JP3006970B2 - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
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- JP3006970B2 JP3006970B2 JP5057486A JP5748693A JP3006970B2 JP 3006970 B2 JP3006970 B2 JP 3006970B2 JP 5057486 A JP5057486 A JP 5057486A JP 5748693 A JP5748693 A JP 5748693A JP 3006970 B2 JP3006970 B2 JP 3006970B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、植物の宿主・ベクタ
ー系に用いるプラスミドに関するものである。さらに詳
しくは、この発明は、高等植物遺伝子の構造や機能の解
析、あるいは有用植物の育種に必要な突然変異体株の作
成等に用いることのできる新しいプラスミドに関するも
のである。
ー系に用いるプラスミドに関するものである。さらに詳
しくは、この発明は、高等植物遺伝子の構造や機能の解
析、あるいは有用植物の育種に必要な突然変異体株の作
成等に用いることのできる新しいプラスミドに関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】近年、生命体を構成する組織
とその機構についての分子遺伝学的解明と、それに伴う
技術的応用が急速に進歩しつつある。このような状況は
高等植物についても例外ではなく、たとえば、その発生
や分化、成長等に関係する遺伝子の構造と機能を明らか
にし、さらにはその遺伝子を人為的に操作することによ
って、遺伝的な優透性と均一性を永続的に維持しうる有
用な新種植物を作成しようとする試みが検討され始めて
いる。
とその機構についての分子遺伝学的解明と、それに伴う
技術的応用が急速に進歩しつつある。このような状況は
高等植物についても例外ではなく、たとえば、その発生
や分化、成長等に関係する遺伝子の構造と機能を明らか
にし、さらにはその遺伝子を人為的に操作することによ
って、遺伝的な優透性と均一性を永続的に維持しうる有
用な新種植物を作成しようとする試みが検討され始めて
いる。
【０００３】このような高等植物の遺伝子操作方法とし
ては、従来より、植物の宿主・ベクター系を用いて異種
遺伝子等を植物染色体に導入する方法が知られており、
そのためのクローニングベクターとして、土壌微生物ア
グロバクテリウム(Agrobacterium) のＴｉプラスミドを
利用した系が開発されている。このＴｉプラスミドは、
その配列中にＴ−ＤＮＡという転移ＤＮＡ因子を有して
おり、アグロバクテリウムが植物に感染すると、このＴ
−ＤＮＡが植物細胞内に移動し、最終的に植物核染色体
の一部として組み込まれる。しかもこのような転移には
Ｔ−ＤＮＡの全領域は必要ではなく、その両端の２５塩
基対からなる境界配列のみが重要な役割を果している。
従って、これらの境界配列に狭まれたＴ−ＤＮＡ領域に
異種ＤＮＡ等を挿入すれば、アグロバクテリウムを介し
て植物核染色体に挿入ＤＮＡを安定に組み込むことがで
きる（P. Zambryski : Annu. Rev. Genet., ２２、ｐ
ｐ．１−３０、１９８８；松本省吾、町田泰則：蛋白質
核酸酵素、３５、ｐｐ．２４７６−２４８９、１９９
０）。そして実際にこの系を用いた変種株の単離も報告
されている（K.A. Feldman他；Science,２４３、ｐｐ．
１３５１−１３５４、１９８９；C. Koncz他：EMBO Jou
rnal, ９、ｐｐ．１３３７−１３４６、１９９０）。
ては、従来より、植物の宿主・ベクター系を用いて異種
遺伝子等を植物染色体に導入する方法が知られており、
そのためのクローニングベクターとして、土壌微生物ア
グロバクテリウム(Agrobacterium) のＴｉプラスミドを
利用した系が開発されている。このＴｉプラスミドは、
その配列中にＴ−ＤＮＡという転移ＤＮＡ因子を有して
おり、アグロバクテリウムが植物に感染すると、このＴ
−ＤＮＡが植物細胞内に移動し、最終的に植物核染色体
の一部として組み込まれる。しかもこのような転移には
Ｔ−ＤＮＡの全領域は必要ではなく、その両端の２５塩
基対からなる境界配列のみが重要な役割を果している。
従って、これらの境界配列に狭まれたＴ−ＤＮＡ領域に
異種ＤＮＡ等を挿入すれば、アグロバクテリウムを介し
て植物核染色体に挿入ＤＮＡを安定に組み込むことがで
きる（P. Zambryski : Annu. Rev. Genet., ２２、ｐ
ｐ．１−３０、１９８８；松本省吾、町田泰則：蛋白質
核酸酵素、３５、ｐｐ．２４７６−２４８９、１９９
０）。そして実際にこの系を用いた変種株の単離も報告
されている（K.A. Feldman他；Science,２４３、ｐｐ．
１３５１−１３５４、１９８９；C. Koncz他：EMBO Jou
rnal, ９、ｐｐ．１３３７−１３４６、１９９０）。
【０００４】一方、このようなＴ−ＤＮＡとは別の転移
ＤＮＡ因子としてトウモロコシのトランスポゾンＡｃ因
子を用いた植物遺伝子の操作方法も知られている。この
トランスポゾンＡｃ因子は全長５キロ塩基対からなり、
両端に１１塩基対の逆位反復配列を有し、その内側には
このＡｃ因子を働かせるための転移酵素をコードする遺
伝子を有している（R.F. Pohlman他：Cell, ３７、ｐ
ｐ．６３５−６４３、１９８４；M. Muller-Neumann
他：Mol. Gen. Genet., １９８、ｐｐ．１９−２４、１
９８４）。従って、この転移酵素遺伝子を含む領域を欠
失するとこのＡｃ因子はその転移機能を喪失する（Defe
ctive Ａｃ：ｄＡｃ）が、両端の逆位反復配列が存在す
れば別の転移酵素遺伝子を導入することによってｄＡｃ
の転移機能を回復させることができる。このため、たと
えば転移酵素遺伝子の代わりに異種ＤＮＡ等をＡｃ因子
内に挿入して、転移酵素発現能を有する植物細胞に導入
すれば、Ａｃ因子の転移を介してその挿入遺伝子を植物
核染色体に組み込むことができ、最近では、トウモロコ
シのトランスポゾンＡｃ因子がタバコ、シロイヌナズ
ナ、ニンジンなどの双子葉植物中でも働くことが示され
ている。（B. Baker他:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
3, pp. 4844-4848, 1986; M. A. Van Sluys 他:EMBO J.
52, pp. 3881-3889, 1987）。また、タバコやシロイヌ
ナズナを材料とし、上記Ｔ−ＤＮＡ用いてｄＡｃを細胞
染色体に組み込み、その後転移酵素遺伝子を交配により
導入すると、ｄＡｃ配列が染色体上の別の位置に転移す
ることが報告されている（C. Grevelding 他：Proc. Na
tl. Acad. Sci USA,８９、ｐｐ．６０８５−６０８９、
１９９２；C. Rommens他：Mol. Gen. Genet., ２３１，
ｐｐ．４３３−４４１、１９９２；S. R. Scofield他：
Plant Cell、４、ｐｐ．５７３−５８２、１９９２）。
そして、Ａｃ因子はその約３分の２が同一染色体内で転
移することも知られている（J. D. G. Jones他：Plant
Cell，２、ｐｐ．７０１−７０７、１９９０）。
ＤＮＡ因子としてトウモロコシのトランスポゾンＡｃ因
子を用いた植物遺伝子の操作方法も知られている。この
トランスポゾンＡｃ因子は全長５キロ塩基対からなり、
両端に１１塩基対の逆位反復配列を有し、その内側には
このＡｃ因子を働かせるための転移酵素をコードする遺
伝子を有している（R.F. Pohlman他：Cell, ３７、ｐ
ｐ．６３５−６４３、１９８４；M. Muller-Neumann
他：Mol. Gen. Genet., １９８、ｐｐ．１９−２４、１
９８４）。従って、この転移酵素遺伝子を含む領域を欠
失するとこのＡｃ因子はその転移機能を喪失する（Defe
ctive Ａｃ：ｄＡｃ）が、両端の逆位反復配列が存在す
れば別の転移酵素遺伝子を導入することによってｄＡｃ
の転移機能を回復させることができる。このため、たと
えば転移酵素遺伝子の代わりに異種ＤＮＡ等をＡｃ因子
内に挿入して、転移酵素発現能を有する植物細胞に導入
すれば、Ａｃ因子の転移を介してその挿入遺伝子を植物
核染色体に組み込むことができ、最近では、トウモロコ
シのトランスポゾンＡｃ因子がタバコ、シロイヌナズ
ナ、ニンジンなどの双子葉植物中でも働くことが示され
ている。（B. Baker他:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
3, pp. 4844-4848, 1986; M. A. Van Sluys 他:EMBO J.
52, pp. 3881-3889, 1987）。また、タバコやシロイヌ
ナズナを材料とし、上記Ｔ−ＤＮＡ用いてｄＡｃを細胞
染色体に組み込み、その後転移酵素遺伝子を交配により
導入すると、ｄＡｃ配列が染色体上の別の位置に転移す
ることが報告されている（C. Grevelding 他：Proc. Na
tl. Acad. Sci USA,８９、ｐｐ．６０８５−６０８９、
１９９２；C. Rommens他：Mol. Gen. Genet., ２３１，
ｐｐ．４３３−４４１、１９９２；S. R. Scofield他：
Plant Cell、４、ｐｐ．５７３−５８２、１９９２）。
そして、Ａｃ因子はその約３分の２が同一染色体内で転
移することも知られている（J. D. G. Jones他：Plant
Cell，２、ｐｐ．７０１−７０７、１９９０）。
【０００５】さらにこの発明の発明者等は、酵母のＤＮ
Ａ組換え系（H. Araki他：J. Mol、Biol.,１８２、ｐ
ｐ．１９１−２０３、１９８５；H. Matsuzaki他：J.Ba
cteriol., １７２、ｐｐ．６１０−６１８、１９９０）
が植物遺伝子の新たな操作手段となりうることを見い出
している（H. Onouchi他：Nuc. Acids Res.,１９，ｐ
ｐ．６３７３−６３７８、１９９１）。すなわち、味噌
・醤油酵母の発現するＲタンパク質は、５８塩基対から
なる一組の特定配列を認識してその間のＤＮＡ組換えを
触媒するが、２つの特定配列が染色体上に同じ向きで存
在する場合には、それらが３５０キロ塩基対離れていて
もその間のＤＮＡ配列を全て欠失させることができる。
Ａ組換え系（H. Araki他：J. Mol、Biol.,１８２、ｐ
ｐ．１９１−２０３、１９８５；H. Matsuzaki他：J.Ba
cteriol., １７２、ｐｐ．６１０−６１８、１９９０）
が植物遺伝子の新たな操作手段となりうることを見い出
している（H. Onouchi他：Nuc. Acids Res.,１９，ｐ
ｐ．６３７３−６３７８、１９９１）。すなわち、味噌
・醤油酵母の発現するＲタンパク質は、５８塩基対から
なる一組の特定配列を認識してその間のＤＮＡ組換えを
触媒するが、２つの特定配列が染色体上に同じ向きで存
在する場合には、それらが３５０キロ塩基対離れていて
もその間のＤＮＡ配列を全て欠失させることができる。
【０００６】以上のように、高等植物の遺伝子を人為的
に操作する方法として、Ｔ−ＤＮＡを用いた転移系、ト
ランスポゾンＡｃ因子を用いた転移系、および酵母の部
位特異的ＤＮＡ組換え系がすでに知られており、Ｔ−Ｄ
ＮＡとＡｃ因子についてはそれぞれ実際に変異株が単離
されてもいる。しかしながら、これら３つの系を組合わ
せた変異株の作成は報告されておらず、またそれを実現
するための手段も見い出されていない。
に操作する方法として、Ｔ−ＤＮＡを用いた転移系、ト
ランスポゾンＡｃ因子を用いた転移系、および酵母の部
位特異的ＤＮＡ組換え系がすでに知られており、Ｔ−Ｄ
ＮＡとＡｃ因子についてはそれぞれ実際に変異株が単離
されてもいる。しかしながら、これら３つの系を組合わ
せた変異株の作成は報告されておらず、またそれを実現
するための手段も見い出されていない。
【０００７】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであり、上記３種類の植物ＤＮＡ組換え系
を組合わせて種々の変異株を効率よく作成することを可
能にする新しい遺伝子操作手段を提供することを目的と
している。
なされたものであり、上記３種類の植物ＤＮＡ組換え系
を組合わせて種々の変異株を効率よく作成することを可
能にする新しい遺伝子操作手段を提供することを目的と
している。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、少なくとも植物感染菌を含む宿
主域を有するプラスミドであって、その環状ＤＮＡ配列
中に、（ａ）アグロバクテリウムの保有するＴｉプラス
ミド由来のＴ−ＤＮＡ配列両端の境界配列を有し、
（ｂ）これらの境界配列に狭まれた領域に、トウモロコ
シのトランスポゾンＡｃ因子をコードするＤＮＡ配列両
端の逆位反復配列を有し、（ｃ）さらにこれらの逆位反
復配列に狭まれた領域に、薬剤耐性遺伝子と、この薬剤
耐性遺伝子の両側に酵母のＲタンパク質が認識する逆位
の特定配列とを有するとともに、（ｄ）上記（ａ）の一
方の境界配列と上記（ｂ）の一方の逆位反復配列との間
に、上記（ｃ）の特定配列と同じ特定配列を有し、
（ｅ）上記（ｄ）の特定配列と、上記（ｃ）の一方の特
定配列とが同位である、ことを特徴とするプラスミドを
提供する。
を解決するものとして、少なくとも植物感染菌を含む宿
主域を有するプラスミドであって、その環状ＤＮＡ配列
中に、（ａ）アグロバクテリウムの保有するＴｉプラス
ミド由来のＴ−ＤＮＡ配列両端の境界配列を有し、
（ｂ）これらの境界配列に狭まれた領域に、トウモロコ
シのトランスポゾンＡｃ因子をコードするＤＮＡ配列両
端の逆位反復配列を有し、（ｃ）さらにこれらの逆位反
復配列に狭まれた領域に、薬剤耐性遺伝子と、この薬剤
耐性遺伝子の両側に酵母のＲタンパク質が認識する逆位
の特定配列とを有するとともに、（ｄ）上記（ａ）の一
方の境界配列と上記（ｂ）の一方の逆位反復配列との間
に、上記（ｃ）の特定配列と同じ特定配列を有し、
（ｅ）上記（ｄ）の特定配列と、上記（ｃ）の一方の特
定配列とが同位である、ことを特徴とするプラスミドを
提供する。
【０００９】以下、添付した図面に沿ってこの発明のプ
ラスミドについてさらに詳しく説明する。図１は、この
発明の一例であるプラスミドｐＲＳｄＡｃの構造を示し
た模式図である。このｐＲＳｄＡｃは、図１にも示した
通り、人工的に調製したＤＮＡ断片（ＲＳ／ｄＡｃ）を
プラスミドｐＧＡ４９２に挿入連結して作成したプラス
ミドである。ｐＧＡ４９２は、アグロバクテリウムのＴ
ｉプラスミドを起源とするｐＲＫ２（G. An ：Method i
n Enzymology, 153, pp. 292-305, 1987）の置換体であ
り、その環状ＤＮＡ配列中にＴｉプラスミド由来のＴ−
ＤＮＡ両端の各２５塩基対からなる左右境界配列（Ｌ
Ｂ，ＲＢ）を有している。またこのｐＧＡ４９２は広宿
主域を有するプラスミドでもあり、アクロバクテリウム
等の植物感染菌とともに、大腸菌をも宿主とすることが
できるため、その操作が容易である。
ラスミドについてさらに詳しく説明する。図１は、この
発明の一例であるプラスミドｐＲＳｄＡｃの構造を示し
た模式図である。このｐＲＳｄＡｃは、図１にも示した
通り、人工的に調製したＤＮＡ断片（ＲＳ／ｄＡｃ）を
プラスミドｐＧＡ４９２に挿入連結して作成したプラス
ミドである。ｐＧＡ４９２は、アグロバクテリウムのＴ
ｉプラスミドを起源とするｐＲＫ２（G. An ：Method i
n Enzymology, 153, pp. 292-305, 1987）の置換体であ
り、その環状ＤＮＡ配列中にＴｉプラスミド由来のＴ−
ＤＮＡ両端の各２５塩基対からなる左右境界配列（Ｌ
Ｂ，ＲＢ）を有している。またこのｐＧＡ４９２は広宿
主域を有するプラスミドでもあり、アクロバクテリウム
等の植物感染菌とともに、大腸菌をも宿主とすることが
できるため、その操作が容易である。
【００１０】一方、ＲＳ／ｄＡｃ断片は、このｐＧＡ４
９２をＬＢ−ＲＢ間で開裂し、その開裂部にに挿入連結
する。ＲＳ／ｄＡｃ断片は、その配列中にｄＡｃ断片を
有しており、このｄＡｃ断片は、トウモロコシのトラン
スポゾンＡｃ因子をコードするＤＮＡ配列より、各々１
１塩基対からなる左右の逆位反復配列（ＩＲ）を残して
転移酵素遺伝子領域を欠失し、代わりに酵母のＲタンパ
ク質が特異的に認識する５８塩基対の特定配列（ＲＳ）
２個とヒグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｐｔr ）とを組み
込んでいる。なお、２個のＲＳはＨｐｔr の両側に挿入
され、それぞれの方向はＩＲと同様に逆位となってい
る。
９２をＬＢ−ＲＢ間で開裂し、その開裂部にに挿入連結
する。ＲＳ／ｄＡｃ断片は、その配列中にｄＡｃ断片を
有しており、このｄＡｃ断片は、トウモロコシのトラン
スポゾンＡｃ因子をコードするＤＮＡ配列より、各々１
１塩基対からなる左右の逆位反復配列（ＩＲ）を残して
転移酵素遺伝子領域を欠失し、代わりに酵母のＲタンパ
ク質が特異的に認識する５８塩基対の特定配列（ＲＳ）
２個とヒグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｐｔr ）とを組み
込んでいる。なお、２個のＲＳはＨｐｔr の両側に挿入
され、それぞれの方向はＩＲと同様に逆位となってい
る。
【００１１】さらにこのＲＳ／ｄＡｃ断片は、ｄＡｃ領
域以外に１個のＲＳを有している。このＲＳは、ｄＡｃ
内の２個のＲＳのうち近い方のＲＳと同一方向となるよ
うに挿入されている。このような構造からなるＲＳ／ｄ
Ａｃ断片は、各断片を制限酵素およびＤＮＡリガーゼ等
を用いる公知の方法で切断・結合することにより調製す
ることができ、具体的には下記実施例に示したように行
なうことができる。また、ＲＳ／ｄＡｃ断片とｐＧＡ４
９２との連結も実施例記載の手続で行なうことができ
る。
域以外に１個のＲＳを有している。このＲＳは、ｄＡｃ
内の２個のＲＳのうち近い方のＲＳと同一方向となるよ
うに挿入されている。このような構造からなるＲＳ／ｄ
Ａｃ断片は、各断片を制限酵素およびＤＮＡリガーゼ等
を用いる公知の方法で切断・結合することにより調製す
ることができ、具体的には下記実施例に示したように行
なうことができる。また、ＲＳ／ｄＡｃ断片とｐＧＡ４
９２との連結も実施例記載の手続で行なうことができ
る。
【００１２】次に、図２に沿ってこのプラスミドｐＲＳ
ｄＡｃを用いた突然変異体の作成方法について説明す
る。 ａ）ｐＲＳｄＡｃを導入したアグロバクテリウムを任意
の植物に感染させ、ＬＢおよびＲＢの転位作用により、
プラスミド中の（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ−ＤＮＡ領域を植物
染色体ＤＮＡのいずれかの部位に挿入する。そして、こ
の植物から全能性細胞を採取し、Ｈｐｔ耐性を指標とし
て形質転換体を選別し、それを植物へと再生させる。こ
の操作を繰り返すことにより多数の（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ
−ＤＮＡ挿入植物体を分離する。
ｄＡｃを用いた突然変異体の作成方法について説明す
る。 ａ）ｐＲＳｄＡｃを導入したアグロバクテリウムを任意
の植物に感染させ、ＬＢおよびＲＢの転位作用により、
プラスミド中の（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ−ＤＮＡ領域を植物
染色体ＤＮＡのいずれかの部位に挿入する。そして、こ
の植物から全能性細胞を採取し、Ｈｐｔ耐性を指標とし
て形質転換体を選別し、それを植物へと再生させる。こ
の操作を繰り返すことにより多数の（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ
−ＤＮＡ挿入植物体を分離する。
【００１３】ｂ）上記ａ）で作成した各挿入個体と、Ａ
ｃの転移酵素遺伝子を導入した同種植物とを交配してｄ
Ａｃ領域を活性化させる。こうすることによって、ｄＡ
ｃは（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ−ＤＮＡ挿入部位を中心として
染色体ＤＮＡ上を様々な場所に転移する。 ｃ）上記ｂ）により得た突然変異体のうち、ｄＡｃが同
一染色体上を転移したものを選別し、その個体と、Ｒタ
ンパク質遺伝子を導入した同種植物とを交配させれば、
同一方向性を有する２つのＲＳ間の特異的欠失を誘導す
ることができ、（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ−ＤＮＡ挿入部位と
ｄＡｃ転位部位間に位置する数個から数十個の染色体遺
伝子を同時に欠失させることができる。
ｃの転移酵素遺伝子を導入した同種植物とを交配してｄ
Ａｃ領域を活性化させる。こうすることによって、ｄＡ
ｃは（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ−ＤＮＡ挿入部位を中心として
染色体ＤＮＡ上を様々な場所に転移する。 ｃ）上記ｂ）により得た突然変異体のうち、ｄＡｃが同
一染色体上を転移したものを選別し、その個体と、Ｒタ
ンパク質遺伝子を導入した同種植物とを交配させれば、
同一方向性を有する２つのＲＳ間の特異的欠失を誘導す
ることができ、（ＲＳ／ｄＡｃ）Ｔ−ＤＮＡ挿入部位と
ｄＡｃ転位部位間に位置する数個から数十個の染色体遺
伝子を同時に欠失させることができる。
【００１４】このようにして、上記ａ）からｃ）に進む
につれて植物ゲノムの変異を拡大することができ、単に
Ｔ−ＤＮＡの挿入変異および／またはＡｃ因子の転移変
異では分離できない新しい変異株を、交配と薬剤耐性選
択という簡単な操作により多数得ることができる。さら
に、図２ａ）、ｂ）、ｃ）に示したように、このプラス
ミドｐＲＳｄＡｃを用いて突然変異を生じさせたゲノム
ＤＮＡ配列には常にｄＡｃ断片領域が残存するため、こ
れをプローブとして用いることによって、変異ＤＮＡ領
域を容易にクローニングすることもできる。これによっ
て、植物の発生や成長、分化等に関わる遺伝子の特定、
あるいはその構造や機能の分子生物学的解析が可能とな
る。
につれて植物ゲノムの変異を拡大することができ、単に
Ｔ−ＤＮＡの挿入変異および／またはＡｃ因子の転移変
異では分離できない新しい変異株を、交配と薬剤耐性選
択という簡単な操作により多数得ることができる。さら
に、図２ａ）、ｂ）、ｃ）に示したように、このプラス
ミドｐＲＳｄＡｃを用いて突然変異を生じさせたゲノム
ＤＮＡ配列には常にｄＡｃ断片領域が残存するため、こ
れをプローブとして用いることによって、変異ＤＮＡ領
域を容易にクローニングすることもできる。これによっ
て、植物の発生や成長、分化等に関わる遺伝子の特定、
あるいはその構造や機能の分子生物学的解析が可能とな
る。
【００１５】以下、実施例を示してこの発明についてさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】この発明のプラスミドの一実施例として、図
１に示したｐＲＳｄＡｃを以下の工程（ａ）−（ｃ）の
通りに作成した。 （ａ）ｐＵＣＲＳＨＹＧの作成（図３参照） 酵母のＲタンパク質が特異的に認識する特定配列（Ｒ
Ｓ）を有するプラスミドｐＲＥＣ５８（H. Onouchi
他：Nuc. Acid. Res.,１９、ｐｐ．６３７３−６３７
８、１９９１）から制限酵素ＳａｌＩで切り出したＲＳ
断片を、ｐＵＣ１２（C. Vanis-Perron 他：Gene，３
３、ｐｐ．１０３−１１９、１９８５）のＳａｌＩ開裂
部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、ｐＵＣ
ＲＥＣ５８−１を作成した。また、上記ＲＳ断片を、方
向を変えてｐＵＣ１２に同じく挿入し、ｐＵＣＲＥＣ５
８−２を作成した。次いで、ｐＵＣＲＥＣ５８−１をＨ
ｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで切断し、かつＸｂａＩ切断
部位をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントでブラ
ント末端化してＲＳを含むＤＮＡ断片を調製した。ま
た、同じくｐＵＣＲＥＣ５８−２をＡｃｃＩおよびＸｂ
ａＩで切断し、ＡｃｃＩ切断部位をブラント末端化して
逆位のＲＳを含むＤＮＡ断片を調製した。
１に示したｐＲＳｄＡｃを以下の工程（ａ）−（ｃ）の
通りに作成した。 （ａ）ｐＵＣＲＳＨＹＧの作成（図３参照） 酵母のＲタンパク質が特異的に認識する特定配列（Ｒ
Ｓ）を有するプラスミドｐＲＥＣ５８（H. Onouchi
他：Nuc. Acid. Res.,１９、ｐｐ．６３７３−６３７
８、１９９１）から制限酵素ＳａｌＩで切り出したＲＳ
断片を、ｐＵＣ１２（C. Vanis-Perron 他：Gene，３
３、ｐｐ．１０３−１１９、１９８５）のＳａｌＩ開裂
部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、ｐＵＣ
ＲＥＣ５８−１を作成した。また、上記ＲＳ断片を、方
向を変えてｐＵＣ１２に同じく挿入し、ｐＵＣＲＥＣ５
８−２を作成した。次いで、ｐＵＣＲＥＣ５８−１をＨ
ｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで切断し、かつＸｂａＩ切断
部位をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントでブラ
ント末端化してＲＳを含むＤＮＡ断片を調製した。ま
た、同じくｐＵＣＲＥＣ５８−２をＡｃｃＩおよびＸｂ
ａＩで切断し、ＡｃｃＩ切断部位をブラント末端化して
逆位のＲＳを含むＤＮＡ断片を調製した。
【００１７】一方、ヒグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｐｔ
r ）を保有するプラスミドｐＬＡＮ１０１ＨＹＧ
〔（株）植物工学研究所、島本功博士より分与〕をＨｉ
ｎｄIII で切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグ
メントで両端をブラント末端化してＨｐｔr 断片を調製
した。このようにして調製したＲＳ断片２個とＨｐｔr
断片を、ｐＵＣ１８（C. Vanish-Perron他：Gene, ３
３、ｐｐ．１０３−１１９、１９８５）のＨｉｎｄIII
−ＸａｂＩ開裂部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入
連結し、ｐＵＣＲＳＨＹＧを作成した。 （ｂ）ｐＵＣＲＳｄＡｃの作成（図４参照） 上記（ａ）で作成したｐＵＣＲＳＨＹＧをＨｉｎｄIII
およびＸｂａＩで切断し、ＲＳ／Ｈｐｔr 断片を調製し
た。
r ）を保有するプラスミドｐＬＡＮ１０１ＨＹＧ
〔（株）植物工学研究所、島本功博士より分与〕をＨｉ
ｎｄIII で切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグ
メントで両端をブラント末端化してＨｐｔr 断片を調製
した。このようにして調製したＲＳ断片２個とＨｐｔr
断片を、ｐＵＣ１８（C. Vanish-Perron他：Gene, ３
３、ｐｐ．１０３−１１９、１９８５）のＨｉｎｄIII
−ＸａｂＩ開裂部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入
連結し、ｐＵＣＲＳＨＹＧを作成した。 （ｂ）ｐＵＣＲＳｄＡｃの作成（図４参照） 上記（ａ）で作成したｐＵＣＲＳＨＹＧをＨｉｎｄIII
およびＸｂａＩで切断し、ＲＳ／Ｈｐｔr 断片を調製し
た。
【００１８】一方、トウモロコシのトランスポゾンＡｃ
因子を有するプラスミドｐＫＵ３（B. Baker他：EMBO−
J., ６、ｐｐ．１５４７−１５５４、１９８７）からＢ
ａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片およびＸｂａＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を切り出し、Ａｃ因子両端の逆位反覆配列（Ｉ
Ｒ）をそれぞれに有する２個のＤＮＡ断片を調製した。
次いで、上記（ａ）で作成したｐＵＣＲＥＣ５８−１を
ＢａｍＨＩで開裂し、ここに上記のＲＳ／Ｈｐｔr 断片
と２個のＩＲ断片を挿入連結してｐＵＣＲＳｄＡｃを作
成した。 （ｃ）ｐＲＳｄＡｃの作成（図５参照） 上記（ｂ）で作成したｐＵＣＲＳｄＡｃをＳｓｅ８３８
７ＩとＫｐｎＩで切断し、ＲＳ／ｄＡｃ断片を調製し
た。
因子を有するプラスミドｐＫＵ３（B. Baker他：EMBO−
J., ６、ｐｐ．１５４７−１５５４、１９８７）からＢ
ａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片およびＸｂａＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を切り出し、Ａｃ因子両端の逆位反覆配列（Ｉ
Ｒ）をそれぞれに有する２個のＤＮＡ断片を調製した。
次いで、上記（ａ）で作成したｐＵＣＲＥＣ５８−１を
ＢａｍＨＩで開裂し、ここに上記のＲＳ／Ｈｐｔr 断片
と２個のＩＲ断片を挿入連結してｐＵＣＲＳｄＡｃを作
成した。 （ｃ）ｐＲＳｄＡｃの作成（図５参照） 上記（ｂ）で作成したｐＵＣＲＳｄＡｃをＳｓｅ８３８
７ＩとＫｐｎＩで切断し、ＲＳ／ｄＡｃ断片を調製し
た。
【００１９】また、ＲＫ２プラスミド（G.An：Method i
n Enzymology, １５３、ｐｐ．２９２−３０５、１９８
７）の置換体であるアグロバクテリウムのＴｉプラスミ
ド系バイナリー・ベクターｐＧＡ４９２をＰｓｔＩおよ
びＫｐｎＩで開裂し、そのＴ−ＤＮＡ領域を左右境界配
列（ＬＢ，ＲＢ）を残して欠失させた。そして、このＰ
ｓｔＩ−ＫｐｎＩ開裂部位に上記のＲＳ／ｄＡｃ断片を
挿入連結して、プラスミドｐＲＳｄＡｃを作成した。
n Enzymology, １５３、ｐｐ．２９２−３０５、１９８
７）の置換体であるアグロバクテリウムのＴｉプラスミ
ド系バイナリー・ベクターｐＧＡ４９２をＰｓｔＩおよ
びＫｐｎＩで開裂し、そのＴ−ＤＮＡ領域を左右境界配
列（ＬＢ，ＲＢ）を残して欠失させた。そして、このＰ
ｓｔＩ−ＫｐｎＩ開裂部位に上記のＲＳ／ｄＡｃ断片を
挿入連結して、プラスミドｐＲＳｄＡｃを作成した。
【００２０】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、Ｔ−ＤＮＡを用いた挿入変異、Ａｃ因子を用いた
転移変異および酵母の特異的組換え系を用いた欠失変異
の各機能を全て備えた新しいプラスミドが提供される。
これによって、様々な植物変異株を効率よく得ることが
可能となり、植物遺伝子の分子生物学的解明や、さらに
は有用な新種植物の育種が促進される。
って、Ｔ−ＤＮＡを用いた挿入変異、Ａｃ因子を用いた
転移変異および酵母の特異的組換え系を用いた欠失変異
の各機能を全て備えた新しいプラスミドが提供される。
これによって、様々な植物変異株を効率よく得ることが
可能となり、植物遺伝子の分子生物学的解明や、さらに
は有用な新種植物の育種が促進される。
【図１】この発明のプラスミドｐＲＳｄＡｃの構造を例
示した模式図である。
示した模式図である。
【図２】ｐＲＳｄＡｃを用いた変異株作成工程を例示し
た植物ＤＮＡの模式図である。
た植物ＤＮＡの模式図である。
【図３】ｐＲＳｄＡｃ作成の第１工程を例示した模式図
である。
である。
【図４】ｐＲＳｄＡｃ作成の第２工程を例示した模式図
である。
である。
【図５】ｐＲＳｄＡｃ作成の最終工程を例示した模式図
である。
である。
ＬＢ，ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡの左右境界配列 ｄＡｃ：トランスポゾンの不活性化Ａｃ ＲＳ：酵母のＲタンパクが認識する特定配列 Ｈｐｔr ：ヒグロマイシン耐性遺伝子
フロントページの続き (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．19，Ｎｏ．23（1991) ｐ．6373−８ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/84 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 少なくとも植物感染菌を含む宿主域を有
するプラスミドであって、その環状ＤＮＡ中に、 （ａ）アグロバクテリウムの保有するＴｉプラスミド由
来のＴ−ＤＮＡ配列両端の境界配列を有し、 （ｂ）上記（ａ）の境界配列に狭まれた領域に、トウモ
ロコシのトランスポゾンＡｃ因子をコードするＤＮＡ配
列両端の逆位反復配列を有し、 （ｃ）さらに上記（ｂ）の逆位反復配列に狭まれた領域
に、薬剤耐性遺伝子と、この薬剤耐性遺伝子の両側に酵
母のＲタンパク質が認識する逆位の特定配列を有すると
ともに、 （ｄ）上記（ａ）の一方の境界配列と上記（ｂ）の一方
の逆位反復配列との間に、上記（ｃ）の特定配列と同じ
特定配列を有し、 （ｅ）上記（ｄ）の特定配列と上記（ｃ）の一方の特定
配列とが同位である、ことを特徴とするプラスミド。 - 【請求項２】 植物感染菌がアグロバクテリウムである
請求項１のプラスミド。 - 【請求項３】 薬剤耐性遺伝子がヒグロマイシン耐性遺
伝子である請求項１または２のプラスミド。 - 【請求項４】 境界配列に狭まれた領域以外が、ＲＫ２
プラスミド由来のｐＧＡ４９２のＤＮＡ配列である請求
項１、２または３のプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5057486A JP3006970B2 (ja) | 1993-03-17 | 1993-03-17 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5057486A JP3006970B2 (ja) | 1993-03-17 | 1993-03-17 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261769A JPH06261769A (ja) | 1994-09-20 |
| JP3006970B2 true JP3006970B2 (ja) | 2000-02-07 |
Family
ID=13057051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5057486A Expired - Fee Related JP3006970B2 (ja) | 1993-03-17 | 1993-03-17 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3006970B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1253568C (zh) * | 2002-09-02 | 2006-04-26 | 大连科源农业生物工程有限公司 | 具有生物安全性的植物基因工程操作方法 |
-
1993
- 1993-03-17 JP JP5057486A patent/JP3006970B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２３（１９９１）ｐ．６３７３−８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06261769A (ja) | 1994-09-20 |
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