BR102012021809B1 - Utilização de mycobacterium bovis bcg auxotrófico superexpressando ag85b como agente terapêutico e/ou imunoterapêutico para câncer de bexiga - Google Patents

Abstract

utilização de mycobacterium bovis bcg auxotrófico superexpressando ag85b como agente terapêutico e/ou imunoterapêutico para câncer de bexiga. a presente invenção refere-se à utilização de cepa de bcg pasteur auxotrófico como agente terapêutico e/ou imunoterápeutico para carcinomas de bexiga. a presente invenção se refere a uma cepa vacinal de mycobacterium bovis bcg auxotrófico e superexpressando o antígeno ag85b de m. bovis (rbcg pasteur (delta)leud/ag85b). a cepa vacinal da presente invenção é uma cepa auxotrófica para o aminoácido leucina, derivada da subcepa bcg pasteur e complementada para leucina após transformação genética. a utilização da cepa rbcg pasteur (delta)leud/ag85b para o tratamento terapêutico e/ou imunoterapêutico de câncer superficial de bexiga in vitro é demonstrada na presente invenção através de ensaio de citotoxicidade utilizando a técnica colorimétrica mtt; bem como através de análise da expressão gênica de linhagem celular de câncer superficial de bexiga. a presente invenção se mostra eficaz para utilização como tratamento terapêutico e/ou imunoterapêutico para câncer de bexiga in vitro. em adição, a presente invenção indica substancial aplicação em tratamentos de câncer, servindo de substrato para novos estudos a respeito de sua aplicabilidade clínica, tanto em tratamentos de tumores de bexiga como em outros tipos de tumores.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à construção de cepa geneticamente engenheiradade Mycobacterium bovisBCG Pasteur e seu usocomo agente terapêutico e/ou imunoterápico para carcinomas de bexiga. A construção genética acima mencionada refere-se a uma cepa vacinal de M.bovis BCG auxotrófico e superexpressando o antígeno Ag85B de M. bovis (rBCG Pasteur ΔleuD/Ag85B). A cepa vacinal da presente invenção é uma cepa auxotrófica para o aminoácido leucina, derivada da subcepa BCG Pasteur e complementada para leucina após transformação genética. A eficácia da cepa rBCG Pasteur ΔleuD/Ag85B para o tratamento terapêutico e/ou imunoterapêutico de câncer superficial de bexiga in vitro é demonstrada na presente invenção.

ESTADO DA TÉCNICA

Dos Carcinomas de bexiga

O câncer de bexiga é o quarto tipo de tumor mais comum em homens e o décimo primeiro mais comuns em mulheres. Possui forte impacto econômico no sistema de saúde mundial e é responsável por aproximadamente 5% de todas as mortes por câncer. Em particular, no Brasil a incidência e mortalidade por câncer de bexiga são menores do que aquelas relatadas em países desenvolvidos, embora haja uma tendência de aumento no número de casos nos últimos anos. Segundo estatísticas nacionais, estimam-se aproximadamente 8.900 novos de câncer na bexiga para o ano de 2012.

Cerca de 80% dos tumores vesicais são do tipo carcinoma superficial de bexiga (carcinoma in situ). Este tipo de tumor se caracteriza por possuir altas taxas de recorrência (69-80%) e predisposição para progredir como tumor músculo-invasivo (33-48%). Carcinomas superficiais de bexiga geralmente se originem de uma única hiperplasia urotelial nodular e se tratados precocemente por ressecção cirúrgica e imunoterapiaintravesical a taxa de sobrevida chega a 90% em cinco anos. Tumores invasivos ou músculo- invasivo da bexiga constituem a segunda forma de neoplasia urotelial e acometem aproximadamente 20% dos pacientes vesicais. Caracterizado por sua alta agressividade, este tipo de tumor se origina através de mecanismos de novo ou através de lesões planas de alto grau oriundas dos carcinomas in situ. O tratamento para tumores invasivos constitui de cistectomia radical e quimioterapias sistêmicas, no entanto, as taxas de sobrevida são bastante limitadas, chegando a apenas 6% em dois anos para pacientes metastáticos.

Um dos grandes desafios da terapêutica para carcinomas de bexiga é a identificação de pacientes com carcinomas in situ que irão apresentar recorrência ou progressão invasiva. O tratamento padrão para câncer superficial de bexiga baseia-se em cirurgia endoscópica associada a terapia intravesical complementar, que tem como objetivo principal promover efeito antineoplásicoatravés da estimulação do sistema imunológico e da secreção de citocinas. Instilações vesicais de Mycobacterium bovis BCG representam o tratamento vesical de escolha para este tipo de tumor, visando a eliminação residual da doença e reduzindo o risco de possíveis recidivas e progressões musculares. Aprovada em 1990 pela FDA, a imunoterapia com instilação intravesical de BCG é considerada o tratamento padrão ouro para carcinomas in situ.

Da Imunoterapia

A imunoterapia é uma estratégia alternativa e potencialmente eficaz para tratamento de câncer, baseada na especificidade do sistema imunológico e na sua limitada toxicidade. O conceito de imunoterapia geralmente envolve a geração de uma resposta ativa contra antígenos associados a tumores (TAAs). Dessa forma, constitui um tratamento que promove estimulação do sistema imune por meio do uso de substâncias modificadoras da resposta biológica.

O sistema imunológico é capaz de reconhecer e extinguir lesões pré-cancerosas e cancerosas. Esse reconhecimento é obtido principalmente através de vacinação com peptídeos antigênicos ou através de células dendríticas ativadas. A administração de moduladores imunes, como citocinas, também pode impulsionar a imunidade antitumoral existente e levar células efetoras da vigilância imunológica aos locais de crescimento do tumor. Quando comparada com quimio ou radioterapia, a utilização de tratamento imunoterapêutico apresenta duas vantagens potenciais: (a) especificidade para com a célula-alvo, reduzindo assim os efeitos adversos nos tecidos sadios; e (b) menor interferência em outras terapias, tornando-se um tratamento adjuvante adequado às terapias convencionais. Em tumores de bexiga, a imunoterapia utilizando M. bovis BCG é considerada tratamento de escolha para carcinomas in situ. Além disso, é o único agente conhecido capaz de reduzir as taxas de recorrência e de progressão muscular da doença, obtidas através da ativação do sistema imune.

Da utilização deMycobacterium bovis BCG em câncer

O BacillusCalmette-Guérin (BCG) é uma cepa viva atenuada da bactéria Mycobacterium bovis, utilizada principalmente como vacina para formas graves de tuberculose (BENEVOLO-DE-ANDRADE et al., 2005). Desenvolvido em 1921 por Albert Calmette e CamilleGuérin, o BCG sofreu sucessivos subcultivos, o que resultou na atenuação da cepa original. A utilização dessa vacina em humanos, bem como sua produção em larga escala, ocorreu em 1924, no Instituto Pasteur de Lille, na França (BENEVOLO- DE-ANDRADE et al., 2005)

Os efeitos antitumorais da administração de BCG em tumores de bexiga foram descritos pela primeira vez em 1976 por Morales et al. A inibição do crescimento tumoral após instilação de BCG foi observada e esse efeito foi atribuído primeiramente a uma reação imunológica de hipersensibilidade do tipo tardio (MORALES et al., 1976). Os mecanismos de atuação da bactéria frente a neoplasias passaram a ser mais bem compreendido em 1971 com a publicação de um estudo demonstrando uma redução da implantação e do crescimento tumoral, quando uma nova aplicação de células neoplásicas era realizada subsequente à inoculação de BCG (ZBAR; TANAKA, 1971). Desde então, diversos estudos confirmaram que a aplicação de BCG intravesical é capaz de eliminar células remanescentes, retardar a progressão da doença e melhorar a sobrevida dos pacientes com câncer superficial de bexiga (COE; FELDMAN, 1966; MATHE et al., 1969; LAMM et al., 1980). Em 1990, a FDA aprovou o uso clínico de BCG no tratamento de pacientes oncológicos (AMIRKHAH et al., 2009).

Do BCG recombinante

O sucesso do BCG como agente imunoterápico vem promovendo o desenvolvimento de pesquisas que buscam maneiras de manter ou melhorar sua eficácia terapêutica, porém reduzindo o perfil de efeitos colaterais (ANDRADE etal., 2010). Embora seja considerada a terapia intravesical mais eficaz no tratamento de tumores superficiais de bexiga, alguns problemas podem ocorrer levando ao surgimento de tumores intolerantes, resistentes ou recorrentes (GONTERO et al., 2010). Além disso, em alguns casos algumas complicações ocorrem em decorrência da utilização de uma bactéria viva, levando ao aparecimento de sintomas como febre, cistite, pneumunites e, em casos mais graves, sepse por BCG (LAMM, 1992; SUTTMANN et al., 2006).

Nesse sentido, algumasestratégias vem sendo desenvolvidas visando melhorias para o tratamento de carcinomas superficiais de bexiga (SCHENK-BRAAT; BANGMA, 2005). As mais utilizadas incluem: utilização de doses diminutas da vacina; a administração de citocinas inflamatórias em conjunto com BCG; identificação dos componentes micobacterianos responsáveis pela resposta imunológica, evitando, assim, a utilização do bacilo vivo, o que diminuiria os riscos de reações graves ou infecções; e a construção de cepas recombinantes (SCHENK-BRAAT; BANGMA, 2005).

A construção de cepas recombinantes que proporcionem maior estímulo do sistema imune e aumento do efeito antitumoral da bactéria constitui um dos principais focos de pesquisas em melhorias imunoterapêuticas do BCG (AMIRKHAH et al., 2009). Muitos avanços ocorreram nas últimas décadas no que diz respeito à manipulação genética de micobactérias. Estes incluem o estabelecimento de protocolos de transformação em micobactérias, geração de vetores bifuncionais (shuttlevectors) para uso em E. coli e micobactéria, desenvolvimento de sistemas de expressão diversos, incluindo diferentes promotores e sistemas de apresentação de antígenos (MATSUO et al., 1990). Esses avanços permitiram a avaliação de BCG recombinante como veículo de apresentação de antígenos heterólogos e vários estudos já demonstraram a viabilidade do BCG em expressar antígenos heterólogos de diferentes espécies com bastante êxito (BASTOS et al, 2009).

O desenvolvimento de cepas recombinantes de BCG tem demonstrado que essa estratégia é capaz de melhorar a eficácia da terapia para tumores de bexiga. Ensaios realizados utilizando micobactéria recombinantes para citocinas constituem um dos principais focos na busca por tratamentos mais eficientes para carcinomas in situ. Cepasrecombinantes de BCGexpressandocitocinas humanas, especialmente IFNα-2b,se mostram mais eficientes que wtBCG no aumento de citotoxicidade de células tumorais de bexiga quanto na indução de respostas imunes contra essas células(Dinget al, 2012). Os documentos patentários CN1710071 eCN1710072também descrevem a construção de cepas recombinantes de BCG expressando IFN-α e IL-2, respectivamente,e seu uso para imunoterapias com resultados mais eficientesquando comparados a utilização de wtBCG, de citocinassolúveis sozinhas ou da combinação dewtBCG com citocinas solúveis.

Da utilização de Antígeno Ag85B

O complexo AG85, composto pelas proteínas Ag85A, Ag85B e Ag85C, é o principal antígeno compartilhado pelas cepas de M. bovis e M. tuberculosis (WIKER; HARBOE, 1992). Estas proteínas são secretadas e retidas na parede celular das micobactérias (WIKER; HARBOE, 1992) e são capazes de interagir especificamente com fibronectinas (DENIS et al., 1997; NAITO et al., 1998).

Os primeiros relatos a respeito da eficácia de BCG recombinante para vacinas de tuberculose foram explorados utilizando BCG superexpressando antígenos Ag85 (TRICCAS, 2010). Estes antígenos são capazes de conferir proteção contra tuberculose em modelos animais e estão intimamente associados à infectividade da bactéria (MUSTAFA et al., 1998). Por serem antígenos superexpressos, existem evidências de que são capazes de aumentar a geração de peptídeos antigênicos, bem como seus carregamentos subsequentes para as moléculas de MHC II, desencadeando processos imunológicos eficientes que podem levar a apoptose e a autofagia (JAGANNATH et al., 2009).

O uso do antígeno Ag85B para imunoterapia de tumores têm recebido atenção nos últimos anos. Em estudos com modelos murinos de câncer de bexiga, o uso de antígeno Ag85B como vacina de DNA demonstrou diminuição do tamanho tumoral, indução de resposta proliferativa de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e indução células imunes Th1 a secretar citocinas, especialmente IFN-Y(Liu et al, 2008). No entanto, os efeitos das vacinas de DNA utilizando antígenos Ag85B foram inferiores aos resultados utilizando imunoterapia com wtBCG (Liu et al, 2008).

A expressão de proteínas fusionadas ao antígeno Ag85B em BCG também é uma estratégia que vem sendo explorada como alternativa para imunoterapia. Lee e colaboradores (2004) fusionaram Ag85B à proteína ESAT6 de micobactérias e administraram combinada com IL-12 solúvel em camundongos portadores de neoplasias de bexiga. Esses autores observaram aumento de resposta imune Th1, alto nível sérico de IFN-y, inibiçãodo crescimento tumoral, e prolongamentoda sobrevida de camundongos portadores de tumor (Lee et al, 2004).Cepa de BCG recombinante expressando o antígeno AG85B fusionado a IL-2 humana também já foi descrita com resultados promissores (patente número CN1544473). Além disso, outras estratégias também utilizam fragmentos gênicos da sequência ‘peptídeo sinal’ de Ag85B como fator de secreção de interleucinas humanas em construções de BCG recombinante para TRAIL (patente número CN102327604) e TNFα (patente número CN1710073).

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve a construção de uma cepa auxotrófica de MycobacteriumbovisBCG Pasteur superexpressando a proteína antígeno Ag85B, e principalmente descrevesua utilização para imunoterapiadeneoplasias da bexiga.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a construção de uma cepa auxotrófica de BCG Pasteur superexpressando a proteína Ag85B, e mais particularmente a sua utilização como agente terapêutico para câncer de bexiga. A eficácia da cepa BCG Pasteur ΔleuD/Ag85B para tratamento de tumores de bexiga in vitro é demonstrada na presente invenção.

Construção da cepa recombinante

Sequências codificadoras para o antígeno Ag85b devem ser amplificadas a partir do gene fbpB do DNA genômico de M. bovis. Os primers utilizados para amplificação do gene fbpB por PCR devem ser baseados na sequência completa do genoma de M. bovis AF2122/97 (5'- GGGGTACCCGCTATGTAGCTCCAATTC-3 'e 5'-GGGGTACCTCAGCCGGCGCC- 3'), e preferencialmente devem ser desenhados utilizando o software Vector NTI 11,0 (Invitrogen ™, Carlsbad, CA, EUA). O cassete gênico, que consiste na região codificadora do gene fbpB e no seu promotor endógeno,deverá ser digerido coma enzima Kpnl(Promega) e inserido no vetor de expressãomicobacteriano pUP410, previamente digerido com a mesma enzima de restrição. Células competentes de E. colidevem ser transformada com o plasmídeo recombinante (pUP410::fbpB) e os clones preferencialmente devem serselecionados por digestão enzimática e PCR.

Células eletrocompetentesde BCG Pasteur auxotrófico para o aminoácido leucina (ΔleuD) devem ser transformadas com o plasmídeo pUP410::fbpB e as cepas recombinante podem ser selecionadas em meio 7H10 contendo 25 ug/ml do antibiótico canamicina. Cepas recombinante BCG ΔleuD (BCG ΔleuD/Ag85B) devem então ser cultivadas em meio seletivo 7H9 até obterem uma densidade óptica de 0,6 a 600 nm (OD600). A expressão da proteína recombinante pelo BCG ΔleuD/Ag85B deverá ser avaliada preferencialmente por Western blot. BCG ΔleuD/Ag85B de cultura líquidadeve ser utilizado para preparação das vacinas de tratamento in vitro de linhagem de câncer superficial de bexiga.

Determinação da citotoxicidade celular

Para validação desta invenção, preferencialmente deve- se utilizar três cepas de M. bovis BCG Pasteur como tratamento para câncer de bexiga: M. bovis BCG Pasteur, cepa semelhante à usada atualmente em clínica para tratamento de pacientes com câncer de bexiga; M. bovis BCG Pasteur ΔleuD, cepa auxotrófica para o aminoácido leucina; e M. bovis BCG Pasteur ΔleuD/Ag85B (rBCG), cepa recombinante de BCG ΔleuDsuperexpressandoo antígeno Ag85B. A viabilidade das células de câncer de bexiga após tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B deve ser determinada preferencialmente através da redução de MTT solúvel [3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-DipHE-nyltetrazolium brometo] para formazano insolúvel. As células devem ser semeadas em placas de 96 cavidades, a uma densidade de 2x104 células por cavidade, em volume de 100 uL, e cultivadas a 37° C em atmosfera de 5% de CO2 durante 24 h. As células são então submetidas ao tratamento com diferentes cepas de BCG (BCG Pasteur ou BCG ΔleuD ou BCG ΔleuD/Ag85B), a uma concentração de 4,8x106 UFC por cavidade, durante 48 horas. Após este período de incubação, os meios devem ser removidos e a análise de citotoxicidadedeve ser feita através da técnica colorimétrica utilizando MTT (Sigma), conforme as instruções do fabricante. As absorbâncias de cada cavidade devem ser lidas preferencialmente em leitor de microplacas a um comprimento de onda de 492 nm. A porcentagem de inibição da proliferação celular deverá ser determinada através da seguinte fórmula: inibição do crescimento = (1 -AbScéluias tratadas/AbScélulas controle) X 100%.

Todas as observações precisam ser validadas por pelo menos três experimentos independentes, em triplicata.

Análise da expressão gênica e tradução proteica

O perfil de expressão gênica das células de câncer de bexiga após 48 h de tratamento com as diferentes cepas de BCG pode ser avaliado, preferencialmente por PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Para validação desta inveçãodevem ser avaliados genes apoptóticos, genes relacionados ao ciclo celular e genes relacionados ao estresse oxidativo. Células tumorais podem ser semeadas em placas contendo 6 cavidades a uma densidade de 2x105 células/cavidade e cultivadas a 37° C em atmosfera umidificada com 5% CO2 durante 24 h. As células são então submetidas ao tratamento com diferentes cepas de BCG (BCG Pasteur ou BCG ΔleuD ou BCG ΔleuD/Ag85B), a uma concentração de 4,8x107 UFC por cavidade, durante 48 horas. Após o período de incubação, as células precisam ser lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS; Gibco) e a extração de RNA deverá ser realizada utilizando TRIzol® (Invitrogen™).Asíntese de cDNAdeve serfeita preferencialmente utilizando-se 1 ug de RNA atravésdo kit High CapacitycDNA Reverse Transcription (AppliedBiosystems™, UK), de acordo com as instruções do fabricante. As reações de qRT-PCRdeverão ser preferencialmente executadas em um Stratagene® Mx3005P™ Real-Time PCR System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), utilizando-se SYBR® Green PCR Master Mix (AppliedBiosystems™, UK) e devem utilizar os primers descritos na Tabela 1.

A detecção da tradução proteica pode ser realizada por Western blot. Células tumorais de bexiga (2x105células/cavidade) devem sertratadas com diferentes cepas de BCG (4,8X107 UFC) por 48 h. Em seguida, estassão sedimentadas por centrifugação, lavadas com PBS, e suspensas em 30μL de tampão de lise. O mix proteicodeve ser submetido à eletroforese durante 2 h em gel de poliacrilamida-SDS 15% e, em seguida, transferido para membrana de nitrocelulose. A membrana deve ser preferencialmente bloqueada overnight com 5% de leite desnatado, e sondada com anticorpos primários para p53, bax e bcl-2 (Sigma-Aldrich).

Detecção de atividade antitumoral da cepa BCG ΔleuD/Ag85B

Os testes de validação desta invenção mostram que a cepa de BCG recombinante auxotrófico superexpressando Ag85B possui capacidade antitumoral frente à linhagem de carcinoma de bexiga. Conforme demonstrado na Fig. 1, a cepa BCG ΔleuD/Ag85B possui significativo potencialantineoplásicoin vitro, após 48 horas de tratamento. A porcentagem de inibição da proliferação do crescimentotumoral foi de 77,8% para o BCG ΔleuD/Ag85B, enquanto para as outras cepas essa inibição foi de 28% (BCG ΔleuD) e 38,1% (BCG Pasteur).

Em particular, a cepa BCG ΔleuD/Ag85B é capaz ainda de promover alteração no padrão de expressão gênica de células de câncer de bexiga. Níveis superiores de expressão de genes pró-apoptóticos (bax, AIF e Endo G), caspases (caspase 3, 8 e 9) e genes relacionados com o ciclo celular (p53 e p21) foram verificados após tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B. Níveis inferiores de expressão de genes antiapoptóticos(bcl-2 e survivin) foram detectados após o mesmo tratamento (Fig. 2). Estas observaçõesnos levam a crer que a cepa da presente invenção está relacionada ao aumento dos níveis apoptóticos em células de câncer de bexiga in vitro, contribuindo para maior eficácia em tratamentos antitumorais.

A cepa de BCG auxotrófico superexpressando Ag85B da presente invenção possui potencial terapêutico para imunoterapia e/ou terapia de câncer superficial de bexiga.Este modelo terapêutico usando BCGrecombinante possui potencial para uma futura aplicação clínica em tratamento de câncer de bexiga. Lista de abreviaturas• BCG — BacillusCalmette-Guérin• wtBCG - BCG do tipo selvage (wild type)• qRT-PCR - PCR em tempo real• BCG ΔleuD - BacillusCalmette-Guérin auxotrófico para o aminoácido leucina• BCG ΔleuD/Ag85B - BacillusCalmette-Guérin auxotrófico para o aminoácido leucina e superexpressando antígeno Ag85B• 5637 - linhagem celular de carcinoma de bexiga• T24 - linhagem celular de carcinoma de células de transição• IL-1 - Interleucina-1• IL-2 - Interleucina-2• IL-6 - Interleucina-6• IL-10 - Interleucina-10• IL-12 - Interleucina-12• IFN—Y — Interferongama • IFN-α — Interferonalpha

EXEMPLOS

Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos são agora apresentados exemplos de possíveis combinações para esta invenção. De acordo com as potenciais aplicações da presente invenção e de forma somente ilustrativa, sem a intenção de limitar em qualquer circunstância a abrangência da presente invenção, são descritos a seguir possíveis utilizações para a mesma.

EXEMPLO 1

- Determinação da citotoxicidade celular por BCG ΔleuD/Ag85B em linhagem de carcinoma de células transicionais (T24)Devem ser utilizados cultivos bacterianos em meio líquido (2x106 UFC mL-1) para preparação dos tratamentos. Placas de cultivo contendo a linhagem celular T24devem ser inoculadas com tratamento de BCG ΔleuD/Ag85B durante 48 h. A viabilidade dalinhagem celular de câncer de bexiga T24deve ser determinada preferencialmente através da redução de MTT solúvel [3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- DipHE-nyltetrazolium brometo] para formazano insolúvel, após tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B. As células devem ser semeadas em placas de 96 cavidades, a uma densidade de 2x104 células por cavidade, em volume de 100 uL, e cultivadas a 37° C em atmosfera de 5% de CO2 durante 24 h. As células são então submetidas ao tratamento com diferentes cepas de BCG (BCG Pasteur ou BCG ΔleuD ou BCG ΔleuD/Ag85B), a uma concentração de 4,8x106 UFC por cavidade, durante 48 horas. Após este período de incubação, os meios devem ser removidos e a análise de citotoxicidadedeve ser feita através da técnica colorimétrica utilizando MTT (Sigma), conforme as instruções do fabricante. As absorbâncias de cada cavidade devem ser lidas preferencialmente em leitor de microplacas a um comprimento de onda de 492 nm. A porcentagem de inibição da proliferação celular deverá ser determinada através da seguinte fórmula: inibição do crescimento = (1 - Abscélulas tratadas/Ab scélulas controle) x 100%. Todas as observações precisam ser validadas por pelo menos três experimentos independentes, em triplicata.

EXEMPLO 2

- Testes de regressão tumoral e resposta imune in vivo após utilização de BCG ΔleuD/Ag85BCarcinomas vesicais devem ser induzidos em camundongosBalb/c conforme descrito abaixo. Células de carcinoma de bexiga (5637) devem ser utilizadas na implantação tumoral dos camundongos, na concentração de 5x105 células/camundongo. Os camundongos devem ser anestesiados preferencialmente com injeção intraperitoneal de 100 μl de uma solução de ketamina (1,5 mg/100 μl) e xilazina (0,1 mg/100 μl). Em seguida, os animais são submetidos à cateterização transuretral, seguida de lesão do epitélio vesical com 0,3 M de nitrato de prata e instilação intravesical de 0,1 mL de suspensão de células 5637 (5x105 células/camundongo).

Após avaliação do estabelecimento tumoral, os animais devem ser submetidos ao tratamento com diferentes concentrações deBCG ΔleuD/Ag85B, visando a regressão tumoral. O delineamento experimental dos grupos de tratamento deve conter grupos controle recebendo apenas solução salina. Os animais devem serinoculadospreferencialmente com injeções intravesicais, uma vez por semana durante um mês, sendo aplicado em volume de 100μl. Após esse período, testes de avaliação de resposta imune, tanto humoral quanto celular, bem como testes morfológicos de regressão tumoral, devem ser realizados. A avaliação morfológica de regressão tumoral deverá feita através da medição de tamanho e peso do tumor.

Os testes de avaliação da resposta imune humoral deverão ser feitos preferencialmenteatravés de ELISA indireta, utilizando como antígeno a p53 recombinante. Para a realização do ELISA amostras de sangue podem ser coletadas através de punção do plexo venoso retro-ocularno início do experimento e antes das aplicações (dia 0), durante (15 dias após o início) e após as aplicações (no dia 30 e 15 dias após o término). O soro separado deve ser processado e congelado a - 70°C até a efetivação das análises.A resposta imune celular pode ser avaliadapreferencialmente pela quantificação de mRNA das principais citocinas utilizando RNA extraído de cultivo de esplenócitos dos animais inoculados com a cepa de BCG da presente invenção. A quantificação da expressão de mRNA das citocinas deverá ser realizada por PCR em tempo real,conforme descrito acima e o gene GAPDH deve ser utilizado preferencialmente como normalizador da reação.

REFERÊNCIAS PATENTÁRIASCN1710071CN1710072CN1710073CN1544473CN102327604REFERÊNCIAS NÃO-PATENTÁRIASAMIRKHAH, R.; KHANAHMAD, H.; ABOLHASSANI, M.; POOYA, M.; MOVASSAGH, H.; SHOKRGOZAR, M.A. Improvement of bladder cancer immunotherapy by creating a recombinant Bacille Calmette-Gu'erin which secrets p53 protein. Med.Hypotheses, v. 72, p. 754, 2009.ANDRADE, P.M.; CHADE, D.C.; BORRA, R.C.; NASCIMENTO, I.P.; VILLANOVA, F.E.; LEITE, L.C.; ANDRADE, E.; SROUGI, M. The therapeutic potential of recombinant BCG expressing the antigen S1PT in the intravesical treatment of bladder cancer. Urol.Oncol., v. 28, p. 520-525, 2010.BASTOS, R.G.; BORSUK, S.; SEIXAS, F.K.; DELLAGOSTIN, O.A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine, v. 27, p. 6495-6503, 2009.BENEVOLO-DE-ANDRADE, T.C.; MONTEIRO-MAIA, R.; COSGROVE, C.; CASTELLO-BRANCO, L.R. BCG Moreau Rio de Janeiro: an oral vaccineagainsttuberculosis--review. Mem.Inst.Oswaldo Cruz, v. 100, p. 459-465, 2005.COE, J.E.; FELDMAN, J.D. Extracutaneous delayed hypersensitivity, particularly in the guinea-pig bladder. Immunology, v. 10, p. 127-136, 1966.DENIS, O.; LOZES, E.; HUYGEN, K. Induction of cytotoxic T- cell responses against culture filtrate antigens in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin-infected mice. Infect.Immun., v. 65, p. 676-684, 1997.Ding GQ, Yu YL, Shen ZJ, et al. Antitumor effects of human interferon-alpha 2b secreted by recombinant bacillus Calmette-Guérin vaccine on bladder cancer cells. J Zhejiang Univ Sci B. 2012;13(5):335-341. doi:10.1631/jzus.B1100366GONTERO, P.; BOHLE, A.; MALMSTROM, P.U.; O'DONNELL, M.A.; ODERDA, M.; SYLVESTER, R.; WITJES, F. The role of bacillus Calmette-Guerin in the treatment of non-muscle-invasive bladder cancer. Eur.Urol., v. 57, p. 410-429, 2010. JAGANNATH, C.; LINDSEY, D.R.; DHANDAYUTHAPANI, S.; XU, Y.; HUNTER, R.L.; EISSA, N.T. Autophagy enhances the efficacy of BCG vaccine by increasing peptide presentation in mouse dendritic cells. Nat.Med., v. 15, p. 267-276, 2009.LAMM, D.L. Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Urol.Clin.North Am., v. 19, p. 565-572, 1992.LIU JING, KOREA LIANG, YANG XIAOFENG, TIAN PINGGUI, WANG PENG, ZHANG XIAOJUN. Immunotherapeutic effect of Ag85A DNA vaccine and Ag85B DNA vaccine on bladder tumor in rats. Chinese Journal of Cancer Biotherapy, 2008, 15(2):144-149. doi: 10.3872/j.issn.1007-385X.2008.2.010LEE CF, CHANG SY, HSIEH DS, YU DS. Immunotherapy for bladder cancer using recombinant bacillus Calmette-Guerin DNA vaccines and interleukin-12 DNA vaccine. J Urol. 2004;171(3):1343-1347.doi:10.1097/01.ju.0000103924.93206.93MATHE, G.; CATTAN, A.; AMIEL, J.L.; SCHWARZENBERG, L.; SCHNEIDER, M. Experimental therapeutic trials of leukemia and hematosarcomas: technologic and philosophic aspects. Ann.N.Y.Acad.Sci., 164, 776-792, 1969.MATSUO, K.; YAMAGUCHI, R.; YAMAZAKI, A.; TASAKA, H.; TERASAKA, K.; TOTSUKA, M.; KOBAYASHI, K.; YUKITAKE, H.; YAMADA, T. Establishment of a foreign antigen secretion system in mycobacteria. Infect.Immun., 58, 4049-4054, 1990.MORALES, A.; EIDINGER, D.; BRUCE, A.W. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors. J.Urol., v. 116, p. 180-183, 1976.MUSTAFA, A.S.; AMOUDY, H.A.; WIKER, H.G.; ABAL, A.T.; RAVN, P.; OFTUNG, F.; ANDERSEN, P. Comparison of antigen-specific T-cell responses of tuberculosis patients using complex or single antigens of Mycobacterium tuberculosis. Scand.J.Immunol., v. 48, p. 535-543, 1998.NAITO, M.; OHARA, N.; MATSUMOTO, S.; YAMADA, T. The novel fibronectin-binding motif and key residues of mycobacteria. J.Biol.Chem., v. 273, p. 2905-2909, 1998.SCHENK-BRAAT, E.A.; BANGMA, C.H. Immunotherapy for superficial bladder cancer. Cancer Immunol.Immunother., v. 54, p. 414-423, 2005.SUTTMANN, H.; RIEMENSBERGER, J.; BENTIEN, G.; SCHMALTZ, D.; STOCKLE, M.; JOCHAM, D.; BOHLE, A.; BRANDAU, S. Neutrophil granulocytes are required for effective Bacillus Calmette- Guerin immunotherapy of bladder cancer and orchestrate local immune responses. Cancer Res., v. 66, p. 8250-8257, 2006.TRICCAS, J.A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioeng.Bugs., 1, 110-115,2010.WIKER, H.G.; HARBOE, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis.Microbiol.Rev., v. 56, p. 648-661, 1992.ZBAR, B.; TANAKA, T. Immunotherapy of cancer: regression of 10 tumors after intralesional injection of livingMycobacterium bovis. Science, 172, 271-273, 1971.

Claims (2)

1. Uso de uma cepa recombinante de Mycobacterium bovis BCG caracterizada por ser auxotrófica para o aminoácido leucina e superexpressar a proteína antígeno Ag85B do microrganismo Mycobacterium bovis BCG para cultivo in vitro de linhagens de células tumorais e não tumorais, bem como em cultivo de linhagens primárias, sejam elas provenientes de qualquer animal ou humanas.

2. Uso de uma cepa recombinante de Mycobacterium bovis BCG caracterizada por ser auxotrófica para o aminoácido leucina e superexpressar a proteína antígeno Ag85B do microrganismo Mycobacterium bovis BCG para co-cultivo in vitro com linhagem celular de sistema imune e/ou secretora de citocinas.

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