂量方案给予。多剂量方案是这样的方案，其中初次接种疫苗过程可用1-10个单独的剂量，接着在维持和或加强免疫应答所需的随后时间间隔给予其它剂量，例如在1-4个月给予第二剂量，如果需要，几个月后给予随后的剂量。给药方案至少部分还将根据个体需要来确定，并且有赖于从业人员的判断。

另外，联合其它免疫调节剂(例如免疫球蛋白)给予重组牛分枝杆菌BCG活疫苗。

本发明主题亦为多价疫苗配方，所述多价疫苗配方作为待混合的混合物包含如上所定义的重组牛分枝杆菌BCG活疫苗与另一种疫苗，特别是如上所定义的另一种重组牛分枝杆菌BCG活疫苗，这些疫苗包含不同的插入序列。

药物组合物

本发明的药物组合物用于哺乳动物针对结核分枝杆菌或牛分枝杆菌攻击的治疗或预防。本发明的药物组合物也用于治疗患有退行性疾病、机能障碍或身体状态异常例如癌症的患者。

药物组合物可通过例如片剂、气雾剂给予、气管内灌注和静脉注射方法给予人或动物。

实施例

实施例1.过表达转录调节蛋白phoP的BCG菌株的构建

如下获得含有T7启动子的卡那霉素(kanamycin)抗性穿梭载体：用EcoRI酶切pDrive克隆载体(自Qiagen获得)，经自我连接产生pDRI。用SspI消化pDRI，分离1903个碱基对的片段产物。用SspI消化pMD31穿梭载体(Wu等，1993，MolecularMicrobiology，7，407-417)，分离3379个碱基对的片段。这两个由SspI产生的片段连接产生pME(5282个碱基对)，其含有pDRIVE的原始T7启动子(见图3)。

用分别含有KpnI和pstI酶切位点(下划线部分)的正向引物(5’-AAAAAGGTACCGCTTGTTTGGCCATGTCAAC-3’)和反向引物(5’-AAAAACTGCAGGCTGCCGATCCGATTAACTAC-3’)，从结核分枝杆菌H37Rv菌株(ATCC25618)扩增野生型结核分枝杆菌phoP基因。设计正向引物使其含有phoP起始密码子上游的257个碱基对，这使得可正确表达phoP基因。用来自野生型结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板实施PCR反应。用KpnI和PstI消化所得到的PCR产物，将得到的片段克隆到pME载体中，从而产生定名为pME:phoP的质粒(图4)。通过DNA测序确证该构建体。

如下完成重组BCG的产生：用pME:phoP质粒通过电穿孔转化牛分枝杆菌BCG-日本(ATCC35737)和牛分枝杆菌BCG-布拉格(ATCC35742)细胞，将经电穿孔的细胞涂布到补充10％OADC(Difco)和25μg/ml卡那霉素的7H11培养基平板上。37℃孵育4周后，挑选单菌落，在补充10％ADC(Difco)和25μg/ml卡那霉素的7H9液体培养基中生长。在该培养基中培养3周后，从所挑选的菌落分离质粒DNA，用限制性酶切和凝胶电泳检查。所有菌落给出的质粒DNA的大小及限制性酶切图谱皆表明构建体转化成功，由此建立了新的重组BCG-日本/pME:phoP和重组BCG-布拉格/pME:phoP。随后将1ml培养液和1ml50％无菌甘油溶液混合并保存于-80℃，来制备BCG-日本/pME:phoP和BCG-布拉格/pME:phoPphoP冷冻贮液。

实施例2.过表达phoP的重组BCG-布拉格基因诱导的测定

为了测定phoP过表达对BCG基因表达的影响，进行微阵列分析以比较BCG-布拉格/pME:phoP和荷有pME空载体的野生型BCG-布拉格的转录概况。让菌株在补充10％ADC(Difco)和0.05％吐温80的7H9液体培养基中于37℃培养，直到OD₆₀₀值达到0.4至0.5。为了分离总RNA，沉淀细胞并将其转移至含有1ml细菌RNA保护试剂(RNAprotectBacterialReagent，Qiagen)的2毫升带螺帽管中，室温下孵育5分钟。细胞再次沉淀，用400μl裂解液(20mMNaCH₃COOH、0.5％SDS、1mMEDTA，pH4)和1ml酚/氯仿(pH4.5，Sigma)重新悬浮。通过三次30秒-脉冲用玻璃珠击打破碎细胞。然后，将细胞于65℃孵育4分钟，然后4℃5分钟，以13000rpm离心5分钟。然后，用300μl氯仿/异戊醇(24∶1)提取上清液，并用异丙醇沉淀。然后用标准程序分离总RNA。

为制备cDNA，用100μl总体积(25mMTrispH8.4、37.5mMKCl、3mMMgCl₂和0.1MDTT)中的2μlSuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)、25μg9聚物随机引物和2uldNTP混合物(0.5mMdATP、0.5mMdCTP、0.5mMdGTP、0.25mMdTTP、0.25mM5-(3-氨基烯丙基)-dUTP)在42℃过夜逆转录25μg总RNA。通过加入1/3体积的1MNaOH水解RNA，然后在65℃孵育20分钟后用1/3体积HCl中和。用QIAquick柱(Qiagen)纯化cDNA。在室温下标记cDNA1小时，然后用4M羟胺终止。纯化标记的cDNA，每个样品2μg与15,000-feature结核分枝杆菌H37RvORF阵列进行杂交，每个ORF用三个不同的探针(AgilentTechnologies)，用Genepix专业4200A扫描仪进行扫描。实施微阵列显著性分析(SAM)来鉴定显著上调或下调的基因，结果示于表1。

结果表明，与携带空载体的对照BCG比较，携带pME:phoP质粒的重组BCG菌株显示出45种基因的表达提高，这些基因包括熟知的T细胞抗原Ag85A、10种ESAT-6/CFP-10样蛋白(EsxI、J、K、L、M、N、O、P、V、W)、PPE18和另外7种PE/PPE蛋白。

表1.在过表达phoP的BCG-布拉格中上调的45个基因列表。7个与PhoP调节子重叠的基因以红色突出显示，10个esx家族基因以蓝色突出显示。数据来自3个生物重复样品，并经SAM分析产生，Q值≤10％。

实施例3.工程重组BCG诱导小鼠抗原特异性免疫应答能力的测定

在小鼠中比较了过表达phoP的重组BCG和亲代BCG诱导细胞免疫应答的能力。用5×10⁵CFU的重组BCG(BCG-日本/pME:phoP，BCG-布拉格/pME:phoP)、相应的对照BCG(BCG-日本/pME、BCG-布拉格/pME)或PBS(首次接受试验的小鼠)免疫C57BL/6小鼠(每组4只)。接种八周后，将小鼠处死，制备脾细胞。将脾细胞以每孔2.5×10⁵个细胞一式三份涂布96孔板，用或不用10μg/mlPPD(自StatensSerumInstitute获得)培养72小时，用于ELISA分析。抗原刺激3天后，收获细胞上清液，用OptEIA^TMELISA试剂盒(BDBiosciences)及适当的单克隆抗体通过ELISA测定IFN-γ的产生。为测定产生IFN-γ的T细胞群的表型和频率，进行了细胞内细胞因子染色(ICCS)和流式细胞术。为进行ICCS分析，用10μg/ml的PPD(自StatensSerumInstitute获得)刺激脾细胞24小时，然后洗涤，与CD16/CD32单克隆抗体孵育以阻断Fc结合。随后，用BDCytofix/Cytoperm试剂盒对合适的细胞表面标志及细胞内细胞因子(例如CD3、CD4、CD8、CD44、IFN-γ、TNF和IL-2)染色，然后进行FACS分析。

如图4所示的结果表明过表达phoP的重组BCG诱导细胞免疫应答提高了：与对照BCG比较，PPD诱导的IFN-γ产生的量级(ELISA法测定)和PPD特异的产生IFN-γ的CD4⁺T细胞的数量(ICCS测定)，都有明显提高。

这些研究提供了直接的免疫学证据，表明过表达phoP的BCG菌株比亲代BCG能诱导更强的细胞免疫应答，其如小鼠中抗原特异性T细胞应答所证明。由于PPD特异性IFN-γ的产生是疫苗选择的最重要的生物标志，并为抗分枝杆菌免疫的重要量度，所以所述工程重组的BCG将比亲代BCG为接种的宿主提供针对结核分枝杆菌攻击的更强大的保护。

业已详细阐述本发明，特别是参考优选实施方案及实施例；然而，本领域的普通技术人员将会理解，可以进行不偏离其精神和范围的改变。例如，当本申请提到蛋白质时，很显然通常可以使用肽和多肽。同样地，当申请中描述基因时，很显然通常可使用核酸或基因片段。

所有出版物(包括GenBank中的条目)、专利和专利申请以其整体引作参考，引用的程度如同每一单个出版物、专利或专利申请明确并单独指明以其整体引作参考的程度一样。

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Claims (15)

1.重组牛分枝杆菌BCG活菌株，所述菌株包含能过表达的核酸，所述核酸编码PhoP蛋白，其中所述PhoP蛋白为来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)的天然存在的功能性PhoP蛋白，其中所述核酸编码SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列，所述牛分枝杆菌BCG菌株选自：牛分枝杆菌BCG-日本,ATCC编号：35737；和牛分枝杆菌BCG-布拉格,ATCC编号：35742。

2.根据权利要求1的重组牛分枝杆菌BCG活菌株，其中所述核酸包含SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列。

3.权利要求1或2的重组牛分枝杆菌BCG活菌株，其中所述牛分枝杆菌BCG菌株为牛分枝杆菌BCG-日本,ATCC编号：35737。

4.权利要求1或2的重组牛分枝杆菌BCG活菌株，其中所述牛分枝杆菌BCG菌株为牛分枝杆菌BCG-布拉格,ATCC编号：35742。

5.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-4中任一项的重组牛分枝杆菌BCG活菌株。

6.用于哺乳动物治疗或预防分枝杆菌攻击的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含权利要求1-4中任一项的重组牛分枝杆菌BCG活菌株。

7.权利要求6的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含药物上可接受的载体。

8.权利要求6所述的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

9.权利要求6-8中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含来自一种或多种其它病原体的免疫原性物质。

10.权利要求1-4中任一项的重组牛分枝杆菌BCG活菌株在制备用于哺乳动物治疗或预防结核杆菌或牛分枝杆菌攻击的疫苗或免疫原性组合物中的用途。

11.权利要求10的用途，其中所述哺乳动物为牛。

12.权利要求10的用途，其中所述哺乳动物为人。

13.权利要求10的用途，其中所述疫苗或免疫原性组合物在佐剂存在下给予。

14.权利要求1-4中任一项的重组牛分枝杆菌BCG活菌株在制备用于哺乳动物治疗或预防膀胱癌的疫苗或免疫原性组合物中的用途。

15.权利要求14的用途，其中所述疫苗或免疫原性组合物在佐剂存在下给予。