JP5994127B2 - 新規な組換えｂｃｇワクチン - Google Patents

Description

本発明は、サイトカインシグナル抑制因子のドミナントネガティブ変異体を発現する組換えＢＣＧ菌の作製とそれを含有する結核予防ワクチンに関するものである。

現在、世界中で広く結核ワクチンとして用いられているＢＣＧワクチン（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）は、小児の結核性髄膜炎ならびに粟粒結核に対しては８０％の防御効果を示しているが、成人の肺結核に対する予防効果は十分とは言えない。結核は世界三大感染症の一つであり、世界中で毎年９３０万人の新規患者の発生が認められる。わが国では２５，０００人以上の患者の発生があり、結核中度蔓延国となっている。有効な４剤の組み合わせによる治療法は確立されているが、近年になってそれらの２剤以上に対して耐性を示す多剤耐性結核菌の感染が広がり、さらに３剤以上に耐性を持つ高度多剤耐性菌の出現も多く報告されており、有効な新規結核ワクチンの開発は急務となっている。

現在、ＢＣＧを含む抗酸菌の分子生物学的な研究が進み、ＢＣＧに外来遺伝子を導入して、その生物学的な性質を改良し、より有効な結核ワクチンを開発する試みが世界中で行われている（非特許文献１，２、特許文献１，２）。例えば、米国のＮＰＯ法人であるＡＥＲＡＳ Ｇｌｏｂａｌ ＴＢ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを中心として、ＢＣＧ菌に対して、結核菌の防御抗原分子の過剰発現やサイトカイン遺伝子等の組込みなどが試みられているが、まだ充分な結核予防効果を上げている訳ではなく、打開策についても決定打と見られるものは見出せていない。また、国内においても、近畿中央胸部疾患センターで、α抗原Ａｇ８５Ｂ等の遺伝子を組み込んだ組換えＢＣＧを用いた結核予防効果が報告されている（非特許文献３）。しかし、また充分効果を上げているようには見えない。

特表２００８−５１７０１３号公報 特表２００１−５１８７８１号公報

Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７、１７９：８４１８−８４２４ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ２００９，Ｊａｎ；８９（１）：６２−６７（２００８） 化学療法の領域、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．３ ４４７−４５３（２００７年）

本発明の一つの目的は、サイトカインシグナル伝達のレベルで様々なサイトカイン産生を高めることのできる組換えＢＣＧ菌を提供することであり、更なる一つの目的は、この組換えＢＣＧ菌を有効成分とする、有効性の高い結核予防ワクチンを提供することである。

本発明者らは、結核ワクチンとしてのＢＣＧ菌の有効性を増強するために、新たな試みとしてＢＣＧ等の抗酸菌に対する宿主免疫反応を負に調節するサイトカイン抑制分子（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ： ＳＯＣＳ）に着目した。即ち、ＳＯＣＳ分子はＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル経路を抑制することにより、種々のサイトカインの産生を調節することが知られている（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７， ４５４−６５ （２００７）など）。例えば、ＢＣＧ菌の感染によりＳＯＣＳの発現がマクロファージ（Ｍφ）や樹状細胞（ＤＣ）等において増強され、免疫反応を抑制することが近年報告されている（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９， １７３−１８０ （２００３）， Ｎａｒａｙａｎａ ａｎｄ Ｂａｌａｊｉ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８３， １２５０１−１２５１１ （２００８））。

このようなＳＯＣＳの発現増強が原因となって、ＢＣＧワクチンの効果が限定的になっている可能性が示唆されている。このＳＯＣＳ１の働きによる免疫反応の抑制を解除できれば、ＢＣＧワクチンの効果を増強できるのではないかと考えられる。なお、SOCSは8個の分子群からなるSOCSファミリーを形成しており、その中でもSOCS1は、現在、IFNγ、IFNα、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21のシグナル伝達を制御することが明らかにされている。
そこで、本発明者らは、SOCS1分子の働きを抑制し、Th1型免疫反応を亢進させる、新しい組換えBCG菌の作製を検討した。まず、ＳＯＣＳ１の機能に対し拮抗的に働くアンタゴニストであるＳＯＣＳ１ドミナントネガティブ変異体（１アミノ酸の変換）を作製し（ＳＯＣＳ１ｄｎ）、このＳＯＣＳ１ｄｎ発現ベクターを組み込んだ組換えＢＣＧ菌（ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ）を作製した。試験管内での解析により、このｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ感染細胞では、ＪＡＫ２リン酸化抑制の解除が観察され、ＳＯＣＳ１によるリン酸化抑制が解除できることが明らかとなった。

上記組換えＢＣＧ菌（ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ）を用いたマウス吸入感染実験により、結核菌特異的免疫反応が増強されていることが明らかになり、ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎが機能して、感染ＤＣにおいてＳＯＣＳ１の機能を抑制し、その結果として抗酸菌特異的免疫反応を増強することを明らかにした。本発明者らは、以上の知見に基づき本発明を完成した。なお、本発明の知見は、上記非特許文献１、２、３や特許文献１、２で報告されているような結核菌の感染防御に働く抗原遺伝子をＢＣＧ菌に導入して、そのワクチン活性増強を目指すストラテジーとは、全く異なるコンセプトに基づくものである。本発明のような宿主由来のタンパク質遺伝子をＢＣＧ菌に組み込み、宿主のシグナル伝達経路を制御して、より有効なワクチンを開発しようというコンセプトは、本発明者らの知る限り過去に例がない。

本発明が提供する例示的な実施態様は、以下の（１）〜（２０）である。
（１）ＢＣＧ菌組換え用のサイトカインシグナル抑制因子の発現ベクターであって、
ａ）ドミナントネガティブな１アミノ酸置換されたサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）の塩基配列からなるＤＮＡ又は当該塩基配列と同一性が９０％以上であり当該１アミノ酸置換を有する塩基配列からなるＤＮＡ、及び
ｂ）シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む、発現ベクター。
（２）ＢＣＧ菌組換え用のサイトカインシグナル抑制因子の発現ベクターであって、
ａ）ドミナントネガティブな１アミノ酸置換されたサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）の塩基配列からなるＤＮＡ、
ｂ）ＳＰ２、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０及びＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂからなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子の転写プロモーターの塩基配列からなるＤＮＡ、
ｃ）ｂｌａＦ、ｂｌａＣ、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ及びＭＰＢ６４からなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子のシグナルペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
ｄ）ＳＤ配列からなるＤＮＡ、及び
ｅ）ｈｓｐ６０、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ及びＭ． ｋａｎｓａｓｉｉ由来α抗原からなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子の転写ターミネーターの塩基配列からなるＤＮＡ
を含む、発現ベクター。
（３）カナマイシン耐性遺伝子をさらに含む、（１）又は（２）に記載の発現ベクター。
（４）発現ベクターが、
ａ）ドミナントネガティブな１アミノ酸置換されたサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）の塩基配列からなるＤＮＡ、
ｂ）ＳＰ２、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０及びＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂからなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子の転写プロモーターの塩基配列からなるＤＮＡ、
ｃ）ｂｌａＦ、ｂｌａＣ、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ及びＭＰＢ６４からなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子のシグナルペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
ｄ）ＳＤ配列からなるＤＮＡ、及び、
ｅ）ｈｓｐ６０、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ及びＭ． ｋａｎｓａｓｉｉ由来α抗原からなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子の転写ターミネーターの塩基配列からなるＤＮＡ
を含む、大腸菌−抗酸菌シャトルベクターである、（１）〜（３）のいずれかに記載の発現ベクター。
（５）大腸菌−抗酸菌シャトルベクターがｐＳＯ２４６である、（４）に記載の発現ベクター。
（６）シグナルペプチドをコードする塩基配列が、ｂｌａＦシグナル配列である、（１）〜（５）のいずれかに記載の発現ベクター。
（７）転写ターミネーターをコードする塩基配列が、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂターミネーター配列である、（１）〜（６）のいずれかに記載の発現ベクター。
（８）１アミノ酸の置換部位がＳＯＣＳ１のキナーゼ阻害領域である、（１）〜（７）のいずれかに記載の発現ベクター。
（９）１アミノ酸の置換部位がＮ末から５９位の位置である、（１）〜（８）のいずれかに記載の発現ベクター。
（１０）５９位のアミノ酸が、フェニルアラニンから、アスパラギン酸に変わっている、（１）〜（９）のいずれかに記載の発現ベクター。
（１１）ドミナントネガティブな１アミノ酸置換されたサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）の塩基配列が配列番号１である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の発現ベクター。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかの発現ベクターを、ＢＣＧ菌に導入して得られた組換えＢＣＧ菌（ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ）。
（１３）ＢＣＧ菌がＢＣＧ東京株である、（１２）に記載の組換えＢＣＧ菌。
（１４）（１２）又は（１３）の組換えＢＣＧ菌を含有する、ＢＣＧワクチン。
（１５）結核予防用ワクチンである、（１４）に記載のＢＣＧワクチン。
（１６）サイトカイン及び／又はケモカインの産生誘導能を増強させる、（１４）又は（１５）に記載のワクチン。
（１７）サイトカイン及びケモカインの産生誘導能が、ＩＦＮ−γ、ＴＨＦ−α及びＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの産生誘導能及び／又はＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ特異的細胞性免疫誘導能である、（１４）〜（１６）のいずれかに記載のワクチン。
（１８）（１４）〜（１７）のいずれかに記載のワクチンを投与することを含む、結核の感染防御方法。
（１９）（１）〜（１１）のいずれかの発現ベクターをＢＣＧ菌に導入することを含む、ＢＣＧワクチンの製造方法。
（２０）ＢＣＧ菌にドミナントネガティブな１アミノ酸置換されたサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）を発現させることを含む、ＢＣＧ菌に対する免疫の増強方法。

本発明は、組換えＢＣＧ菌（ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ）であって、生体に投与されると速やかにマクロファージや樹状細胞に取り込まれ、その細胞内でＳＯＣＳ１ｄｎ蛋白質を産生する組換えＢＣＧ菌（ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ）を提供する。産生されたＳＯＣＳ１ｄｎ蛋白質は、元々細胞内に存在するＳＯＣＳ１蛋白質と拮抗的に作用して、ＳＯＣＳ１によるＪＡＫリン酸化阻害活性を抑制する。一つの実施態様において、本発明の組換えＢＣＧ菌は、免疫個体におけるＩＦＮ−γのシグナルを増強してＩＦＮ−γの産生能を高め、宿主のＢＣＧ親株に比して格段に高い免疫誘導能を持つ。従って、この組換えＢＣＧ菌を有効成分とするワクチンは、結核ワクチンとして、これまでにない増強された宿主サイトカイン産生能と増強された免疫誘導能を備えている。

ＳＯＣＳ１ｄｎ遺伝子（配列番号１）のＢＣＧでの発現プラスミドの構築ストラテジーを示した流れ図である。 （ａ）図は、最終的に構築したＳＯＣＳ１ｄｎ発現プラスミドの構造を模式的に示した図である。図中ＫｍＲは、カナマイシン耐性遺伝子を、ＳＰ２はＳＰ２プロモーターを、ｍｅｇａＳＤは、シャインダルガーノ（ＳＤ）配列を、ｂｌａＦは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ由来βラクタマーゼ遺伝子のシグナルペプチド配列を、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＭ． ｋａｎｓａｓｉｉ由来α抗原遺伝子のターミネーターを示す。（ｂ）図は、その発現プラスミドを導入したｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎの菌体抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ＰＶＤＦ膜にブロットした後、抗ＳＯＣＳ抗体と反応する蛋白質を検出したウエスタンブロット解析の図である。約３７ ｋＤａの位置に特異的なバンドが認められる。 は、ＲＡＷ２６４．７細胞にＢＣＧ Ｔｏｋｙｏ株およびｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎを試験管内で感染させ、ＪＡＫ２タンパク質のリン酸化を調べるために行なったウエスタンブロット解析の図である。 （ａ）図は、ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎを免疫したマウスの脾細胞を用いて、組換えＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ蛋白質またはａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスで刺激した後のＩＦＮ−γ産生細胞数をＥＬＩＳＰＯＴ法で評価した結果である。（ｂ）図は、同様の免疫マウス脾細胞を、組換えＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ蛋白質、ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスまたはＰＰＤ刺激後に試験管内で一定時間培養し、培養上清中のＴＮＦ−αおよびＲＡＮＴＥＳの産生量を測定した結果である。 ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎおよびＢＣＧ東京親株を免疫したマウスに結核菌を噴霧感染し、４週および８週後の肺と脾臓での結核菌を還元培養して菌数を比較したグラフである。

−本発明の第一の態様−
本発明の第一の態様において、ＳＯＣＳ１ドミナントネガティブ変異体の遺伝子配列を含有するベクターが提供される。当該ベクターの例には、配列番号２で表される塩基配列からなるベクターが挙げられる。
本発明において使用される「ＳＯＣＳ１ドミナントネガティブ変異体（ＳＯＣＳ１ｄｎ）」は、ＳＯＣＳ１の活性を阻害する変異タンパク質であって、野生型のＳＯＣＳ１タンパク質のキナーゼ阻害領域に存在するアミノ酸が１アミノ酸置換を起こした変異体タンパク質であり得る。特に好ましい例としては、野生型のＳＯＣＳ１タンパク質のＰｈｅ−５９がＡｓｐ−５９に１アミノ酸置換を起こしたタンパク質が挙げられる。このようなＳＯＣＳ１ｄｎをコードする遺伝子は、野生型のＳＯＣＳ１遺伝子のＰｈｅ−５９をＡｓｐ−５９に１アミノ酸置換を起こすような遺伝子変異を導入することにより得ることができる（Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６， ４０７４６−４０７５４ （２００１））。また、その変異の導入方法としては、ＰＣＲプライマー内に変異を導入し、ＰＣＲでその変異を含むＤＮＡを増幅後クローニングする方法や、Ｋｕｎｋｅｌ法による部位特異的変異導入法などの公知の方法を用いることができる。
また、本発明が提供する発現ベクターは、野生型のＳＯＣＳ１のアミノ酸配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＳＯＣＳ１変異体をコードするＤＮＡを含んでもよい。そのような同一性を有するアミノ酸配列からなるＳＯＣＳ１変異体は、野生型のＳＯＣＳ１タンパク質のキナーゼ阻害領域に存在するアミノ酸が１アミノ酸置換を起こした変異体タンパク質であって、ＳＯＣＳ１の活性を阻害する蛋白質であり得る。
ＳＯＣＳ１ｄｎ遺伝子の例には、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。

本明細書において「発現ベクター」とは、特定の外来遺伝子を発現させるために用いられるベクターである。本発明が提供する発現ベクターの例には、ＳＯＣＳ１ｄｎをＢＣＧ菌で分泌発現させるための転写プロモーター、シャインダルガーノ（ＳＤ）配列、シグナルペプチドおよび転写ターミネーターを含み、且つＢＣＧ菌などの抗酸菌で複製可能なレプリコンを有するプラスミドＤＮＡが挙げられる。
本発明において使用される「転写プロモーター」は、本発明の目的遺伝子の発現に関わる重要な因子であり、その強度が強くて、ｍＲＮＡを多量に産生できるものであり得る。好ましいものとして、例えばＳＰ２（Ｓｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．２２４：１３９−１４２（２００３））、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂなどのプロモーターを挙げることができる。より好ましくは、ＳＰ２を挙げることができる。
本発明において使用される「転写ターミネーター」は、転写を止めてＲＮＡポリメラーゼのターンオーバーを改善する目的で搭載されるものであり得、例えばｈｓｐ６０、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ、Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ由来α抗原などのターミネーターを挙げることができる。好ましいものとしては、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂのターミネーターを挙げることができる。
本発明において使用される「ＳＤ配列」は、転写で産生されたｍＲＮＡが、１６ＳリボゾームＲＮＡの３′末端と相補性を持つことで結合し、タンパク質への翻訳を進めるための重要な配列であり得る。例えば、４−５塩基の通常ＳＤ配列と共に、結合力がより強力でｍｅｇａＳＤと呼ばれる１１塩基（ＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧ）のものを使用することができる（Ｍｅｄｅｒｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．７０：３０３−３１４（２００２））。このましいＳＤ配列としては、ｍｅｇａＳＤを挙げることができる。

本発明において使用される「シグナルペプチド」は、分泌タンパク質が膜を通過する際に必要な２０−４０アミノ酸残基からなるペプチド配列であり得る。なお、ＳＯＣＳ１は元来宿主細胞の細胞質内で働くタンパク質であり、概して細胞質内で働くタンパク質は膜を通過しにくい構造を持つことから、本発明において使用されるＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質も細胞膜を通過し難いと考えられる。そこで、膜透過に働くシグナルペプチドにＳＯＣＳ１ｄｎを繋いで菌体外に分泌させることが、重要であると考えられた。本発明において使用されるシグナルペプチドとしては、抗酸菌由来のシグナルペプチドが挙げられ、それは、ＢＣＧ菌からＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質を効率的に分泌させる。例えば、ｂｌａＦ （Ｔｉｍｍ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １２：４９１−５０４（１９９４）），ｂｌａＣ （ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８７：７６６７−７６７９（２００５））， Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ （Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７０：３８４７−３８５４（１９８８））， ＭＰＢ６４ （Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．５７：２８３−２８８（１９８９））など様々な抗酸菌由来のシグナルペプチド遺伝子を使用することができる。好ましいものとしては、ｂｌａＦを挙げることができる。

更に本発明が提供する発現ベクターには、通常の発現ベクターに存在する、抗生物質耐性遺伝子や複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ＝ｏｒｉ）などが存在してもよい。例えば、抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）、ハイグロマイシンなどを挙げることができる。目的に応じて、適宜、抗生物質耐性遺伝子を選択することが出来る。複製起点としては、例えばＳＶ４０、Ｃｏｌ Ｅｌ ｏｒｉ、ｐＵＣ ｏｒｉ、２μ ｏｒｉ、ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、Ｏｒｉ−Ｍなどが挙げられ、目的に応じて適宜選択することが出来る。
本発明において使用される「大腸菌−抗酸菌シャトルベクター」は、ＢＣＧ菌のような抗酸菌と大腸菌の両方で発現可能なベクターであり得、このベクターにＳＯＣＳ１ｄｎ遺伝子と転写プロモーター、シャインダルガーノ（ＳＤ）配列、シグナルペプチドおよび転写ターミネーターを包含させるとことにより、より効率的にＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質を発現することができる。本発明で使用可能な大腸菌−抗酸菌シャトルベクターは、公知のもので特に限定されるものはなく、例えば、ｐＳＯ２４６、ＰＮＮ２等のものを挙げることができる。

−本発明の第二の態様−
本発明の第二の態様において、ＳＯＣＳ１の５９位がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からアスパラギン酸（Ａｓｐ）に変化したドミナントネガティブ変異体の遺伝子配列を含有したベクターで形質転換された組換えＢＣＧ菌が提供される。
本明細書において、「ＢＣＧ菌」とは、ウシ型結核菌が継代培養されて人に対する毒性が失われて抗原性だけが残った細菌のことであり、作製者の名前を取って名付けられたカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ ｄｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ ｅｔ Ｇｕｅｒｉｎ）の略称である。ＢＣＧ菌の例には、ＢＣＧ東京株が挙げられる。
発現ベクターをＢＣＧ菌に導入する方法としては、抗酸菌への発現ベクターの導入方法を利用することができる。本発明が提供する発現ベクターを用いて電気穿孔法でＢＣＧ菌に導入する方法を用いてもよい。また、相同組換えを利用して部位特異的にゲノムＤＮＡに当該遺伝子を挿入することも可能である。
本発明が提供する「組換えＢＣＧ菌」は、本発明が提供する発現ベクターで組換えられ、ＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質を発現するようになったＢＣＧ菌であり得る。組換えＢＣＧ菌を選択するためには、ＢＣＧ菌に本発明の発現ベクターを導入した後、市販の抗酸菌培養用の７Ｈ１０等の寒天培地にカナマイシンやハイグロマイシン等の薬剤を加えた寒天培地上で、約３週間３７℃で培養することによって得られるコロニーをピックアップすることにより、組換えＢＣＧ菌を選択することができる。

更に、組換えＢＣＧ菌におけるＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質の発現確認は、以下のようにして行うことができる。まず、組換えＢＣＧ菌の一部を採取し、７Ｈ９培地やソートン培地などの液体培地中、３７℃で約２週間培養することにより菌を増殖させた後に、超音波破砕法などで菌体を破砕することにより菌体抽出液を調製する。培養上清中の蛋白質は、硫安沈殿、トリクロロ酢酸沈殿などの一般的な生化学的方法で濃縮して菌体分泌蛋白質混合物を調製する。これらのサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ニトロセルロース製等のフィルターに電気的に吸着（ブロット）させた後に、市販の抗ＳＯＣＳ１抗体と反応する蛋白質を検出するウエスタンブロット法により、ＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質の発現を確認することができる。

−本発明の第三の態様−
本発明の第三の態様において、上記組換えＢＣＧ菌を有効成分とするＢＣＧワクチンが提供される。
本発明が提供する「ＢＣＧワクチン」は、ＩＦＮ−γ等の種々のサイトカイン産生能が向上したＢＣＧ生菌ワクチンであり得る。例えば、本発明が提供するＢＣＧワクチンは、ＩＦＮ−γ、ＴＨＦ−α及びＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの産生誘導能及び／又はＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ特異的細胞性免疫誘導能が増強されたワクチンであり得る。好ましくは、本発明が提供するＢＣＧワクチンは、結核予防ワクチンとして使用される。
一つの実施態様において、本発明は、宿主のＢＣＧ東京株由来のワクチンと比較して、ＩＦＮ−γ産生細胞数が増大すると共にＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ特異的細胞性免疫誘導能が増強され、ＴＮＦ−αとＲＡＮＴＥＳの産生量が増大するＢＣＧワクチンを提供する。
また、一つの実施態様において、本発明が提供するＢＣＧワクチンは、投与されたＳＯＣＳ１ドミナントネガティブ変異体（ＳＯＣＳ１ｄｎ）により、投与された対象（ヒト）で、サイトカインとケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＨＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ）の産生の増加が惹起され、ＢＣＧ菌に対する免疫（例えば、ＢＣＧ菌に対する抗体産生）が増強される。
「サイトカインとケモカインの産生誘導能」は、本発明が提供する組換えＢＣＧ菌の免疫原性を評価する指標となり得るものであり、以下の方法で評価することができる。まず、適当量の組換えＢＣＧの生菌を生理食塩水等の媒体に懸濁させたものをマウス、モルモット等の小動物に皮下接種する。２−８週後の脾細胞を採取し、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５ＢやＰＰＤ等のＢＣＧあるいは結核菌由来抗原蛋白質で刺激した後、ＩＦＮ−γ産生細胞数をＥＬＩＳＰＯＴ法により測定することにより評価することができる。更に、上記免疫感作動物の脾細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで一定期間培養後、培養上清中の種々のサイトカインもしくはケモカインの濃度をＥＬＩＳＡ法により定量することにより、サイトカインもしくはケモカイン産生能を評価することができる。これらの評価試験の結果、本明細書実施例において作製されたＢＣＧワクチンは、それが投与された動物（例えば、マウス）において、ＩＦＮ−γ産生細胞数が増大すると共にＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ特異的細胞性免疫誘導能が増強され、ＴＮＦ−αとＲＡＮＴＥＳの産生量が増大していることが示された。
なお、本発明が提供するＢＣＧワクチンは、従来のＢＣＧワクチンと同様の処方でヒトに投与できる。投与量は、適宜、効果を勘案して調整することができる。
また、本発明が提供するＢＣＧワクチンは、結核予防用組成物であり得、医薬品として許容できる担体（添加剤も含む）と共に製剤化することができる。医薬品として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。よって、本発明は、一つの実施態様において、本発明が第二の態様で提供するＢＣＧ菌と医薬品として許容できる担体を混合することを含む、ＢＣＧワクチンの製造方法を提供する。また、本発明は、一つの実施態様において、本発明が提供するＢＣＧワクチンをヒトに投与することを含む、結核感染防御方法を提供する。

以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。

以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。

（実施例１）ＳＯＣＳ１ｄｎ分泌発現ベクターの構築
構築の流れ図を図１に示す。まず、ＳＰ２プロモーター（Ｓｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．２２４：１３９−１４２（２００３））、ｍｅｇａＳＤ配列（Ｍｅｄｅｒｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：３０３−３１４ （２００２））、Ｍ． ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ由来β−ｌａｃｔａｍａｓｅ遺伝子（ｂｌａＦ）のシグナルペプチド遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｌ２５６３４ （ヌクレオチド番号１２７４−１３６９））、及びＭ． ｋａｎｓａｓｉｉ由来α抗原ターミネーター遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ５３８９７ （ヌクレオチド番号１２２１−１３９６））を、５‘側からこの順に並んだ発現カセットをｐＵＣ１８プラスミドに搭載してｐＡ７１７Ｎベクター（配列番号３）を作製した。次に、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングされている、Ｎ末端にＨＡタグを持つＳＯＣＳ１ｄｎ遺伝子をＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ消化により切り出し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＳＯＣＳ１ｄｎを得た。このプラスミドからＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ消化によりＮｃｏＩ以降終止コドンまでを含むＤＮＡ断片を切り出し、ｂｌａＦシグナル配列の ３’末端の一部とＳＯＣＳ１ｄｎの ５’末端の一部を含む合成ＤＮＡアダプターを介して、ｐＡ７１７ＮプラスミドのＳＰ２プロモーターの下流に位置するＮａｒＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＡ７１７Ｎ−ＳＯＣＳ１ｄｎ（配列番号２）を得た。このプラスミドからＳＯＣＳ１ｄｎ発現カセットをＫｐｎＩ消化で切り出し、大腸菌−抗酸菌シャトルベクターｐＳＯ２４６ ［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １３５：２３７−４３ （１９９６）］のＫｐｎＩ部位に導入し、ＳＯＣＳ１ｄｎ分泌発現ベクターｐＳＯ−ＳＯＣＳ１ｄｎを得た（図２（ａ））。

（実施例２）ＳＯＣＳ１ｄｎを発現する組換えＢＣＧ菌の構築
ｐＳＯ−ＳＯＣＳ１ｄｎおよびｐＳＯ２４６（配列番号４）を常法により電気穿孔法でＢＣＧ東京株に形質転換し、カナマイシン添加７Ｈ１０−ＯＡＤＣ寒天培地（ベクトンディッキンソン社製）で２−３週間、３７℃で培養した。コロニーをピックアップし、カナマイシン添加７Ｈ９−ＡＤＣエンリッチメント液体培地（ベクトンディッキンソン社製）中で２週間振とう培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５に達した時点で菌体を遠心分離で集め、超音波破砕にて菌体抽出液を調製した。その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜にブロットした後に、一次抗体としてヤギ抗ＳＯＣＳ１ポリクローナル抗体、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ社製）と反応させた（ウエスタンブロット解析）。バンドの検出にはＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた。結果を図２（ｂ）に示す。ｐＳＯ−ＳＯＣＳ１ｄｎを導入したＢＣＧでは、空ベクターのｐＳＯ２４６を導入したＢＣＧには見られない特異的なバンドが認められ、ＳＯＣＳ１ｄｎ蛋白質が著量発現していることがわかった。一方、同じ組換えＢＣＧクローンを、ＡＤＣエンリッチメントを含まず２％グリセリン含有、カナマイシン添加７Ｈ９液体培地（ベクトンディッキンソン社製）で２−３週間、３７℃で培養し、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達した時点で菌体を遠心分離で除いて上清を回収後、０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）を通して完全に除菌した。この上清１ｍｌに等量の１０％トリクロロ酢酸水溶液を加えて混和し、氷中で３０分間静置後、遠心分離にて沈殿したタンパク質の混合物を回収した。このサンプルを上記と同様にウエスタンブロット解析を行なったところ、発現したＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質がＢＣＧ菌体外に分泌されていることがわかった。

（試験例１）ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎのＪＡＫ２リン酸化抑制解除効果の解析（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ）
ＲＡＷ２４６．７細胞を１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０^５個／ｗｅｌｌに調整して播き、ＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃， ５％ ＣＯ２存在下で１８時間培養後、ＭＯＩ＝１０になるようにＢＣＧ−ＴｏｋｙｏまたはｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎを加え、さらに２４時間培養を行った。培養後、細胞を回収し、１００μｌのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ （５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を加え、４℃で１時間溶解させた。さらに超音波処理にて細胞を破砕し、細胞抽出液とした。これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開後、ＰＶＤＦ膜にブロットし、ウサギ抗ＪＡＫ２抗体（ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ社製）及びウサギ抗ｐＪＡＫ２抗体（ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ社製）を用いてウエスタンブロット解析を行なった。結果を図３に示す。
ＢＣＧ Ｔｏｋｙｏ感染ＲＡＷ２６４．７細胞では、非感染細胞に比べてＪＡＫ２のリン酸化が抑制されており、ＳＯＣＳ１の発現亢進による効果だと考えられる。一方、ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ感染細胞では、ＪＡＫリン酸化が認められ、ＳＯＣＳ１によるリン酸化抑制が解除されていることがわかった。

（試験例２）ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎによるマウスでのＢＣＧ特異的ＩＦＮ−γ産生の増強試験
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＢＣＧ東京株又はｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎそれぞれを０．１ ｍｇずつ皮下接種し、４週後の脾臓を採取して脾細胞を調製後、組換えＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ蛋白質あるいはＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ発現型組換えワクシニアウイルスで刺激した後のＩＦＮ−γ産生細胞数を市販のＥＬＩＳＰＯＴ ｋｉｔ（ＭＡＢＴＥＣ社製）で測定した。結果を図４（ａ）に示す。ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ免疫群ではＢＣＧ東京免疫群と比較して有意に高い頻度でｓｐｏｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌが認められ、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ特異的細胞性免疫誘導能が増強されていることがわかった。また免疫マウスの脾細胞を各種抗原で刺激後に培養し、培養上清中のＴＮＦ−αおよびＲＡＮＴＥＳを定量したところ、ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ免疫群ではＢＣＧ東京免疫群と比較してこれらの濃度が高く、サイトカインおよびケモカイン産生誘導能が増強されていることがわかった（図４（ｂ））。

（試験例３）ｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎによるマウスでの結核菌感染防御能の増強試験
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＢＣＧ東京株とｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎをそれぞれ０．５ ｍｇずつ皮下接種し、陰性対照として生理食塩水のみを皮下接種した群をおいた。免疫４週後に結核菌Ｈ３７Ｒｖ株（マウス１匹あたり４７ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を、Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ社製噴霧感染装置ｍｏｄｅｌ ０９９Ｃ Ａ４２１２
を用いて噴霧感染させた。感染４週および８週後に肺および脾臓を採取し、一定重量の臓器をグラインダーですり潰して１％小川培地（日本ビーシージー製造（株）製品）に播き培養した。培養４週後に結核菌のコロニー数を計測し、ＢＣＧ東京株免疫マウスよりも菌数が少ないかどうかで、感染防御能増強効果を評価した（図５）。肺ではＢＣＧ東京株およびｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ免疫で差がなく、むしろＢＣＧ親株の方が防御効果が高い傾向にあったが、脾臓ではｒＢＣＧ−ＳＯＣＳ１ｄｎ免疫マウスの方が菌数が低く、結核菌防御効果が増強されていた。

本発明が提供することができるＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質発現ベクターを用いて作製された組換えＢＣＧ菌は、菌体外にＳＯＣＳ１ｄｎタンパク質を分泌することができ、マクロファージや樹状細胞におけるサイトカインおよびケモカイン産生誘導能を増強させ得る。それ故、本発明が提供することができる組換えＢＣＧワクチンを有効成分とするＢＣＧワクチンは、結核ワクチンの有効性が増強され、近年、蔓延が危惧される多剤耐性結核菌に関する有望な結核予防ワクチンであり得る。

Claims (9)

1. 発現ベクターが、
   ａ）サイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）のキナーゼ阻害領域のフェニルアラニンがアスパラギン酸に１アミノ酸置換された変異体タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
   ここでキナーゼ阻害領域の１アミノ酸置換の位置は、配列番号１の塩基配列がコードする変異体タンパク質アミノ酸配列のＮ末から５９位に対応する位置である、
   ｂ）ＳＰ２、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０及びＡｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂからなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子の転写プロモーターの塩基配列からなるＤＮＡ、
   ｃ）ｂｌａＦ、ｂｌａＣ、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ及びＭＰＢ６４からなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子のシグナルペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
   ｄ）ＳＤ配列からなるＤＮＡ、及び、
   ｅ）ｈｓｐ６０、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂ及びＭ． ｋａｎｓａｓｉｉ由来α抗原からなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子の転写ターミネーターの塩基配列からなるＤＮＡ
   を含む、ｐＳＯ２４６の大腸菌−抗酸菌シャトルベクターであることを特徴とする、発現ベクター。
2. カナマイシン耐性遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の発現ベクター。
3. シグナルペプチドをコードする塩基配列が、ｂｌａＦシグナル配列である、請求項１又は２に記載の発現ベクター。
4. 転写ターミネーターをコードする塩基配列が、Ａｎｔｉｇｅｎ ８５Ｂターミネーター配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクター。
5. １アミノ酸置換されたサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）をコードする塩基配列が配列番号１である、請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクター。
6. 請求項１〜５のいずれかの発現ベクターを、ＢＣＧ菌に導入して得られた組換えＢＣＧ菌。
7. 請求項６に記載の組換えＢＣＧ菌を含有する、ＢＣＧワクチン。
8. サイトカインとケモカインの産生誘導能を増強させる、請求項７に記載のワクチン。
9. 請求項６に記載のＢＣＧ菌を含む、結核発症予防用組成物。