SK154997A3 - Promoters for gene expression - Google Patents
Promoters for gene expression Download PDFInfo
- Publication number
- SK154997A3 SK154997A3 SK1549-97A SK154997A SK154997A3 SK 154997 A3 SK154997 A3 SK 154997A3 SK 154997 A SK154997 A SK 154997A SK 154997 A3 SK154997 A3 SK 154997A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- protein
- recombinant dna
- seq
- promoter
- dna construct
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 3
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 9
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 9
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 9
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 8
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229920000267 ladder-type polyparaphenylene Polymers 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101000992180 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) Outer membrane protein Omp38 Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001316618 Allexis Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 1
- 102400000326 Glucagon-like peptide 2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101001086530 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Outer membrane protein P5 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 101150019416 trpA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblasť techniky
Tento vynález sa týka oblasti genetického inžinierstva aplikovaného na bakteriálnych hostiteľov. Presnejšie, vynález sa týka expresných systémov na produkciu proteínov v bakteriálnych hostiteľoch.
Doterajší stav techniky
Príchod technológie rekombinantnej DNA umožnil produkciu rôznych prirodzene sa vyskytujúcich a syntetických proteínov v organizmoch ako sú baktérie, huby, kvasinky a cicavčie bunky. Vo všeobecnosti táto produkcia vyžaduje inzerciu génov, ktoré kódujú požadovaný proteín, do hostiteľského organizmu a využitie bunkového mechanizmu na expresiu génu.
Technológia rekombinantnej DNA sa kontinuálne vyvíja aby bola dosiahnutá produkcia v komerčne akceptovateľných množstvách. Limitujúcim faktorom pri rekombinantnej produkcii proteínov je stupeň, v ktorom je gén kódujúci požadovaný proteín exprimovaný. Presnejšie, bolo zistené, že promotorový región génu je zásadným v procese transkripcie pri génovej expresii. Účinný promotor, ako je trp promotor nájdený v E. coli, sa tesne viaže k DNA-riadenej RNA polymeráze aby sa navodila transkripcia génu pri vytváraní mRNA. Menej účinný promotor, ako je lac promotor viaže RNA polymerázu menej tesne, čo vedie k nižšej rýchlosti generovania mRNA.
trp promotor je široko používaný pri produkcii heterológnych proteínov vzhľadom ku svojej schopnosti účinne iniciovať transkripciu. Navzdory jeho účinnosti, základnou nevýhodou trp promotora je to, že nie je ľahko
Z kontrolovateľný. Presnejšie, trp promotor nie je plne reprimovateľný, t.j. môže riadiť transkripciu pred tým, než je hostiteľ v kultúre kultivovaný do vhodnej fázy na f
produkciu proteínu. Iným široko používaným promotorom je lac promotor, ktorý je menej účinný ako trp, ale je lepšie kontrolovateľný.
Pre vývoj nových účinných promótorov boli kombinované funkčné zložky rôznych promótorov, napríklad ako je popísané v U.S. patente č. 5.362.646. V jednom príklade boli časti bakteriofágového T7 promótora A-, (PA1) kombinované s dvoma lac operátormi. Presnejšie, intergénový región medzi takzvanými -35 a -10 t
regiónmi bakteriofágového T7 promótora bol nahradený modifikovanou sekvenciou lac operátora a na kontrolu vzniknutého promotorového hybridu bol druhý lac operátor zavedený downstream. Bolo zistené, že vzniknutý promotor/operátorový systém, ktorý je inkorporovaný do komerčne dostupných pUHE plazmidov, účinne iniciuje transkripciu indukciou a je vysoko reprimovateľný pred indukciou.
Iný promótor popísaný Tsungom et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 5940) obsahuje účinný trp -35 región, -10 región z vysoko účinného lppP-5 t
promótora (varianta Ipp promótora) a intergén odvodený od lac promotora. Pri tomto promótore bolo ukázané, že je vysoko účinný v iniciácii transkripcie, čo vedie k bunkovej letalite. Zatiaľčo rôzne iné promotory umožňujú výťažku proteínov z mikrobiálnych hostiteľov, stále existuje potreba promótorov, ktoré ešte účinnejšie riadia produkciu proteínov komerčnej hodnoty.
Podstata vynálezu
Podľa jedného aspektu predkladaného vylálezu je tu poskytnutý konštrukt rekombinantnej DNA použiteľný na expresiu proteínu v bakteriálnom hostiteľovi. Konštrukt obsahuje kódujúci región pre proteín a s ním viazaný kontrolný región obsahujúci promótor majúci DNA sekvenciu vybranú z:
5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'; a
5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'.
Popis obrázkov na pripojených výkresoch.
Obrázok 1 ilustruje nukleotidovú sekvenciu a schématickú reprezentáciu expesnej kazety inkorporujúcej konštrukty rekombinantnej DNA podľa predkladaného vynálezu.
Obrázky 2 a 3 ilustrujú nukleotidovú sekvenciu DNA konštruktov podľa predkladaného vynálezu, ktorá obsahuje promotorový a operátorový región.
predkladaný vynález poskytuje DNA sekvencie použiteľné pri riadení DNA expresie s vysokou účinnosťou v bakteriálnych hostiteľoch ako je E. coli. Použitie expresných vektorov obsahujúcich tieto sekvencie poskytuje hodnotné prostriedky na dosiahnutie zvýšenej produkcie expresibilých proteínov, ako endogénnych, tak heterológnych. V jednom aspekte vynálezu je tu poskytnutý nový rekombinantný DNA konštrukt použiteľný na expresiu proteínu v bakteriálnom hostiteľovi. Konštrukt obsahuje kódujúci región pre proteín operatívne viazaný na promotor na umožnenie expresie uvedeného proteínu v hostiteľovi, kde promotor obsahuje DNA sekvenciu vybranú z:
5'-TTGACAAC ATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3' ; a
5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'.
Tieto promotory majú spoločnú konsenzus sekvenciu -35 regiónu TTGACA a sekvenciu -10 regiónu TATACT. Intergénová sekvencia, t.j. sekvencia s 18 bázami, ktorá je včlenená, môže byť podľa predkladaného vynálezu buď sekvencia ACATAAAAAACTTTGTGT alebo CTTTATGCTTCCGGCTCG a výhodne je to sekvencia ACATAAAAAACTTTGTGT. V súlade s tým poskytuje vynález vo výhodnom uskutočnení DNA konštrukty, v ktorých je DNA kódujúca požadovaný proteín operatívne naviazaná pod expresnú kontrolu na promotorovú sekvenciu 5'TTGACAAC ATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'.
Odborníci v odbore ocenia, že promotory podľa predkladaného vynálezu vytvárajú jeden základný element požadovaných zložiek, vo vnútri funkčného kontrolného regiónu, na riadenie expresie. Okrem toho, tieto promotory môžu byť inzertované použitím štandardných postupov do akéhokoľvek vhodného expresného vektora, ktorý sa môže replikvať v Gram+ alebo v Gram' baktériách. Presnejšie, a na vytvorenie kontrolného regiónu génovej expresie, predkladané promotory budú inkorporované s takými ďalšími kontrolnými elementárni, ktoré sú typicky vyžadované na túto expresiu, vrátane väzobného miesta pre ribozómy, a v uskutošnení podľa predkladaného vynálezu, operátorom, ktorého funkciou je kontrolovať funkciu promotora.
Tieto zložky musia byť zostavené vo vzťahu jedna k druhej ako je to nutné pre priebeh expresie podľa dobre známych pravidiel génovej expresie.
V jednom uskutočnení vynálezu inkorporuje kontrolný región konštruktu operátor. Operátory, ktoré môžu byť použité, zahŕňajú tie, ktoré sú priamo indukovateľné chmickými induktormi a tie, ako je lac, ktoré sú dereprimovateľné. Príklady vhodných operátorov zahŕňajú E. coli laktózový, glaktózový, tryptofánový a tetracyklínový operátor (viz Miller et al., The Operon, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980, a Hillen et al., J. Mol. Biol., 1984, 172: 185). Výhodnými operátormi sú vysoko reprimovateľné, takže expresia DNA kódujúcej proteín môže byť kontrolovaná. V špecifickom uskutočnení, obsahuje kontrolný región lac operátor (obr. 1), ktorý bráni expresii z promotora v prípade, že chýba syntetický induktor izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid (IPTG) a prirodzený induktor laktózy.
Kontrolný región tiež obsahuje sekvenciu väzobného miesta pre ribozóm (RBS) na uľahčenie väzby ribozómov na mRNA transkript a tak na iniciáciu translácie RNA kódujúceho regiónu na generovanie proteínu. Vhodné väzobné miesta pre ribozómy obsahujú lac a bakteriofág T5. Vo výhodnom uskutočnení je RBS sekvencia odvodená od T5 bakteriofágového RBS, ktoré má sekvenciu 5'ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3'.
Kontrolné regiónu konštruktov podľa predkladaného vynálezu sú operatívne naviazané na kódujúce regióny pre endogénne a heterológne proteíny. Termín heterológne proteíny označuje polypeptidy alebo proteíny, ktoré, hoci nie sú prirodzene produkované bakteriálnym hostiteľom, sú exprimované týmto hostiteľom, pokiaľ je vhodne transformovaný DNA kódujúcou proteín; genómová DNA, cDNA a syntetická DNA môže byť použitá na transformáciu hostiteľa. Proteíny, ktoré môžu byť produkované použitím tu popísaného systému zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, hormóny ako je paratyreoidálny hormón (PTH), glukagón alebo jeho fragmenty a príbuzné peptidy ako je GLP-1 a GLP-2, rastové faktory ako je epidermálny rastový faktor (EGF); a lymfokíny ako je interleukín-6 a 5 (IL-6, -8). Na uľahčenie izolácie autentických foriem proteínu, t.j. proteínu bez ďalšieho Met zvyšku, môžu byť tiež produkované fúzne proteíny, ktoré sú štiepené po expresii. Napríklad, DNA kódujúca požadovaný proteín môže byť za DNA, ktorá kóduje signálny peptid, ako napríklad E. coli vonkajší membránový proteín ompA. V tomto prípade, expresiou génu vzniká fúzny proteín obsahujúci ompA signálny peptid s N-Met, ktorý je nasledovaný požadovaným proteinom. Signálny peptid prenáša fúzny proteín cez intermembránu baktérie, kde je signálny peptid štiepený. Iné signálne peptidy, ktoré môžu byť použité, obsahujú alkalickú fosfatázu, E. coli termostabilný enterotoxín II a proteín A od Streptococcus. Alternatívne, fúzny proteín môže byť syntetizovaný a štiepený oddeleným postupom, aby sa vyťažil požadovaný proteín. Napríklad glutatión-S-transferáza (GST) môže byť vyštiepená z požadovaného proteínu trombínom alebo faktorom Xa.
V špecifickom uskutočnení vynálezu obsahuje kódujúci región DNA kódujúcu humánny PTH, ktorého aminokyselinová sekvencia je popísaná Hendym et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7365). V príkladoch, ktoré sú tu popísané je DNA sekvencia kódujúca PTH priamo na a v čítacom rámci s DNA kódujúcou ompA signálny peptid.
Výhodné rekombinantné DNA konštrukty ilustrované na obrázku 1, majúce Ipp alebo lacUV5 intergén, boli produkované z jednoreťazcových oligonukleotidov syntetizovaných fosforamiditovou metódou. Gélovo purifikovaný teťazec obsahujúci sekvencie od Xhol do EcoRI reštrikčného miesta bol potom použitý ako iniciačná cieľová sekvencia pre PCR a bol PCR amplifikovaný do dvojreťazcového fragmentu použitím komplementárnych jednoreťazcových DNA oligonukleotidov, ktoré špecificky hybridizujú na konce buď iniciačnej oligonukleotidovej sekvencie alebo na jej komplementárny reťazec. Takže konštrukty sú pripravené použitím štandardnej metódy génovej syntézy ako je popísaná napríklad v Maniatis et al., (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) a Innis et al. (PCR protócols, A guide to Methods and Applications).
V inom aspekte vynálezu sú poskytnuté expresné vektory použiteľné na produkciu transformantov bakteriálnych hostiteľských buniek, ktoré inkorporujú rekombinantný DNA konštrukt podľa predkaldaného vynálezu. DNA konštrukty podľa predkladaného vynálezu môžu byť inkorporované ako kazeta” do vektora, výhodne do plazmidového vektora, zavedenými technikami. Vo všeobecnosti, vektor je štiepený v reštrikčných miestach, ktoré korešpondujú s reštrikčnými miestami na jednom z koncov kazety. Kazeta je potom včlenená ligáciou koncov do komplementárne štiepených miest vektora.
Hoci môžu byť použité bakteriofágové vektory, výhodnými sú plazmidové vektory ako je pBR322 a pUC séria plazmidov, Po začlenení do vhodného vektora, môže byť vzniklnutý plazmid amplifikovaný v hostiteľovi; aby sa získalo dostatočné množstvo pre následné kolonovanie. Bude treba brať do úvahy, že DNA kódujúca vybraný proteín je vhodne inkorporovaná do plazmidu, ktorý je vybavený mnohými kolonovacími miestami, použitím štandardných klonovacích/ligačných metód. Plazmid tiež nevyhnutne musí obsahovať počiatok replikácie a je žiaduce, aby obsahoval markery ako sú gény rezistencie na ampicilín alebo tetracyklín, aby bola umožnená selekcia transformovaných buniek. Bude tiež treba brať do úvahy, že na uspokojivú expresiu požadovaného proteínu, budú nevyhnutné správne umiestnenie translačných stop kodónov vo všetkých troch čítacích rámcoch a správne umiestnený transkripčný terminačný región. Vhodné transkripčné terminátory zahŕňajú transkripčné terminátory z E. coli trpA, thr, his a phe génov.
Po včlenení DNA kódujúcej požadovaný proteín clo vektora je týmto vektorom transformovaný vybraný bakteriálny hostiteľ použitím štandardnej chloridom vápenatým sprostrodkovanej transformačnej techniky. Vhodní bakteriálni hostitelia zahŕňajú Gram negatívne baktérie ako je E. coli a Salmonella. Výhodnýcm hostiteľom je komerčne dostupný kmeň E. coli a najlepšie JM101 a jeho deriváty.
Pokiaľ kontrolný región DNA konštruktu obsahuje lac operátor, ako je tu popísané podrobnejšie ďalej, potom by transformovaný hostiteľský kmeň mal byť schopný oxprimovať, a požadovane v niektorých prípadoch nadprodukovať, lacl produkt, takže funkcia promotora a preto expresia proteínu môžu byť regulované. Potreba nadprodukcie lacl niektorými transformantami môže byť dosiahnutá podľa jedného uskutočnenia vynálezu, použitím hostiteľov, ktorý už nesú lacl9 gén zodpovedný za nadprodukciu lacl produktu. Lacl nadprodukujúce kmene E. coli, ktoré môžu byť použité ako hostitelia, zahŕňajú JM sériu kmeňov dostupnú od Clontech Laboratories Inc., California, USA. Špecifické hostiteľské kmene vhodné na použitie zahŕňajú JM101, JM105 a JM107. Alternatívne, lacl nadprodukcia v transformantoch môže byť dosiahnutá včlenením laclq génu do vektorov podľa predkladaného vynálezu. Pretože je, v tejto situácii, nadprodukcia lacl sprostredkovaná vektorom, môže byť využitý ktorýkoľvek z mnohých komerčne dostupných bakteriálnych hostiteľských kmeňov, vrátane E. coli kmeňov DH1, RR1, C600, CMK603 a EB505. Lacq gén, ktorý má byť včlenený do vektora, môže byť získaný ako 1,2 kb Hindlll fragment plazmidu pMMB22 (ktorý popísal Bagdasarian et al., Gene 1983, 26: 273) a potom môže byť včlenený bez narušenia v akomkoľvek mieste plazmidového vektora.
Na zvýšenie stability dedičnosti vektorov, hlavne plazmidov, z pôvodne transformovaného kmeňa na jeho potomstvo, môže byť do vektora včlenený tiež oddeľujúci element (par), ktorý je funkčný v E. coli. Jeden taký par element môže byť uvolnený z pSC101 ako 380 bp Hincll/Aval fragment a môte byť potom klonovaný do vhodného miesta vektora.
Po transformácii sú bakteriálni hostitelia nesúci expresný vektor kultivovaný v kultivačnom médiu najvhodnejšom pre vybraného hostiteľa. Pre E. coli môže byť použitý LB bujón alebo 2YT médium (kvasinkový extrakt/tryptón) na kultiváciu tu preferovaných kmeňov. Selektívny tlak na plazmidové transformanty by mal byť udržovaný cytotoxickým agensom, ktorý zabíja netransformované hostiteľské bunky. Napríklad, transformanty nesúce gén pre rezistenciu na tetracyklín by mali byť kultivované v médiu obsahujúcom tetraciklín. Vhodné sú koncentrácie tetracyklínu v médiu okolo 5-15 pg/ml.
r
Promotor na konštrukte je výhodne regulovateľný prostredníctvom väzby represorovej molekuly na operátor umiestnený v susedstve promótora v kontrolnom regióne. Vo výhodnom uskutočnení sa lacl génový produkt viaže na lac z
operátor umiestnený v susedstve promótora. V tomto prípate reprimuje väzba lacl
Z produktu promoter, čo znižuje expresné hladiny kódujúcej DNA, ktorá je pod jej kontrolou. Na zvýšenie hladiny expresie je chemický IPTG (izopropyl-p-Df tiogalaktopyranozid), ktorý sa viaže na lacl a dereprimuje promoter, pridaný do kultivačného média na derepresiu promótora a indukciu expresie. Vhodne je 1PTG pridaný do kultivačného média vtedy, keď bunky dosiahli strednú log rastovú fázu.
Na určenie optimálnej hustoty, pri ktorej by kultúra mal byť kultivovaná na dosiahnutie maximálneho výťažku požadovaného proteínu môžu vyť uskutočnené pokusy a môže byť testovaná hladina proteínu v priebehu pokusu. Vo všeobecnosti, dostatočný výťažok proteínu môže byť získaný vtedy, keď bunky dosiahnu strednú log fázu, hoci akumulácia vyššieho množstva proteínu sa môže očakávať v priebehu 4-5 nasledujúcich hodín.
Požadovaný proteín môže byť purifikovaný technikami zavedenými v odbore, ktoré su vhodné pre určitý proteín. V špecifickém uskutočnení vynálezu je exprimovaný PTH exkretovaný cez periplazmatický priestor a do kultivačného média, kde je získavaný priamo. Pokiaľ je proteín exkretovaný, potom môže byť vyčerpané médium izolované použitím biochemických techník, ktoré rešpektujú charakter protínu v zmysle jeho molekulovej veľkosti, náboja, izoelektrického bodu atď. Médium môže byť najprv koncentorvané, napríklad lyofilizáciou. Ďalej, pokiaľ sú dostupné protilátky, alebo prirodzený ligand proteínu, môžu byť použité afinitné kolóny.
Špecifické uskutočnenia vynálezu budú teraz doložené príkladmi s odkazom na obrázky.
Príkladu uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
V zrelej forme je PTH 84 aminokyselinový peptid, ktorý u ľudí zvyšuje hladinu vápnika v krvi a moduluje tvorbu kostí. DNA kódujúca ľudský PTH bola syntetizovaná použitím zavedených techník a podľa aminokyselinovej sekvencie publikovaná Hendym et al., vyššie, a bola včlenená do konštruktov popísaných ďalej, ako je ukázané na obr. 1.
Výhodné DNA konštrukty obsahujú promotor č. 1 a 2, rovnako ako referenčné promotory č. 3 a 4 ilustrované v tabuľke 1 a na obrázku 1, na ktoré odkazujeme, boli produkované z jednoreťazcového oligonukleotidu syntetizovaného fosforamiditovou metódou. Gélovo purifikovaný reťazec obsahujúci sekvencie od Xhol do EcoRI reštrikčného miesta bol potom použitý ako iniciačná cieľová sekvencia pre PCR a bol PCR amplifikovaný do dvojreťazcového fragmentu použitím komplementárnych jednoreťazcových DNA oligonukleotidov, ktoré špecificky hybridizujú na konce buď iniciačnej oligonukleotidovej sekvencie alebo na jej komplementárny reťazec. Takže konštrukty sú pripravené použitím štandardnej metódy génovej syntézy ako je popísaná napríklad v Maniatis et al., (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) a Innis et al. (PCR protocols, A guide to Methods and Applications).
Konštrukty boli potom klonované do od pUC18 odvodených plazmidov, ktoré zavádzajú rezistenciu na tetracyklín miesto rezistencie na ampicilín. JM1Q1 odvodený kmeň E. coli bol potom transfektovaný podľa zavedených techník (viz Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982).
Príklad 2
Expresia transformovaných hostiteľov
Transformanty obsahujúce PTH vektory boli kultivované cez noc pri 30°C v 2YT bujóne obsahujúcom 0,5 % glukózu a tetracyklín a potom boli inokulované do čerstvého média s rovnakým zložením, kde pokračovala kultivácia pri 30 °C pokiaľ nebola dosiahnutá log fáza. Kultúry boli potom indukované (1mM IPTG) v 1 hodinových intervaloch, aliquoty kultúr boli odoberané a frakcionované, zaúčelom produkcie vzoriek kultivačného média na identifikáciu exkretovaných PTH produktov použitím štandardného Allegro testu. Výsledky testu sú v tabuľke 1, nižšie.
iô
Tabuľka 1
| Promotor | RBS | Max PTH (mg/l) 6-8 hod. | |||
| č. | -35 región | intergén | -10 región | ||
| 1 | trp | Ipp | lppP-5 | T5 lac | 245 148 |
| 2 | trp | /acUV5 | lppP-5 | T5 lac | 121 10 |
| 3 | trp | /acO | lppP-5 | T5 lac | 50 5 |
| 4 | T7 | /acO | T7 | T5 lac | 100 10 |
Výsledky Allegro testu ukazujú, že promotory obsahujúce 18 bp Ipp a /acUV5 sekvencie uľahčujú zvýšenie hladín hotorológneho PTH proteínu. Promotery č. 1 a č. 2 sú lepšie v porobaní s promotorom č. 3, v ktorom bol intergén substituovaný modifikovanou sekvenciou lac operátora (lacO); a v porovnaní s promotorom č. 4, kde je -35 región a -10 región z bakteriofága T7 a intergén je lacO promotor. Štúdia s rovnakými promótormi exprimujúcimi gén kódujúci chloramfenikol acetyl transferázu (CAT) ukázali podobné výsledky zvýšenej expresie pre promotory č. 1 a č. 2. Tiež bolo zaznamenané, že každý zo študovaných promotorov vykazoval zvýšený výťažok proteínu, pokiaľ bol kombinovaný s RBS z bakteriovága T5 v porovnaní s RBS odvodeným od lac.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) Prihlasovateľ: Allexis Biopharmaceuticals INC.
(ii) Názov vynálezu: Promotory na génovú expresiu (iii) Počet sekvencií: 11 (iv) Adresa pre korešpondenciu (A) Adresa: Nikaido, Marmelstein, Murray and Oram LLP (B) Ulica: 655 Fifteenth Street N.W. Suite 330 (C) Mesto: Washington (D) Štát: D.C.
(E) Krajina: USA (F) ZIP: 20005-5071 (v) Počítačová čítacia forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verzia #1.25 (vi) Údaje o súčasnej prihláške:
(A) Číslo prihlášky: P C T/l B96/00462
I 1 (B) Dátum podania: 16.5.1996 (C) klasifikácia:
(vii) Predchádzajúce dáta prihlášky:
(A) Číslo prihlášky: US 08/445133 (B) Dátum podania: 16.5.1995 (viii) Zástupca/agent informácie (A) Meno: Strachan, Graham (B) Referencia/číslo registra: F8074-6007 (ix) Telekomunikačné informácie:
(A) Telefón: (202) 638-5000 (B) Telefax: (202) 638-4810 (2) Informácie o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 30 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT 30 (2) Informácie o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 30 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 2:
TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT 30 (2) Informácie o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 18 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
ACATAAAAAA CTTTGTGT 18 (2) Informácie o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 18 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
CTTTATGCTT CCGGCTCG 18 (2) Informácie o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristiky sekvencie:
. (A) Dĺžka: 21 bázových párov (B) Týp: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna.
(ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC (2) Informácie o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 136 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 6:
CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACAAC ATAAAAAACT 60 TTGTGTTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCATTAAAGA 120
GGAGAAATTA AGCATG 136 (2) Informácie o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 132 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 7:
CTCGAGGCCA CČCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACAAC ATAAAAAACT 60 TTGTGTTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCAGGAGGAA 12
AAAATTATGA TG 13 2 (2) Informácie o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 136 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 8:
CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACACT TTATGCTTCC 60
GGCTCGTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCATTAAAGA 12.0
GGAGAAATTA AGCATG (2) Informácie o SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 132 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 9:
CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACACT TTATGCTTCC 60 GGCTCGTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCAGGAGGAA 120 AAAATTATGA TG 13?
(2) Informácie o SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 136 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 10:
CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACATT GTGAGCGGAT 60 AACAATTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCATTAAAGA 12.0
GGAGAAATTA AGCATG 13 G (2) Informácie o SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 132 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 11:
CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACATT GTGAGCGGAT 60
AACAATTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCAGGAGGAA 120
AAAATTATGA TG 112(2) Informácie o SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 101 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 12:
CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AT T GACAACA TAAAAAACTT TGTGTTATAC 60 TGTCGACAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGAATT C
10A (2) Informácie o SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 101 bázových párov . (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý , (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 13:
CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA ATTGACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATAC 60 Λ Oz
TGTCGACAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGAATT C
7í/ /777 - 7/
Claims (14)
1. Rekombinantný DNA konštrukt, ktorý exprimuje protein v bakteiálnom hostiteľovi kde konštrukt obsahuje kódujúci región pre protein, ktorý je operatívne t
naviazaný na kontrolný región obsahujúci promotor, ktorý umožňuje expresiu uvedeného proteínu v hostiteľskej bunke, vyznačujúci sa tým, že promotor obsahuje DNA sekvenciu skladajúcu sa z
5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3' (SEQ ID NO: 1); a
5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'(SEQ ID NO: 2).
2. Rekombinantný DNA konštrukt podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že /
promotorový región obsahuje DNA sekvenciu
5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3' (SEQ ID NO: 1).
3. Rekombinantný DNA konštrukt podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedenou bakteriálnym hostiteľom je E. coli.
4. Rekombinantný DNA konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že kontrolný región navyše obsahuje operátor na reguláciu expresie proteínu.
5. Rekombinantný DNA konštrukt podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že operátor je lac operátor.
6. Rekombinantný DNA konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov, 1 až 5, ' ' I vyznačujúci sa tým, že protein je ľudský paratyreoidálny hormón.
7. Rekombinantný DNA konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že navyše obsahuje DNA kódujúcu OmpA signálny peptid v čítacom rámci s kódujúcim regiónom, čo navodzuje vylučovanie proteínu do periplazmy hostiteľskej bunky.
8. Rekombinantný DNA konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že kontrolný región obsahuje T5 ribozómové väzobné miesto majúce DNA sekvenciu
5'- ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3' (SEQ ID NO: 5)
9. Rekombinantný DNA konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že kontrolný región obsahuje sekvenciu danú na obrázku 2 (SEQ ID NO: 12).
10. Rekombinantný DNA konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že kontrolný región obsahuje sekvenciu danú na obrázku 3 (SEQ ID NO: 13).
11. Vektor obsahujúci rekombinantný DNA konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1až10.
12. Bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná vektorom podľa nároku 11.
13. Bakteriálna hostiteľská bunka podľa nároku 11, ktorou je E. coli.
14.Spôsob výroby rekombinantného proteínu vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek podľa nároku 12 alebo 13 v podmienkach, pri ktorých je uvedený proteín produkovaný, a získanie uvedeného proteínu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/445,133 US5629205A (en) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | Promoters for gene expression |
| PCT/IB1996/000462 WO1996036721A1 (en) | 1995-05-19 | 1996-05-16 | Promoters for gene expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK154997A3 true SK154997A3 (en) | 1998-05-06 |
Family
ID=23767732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1549-97A SK154997A3 (en) | 1995-05-19 | 1996-05-16 | Promoters for gene expression |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5629205A (sk) |
| EP (1) | EP0828844B1 (sk) |
| JP (2) | JP3828576B2 (sk) |
| KR (1) | KR19990014906A (sk) |
| CN (1) | CN1131313C (sk) |
| AT (1) | ATE248923T1 (sk) |
| AU (1) | AU698656B2 (sk) |
| BR (1) | BR9609102A (sk) |
| CA (1) | CA2221587C (sk) |
| CZ (1) | CZ357997A3 (sk) |
| DE (1) | DE69629808T2 (sk) |
| DK (1) | DK0828844T3 (sk) |
| EE (1) | EE9700355A (sk) |
| ES (1) | ES2202436T3 (sk) |
| HK (1) | HK1004148A1 (sk) |
| HU (1) | HUP9900750A3 (sk) |
| IS (1) | IS4609A (sk) |
| MX (1) | MX9708689A (sk) |
| NO (1) | NO325879B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ306536A (sk) |
| PL (1) | PL324226A1 (sk) |
| PT (1) | PT828844E (sk) |
| SK (1) | SK154997A3 (sk) |
| TR (1) | TR199701394T1 (sk) |
| WO (1) | WO1996036721A1 (sk) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6194168B1 (en) * | 1997-09-30 | 2001-02-27 | Human Genome Sciences, Inc. | Expression control sequences |
| WO2003099854A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| US20050119183A1 (en) * | 2003-11-12 | 2005-06-02 | Nps Allelix Corp. | Method for treating bone loss using parathyroid hormone |
| ME01366B (me) * | 2003-11-21 | 2013-12-20 | Nps Allelix Corp | POSTUPAK ZA PROIZVODNJU PEPTIDA 2 NALIK NA GLUKAGON l NJIHOVIH ANALOGA |
| WO2005058946A2 (en) * | 2003-12-12 | 2005-06-30 | Zymogenetics, Inc. | Methods for enhancing expression of recombinant proteins |
| MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
| NZ758485A (en) | 2017-04-27 | 2024-02-23 | Juno Therapeutics Gmbh | Oligomeric particle reagents and methods of use thereof |
| CN108060168B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-06-29 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的t载体和应用 |
| CN108165551B (zh) * | 2017-12-30 | 2021-06-29 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的t载体和应用 |
| CN108118059B (zh) * | 2017-12-30 | 2021-03-19 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的载体和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8517071D0 (en) * | 1985-07-05 | 1985-08-14 | Hoffmann La Roche | Gram-positive expression control sequence |
| EP0303925B1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Hochreprimierbare Expressionskontrollsequenzen |
| US5223407A (en) * | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| US5171670A (en) * | 1989-05-12 | 1992-12-15 | The General Hospital Corporation | Recombinant dna method for production of parathyroid hormone |
| ES2076544T3 (es) * | 1990-08-28 | 1995-11-01 | Du Pont | Procedimiento para seleccion rapida de vectores de secrecion eficaces. |
-
1995
- 1995-05-19 US US08/445,133 patent/US5629205A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-16 CN CN96195518A patent/CN1131313C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 ES ES96912181T patent/ES2202436T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 CA CA002221587A patent/CA2221587C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 PT PT96912181T patent/PT828844E/pt unknown
- 1996-05-16 TR TR97/01394T patent/TR199701394T1/xx unknown
- 1996-05-16 EE EE9700355A patent/EE9700355A/xx unknown
- 1996-05-16 SK SK1549-97A patent/SK154997A3/sk unknown
- 1996-05-16 PL PL96324226A patent/PL324226A1/xx unknown
- 1996-05-16 EP EP96912181A patent/EP0828844B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 CZ CZ973579A patent/CZ357997A3/cs unknown
- 1996-05-16 WO PCT/IB1996/000462 patent/WO1996036721A1/en active IP Right Grant
- 1996-05-16 NZ NZ306536A patent/NZ306536A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-05-16 AT AT96912181T patent/ATE248923T1/de active
- 1996-05-16 JP JP53467596A patent/JP3828576B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 AU AU55116/96A patent/AU698656B2/en not_active Expired
- 1996-05-16 KR KR1019970708251A patent/KR19990014906A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-05-16 BR BR9609102A patent/BR9609102A/pt unknown
- 1996-05-16 DK DK96912181T patent/DK0828844T3/da active
- 1996-05-16 HU HU9900750A patent/HUP9900750A3/hu unknown
- 1996-05-16 DE DE69629808T patent/DE69629808T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-16 MX MX9708689A patent/MX9708689A/es unknown
-
1997
- 1997-11-07 IS IS4609A patent/IS4609A/is unknown
- 1997-11-18 NO NO19975286A patent/NO325879B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-24 HK HK98103447A patent/HK1004148A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-03-13 JP JP2006066844A patent/JP3837154B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1328628B1 (de) | Verfahren zur exposition von peptiden und polypeptiden auf der zelloberfläche von bakterien | |
| Kawasaki et al. | Roles of Escherichia coli heat shock proteins DnaK, DnaJ and GrpE in mini-F plasmid replication | |
| JP2645217B2 (ja) | 植物細胞内で発現するキメラ遺伝子 | |
| CA1253092A (en) | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products | |
| JP3837154B2 (ja) | 遺伝子発現用プロモーター | |
| US5232840A (en) | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site | |
| SK116896A3 (en) | Enhanced secretion of polypeptides | |
| JP3416888B2 (ja) | プラスミド安定化 | |
| CA1340091C (en) | Enhanced protein production in bacteria by employing novel ribosome binding site | |
| JPH04502851A (ja) | 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム | |
| MXPA97008689A (en) | Promoters of the expression of ge | |
| Yamamoto et al. | Molecular organization of heat-labile enterotoxin genes originating in Escherichia coli of human origin and construction of heat-labile toxoid-producing strains | |
| JP2612264B2 (ja) | Ｄｎａ配列体 | |
| JP2545377B2 (ja) | Ｄｎａ配列体 | |
| JPS60199387A (ja) | 縦列配列した遺伝子をもつハイブリツド核酸配列 | |
| US5340732A (en) | Antiviral protein | |
| WO1990004026A1 (en) | New plasmid constructions for high level production of eukaryotic proteins | |
| JP3006970B2 (ja) | プラスミド | |
| WO1992014826A1 (en) | Bacillus thuringiensis-promoter | |
| JPH0686678A (ja) | 改良型バクテリオファージλｐＬプロモーター | |
| JPH09234083A (ja) | ｃｉｓ調節要素と一緒にプロモーターをコードするＤＮＡの使用およびペプチドを産生させる新規な方法 | |
| JP2003093061A (ja) | 新規発現ベクター | |
| JPH0646945B2 (ja) | 発現用ベクタ− |