ES2282460T3 - Composciones bacterianas inmunogenicas de celulas completas incapacitadas. - Google Patents
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Abstract
Uso de una composición bacteriana de célula entera incapacitada en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune a un patógeno bacteriano en un sujeto susceptible a una infección por una enfermedad causada por una bacteria patogénica, en donde la composición comprende la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y en donde dicho medicamento se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el hospedador.
Description
Composiciones bacterianas inmunogénicas de
células completas incapacitadas.
La invención se refiere a procedimientos y
composiciones para la producción de composiciones inmunogénicas
bacterianas de células enteras inactivadas, que son muy similares a
los patógenos infecciosos vivos pero no son infecciosas.
El incremento alarmante en la resistencia
bacteriana a los antibióticos disponibles, enfermedades contraídas
en viajes internacionales y las enfermedades infecciosas
recientemente identificadas, han resaltado la necesidad de nuevas
vacunas efectivas. Las vacunas de células enteras inactivadas, son
un componente importante de las aproximaciones que aparecen para
cubrir estas necesidades de salud pública. La administración de
vacunas de células enteras, es uno de los métodos más bien
estudiados de vacunación contra infección bacteriana. Las ventajas
particulares de las vacunas de células enteras incluyen la
presentación de muchos antígenos (incluyendo antígenos protectores
pero todavía indefinidos), opciones mínimas de efectos secundarios
cuando no se dan de manera parenteral, un potencial de virulencia de
cero y un carácter de tipo adyuvante. Los estudios en modelos
animales y en humanos han mostrado inmunogenicidad cuando las
vacunas de células enteras se administran oral o parenteralmente.
También se ha demostrado la protección efectiva contra infecciones
bacterianas respiratorias entéricas y sistémicas. Aunque solamente
la vacuna de tosferina de células enteras inactivadas se ha
utilizado para inmunizar al público en general, otras vacunas de
células enteras tienen el potencial para un uso global.
Existen únicamente dos tipos básicos de vacunas
de células enteras: las vivas atenuadas y las inactivadas. Las
características de las vacunas vivas e inactivadas son diferentes, y
estas características determinan como se usa la vacuna.
Grundling et al., J Bacteriol. 2000 Nov.;
182(21):6082-90, describen el análisis
genético y bioquímico de interacciones de dímeros y oligómeros de la
holina S de lambda, una proteína de membrana pequeña que
permeabiliza la membrana interior a un tiempo precisamente
programado después de la infección y permite que la endolisina
acceda a su sustrato, dando como resultado la lisis de la célula
hospedadora. Mindich et al., J Virol. 1982 Dic;
44(3):1013-20, describen el aislamiento de
mutantes sin sentido del bacteriófago que contiene el lípido
PRDI.
Las vacunas vivas atenuadas se producen al
modificar una bacteria productora de la enfermedad ("salvaje")
en el laboratorio. Las vacunas vivas atenuadas disponibles en los
Estados Unidos incluyen virus vivos y bacterias vivas. Estos virus o
bacterias salvajes se atenúan o se debilitan en el laboratorio
habitualmente mediante cultivo repetido. Con el fin de producir una
respuesta inmune, las vacunas vivas atenuadas deben replicarse
(crecer) en la persona vacunada. Se da una dosis relativamente
pequeña del virus o bacteria, la cual se replica en el cuerpo y se
incrementa hasta un gran volumen suficiente para estimular una
respuesta inmune. Cualquier cosa que dañe al organismo vivo en el
vial (por ejemplo, calor, luz) o interfiera en la replicación del
organismo en el cuerpo (anticuerpo circulante) puede causar que la
vacuna sea ineficaz. Aunque las vacunas vivas atenuadas se replican,
habitualmente no provocan enfermedad, tal como puede suceder con el
organismo natural ("salvaje"). Cuando una vacuna viva atenuada
provoca una "enfermedad", es habitualmente mucho más moderada
que la enfermedad natural y se refiere como una reacción adversa. La
respuesta inmune a una vacuna viva atenuada es virtualmente idéntica
a aquella producida por una infección natural. El sistema inmune no
diferencia entre una infección con una bacteria de vacuna
debilitada y una infección con una bacteria de tipo salvaje. Las
vacunas vivas atenuadas son generalmente efectivas con una dosis
excepto aquellas que se administran oralmente.
Sin embargo, las vacunas vivas atenuadas
encuentran diversas limitaciones. Primero, las vacunas vivas
atenuadas pueden provocar reacciones fatales o severas como
resultado de una replicación descontrolada (crecimiento) del virus
de vacuna. Esto sucede sólo en personas con inmunodeficiencia (por
ejemplo, de leucemia, tratamiento con ciertos fármacos o infección
por VIH). Además dependiendo de como se genera la cepa de la vacuna,
una vacuna atenuada viva puede algunas veces revertirse a su forma
patogénica original (que causa la enfermedad). Hasta la fecha, esto
solamente se sabe que sucede con la vacuna de polio viva. La
inmunidad activa de una vacuna viva atenuada puede no desarrollarse
debido a la interferencia del anticuerpo en circulación con el virus
de la vacuna. El anticuerpo de cualquier fuente (por ejemplo, a
través de la placenta, transfusión) puede interferir en el
crecimiento del organismo de vacuna, y conduce a una no respuesta a
la vacuna (también conocida como fallo de vacuna). El virus de la
vacuna del sarampión parece ser más sensible al anticuerpo en
circulación. Los virus de la vacuna del rotavirus y de la polio
están menos afectados. Las vacunas vivas atenuadas son lábiles y se
pueden dañar o destruir por el calor y la luz. Se deben manejar y
almacenar cuidadosamente. Las vacunas vivas atenuadas actualmente
disponibles, incluyen virus vivos (sarampión, paperas, rubeola,
polio, fiebre amarilla, vaccinia y varicela), y dos vacunas
bacterianas vivas (BCG y tifoidea oral).
Las vacunas inactivadas pueden estar compuestas
de virus o bacterias completos o fracciones de cada uno. Las vacunas
fraccionadas están basadas en proteínas o en polisacáridos. Las
vacunas basadas en proteínas incluyen toxoides (toxinas bacterianas
inactivadas) y productos de subunidad. La mayoría de las vacunas
basadas en polisacáridos, se componen de un polisacárido de pared
celular puro procedente de las bacterias. Las vacunas de
polisacáridos conjugados son aquellas en las cuales el polisacárido
se une químicamente a una proteína. Esta unión hace al polisacárido
una vacuna más potente. Estas vacunas se producen mediante
crecimiento de las bacterias en medios de cultivo, luego se
inactivan con el calor y/o productos químicos (habitualmente
formalina). En el caso de las vacunas fraccionadas, el organismo se
trata además para purificar solamente aquellos componentes a ser
incluidos en la vacuna (por ejemplo, la cápsula de polisacáridos de
neumococo).
Las vacunas inactivadas no están vivas y no se
pueden replicar. La dosis completa del antígeno se administra en la
inyección (en comparación con las vacunas atenuadas vivas, que
proporcionan dosis adicionales con la replicación en el hospedador).
Las vacunas inactivadas no pueden provocar una enfermedad por la
infección, incluso en una persona inmunodeficiente. A diferencia de
los antígenos vivos, los antígenos inactivados no se ven afectados
habitualmente por el anticuerpo en circulación. Las vacunas
inactivadas se pueden dar cuando el anticuerpo está presente en la
sangre (por ejemplo, en la infancia o después de recibir productos
sanguíneos que contienen anticuerpos). Las vacunas inactivadas
siempre requieren múltiples dosis. En general la primera dosis no
produce una inmunidad protectora sino que solamente "activa" el
sistema inmune. Una respuesta inmune protectora se desarrolla
después de la segunda o tercera dosis.
A diferencia de las vacunas vivas, en las cuales
la respuesta inmune se asemeja cercanamente a una infección natural,
la respuesta inmune a una vacuna inactivada es principalmente
humoral. Resulta en poca o ninguna inmunidad celular. Las
concentraciones de anticuerpos contra antígenos inactivados
disminuyen durante el tiempo. Como resultado, algunas vacunas
inactivadas pueden requerir dosis complementarias periódicas para
incrementar o reforzar las concentraciones de anticuerpo. En algunos
casos el antígeno crítico para la protección contra la enfermedad
puede no estar definido, requiriendo así el uso de vacunas de
"células enteras". Las vacunas inactivadas actualmente
disponibles incluyen virus enteros inactivados (influenza, polio,
rabia, hepatitis A) y bacterias completas inactivadas (tosferina,
tifoidea, cólera, peste). Las vacunas "fraccionadas" incluyen
subunidades (Hepatitis B, influenza, tosferina acelular, tifoidea
Vi, enfermedad de Lyme), toxoides (difteria, tétanos, botulinum),
polisacáridos puros (neumococos, meningococos, Haemophilus
influenzae de tipo b), y conjugados de polisacáridos
(Haemophilus influenzae de tipo b y neumococos).
En resumen se reconoce que cuanto más similar
sea una vacuna a la enfermedad natural, mejor es la respuesta inmune
a la vacuna. Aunque las vacunas atenuadas son más prometedoras a
este respecto, poseen riesgos de enfermedad en hospedadores
inmunocomprometidos y la reversión a organismos patogénicos de tipo
salvaje. Las vacunas inactivadas evitan estos problemas, pero
todavía pueden ser menos deseables que estas vacunas no imiten una
infección natural, y entonces no pueden producir una respuesta
inmune relevante o producir una respuesta inmune protectora tan
robusta como se pudiera desear.
Así existe una necesidad en el campo de vacunas
bacterianas seguras, que se asemejen al organismo infeccioso más
cercanamente que las vacunas inactivadas pero que tengan un riesgo
reducido o no significativo de provocar una enfermedad en el sujeto
vacunado. La presente invención atiende esta necesidad.
La invención se refiere a composiciones
inmunogénicas bacterianas de células enteras incapacitadas,
producidas por la infección de un bacteria con un bacteriófago Lys
menos (en inglés "Lys minus bacteriophage") que es
deficiente en la proteína de lisina. El bacteriófago Lys menos es
incapaz de facilitar una lisis eficiente del hospedador bacteriano,
ya que la actividad enzimática de la lisina del fago se necesita
para la degradación enzimática de la capa de peptidoglicano de la
pared celular bacteriana. El bacteriófago Lys menos conserva su
actividad en la infección de su hospedador bacteriano adecuado, la
destrucción de genoma bacteriano y la replicación que son
suficientes para inhibir el crecimiento y replicación bacterianas.
La bacteria resultante infectada con Lys menos, se proporciona en un
estado de bacteriostasis, y no es capaz de replicarse más (por
ejemplo, está incapacitada). A continuación, se puede usar la
bacteria incapacitada para obtener una respuesta inmune para
propósitos profilácticos y/o terapéuticos. Así, la invención se
refiere también a bacterias incapacitadas formuladas adecuadamente
para su uso en composiciones inmunogénicas para obtener una
respuesta inmune, por ejemplo, para la producción de anticuerpos en
un hospedador no humano o en una vacuna bacteriana de células
enteras.
En un aspecto, la presente invención proporciona
el uso de una composición bacteriana de células enteras
incapacitadas en la fabricación de un medicamento para provocar una
respuesta inmune a un patógeno bacteriano en un sujeto susceptible a
infección por una enfermedad causada por una bacteria patogénica, en
donde la composición comprende la bacteria patogénica incapacitada
mediante la infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y
en donde dicho medicamento se administra en una cantidad efectiva
para provocar una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el
hospedador.
\newpage
En otro aspecto, se proporciona el uso de una
composición bacteriana de células enteras incapacitadas en la
fabricación de una vacuna para vacunar a un sujeto contra una
enfermedad causada por un patógeno bacteriano, comprendiendo la
vacuna la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un
bacteriófago defectuoso en la lisis, y en donde dicha vacuna se
administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta
inmune a la bacteria patogénica en el sujeto.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona el uso de una composición bacteriana de células enteras
incapacitadas en la fabricación de un medicamento para provocar una
respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, en donde la composición
comprende una bacteria incapacitada mediante infección con un
bacteriófago defectuosos en la lisis, y en donde dicho medicamento
se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta
inmune a un antígeno presente en o en la bacteria.
La invención además proporciona una composición
que comprende una bacteria incapacitada y un excipiente
farmacéuticamente aceptable, en donde la bacteria incapacitada se
produce mediante infección de una bacteria patogénica con un
bacteriófago Lys menos.
En realizaciones específicas de cada uno de los
aspectos anteriores, la bacteria patogénica es de un género
seleccionado del grupo que consiste en Mycobacteria,
Staphylococci, Vibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia,
Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigella, Serratia, Salmonella,
Streptococcus, Klebsiella y Yersinia, y en donde el
bacteriófago inhibe el crecimiento de las bacterias infecciosas. En
realizaciones específicas adicionales de cada uno de los aspectos
anteriores, el bacteriófago defectuoso en la lisis es el
bacteriófago Lys menos.
Un aspecto de la invención, es que se
proporcionan procedimientos para producir una composición
inmunogénica de células enteras bacterianas que están incapacitadas
de manera que mantiene la inmunogenicidad o antigenicidad de la
bacteria, pero que no permite la recuperación de la bacteria y la
replicación e infección en el hospedador.
Otro aspecto de la invención, es proporcionar
procedimientos y composiciones para efectuar una respuesta inmune
protectora contra infecciones bacterianas, particularmente
infecciones por bacterias patogénicas.
Una ventaja de la invención es que las bacterias
incapacitadas por infección con los bacteriófagos Lys menos, no son
capaces de recuperarse de la bacteriostasis con la eliminación del
bacteriófago libre. Así, las vacunas bacterianas incapacitadas se
asocian con un riesgo sustancialmente reducido de provocar la
enfermedad en un hospedador vacunado en comparación con las vacunas
vivas atenuadas.
Otra ventaja de la invención es que el antígeno
contra el cual se desea una respuesta inmune, cuando se produce en
bacterias incapacitadas por fagos, no se modifica significativamente
en términos de los antígenos presentes en la superficie de células
bacterianas, o en términos de los antígenos que se proporcionan como
inclusión o cuerpos agregados dentro de las bacterias que son
procesados por el sistema inmune, por ejemplo, a continuación de la
fagocitosis de la bacteria por un macrófago. En contraste, la
inactivación bacteriana inducida químicamente puede resultar en la
reticulación de proteínas de superficie y una modificación química e
irreversible del antígeno.
Estos y otros objetivos, ventajas y
características de la invención, serán evidentes para aquellas
personas expertas en la técnica con la lectura de los detalles de
las composiciones de la invención y sus métodos de uso tal como se
describen más completamente a continuación.
La figura 1 es un esquema que muestra el uso de
un hospedador bacteriano que tiene un plásmido con un gen de lisina
mutante, para uso en la producción de un bacteriófago Lys menos de
la invención.
La figura 2 ilustra el SDS-PAGE
de los productos de los genes producidos por los plásmidos pGMB011 y
pGMB021 (carril 1: pGMB11, sin inducir; carril 2: pGMB011, inducido;
carril 3; pGMB021, sin inducir; carril 4: pGMB021, inducido; carril
5: marcador 14-97 kDa).
La figura 3 ilustra los resultados de la PCR de
la construcción pGMB021 usada para experimentos de recombinación
(carril 1: cebadores GMB1/GMB2; carril 2: cebadores GMB2/GMB5;
carril 3: marcadores; carril 4: cebadores GMB5/GMB6).
La figura 4 ilustra la PCR de placas turbias
producto del gen GFP (carriles 1-5, 7, 8, 17 y 18:
pools positivos para el producto del gen GFP; carriles 6,
11-16; pools negativos para el producto del gen GFP;
carriles 9, 19: control positivo; carriles 10, 20: marcador de
PM).
La figura 5 representa la PCR de placas turbias
para el producto de gen
lisina-GFP-lisina (carriles
1-6: placas turbias #1, 2, 3, 4, 7, 8: carril 7:
control positivo para el producto
lisina-GFP-lisina (ADN plásmido);
carril 8: marcador PM; carril 9: control positivo para el producto
de lisina (ADN plásmido); carril 10: control negativo).
La figura 6 ilustra lisados de fagos
recombinantes con moteados en una capa de E. coli que muestra
niveles diferentes de contaminación con el fago de tipo salvaje o la
ausencia total de placas salvajes (mancha #1: lisado #11 que muestra
un número contable de placas salvajes; mancha #2: lisado que muestra
un alto número de placas salvajes que lisan completamente las
células; mancha #3: lisado que no muestra ninguna de las placas
salvajes).
La figura 7 ilustra un fago recombinante que
contiene los lisados moteados en una capa de E. coli que
muestra la ausencia de placas.
La figura 8 ilustra lisados que contienen fagos
recombinantes (RP) que conducen a la pérdida de viabilidad de las
células E. coli infectadas (cuadrante #1: \sim50% de
pérdida de viabilidad observada con el lisado RP #33; cuadrantes #2
y 4: pérdida total de viabilidad en el caso de los lisados RP #34 y
#36; cuadrante #3: ninguna pérdida significativa de viabilidad con
el lisado RP #35).
Antes de que se describa la presente invención,
se debe entender que esta invención, no está limitada a una
metodología, protocolos, bacteriófagos, patógenos bacterianos,
especies o géneros animales, construcciones y reactivos particulares
descritos, como tales pueden por supuesto variar. También se debe
entender, que la terminología usada en la presente es para el
propósito de describir solamente realizaciones particulares, y no se
pretende que sea limitante ya que el alcance de la presente
invención estará solamente limitado por las reivindicaciones
anexas.
En donde se proporciona un rango de valores, se
entiende que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del
límite inferior a menos que el contexto lo dicte claramente de otra
manera, entre los límites superior e inferior del rango también se
describe específicamente. Cada rango más pequeño entre cualquier
valor indicado o valor intermedio, en un intervalo establecido, y
cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo
establecido está englobado dentro de la invención. Los límites
superior e inferior de estos intervalos más pequeños, se pueden
incluir independientemente o excluir del intervalo, y cada intervalo
en donde alguno, ninguno o ambos límites están incluidos en los
intervalos más pequeños también está incluido dentro de la
invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el
intervalo establecido. En donde el intervalo establecido incluye uno
o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de
esos límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente, tienen el
mismo significado como se entiende comúnmente por alguien experto en
la técnica a quien pertenece esta invención. Aunque se pueden usar
cualquiera de los procedimientos y materiales similares equivalentes
a los aquí descritos en la práctica o probando la presente
invención, se describen ahora los procedimientos y materiales
preferidos.
Se debe indicar que como se usa en la presente y
en la reivindicaciones anexas, las formas singulares "un",
"y", y "el", incluyen los referentes en plural al menos
que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Así, por ejemplo
la referencia a "un bacteriófago" incluye una pluralidad de
tales bacteriófagos y la referencia a la célula hospedadora, incluye
la referencia a una o más células hospedadoras y equivalentes de las
mismas conocidas por aquellos expertos en la técnica y así
sucesivamente.
Las publicaciones aquí discutidas, se
proporcionan únicamente para su divulgación previa a la fecha de
presentación de la solicitud actual. Nada en la presente se
constituye como una admisión de que la presente invención no está
acreditada por ser anterior a tal publicación en virtud de la
invención previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas
pueden ser diferentes de las fechas de publicación actuales lo cual
puede necesitar que sea confirmado independientemente.
La presente invención proporciona procedimientos
y composiciones para la producción de bacterias de células enteras
inactivadas, bacterias que se generan usando un bacteriófago
defectuoso en la capacidad para lisar la célula hospedadora
bacteriana. Los bacteriófagos son virus altamente específicos que
infectan a las bacterias. Después de la infección de una bacteria
como E. coli por un fago lítico, tal como T4, tiene lugar una
reconfiguración profunda de todas las síntesis macromoleculares. La
polimerasa de ARN RNAP de la bacteria hospedadora se une a los
sitios de inicio del genoma del fago conocidos como genes tempranos
inmediatos (IE) y los transcribe. Algunos de los productos IE
degradan al ADN hospedador (bacteriano) que carece de la base
modificada hidroximetilcitosina (mientras que otro producto, la
ADP-ribosa, se une a las subunidades alfa de RNAP
bacterianas y la hace incapaz de reconocer a los promotores
celulares bacterianos. Esto resulta en el cese de la transcripción
de los genes hospedadores. Estos eventos suceden en los primeros 3 a
5 minutos después de la infección.
En la siguiente etapa el RNAP modificado
reconoce y se une a los genes denominados temprano retrasados (DE)
eliminando así una expresión adicional de los genes IE del fago. Los
productos de genes DE están involucrados en la replicación del
genoma de fagos usando las bases de ADN bacterianas degradadas. Uno
de los productos de los genes DE es un factor sigma nuevo que
provoca que el RNAP hospedador reconozca solamente los genes tardíos
(L) que son los siguientes en ser traducidos. Los genes tardíos
están involucrados en la síntesis de nuevas proteínas de las
cápsides, extremos y fibras de extremo y ensamblan proteínas, todas
las cuales siendo necesarias para ensamblar las partículas de fagos
de progenie. Finalmente el gen de lisozima de los fagos se activa
resultando en la lisis de la célula hospedadora bacteriana y la
liberación del fago de la progenie.
Durante la década anterior, se han investigado
los componentes claves esenciales para la lisis de hospedador por
bacteriófagos. Se reconoce ahora que dos proteínas, una endolisina y
una holina, son necesarias para que suceda la lisis del hospedador.
Las endolisinas son enzimas muralíticas que se acumulan en el
citosol, y las holinas son proteínas de membrana pequeñas que
regulan el acceso de las endolisinas a la pared celular a través de
la membrana citoplásmica (Wang y otros Ann. Rev. Microbiol. 54,
799-825 (2000)). La región de gen de lisis del
bacteriófago lambda se clona en un plásmido
multi-copia, pBH 20 bajo el control transcripcional
del operador lac y la inducción de este "operón de lisis"
conduce a un comportamiento lítico paralelo al de células infectadas
con bacteriófagos (Garrett, J. et al., Mol. Gen. Genet.
182, 326 (1981). Los dos genes de lisis cph1 y cpl1 del
bacteriófago Streptococcal pneumoniae Cp-1, que
codifica la holina y la lisina respectivamente, se han clonado y
expresado en E. coli (Martin et al., J. Bacteriol.
180, 210 (1998)). La expresión de la holina Cph1 resulta en
la muerte de las células bacterianas pero no en la lisis. La
expresión concomitante de tanto la holina como la lisina del fago
Cp-1 en E. coli resultó en lisis celular.
Además, el gen cph1 fue capaz de complementar una mutación lambda
Sam (que lleva una mutación ámbar en el gen de holina) en la cepa no
supresora de E. coli HB101 para liberar la progenie de fagos.
La expresión regulada de los genes S y R de la lisis de fagos lambda
provoca una lisis espectacular de las células de serovar Typhimurium
del Vibrio cholerae y Salmonella enterica (Jain y otros Infect
Immun, 68, 986 (2000).
La presente invención se refiere a bacterias que
están incapacitadas (por ejemplo, no son capaces de replicarse para
soportar una infección en un hospedador), bacterias que se
incapacitan mediante infección con un bacteriófago específico que
carece de uno o más componentes del sistema de lisis del fago. El
fago modificado entra en el hospedador bacteriano, interrumpe las
síntesis macromoleculares del hospedador, se replica en sí mismo
pero no lisa el hospedador bacteriano. Las bacterias infectadas con
fagos están incapacitadas y no pueden esparcir la infección, pero
conservan los epítopos antigénicos en la superficie celular en una
conformación esencialmente nativa y la configuración o expresa el
antígeno como un cuerpo de inclusión o forma agregada, que luego
puede ser procesado por el sistema inmune por ejemplo, a
continuación de la fagocitosis de la bacteria por un macrófago. Las
bacterias infectadas con fagos tienen esencialmente la misma
inmunogenicidad que el patógeno vivo y producen por lo tanto una
respuesta inmune protectora contra el patógeno bacteriano. Así, las
bacterias incapacitadas de la invención son útiles, por ejemplo, en
la producción de una respuesta inmune contra un antígeno de interés
por ejemplo, para la producción de anticuerpos en un animal no
humano, como una vacuna bacteriana de células enteras y
similares.
Los aspectos específicos de la invención se
describirán ahora en mayor detalle.
Por "bacteriófago" y "fago", términos
que se usan intercambiablemente en la presente, significa cualquiera
de una diversidad de virus que tiene una afinidad específica e
infectan bacterias. Estas incluyen así, colifagos, que infectan
Escherichia coli (por ejemplo, el fago lambda y los fagos
uniformes T, T2, T4, y T6). Los fagos están compuestos generalmente
por un recubrimiento de proteína o cápside que encierra al material
genético, ADN o ARN, que se inyecta en la bacteria para la
infección. En el caso de fagos virulentos, todas las síntesis del
ADN, ARN y proteínas del hospedador se suspenden y se usa el genoma
del fago para dirigir la síntesis de los ácidos nucleicos y las
proteínas del fago utilizando el aparato de traducción y
transcripción del hospedador. Estos componentes del fago luego se
autoensamblan para formar nuevas partículas de fago. La síntesis de
la lisozima del fago conduce a la ruptura de una pared celular
bacteriana que libera típicamente una progenie de
100-200 fagos. Los fagos moderados, tales como
lambda, pueden mostrar también este ciclo lítico cuando infectan una
célula, pero más frecuentemente inducen la lisogenia en la cual el
fago se integra en el ADN del hospedador bacteriano para persistir
como un profago. En general el bacteriófago de interés de la
invención son fagos líticos más que fagos moderados.
Por "fago Lys menos" o "bacteriófago Lys
menos", cuyos términos se usan intercambiablemente, significa un
fago deficiente en la proteína de lisina. Los bacteriófagos Lys
menos son incapaces de facilitar una lisis eficiente del hospedador
bacteriano ya que la actividad enzimática de la lisina del fago se
necesita para la degradación enzimática de la capa de peptidoglicano
de la pared celular bacteriana. El bacteriófago Lys menos mantiene
la actividad en la infección de su hospedador bacteriano apropiado,
destrucción del genoma bacteriano, y replicación, que son
suficientes para inhibir el crecimiento y la replicación
bacterianos. El fago Lys menos incluye aquellos generados por
mutación o eliminación del gen que codifica la lisina del sistema de
lisis de fago. El fago Lys menos, abarca el fago defectuoso en
lisina debido a la eliminación de todo o una parte del ácido
nucleico que codifica la lisina, de manera que no se produce lisina
detectable, o se produce una forma truncada de la lisina la cual
tiene una actividad reducida para facilitar la lisis (por ejemplo,
la lisina truncada no es efectiva en la promoción eficiente de la
lisis del hospedador bacteriano o no facilita ninguna actividad de
lisis mediada por lisina de tipo salvaje detectable). El fago Lys
menos también incluye aquellos en los que un ácido nucleico que
codifica la lisina se une operativamente a un promotor inducible de
manera que tiene lugar la producción de lisina a un nivel efectivo
para inducir la lisis sólo cuando está en presencia de un agente que
activa el promotor inducible. Preferiblemente, el agente inductor es
uno que normalmente no se encuentra en el hospedador
a ser tratado usando el fago, por ejemplo, el inductor no es un agente que es endógeno al hospedador ser a tratado.
a ser tratado usando el fago, por ejemplo, el inductor no es un agente que es endógeno al hospedador ser a tratado.
El fago Lys menos, también incluye un fago que
produce la proteína de lisina modificada, cuya lisina es deficiente
para promover la lisis bacteriana debido a la presencia de una o más
mutaciones. Tales mutaciones incluyen al menos una, o una
combinación de una o más, eliminaciones, sustituciones, adiciones o
inserciones de ácido nucleico, que resultan en una alteración en la
correspondiente secuencia de aminoácido de la proteína de lisina
codificada. Así, el fago Lys menos abarca generalmente fagos en los
cuales el gen de lisina está completa o parcialmente eliminado para
el gen de lisina o modificado de otra manera (por ejemplo, por
adición, sustitución o reemplazo de los nucleótidos codificantes)
para proporcionar una expresión sustancialmente disminuida o ninguna
expresión de la lisina funcional. El fago Lys menos también se puede
reproducir inhibiendo la función de la lisina en un hospedador a
través de la expresión del ARN de interferencia (por ejemplo,
antisentido) o la producción de péptidos inhibidores en la célula
hospedadora, los ARN de interferencia o péptidos inhibidores
pudiendo ser producidos por esas células (por ejemplo, a
partir
de una célula bacteriana hospedadora modificada genéticamente) o a partir de un ácido nucleico liberado de fagos.
de una célula bacteriana hospedadora modificada genéticamente) o a partir de un ácido nucleico liberado de fagos.
Por "incapacitado" en el contexto de una
célula bacteriana incapacitada producida de acuerdo con la
invención, significa que la célula bacteriana está en un estado de
bacteriostasis irreversible. Aunque la bacteria conserva su
estructura, y conserva así por ejemplo, la inmunogenicidad,
antigenicidad y/o interacciones ligando-receptor
asociadas con una bacteria de tipo salvaje, no es capaz de
replicarse debido a la presencia de un fago infeccioso dentro de la
célula bacteriana.
Por "aislado" significa que el material es
al menos un 60%, en peso libre de proteínas y moléculas orgánicas
que se encuentran de manera natural con las cuales se asocia de
manera natural. Preferiblemente, el material es al menos un 75%, más
preferiblemente al menos un 90%, y más preferiblemente al menos un
99% en peso de material de interés. "Aislado" incluye de esta
manera preparaciones que se enriquecen del material deseado.
Los términos "polinucleótidos" y "ácido
nucleico", usados intercambiablemente en la presente, se refieren
a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea
ribonucleótidos o desoxinucleótidos. De esta manera, los términos
incluyen pero no se limitan a, ADN o ARN de estructura de cadena
múltiple, doble o única, ADN genómico, híbridos de
ADN-ARN, ADNc o un polímero que comprende bases
purina y pirimidina u otras bases de nucleótido derivados, no
naturales, modificados químicamente o bioquímicamente o
naturales.
Los términos "polipéptidos" y
"proteína", usados intercambiablemente en la presente, se
refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier
longitud, que pueden incluir aminoácidos codificados y no
codificados, modificados químicamente o bioquímicamente (por
ejemplo, modificación post-traduccional tal como
glicosilación), o aminoácidos derivados, polipéptidos poliméricos, y
polipéptidos que tienen estructuras de péptidos modificados. El
término incluye proteínas de fusión, incluyendo pero no limitándose
a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga,
fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin
residuos de metionina N-terminales; proteínas
etiquetadas inmunológicamente y similares.
El término "polinucleótido recombinante"
tal y como se usa en el presente documento, se dirige a un
polinucleótido de un origen genómico, ADNc, semisintético, o
sintético el cual en virtud de su origen, o manipulación: (1) no
está asociado con toda o una porción de un polinucleótido al cual se
asocia en la naturaleza, (2) se enlaza a un polinucleótido diferente
al que se une en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la
naturaleza.
"Células hospedadoras recombinantes",
"células hospedadoras", "células", "líneas
celulares", "cultivos celulares", y otros términos denotan
microorganismos o células eucariotas superiores cultivadas como
identidades unicelulares con referencia a las células que pueden, o
tienen, que ser usadas como receptores del vector recombinante u
otro ADN de transferencia e incluye la progenie de la célula
original que se ha transfectado. Se debe entender que la progenie de
una única célula parental puede no ser necesariamente idéntica
completamente en morfología, o el complemento de ADN genómico o
total, que la precursora original, debido a la naturaleza, mutación
deliberada o accidental.
"Unido operativamente" se refiere a una
yuxtaposición en donde los componentes de esta manera descritos
están en una relación que permite que funcionen en su manera
pretendida. Una secuencia control "unida operativamente" a una
secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la
secuencia codificante se consigue bajo condiciones compatibles con
las secuencias control.
Un "marco de lectura abierto" (ORF) es una
región de una secuencia de polinucleótido que codifica un
polipéptido; esta región puede representar una porción de una
secuencia codificante o una secuencia codificante total.
Una "secuencia de codificación" es una
secuencia de polinucleótido que se transcribe en ARNm y/o se traduce
en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias
reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación
se determinan por un codón de inicio de la traducción en el extremo
5' y un codón de finalización de la traducción en la extremo 3'. Una
secuencia de codificación puede incluir pero no se limita a
secuencias de ARNm, ADNc y de polinucleótido recombinantes.
"Heterólogos" significa que los materiales
se derivan de diferentes fuente (por ejemplo, de diferentes genes,
diferentes especies etc).
"Transformación", como se usa en la
presente se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en
una célula hospedadora, sin tener en cuenta el procedimiento usado
para la inserción, por ejemplo, ingestión directa, transducción,
acoplamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno puede
mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o
alternativamente, se puede integrar en el genoma hospedador.
Los términos "individuo", "sujeto",
"hospedador", y "paciente", se usan intercambiablemente en
la presente y se refiere a cualquier sujeto que tiene una infección
bacteriana que se puede tratar usando el bacteriófago terapéutico de
la invención, y del cual se desea el tratamiento o terapia. Los
sujetos y pacientes mamíferos, particularmente sujetos o pacientes
humanos son de interés particular. Otros sujetos pueden incluir
ganado perros, gatos, conejillos de indias, conejos, ratas, ratones,
caballos y demás.
Los términos "tratamiento", "tratado"
y "tratar" y similares, se usan en la presente para referirse
generalmente a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico
deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir
completamente o parcialmente una enfermedad o síntoma del mismo, y/o
puede ser terapéutico n términos de una estabilización parcial o
completa o cura para una enfermedad y/o efecto o adverso atribuible
a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente
cubre cualquier tratamiento de una enfermedad de un sujeto,
particularmente un sujeto mamífero, más particularmente un humano e
incluye, (a) prevenir que tenga lugar la enfermedad o síntoma en un
sujeto, que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero
que no se ha diagnosticado todavía por tenerlo; (b) inhibir el
síntoma de la enfermedad, esto es, suspender su desarrollo, o
aliviar el síntoma de la enfermedad, esto es, provocar la regresión
de la enfermedad o síntoma.
Por "bacteria infecciosa" significa una
bacteria que tiene una infección establecida en el hospedador, y que
se puede asociar con una enfermedad o un síntoma indeseable como
resultado. Generalmente, las bacterias infecciosas son bacterias
patogénicas.
Por "bacterias resistentes a fármaco" o
"bacterias resistentes a antibióticos" se entiende una cepa
bacteriana que es resistente a la inhibición del crecimiento o a la
muerte por antibiótico. Las bacterias resistentes a multifármacos
son resistentes a dos o más antibióticos. La resistencia a fármacos
puede abarcar por ejemplo, la muerte ineficaz de las bacterias
infecciosas, de manera que al menos permanece una dosis infecciosa
en el sujeto y continúa la infección, resultando en síntomas
continuos de la enfermedad infecciosa asociada o una evidencia
posterior de tales síntomas. También puede abarcar la resistencia a
fármacos la inhibición del crecimiento de bacterias resistentes a
fármacos hasta que dicha terapia de tiempo se descontinúa, después
de lo cual las bacterias comienzan a replicarse y además la
enfermedad infecciosa.
Por "inhibición del crecimiento bacteriano"
en el contexto de la infección de una célula bacteriana con un
bacteriófago Lys menos, significa que después de la infección de las
bacterias el bacteriófago inhibe o interfiere en los mecanismos de
traducción y/o transcripción normales de la célula hospedadora
bacteriana, de manera que las bacterias infectadas no se someten a
una división celular sustancial (replicación) y se provoca que entre
en un estado de bacteriostasis.
El término "inmunidad protectora" significa
que una vacuna, composición inmunogénica, o programa de inmunización
que se administra a un mamífero induce una respuesta inmune que
previene, retrasa el desarrollo de, o reduce la severidad de una
enfermedad que es causada por una bacteria patogénica o disminuye o
elimina por completo los síntomas de la enfermedad.
La frase "una cantidad suficiente para
producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha
preparación" significa que existe una diferencia detectable entre
un indicador medido de respuesta inmune antes y después de la
administración de una preparación de vacuna particular o composición
inmunogénica. Los indicadores de respuesta inmune incluyen, pero no
se limitan a: titulación o especificidad de anticuerpo, como se
detecta por un ensayo tal como el inmunoensayo enlazado a la enzima
(ELISA), ensayo bactericida, citometría de flujo,
inmunoprecipitación, inmunodifusión Ouchter-Lowny;
ensayos de detección de unión de, por ejemplo, "spot",
Western blot o ensayos de antígeno; ensayos de citotoxicidad,
etc.
Los términos "composición bacteriana
inmunogénica", "composición inmunogénica", y "vacuna"
se usan intercambiablemente en la presente para significar una
preparación capaz de provocar una respuesta inmune celular y/o
humoral en un sujeto cuando se administra en una cantidad suficiente
para provocar una respuesta inmune a los epítopos presentes en la
preparación.
Un "antígeno de superficie" es un antígeno
que está presente en la estructura de superficie de una célula
bacteriana (por ejemplo, la membrana exterior, la membrana interior,
el espacio periplásmico, cápsula, pilos, etc.).
El término "inmunológicamente naïve" con
respecto a un patógeno bacteriano particular, significa un individuo
(por ejemplo, un mamífero tal como un paciente humano) que nunca ha
sido expuesto (a través de la infección o administración) al
patógeno bacteriano específico o a una composición de antígeno
derivada de dicha bacteria en cantidades suficientes para provocar
una inmunidad protectora, o si se ha expuesto falla en el montaje de
una respuesta inmune protectora.
Tal y como se usa en el presente documento, el
término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de
polipéptidos que comprenden al menos un sitio de combinación de
anticuerpos. Un "sitio de combinación de anticuerpos" o
"dominio de unión" se forma a partir del plegamiento de
dominios variables de una(s) molécula(s) de anticuerpo
para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de
superficie interna y una distribución de carga complementaria a las
características de un epítopo de un antígeno, lo que permite una
reacción inmunológica con el antígeno. Un sitio de combinación de
anticuerpo puede formarse a partir de un dominio de cadena pesada
y/o ligera (V_{H} y V_{L}, respectivamente), que forman bucles
hipervariables que contribuyen a la unión del antígeno. El término
"anticuerpo" incluye por ejemplo, anticuerpos vertebrados,
anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos alterados,
anticuerpos univalentes, las proteínas Fab y anticuerpos de un único
dominio. Un anticuerpo "anti-idiotipo", se
refiere a un tipo de anticuerpo que imita la estructura de un
antígeno para el cual otro anticuerpo es específico.
Un fago Lys menos útil en la producción de una
bacteria incapacitada, que a su vez es útil en vacunas de la
invención, se puede generar a partir de cualquier bacteriófago de
tipo salvaje, preferiblemente a partir de un fago lítico. De esta
manera, los procedimientos y composiciones de la invención pueden
aplicarse al desarrollo de cualesquiera de una variedad de
bacteriófagos Lys menos que son específicos para cualesquiera de una
variedad de bacterias y de esta manera son útiles en el tratamiento
de una amplia variedad de infecciones bacterianas. Aunque está
contemplado que la presente invención pueda usarse para generar
cualesquiera de una variedad de vacunas bacterianas de células
enteras, cuyas vacunas se pueden usar de manera profiláctica o
terapéutica, ya sea solas o junto con otras terapias (adjuntas o de
presentación única) para infecciones bacterianas.
De particular interés es el desarrollo de
vacunas para especies bacterianas y cepas clínicamente importantes,
particularmente especies y cepas bacterianas resistentes a fármacos.
Ejemplos de estos se listan a continuación. El número de acceso en
la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, MD) para un
ejemplo de bacteriófago de tipo salvaje que infecta las cepas
clínicamente relevantes correspondientes, se proporcionan siguiendo
las cepas que infectan. Tales fagos son ejemplos de aquellos que
pueden modificarse para ser Lys menos para proporcionar un
bacteriófago de acuerdo con la invención. La lista es como
sigue:
- 1.
- Todos los miembros clínicamente importantes de la familia Enterobacteriaceae, incluido pero no limitado a:
- a.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Escherichia, siendo de interés particular E. coli (fago ATCC #23723-B2);
- b.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Klebsiella, siendo de particular interés K.pneumoniae (fago ATCC # 23356-B1).
- c.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Shigella, siendo de particular interés S.dysenteriae (fago ATCC #11456a-B1).
- d.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Salmonella incluyendo S. abortus-equi (fago ATCC #9842-B1), S. typhi (fago ATCC #19937-B1), S. typhimurium (fago ATCC #19585-B1), S, newport (fago ATCC #27869-B1), S. paratyphi-A (fago ATCC #12176-B1), S. paratyphi-B (fago ATCC #19940-B1), S. potsdam (fago ATCC #259578-B2), y S. pollurum (fago ATCC #19945- B1).
- e.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Serratia, más notablemente S. marcescens (Fago ATCC #14764-B1).
- f.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Yersinia, más notablemente Y. pestis (Fago ATCC #11953-B1).
- g.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Enterobacter, más notablemente E. cloacae (Fago ATCC #23355-B1);
- 2.
- Todas las de Enterococci clínicamente importantes, más notablemente E. faecalis (Fago ATCC #19948-B1) y E. faecium (Fago ATCC #19953-B1).
- 3.
- Todas las cepas clínicamente importantes de Haemophilus, más notablemente H. influenzae (el fago ejemplificativo se puede obtener de la Organización Mundial de la Salud (OMS) o de otros laboratorios que los hagan disponibles de forma pública);
- 4.
- Todos los Mycobacteria clínicamente importantes, más notablemente M. tuberculosis (Fago ATCC #25618-B1), M. avium-intracellulare, M. bovis, y M. leprae (fago ejemplificativo comercialmente disponible de la OMS, por medio del Instituto Nacional de Salud Pública y Protección Ambiental, Bilthoven, Países Bajos);
- 5.
- Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis (fago ejemplificativo que se puede obtener de manera pública de la OMS y de otras fuentes);
- 6.
- Todas las Pseudomonads, clínicamente importantes siendo de particular interés P. aeuruginosa (Fago ATCC #14203-B1);
- 7.
- Todos los Staphylococci, clínicamente importantes siendo de particular interés S. aureus (Fago ATCC#27690-B1) y S. epidermidis (fago ejemplificativo públicamente disponible a través de la OMS, por medio del instituto Colindale en Londres);
- 8.
- Todos los Streptococci, clínicamente importantes siendo de particular interés S. pneumoniae (fago ejemplificativo que se puede obtener públicamente de la OMS o de otras fuentes); y
- 9.
- Vibrio cholera (fago #14100-B1).
Los patógenos bacterianos adicionales, demasiado
numerosos para mencionarse aquí, particularmente aquellos para los
cuales se ha desarrollado una resistencia a fármacos, también pueden
ser susceptibles a terapia de acuerdo con la presente invención. En
resumen, todas las infecciones bacterianas provocadas por bacterias
para las cuales hay un fago correspondiente actualmente disponible,
o para los cuales se puede identificar el fago, se pueden tratar
usando la pre-
sente invención al hacer el fago correspondiente Lys menos, y poner en contacto las bacterias con el fago Lys menos.
sente invención al hacer el fago correspondiente Lys menos, y poner en contacto las bacterias con el fago Lys menos.
También se puede usar un nuevo fago en la
presente invención. Tales fagos novedosos se aíslan continuamente de
desechos de hospitales y de otras fuentes mediante procedimientos
estándar. Típicamente, 9 ml de una muestra de desechos se mezclan
con un 1 ml de caldo 10X LB, se añade 0,1 ml de caldo LB agitado
durante la noche para el crecimiento del cultivo de una cepa
bacteriana diana y se incuba durante la noche a 37°C. Se añade
cloroformo (0,1 ml) y se incuba a 37°C durante 15 minutos con
agitación a 300 rpm. A continuación se centrifuga a 14,000 rpm
durante 20 minutos a 4ºC y el sobrenadante se guarda en tubos
Eppendorf estériles. Estas preparaciones crudas de fagos se
purifican y caracterizan adicionalmente si se necesita.
La lisis de la célula bacteriana hospedadora por
muchos tipos de bacteriófagos, depende de al menos 2 tipos
diferentes de proteínas (Young et al., Microbiol. Rev.
56, 430 (1992)). La degradación de la pared celular
bacteriana se logra por las lisinas. Los ejemplos mejor estudiados
son el producto de gen e T4, una lisozima (Tsugita et al., J.
Biol. Chem. 243, 391 (1968)) y la proteína lambda R, una
transglicosilasa (Garrett et al., Mol. Gen. Genet.
182, 326 (1981)). En la década pasada se han identificado y
caracterizado los genes de lisina de un gran número de
bacteriófagos. Estos incluyen las lisinas del bacteriófago T7
(Inouye et al., Biol. Chem. 248, 7247 (1973)), gp 19
del fago P22 de Salmonella typhimurium (Rennell et
al., Virol. 143, 280 (1985)), phi 29 gp 15 de dos fagos
de las bacterias gram-positivo Lactococcus
lactis y Bacillus subtilis (Garvey et al., Nucleic
Acids Res. 14, 10001 (1986)), el bacteriófago del pneumococo
Cp-1 (Garcia et al., J. Virol. 61,
2573 (1987)), el fago f6 de pseudomonas (Caldentey et al.,
Biochim. Biophys. Acta 1159, 44 (1992)), el gen K del
bacteriófago P2 (Ziermann et al., J. Bacteriol. 176,
4974 (1994)), el gen 17 del bacteriófago P1 (Schmidt et al.,
Bacteriol. 178, 1099 (1996)), las lisinas del bacteriófago de
Listeria monocytogenes, Ply 511 y Ply 518 (Gaeng et
al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 2951 (2000)) así como
diversos fagos que infectan a los lactobacilos (Shearman et
al., Appl. Environ. Microbiol. 60, 3063 (1994)); Henrich
et al., J. Bacteriol. 177, 723 (1995)).
Se dan a continuación lisinas adicionales de
fagos publicadas en la literatura.
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Cuando el gen de lisina de un bacteriófago de
interés no haya sido todavía identificado, se puede lograr dicha
identificación usando procedimientos de rutina en la materia. Los
genes de lisina de los bacteriófagos se pueden identificar mediante
por ejemplo, procedimientos basados en la secuenciación del genoma
de bacteriófagos y la comparación de la secuencia con aquellas del
bacteriófago en la que se ha descrito el gen de lisina. La
comparación de las secuencias de aminoácidos de las lisinas
descritas hasta la fecha, revela tres regiones conservadas (Schmidt
et al., J Bacteriol. 178, 1099 (1996). La primera
región conservada contiene el sitio catalítico con la secuencia EG
y la hendidura del sitio activo. Los genes de lisina de los
bacteriófagos recientemente aislados, o los bacteriófagos en los
cuales no ha sido todavía descrito el gen de lisina, se pueden
identificar y aislar por técnicas de amplificación de ácido nucleico
(por ejemplo, PCR) usando cebadores que corresponden a la secuencia
de nucleótidos de las regiones conservadas de los genes de lisina
conocidos. Al usar las partes conservadas del gen de lisina, los
genes de lisina de cualquier fago se pueden aislar usando oligos
degenerados, homólogos con cualquiera de 2 de 3 regiones
conservadas. Una vez que se forma la secuencia de este producto de
PCR, se pueden diseñar nuevos cebadores para la secuencia de las
regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de
los genes de lisina, usando como plantilla el ADN del fago para la
formación de secuencias.
El fago Lys menos se puede generar de cualquiera
de una diversidad de maneras consistentes con el suministro de un
fago defectuoso en la lisis de acuerdo con la invención.
Preferiblemente, el fago Lys menos se genera modificando el genoma
del bacteriófago de manera que el bacteriófago sea deficiente en la
proteína de lisina de tipo salvaje (Lys) o de manera que el
bacteriófago contenga un gen de lisina funcional unido
operativamente a un promotor inducible. Alternativamente, los
bacteriófagos tienen niveles reducidos de lisina, y de esta manera
velocidades reducidas de lisis, se pueden seleccionar identificando
fagos que infectan las bacterias e inhiben la replicación del
hospedador bacteriano, pero que tiene tasas reducidas de lisis, por
ejemplo, el bacteriófago actúa como agente bacteriostático del
hospedador bacteriano, pero no lisa la célula hospedadora bacteriana
a una velocidad o nivel asociado con un fago de tipo salvaje que no
es deficiente en el sistema de lisis de fagos.
Los bacteriófagos deficientes en la proteína de
lisina (fagos "Lys menos"), incluyen aquellos generados por la
mutación o eliminación del gen que codifica la lisina del sistema de
lisis de fagos. El fago "Lys menos" engloba fagos defectuosos
en lisina debido a la eliminación de toda o de una porción del ácido
nucleico que codifica la lisina, de manera que no se produce ninguna
lisina detectable, o se produce una forma truncada de la lisina que
tiene una actividad disminuida en la facilitación de la lisis (por
ejemplo, la lisina truncada es ineficiente en la promoción de lisis
eficiente del hospedador bacteriano, o no facilita ninguna actividad
de lisis mediada por lisina de tipo salvaje detectable). El fago
"Lys menos" también incluye fagos que producen una proteína de
lisina modificada, lisina que es defectuosa en la promoción de la
lisis bacteriana debido a la presencia de una o más mutaciones.
Dichas mutaciones incluyen al menos una, o alguna combinación de una
o más eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones de ácido
nucleico, que resultan en una alteración de la secuencia de
aminoácidos correspondiente de la proteína de lisina codificada.
El fago Lys menos también incluye aquellos en
los que el gen que codifica la lisina se ha modificado de manera tal
que el gen se une operativamente a un promotor inducible de manera
que la lisina se produce solamente cuando el fago se pone en
contacto con un agente o condición ambiental (tal como temperatura,
metales, sales, iones, nutrientes, fármacos, etc.) que activa al
promotor inducible. Tal fago Lys menos puede producirse modificando
el gen de lisina de tipo salvaje, para que incluya un promotor
inducible, reemplazando el gen de lisina con un ácido nucleico
codificante de lisina, unido operativamente a un promotor inducible,
o mutando o eliminando el gen que codifica lisina e insertando en el
fago un ácido nucleico codificante de lisina, unido operativamente a
un promotor inducible.
Se puede generar el bacteriófago que tiene
lisina defectuosa usando procedimientos microbiológicos clásicos,
tales como ensayos de morfología de placas (ver por ejemplo,
Streisinger et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
26, 25 (1961)).
También se puede generar el fago Lys menos,
usando técnicas recombinantes tal como la mutagénesis dirigida al
sitio (Smith Ann. Rev. Genet. 19, 423 (1985)), por ejemplo,
usando técnicas de amplificación de ácido nucleico tal como PCR
(Zhao et al., Methods Enzymol. 217, 218(1993))
para introducir eliminaciones sencillas, inserciones y mutaciones
puntuales. Otros procedimientos para la mutagénesis de eliminación
implican, por ejemplo, el uso de la nucleasa BAL31, que acorta
progresivamente un fragmento de ADN de estructura de cadena doble
desde las terminaciones 5' y 3', o la exonucleasa III, que digiere
el ADN diana por la terminación 3' (ver por ejemplo, Henikoff Gene
28, 351 (1984)). El grado de digestión en ambos casos, está
controlado por el tiempo de incubación o la temperatura de reacción
o ambos. Se pueden introducir mutaciones puntuales mediante
tratamiento con mutágenos tal como bisulfito de sodio, que desamina
la desoxicitidina a desoxiuridina lo que resulta en la sustitución
de un par de bases A:T por un par de bases G:C en aproximadamente un
50% de las moléculas plantilla después de una ronda de replicación
(Botstein et al., Science 229, 1193 (1985)).
Otros procedimientos ejemplificativos para
introducir mutaciones puntuales, implican la incorporación
enzimática de análogos de nucleótidos o la incorporación errónea de
nucleótidos normales o alfa-tionucleótidos por ADN
polimerasas (Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79, 1588 (1982)). En la mutagénesis dirigida a
oligonucleótidos, se clona el ADN diana en un vector M13 para
producir una plantilla de ADN de tipo salvaje de estructura de
cadena sencilla, a la cual se hibrida el oligo mutágeno. Esto
produce una región no complementaria (en circuito) en el cebador
oligo o sobre la plantilla, lo que resulta en una inserción o
eliminación respectivamente. Los pares de bases no emparejados entre
la plantilla y el cebador causa mutagénesis puntual. Los
procedimientos de mutagénesis basados en PCR (u otros procedimientos
de mutagénesis basados en técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos), se prefieren generalmente ya que son simples y más
rápidos que las técnicas clásicas descritas más arriba (Higuchi
et al., Nucleic Acids Res. 16, 7351(1988);
Vallette et al., Nucleic Acids Res. 17,
723(1989)).
Se pueden identificar bacteriófagos defectuosos
en lisinas, cribando un fago candidato mediante por ejemplo, la
comparación de la capacidad del fago candidato para lisar un
hospedador bacteriano de tipo salvaje respecto la capacidad del fago
candidato para lisar un hospedador bacteriano recombinante,
modificado para que exprese la proteína de lisina (por ejemplo, por
un fago auxiliar, a partir de un plásmido auxiliar introducido que
codifica la lisina del fago, o a partir de una secuencia codificante
de lisina de una fago recombinante, integrado en el genoma del
hospedador bacteriano). Los fagos candidatos que lisan el hospedador
bacteriano que expresa lisina, pero que falla al efectuar o no
afecta eficientemente la lisis del hospedador bacteriano de tipo
salvaje, representa un fago ejemplificativo Lys menos adecuado para
su uso en la invención.
Una aproximación de particular interés para la
generación de fagos Lys menos que carecen totalmente de la actividad
lisozima del gen de lisina, es eliminar la primera región
conservada que contiene el sitio catalítico y la hendidura del sitio
activo. En base a la secuencia de nucleótidos de la lisina,
se generan los productos de PCR que carecen de la región conservada
I y se transforman en el hospedador bacteriano adecuado junto con el
fago de tipo salvaje. Se puede usar un marcador de selección, tal
como la proteína fluorescente verde de medusas (GFP; Chalfie, M.
et al., Science 263, 802, 1994), en lugar de un
marcador de resistencia al antibiótico. Los marcadores de
resistencia a un antibiótico pueden ser indeseables cuando el fago
puede estar dentro de la vacuna en cierto nivel (por ejemplo, como
contaminante). Las réplicas de las bacterias de resistencia (para
evitar la mutagénesis por UV) se criban a continuación por expresar
GFP bajo luz UV.
En otra realización, el fago Lys menos que tiene
un defecto deseado en el gen de lisina, se generan usando técnicas
de recuperación del marcador. La técnica de recuperación del
marcador se ha utilizado ampliamente para mapear mutaciones en los
fagos, y para transferir mutaciones generadas artificialmente a
partir de los genes de los fagos clonados en un plásmido al genoma
de los fagos (Volker et al., Mol. Gen. Genet. 177,
447(1980)). Un ejemplo del uso de esta técnica, es la
aplicación para identificar genes involucrados en el ensamblaje y
maduración del fago T4. Específicamente, los fragmentos de
restricción que contienen los genes para el ensamble del fago T4 y
de maduración 20 a 22 se clonaron en plásmidos, se sometieron a
mutagénesis y luego se recombinaron las mutaciones de vuelta en el
genoma del fago mediante infección de E. coli que lleva el
plásmido con un doble mutante T4 20/21 am (ámbar) (Volker,
supra, 1980). La progenie del fago que se había sometido a
recombinación con el plásmido, se seleccionó por formación de placas
en un hospedador su^{-} (que carece de un supresor ámbar)
permitiendo la selección del fago recombinante. Estos fagos am^{+}
se separaron a continuación por exclusión de forma no selectiva por
las mutaciones sensibles a temperaturas deseadas en los genes 20 y
21.
Se puede emplear una estrategia similar para el
gen de lisina. El gen de lisina mutante (ya sea un gen de lisina no
funcional o un gen de lisina funcional unido operativamente a un
promotor inducible), que se puede generar usando las técnicas
recombinantes descritas más arriba, se clonan en un plásmido que
tiene un marcador de selección, por ejemplo, resistencia a
ampicilina. Se usan dos tipos de hospedadores bacterianos que
contienen plásmidos con genes de lisina mutante (hospedador de
lisina mutante) o de tipo salvaje (hospedador de lisina WT). Se usa
la cepa anterior que contiene el gen de lisina de tipo salvaje, como
la cepa auxiliar para la producción a gran escala del fago mutante
Lys menos, en donde el fago Lys menos es uno que carece de un gen de
lisina de inducible. Esta última cepa que contiene el gen de lisina
mutante, se usa para introducir las mutaciones Lys en el fago de
tipo salvaje. La Fig. 1 proporciona un esquema de una célula
hospedadora bacteriana que tiene un gen de lisina mutante útil en la
generación del fago Lys menos de la invención.
Los hospedadores bacterianos que expresan la
lisina mutante recombinante, para la producción de los fagos Lys
menos (como se ilustra en la figura 1) se pueden generar mediante el
uso de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se
aíslan las secuencias de las regiones que flanquean el gen de lisina
(alrededor de 100 pares base en cada lado) en cada uno de los fagos
a ser mutados. Generalmente, al menos alrededor de una homología de
50 pb es proporcionada a cada lado, flanqueando la región de interés
que codifica el gen de lisina de fagos (Singer (1982) Cell,
31: 25-33). Los ADN que corresponden a la
regiones en dirección cadena arriba y dirección cadena abajo de
cada gen de lisina del fago se aíslan por amplificación de
ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) y se clonan en un plásmido que
tiene un primer marcador de selección (por ejemplo, resistencia a
ampicilina) con un sitio de restricción adecuado entre las dos
regiones para la inserción de un casete de ADN en el cual se expresa
un segundo marcador de selección (por ejemplo GFP) de un promotor
temprano del mismo fago. Este plásmido se introduce en las células
hospedadoras bacterianas adecuadas por transformación y selección
del primer marcador de selección (ejemplificado aquí por la
resistencia ampicilina). Se muestra un plásmido ejemplificativo con
un gen de lisina mutante útil en esta técnica en la Fig. 1.
Alternativamente la construcción del plásmido se puede integrar
genómicamente en el ADN genómico del hospedador bacteriano.
El hospedador bacteriano que contiene el gen de
lisina mutante, se infecta con un fago de tipo salvaje a una baja
multiplicidad de infección. Cuando se replica el fago, alguno de los
fagos se recombinan por un evento doble de cruce con el gen de
lisina mutante en el hospedador bacteriano, para producir el fago
Lys menos. Ya que es probable que la recombinación en cualquier
célula no sea 100% eficiente, puede haber un fago de tipo salvaje en
las mismas células que el fago Lys menos. El virus de tipo salvaje
actuará como un virus auxiliar para provocar la lisis de las células
infectadas tanto si tiene lugar la recombinación como si no.
Los dos tipos de virus se recogen lisando las
células bacterianas con cloroformo, y el fago Lys menos se purifica
del virus del tipo salvaje mediante purificación en placas. El virus
de cada placa se prueba, a continuación, para ver si es de tipo
salvaje o Lys menos. La prueba para identificar el fago Lys menos se
puede llevar a cabo por ejemplo, examinando la capacidad del fago de
cada placa para infectar y matar dos tipos de células hospedadoras
cuando se detectan por la formación de placas. Un tipo de célula
hospedadora es la bacteria hospedadora normal (de tipo salvaje), el
otro es la bacteria hospedadora de lisina de tipo salvaje descrita
más arriba. El fago de tipo salvaje lisará y matará de manera
efectiva ambos tipos de hospedadores, mientras que el fago Lys menos
mata solamente las células hospedadoras que expresan lisina.
Cuando el fago Lys menos expresa un marcador de
detección (por ejemplo, GFP), y particularmente cuando el marcador
de selección se expresa a partir de un promotor temprano vírico, se
pueden visualizar directamente las placas fluorescentes que
representan el fago Lys menos durante la purificación de placas. El
fenotipo Lys menos de estos fagos puede confirmarse, a continuación,
mediante cribado tal y como se ha descrito más arriba.
\newpage
Los fagos Lys menos se pueden replicar y
ensamblar en sus bacterias hospedadoras pero por definición, no
serán capaces de lisar al hospedador y liberar de manera eficiente
los fagos de la progenie. Para la producción de los fagos
terapéuticos Lys menos, es esencial la liberación de los fagos
modificados del hospedador bacteriano. Cuando el fago Lys menos es
uno en el cual un gen de lisina está bajo control de un
promotor inducible, se puede lograr la lisis del hospedador
bacteriano poniendo en contacto el fago con un agente que active al
promotor inducible, con lo cual se induce la producción de lisina y
la lisis consiguiente de las células bacterianas hospedadoras.
La lisis de las bacterias hospedadoras y la
liberación del fago Lys menos también se puede lograr introduciendo
un plásmido auxiliar que lleve un gen de lisina bajo un promotor
inducible en un hospedador bacteriano. Los estudios previos han
demostrado que la expresión de los genes de lisis del fago lambda en
E. coli resultan en una lisis uniformemente definida (Garrett
et al., Mol. Gen. Genet. 182, 326,1981). Recientemente
los productos del gen S y R del fago lambda (holina y
lisina respectivamente) se han usado en un sistema de lisis
inducible (Jain et al.,Infection & Immunity 68,
986, 2000). De esta manera, se pueden producir grandes cantidades de
fagos Lys menos en hospedadores adecuados que contienen un plásmido
auxiliar que lleva un gen de lisina que codifica una lisozima
altamente potente (por ejemplo, la lisozima T4) bajo un promotor
inducible.
Los genes de lisina de cualquiera de los
fagos secuenciados se pueden aislar mediante técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) y clonar en un
plásmido que tiene marcador de selección (por ejemplo, resistencia a
antibióticos tal como resistencia a ampicilina) de manera que se
expresan a partir de un promotor inducible utilizando procedimientos
estándar de ADN recombinante. El gen de lisina escogido será
uno con la menor cantidad de homología con el gen de lisina
del fago, para evitar la recombinación entre el fago Lys menos y el
gen de lisina en la cepa del hospedador para producir
recombinantes de tipo salvaje. La eficacia de la producción de
solamente los fagos Lys menos se determina confirmando que el stock
de fagos Lys menos no produce placas en una cepa de hospedador
carente del gen de lisina. Si es necesario, se puede usar una
diversidad de cepas hospedadoras auxiliares que expresan lisina a
partir de diferentes fuentes y promotores inducibles, para encontrar
empíricamente la cepa hospedadora adecuada que produzca el nivel más
bajo de recombinantes de tipo salvaje.
Los bacteriófagos defectuosos en la lisis de la
invención, abarcan no solamente los fagos que tienen un gen de
lisina defectuoso, sino también el fago que es defectuoso en la
maquinaria de lisis debido a defectos diferentes al gen Lys o
adicionalmente al gen Lys. Por ejemplo, más que ser defectuoso
solamente en el gen de lisina, se pueden eliminar o modificar
tanto el gen de lisina como el gen de holina para no
ser funcionales en el fago y el sistema de lisis. Tales fagos
defectuosos se pueden producir para expresar los componentes
carentes o defectuosos de lisis en un plásmido auxiliar en un
hospedador bacteriano. Martin et al., (J, Bacteriol.
180, 210 (1998)) ha demostrado que la expresión concomitante
de holina y lisina del fago de neumococos
Cp-1 en E. coli resulta en lisis celular. Se
pueden usar estrategias similares discutidas más arriba para evitar
la generación del fago de tipo salvaje mediante recombinación
durante la fase de producción.
Puesto que las holinas son las proteínas que
atraviesan las membranas que permiten que las lisinas de fagos
tengan acceso a la mureína de pared celular bacteriana, la
eliminación o activación del gen de holina solo, también es
suficiente para generar los bacteriófagos terapéuticos que carecen
de un potencial de respuesta inmune. Dependiendo de la estructura y
propiedades del fago específico, la eliminación o inactivación del
gen de lisina, el gen de holina o ambos se puede
emplear para generar el fago terapéutico deseado.
Cualquier cepa de fago capaz de facilitar un
daño directo o indirecto en bacterias (u otros patógenos) (por
ejemplo en la inhibición o interferencia de la transcripción y/o
traducción del ADN bacteriano (por ejemplo a través de la
competencia del ADN del fago para la misma maquinaria de células
hospedadoras), que inhibiendo la replicación bacteriana y similares)
se contempla como útil en la presente invención. Estos fagos que son
líticos y los fagos que son lisogénicos pero que pueden más tarde
convertirse en líticos se pueden adaptar para su uso en la presente
invención.
Cualquiera de una variedad de bacterias
patogénicas puede usarse para generar una vacuna bacteriana de
células enteras incapacitadas, de acuerdo con la invención. Los
patógenos bacterianos ejemplificativos son aquellos descritos más
arriba junto con sus correspondientes bacteriófagos (cuando se
conocen).
Además, el bacteriófago Lys menos puede usarse
para crear vacunas bacterianas de células enteras incapacitadas,
usando bacterias que son manipuladas genéticamente para expresar una
proteína heteróloga o para sobreexpresar una proteína endógena. Por
ejemplo, la bacteria puede modificarse genéticamente para expresar
uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más moléculas de
interés, particularmente moléculas que provocan o potencian una
respuesta inmune protectora, por ejemplo, antígenos recombinantes.
De particular interés son los fragmentos antigénicos de dichas
moléculas, por ejemplo, epítopos. Los ácidos nucleicos pueden
codificar, por ejemplo, toda o parte de una proteína de membrana
externa, pilina, flagelo, u otra proteína que está implicada en la
generación de una respuesta inmune protectora.
Cualquier secuencia de ADN que codifica una
molécula antigénica o fragmento de las mismas, (por ejemplo,
epítopo) ya sea, de un organismo heterólogo o endógeno, que cuando
se expresa en una bacteria produce una inmunidad protectora contra
el organismo o contra una condición o trastorno causado con el
organismo, puede aislarse para usarse en las preparaciones de vacuna
de la presente invención. En una realización, el antígeno es un
antígeno de superficie. En otra realización el organismo es un
microorganismo patogénico. Todavía en otra modalidad, la molécula
antigénica o fragmento de la misma, es característica del cáncer y
proporciona inmunidad protectora contra el cáncer o provoca una
respuesta inmune contra el cáncer lo que resulta en la reducción o
eliminación del cáncer en un sujeto.
Las moléculas antigénicas, o fragmentos de las
mismas, pueden encontrarse en patógenos, tales como bacterias,
parásitos, virus, u hongos. Las bacterias, parásitos, virus y hongos
de interés incluyen pero no se limitan a, los incluidos en la tabla
a continuación.
Además, pueden usare las moléculas antigénicas
de células de cáncer. Los antígenos característicos de células de
cáncer y útiles en preparaciones de vacuna de la presente invención
incluyen, pero no se limitan a MAGE, MUC1, HER2/neu, CEA, pS3,
tirosinasa, MART-1/melan A, gp 100,
TRP-1, TRP-2, PSA,
CDK4-R24C, BCR/ABL, K-ras mutada
ESO-1, CA15-3, CA125,
CA19-9, CA27.29, TPA, TPS, citoqueratina 18, y p53
mutada.
Si los antígenos no se han identificado aún, los
antígenos potencialmente útiles para formulaciones de vacuna pueden
identificarse por varios criterios, tales como la implicación del
antígeno en la neutralización de la infección por patógenos (Norrby,
E., 1985, Summary, en Bacines 85, Lerner, R. A., R. M. Chanock, and
F. Brown (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N. Y., pp. 388-389), tipo o especificidad de grupo,
reconocimiento por las células inmunes o antisuero del paciente, y/o
la demostración de efectos protectores del
anti-suero o células inmunes específicas para el
antígeno.
Las moléculas inmunoreactivas pueden
identificarse y caracterizarse mediante procedimientos conocidos en
la materia. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse en la
superficie u otras moléculas de un patógeno pueden identificar
aquellos que son capaces de ser reconocidos por los anticuerpos.
Alternativamente, los péptidos sintéticos pequeños conjugados a
moléculas portadoras pueden probarse para la generación de
anticuerpos monoclonales que se unan a los sitios correspondientes
al péptido en la molécula intacta (ver por ejemplo, Wilson, I. A.,
et al., 1984, Cell 37:767).
Se pueden crear las bacterias manipuladas
genéticamente útiles en la invención utilizando la tecnología del
ADN recombinante. Una secuencia de nucleótidos que codifica una
molécula antigénica de interés se inserta en un vector de expresión,
se transforma o transfecta en una célula hospedadora bacteriana
apropiada y se cultiva en condiciones apropiadas para la expresión.
Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se describen
generalmente en Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
N.Y. (1989).
La secuencia de nucleótidos que codifica una
molécula antigénica también pueden fusionarse con un ácido nucleico,
bacteriano o de otra manera, para facilitar la expresión y/o cuando
se desee, facilita la presentación del polipéptido antigénico
expresado en la superficie de la célula bacteriana (Cattozzo et
al., J. Biotechnol 56, 191 (1997), Stocker y Newton, Int.
Rev. Immunol. 11, 167 (1994), Stocker, Res. Microbiol.
141, 787 (1990), Newton et al., Science 244, 70
(1989), USPN 6.130.082)). Por ejemplo, Newton et al., (Res.
Microbiol. 146, 203 (1995)) fusionó un epítopo de VIH1 gp41,
que es parte de la proteína gp160, a un gen de flagelo de
Salmonella en la orientación y marco de lectura correctos. El
plásmido se colocó en una cepa de Salmonella, de vacuna viva
de flagelina negativa, la cual hizo a continuación una proteína con
la secuencia de epítopo de VIH1 externo integrada en este. Ratones
inmunizados con la vacuna viva de la Salmonella recombinante
mostraron la producción de un anticuerpo con afinidad para
gp160.
La secuencia de nucleótidos que codifica una
molécula antigénica también pueden fusionarse con un ácido nucleico,
bacteriano o de otra manera, para facilitar la presentación del
polipéptido antigénico expresado en la superficie celular de la
bacteria manipulada genéticamente (Cattozzo et al., J.
Biotechnol 56, 191 (1997), Stocker y Newton, Int. Rev.
Immunol. 11, 167 (1994), Stocker, Res. Microbiol. 141,
787 (1990), Newton et al., Science 244, 70 (1989),
USPN 6.130.082)). Por ejemplo, Newton et al., (Res.
Microbiol. 146, 203 (1995)) fusionó un epítopo de VIH1 gp41,
que es parte de la proteína gp160, a un gen de flagelo de
Salmonella en la orientación y marco de lectura correctos. El
plásmido se colocó en la cepa de Salmonella, de vacuna viva
de flagelina negativa, la cual hizo a continuación una proteína con
la secuencia de epítopo de VIH1 externo integrada en este. Ratones
inmunizados con la vacuna viva de la Salmonella recombinante
mostraron la producción de un anticuerpo con afinidad para
gp160.
Puede determinarse la inmunopotencia de la
molécula inmunogénica expresada por la bacteria manipulada
genéticamente en una preparación de vacuna de células enteras
incapacitadas al observar la respuesta inmune de animales de ensayo
después de la inmunización con las bacterias que expresan el
antígeno recombinante. Los animales de ensayo pueden incluir
ratones, conejillos de indias, conejos, pollos, chimpancés y otros
primates, y eventualmente sujetos humanos. Los procedimientos de
introducción de la bacteria recombinante incapacitada pueden incluir
la ruta oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea, intranasal o cualquier otra ruta estándar
de inmunización.
La respuesta inmune de los sujetos de ensayo
puede analizarse mediante varias aproximaciones tales como: (a) la
reactividad del suero inmune resultante al antígeno nativo o un
fragmento del mismo, o para el organismo que se encuentra de manera
natural aislado (por ejemplo, organismo de tipo salvaje) del cual se
deriva la molécula antigénica de ensayo cuando se determina mediante
técnicas conocidas, por ejemplo ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima (ELISA), inmunoblot, radioinmunoprecipitaciones, etc., (b) la
reactividad de los linfocitos aislados del sujeto inmunizado para el
antígeno nativo o fragmento del mismo, o el organismo que se
encuentra de manera natural del cual se deriva la molécula
antigénica de ensayo cuando se determina mediante técnicas
conocidas, por ejemplo, ensayos de respuesta blastogénica, ensayos
de citotoxicidad, hipersensibilidad de tipo retardado, etc., (c) la
capacidad del suero inmune para neutralizar la infección del
organismo in vitro o la actividad biológica del antígeno
nativo, y (d) la protección de la enfermedad y/o mitigación de
síntomas infecciosos en animales inmunizados.
Para la producción de anticuerpos con una
molécula antigénica expresada por bacterias, bacterias que pueden
manipularse genéticamente para expresar una proteína heteróloga o
para sobreexpresar una proteína endógena, se pueden inmunizar varios
animales hospedadores mediante inyección con una composición
inmunogénica de células enteras incapacitadas que comprende la
bacteria incapacitada por infección con un fago defectuoso en
lisis.
Dichos animales hospedadores pueden incluir,
pero no se limitan a conejos, ratones, y ratas, por nombrar algunos.
Pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta
inmunológica, dependiendo de las especies hospedadoras, incluyendo
pero no limitándose a Freund (completo e incompleto), geles
minerales tales como el hidróxido de aluminio, sustancias de
superficie activa tal como lisolecitina, polioles plurónicos,
polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas, hemocianina de una
especie de lapa ("keyhole limpet"), dinitrofenol y
adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivados de los sueros de
animales inmunizados con el antígeno. Para la producción de
anticuerpo policlonales, los animales hospedadores tales como los
descritos más arriba, pueden inmunizarse mediante una inyección con
una composición bacteriana de células enteras incapacitadas de la
invención. La composición puede complementarse con adyuvantes.
Se puede seguir durante el tiempo la titulación
de anticuerpos en el sujeto inmunizado mediante técnicas estándar,
tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) usando un
polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo
pueden aislarse del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y
purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales
como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. Los
anticuerpos específicos para un antígeno, o fragmento del mismo,
particularmente, para una molécula antigénica recombinante expresada
por una bacteria manipulada genéticamente, se pueden seleccionar
para (por ejemplo, parcialmente purificada) o purificada mediante,
por ejemplo, cromatografía de afinidad.
Por ejemplo, se produce un antígeno de proteína
expresado de manera recombinante y purificado (o parcialmente
purificado) en una bacteria manipulada genéticamente tal y como se
describe en el presente documento, y se acopla de manera covalente o
no covalente a un soporte sólido tal como, una columna de
cromatografía. La columna puede entonces usarse para purificar por
afinidad anticuerpos específicos para las proteínas de una muestra
que contiene anticuerpos dirigidos contra un gran número de
diferentes epítopos, generándose así una composición de anticuerpos
sustancialmente purificada, esto es, una que está sustancialmente
libre de anticuerpos contaminantes. Por una composición de
anticuerpos sustancialmente purificada se entiende en este contexto
que la muestra de anticuerpos contiene como máximo sólo un 30% (en
peso seco) de los anticuerpos contaminantes dirigidos contra
epítopos diferentes a aquellos en la proteína deseada o polipéptido
de interés, y preferiblemente, como máximo un 20%, aun más
preferiblemente como máximo un 10% y más preferiblemente como máximo
un 5% (en peso seco) de la muestra es anticuerpos contaminantes. Una
composición de anticuerpos purificados significa que al menos un 99%
de los anticuerpos en la composición se dirigen contra la proteína o
polipéptido antigénico deseado.
Los anticuerpos monoclonales, que son
poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno en
particular, pueden obtenerse mediante cualquier técnica que
proporcione la producción de anticuerpos mediante, por ejemplo,
líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen pero no se
limitan a, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein, (1975,
Nature 256, 495-497; y patente US No. 4.376.110), la
técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., 1983,
Immunology Today 4, 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80: 2026-2030), y la técnica de
hibridoma-EBV (Cole y otros, 1985, Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.
77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier
clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y
cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAb
deseado puede cultivarse in vitro o in vivo. La
producción de altas concentraciones de mAbs in vivo hace de
este el procedimiento de producción actualmente preferido.
Los anticuerpos generados contra la composición
bacteriana inmunogénica de células enteras incapacitadas de la
invención tiene usos potenciales en inmunoensayos de diagnostico,
inmunoterapia pasiva, y generación de anticuerpos
anti-idiotípicos. En una realización, la composición
usada para generar los anticuerpos comprende bacterias manipuladas
genéticamente para expresar una proteína heteróloga o para sobre
expresar una proteína endógena.
Los anticuerpos generados pueden aislarse por
técnicas estándar conocidas en la técnica (por ejemplo,
cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación,
etc.) y usarse en inmunoensayos diagnosticos para detectar la
presencia de células o virus cancerosos, bacterias, hongos o
parásitos de importancia médica o veterinaria en tejidos humanos o
animales, sangre suero etc. Los anticuerpos también pueden usarse
para observar el proceso de tratamiento y/o enfermedad. Cualquiera
de los sistemas de inmunoensayos conocidos en la materia, tales como
los indicados en el presente documento, pueden usarse con este
propósito incluyendo, pero no limitando a, sistemas de ensayos
competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como
radioinmunnoensayos, ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a
enzima), inmunoensayos sándwich, reacciones de precipitina,
reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de
inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de
complemento, ensayo inmunoradiométrico, inmunoensayos fluorescentes,
inmunoensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.,
en donde tales inmunoensayos son conocidos en la técnica.
Las preparaciones de vacuna de la presente
invención también pueden usarse en la producción de anticuerpos para
usarse en inmunoterapia pasiva, en las que la protección a corto
plazo de un hospedador se consigue mediante administración de un
anticuerpo preformado dirigido contra un organismo heterólogo.
Los anticuerpos generados mediante preparaciones
de vacuna de la presente invención también pueden usarse en la
producción de anticuerpo anti-idiotípico. El
anticuerpo anti-idiotípico pueden entonces a su vez
usarse para inmunización, con el fin de producir una subpoblación de
anticuerpos que se unan al antígeno inicial del microorganismo
patogénico (Jerne, N, K., 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373;
Jerne, N.K., et al., 1982. EMBO 1:234).
Las vacunas de la invención pueden formularse de
cualquier manera apropiada. En general las vacunas de la invención
pueden administrarse oralmente, nasalmente, nasofaringealmente,
parenteralmente, entéricamente, gástricamente, tópicamente,
transdérmicamente, subcutáneamente, intramuscularmente, en tableta,
sólido, polvos, liquido forma de aerosol localmente o
sistémicamente, con o sin excipientes añadidos. Los procedimientos
actuales para preparar composiciones parenteralmente administrables
son bien conocidos o aparentes por aquellos expertos en la materia y
se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's
Pharmaceutical Science, 15^{th} ed., Mack Publishing Company,
Easton, Pennylvania (1980).
Se reconoce que los polipéptidos y compuestos
relacionados descritos arriba cuando se administran oralmente
deberán protegerse de la digestión. Esto puede realizarse ya sea al
mezclar o empacar la bacteria incapacitada en un portador apropiado
altamente resistente tal como un liposoma. Las preparaciones también
pueden proporcionarse para liberarse en formas de liberación
controladas o liberación retardada y la administración de las
preparaciones antigénicas como una mezcla o de una manera en
serie.
\newpage
Las vacunas incapacitadas de la invención se
proporcionan generalmente en composiciones con un excipiente
farmacéuticamente aceptable. Varios excipientes farmacéuticamente
aceptables son bien conocidos en la técnica. Tal y como se usa en la
presente invención, "excipiente farmacéuticamente aceptable"
incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente
activo de una composición, permite que el ingrediente mantenga la
actividad biológica y sin causar reacciones perjudiciales en el
sistema inmune del sujeto.
Los portadores farmacéuticamente
ejemplificativos incluyen soluciones acuosas o no acuosas,
suspensiones y emulsiones estériles. Los ejemplos incluyen pero no
se limitan a, alguno de los excipientes farmacéuticos estándar tales
como solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tal
como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes
humectantes. Ejemplos de solventes no acuosos son el propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de olivo y
ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los
portadores acuosos incluyen soluciones acuosas/alcohólicas, agua,
emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados.
Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio,
dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, aceites fijos o de
Ringer lactados. Vehículos intravenosos incluyen regeneradores de
fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como
aquellos basados en la dextrosa de Ringer) y similares.
Una composición que comprende un bacteriófago de
la invención, también se puede liofilizar usando medios bien
conocidos en la materia, para la posterior reconstitución y uso de
acuerdo con la invención.
Son también de interés, las formulaciones para
la administración liposómica, y formulaciones que comprenden la
vacuna bacteriana de células enteras microencapsuladas. Las
composiciones que comprenden dichos excipientes se formulan mediante
procedimientos convencionales bien conocidos (ver, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences, Capítulo 43, 14a Ed. Mack
Publishing Col, Easton PA 18042, USA).
En general, se pueden preparar las composiciones
farmacéuticas en diversas formas tales como gránulos, tabletas,
píldoras, supositorios, cápsulas (por ejemplo, adaptadas para
administración oral) microperlas, microesferas, liposomas,
suspensiones, ungüentos, lociones y similares. Los portadores y/o
diluyentes orgánicos o inorgánicos de grado farmacéutico, adecuados
para uso oral y tópico se pueden usar para elaborar composiciones
que comprenden los compuestos terapéuticamente activos. Los
diluyentes conocidos en la materia incluyen medios acuosos, aceites
animales y vegetales y grasas. Los agentes estabilizantes, agentes
emulsionantes y humectantes, sales para variar la presión osmótica o
tampones de pH para asegurar un valor adecuado de pH.
La composición farmacéutica puede comprender
otros componentes además del bacteriófago. Además, las composiciones
farmacéuticas pueden comprender más de un bacteriófago, por ejemplo
dos o más, tres o más, cinco o más, o diez o más bacteriófagos
diferentes, en donde el bacteriófago diferente puede ser específico
para bacterias iguales o diferentes. Como se indica más arriba el
bacteriófago puede administrase en conjunto con otros agentes, tales
como un agente antimicrobiano convencional (ver tabla anterior). En
algunas realizaciones se puede desear administrar el bacteriófago y
antibiótico dentro de la misma formulación.
Las composiciones se administran a un animal que
está en riesgo de adquirir una enfermedad causada por el patógeno
bacteriano para prevenir o al menos detener parcialmente el
desarrollo de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad
adecuada para realizar esto se define como una "dosis
terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para uso
terapéutico dependerán de, por ejemplo, la composición de antígeno,
la manera de administración, el peso y estado general de salud del
paciente y el criterio del médico que prescribe. Se pueden
administrar dosis únicas o múltiples de las composiciones
dependiendo de la dosis y frecuencia requerida y tolerada por el
paciente, y la ruta de administración.
Las cantidades para la inmunización de la mezcla
generalmente están en el rango de aproximadamente 0,001 mg a
aproximadamente 1,0 mg por 70 kilogramos del paciente, más
comúnmente es de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 0,2 mg
por 70 kilogramos del paciente. Pueden usarse dosis desde 0,001
hasta aproximadamente 10 mg por paciente y día, particularmente
cuando el antígeno se administra en un sitio aislado y no en el
torrente sanguíneo, tal como en una cavidad corporal o en el lumen
de un órgano. Son posibles dosis sustancialmente superiores (por
ejemplo, 10 hasta 100 mg o más) en administración oral, nasal o
tópica. La administración inicial de la mezcla puede seguirse de una
inmunización de refuerzo ("booster") de la misma o
diferente mezcla, con al menos una de refuerzo, siendo preferida más
habitualmente dos de refuerzo.
La invención también contempla que la
composición de vacuna que comprende una vacuna bacteriana
incapacitada pueda incluir una o más cepas de bacterianas.
Las vacunas pueden administrase a cualquier
sujeto, generalmente un sujeto mamífero, que tiene o es susceptible
a, una infección por un patógeno bacteriano. Los sujetos de
particular interés incluyen, pero no se limitan necesariamente a,
humanos y animales domésticos (por ejemplo, ganado mascotas y
similares) así como animales mantenidos en cautividad (por ejemplo,
en zoológicos o parques acuáticos).
Aunque el sujeto no necesita ser
inmunológicamente naive, las vacunas de la invención se administran
típicamente a un sujeto que es inmunológicamente naive con respecto
al patógeno bacteriano concreto. En una realización particular, el
mamífero es un niño humano de alrededor de 5 años o más joven y
preferiblemente alrededor de 2 años de edad o más joven. La vacuna
de la invención puede administrarse como una dosis única o, si desea
o es necesaria, la dosis inicial puede seguirse por vacunas de
refuerzo varios días, varias semanas, o varios meses o años después
de la dosis inicial. En general, la administración a cualquier
mamífero se inicia preferiblemente antes del primer signo de los
síntomas de la enfermedad, o al primer signo de una exposición
posible o real al patógeno bacteriano.
Las realizaciones anteriores de la presente
invención, se describen adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Sin embargo, la presente invención no está limitada a los ejemplos,
y serán evidentes las variaciones para aquellos expertos en la
materia, sin alejarse del alcance de la presente invención. En
particular, se puede sustituir cualquier bacteria y fago conocido
para infectar dichas bacterias, en los experimentos de los
siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se incluyen para
proporcionar a aquellos expertos en la materia, una descripción y
divulgación completa de la forma de cómo llevar a cabo y utilizar la
presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo
que los inventores refieren como su invención. Se han hecho
esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números
usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se debe
tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A
menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso,
el peso molecular es el peso molecular promedio en número, la
temperatura es en grados centígrados y la presión de o cercana a la
atmosférica.
La secuencia de nucleótidos del gen de lisozima
(e) del bacteriófago T4, junto con 130 nucleótidos adicionales a
cada lado, fue publicada por Owen et al. (J. Mol. Biol.
165, 229, 1983). Los ADN correspondientes a los nucleótidos
de las regiones de dirección cadena arriba y dirección cadena abajo
del gen e, se aíslan por PCR y se clonan en el plásmido de
resistencia a ampicilina pUC 18 con sitios únicos de restricción
(Xba I y Pst I) entre las dos regiones ((Sambrook, J. y otros
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Se genera un casete de
ADN que contiene el gen para una forma mutante de la proteína
fluorescente verde (GFP) que tiene una fluorescencia 40 veces más
brillante que la proteína de tipo salvaje, como un fragmento Xba
I-Pst I a partir del plásmido pmut2 que lleva
gfp (Cormack, B.P., Valdivia, R.H. y Falkow, S. Gene
173, 33, 1996), y se introduce entre las secuencias de
dirección cadena arriba y dirección cadena abajo del gen de lisozima
en pUC18 (pGG8). El promotor y finalizador de la expresión de GFP en
este casete se reemplazan por el promotor temprano del gen de la
dihidrofolato reductasa T4 frd (Rosenberg, M. y Court, D.
Ann. Rev. Genet. 13, 319, 1979) en la terminación 5', y el
finalizador de la transcripción situado entre los genes 44 y 45 de
T4 (Spicer y Konigsberg in Bacteriophage T4 eds. Mathews, Kutter,
Mosig y Berget, American Society for Microbiology, Washington, DC,
1983, pp. 299) en la terminación 3' respectivamente. El promotor frd
está en la clase temprana inmediata de los promotores T4 que son de
los primeros en expresarse en células bacterianas infectadas con T4.
Se usa la polimerasa del ARN del hospedador para la transcripción
desde este promotor.
Este plásmido pGG8 se transforma en células de
E. coli HB101 mediante el procedimiento RbCl y se selecciona
por resistencia a ampicilina. Las células de E. coli HB101
que llevan el plásmido pGG8 con el gen de lisozima mutante, se
infectan a continuación con el fago T4 de tipo salvaje a baja
multiplicidad de infección. Durante la replicación, algunos se
recombinan con el gen de lisozima mutante llevado en los plásmidos
en las células para proporcionar el fago Lys menos. Es posible que
la recombinación en cualquier célula no sea 100% eficiente. Ambos
tipos de fagos se recogen lisando las células bacterianas con
cloroformo, y el fago Lys menos se separa del de tipo salvaje
mediante purificación en placa. Cada placa se prueba a continuación
para ver si es del tipo salvaje o Lys menos. Los fagos Lys menos
pueden identificarse por la fluorescencia verde de las placas de
replicado bajo luz UV ya que el GFP se expresa bajo el promotor
temprano T4. Esto se puede confirmar además probando el fago de cada
placa en E. coli HB101 así como células que expresan el gen
de lisina descrito abajo. Mientras que el fago de tipo
salvaje elimina ambos hospedadores, el fago Lys menos sólo elimina
las células hospedadoras que expresan la lisina.
El sistema de lisis de dos genes del fago
neumococo Cp-1, se ha clonado y expresado en E.
coli (Martín et al., J. Bacteriol. 180, 210
(1998). La PCR que usa el ADN de Cp-1 como
plantilla, genera fragmentos de ADN que contienen el gen cpl1
(lisina) o los genes de casete
cph1-cpl1(holina-lisina), en los que los
genes mantienen sus propios sitios de unión a ribosoma. Usando los
oligonucleótidos apropiados, se crean los sitios de restricción
Sac II y Sac I en los extremos 5' y 3' de los
fragmentos de PCR para la clonación en el plásmido pNM185 (Mermod
et al., J. Bacteriol. 167, 447 (1986)). El gen cpl1 o
el casete que contiene los genes cph1 y cpl1 se
expresan bajo el control de un promotor regulado positivamente
(Pm) del operón de ruta meta del plásmido TOL. La
transcripción de los genes de Pm es inducida específicamente
por el producto del gen regulador xylS solamente cuando están
presentes las moléculas efectoras tipo
3-metilbenzoato. La transformación de células de
E. coli HB101 con los plásmidos pNM185 que llevan el casete
cpl1 o cph1-cpl1, se lleva a cabo mediante el
procedimiento RbCl ((Sambrook y otros Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1989)). Las células de E. coli HB101
transformadas se hacen crecer en caldo LB u otro medio apropiado, y
se inocula con el fago T4 Lys menos. En el momento apropiado, la
expresión del casete cpl1 o el cph1-cpl1 en el
plásmido pNM185 se induce por la adición de
3-metilbenzoato 2 mM para efectuar la liberación de
la progenie del fago T4 Lys menos.
Materiales y Métodos. La Tag ADN
polimerasa, los dNTP, la fosfatasa intestinal de ternero, los
enzimas de restricción, cebadores y la T4 ADN ligasa, se obtuvieron
de Bangalore Genei Pvt. Ltd (BGPL), Bangalore. Los vectores pRSET
procedían de Invitrogen Ltd, USA.
Las ligaciones se llevaron a cabo con la
relación vector:inserto de 1:10 M. Los productos de la PCR junto con
los vectores digeridos se purificaron en gel de agarosa usando los
reactivos del kit de extracción en gel Qiagen salvo que se indique
de otra manera.
Construcción del clon de lisozima T4 en el
vector pRSETB (pRSETB-T4L) basado en el promotor
T7. La amplificación por PCR del gen de lisina de T4 se llevó a
cabo con el fago T4 de tipo salvaje obtenido de BGPL, usando los
siguientes cebadores:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ GMB1: \+ Delantero 5' CG GAA TTC CAT ATG AAT ATA TTT GAA ATG TTA CGT 3' \+ (SEC ID NO:1)\cr \+\+\cr GMB2: \+ Inverso 5' AA AGC GGC CGC AAG CTT TAG ATT TTT ATA CGC GTC CCA 3' \+ (SEC ID NO:2).\cr}
La desnaturalización inicial fue a 95°C durante
4 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95°C durante
30 segundos, hibridación a 55°C durante 30 segundos, y una extensión
a 72°C durante 30 segundos. Los contenidos se extendieron finalmente
durante 7 minutos a 72°C.
A continuación, el producto de la PCR obtenido
se purificó y se rellenó con Klenow antes de la ligación al vector
pRSETB digerido con PvuII y desfosforilado con CIP. La relación
vector a inserto se mantiene a 1:10M. La ligación se realizó a 22°C
durante 5 horas y luego se transformaron células competentes DH5
alfa con la mezcla de ligación anterior. Los transformantes se
seleccionaron a continuación en una placa LB amp (concentración
final 100 ug/ml) a 37°C durante la noche. Los transformantes se
cribaron por PCR de colonia de acumulados ("pool colony
PCR") y los clones positivos se comprobaron a continuación
por digestión por restricción después de aislar el ADN.
El ADN de los clones positivos se secuenció por
ABI Prism de Pharmacia. El clon anterior expresaba la proteína
lisozima T4 como se observa en el gel SDS-PAGE. La
proteína era una proteína de lisina etiquetada con His de 25 kDa tal
como se esperaba (ver Figura 2, carriles 1 y 2). Se seleccionó
PGMB011 para uso adicional.
Construcción de GFP como proteína de fusión
con etiqueta his en el vector pRSETA
(pSETA-GFP). Para interrumpir el gen de lisina
con un gen reportero, se escogió el gen GFP. Primero, el gen GFP se
amplificó del plásmido pUC-GFP en el kit de
enseñanza GFP de BGPL, usando los siguientes cebadores:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ GMB5: \+ Delantero 5' CC GGA ATT CAT ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC 3' \; \+ (SEC ID NO:3)\cr \+\+\cr GMB6: \+ Inverso 5' CC GGA ATT CAT TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC 3' \+ (SEC ID NO:4).\cr}
La desnaturalización inicial fue a 95°C durante
4 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante
30 segundos, hibridación a 60°C durante 30 segundos, y extensión a
72°C durante 30 segundos. La extensión final fue a 72°C durante 7
minutos. El producto purificado se digirió con EcoR1 y luego se ligó
con pRSETA cortado con EcoR1.
Los clones se cribaron a continuación por PCR de
acumulados de colonias para GFP y se observó la expresión de pequeña
escala de GFP en SDS-PAGE. Todos los clones se
revisaron bajo luz UV por la fluorescencia GFP que indicaba que el
clon tenía la GFP en la orientación correcta con respecto al
promotor T7. El tamaño de la proteína GFP fue de 36 kDa tal como se
espera.
Interrupción del gen de lisina T4 con GFP en
la estructura con el extremo 5' del gen de lisina T4 para la
construcción de pGMB021. El fragmento GFP del clon
pRSETA-GFP se subclonó a continuación en pGMB011
parcialmente digerido (un vector pRSETB-T4L
producido más arriba) con EcoR1. Los transformantes se cribaron por
PCR con GMB5/GMB6 y luego se revisaron por la expresión a pequeña
escala de la proteína de fusión GFP-lisina con
etiqueta his. La proteína de fusión GFP-lisina con
etiqueta His expresada del clon anterior (42 KDa) (ver Figura 2,
carriles 3 y 4) y su fluorescencia mostrada bajo luz UV, indica que
el gen GFP estaba intacto en esta construcción.
El clon anterior se probó además por PCR con
cebadores GMB1/GMB2 (cebadores específicos de lisina T4). Como se
esperaba, la PCR con GMB1/GMB2 dio un producto de
lisina-GFP-lisina de aproximadamente
1200 pb que mostraba lo intacto de los genes GFP y lisina (Figura
3). Este clon se usó en el experimento recombinante descrito en el
Ejemplo 4 de más abajo.
Se infectaron células DH5\alpha que contenían
el plásmido pGMB021 con el fago T4 de tipo salvaje a 2,5 m.o.i. Esta
alta multiplicidad de infección asegura que cada célula se infecta
con al menos un fago. Después de 40 minutos de incubación, se añadió
cloroformo (1%) y se centrifugó el lisado. Se separó el sobrenadante
y se aireó durante 30 minutos a temperatura ambiente para la
evaporación del cloroformo residual.
El lisado se trató con DNasa (50 ug/ml) durante
30 minutos a 37°C para digerir el ADN cromosómico y plásmido, y
luego se tituló. A continuación, se infectaron células de E.
coli normales (que no llevan plásmido) con el lisado a 0,1
m.o.i. Esta baja multiplicidad de infección asegura que todas las
células infectadas contienen un único fago, lo que a su vez sirve
para separar el fago recombinante y los fagos de tipo salvaje.
La mezcla de infección anterior se incubó a 37°C
durante 30 minutos y luego se centrifugó. Se separaron los pellets
celulares y el sobrenadante. Las células que contenían el fago Lys
menos no se lisaron y, por lo tanto, estaban presentes en los
gránulos celulares junto con células no infectadas. Se descartó el
sobrenadante, ya que esta fracción era posible que contuviera la
mayoría de los fagos de tipo salvaje. Los pellets se volvieron a
suspender a continuación en el medio de cultivo (Caldo Luria) y se
lisaron con lisozima de huevo blanco (10 ug/ml) y cloroformo (2%).
Este lisado se usó para infectar células pLys E BL21(DE3) a
0,1 m.o.i., y se colocaron en placas en un tramo de las mismas
células. Se escogieron específicamente estas células para esta etapa
ya que expresan de manera constitutiva la lisozima del fago T7 a
partir de un plásmido y deberían ayudar al fago Lys menos a formar
placas.
Se apreciaron dos tipos de placas en la placa,
varias placas de tipo salvaje y algunas placas de minúsculas o de
punta de alfiler. Se recogieron las placas de punta de alfiler y se
volvieron a suspender en el medio de cultivo. A continuación, se
dejó que éstas infectaran células BL21(DE3) pLysE y luego se
colocaron en placas en una mezcla 1:1 de células
BL21(DE3)pLysE (que hacen la lisozima T7) y células
LE392 (sin lisozima).
Las áreas turbias que representan el fago
recombinante se distinguieron de las placas de tipo salvaje en el
tramo de la mezcla de células. Se recogieron estas áreas turbias.
Una parte se volvió a suspender en agua para PCR y el resto se
volvió a suspender en medio de cultivo. El producto del gen GFP fue
amplificable a partir de muchas de las placas turbias (Figura
4).
Se amplificó también la
lisina-GFP-lisina T4 de longitud
completa. Sin embargo, también se produjo el producto del gen de
lisina de tipo salvaje, lo que indicó la presencia del fago de tipo
salvaje (Figuras 5 y 6). La eliminación selectiva del fago de tipo
salvaje de estos lisados tuvo lugar infectando células a un bajo
m.o.i. y la lisis de las células a los 40 minutos. En este momento,
el fago de tipo salvaje debería estar otra ronda de infección de
células y estar en el estadio de eclipse (en forma de ADN). La lisis
de las células destruye de esta manera el fago de tipo salvaje antes
de ensamblarse en partículas. Después de 3-5 rondas
de dicha eliminación, los lisados fueron menos placas (Figura 7). La
confirmación de la presencia del fago recombinante en dichos
lisados, y la cuantificación se realizaron estimando el número de
células viables después de la infección. La pérdida de viabilidad de
las células infectadas fue evidente durante el plaqueado de la
mezcla de infección (Figura 8).
Con el fin de enriquecer el fago recombinante y
evitar el uso de cloroformo y suplementación externa de lisozima, se
usó un tipo de célula de E. coli mutante sensible a la
temperatura (RE 7) (que crece a 30°C y se lisa a 42°C). Se alcanzó
un enriquecimiento del fago recombinante a un nivel de
\sim2x10^{8}/ml. Esta preparación se usó para infectar una cepa
patogénica de E. coli a 2 m.o.i. Estas células en su estado
nativo provocan la muerte del 80% de los animales cuando se inyectan
a una dosis de 10^{8} células/ratón dentro de 48 horas. Las
células patogénicas inactivadas con el fago recombinante, han sido
inyectadas en ratones para evaluar la eficacia como una vacuna
inactivada de células enteras.
Se inyectó en ratones macho y hembra Swiss
Albino de 6 a 8 semanas de edad, de manera intraperitoneal, una cepa
patogénica de E. coli que provoca un 100% de mortalidad a 108
cfu. Todos los ratones murieron dentro de 48 horas.
Cuando se inyectó en los ratones con 5x10^{7}
células, se observó una mortalidad del 70-80%. No
hubo mortalidad sin embargo, a 10^{6} cfu.
Por lo tanto, se inyectó en los ratones (i)
10^{6} células de tipo salvaje o (ii) 10^{6} células que se
hicieron no viables mediante infección con el fago Lys menos.
Después de dejarlas 10 días para el desarrollo de una respuesta
inmune, se desafiaron los animales con células de tipo salvaje
(5x10^{7} cfu) junto con animales a los que se les administró
solamente solución salina y se observaron hasta un periodo de 10
días. Hubo una mortalidad importante en el grupo inyectado con E.
coli inactivada con el fago Lys menos probablemente debido a la
endotoxina.
\newpage
En el grupo control del vehículo, hubo una
mortalidad del 80% como se esperaba. En el grupo donde se usaron
células de tipo salvaje como vacuna, se observó una mortalidad del
20% lo que indicaba una protección del 80%. En el grupo en donde las
células habían resultado no viables por el fago Lys menos, no hubo
mortalidad en absoluto, lo que indica una protección total.
Para verificar la presencia de anticuerpos en
los ratones que sobrevivieron en grupos diferentes, se sacrificaron
los ratones 7 días después de la dosis de exposición que se
administró y se recogió el suero. Se recolectó el suero a partir de
los animales del grupo de control de vehículo no expuestos que
sirvieron como control negativo. Se comprobaron las muestras de
suero por reactividad con las células 443 de E. coli. Se
confirmó la presencia de anticuerpos anti-E. coli en los
sueros en un ELISA de formato estándar usando una preparación de
células E. coli (cepa #MTCC443) recubierta en pocillos de
microplacas para la captura y IgG de anti-ratón
conjugado a la enzima fosfatasa alcalina como reportero. Se marcaron
los ratones como positivo para los anticuerpos anti-E. coli
contra la media de los valores OD de 6 sueros de control negativo
usados.
Todos los ratones que sobrevivieron al desafío
mostraron la presencia de anticuerpos anti-E. coli 443. El
grupo del fago Lys menos fue comparable al grupo de células vivas
administradas. Todos los valores que se muestran en la tabla a
continuación representan la media de los ensayos por duplicado. La
media OD de los animales control (6) no expuestos a E. coli
(control sin infectar) fue de 0,3.
<110> Gangagen, Inc.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones inmunogénicas
bacterianas de células enteras incapacitadas
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<130> AHB/FP6217392
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<151>
2001-09-27
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<160> 4
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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\hfill35
Claims (10)
1. Uso de una composición bacteriana de célula
entera incapacitada en la fabricación de un medicamento para
provocar una respuesta inmune a un patógeno bacteriano en un sujeto
susceptible a una infección por una enfermedad causada por una
bacteria patogénica, en donde la composición comprende la bacteria
patogénica incapacitada mediante infección con un bacteriófago
defectuoso en la lisis, y en donde dicho medicamento se administra
en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a la
bacteria patogénica en el hospedador.
2. Uso de una composición bacteriana de célula
entera incapacitada en la fabricación de una vacuna para vacunar a
un sujeto contra una enfermedad causada por un patógeno bacteriano,
comprendiendo la vacuna la bacteria patogénica incapacitada mediante
infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y donde dicha
vacuna se administra en una cantidad efectiva para provocar una
respuesta inmune a la bacteria patogénica en el sujeto.
3. Uso de una composición bacteriana de célula
entera incapacitada en la fabricación de un medicamento para
provocar una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, donde la
composición comprende una bacteria incapacitada mediante infección
con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y donde el medicamento
se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta
inmune a un antígeno presente dentro o en la bacteria.
4. Composición que comprende una bacteria
incapacitada y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde la
bacteria incapacitada se produce mediante infección de una bacteria
patogénica con un bacteriófago Lys menos.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
donde la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un
bacteriófago defectuoso en la lisis se manipula genéticamente para
sobreexpresar un antígeno endógeno.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2 o la composición de la reivindicación 4 en donde la
bacteria patogénica es de un género seleccionado del grupo que
consiste en Mycobacteria, Staphylococci, Vibrio, Enterobacter,
Enterococcus, Escherichia, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas,
Shigella, Serratia, Salmonella, Streptococcus, Klebsiella y
Yersinia.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, la
reivindicación 2 o la reivindicación 3 o la composición de la
reivindicación 4, donde el bacteriófago defectuoso en la lisis es el
bacteriófago Lys menos.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde
el antígeno es un antígeno bacteriano endógeno a la bacteria.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde
el antígeno es un antígeno recombinante.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9,
donde el antígeno recombinante es exógeno a la bacteria.
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