JP3819436B2 - 部位特異的変異導入方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、遺伝子工学において使用される部位特異的変異導入（site-directed mutagenesis）を、より一層簡易にかつ効率的に行うための方法及びそれに使用するキットに関する。
背景技術
近年、遺伝子工学の分野において、遺伝子をクローニングし、発現するだけの技術では、その遺伝子産物を単にそのまま大量に取得することは困難であることが多く、成功する例は少ない。このため、これらのクローニングされた遺伝子を該産物の発現量を上げるためにフレームを合わせ、またアミノ酸配列を変えることなく開始コドン付近の塩基配列を変える技術（サイレント変異）は、最低限必要な技術である。また、遺伝子をクローニングし、発現させるタンパク質をより有用なものにするために、対応するコドンの塩基配列を変えることにより、アミノ酸を削除、置換してそのタンパク質の特異性を変化させ、それが酵素であるなら、至適ｐＨ、安定性、基質特性、Ｋｍ値等を操作する技術は重要であり、また必須である。
このように、クローニングされた遺伝子内の特定の塩基配列を希望通りに変化させる方法、つまり部位特異的変異導入は、ＲＮＡも含め遺伝子上の様々な調節領域の構造、機能解析や組換えＤＮＡ技術を用いたタンパク質工学を行なう場合になくてはならないものである。また、タンパク質工学の研究分野において、部位特異的変異導入方法は、ＤＮＡレベルでの変異導入、削除を行うことにより、研究をより迅速、正確に行うことができる点からもさらに重要である。
従来、部位特異的変異導入方法は、例えば以下のような手順からなっている。
（１）まず、変異を導入したい目的のＤＮＡをベクターに挿入した後、二本鎖プラスミドＤＮＡの場合、熱変性させて相補鎖を解離させるか、又はＭ１３ファージベクターを用いて一本鎖ＤＮＡを調製する。
（２）目的の変異を導入するようにデザインされたオリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）を上記の一本鎖ＤＮＡにアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼの反応により、イン ビトロ（in vitro）系で相補鎖ＤＮＡを合成する。
（３）上記（２）で得られたＤＮＡを大腸菌に形質転換し、変異の導入されたクローンを選択する。
しかしながら、このような手順のみでは親ＤＮＡに対して変異体の割合は極めて低く、変異導入用プライマーがアニールしたものを効率良く選択する必要がある。そのため（３）の段階において親ＤＮＡをもったクローンは生育しないように選択的に排除するシステムが用いられている。
例えば、アンバー変異（アンバーコドン）を利用する方法［ヌクレイック アシズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第１２巻、第２４号、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）］、制限酵素部位を利用する方法［アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第２００巻、第８１〜８８頁（１９９２）、ジーン（Gene）、第１０２巻、第６７〜７０頁（１９９１）］、ｄｕｔ（dUTPase）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する方法［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA）、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９８５）］等がある。しかしながら、これらの変異導入方法は手順が複雑で、かつ時間を費やすものであるのに加えて、変異が導入された目的のクローンが得られる割合も低いものであった。
一方、特開平７−２８９２６２号公報に記載の部位特異的変異導入方法は、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法である。前述の方法に比べ、高い効率で変異体を得ることができるが、大腸菌への形質転換が２段階必要であり、簡易な方法とはいえないのが実情である。
最近ではＰＣＲ法の普及に伴い、これを応用した部位特異的変異導入の手法が開発されている。
例えば、変異導入用プライマーを含む３種類以上のプライマーを用いて、変異を導入したいＤＮＡ鎖を合成し、その後、変異が導入されたと予想されるＤＮＡ鎖を制限酵素で切り出した後に別のベクターにライゲーションし、宿主大腸菌に形質転換する方法が知られている。また、クイック チェンジ サイト−ダイレクティッド ミュータジェネシス キット［Quik ChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit、ストラタジーン（Stratagene）社製］は、変異を導入したい二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする相補的な２種類の変異導入用オリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）を用い、ＰＣＲもしくはピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼで鎖の合成を行い、その後、制限酵素Dpn Iで変異が導入されない鎖を切断し、宿主大腸菌に形質転換することで変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。更に、２種の変異導入用オリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）の５’末端側にクラスＩＩＳの制限酵素の認識部位を付加し、ＰＣＲで鎖の合成を行い、その後、クラスＩＩＳの制限酵素で変異が導入されたＤＮＡを消化し、ライゲーションした後、宿主大腸菌に形質転換することで変異が導入されたＤＮＡを得ることができる方法が知られている（ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５１２，４６３）。
前記のように、従来のＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いる方法では、これら酵素反応や、変異部位を固定するために複数回の形質転換などの操作が必要であり、このために時間を費やし、効率を上げることが困難であった。また、アンバー変異、ｄｕｔとｕｎｇ変異を利用したものでは、一本鎖のＤＮＡを単離しなくてはならず、制限酵素部位を除去する方法についても、利用できる制限酵素が限られているなどの問題点があった。
このため、近年広く普及したＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入方法が開発、利用されてきているがこれも変異導入用プライマーを含む３種類以上のプライマーが必要であったり、変異導入用プライマーを２種類以上用い、さらに操作途中段階での制限酵素反応が必要であることなど操作が煩雑であった。また、この制限酵素反応が不完全であると極端に変異効率が低下してしまうものであった、等種々の問題を有するものであった。
従って、本発明の目的は、ＰＣＲ法を用いたより簡便かつ実用的な部位特異的変異導入方法及びその部位特異的変異導入方法を行うためのキットを提供することにある。
本発明者らは、高い効率でかつ簡便な部位特異的変異導入方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＣＲを行った後に１回の大腸菌への形質転換だけで目的の変異が導入されたクローンを得ることに成功した。本発明はかかる事実に基づいて完成するにいたったものである。
発明の開示
即ち、本発明の要旨は、
（１） 部位特異的変異導入方法において、
〔Ａ〕部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した、１個以上のアンバーコドンを有する二本鎖ＤＮＡベクターを得る工程、
〔Ｂ〕工程〔Ａ〕で得られたベクターと変異させる遺伝子の目的の位置に変異を導入する変異導入用プライマーと、該プライマーの反対側のストランドに配置され、アンバーコドンを復帰させるためのアンバーコドン復帰用プライマーとを用いＰＣＲを行う工程、及び
〔Ｃ〕工程〔Ｂ〕で得られたＰＣＲ産物をサプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主に導入し、目的の変異を有するクローンを選択する工程、
を含むことを特徴とする部位特異的変異導入方法、
（２） ベクターが１個以上のアンバーコドンを含む薬剤耐性遺伝子を有することを特徴とする前記（１）記載の部位特異的変異導入方法、
（３） サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主が大腸菌であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の部位特異的変異導入方法、
（４） 前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の部位特異的変異導入方法を用いるためのキットであって、
(I) アンバーコドン復帰用プライマー、
(II)アンバーコドンを有するベクター、
(III) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
(IV)ＰＣＲを行うための反応液、
を含有することを特徴とする部位特異的変異導入用キット、
（５） サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主をさらに含有することを特徴とする前記（４）記載の部位特異的変異導入用キット、並びに
（６） サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主が大腸菌であることを特徴とする前記（５）記載の部位特異的変異導入用キット、に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＫＦ１９ｋの構造を示す概略図である。
第２図は、プラスミドｐＫＦ１９ｋＭの構造を示す概略図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を１個以上のアンバーコドンを有する二本鎖ＤＮＡベクターに挿入し、この二本鎖ＤＮＡベクターと、少なくとも２種類の選択プライマーを用いてＰＣＲを行うことに特徴を有する部位特異的変異導入方法である。本発明において用いる選択プライマーとしては、変異させる遺伝子の目的の位置に変異を導入する変異導入用プライマーと、該プライマーの反対側のストランドに配置され、アンバーコドンを復帰させるためのアンバーコドン復帰用プライマーの少なくとも２種類を用いることができる。ここで、少なくとも２種類とは、変異導入用プライマーとアンバーコドン復帰用プライマーが挙げられ、これら２種類の選択プライマーを有するものであれば本発明で言う少なくとも２種類の選択プライマーに含まれる。
本発明に使用する１個以上のアンバーコドンを有する二本鎖ＤＮＡベクターとしては、１個以上のアンバーコドンを有するベクターであれば、特に限定されることはなく、本発明の部位特異的変異導入方法に使用することができる。この場合、薬剤耐性遺伝子上にアンバーコドンを有するベクターを用いることが好ましい。薬剤耐性遺伝子としては特に限定されないが、例えば、カナマイシン耐性遺伝子やクロラムフェニコール耐性遺伝子等が好ましい。即ち、カナマイシンやクロラムフェニコール等の薬剤耐性遺伝子上に１個以上のアンバーコドンを有するベクターが好適に使用することができ、例えばｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）を用いることができる。また、アンバーコドンを有するカセットを作製し、ベクターに導入しても構わない。このようなベクターを用いることで、ＰＣＲ産物をサプレッサーフリーの大腸菌などの宿主に導入し、例えばカナマイシンやクロラムフェニコール等の薬剤を含む寒天培地上で生育させるだけで薬剤耐性遺伝子上のアンバーコドンが復帰していることが容易に確認できる。
本発明の部位特異的変異導入方法で導入できる変異の種類は、特に限定されないが、例えば塩基の置換、欠失、挿入等の変異が挙げられる。変異の大きさは特に限定されるものではないが、変異の大きさにより、変異導入用プライマーの長さを変えることが好ましい。例えば、変異の大きさが１〜３塩基程度のものであれば、変異導入用プライマーの長さは２０塩基前後が好ましく、変異の大きさが４塩基以上の場合は、目的の変異の位置の５’側、及び３’側それぞれ１５塩基対前後を含む約３０塩基の長い変異導入用プライマーを用いるのが好ましい。また、変異導入用プライマーの３’末端はポリメラーゼ反応の始点となる点からＧまたはＣであることが望ましい。これらの条件を考慮して、変異導入用プライマーを作製する。該プライマーを用い、ＰＣＲによって目的の断片が確実に増幅されることを電気泳動等で確認し、該プライマーの設計及び純度を検定することも可能である。また、本発明では変異導入用プライマーの数は１種類で目的とする変異を導入することができるが、同一箇所に異なる変異を導入する場合、目的に応じて変異導入用プライマーを設定し、これらを混合して用いることにより、１回の操作で目的とするそれぞれの変異が導入されたものを得ることができる。例えば、１箇所の塩基をＧからＡ、Ｔ、Ｃのそれぞれに変異させる塩基置換部位特異的変異導入を行う場合、３種類の変異導入用プライマーをそれぞれ作製し、これらを混合して用いることにより１回の操作でＧからＡ、Ｔ、Ｃにそれぞれ変異が導入されたものを得ることができる。
また、アンバーコドン復帰用プライマーとしては、アンバーコドン部分を野生型等に復帰させるようなプライマーであればよく、特に限定されるものではない。例えば、アンバーコドンがＴＡＧの場合、このＴＡＧがＴＣＧやＣＴＧになるようにプライマーを作製することにより、アンバーコドンを復帰することができる。アンバーコドン復帰用プライマーは、アンバーコドンの数やＰＣＲの効率等により、長さを変えることが好ましい。アンバーコドン復帰用プライマーの長さとしては、特に限定されるものではないが、２０塩基前後から約３０塩基の長さが好ましい。また、アンバーコドンの３’末端は変異導入用プライマーと同様に、ポリメラーゼ反応の始点となる点からＧまたはＣであることが望ましい。該プライマーを用い、ＰＣＲによって目的の断片が確実に増幅されることを電気泳動等で確認し、該プライマーの設計及び純度を検定することも可能である。また、アンバーコドン復帰用プライマーの数は、１種類を用いることがよく、アンバーコドンが２個以上ある場合は、それらアンバーコドンを１種類のプライマーで復帰させるようにアンバーコドン復帰用プライマーを作製することが好ましい。
変異導入用プライマー及びアンバーコドン復帰用プライマーのＰＣＲ時の濃度は、特に限定されるものではないが、プライマーの濃度が低過ぎると増幅量が少なくなり、高過ぎると非特異的な反応が助長し、結果的に特異的な増幅反応が起こりにくくなる場合があるので、それぞれの反応至適濃度を検討することが望ましい。通常、それぞれのプライマーの最終濃度が０．１〜１．０μＭの範囲でＰＣＲを行うことが好ましい。
本明細書で言うサプレッサーフリーの宿主としては、好適には大腸菌が挙げられ、例えばイー コリ（Escherichia coli）ＭＶ１１８４（宝酒造社製）を用いることができるが、これに限定されるものではなく、サプレッション能力を欠く宿主であればいかなるものでも使用することができ、本明細書で言うサプレッサーフリーの宿主に含まれる。
本発明の方法による部位特異的変異導入は、例えば以下の工程によって行うことができる。
（１） １個以上のアンバーコドンを有する２本鎖ＤＮＡベクターに標的となるＤＮＡを挿入する。
（２） （１）で作製したＤＮＡ挿入ベクター、変異させる遺伝子の目的の位置に変異を導入する変異導入用プライマーと、該プライマーの反対側のストランドに配置され、アンバーコドンを復帰させるためのアンバーコドン復帰用プライマーとを混合しＰＣＲを行う。
（３） このＰＣＲ産物をサプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主に導入し、目的の変異を有するクローンを選択する。
上記の工程を行うことにより、目的の位置に変異が導入された遺伝子を効率よく得ることができる。
本発明はＰＣＲによって増幅したＰＣＲ産物自体が一種の長鎖プライマーとなり、その過程において全長のＤＮＡが合成されやすくなる。また、宿主として大腸菌内（in vivo）にそのまま導入すると環状になる。また、目的の位置に変異が導入された遺伝子を含有するクローンを選択する場合、サプレッション系を利用した方法を用いることでより簡便化される。つまり上記ＰＣＲ産物を例えば、宿主としてサプレッサーフリーの大腸菌に導入し、該大腸菌を前記の薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で培養することによりその生育を確認するだけでアンバーコドンの復帰を確認できる。つまりアンバーコドンが復帰したクローンのみを選択できるため、生育した株には目的の位置に変異が導入された遺伝子が組込まれているクローンである確率が高くなる。
本発明の方法では、変異させたい遺伝子のどの位置でも変異の導入が可能である。
本発明の方法でＰＣＲを行う際、通常の方法を用いることができるが、ＰＣＲによる塩基の誤った取込み、また３’末端へのアデニン（Ａ）の付加等を避けるために以下の工夫を行なうことが好ましい。
（Ｉ） ベクターへ挿入する変異させる遺伝子は２ｋｂｐ以下の短いものが好ましい。
（II） ＰＣＲのサイクル数は２０〜３０サイクルが好ましい。
（III） ＰＣＲに用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、高い増幅効率と低いエラー率を持ったものを用いることが好ましい。例えば、ＰＣＲに用いるキットとしては、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いることができ、また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いることで高い増幅率と低いエラー率でＰＣＲを行うことが可能である。
ここで、ＰＣＲ産物を大腸菌などの宿主に形質転換する方法は、塩化カルシウム法〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）、第１６６巻、第５５７〜５８０頁（１９８３）〕及びエレクトロポレーション法〔ヌクレイック アシドズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第１６巻、第６１２７〜６１４５頁（１９８８）〕等が挙げられる。得られた形質転換体のスクリーニングは、前記のように薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で培養してその生育を確認することにより、アンバーコドンが復帰した、換言すれば目的の位置に変異が導入された確率の高い遺伝子が組込まれているクローンを選択することができる。
本発明により、アンバーコドンを用いた簡便は部位特異的変異導入方法が可能となったことにより、アンバーコドン以外の終止コドンであるオーカーコドン又はオパールコドンについても、本発明のアンバーコドンの代わりに利用可能であることは当業者にとって明らかである。従って、本発明のアンバーコドンの代わりに、これらオーカーコドン又はオパールコドンを用いた部位特異的変異導入方法は、当然、本発明に包含される。
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
１塩基置換部位特異的変異導入
１．ｐＫＦ１９ｋＭの構築
以下の実施例に用いるプラスミドとして、２個のアンバーコドンを含むカナマイシン耐性遺伝子を有するｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製、第１図）中のｌａｃＺ’遺伝子内のマルチクローニングサイトから下流３０番目のＧをＡに変換したｐＫＦ１９ｋＭ（第２図）を構築した。
ｌａｃＺ’遺伝子は、１ａｃＺ△Ｍ１５の遺伝子型をもつ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダーゼの活性を生じる。したがって塩基置換のされていないｌａｃＺ’遺伝子ではイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、宝酒造社製）存在下で、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａ１、宝酒造社製）を基質とした反応により生育コロニーは青くなる。逆に塩基置換された変異型ｌａｃＺ’遺伝子では本来の活性を生じることができず、生育コロニーは白くなる。
このことを利用してｐＫＦ１９ｋＭ中の変異型ｌａｃＺ’遺伝子の塩基置換を部位特異的変異導入によって活性型遺伝子に復帰させたときの効率を青コロニー、白コロニーの数から算出した。
２．変異導入用オリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）及びカナマイシン耐性遺伝子内のダブルアンバーコドンを復帰させるオリゴヌクレオチド（アンバーコドン復帰用プライマー）の合成
変異型ｌａｃＺ’遺伝子内の塩基置換部位を復帰させる（ＡをＧに戻す）ための変異導入用オリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号：１に示される５’末端リン酸化オリゴヌクレオチド（ｍｕｔ１）を合成した。すなわちｍｕｔ１は１０番目のＣによって塩基置換が復帰し活性型のｌａｃＺ’遺伝子になるようにデザインした。
また、カナマイシン耐性遺伝子内のダブルアンバーコドン（２個のアンバーコドン）を復帰させるプライマー（ＫＱ２）として、配列表の配列番号：２に示す５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわちｐＫＦ１９ｋＭでは、ＫＱ２の３番目から５番目のＴＴＧ及び９番目から１１番目のＣＴＧにより、アンバーコドン（ＴＡＧ）が復帰するようにデザインした。
３．ＰＣＲ
反応液の組成を表１に示す。ＰＣＲはサーマルサイクラー（宝酒造社製）を用いて行ない、反応液を脱塩、濃縮するためにエタノール沈殿を行なって、５μｌの滅菌水に懸濁した。
サイクルの条件は９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で２分で行い、サイクルＩは前記条件を２０サイクル、サイクルＩＩは２４サイクル繰り返した。なお、ＰＣＲ後にサイクルＩ及びＩＩのＰＣＲ産物をそれぞれ電気泳動を行ない、目的のサイズのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。
４．形質転換
エタノール沈殿後のＰＣＲ産物の２μｌを用いて、サプレッサーフリーの大腸菌ＭＶ１１８４（宝酒造社製）をエレクトロポレーション法により形質転換した。その後、形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）及びＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）を含んだＬＢ〔バクトトリプトン（１０ｇ）、バクトイースト エクストラクト（５ｇ）、ＮａＣｌ（５ｇ）、蒸留水（１リットル）、ｐＨ（７．０）〕寒天培地上にまき、得られた部位特異的変異のクローンの効率を計算した。なお変異型ｌａｃＺ’遺伝子内の変異部分が活性型ｌａｃＺ’遺伝子に復帰するとコロニーは青く、しないとコロニーは白くなる。結果を表２に示す。
すなわちサイクルＩＩで７５％の効率で部位特異的変異の導入により活性型に復帰したクローンが得られた。
５．部位特異的変異の部位の解析
実施例１の４で得られた青コロニー４つについて、プラスミドＤＮＡをアルカリリシス（Alkali lysis）法で調製した。該プラスミドＤＮＡの塩基配列をジデオキシ法を用いて決定し、変異部位を解析したところ、すべてのものについてｌａｃＺ’遺伝子内のマルチクローニングサイトの下流３０番目においてＡから復帰したＧが観察され、部位特異的変異が導入されたことが明らかとなった。
実施例２
３塩基及び６塩基欠失部位特異的変異導入
３塩基及び６塩基を欠失させるために、野生型のｌａｃＺ’遺伝子と２個のアンバーコドンをもつカナマイシン耐性遺伝子とを含むｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製、第１図）を用いた。
１．変異導入用オリゴヌクレオチドの合成
ｐＫＦ１９ｋのマルチクローニングサイト内のBamHI及びBamHI-EcoRIサイトがそれぞれ３塩基及び６塩基の欠失によって失われるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。３塩基欠失に用いるオリゴヌクレオチド（ｄｅｌ１）は配列表の配列番号：３に、６塩基欠失に用いるオリゴヌクレオチド（ｄｅｌ２）は配列表の配列番号：４に示す。すなわちｄｅｌ１は、配列表の配列番号：３中の１２番目のＧと１３番目のＣ、ｄｅｌ２は、配列表の配列番号：４中の１２番目のＧと１３番目のＴの間で塩基が欠失するようにデザインされた。
２．ＰＣＲ及び形質転換
実施例２の１で作製したプライマーｄｅｌ１及びｄｅｌ２と実施例１で用いたＫＱ２プライマーとをそれぞれ用いて、表１の組成（表中ｐＫＦ１９ｋＭの代わりにｐＫＦ１９ｋを使用）により９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、１０株ずつを選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様に調製した。それらを制限酵素BamHIで消化することにより変異の確認を行った。つまり、変異が導入されたプラスミドは消化されないことになる。
その結果を表３に示す。
プライマーｄｅｌ１、ｄｅｌ２を用いたＰＣＲ産物中にそれぞれ９０％の変異効率で変異が導入され、またシークエンスの結果からもそれぞれが３塩基、６塩基欠失しているのを確認した。
実施例３
６０塩基欠失部位特異的変異導入
１．変異導入用オリゴヌクレオチドの合成
ｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）のマルチクローニングサイト全体（６０塩基）が欠失によって失われるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド（ｄｅｌ３）を配列表の配列番号：５に示す。すなわちｄｅｌ３は、配列表の配列番号：５中の１０番目のＴと１１番目のＧの間でマルチクローニングサイト全体（６０塩基）が欠失するようにデザインされた。
２．ＰＣＲ及び形質転換
実施例３の１で作製したプライマーｄｅｌ３と実施例１で用いたＫＱ２プライマーとを用いて、表１の組成（表中ｐＫＦ１９Ｍの代わりにｐＫＦ１９ｋを使用）により９４℃で３０秒、５０℃で２分、７２℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、２０株を選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様にして調製した。それらを制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することにより変異の確認を行った。つまり変異の導入されたプラスミドはマルチクローニングサイトを失っているため、これらの酵素で消化されないことになる。その結果を表４に示す。
プライマーｄｅｌ３を用いたＰＣＲによって、１００％の効率で変異が導入され、シークエンスの結果からもマルチクローニングサイト全体（６０塩基）が欠失していることを確認した。
これにより比較的長い領域の塩基の欠失も容易に行えることが明らかになった。
実施例４
欠失挿入部位特異的変異
１．変異導入用オリゴヌクレオチドの合成
ｐＫＦ１９ｋのマルチクローニングサイト内のEcoRIサイトから下流１００塩基のところにもう一つEcoRIサイトが導入されるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド（ｅｃｏ１）を配列表の配列番号：６に示す。すなわちｅｃｏ１は、配列表の配列番号：６中の９番目のＧから１４番目のＣの塩基で、この塩基の位置に相当する元の配列のAATを欠失させ、EcoRIサイトであるGAATTCを挿入するようにデザインされている。
２．ＰＣＲ及び形質転換
実施例４の１で作製したプライマーｅｃｏ１と実施例１で用いたＫＱ２プライマーを用いて、表１の組成（表中ｐＫＦ１９Ｍの代わりにｐＫＦ１９ｋを使用）により９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で２分の条件で２４サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、１２株を選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様にして調製した。それらを制限酵素EcoRIで消化し、１００塩基のＤＮＡ断片が電気泳動で確認されることにより変異の確認を行った。つまり変異の導入されたプラスミドはEcoRIサイトを１００塩基の間隔で二つもつことになり、制限酵素EcoRI消化により１００塩基の断片を確認することができる。その結果を表５に示す。
プライマーｅｃｏ１を用いた変異導入によって、１００％の効率で目的の変異プラスミドが得られ、シークエンスの結果からも目的の部位に、EcoRIサイトが導入されていることを確認した。
実施例５
ｐＫＦ１９ｋに連結したＤＮＡ断片への変異導入
１．ｐＫＦ１９ｋへの大腸菌系プラスミドベクターｐＢＲ３２２の連結
ｐＫＦ１９ｋを制限酵素BamHIで消化し、このBamHIサイトに大腸菌系の４３６１塩基の長さをもつプラスミドｐＢＲ３２２［宝酒造社製、ジーン（Gene）、第２２巻、第２７７〜２８０頁（１９８３）］を組込んだベクターを作製し、これをｐＫＢ１０１と命名した。これによって挿入断片への部位特異的変異導入を試みた。
２．変異導入オリゴヌクレオチドの合成
ｐＢＲ３２２のBamHIサイト下流の４００塩基のところにもう一つBamHIサイトが導入されるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド（ｂａｍ１）を配列表の配列番号：７に示す。すなわちｂａｍ１は、配列表の配列番号：７中の１６番目のＧから２１番目のＣで、元の配列であるAGCGCTをBamHIサイトであるGGATCCに置換するようにデザインされている。
３．ＰＣＲ及び形質転換
実施例５の２で作製したプライマーｂａｍ１と実施例１で使用したＫＱ２プライマーを用いて表１の組成（表中ｐＫＦ１９Ｍの代わりにｐＭＢ１０１を使用）により９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６分の条件で２５サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、６株を選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様にして調製した。それらを制限酵素BamHIで消化し、４００塩基のＤＮＡ断片が電気泳動で確認されることにより変異の確認を行った。つまり変異の導入されたプラスミドはBamHIサイトを４００塩基の間隔で二つもつことになり、制限酵素BamHI消化により４００塩基の断片を確認することができる。その結果を表６に示す。
ｐＫＦ１９ｋに連結したＤＮＡ断片に対しても８０％以上の効率で目的の変異プラスミドが得られ、シークエンスの結果からも目的の部位にBamHIサイトが導入されていることを確認した。
実施例６
部位特異的変異用キットの作成
宿主大腸菌、コントロール用のベクター及びオリゴヌクレオチドをセットにして部位特異的変異導入用キット（２０回分）を構築した（表７）。
尚、表７に記載のキットは、市販のＰＣＲ用キットに組合わせることが可能である。
また、ＰＣＲを行うための反応液、ｄＮＴＰ混合液、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをセットした部位特異的変異導入用キット（２０回分）を構築した（表８）。
産業上の利用可能性
本発明により、遺伝子工学やタンパク質工学で有用な、より簡便でかつ迅速な部位特異的変異導入方法及びキットが提供される。本発明の方法およびキットを用いることにより、ＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を、宿主に形質転換するだけで、効率よく目的の位置に変異が導入された遺伝子を取得することが可能である。
配列表
配列番号：1
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：2
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：3
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：4
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：5
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：6
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：7
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
本発明は、遺伝子工学において使用される部位特異的変異導入（site-directed mutagenesis）を、より一層簡易にかつ効率的に行うための方法及びそれに使用するキットに関する。
背景技術
近年、遺伝子工学の分野において、遺伝子をクローニングし、発現するだけの技術では、その遺伝子産物を単にそのまま大量に取得することは困難であることが多く、成功する例は少ない。このため、これらのクローニングされた遺伝子を該産物の発現量を上げるためにフレームを合わせ、またアミノ酸配列を変えることなく開始コドン付近の塩基配列を変える技術（サイレント変異）は、最低限必要な技術である。また、遺伝子をクローニングし、発現させるタンパク質をより有用なものにするために、対応するコドンの塩基配列を変えることにより、アミノ酸を削除、置換してそのタンパク質の特異性を変化させ、それが酵素であるなら、至適ｐＨ、安定性、基質特性、Ｋｍ値等を操作する技術は重要であり、また必須である。
このように、クローニングされた遺伝子内の特定の塩基配列を希望通りに変化させる方法、つまり部位特異的変異導入は、ＲＮＡも含め遺伝子上の様々な調節領域の構造、機能解析や組換えＤＮＡ技術を用いたタンパク質工学を行なう場合になくてはならないものである。また、タンパク質工学の研究分野において、部位特異的変異導入方法は、ＤＮＡレベルでの変異導入、削除を行うことにより、研究をより迅速、正確に行うことができる点からもさらに重要である。
従来、部位特異的変異導入方法は、例えば以下のような手順からなっている。
（１）まず、変異を導入したい目的のＤＮＡをベクターに挿入した後、二本鎖プラスミドＤＮＡの場合、熱変性させて相補鎖を解離させるか、又はＭ１３ファージベクターを用いて一本鎖ＤＮＡを調製する。
（２）目的の変異を導入するようにデザインされたオリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）を上記の一本鎖ＤＮＡにアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼの反応により、イン ビトロ（in vitro）系で相補鎖ＤＮＡを合成する。
（３）上記（２）で得られたＤＮＡを大腸菌に形質転換し、変異の導入されたクローンを選択する。
しかしながら、このような手順のみでは親ＤＮＡに対して変異体の割合は極めて低く、変異導入用プライマーがアニールしたものを効率良く選択する必要がある。そのため（３）の段階において親ＤＮＡをもったクローンは生育しないように選択的に排除するシステムが用いられている。
例えば、アンバー変異（アンバーコドン）を利用する方法［ヌクレイック アシズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第１２巻、第２４号、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）］、制限酵素部位を利用する方法［アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第２００巻、第８１〜８８頁（１９９２）、ジーン（Gene）、第１０２巻、第６７〜７０頁（１９９１）］、ｄｕｔ（dUTPase）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する方法［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA）、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９８５）］等がある。しかしながら、これらの変異導入方法は手順が複雑で、かつ時間を費やすものであるのに加えて、変異が導入された目的のクローンが得られる割合も低いものであった。
一方、特開平７−２８９２６２号公報に記載の部位特異的変異導入方法は、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法である。前述の方法に比べ、高い効率で変異体を得ることができるが、大腸菌への形質転換が２段階必要であり、簡易な方法とはいえないのが実情である。
最近ではＰＣＲ法の普及に伴い、これを応用した部位特異的変異導入の手法が開発されている。
例えば、変異導入用プライマーを含む３種類以上のプライマーを用いて、変異を導入したいＤＮＡ鎖を合成し、その後、変異が導入されたと予想されるＤＮＡ鎖を制限酵素で切り出した後に別のベクターにライゲーションし、宿主大腸菌に形質転換する方法が知られている。また、クイック チェンジ サイト−ダイレクティッド ミュータジェネシス キット［Quik ChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit、ストラタジーン（Stratagene）社製］は、変異を導入したい二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする相補的な２種類の変異導入用オリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）を用い、ＰＣＲもしくはピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼで鎖の合成を行い、その後、制限酵素Dpn Iで変異が導入されない鎖を切断し、宿主大腸菌に形質転換することで変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。更に、２種の変異導入用オリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）の５’末端側にクラスＩＩＳの制限酵素の認識部位を付加し、ＰＣＲで鎖の合成を行い、その後、クラスＩＩＳの制限酵素で変異が導入されたＤＮＡを消化し、ライゲーションした後、宿主大腸菌に形質転換することで変異が導入されたＤＮＡを得ることができる方法が知られている（ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５１２，４６３）。
前記のように、従来のＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いる方法では、これら酵素反応や、変異部位を固定するために複数回の形質転換などの操作が必要であり、このために時間を費やし、効率を上げることが困難であった。また、アンバー変異、ｄｕｔとｕｎｇ変異を利用したものでは、一本鎖のＤＮＡを単離しなくてはならず、制限酵素部位を除去する方法についても、利用できる制限酵素が限られているなどの問題点があった。
このため、近年広く普及したＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入方法が開発、利用されてきているがこれも変異導入用プライマーを含む３種類以上のプライマーが必要であったり、変異導入用プライマーを２種類以上用い、さらに操作途中段階での制限酵素反応が必要であることなど操作が煩雑であった。また、この制限酵素反応が不完全であると極端に変異効率が低下してしまうものであった、等種々の問題を有するものであった。
従って、本発明の目的は、ＰＣＲ法を用いたより簡便かつ実用的な部位特異的変異導入方法及びその部位特異的変異導入方法を行うためのキットを提供することにある。
本発明者らは、高い効率でかつ簡便な部位特異的変異導入方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＣＲを行った後に１回の大腸菌への形質転換だけで目的の変異が導入されたクローンを得ることに成功した。本発明はかかる事実に基づいて完成するにいたったものである。
発明の開示
即ち、本発明の要旨は、
（１） 部位特異的変異導入方法において、
〔Ａ〕部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した、１個以上のアンバーコドンを有する二本鎖ＤＮＡベクターを得る工程、
〔Ｂ〕工程〔Ａ〕で得られたベクターと変異させる遺伝子の目的の位置に変異を導入する変異導入用プライマーと、該プライマーの反対側のストランドに配置され、アンバーコドンを復帰させるためのアンバーコドン復帰用プライマーとを用いＰＣＲを行う工程、及び
〔Ｃ〕工程〔Ｂ〕で得られたＰＣＲ産物をサプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主に導入し、目的の変異を有するクローンを選択する工程、
を含むことを特徴とする部位特異的変異導入方法、
（２） ベクターが１個以上のアンバーコドンを含む薬剤耐性遺伝子を有することを特徴とする前記（１）記載の部位特異的変異導入方法、
（３） サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主が大腸菌であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の部位特異的変異導入方法、
（４） 前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の部位特異的変異導入方法を用いるためのキットであって、
(I) アンバーコドン復帰用プライマー、
(II)アンバーコドンを有するベクター、
(III) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
(IV)ＰＣＲを行うための反応液、
を含有することを特徴とする部位特異的変異導入用キット、
（５） サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主をさらに含有することを特徴とする前記（４）記載の部位特異的変異導入用キット、並びに
（６） サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主が大腸菌であることを特徴とする前記（５）記載の部位特異的変異導入用キット、に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＫＦ１９ｋの構造を示す概略図である。
第２図は、プラスミドｐＫＦ１９ｋＭの構造を示す概略図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を１個以上のアンバーコドンを有する二本鎖ＤＮＡベクターに挿入し、この二本鎖ＤＮＡベクターと、少なくとも２種類の選択プライマーを用いてＰＣＲを行うことに特徴を有する部位特異的変異導入方法である。本発明において用いる選択プライマーとしては、変異させる遺伝子の目的の位置に変異を導入する変異導入用プライマーと、該プライマーの反対側のストランドに配置され、アンバーコドンを復帰させるためのアンバーコドン復帰用プライマーの少なくとも２種類を用いることができる。ここで、少なくとも２種類とは、変異導入用プライマーとアンバーコドン復帰用プライマーが挙げられ、これら２種類の選択プライマーを有するものであれば本発明で言う少なくとも２種類の選択プライマーに含まれる。
本発明に使用する１個以上のアンバーコドンを有する二本鎖ＤＮＡベクターとしては、１個以上のアンバーコドンを有するベクターであれば、特に限定されることはなく、本発明の部位特異的変異導入方法に使用することができる。この場合、薬剤耐性遺伝子上にアンバーコドンを有するベクターを用いることが好ましい。薬剤耐性遺伝子としては特に限定されないが、例えば、カナマイシン耐性遺伝子やクロラムフェニコール耐性遺伝子等が好ましい。即ち、カナマイシンやクロラムフェニコール等の薬剤耐性遺伝子上に１個以上のアンバーコドンを有するベクターが好適に使用することができ、例えばｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）を用いることができる。また、アンバーコドンを有するカセットを作製し、ベクターに導入しても構わない。このようなベクターを用いることで、ＰＣＲ産物をサプレッサーフリーの大腸菌などの宿主に導入し、例えばカナマイシンやクロラムフェニコール等の薬剤を含む寒天培地上で生育させるだけで薬剤耐性遺伝子上のアンバーコドンが復帰していることが容易に確認できる。
本発明の部位特異的変異導入方法で導入できる変異の種類は、特に限定されないが、例えば塩基の置換、欠失、挿入等の変異が挙げられる。変異の大きさは特に限定されるものではないが、変異の大きさにより、変異導入用プライマーの長さを変えることが好ましい。例えば、変異の大きさが１〜３塩基程度のものであれば、変異導入用プライマーの長さは２０塩基前後が好ましく、変異の大きさが４塩基以上の場合は、目的の変異の位置の５’側、及び３’側それぞれ１５塩基対前後を含む約３０塩基の長い変異導入用プライマーを用いるのが好ましい。また、変異導入用プライマーの３’末端はポリメラーゼ反応の始点となる点からＧまたはＣであることが望ましい。これらの条件を考慮して、変異導入用プライマーを作製する。該プライマーを用い、ＰＣＲによって目的の断片が確実に増幅されることを電気泳動等で確認し、該プライマーの設計及び純度を検定することも可能である。また、本発明では変異導入用プライマーの数は１種類で目的とする変異を導入することができるが、同一箇所に異なる変異を導入する場合、目的に応じて変異導入用プライマーを設定し、これらを混合して用いることにより、１回の操作で目的とするそれぞれの変異が導入されたものを得ることができる。例えば、１箇所の塩基をＧからＡ、Ｔ、Ｃのそれぞれに変異させる塩基置換部位特異的変異導入を行う場合、３種類の変異導入用プライマーをそれぞれ作製し、これらを混合して用いることにより１回の操作でＧからＡ、Ｔ、Ｃにそれぞれ変異が導入されたものを得ることができる。
また、アンバーコドン復帰用プライマーとしては、アンバーコドン部分を野生型等に復帰させるようなプライマーであればよく、特に限定されるものではない。例えば、アンバーコドンがＴＡＧの場合、このＴＡＧがＴＣＧやＣＴＧになるようにプライマーを作製することにより、アンバーコドンを復帰することができる。アンバーコドン復帰用プライマーは、アンバーコドンの数やＰＣＲの効率等により、長さを変えることが好ましい。アンバーコドン復帰用プライマーの長さとしては、特に限定されるものではないが、２０塩基前後から約３０塩基の長さが好ましい。また、アンバーコドンの３’末端は変異導入用プライマーと同様に、ポリメラーゼ反応の始点となる点からＧまたはＣであることが望ましい。該プライマーを用い、ＰＣＲによって目的の断片が確実に増幅されることを電気泳動等で確認し、該プライマーの設計及び純度を検定することも可能である。また、アンバーコドン復帰用プライマーの数は、１種類を用いることがよく、アンバーコドンが２個以上ある場合は、それらアンバーコドンを１種類のプライマーで復帰させるようにアンバーコドン復帰用プライマーを作製することが好ましい。
変異導入用プライマー及びアンバーコドン復帰用プライマーのＰＣＲ時の濃度は、特に限定されるものではないが、プライマーの濃度が低過ぎると増幅量が少なくなり、高過ぎると非特異的な反応が助長し、結果的に特異的な増幅反応が起こりにくくなる場合があるので、それぞれの反応至適濃度を検討することが望ましい。通常、それぞれのプライマーの最終濃度が０．１〜１．０μＭの範囲でＰＣＲを行うことが好ましい。
本明細書で言うサプレッサーフリーの宿主としては、好適には大腸菌が挙げられ、例えばイー コリ（Escherichia coli）ＭＶ１１８４（宝酒造社製）を用いることができるが、これに限定されるものではなく、サプレッション能力を欠く宿主であればいかなるものでも使用することができ、本明細書で言うサプレッサーフリーの宿主に含まれる。
本発明の方法による部位特異的変異導入は、例えば以下の工程によって行うことができる。
（１） １個以上のアンバーコドンを有する２本鎖ＤＮＡベクターに標的となるＤＮＡを挿入する。
（２） （１）で作製したＤＮＡ挿入ベクター、変異させる遺伝子の目的の位置に変異を導入する変異導入用プライマーと、該プライマーの反対側のストランドに配置され、アンバーコドンを復帰させるためのアンバーコドン復帰用プライマーとを混合しＰＣＲを行う。
（３） このＰＣＲ産物をサプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主に導入し、目的の変異を有するクローンを選択する。
上記の工程を行うことにより、目的の位置に変異が導入された遺伝子を効率よく得ることができる。
本発明はＰＣＲによって増幅したＰＣＲ産物自体が一種の長鎖プライマーとなり、その過程において全長のＤＮＡが合成されやすくなる。また、宿主として大腸菌内（in vivo）にそのまま導入すると環状になる。また、目的の位置に変異が導入された遺伝子を含有するクローンを選択する場合、サプレッション系を利用した方法を用いることでより簡便化される。つまり上記ＰＣＲ産物を例えば、宿主としてサプレッサーフリーの大腸菌に導入し、該大腸菌を前記の薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で培養することによりその生育を確認するだけでアンバーコドンの復帰を確認できる。つまりアンバーコドンが復帰したクローンのみを選択できるため、生育した株には目的の位置に変異が導入された遺伝子が組込まれているクローンである確率が高くなる。
本発明の方法では、変異させたい遺伝子のどの位置でも変異の導入が可能である。
本発明の方法でＰＣＲを行う際、通常の方法を用いることができるが、ＰＣＲによる塩基の誤った取込み、また３’末端へのアデニン（Ａ）の付加等を避けるために以下の工夫を行なうことが好ましい。
（Ｉ） ベクターへ挿入する変異させる遺伝子は２ｋｂｐ以下の短いものが好ましい。
（II） ＰＣＲのサイクル数は２０〜３０サイクルが好ましい。
（III） ＰＣＲに用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、高い増幅効率と低いエラー率を持ったものを用いることが好ましい。例えば、ＰＣＲに用いるキットとしては、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いることができ、また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いることで高い増幅率と低いエラー率でＰＣＲを行うことが可能である。
ここで、ＰＣＲ産物を大腸菌などの宿主に形質転換する方法は、塩化カルシウム法〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）、第１６６巻、第５５７〜５８０頁（１９８３）〕及びエレクトロポレーション法〔ヌクレイック アシドズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第１６巻、第６１２７〜６１４５頁（１９８８）〕等が挙げられる。得られた形質転換体のスクリーニングは、前記のように薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で培養してその生育を確認することにより、アンバーコドンが復帰した、換言すれば目的の位置に変異が導入された確率の高い遺伝子が組込まれているクローンを選択することができる。
本発明により、アンバーコドンを用いた簡便は部位特異的変異導入方法が可能となったことにより、アンバーコドン以外の終止コドンであるオーカーコドン又はオパールコドンについても、本発明のアンバーコドンの代わりに利用可能であることは当業者にとって明らかである。従って、本発明のアンバーコドンの代わりに、これらオーカーコドン又はオパールコドンを用いた部位特異的変異導入方法は、当然、本発明に包含される。
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
１塩基置換部位特異的変異導入
１．ｐＫＦ１９ｋＭの構築
以下の実施例に用いるプラスミドとして、２個のアンバーコドンを含むカナマイシン耐性遺伝子を有するｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製、第１図）中のｌａｃＺ’遺伝子内のマルチクローニングサイトから下流３０番目のＧをＡに変換したｐＫＦ１９ｋＭ（第２図）を構築した。
ｌａｃＺ’遺伝子は、１ａｃＺ△Ｍ１５の遺伝子型をもつ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダーゼの活性を生じる。したがって塩基置換のされていないｌａｃＺ’遺伝子ではイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、宝酒造社製）存在下で、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａ１、宝酒造社製）を基質とした反応により生育コロニーは青くなる。逆に塩基置換された変異型ｌａｃＺ’遺伝子では本来の活性を生じることができず、生育コロニーは白くなる。
このことを利用してｐＫＦ１９ｋＭ中の変異型ｌａｃＺ’遺伝子の塩基置換を部位特異的変異導入によって活性型遺伝子に復帰させたときの効率を青コロニー、白コロニーの数から算出した。
２．変異導入用オリゴヌクレオチド（変異導入用プライマー）及びカナマイシン耐性遺伝子内のダブルアンバーコドンを復帰させるオリゴヌクレオチド（アンバーコドン復帰用プライマー）の合成
変異型ｌａｃＺ’遺伝子内の塩基置換部位を復帰させる（ＡをＧに戻す）ための変異導入用オリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号：１に示される５’末端リン酸化オリゴヌクレオチド（ｍｕｔ１）を合成した。すなわちｍｕｔ１は１０番目のＣによって塩基置換が復帰し活性型のｌａｃＺ’遺伝子になるようにデザインした。
また、カナマイシン耐性遺伝子内のダブルアンバーコドン（２個のアンバーコドン）を復帰させるプライマー（ＫＱ２）として、配列表の配列番号：２に示す５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわちｐＫＦ１９ｋＭでは、ＫＱ２の３番目から５番目のＴＴＧ及び９番目から１１番目のＣＴＧにより、アンバーコドン（ＴＡＧ）が復帰するようにデザインした。
３．ＰＣＲ
反応液の組成を表１に示す。ＰＣＲはサーマルサイクラー（宝酒造社製）を用いて行ない、反応液を脱塩、濃縮するためにエタノール沈殿を行なって、５μｌの滅菌水に懸濁した。
４．形質転換
エタノール沈殿後のＰＣＲ産物の２μｌを用いて、サプレッサーフリーの大腸菌ＭＶ１１８４（宝酒造社製）をエレクトロポレーション法により形質転換した。その後、形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）及びＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）を含んだＬＢ〔バクトトリプトン（１０ｇ）、バクトイースト エクストラクト（５ｇ）、ＮａＣｌ（５ｇ）、蒸留水（１リットル）、ｐＨ（７．０）〕寒天培地上にまき、得られた部位特異的変異のクローンの効率を計算した。なお変異型ｌａｃＺ’遺伝子内の変異部分が活性型ｌａｃＺ’遺伝子に復帰するとコロニーは青く、しないとコロニーは白くなる。結果を表２に示す。
５．部位特異的変異の部位の解析
実施例１の４で得られた青コロニー４つについて、プラスミドＤＮＡをアルカリリシス（Alkali lysis）法で調製した。該プラスミドＤＮＡの塩基配列をジデオキシ法を用いて決定し、変異部位を解析したところ、すべてのものについてｌａｃＺ’遺伝子内のマルチクローニングサイトの下流３０番目においてＡから復帰したＧが観察され、部位特異的変異が導入されたことが明らかとなった。
実施例２
３塩基及び６塩基欠失部位特異的変異導入
３塩基及び６塩基を欠失させるために、野生型のｌａｃＺ’遺伝子と２個のアンバーコドンをもつカナマイシン耐性遺伝子とを含むｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製、第１図）を用いた。
１．変異導入用オリゴヌクレオチドの合成
ｐＫＦ１９ｋのマルチクローニングサイト内のBamHI及びBamHI-EcoRIサイトがそれぞれ３塩基及び６塩基の欠失によって失われるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。３塩基欠失に用いるオリゴヌクレオチド（ｄｅｌ１）は配列表の配列番号：３に、６塩基欠失に用いるオリゴヌクレオチド（ｄｅｌ２）は配列表の配列番号：４に示す。すなわちｄｅｌ１は、配列表の配列番号：３中の１２番目のＧと１３番目のＣ、ｄｅｌ２は、配列表の配列番号：４中の１２番目のＧと１３番目のＴの間で塩基が欠失するようにデザインされた。
２．ＰＣＲ及び形質転換
実施例２の１で作製したプライマーｄｅｌ１及びｄｅｌ２と実施例１で用いたＫＱ２プライマーとをそれぞれ用いて、表１の組成（表中ｐＫＦ１９ｋＭの代わりにｐＫＦ１９ｋを使用）により９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、１０株ずつを選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様に調製した。それらを制限酵素BamHIで消化することにより変異の確認を行った。つまり、変異が導入されたプラスミドは消化されないことになる。
その結果を表３に示す。
実施例３
６０塩基欠失部位特異的変異導入
１．変異導入用オリゴヌクレオチドの合成
ｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）のマルチクローニングサイト全体（６０塩基）が欠失によって失われるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド（ｄｅｌ３）を配列表の配列番号：５に示す。すなわちｄｅｌ３は、配列表の配列番号：５中の１０番目のＴと１１番目のＧの間でマルチクローニングサイト全体（６０塩基）が欠失するようにデザインされた。
２．ＰＣＲ及び形質転換
実施例３の１で作製したプライマーｄｅｌ３と実施例１で用いたＫＱ２プライマーとを用いて、表１の組成（表中ｐＫＦ１９Ｍの代わりにｐＫＦ１９ｋを使用）により９４℃で３０秒、５０℃で２分、７２℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、２０株を選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様にして調製した。それらを制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することにより変異の確認を行った。つまり変異の導入されたプラスミドはマルチクローニングサイトを失っているため、これらの酵素で消化されないことになる。その結果を表４に示す。
これにより比較的長い領域の塩基の欠失も容易に行えることが明らかになった。
実施例４
欠失挿入部位特異的変異
１．変異導入用オリゴヌクレオチドの合成
ｐＫＦ１９ｋのマルチクローニングサイト内のEcoRIサイトから下流１００塩基のところにもう一つEcoRIサイトが導入されるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド（ｅｃｏ１）を配列表の配列番号：６に示す。すなわちｅｃｏ１は、配列表の配列番号：６中の９番目のＧから１４番目のＣの塩基で、この塩基の位置に相当する元の配列のAATを欠失させ、EcoRIサイトであるGAATTCを挿入するようにデザインされている。
２．ＰＣＲ及び形質転換
実施例４の１で作製したプライマーｅｃｏ１と実施例１で用いたＫＱ２プライマーを用いて、表１の組成（表中ｐＫＦ１９Ｍの代わりにｐＫＦ１９ｋを使用）により９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で２分の条件で２４サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、１２株を選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様にして調製した。それらを制限酵素EcoRIで消化し、１００塩基のＤＮＡ断片が電気泳動で確認されることにより変異の確認を行った。つまり変異の導入されたプラスミドはEcoRIサイトを１００塩基の間隔で二つもつことになり、制限酵素EcoRI消化により１００塩基の断片を確認することができる。その結果を表５に示す。
実施例５
ｐＫＦ１９ｋに連結したＤＮＡ断片への変異導入
１．ｐＫＦ１９ｋへの大腸菌系プラスミドベクターｐＢＲ３２２の連結
ｐＫＦ１９ｋを制限酵素BamHIで消化し、このBamHIサイトに大腸菌系の４３６１塩基の長さをもつプラスミドｐＢＲ３２２［宝酒造社製、ジーン（Gene）、第２２巻、第２７７〜２８０頁（１９８３）］を組込んだベクターを作製し、これをｐＫＢ１０１と命名した。これによって挿入断片への部位特異的変異導入を試みた。
２．変異導入オリゴヌクレオチドの合成
ｐＢＲ３２２のBamHIサイト下流の４００塩基のところにもう一つBamHIサイトが導入されるように５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド（ｂａｍ１）を配列表の配列番号：７に示す。すなわちｂａｍ１は、配列表の配列番号：７中の１６番目のＧから２１番目のＣで、元の配列であるAGCGCTをBamHIサイトであるGGATCCに置換するようにデザインされている。
３．ＰＣＲ及び形質転換
実施例５の２で作製したプライマーｂａｍ１と実施例１で使用したＫＱ２プライマーを用いて表１の組成（表中ｐＫＦ１９Ｍの代わりにｐＭＢ１０１を使用）により９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６分の条件で２５サイクルのＰＣＲを行い、実施例１と同様にしてエタノール沈殿後、ＰＣＲ産物を５μｌの滅菌水に懸濁し、そのうちの２μｌで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ寒天培地上にまき、生育したコロニーより、６株を選び、プラスミドＤＮＡを実施例１の５と同様にして調製した。それらを制限酵素BamHIで消化し、４００塩基のＤＮＡ断片が電気泳動で確認されることにより変異の確認を行った。つまり変異の導入されたプラスミドはBamHIサイトを４００塩基の間隔で二つもつことになり、制限酵素BamHI消化により４００塩基の断片を確認することができる。その結果を表６に示す。
実施例６
部位特異的変異用キットの作成
宿主大腸菌、コントロール用のベクター及びオリゴヌクレオチドをセットにして部位特異的変異導入用キット（２０回分）を構築した（表７）。
また、ＰＣＲを行うための反応液、ｄＮＴＰ混合液、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをセットした部位特異的変異導入用キット（２０回分）を構築した（表８）。
本発明により、遺伝子工学やタンパク質工学で有用な、より簡便でかつ迅速な部位特異的変異導入方法及びキットが提供される。本発明の方法およびキットを用いることにより、ＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を、宿主に形質転換するだけで、効率よく目的の位置に変異が導入された遺伝子を取得することが可能である。
配列表
配列番号：1
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
Claims (6)
- 部位特異的変異導入方法において、
〔Ａ〕部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した、１個以上のアンバーコドンを有する二本鎖ＤＮＡベクターを得る工程、
〔Ｂ〕工程〔Ａ〕で得られたベクターと変異させる遺伝子の目的の位置に変異を導入する変異導入用プライマーと、該プライマーの反対側のストランドに配置され、アンバーコドンを復帰させるためのアンバーコドン復帰用プライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、及び
〔Ｃ〕工程〔Ｂ〕で得られたＰＣＲ産物をサプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主に導入し、目的の変異を有するクローンを選択する工程、
を含むことを特徴とする、ＰＣＲ後に１回の形質転換を行う部位特異的変異導入方法。 - ベクターが１個以上のアンバーコドンを含む薬剤耐性遺伝子を有することを特徴とする請求項１記載の部位特異的変異導入方法。
- サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主が大腸菌であることを特徴とする、請求項１又は２記載の部位特異的変異導入方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の部位特異的変異導入方法を用いるためのキットであって、
（Ｉ）アンバーコドン復帰用プライマー、
（ＩＩ）アンバーコドンを有するベクター、
（ＩＩＩ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ＩＶ）ＰＣＲを行うための反応液、
を含有することを特徴とする部位特異的変異導入用キット。 - サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主をさらに含有することを特徴とする請求項４記載の部位特異的変異導入用キット。
- サプレッサーフリー（Ｓｕｐ0）の宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項５記載の部位特異的変異導入用キット。
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