JP7332699B2 - 環状及び線状ｄｎａ分子を規則正しく構築する方法 - Google Patents

環状及び線状ｄｎａ分子を規則正しく構築する方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／７９２５３２号の優先権を主張する。
発明の背景
発明の分野
本発明は、環状及び線状ＤＮＡ分子を構築する(assembling)方法に関し、より詳細には、本発明は、環状及び線状ＤＮＡ分子を構築するための非線状の環状ＤＮＡベクター及び少なくとも１つの制限酵素を含む、相同性に基づくワンチューブ構築法（one－tube assembly method）を提供する。
関連技術
特定の遺伝子を環状プラスミドベクターにクローニングすることは、多くの場合、遺伝子機能の研究の最初のステップである。相同性に基づくクローニング戦略が開発される前は、遺伝子クローニングは、標的遺伝子とベクターを制限エンドヌクレアーゼで消化し、続いてＤＮＡリガーゼを使用してそれらを連結することによって達成されていた。このプロセスは、特にクローニングされるべき標的遺伝子がＰＣＲによって作製される場合、技術的に困難であり得る。ＰＣＲ産物のクローニングの主なハードルは、多くの場合、ＰＣＲ産物の制限酵素消化の効率が低いことである。
相同性に基づくクローニング戦略は、ＰＣＲ産物のクローニングの効率を大幅に向上させる。複数の相同性に基づく戦略が説明されている。「ギブソン構築」法は、線状化ベクターから始まり、同じ反応で３種類の酵素：Ｔ５エキソヌクレアーゼ、フュージョン（Phusion）ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴａｑリガーゼを使用する［１］。「In-Fusion」法は、同様の戦略を使用するが、Ｔａｑリガーゼは使用しない［２］。これらの戦略は、複数のＤＮＡ断片を１つのプラスミドＤＮＡベクターに高効率で構築することができる。構築を行うためにＴ５エキソヌクレアーゼのみを必要とする別の方法が最近説明された［３］。
しかしながら、上記のすべての戦略では、構築反応の前に環状プラスミドＤＮＡの線状化が必要である。さらに、ほとんどのシステムでは、線状化ベクターは、構築前にアガロースゲル電気泳動によって精製する必要がある。このプロセスは、時間がかかり、技術的に困難であり得、且つコストがかかる。従って、従来技術の欠点を克服するために、環状及び線状ＤＮＡの両方を構築する方法を提供することは有利であろう。
発明の概要
本発明は、環状又は線状ＤＮＡ分子を構築する方法を提供し、この方法では、１つの反応容器において、ワンステップで、線状ヌクレオチド産物と共に環状ＤＮＡベクターが直接構築される。
一態様では、本発明は、ヌクレオチド最終産物の調製に使用するための環状又は線状ＤＮＡ分子を調製するためのワンポット法を提供し、この方法は：
反応容器、ベクターと相同性を有する配列の領域を両末端に有する環状ＤＮＡベクター及び線状化標的ＤＮＡ分子の組み合わせを提供すること；
環状ＤＮＡベクターと増幅された線状化標的ＤＮＡ分子を本質的に同時に反応容器に導入し、且つ少なくとも１つの制限酵素を、環状ＤＮＡベクターを線状化する量で反応容器に導入すること；
少なくともＤＮＡポリメラーゼ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、緩衝剤を含む緩衝液であって、任意にＤＮＡリガーゼを含む緩衝液を反応容器に加えること；
環状ＤＮＡベクター、線状化標的ＤＮＡ分子、及び緩衝液を、環状ＤＮＡベクターの線状化に十分な時間及び温度でインキュベートして、環状化又は線状化ＤＮＡ分子を作製するために、増幅された線状化標的ＤＮＡ分子と線状化環状ＤＮＡベクターとを結合すること(joining)、を含み、ヌクレオチド最終産物は、環状又は線状ＤＮＡ分子、環状又は線状ＲＮＡ分子、又は宿主細胞の産生を通じて環状化又は線状化ＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質からなる群から選択される。
組み合わせの調製において、線状化標的ＤＮＡ分子を増幅することができ、続いて、線状化標的ＤＮＡ分子を組み合わせにすぐ使用することができる。さらに、ＤＮＡ標的分子は、５’及び３’末端の両方に一本鎖ヌクレオチドを含み得、この一本鎖ヌクレオチドは、ワンポットシステム内の切断プロセスで使用される特定の制限酵素によって生じる、線状化環状ＤＮＡベクターのＤＮＡヌクレオチド一本鎖に対応する。従って、標的ＤＮＡ標的分子は、環状ＤＮＡベクターが線状化されると、線状化環状ＤＮＡ分子の重複する相補的な一本鎖ＤＮＡ領域にハイブリダイズすることができる。
線状化標的ＤＮＡ分子は、いくつかの実施形態では、組み合わせられた複数のＤＮＡ断片を含み得、そのような各ＤＮＡ断片は、次の断片の一本鎖ＤＮＡ末端と重複する重複一本鎖ＤＮＡ末端を含み、次いで、断片の組み合わせの末端は、切断された環状ベクターの末端配列と重複するか又は相同性を有する。そのような断片を結合する方法で機能するＤＮＡポリメラーゼは、固有のエキソヌクレアーゼ活性を有すると共に本発明のＤＮＡ結合反応を行うことができるＤＮＡポリメラーゼである。このようなポリメラーゼは、相補的なヌクレオチド配列を含む末端を有する２つの線状ＤＮＡ分子を結合する能力を有する。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、市販されたものであってもよいし、又は標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製してもよい。断片の結合に有用なＤＮＡポリメラーゼは、固有の３’－５’エキソヌクレアーゼ活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
重要なことに、本発明は、システムにおけるリガーゼの使用の有無にかかわらず、この方法の実現可能性を実証した。ＤＮＡリガーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）、９Ｎ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）、又はアンプリガーゼ（Ampligase（Illumina, San Diego, Calif.））などの熱安定性ＤＮＡリガーゼであり、Ｔａｑリガーゼを使用することが好ましい。
本発明の方法では、任意のＤＮＡポリメラーゼ酵素を、ポリメラーゼサイクリング構築反応に使用することができる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、フィデリティの高いＤＮＡポリメラーゼであり、これは、ＤＮＡポリメラーゼが、結果として生じるインタクトな核酸分子に配列エラーを導入する可能性が低いような校正機能を有することを意味する。ポリメラーゼサイクリング構築反応に適したＤＮＡポリメラーゼの例には、限定されるものではないが、Phusionポリメラーゼ、プラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ(High Fidelity)（Invitrogen）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなどが含まれる。好ましくは、ＰＣＲで使用されるＤＮＡポリメラーゼは、Phusion ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Ipswich, Mass）などの熱安定性でフィデリティの高いＤＮＡポリメラーゼである。
本発明では、緩衝液は、少なくともＰＥＧ分子などのクラウディング剤（crowding agent）、並びに限定されるものではないが、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ウシ血清アルブミン、ｄＮＴＰ、及びトリス緩衝剤などの緩衝剤からなる群から選択される成分を含む、他の成分を含む。一実施形態では、緩衝液は、２％～１０％のＰＥＧ８０００、５０ｍＭ～約１５０ｍＭのトリス酢酸(tris acetate)、ｐＨ６．５～８．５、約０．０９ｍＭ～約０．４ｍＭのｄＮＴＰ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭの酢酸カリウム、約１０ｍＭ～約４０ｍＭの酢酸マグネシウム、及び約５０ｍｇ／ｍｌ～約１５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む。より好ましくは、緩衝液は、約５％のＰＥＧ８０００、約１００ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ８、約０．２ｍＭのｄＮＴＰ、約５０ｍＭの酢酸カリウム、約２０ｍＭの酢酸マグネシウム、及び約１００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む。
インキュベーション時間は、好ましくは、環状プラスミドを線状化して環状化又は線状化ＤＮＡ分子を作製するために、少なくとも２つの異なる期間及び温度レジームに分けられる。例えば、第１の期間及び温度は、約３２℃～約４０℃で約１０分間～約２０分間であり得、より好ましくは、約３７℃の温度で約１５分間であり得る。次の期間及び温度は、約４５℃～約５５℃で約１０分間～約２０分間であり、より好ましくは、約５０℃の温度で約１５分である。特に、５０℃で６０分間；３７℃で１５分間＋５０℃で４５分間、及び３７℃で３０分間＋５０℃で３０分などの他の温度と期間が効果的であることが分かっている。
本発明では、少なくとも１つの制限酵素が使用され、いくつかの状況では、ＢａｍＨＩとＳａｌＩとの組み合わせなどの制限酵素の組み合わせが可能である。ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩが、本発明及び好ましい緩衝液において効率的に機能することも見出された。さらに、制限酵素（エンドヌクレアーゼ）には、平滑末端（例えば、ＳｍａＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＶ）又は３’オーバーハング（例えば、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＡｌｕＩ）を生成する酵素が含まれ得ると考えられている。場合によっては、５’オーバーハングを生成する他の制限エンドヌクレアーゼも使用することができる。
別の態様では、本発明は、環状又は線状ＤＮＡ分子を調製するためのワンポット法を提供し、この方法は：
反応容器、既知のヌクレオチド配列を有する環状プラスミド、及び所望の標的タンパク質をコードするための既知のヌクレオチド配列を有する線状化標的ＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅産物を提供すること；
環状プラスミドと線状化標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を反応容器に本質的に同時に導入し、且つＢａｍＨＩとＳａｌＩの組み合わせを含む少なくとも２つの制限酵素を、環状プラスミドを線状化する量で反応容器に導入すること；
少なくとも、ＤＮＡポリメラーゼ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、少なくともＰＥＧ分子などのクラウディング剤を含む緩衝液を含む成分、並びに限定されるものではないがｄＮＴＰ、トリス緩衝剤を含む成分、及び任意にＤＮＡリガーゼを含む、他の成分を含むインキュベーション溶液を反応容器に加えること；
環状プラスミドの線状化のための十分な時間及び温度で成分をインキュベートし、宿主細胞におけるその後の発現のための環状化又は線状化ＤＮＡ分子の作製のためにＰＣＲ増幅産物と線状化環状プラスミドを結合すること、を含み、インキュベーション時間及び温度は、３７℃で１５分間＋５０℃で約１５分間；５０℃で６０分間；３７℃で１５分間＋５０℃で４５分間、及び３７℃で３０分間＋５０℃で３０分間の群から選択される。
さらに別の態様では、本発明は、環状又は線状ＤＮＡ分子を調製するためのワンポット法を提供し、この方法は：
反応容器、環状プラスミド、及び所望の標的タンパク質をコードする線状化標的ＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅産物を提供すること；
環状プラスミドと線状化標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を反応容器に本質的に同時に導入し、且つ少なくとも１つの制限酵素を、環状プラスミドを線状化する量で反応容器に導入すること；
少なくともＤＮＡポリメラーゼ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、緩衝剤を含む緩衝液であって、任意にＤＮＡリガーゼを含む緩衝液を反応容器に加えること；
環状プラスミド、線状化標的ＤＮＡ分子と緩衝液のＰＣＲ増幅産物を、環状プラスミドの線状化に十分な時間及び温度でインキュベートし、宿主細胞におけるその後の発現のための環状化又は線状化ＤＮＡ分子の作製のためにＰＣＲ増幅産物と線状化環状プラスミドを結合することを含む。
さらに別の態様では、本発明は、環状化又は線状化ＤＮＡ分子のワンポット合成のための組成物を提供し、この組成物は：
環状プラスミド、線状化標的ＤＮＡ分子、少なくとも１つの制限酵素、好ましくは２つの制限酵素、少なくともＤＮＡポリメラーゼ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、クラウディング剤としてＰＥＧ分子を含むインキュベーション溶液、並びに限定されるものではないがｄＮＴＰ、トリス緩衝剤を含み、任意にＤＮＡリガーゼを含む、他の成分を含む。線状化ＤＮＡ標的分子は、組成物に含めるために増幅することができる。
さらに別の態様では、本発明はまた、線状化ＤＮＡ標的産物を環状ＤＮＡベクターに一方向にクローニングするのに適したキットを提供する。キットは、単一の反応容器に加えるための別個の容器内に、増幅産物の環状ＤＮＡベクターへのＤＮＡ結合反応を行うことができる固有のエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアリコート、反応容器に加えるための別の容器に入れることができる少なくとも１つの制限酵素、及び反応緩衝液のアリコートを含み得る。アリコートは、クローニングの少なくとも１つのプログラムを実行するのに十分な成分の量を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、他の試薬を含む緩衝液などの既知の濃度の溶液として提供することができ、そのような試薬は、一緒に又は別々の容器に、クラウディング剤としてのＰＥＧ分子、並びに限定されるものではないがｄＮＴＰ、トリス緩衝剤を含み、任意にＴａｑリガーゼを含む、他の成分を含み得る。
本発明の様々な他の態様、特徴、及び実施形態は、以降の開示及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
図１は、先行技術の方法で使用されるベクターに遺伝子を構築するためのプロセスを示す。 図２は、環状ベクターＤＮＡの本発明の標的ＤＮＡでのワンステップ構築を示す。 図３は、適切なインサートを有するクローンのコロニーＰＣＲ画面を示す。 図４は、相同性ステッチングオリゴ（stitching oligo）を用いた本発明の概略図を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、既存の方法に比べて複数の利点を有する。第１の利点は、時間がかからないことである。従来技術の方法は、事前に線状化したＤＮＡ環状ベクターを使用し、ベクターＤＮＡのそのような制限消化は、多くの場合、２０分～１時間かかる。特に、図１に示すように、ベクターＤＮＡの制限酵素消化は、多くの場合、不完全である。不完全に消化された微量のベクターＤＮＡは、標的ＤＮＡ分子を含まない偽陽性クローンを生成する。構築反応中にベクターが分子内でそれ自体に迅速且つ優先的に再ライゲーションされるため、ベクターが単一の制限酵素で消化される場合、ギブソン法を使用して構築を成功させることは技術的に非常に困難である。これは、構築反応が非効率的である場合、例えば、適切なインサートを作製するために複数の断片の結合が必要な場合に特に問題である。
次に、従来技術の次のステップは、多くの場合、アガロースゲルを調製する時間を含めると少なくとも１時間かかる可能性があるＤＮＡの電気泳動を必要とする。従来技術の事前に線状化されたベクターＤＮＡをゲルから精製するには、多くの場合、３０分以上かかる。他の方法には、制限消化後の沈殿及び再懸濁が含まれる。
重要なことに、本発明は、上記のすべての時間のかかるステップを回避し、さらに重要なことに、アガロースゲル電気泳動及びベクターＤＮＡのゲル精製のための試薬のコストなどのそのようなステップの高コストを回避する。さらに、本発明の方法は、事前の制限消化、ゲル電気泳動、及びゲル精製で必要とされる希釈及び再濃縮ステップを排除することによって、反応において高濃度のベクターＤＮＡを達成することをより容易にする。高いベクター濃度は、構築されたＤＮＡが細菌細胞に形質転換されるときに得られる陽性クローンの数を著しく増加させるため望ましい。
本発明の最大の利点は、新規且つ発明のシステムにおいて制限酵素が連続して存在することにより達成されるより低いバックグラウンドであり、それにより、自己ライゲーションベクター（self-ligated vector）の動的消化を可能にし、バックグラウンドを大幅に低減する。
本明細書で使用される「５’－３’エキソヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡを５’末端から、即ち５’から３’方向に分解するエキソヌクレアーゼを指す。目的の５’－３’エキソヌクレアーゼは、平滑末端で、特定の実施形態では３’及び又は５’オーバーハングで、ｄｓＤＮＡ鎖の５’末端からヌクレオチドを除去することができる。Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、及びＴ７エキソヌクレアーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼの例である。特定の実施形態では、Ｔ５エキソヌクレアーゼが好ましい。Ｔ５エキソヌクレアーゼは、さらにｓｓエンドヌクレアーゼ活性を有する。
本明細書で使用される「リガーゼ」という用語は、特にニックで、ＤＮＡ分子の３’末端を別のＤＮＡ分子の５’末端に共有結合させることができる酵素を指す。リガーゼの例には、Ｔ７リガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、及びＴａｑリガーゼが含まれるが、他の多くのリガーゼが知られており、本明細書で使用することができる。
本明細書で使用される「重複配列」という用語は、２つのポリヌクレオチドにおいて相補的である配列を指し、重複配列がｓｓである場合、重複配列は、あるポリヌクレオチド上で、別のポリヌクレオチド上の別の重複する相補的なｓｓ領域にハイブリダイズすることができる。
本明細書で使用される「オーバーハング」という用語は、その末端にあるｄｓＤＮＡの一本鎖領域を指し、ＤＮＡの固有の方向性に応じてタイプ５’又は３’のいずれかである。オーバーハングは一般に、ｄｓＤＮＡを制限酵素又はエキソヌクレアーゼで処理することによって、及び／又は適切なｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を追加することによって様々な長さに生成される。
本明細書で使用される場合、「一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ結合タンパク質」という用語は、ｓｓＤＮＡに結合して早期アニーリングを防止し、ｓｓＤＮＡがヌクレアーゼ及びポリメラーゼによって消化されるのを保護し、及び／又はＤＮＡから二次構造をから除去して他の酵素がそれに対して効果的に機能することを可能にするタンパク質を指す。シントン生成の効率を最適化するために、本明細書に記載の組成物にｓｓ結合タンパク質を含めることが好ましい。ｓｓＤＮＡ結合タンパク質の例は、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌（E. coli）ＳＳＢ、Ｔ７ ｇｐ２．５ ＳＳＢ、及びファージｐｈｉ２９ ＳＳＢ、及びＥＴ ＳＳＢであるが、多くの他のＤＮＡ結合タンパク質、例えば、ラムダファージのＲｅｄＢ、ＲａｃプロファージのＲｅｃＴ、及び以下に列挙される配列も知られており、本明細書で使用することができる。
ｄｓＤＮＡの両端を結合するリガーゼに依存しない方法では、最適な長さの５’又は３’オーバーハングを生成することが重要であり、これは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性又は５’→３’エキソヌクレアーゼをそれぞれ有するＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。
本明細書で使用される二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）という用語は、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を有し、そのすべて又は一部が互いに相補的である２つの一本鎖から構成されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指し、従って、ｄｓＤＮＡは、末端に一本鎖領域を含み得、合成起源又は細胞又は組織に由来する天然起源であり得る。一実施形態では、ｄｓＤＮＡは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の産物であるか、又はゲノムＤＮＡ若しくはプラスミド若しくはベクターからその物理的若しくは酵素的処理によって作製される断片である。
本明細書で使用される「緩衝剤」という用語は、酸又はアルカリが溶液に添加されたときに溶液がｐＨの変化に抵抗することを可能にする薬剤を指す。本発明の組成物、キット、及び方法で使用することができる適切な天然に存在しない緩衝剤の例には、例えば、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＭＯＰＳ、トリシン、又はＭＥＳが含まれる。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドを包含し、任意の長さの核酸を指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。特に明記しない限り、ポリヌクレオチドはｓｓ又はｄｓであり得る。ポリヌクレオチドは、合成、例えば、ＤＮＡシンセサイザーで合成され得るか、或いは天然に存在し得、例えば、天然源から抽出されるか、又はクローニング若しくは増幅された材料に由来し得る。本明細書で言及されるポリヌクレオチドは、修飾された塩基を含み得る。
本明細書で利用される標的核酸は、任意の核酸、例えば、ヒト核酸、細菌核酸、又はウイルス核酸であり得る。標的核酸試料は、例えば、１つ又は複数の細胞、組織、若しくは体液、例えば、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、若しくは羊水からの核酸試料、又は他の生物学的試料、例えば、組織培養細胞、頬スワブ、マウスウォッシュ、便、組織切片、生検吸引、及び考古学的試料、例えば、骨若しくはミイラ化組織であり得る。標的核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は逆転写されたＲＮＡのＤＮＡ産物であり得る。標的試料は、限定されるものではないが、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚、哺乳動物、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検、針吸引生検、癌、腫瘍、組織、細胞、細胞溶解物、粗細胞溶解物、組織溶解物、組織培養細胞、頬スワブ、マウスウォッシュ、便、ミイラ化組織、法医学的源（forensic source）、剖検、考古学的源（archeological source）、感染症、院内感染、生産源（production source）、薬物調製物、生体分子生産、タンパク質調製物、脂質調製物、炭水化物調製物、無生物、空気、土壌、樹液、金属、化石、掘削された材料、及び／又は他の地球若しくは地球外の材料及び供給源を含む任意の供給源に由来し得る。
試料にはまた、１つの供給源又は異なる供給源からの材料の混合物も含まれ得る。例えば、感染する細菌又はウイルスの核酸は、そのような感染した細胞又は組織からの核酸が開示される方法を使用して増幅されるときにヒトの核酸と共に増幅することができる。有用な標的試料の種類には、真核生物試料、植物試料、動物試料、脊椎動物試料、魚試料、哺乳動物試料、ヒト試料、非ヒト試料、細菌試料、微生物試料、ウイルス試料、生物学的試料、血清試料、血漿試料、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、癌試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、組織溶解物試料、組織培養細胞試料、頬スワブ試料、マウスウォッシュ試料、便試料、ミイラ化組織試料、剖検試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、生産試料、薬物調製物試料、生体分子生産試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、炭水化物調製物試料、無生物試料、空気試料、土壌試料、樹液試料、金属試料、化石試料、発掘された材料試料、及び／又は他の地球又は地球外試料が含まれる。法医学試料の種類には、血液、乾燥血液、血痕、頬スワブ、指紋、接触試料（例えば、飲用グラスの唇、野球帽の内縁、又はたばこの吸い殻に残った上皮細胞）、チューインガム、胃内容物、唾液、爪あか、土壌、性的暴行の試料、毛髪、骨、皮膚、及び固形組織が含まれる。環境試料の種類には、ろ過されていない及びろ過された空気と水、土壌、表面、封筒、及び粉末からのスワブ試料が含まれる。
本明細書で使用される「重複配列」という用語は、２つのポリヌクレオチドにおいて相補的である配列を指し、重複配列が、あるポリヌクレオチドにおけるｓｓである場合、重複配列は、別のポリヌクレオチドの別の重複する相補的なｓｓ領域にハイブリダイズすることができる。例として、重複配列は、ポリヌクレオチドのセットにおける少なくとも５、１０、１５、又はそれ以上のポリヌクレオチドにおいて相補的であり得る。重複配列は、長さが異なり得、場合によっては、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１５、２０又はそれ以上のヌクレオチド長）であり得、及び／又は最大１００ヌクレオチド長（例えば、最大５０、最大３０、最大２０、又は最大１５ヌクレオチド長）であり得る。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド構築」という用語は、２つ以上、４つ以上、６つ以上、８つ以上、１０以上、１２以上、１５以上のポリヌクレオチド、例えば、４つ以上のポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドに結合して、より長いポリヌクレオチドを形成する反応を指す。ポリヌクレオチド構築反応の生成物、即ち、多くの実施形態における「構築ポリヌクレオチド」は、重複配列のそれぞれの１つのコピーを含むはずである。
本明細書で使用される「適切な反応条件下でインキュベートする」という用語は、所望の結果、即ち、ポリヌクレオチド構築を達成するのに適した温度及び時間にわたって反応を維持することを指す。本方法で使用される酵素及び試薬に適した反応条件は、本明細書に記載されており、従って、本方法に適した反応条件は、容易に決定することができる。これらの反応条件は、使用される酵素によって異なり得る（例えば、至適温度などで決まる）。
本明細書で使用される「フュージョン(Phusion)ポリメラーゼ」という用語は、処理能力増強ドメインと融合したピュロコックス（Pyrococcus）様酵素を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを指し、処理能力増強ドメインとの融合の結果、フィデリティ及び速度が向上し、例えば、エラー率がＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼのエラー率の５０分の１未満であり、ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）ＤＮＡポリメラーゼのエラー率の６分の１である。Phusionポリメラーゼは、５’－３’ポリメラーゼ活性を有し、Phusionポリメラーゼの例は、Phusion（登録商標）ハイフィデリティ(High-Fidelity)ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）である。
本明細書で使用される「結合」という用語は、２つの配列間の共有結合の形成を指す。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「プライマー」という用語は、二部プライマー（bipartite primer）又は第１及び第２の部分を有するプライマーを指す。プライマーの第１の部分は、標的ＤＮＡ分子の適切な末端に相補的であるように設計され、プライマーの第２の部分は、本発明の緩衝液中で線状化されると、環状プラスミドの選択された制限部位の一側のヌクレオチド配列に相補的であるように設計されている。二部プライマーは、一般に、約１０ヌクレオチドの最小長及び約２００ヌクレオチドの最大長、好ましくは約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長、より好ましくは約３０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド長を有する。
本明細書で使用される「組成物」という用語は、列挙されたものに加えて、他の試薬、例えば、グリセロール、塩、ｄＮＴＰなどを含み得る試薬の組み合わせを指す。組成物は、任意の形態、例えば、水性形態又は凍結乾燥形態であり得、且つ任意の状態（例えば、凍結又は液体形態）であり得る。
本明細書で使用されるタンパク質（例えば、リガーゼ、ＳＳＢＰ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、又はポリメラーゼなど）のいずれか１つ又は複数は、温度感受性又は熱安定性であり得、本明細書で使用される「温度感受性」という用語は、６５℃の温度で１０分後にその活性の少なくとも９５％を失う酵素を指し、「耐熱性」という用語は、６５℃の温度で１０分後にその活性の少なくとも９５％を保持する酵素を指す。
本発明のステップは、まず、線状化標的ヌクレオチド分子にプライマーを付着させることを含む。線状標的ヌクレオチド分子は、第１及び第２のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって増幅してＰＣＲ増幅産物を提供することができる。第１のプライマー分子の３’末端は、標的ＤＮＡ分子の第１の末端とハイブリダイズするように設計されており、第１のプライマー分子の５’末端は、環状プラスミドが適切な制限酵素と相互作用して選択された挿入部位でこの環状プラスミドを切断した後に、線状化プラスミドＤＮＡ分子の第１の末端に相補的な配列を最終的なＰＣＲ産物に組み込むように設計された配列を有する。第２のプライマーの３’末端は、標的ＤＮＡ分子の第２の末端とハイブリダイズするように設計されており、第２のプライマー分子の５’末端は、適切な制限酵素との相互作用後に、線状化プラスミドＤＮＡ分子の第２の末端に相補的な配列を最終的なＰＣＲ産物に組み込むように設計された配列を有する。次に、２つのプライマーが標的ＤＮＡ分子にアニーリングされ、次に、標準的な条件を使用してＰＣＲ増幅されてＰＣＲ増幅産物が生成される。
図２に示すように、次に、ＰＣＲ増幅産物は、適切な制限酵素の存在下で環状プラスミドと同時にインキュベートされ、標準的な条件、適切な反応緩衝液を使用して、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、選択された挿入部位で切断され、このＤＮＡポリメラーゼは、本発明のＤＮＡ結合反応を約５～約６０分間、好ましくは約１０～約４０分間、最も好ましくは約１５～約３０分間行うことができる。反応緩衝液は、ＤＮＡアニーリング反応で使用される任意の緩衝液であり得る。温度は、約３５～４０℃の範囲、より好ましくは約３７℃であり得る。
本発明の方法を使用して、任意の種類又は数の標的ＤＮＡ分子をクローニングすることができる。サイズの唯一の制限は、宿主細胞での形質転換及び複製においてインサートを運ぶ環状ＤＮＡベクターの能力である。原核生物又は真核生物の細胞で複製することができる任意の環状ＤＮＡベクターを本発明で使用可能である。キャプシド、コスミド、又は細菌人工染色体などの環状ＤＮＡベクターの選択は、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現、及び形質転換される宿主細胞に依存する。好ましくは、環状ＤＮＡベクターは、選択された制限酵素部位のいずれかの側に、約５～約１００、好ましくは約８～約５０、最も好ましくは約１０～約３５ヌクレオチドの既知の配列を有する。
別の実施形態では、例えば、プロモーター配列又は図４に示すようなタンパク質のタグをコードするＤＮＡ配列を追加することが望ましい場合、一本鎖オリゴヌクレオチドの対を使用して、ベクターと標的ＤＮＡ分子との間、又はベクター若しくは標的ＤＮＡには見られない追加のヌクレオチドを含む２つの標的ＤＮＡ分子間に配列重複領域を形成することができる。
組換えＤＮＡ分子の形質転換
任意の環状プラスミドを使用することができる［４］。典型的な環状発現プラスミドには、プロモーター、エンハンサー、コード配列、及びターミネーターが含まれる。プラスミドのプロモーター領域は、転写を開始するために必要なＲＮＡポリメラーゼＩＩ、関連酵素、及びその他の因子に結合する。エンハンサー配列の機能は、特定の細胞内転写因子に結合することである。ＤＮＡに結合した転写因子は、転写複合体と相互作用し、転写速度を増加させる。通常の内因性転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインの２つのドメインを含むタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、エンハンサー領域にある、通常は５～１０塩基対の特定の二重鎖ＤＮＡ配列に結合する。ＤＮＡ結合ドメインにより、転写活性化ドメインが最小プロモーターに近づき、そこで、この転写活性化ドメインがＲＮＡポリメラーゼと相互作用して転写を活性化する。
この例は、選択可能なマーカーを有する市販のプラスミドを利用した。任意の選択可能なマーカーを使用することができる。同様に、特定の切断部位が、目的の断片の末端に隣接するエンジニアリングされた位置に加えて目的の断片に生じない場合に、オリゴヌクレオチドの末端で特異的に切断して付着末端又は平滑末端のいずれかを生成することができる任意の制限切断酵素に特異的な認識部位を選択することができる。本発明では、付着末端を生成する制限酵素の認識部位は、ＤＮＡ合成によって目的のポリヌクレオチドに隣接して導入された。
ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素と環状プラスミド及びＰＣＲ増幅産物とのインキュベーションから得られた反応混合物を使用し、標準的な形質転換手順を使用して任意の宿主細胞を形質転換することができる。そのような宿主は、特に、細菌又は真核細胞（酵母、動物細胞、植物細胞）などであり得る。細菌の中では、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）（Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．エルギノーザ（P. aeruginosa））、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespirais）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、又はクロストリジウム（Clostridium）などを挙げることができる。細菌の中では、大腸菌（E. coli）が一般的に使用される。酵母の中では、クリベロミセス（Kluyveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）、及びハンゼヌラ（Hansenula）などを挙げることができる。哺乳動物細胞の中では、ＣＨＯ、ＣＯＳ、及びＮＩＨ３Ｔ３などを挙げることができる。
使用される宿主に応じて、当業者は、本発明に記載されるプラスミドの選択／複製を合わせる。特に、複製起点及び選択マーカー遺伝子は、選択された宿主細胞に応じて選択される。
選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、ジェネティシン、及びハイグロマイシンなど）に対する耐性を付与する耐性遺伝子、又はもはや有していない機能を細胞に与える任意の遺伝子（例えば、染色体上で欠失しているか又は不活性化された遺伝子）、即ち、この機能を再確立するプラスミド上の遺伝子であり得る。この選択可能なマーカー遺伝子により、最少培地でのプラスミドの選択と生産が可能になる。
本発明は、以下の実施例でさらに説明される。しかしながら、この実施例は例示のみを目的としており、いかなる方法であっても本発明の範囲を制限するために使用されるべきではないことを理解されたい。
実施例１
ヒトＳＲＳＦ３遺伝子のクローニング
線状ＤＮＡ分子を構築する方法は数多く開発されているが、環状ＤＮＡを環状ＤＮＡに、又は環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにワンステップで構築する方法は開発されていない。そこで、本発明者らは、線状ＰＣＲ産物を用いて環状プラスミドＤＮＡをワンステップで直接構築する方法を説明する。
環状ＤＮＡは、ベクターｐＱＥ８０Ｌを骨格として使用し、ヒトＲＰＳ６遺伝子を含むプラスミドである。線状ＰＣＲ産物は、ヒトＳＲＳＦ３であり、ＳＲＳＦ３遺伝子を増幅するために使用されるプライマーは：ＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧｔｇｃａｔｃｇｔｇａｔｔｃｃｔｇｔｃｃ（配列番号１）及びＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧｃｔａｔｔｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｔｇａｃｃ（配列番号２）である。各プライマーは、ベクターと２０塩基対の相同性を有する。ＳＲＳＦ３遺伝子は、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅される。線状ＰＣＲ産物を構築するためには、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを３００ｎｇのＰＣＲ産物と混合し、緩衝液とPhusion Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔａｑリガーゼ、及びＴ５エキソヌクレアーゼと共に１μｌのＢａｍＨＩ及び１μｌのＳａｌＩと混合する。
混合物を３７℃で１５分間インキュベートしてから５０℃で４５分間インキュベートしてＳＲＳＦ３をｐＱＥ８０Ｌに構築する。反応混合物をカラムに通して塩を除去し、ＤＮＡを使用して大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞を形質転換した。コロニーをコロニーＰＣＲでスクリーニングする。プレートから８個のコロニーを選び、同じプライマーを使用してコロニーＰＣＲでスクリーニングした。８つのコロニーすべてから精製されたプラスミドには正しいインサートが含まれており、図３に示されている。矢印は正しいサイズのインサートを示している。
参考文献
以下に示す参考文献は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (14)

  1. ヌクレオチド最終産物の調製に使用するための環状化ＤＮＡ分子を調製するためのワンポット法であって：
    反応容器を提供すること；
    環状ＤＮＡベクターと、増幅された線状化標的ＤＮＡ分子と、少なくとも１つの制限酵素、ここで、前記少なくとも１つの制限酵素は、反応容器内で環状ＤＮＡベクターを線状化する量のＢａｍＨＩ及びＳａｌＩの組み合わせであり、と、及び緩衝液、ここで、前記緩衝液は、少なくともＤＮＡポリメラーゼ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、緩衝剤、及びＤＮＡリガーゼを含み、とを本質的に同時に前記反応容器に導入すること；
    前記環状ＤＮＡベクター、前記増幅された線状化標的ＤＮＡ分子、及び前記緩衝液を、前記環状ＤＮＡベクターの線状化に十分な時間及び温度でインキュベートし、環状化ＤＮＡ分子の作製のために、前記増幅された線状化標的ＤＮＡ分子及び線状化された前記環状ＤＮＡベクターを結合することを含む、ワンポット法。
  2. 前記ＤＮＡリガーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、９Ｎ ＤＮＡリガーゼ、及びアンプリガーゼ（Ampligase）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、フュージョン（Phusion）ＤＮＡポリメラーゼ、プラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ（High Fidelity）、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記緩衝液が、少なくともクラウディング剤、ｄＮＴＰ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ウシ血清アルブミン、及びトリス酢酸緩衝剤からなる群から選択される成分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記５’－３’エキソヌクレアーゼが、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、及びＴ７エキソヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記クラウディング剤がＰＥＧ分子である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記緩衝液が、２％～１０％のＰＥＧ８０００、５０ｍＭ～約１５０ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ６．５～８．５、約０．０９ｍＭ～約０．４ｍＭのｄＮＴＰ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭの酢酸カリウム、約１０ｍＭ～約４０ｍＭの酢酸マグネシウム、及び約５０ｍｇ／ｍｌ～約１５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記インキュベーションの十分な時間及び温度が、３７℃で１５分間＋５０℃で約１５分間、３７℃で１５分＋５０℃で４５分間、及び３７℃で３０分＋５０℃で３０分間からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ヌクレオチド最終産物が、二本鎖ＤＮＡ、環状化ＤＮＡ分子、環状化ＲＮＡ分子、又は宿主細胞の産生による前記環状化ＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 環状化ＤＮＡ分子のワンポット合成のための成分の混合物であって：
    環状ＤＮＡベクター、増幅された線状化標的ＤＮＡ分子、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩの組み合わせである少なくとも１つの制限酵素、少なくともＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、インキュベーション溶液であって少なくともクラウディング剤、ｄＮＴＰ、及びトリス緩衝剤を含むインキュベーション溶液、を含む、成分の混合物。
  11. 前記ＤＮＡリガーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、９Ｎ ＤＮＡリガーゼ、及びアンプリガーゼ（Ampligase）からなる群から選択される、請求項１０に記載の成分の混合物。
  12. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、フュージョン（Phusion）ＤＮＡポリメラーゼ、プラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ（High Fidelity）、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の成分の混合物。
  13. 前記５’－３’エキソヌクレアーゼが、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、及びＴ７エキソヌクレアーゼからなる群から選択され、前記クラウディング剤がＰＥＧ分子である、請求項１０に記載の成分の混合物。
  14. 前記インキュベーション溶液が、２％～１０％のＰＥＧ８０００、５０ｍＭ～約１５０ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ６．５～８．５、約０．０９ｍＭ～約０．４ｍＭのｄＮＴＰ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭの酢酸カリウム、約１０ｍＭ～約４０ｍＭの酢酸マグネシウム、及び約５０ｍｇ／ｍｌ～約１５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む、請求項１０に記載の成分の混合物。
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