KR100609565B1

KR100609565B1 - 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 식물발현용 벡터

Info

Publication number: KR100609565B1
Application number: KR1020040107735A
Authority: KR
Inventors: 강동균; 신종희; 권중배; 강오구; 이봉호
Original assignee: 경상북도농업기술원생물자원연구소
Priority date: 2004-12-17
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2006-08-08
Also published as: KR20060069540A

Abstract

본 발명은 마 모자이크바이러스의 전체 게놈을 함유하는 식물 발현용 벡터에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 마 모자이크바이러스의 전체 게놈과 T3 프로모터 및 제한효소 절단부위를 함유하는 목적유전자의 식물발현용 벡터 및 상기 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 식물발현용 벡터를 사용하면, 목적유전자를 식물의 세포질에서 복제 및 발현시킬 수 있어, 생식기관에 의한 목적유전자의 전파 위험성이 없으며, 항생제나 제초제 저항성 유전자를 사용하지 않기 때문에, 생태환경적으로 위험요소가 없이 안정적으로 목적단백질을 제조하는 것이 가능하다.

마 모자이크바이러스, 바이러스 벡터, 식물발현벡터

Description

마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 식물발현용 벡터{Plant Expression Vector Containing Full Genome of YMV-K(Yam Mosaic Virus-K)}

도 1은 본 발명의 마 바이러스벡터 제작을 위하여 사용한 프라이머의 YMV-K 게놈 상에서의 위치를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에서 사용한 모벡터인 pCR-SL-TOPO의 유전자 지도이다.

도 3은 본 발명의 p7.7kb 및 p3kb를 제한효소 PstI으로 처리한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 왼쪽 레인은 마커이고, 레인 A는 p7.7kb이며, 레인 B는 p3kb이다.

도 4는 본 발명의 p7.7kb 및 p3kb를 이용하여 마바이러스 벡터를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.

발명의 분야

발명의 배경

마 모자이크 바이러스(Yam mosaic virus-K)는 둥근마(Dioscorea batatas), 참마(Dioscorea japonica)에 모자이크병을 일으키는 바이러스로서, 마바이러스(YMV-K) genomic RNA는 poly (A) tail을 제외하고 9759 nts로 구성되어 있으며 이중 9621 nts가 단백질 발현에 관여하며 구성은 아데닌 34.02%, 구아닌 22.71%, 티민 24.23%, 시토신 19.00%이다. YMV-K genomic RNA로부터 생성되는 polyprotein의 분자량은 365.29kDa이며 3131개의 아미노산으로 구성되어 있다. 이 바이러스는 포티바이러스(potyvirus)로서 포티비리데 패밀리의 한 종으로서, 현재까지 가장 많은 종을 포함하고 있으며, 외, 쌍떡잎 두 식물을 포함하는 기주범위를 가진다. 이들은 짧은 잠복기내에서 주로 진딧물에 의해 전염되며 작물에 심각한 경제적 손실을 일으킨다. 포티바이러스는 굴절성 형태를 가진 사상형의 입자로 680~900nm의 길이와 11~15nm의 너비를 가진다. 포티바이러스의 게놈은 양성 단일가닥 RNA이며, 대락 10kb의 길이로써, 약 2,000 카피의 외막 단백질 유닛으로 싸여있다. 이들의 RNA 게놈은 5' 말단에서 공유적으로 결합된 Vpg를 가지며, 3'말단에 폴리 A 테일을 가진다.

형질전환 식물에서 목적 유전자를 산업적으로 발현시킨 것은 1984년에 세균 유래의 유전자를 담배에서 발현시킴으로 처음 보고 되었다 (Gasser, C.S. et al., Science, 244, 1293-9, 1989). 최근 유전공학적 변형작물을 이용한 고 부가가치의 치료용 물질의 생산에 대하여 많은 연구가 진행되고 또한 치료용 단백질 등 유용물질의 생산성 향상에 관한 여러 가지 방법들이 연구되고 있다. 그 중에서도 식물 바이러스 벡터를 이용한 유용물질의 발현에 대해 많은 연구자들이 관심을 가지고 연구하고 있다.

현재 바이오산업의 발전에 따른 분자농업(molecular farming)의 산업화에 대한 관심이 높아지면서 새로운 형질전환식물을 산업적으로 응용하는 데 대한 가능성이 여러 분야에서 기대되고 있다.

분자농업이란 식물을 생산공장으로 활용하여 고부가가치의 유용단백질을 대량 생산하는 기술로 다양한 종류의 단백질을 생산하고, 대규모 재배가 가능한 주체인 식물을 이용하여 고부가가치의 유용단백질을 값싸게 대량으로 생산하는 것이다. 또한 동물세포배양에 비하여는 약 1/30, 미생물 발효에 비하여 약 1/3의 비용이 소요되므로 쉽게 산업화할 수 있는 장점을 가지고 있다.

특히 분자 농업의 개발 분야 중 현재 산업화를 위해 현저하게 연구되는 분야로는 고부가가치의 의료용 단백질 (인슐린, 인터페론, 성장호르몬, 각종 의료용 인체효소 등)을 값싸게 대량 생산하는 것으로 해당 유전자를 식물에 도입, 발현시켜 이로부터 유용물질을 추출하는 것이다 (Hughes, J. et al., BioPham, 4, 18-26, 1991; Fiedler, U. et al., Bio/Technology, 13, 1090-3, 1995; Jefferson, R. A. et al., EMBO J, 6, 3901-7, 1987). 이는 식물로부터 원하는 단백질의 분리, 정제 에 고도의 비용이 요구되므로, 식물에서의 발현시스템을 조절하여 분리, 정제에 드는 비용을 최소화하는 기술이며 주로 고순도의 품질을 요구하는 의료용 단백질들이 그 대상이다.

따라서 현재 생명공학 기업인 Monsanto사, Dupont사 그리고 Novatis사에서는 형질전환식물을 이용한 치료용 물질의 생산에 많은 연구와 투자를 하고 있다. 그러나 식물을 이용한 유용물질의 생산은 기본적으로 형질전환 식물체에서 외래유전자 발현이 담보되어야하는데 일반적으로 전체 가용성 단백질(total soluble protein)의 0.2~5%로 아직까지는 그 발현효율이 미흡한 실정이다 (Hood, E. E. et al., Current Opinion in Bitechnol., 10, 382-6, 1999; Witcher, D. R. et al., Mol. Breed., 4, 301-12, 1998; Zhong, G. Y. et al., Mol. Breed., 5, 345-56, 1999). 그러므로 유용물질의 효율적인 대량생산을 위한 식물 발현벡터의 개발은 분자농업에 있어서 가장 큰 과제로 많은 연구가 필요하다.

이에, 본 발명자들은 효율적으로 재조합 단백질의 생산이 가능한 식물 발현벡터를 개발하고자 예의 노력한 결과, 마 모자이크바이러스의 전체 게놈과 T3 프로모터를 함유하는 벡터를 제조하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 마 모자이크바이러스의 전체 게놈을 함유하는 식물발현용 벡터 및 상기 벡터의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 마 모자이크바이러스 게놈을 역전사 반응시켜 DNA를 수득하는 단계; (b) 하기 2개의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 DNA를 각각 PCR하여 2개의 DNA 단편을 수득하는 단계: (i) 제한효소 절단부위, T3 프로모터 및 마 모자이크바이러스 게놈의 5' 말단 부위를 포함하는 프라이머/마 모자이크바이러스 게놈의 중간부 서열 및 제한효소 절단부위를 포함하는 프라이머; 및 (ii) 마 모자이크바이러스 게놈의 중간부 서열 및 제한효소 절단부위를 포함하는 프라이머/올리고dT 프라이머 (c) 상기 2개의 DNA단편을 각각 클로닝 벡터에 삽입하여 마 모자이크바이러스 게놈 단편이 포함된 2개의 벡터를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 2개의 벡터에 포함된 마 모자이크바이러스 게놈 단편을 서브클로닝하여 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 벡터를 제작하는 단계를 포함하는 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 목적유전자의 식물발현용 벡터를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, (e) Acc65I, AfeI, AgeI, AscI, AvrII, BbeI, BbvCI, BsiEI, BsiWI, BsrBI, BsrFI, Bsu36I, EagI, FseI, Kas I, KpnI, MluI, NaeI, NarI, NciI, NgoMIV, NotI, PacI, PmeI, PpuMI, PvuI, Rsr II, SacII, SalI, SanDI, SbfI, SfiI, SfoI, SgfI, SgrAI, SmaI, SrfI, SwaI, Tth 111I 및 XmaI으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제한효소의 절단부위 염기서열을 삽입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 마 모자이크 바이러스(YMV-K) 게놈의 전체 염기서열은 서열번호 5를 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 (i) (c) 단계에서 수득된 2개의 벡터(p7.7kb 및 p3kb)를 제한효소 NotI 및 PstI으로 절단하는 단계; (ii) 상기 단계에서 수득된 p7.7kb벡터의 6kb NotI/PstI 단편과 p3kb벡터의 2.3kb NotI/PstI 단편을 라이게이션하여 p8.3kb 벡터를 수득하는 단계; 및 (iii) 상기 p8.3kb 벡터를 제한효소 PstI으로 절단한 단편과 (i) 단계에서 수득된 p7.7kb벡터의 1.5kb PstI 단편을 라이게이션하여 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 벡터를 제작하는 단계를 거쳐 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조되고, 마 모자이크바이러스 전체 게놈과 T3프로모터 및 제한효소 절단부위를 함유하는 식물발현용 벡터를 제공한다. 본 발명에 있어서, 식물발현용 벡터는 pYMV-K인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli JM109, E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 투메파시앙스와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다. 또한, 효모 및 곰팡이와 같은 진핵세포를 숙주로 사용하는 것도 가능하다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예: 마 바이러스 전체 게놈을 포함하는 식물 발현벡터의 제작

마 모자이크바이러스의 게놈 RNA를 분리하기 위하여, 이병 둥근마(Dioscorea batatas) 잎에 추출완충액을 넣고 마쇄한 후 통상의 바이러스분리법으로 청징화, 염석하고, 초원심분리법과 고속원심분리법으로 농축한 다음 슈크로오스 밀도구배 초원심분리법(sucrose density gradient ultracentrifugation)으로 바이러스를 순수분리하였다. 정제한 마 바이러스 입자 현탁액에 통상의 RNA추출법으로 SDS, TE-페놀, 페놀:클로로포름-이소아밀알콜(1:1), 소듐아세테이트, 에탄올 등과 원심분리법을 이용하여 바이러스 RNA를 추출하였다.

상기 분리된 마 모자이크바이러스 게놈(YMV-K genome) RNA, 역전사효소 및 올리고dT 프라이머를 사용하여 마 모자이크바이러스 게놈 정보를 가진 9.8kb의 DNA를 합성하였다.

상기 합성된 마 모자이크바이러스 게놈 DNA를 발현벡터로 삽입하기 위하여, 2개의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여, 2개의 마 모자이크바이러스 게놈 단편을 수득하였다.

상기 PCR에서는 NotI 부위, T3 프로모터 및 마 모자이크바이러스 게놈의 5' 말단부위를 포함하는 서열 1의 프라이머 및 마 모자이크바이러스 게놈의 중간부 서열을 포함하는 서열 2의 프라이머로 구성된 프라이머 쌍 및 또 다른 마 모자이크바이러스 게놈의 중간부 서열을 포함하는 서열 3의 프라이머 및 올리고 dT 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 사용하였다 (도 1).

서열 1: 5'-gcggccgc/ATTAACCCTCACTAAA/GGAAAATATAAAATCTCAAC AAG-3'

(NotI결합부위/T3 프로모터/마 모자이크바이러스 게놈의 5' 말단부위)

서열 2: 5'-TGTCATGCCAACACTCCATGG-3'

서열 3: 5'-CCAATGGATGACTGTCAC-3'

서열 4: Oligo dT(18)mer

통상의 유전자 증폭방법으로는 3 kb 이상을 증폭산물을 획득하기 어려워 Long accurate(LA)-RT-PCR법으로 YMV-K의 RNA로부터 3 kb와 7.7 kbp의 증폭산물을 획득한다. 반응조건은 65℃에서 10분간 열처리한 RNA 용액 8.5 ㎕, 25 mM MgCl2 4 ㎕, 10ㅧRNA PCR buffer 2 ㎕, 10 mM dNTP 2 ㎕, RNase inhibitor 0.5 ㎕, AMV RTase XL 1 ㎕, DMSO 1 ㎕, 20 pmole reverse primer 1 ㎕를 혼합한 다음 30℃에서 10분, 42℃에서 50분, 70℃에서 15분간 반응 시켰다. 반응액에 다시 25 mM MgCl2 625 mM MgCl2 4 ㎕, 10ㅧLA PCR buffer 8 ㎕, DDW 64.5 ㎕, Takara LA Taq 0.5 ㎕, 20 pmole forward primer를 첨가하여 94℃에서 30초, 65℃에서 15분간 30회 PCR 반응을 수행하였다.

이에 따라, 서열 1 및 서열 2의 프라이머를 사용하여 7.7kb의 마 모자이크바이러스 게놈 단편을 수득하였으며, 서열 3 및 서열 4의 프라이머를 사용하여 3kb의 마 모자이크바이러스 게놈 단편을 수득하였다.

상기 두개의 7.7kb 및 3kb 게놈 단편을 3,5kb의 pCR-XL-TOPO벡터(도 2: invitirogen, USA)에 각각 클로닝하여, p7.7kb 및 p3kb 벡터를 제작하였다.

상기 두 벡터를 모두 제한효소 PstI으로 처리한 후, 아가로오스 젤 상에서 전기영동하여 게놈 단편이 삽입된 것을 확인하였다 (도 3).

도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 두 벡터를 사용하여 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, p7.7kb벡터에 제한효소 PstI 및 NotI으로 처리하여, 양 말단에 PstI 및 NotI 절단부위를 가지는 6kb의 게놈 단편과 양 말단에 PstI 절단부위를 가지는 1.5 kb의 게놈단편을 얻었다. 상기 6kb의 게놈단편을 동일한 제한효소인 PstI 및 NotI으로 처리된 p3kb 벡터와 라이게이션하여, 8.3kb의 마 바이러스게놈 단편이 삽입된 p8.3kb 벡터를 제조하였다.

상기 p8.3kb 벡터를 PstI으로 절단하고, 상기 양 말단에 PstI 절단부위를 가지는 1.5 kb의 게놈단편과 라이게이션하여, 9.8kb의 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 포함하는 p9.8kb 벡터를 제조하고 이를 pYMV-K로 재명명하였다.

상기 pYMV-K는 표 1에 나타난 바와 같이 목적유전자를 삽입시킬 수 있는 25개의 단일 제한효소 부위를 가지고 있으며, site-directed mutagenesis법을 사용하여, 표 1에 나타난 부재 제한효소 부위를 삽입하여, 목적유전자를 삽입시킬 수도 있다.

본 발명의 벡터의 제한효소 부위

절단 부위	단일 제한효소 부위(위치)	부재 제한효소 부위
제한효소	AatII(6354), AflII(3176), ApaI(578), ApaLI(7590), BclI(8187), BglI(9531), BmrI(664), BsaI(4853), BsmBI(5389), BssHII(9383), BstEII(2414), ClaI(6463), EciI(5772), EcoO109I(574), FauI(7712), FspI(3110), HpaI(55), MspA1I(9497), NheI(8095), PflMI(9296),PspOMI(574), PvuII(9497), ScaI(5411), StuI(2472), XcmI(2078)	Acc65I, AfeI, AgeI, AscI, AvrII, BbeI, BbvCI, BsiEI, BsiWI, BsrBI, BsrFI, Bsu36I, EagI, FseI, KasI, KpnI, MluI, NaeI, NarI, NciI, NgoMIV, NotI, PacI, PmeI, PpuMI, PvuI, RsrII, SacII, SalI, SanDI, SbfI, SfiI, SfoI, SgfI, SgrAI, SmaI, SrfI, SwaI, Tth111I, XmaI

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 본 발명의 목적은 마 모자이크바이러스의 전체 게놈을 함유하는 식물발현용 벡터 및 상기 벡터의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명의 마 모자이크바이러스의 전체 게놈을 함유하는 식물발현용 벡터에 목적유전자를 삽입한 재조합 벡터를 미생물에 형질전환하여, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 재조합 벡터를 수득하고, 상기 재조합벡터에 RNA 중합효소를 처리하여 RNA를 합성한 후 식물에 감염시킴으로서 목적유전자를 발현하는 형질전환된 식물을 수득할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음 단계를 포함하는 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 목적유전자의 식물발현용 벡터를 제조하는 방법:

(a) 마 모자이크바이러스 게놈을 역전사 반응시켜 DNA를 수득하는 단계;

(b) 하기 2개의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 DNA를 각각 PCR하여 2개의 DNA 단편을 수득하는 단계:

(i) 제한효소 절단부위, T3 프로모터 및 마 모자이크바이러스 게놈의 5' 말단 부위를 포함하는 프라이머/마 모자이크바이러스 게놈의 중간부 서열 및 제한효소 절단부위를 포함하는 프라이머; 및

(ii) 마 모자이크바이러스 게놈의 중간부 서열 및 제한효소 절단부위를 포함하는 프라이머/올리고dT 프라이머;

(c) 상기 2개의 DNA단편을 각각 클로닝 벡터에 삽입하여 마 모자이크바이러스 게놈 단편이 포함된 2개의 벡터를 수득하는 단계; 및

(d) 상기 2개의 벡터에 포함된 마 모자이크바이러스 게놈 단편을 서브클로닝하여 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 벡터를 제작하는 단계.
제1항에 있어서, (e) Acc65I, AfeI, AgeI, AscI, AvrII, BbeI, BbvCI, BsiEI, BsiWI, BsrBI, BsrFI, Bsu36I, EagI, FseI, Kas I, KpnI, MluI, NaeI, NarI, NciI, NgoMIV, NotI, PacI, PmeI, PpuMI, PvuI, RsrII, SacII, SalI, SanDI, SbfI, SfiI, SfoI, SgfI, SgrAI, SmaI, SrfI, SwaI, Tth 111I 및 XmaI으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제한효소의 절단부위 염기서열을 삽입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 마 모자이크 바이러스(YMV-K) 게놈의 전체 염기서열은 서열번호 5로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 다음과 같이 수행하는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) (c) 단계에서 수득된 2개의 벡터(p7.7kb 및 p3kb)를 제한효소 NotI 및 PstI으로 절단하는 단계;

(ii) 상기 단계에서 수득된 p7.7kb벡터의 6kb NotI/PstI 단편과 p3kb벡터의 2.3kb NotI/PstI 단편을 라이게이션하여 p8.3kb 벡터를 수득하는 단계; 및

(iii) 상기 p8.3kb 벡터를 제한효소 PstI으로 절단한 단편과 (i) 단계에서 수득된 p7.7kb벡터의 1.5kb PstI 단편을 라이게이션하여 마 모자이크바이러스 전체 게놈을 함유하는 벡터를 제작하는 단계.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조되고, 마 모자이크바이러스 전체 게놈과 T3프로모터 및 제한효소 절단부위를 함유하는 식물발현용 벡터.
제5항에 있어서, 식물발현용 벡터는 pYMV-K인 것을 특징으로 하는 식물발현용 벡터.