KR20110081563A

KR20110081563A - 사카자키 균의 생육을 저해하는 효과를 가지는 독성파아지 및 이를 이용한 생육 제어 방법

Info

Publication number: KR20110081563A
Application number: KR1020100001781A
Authority: KR
Inventors: 박종현; 이영덕
Original assignee: 경원대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2010-01-08
Publication date: 2011-07-14
Also published as: KR101188611B1

Abstract

본 발명은 Cronobacter sakazakii 생육을 저해하는 효과를 가지는 독성파아지에 관한 것으로서, ES2(수탁번호 KCTC11614BP) 또는 EI-1(수탁번호 KCTC11613BP)에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, Cronobacter sakazakii 생육을 인체에 유해하지 않으며, 간단한 방법으로 제어할 수 있게 된다.

Description

사카자키 균의 생육을 저해하는 효과를 가지는 독성파아지 및 이를 이용한 생육 제어 방법{Virulent Phages inhibiting the Growth of Cronobacter sakazakii}

본 발명은 Cronobacter sakazakii 생육을 저해하는 효과를 가지는 독성파아지에 관한 것으로서, ES2(수탁번호 KCTC11614BP) 또는 EI-1(수탁번호 KCTC11613BP)에 관한 것이다.

사카자키균은 주요 매개체로서 건조 조제분유가 보고되며 장염을 일으키기도 하고 피로 들어가면 패혈증, 뇌로 침입하면 뇌수막염을 일으킬 수 있으며 한 살 미만인 아기가 패혈증에 걸릴 경우 10 내지 20%의 사망률을, 뇌수막염일 경우 20 내지 30%의 사망률을 나타낸다. 이는 정상적인 면역력을 가진 사람에게는 크게 문제가 되지 않으나 신생아, 특히 면역력이 약한 신생아에게 치명적인 위험을 줄 수 있다.

또한, 선진국의 식중독 관련 통계자료를 살펴보면 전체 식중독 사고의 10% 미만만이 보고되고 나머지 90%는 정확히 집계되지 못하고 있는 실정이며 이러한 식중독 사고의 미흡한 보고는 일반 병원이나 실험실에서 기술 설비가 부족하여 원인 식중독세균을 규명하지 못하는 것이 주요 원인으로 작용한다.

본 발명은 식중독의 예방, 식중독의 원인 파악 및 식품이나 음식재료의 오염 현황 파악 등을 위하여 식품 등에서 Cronobacter sakazakii를 효율적으로 제어하는 기술을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 Cronobacter sakazakii 생육을 저해하는 효과를 가지는 독성파아지 ES2(수탁번호 KCTC11614BP) 또는 EI-1(수탁번호 KCTC11613BP)을 제공한다.

또한, 본 발명은 Cronobacter sakazakii 생육 제어 방법으로서, Cronobacter sakazakii가 포함된 시료에 독성파아지 ES2(수탁번호 KCTC11614BP) 및 EI-1(수탁번호 KCTC11613BP)을 함께 처리하는 것을 특징으로 하는 Cronobacter sakazakii 생육 제어 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, Cronobacter sakazakii 생육을 인체에 유해하지 않으며, 간단한 방법으로 제어할 수 있게 된다.

도 1은 ES2 및 EI-1의 접종에 따른 Cronobacter sakazakii 생장 저해 효과를 나타낸다.
도 2는 분유 내에서 ES2 및 EI-1의 접종에 따른 Cronobacter sakazakii 생장 저해 효과를 나타낸다.
도 3은 또한 분리된 ES2와 EI-1 bacteriophage를 혼합하여 cocktail 형태로 제조 후 식품으로부터 분리된 Cronobacter sakazakii KYU48, KYU50, KYU51, KYU60, KYU98을 각각 배양 후 5개의 분리주를 혼합하여 co-culture를 했을 때 ES2와 EI-1 phage cocktail에 의한 감소 효과를 나타낸다.

경기도 소재의 도축장에서 수집된 소와 돼지의 분변 20종으로부터 Cronobacter sakazakii의 제어를 위한 bacteriophage의 분리를 시도하였다.

샘플을 채취하여 냉장 상태로 실험실에 이동한 후 24시간 이내에 실험을 수행하였으며, 실험 후 나머지 샘플은 -70도 deep freezer에 보관하였다.

고체의 샘플일 경우, Cronobacter sakazakii가 배양된 10mM CaCl₂가 첨가된 Luria-bertani(LBC) broth 50mL에 50gram을 첨가한 후 37도에서 200rpm으로 추가로 배양하였다. 그리고 배양 후 배양액에 chloroform을 1% 첨가한 후 혼합하고 10,000g에서 10분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 취해 0.22um syringe filter를 사용하여 제균하여 Cronobacter sakazakii의 virulent phage 분리를 위해 4도에서 보관하여 사용하였다.

또한, 액체 샘플의 경우, 5XLBC broth를 제조하고 샘플(4):5XLBC broth(1)로 혼합 후 배양된 Cronobacter sakazakii를 첨가한 후 37도에서 200rpm으로 배양한 후 고체시료와 동일하게 수행하였다.

Cronobacter sakazakii를 LBC broth에서 37도, 200rpm으로 배양한 후 제균액과 배양액을 1:1의 비율로 혼합하고 동일한 배양 조건에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 이를 LBC soft agar에 접종하여 vortex 한 후 LBC agar에 lawn으로 분주하고 37℃에서 24~48시간 동안 배양하면서 bacteriophage에 의한 plaque 형성 유무를 확인하였다. 형성된 plaque의 형태, size, 혼탁 정도 등을 비교하여 서로 다른 plaque morphology를 분리하였다. Plaque를 tooth-picking 하고 SM buffer에 현탁한 후 현탁액을 SM buffer를 이용하여 10진 희석하여 plaque assay를 수행하고 single plaque를 분리하였다. 확인된 single plaque들로부터 plate lysate를 추출한 후 이를 이용하여 plaque assay를 통해 virulent phage의 양을 확인한 후 이를 이용하여 liquid lysate를 얻은 후 plaque assay를 통해 virulent phage의 양을 개수하여 실험에 사용하였다.

Cronobacter sakazakii의 virulent phage 분리를 위해 다양한 환경 샘플, 경기도 소재의 도축장에서 수집된 소와 돼지의 분변 20종으로부터 분리한 결과 총 11주의 virulent phage를 분리할 수 있었다.

또한, 분리된 virulent phage들의 host spectrum을 확인한 결과 Cronobacter sakazakii ATCC51329, ATCC29544의 표준 균주에 작용하였으며, 식품으로부터 분리된 Cronobacter sakazakii들 중 Cronobacter sakazakii KYU46, KYU58, KYU60, KYU129는 분리된 virulent phage 모두 plaque를 형성하는 것을 확인하였으며, Cronobacter sakazakii KYU50은 ES2, ESSI-2, ESSI-3, Cronobacter sakazakii KYU51은 EI-1, EI-2, EI-3만이 plaque를 형성하는 것으로 확인되었다.

분리된 virulent phage의 host spectrum 확인 결과

strain	virulent phages
strain	EI-1	EI-2	EI-3	EI-4	ES-1	ES-2	ES-3	ES1	ES2	ESSI-2	ESSI-3
KYU46	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○
KYU 50	X	X	X	X	X	X	X	X	○	○	○
KYU 51	○	○	○	X	X	X	X	X	X	X	X
KYU 58	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○
KYU 60	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○
KYU98	○	X	X	○	X	X	X	X	○	○	X
KYU129	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○	○

Host spectrum을 통해 확인된 결과 분리된 virulent phage 중 ES2와 EI-1 phage을 이용하여 Cronobacter sakazakii의 제어에 사용하였다.

분리된 ES2, EI-1을 각각 LBC broth에 접종 후 Cronobacter sakazakii ATCC29544를 접종하고 37도에서 200rpm으로 배양하면서 시간마다 흡광도를 측정하여 균 감소 효과를 확인하였다. 그 결과 시간이 흐름에 따라 virulent phage를 접종하지 않은 Cronobacter sakazakii의 경우는 흡광도 값이 지속적으로 증가하는 반면, virulent phage와 함께 배양하였을 경우 흡광도 값이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 분리된 ES2, EI-1 phage를 시판 중인 분유를 제조 방법에 따라 조제한 후 Cronobacter sakazakii ATCC29544를 약 2 log CFU/mL로 접종 후 약 6 log PFU/mL로 접종하여 시간이 지남에 따라 Cronobacter sakazakii의 감소 정도를 비교하였다. 그 결과 virulent phage를 infection하지 않았을 경우는 시간이 지나감에 따라 계속 증가하는 양상을 나타내고 있으나, ES2와 EI-1을 각각 함께 배양하였을 경우에는 Cronobacter sakazakii가 증가하지 않는 것으로 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조). 이들 독성파아지는 2010년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 ES2(수탁번호 KCTC11614BP) 및 EI-1(수탁번호 KCTC11613BP)로 기탁하였다.

또한, 분리된 ES2와 EI-1 bacteriophage를 혼합하여 cocktail 형태로 제조 후 식품으로부터 분리된 Cronobacter sakazakii KYU48, KYU50, KYU51, KYU60, KYU98을 각각 배양 후 5개의 분리주를 혼합하여 co-culture를 했을 때 ES2와 EI-1 phage cocktail에 의한 감소 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과 5주의 Cronobacter sakazakii의 생육 억제 효과는 ES2와 EI-1을 각각 처리했을 경우, phage를 처리하지 않았을 경우에 비해 생육을 억제하는 효과가 있었으며, phage cocktail 형태로 처리하였을 경우 균의 감소를 확인할 수 있었다. 따라서 단독으로 phage를 처리할 경우보다 혼합 형태로 처리하였을 때 Cronobacter sakazakii에 대한 제어가 효과적이었다(도 3 참조).

한국생명공학연구원

KCTC11614

20100106

한국생명공학연구원

KCTC11613

20100106

Claims

Cronobacter sakazakii 생육을 저해하는 효과를 가지는 독성파아지 ES2(수탁번호 KCTC11614BP) 또는 EI-1(수탁번호 KCTC11613BP).
Cronobacter sakazakii 생육 제어 방법으로서,
Cronobacter sakazakii가 포함된 시료에 독성파아지 ES2(수탁번호 KCTC11614BP) 및 EI-1(수탁번호 KCTC11613BP)을 함께 처리하는 것을 특징으로 하는 Cronobacter sakazakii 생육 제어 방법.