CN1253568C - 具有生物安全性的植物基因工程操作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有生物安全性的无载体、无选择标记基因的基因工程操作方法，可以解决在常规植物基因工程操作中，由载体骨架序列和选择标记基因所引起的转基因植物在环境和食品两个方面的安全性问题。本发明的技术要点是，构建由外源基因和调控序列，以及两侧的边界序列共同组成的基因转化元件，再通过花粉管通道等途径进行基因转化操作，并根据基因转化元件中外源基因的表达和边界序列插入植物基因组后引起转化植株性状的变化进行检测。本发明解决了常规转化方法中由于使用来源于微生物等其它非近缘物种载体，以及采用抗抗生素类药物基因或抗除草剂类基因作为选择标记基因所带来的安全性问题。

Description

具有生物安全性的植物基因工程操作方法
【技术领域】
本发明涉及一种具有生物安全性的无载体、无选择标记基因的基因工程技术方法，属于生物工程领域。
【技术背景】
植物基因工程是指采用重组体DNA技术克隆外源基因并导入植物中，通过基因表达使植物获得新的性状，培育植物新品种。这一技术克服了植物有性杂交的限制，基因交流的范围无限扩大，可将从细菌、病毒、动物、人类、远缘植物甚至人工合成的基因导入植物，所以其应用前景十分广阔。
1983年，世界首例转基因植物培育成功，标志着人类应用转基因技术改良农作物的开始。1986年，转基因农作物获得批准进入田间试验。1994年，美国Calgene公司培育的延熟保鲜的转基因番茄被批准商品化生产。近年来，全球范围内转基因农作物的种植面积呈逐年大幅度增长的趋势，1996年全世界转基因农作物的种植面积仅为170万公顷，2000年达到4,420万公顷，增长了25倍。其中，美国、加拿大、阿根廷三个国家的转基因植物的种植面积占其中的99％。转基因作物产品的市场销售额从1995年的0.75亿美元增长到1999年的22亿美元左右，五年间增长约30倍。据不完全统计，转基因研究至少在35科120种植物中获得了成功，所涉及到的性状包括抗虫、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗除草剂、抗逆境、品质改良，以及对生长发育的调控以提高产量潜力等。
根据“经济合作与发展组织”(OECD)的统计，从1986年到2000年的15年间，OECD国家共批准10,313例转基因生物进入田间试验，其中转基因植物占总数的98.4％，涉及的植物种类有40多种。在全部被批准的10,313例田间试验中，美国占71.1％，种植面积在100万公顷以上的有大豆、玉米、棉花和油菜，主要为抗除草剂基因和抗虫基因。尤其需要指出的是，美国1999年种植转基因大豆面积为1,500万公顷，占全国大豆种植面积的50％；转基因玉米的种植面积为1,030万公顷，占全国玉米种植面积的33％。目前，美国超过60％的加工食品中含有转基因成分，转基因食品的销售额高达百亿美元。
中国现有6种转基因植物被批准进入商品化生产，包括耐储藏番茄(1997)、抗虫棉(1997)、观赏植物矮牵牛(1997)、抗病毒甜椒(1998)、抗病毒番茄(1998)，以及美国孟三都公司培育的抗虫棉(1997)。其中种植面积最大的是抗虫棉，到2000年底止，国产抗虫棉的累计推广面积达37万公顷，减少农药用量达80％，创造效益7.7亿元人民币。
转基因植物的产业化，尤其是转基因农作物的产业化，由于能够提高产量、减少除草剂和杀虫剂等农药的使用量以及节约大量劳力，为人类带来了巨大的经济效益和社会效益。据联合国估计，全球有八亿五千六百万人口遭受饥饿的折磨。转基因技术能够培育出高产、优质的农作物新品种，从而使这一状况得到根本缓解。另外，利用转基因技术培育出抗病、抗虫的农作物新品，可以解决由于长期过量使用农药和化肥所带来的难以治理的环境危害。
植物转基因技术在显示出极为广阔的应用前景的同时，也引发了转基因植物包括环境和食品两个方面的安全性问题。环境安全性评价的核心问题是转基因植物释放到田间后，是否会将所转基因移到野生植物中，是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡，包括：(1)转基因植物演变成农田杂草的可能性。(2)基因漂流到近缘野生种的可能性。(3)对生物类群的影响。关于食品的安全性主要涉及到：(1)有毒物质。必须确保转入的外源基因或基因产物对人畜无害。(2)过敏源。在自然条件下存在着许多过敏源，在基因工程操作中如果将控制过敏源形成的基因转入目标植物，则会产生不利的影响。
引发安全性问题的根源在于：(1)目前的植物基因转化系统中，所导入的外源基因和所使用的载体元件通常来源于非近缘物种，甚至为人工合成，可能成为人类新的过敏源；(2)采用抗抗生素类药物基因或抗除草剂类药物基因作为选择标记基因用于转化体的筛选，可能造成对生态环境的潜在危害。
导入外源基因所编码的蛋白在下列情况可能产生过敏性：(1)所转基因编码已知的过敏蛋白；(2)基因源含有过敏蛋白；(3)导入基因编码的蛋白与已知过敏蛋白的氨基酸序列在免疫学上有明显的同源性；(4)导入基因编码的蛋白属某类蛋白的成员，而这类蛋白家族中的某些成员是过敏蛋白。
由标记基因引发的安全性问题主要取决于：(1)标记基因有无直接毒性；(2)基因的水平转移(Horizontal Transfer)；(3)未预料的基因多效性；(4)标记基因编码蛋白的安全性，包括直接毒性、过敏性、因蛋白的催化功能而产生的副作用等。由标记基因带来的安全性问题主要包括：(1)编码除草剂的基因是否会通过基因逃逸渠道使转基因植物的近源野生种转变成杂草，破坏自然生态环境，打破生物种群动态平衡；(2)转基因植物是否会对土壤产生影响；(3)抗生素编码基因的水平转移是否会导致微生物和某些害虫的抗药性等。
载体骨架序列整合到植物基因组中所导致的安全性问题目前尚不清楚。虽然这些序列在转基因植物中没有任何价值，但却有可能产生有负面作用的蛋白质，或者影响植物正常基因的表达和促进转基因的重排等。另外，这些序列也有可能会逃逸到环境中，对生态环境造成潜在的负面影响。
近年来，有关转基因生物安全性的争论主要有：
Pusztai事件1998年，英国研究人员Pusztai的研究表明，幼鼠食用转基因马铃薯后，导致其内脏和免疫系统损坏，体重减轻，从此引发了国际上对转基因作物安全性的争论。
帝王蝶事件1999年，美国康奈尔大学Losey等报道，用涂有转Bt基因抗虫玉米花粉的马利筋草叶片喂养帝王蝶(Monarch butterfly)，导致幼虫发育不良，死亡率显著提高。在美国衣阿华州进行的野外实验也获得了同样的结果。
丹麦科学家的研究表明，把抗除草剂的转基因油菜与杂草一起培养，产生了抗除草剂的杂草，预示着通过转基因技术产生的基因可以扩散到自然界中。美国亚利桑那大学的研究结果指出，已经发现一些昆虫，吃了抗虫的转基因农作物后并不死亡，具备了一定的抵抗力。
有关研究还发现，Bt基因的农作物产生的具有杀虫功能的毒素(Bt)可由根部渗入周围的土壤，并可保持很强的活性，仍能杀虫，有可能使一些害虫产生抗药性，对环境生态产生长远的负面影响。
目前，对上述转基因植物安全性问题的解决方案是对转基因植物进行安全性评价，主要包括表型性状(形态、产量等农艺性状)、关键营养成分(脂肪、蛋白质、碳水化合物或微量营养成分)及抗营养因子、有无毒性物质及有无过敏性蛋白等，主要针对导入外源基因编码的蛋白质的特性研究，并不能有效地解决由基因转化系统，尤其是由选择标记基因带来的安全性问题。
为了从根本上解决转基因植物可能引起的食用安全性和环境安全性问题，人们已经在建立无载体转化系统或无选择标记基因转化系统方面进行了尝试，如位点特异性重组(Site Specific Recombination)、转座子介导的再定位(Intra-genomic Relocation of Transgenes Viatransposable Elements)、共转化(Co-transformation)、选择标记基因的组织特异性表达(Tissue SpecificExpression of Selectable Marker Genes)、靶基因替换(Targeted GeneReplacement)、同源重组(Homologous Recombination)等。上述各种植物基因工程操作方法尽管已经取得了一些进展，但在彻底去除选择标记基因和载体骨架序列、建立可应用的植物遗传转化技术上等方面还存在许多有待于解决的技术问题。因此，寻找一种仅将外源的目的基因及表达调控序列转入植物的途径并建立成熟的植物基因工程操作方法，从根本上解决植物转基因安全性存在的问题，将具有十分广泛的应用前景。
【发明内容】
本发明提供了一种具有生物安全性的无载体、无选择标记基因的植物基因工程操作方法。本发明采用的方法能够解决常规植物基因工程操作中由载体骨架序列和选择标记基因所引起的转基因植物安全性问题。
本发明提供的植物基因工程操作方法，其要点是构建由外源基因和调控序列，以及两侧的边界序列共同组成的基因转化元件，再通过花粉管通道等途径进行基因转化操作，并根据基因转化元件中外源基因的表达和边界序列插入植物基因组后引起转化植株性状的变化，在DNA水平、蛋白质水平和形态性状水平进行检测，以鉴别转化植株。
本发明提供的供转化的基因转化元件是一段线性的脱氧核糖核苷酸序列，包括编码某一功能蛋白的结构基因和植物基因的表达调控序列，以及位于表达调控序列两侧的边界序列。
本发明提供的基因转化元件中的边界序列，可以是T-DNA的边界序列或转座子的全部(或部分)DNA序列。采用T-DNA的边界序列构建的基因转化元件进行植物转化时，转化率为10-1-10-2。
本发明也可以将所转化的植物基因组中某一编码区的全部(或部分)DNA序列作为边界序列，或将某一编码区的调控序列作为边界序列，还可以将所转化的植物基因组中某一非编码区的DNA序列作为边界序列。采用植物基因组中某一编码区、或将某一编码区的调控序列、或非编码区DNA序列作为基因转化元件中的边界序列是外源基因与受体DNA同源重组的基础，这类边界序列的主要功能是在基因转化过程中有助于基因转化元件可以定向或非定向地整合到植物基因组中，由其构建成的基因转化元件的转化率为10-3-10-4。
本发明提供的将所转化的植物基因组中作为边界序列的某一编码区DNA序列，可以是编码决定植物某一形态性状的结构基因，其改变可引起植物在育性、叶片是否有毛、叶片颜色、植株矮化等形态性状发生变化。本发明提供的将所转化的植物基因组中作为边界序列的某一编码区DNA边界序列，也可以是编码决定植物体内某一生理、生化性状的结构基因，如编码调控植物体内某一代谢环节的酶或蛋白质基因的改变，可以引起植物某一氨基酸或其它代谢产物发生变化。选择所转化的植物基因组中某一编码区的DNA序列作为边界序列，在转化过程中可以通过同源重组方式使基因转化元件定向地插入到植物基因组中，导致编码决定植物某一性状基因的失活，该基因的失活通常不会明显地影响植物的正常生长。植物转化后代基因组中，由于基因转化元件的插入将导致某一形态性状或生理、生化性状的改变，本发明据此建立相应的检测方法以便有效地鉴别外源基因是否转化到植株中。
本发明提供的将所转化的植物基因组中某一结构基因的调控序列作为边界序列，包括启动子区域(及部分结构基因序列)和3’端调控区域(及部分结构基因序列)。在转化过程中可以通过同源重组方式使基因转化元件替换掉该结构基因，使外源基因特异性表达。
本发明提供的将所转化的植物基因组中作为边界序列的某一非编码DNA序列，可以是真核生物染色质中可以与核基质结合的核基质结合区(MatrixAttachment Region，MAR)DNA序列。MAR序列有助于提高外源基因的整体表达水平，并增强外源基因表达的稳定性。也可以是在真核生物基因组中的中度或高度重复序列，如18S rRNA序列等。
本发明提供的编码某一功能蛋白的结构基因，包括来源于无花果曲霉(A.ficuum As3.324)的植酸酶(phytase)基因，以及来源于盐生植物辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis kitag)的可提高转化植株甜菜碱含量，从而提高其耐盐碱和耐旱能力的胆碱单加氧酶(choline monooxygenase，CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydro-genase，BADH)基因等。
本发明使用的位于结构基因两侧的植物基因表达调控序列包括启动子、转录终止子、增强子等。
本发明主要采用花粉管通道法转化植物，即将裸露的线形的外源的基因转化元件通过花粉管通道进入胚囊，直接转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞，不需经过原生质体培养、细胞培养、组织培养以及再生植株等遗传转化过程。本发明还可以采用种子浸泡法和胚囊注射法转化植物。
本发明采用花粉管通道等方法将构建的基因转化元件导入植物体内，获得的是转化的植物种子。由于转化的种子和未转化的种子混杂在一起，本发明根据所设计的边界序列和使用的外源基因，提供了DNA水平、蛋白质水平和形态性状水平三个层次的基因转化植株(种子)的检测策略。DNA水平的检测方法包括PCR、DNA序列测定、SOUTHERN杂交、NORTHERN杂交等；蛋白质水平的检测方法包括表达蛋白(或酶)的生理生化指标检测、氨基酸含量变化的测定、WESTERN杂交等；形态性状水平的检测包括对外观性状的观察和检出等。
利用本发明提供的植物基因操作方法所构建的基因转化元件，由外源基因、表达调控序列和边界序列组成，因此从根本上解决了常规转化方法中由于使用来源于微生物等其它非近缘物种载体，以及采用抗抗生素类药物基因或抗除草剂类基因作为选择标记基因所带来的安全性问题。本发明提供的位于表达调控序列两侧的边界序列是外源基因与受体植物基因组DNA重组的基础。应用花粉管通道方法可以实现该基因转化元件导入植物，方法简便有效，转化速度较快，一般当年即可获得转基因植株，并且可基本上应用于任何开花植物，进行任何物种之间包括人工合成的基因转移，不受植物基因型的限制，从而极大地扩大了基因工程目的基因的来源和受体植物的范围。
【具体实施方式】
以下是本发明提供的六个最佳实施例。
实施例1  含有T-DNA边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化玉米和大豆
(a)植酸酶基因phyI的获得
用马铃薯培养基30℃震荡培养无花果曲霉A.ficuum As3.324，24小时后收集菌体提取基因组DNA。以A.ficuum NRRL3135的phyA核苷酸序列作参考，设计两条PCR引物(F15’-AGGTGGGATGAAGGG GTTAT-3’，R15’-CAGCGGCCGCCTAAGCAAAACTCTCCGCCC-3’)，PCR扩增获得全长为1515bp的phyI结构基因(GenBank，AY013315)，+46-+156的11个核苷酸为内含子序列，其中含有真菌内含子的特征保守序列(Doner序列：GTATGC；Lariat序列：GCTGAC；Acceptor序列：CAG)。phyI共编码467个氨基酸，N端的19个氨基酸为信号肽。在phyI编码的氨基酸序列中存在10个潜在的糖基化位点，81-88位氨基酸为植酸酶的活性位点保守序列：RHGARYPT。
phyI基因序列如下：
1   gaggaccggc tggtccggtg caatggccat cgccatcaat tgctgctgtg caagaaattt
61  ctcctcatag gtatcatggg tgtctctgcc gttctacttc ctttgtacct cctgtccgga
121
Figure C0213283800121
181
Figure C0213283800122
241 ggactggcag tccccgcctc gagaaatcaa tccacttgcg atacggtcga tcaggggtat
301 caatgcttct cggagacttc gcatctttgg ggccaatacg cgccgttctt ttctctggca
361 aacaaatcgg ccatctcccc tgatgttcct gccggatgcc atgtcacttt cgcccaggtt
421 ctctc
Figure C0213283800123
gactccaagg gcaagaaata ctccgctctc
481 atcgaggaga tccagcagaa cgcgacaacc ttcgagggga aatatgcctt cctgaagaca
541 tacaactaca gcctgggcgc ggatgacctg actcccttcg gagagcagga gctggtcaac
601 tccggcgtca agttctacca gcgatacgaa tcgctcacaa gaaacattgt cccgttcatc
661 cgatcctcag gctccagccg cgtgattgcc tctggcaata aattcatcga gggcttccag
721 agcactaagc tgaaggatcc tcgtgcccag cccggccaat cgtcgcccaa gatcgacgtg
781 gtcatttcag aggccagcac atccaacaac actctcgatc cgggcacctg caccgttttc
 841 gaagatagcg aattggccga tgacatcgaa gccaatttca ccgccacgtt cgtcccctcc
 901 attcgtcaac gtctggagaa cgacttgtct ggcgtgtctc tcacggacac agaagtgacc
 961 tacctcatgg acatgtgctc cttcgacacc atctccacca gcaccgtcga caccaagctg
1021 tcccccttct gtgacctgtt cacccatgaa gaatggatca actacgacta cctccagtcc
1081 ctgaacaaat actacggcca tggcgcaggt aacccgctcg gcccgaccca gggcgtcggc
1141 tacgctaacg agctcatcgc ccgtctcacc cactcgcctg tccacgatga caccagctcc
1201 aaccacacat tggactccaa cccggctact ttcccgctca actccactct ctatgcggac
1261 ttttcgcatg ataacggcat catctctatc ctctttgctt tgggtctgta caacggcacc
1321 aagccgctgt cttccacgac cgcggagaat atcacccaga ccgatgggtt ctcatctgcc
1381 cggacggttc ctttcgcgtc gcgcatgtac gtcgagatga tgcaatgcca gtccgagcag
1441 gagcctttgg tccgtgtctt ggttaatgat cgtgttgttc cgctgcatgg ctgtccggtt
1501 gatgctttgg gaagatgtac gcgggatagc ttcgtgaagg ggttgagctt tgccagatct
1561 ggcggtgatt gggcggagtg ttttgcttag
注：ATG翻译起始密码子；TAG翻译终止密码子；
内含子序列
酶活性中心编码序列。
(b)基因转化元件TCPNT的构建
基因转化元件TCPNT结构为：
5’-T-DNA-CaMV35S-phyII-Nos-T-DNA-3’
具体策略如下：利用PCR方法获得去掉内含子的植酸酶基因phyII。克隆至植物表达载体pBI121中，构成pBI121/phyII重组质粒，用PCR方法扩增获得带有T-DNA边界序列的转化元件TCPNT。引物序列如下：
TR：5’- GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’
TF：5’- TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACTGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTT-3’
注：下划线为T-DNA边界序列。
PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR扩增TCPNT片段大小约2.7kb，经氯仿/异戊醇抽提，吸取上清，无水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，终浓度为300ng/ul，待用于转化。
(c)花粉管通道法转化玉米和大豆
种植玉米自交系137、K12和C8605-2，待生长至开花期做雌、雄花套袋隔离，雄花套袋隔离24小时后自花授粉。24小时后切除部分雌花柱头，将100ulTCPNT溶液滴于切口处，套袋。对照植株只转化0.1×SSC溶液(不含TCPNT)。成熟后收获种子。
选择大豆品种早熟91025-7、辽豆16和铁丰29，在大豆自花授粉后6-32小时(花冠高于花萼1mm左右)切除柱头，将5ulTCPNT溶液滴于切口处。如果气温较高，补滴一次。标记处理的花朵，并摘除该花所在果枝的顶心。成熟后收获种子。
(d)转化植株的检测
PCR检测  根据phyII基因序列设计引物：
F4：5’-CCAAGGGCAAGAAATACTCC-3’
R4：5’-GAGAGACACGCCAGACAAG-3’
以玉米幼叶基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得0.5kb的目的基因片段。检测137品系1019株，其中阳性植株132株；检测C8605-2品系960株，获得阳性植株94株。
以大豆幼叶基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得0.5kb的目的基因片段。检测早熟91025-7品种121株，其中阳性植株19株；检测辽豆16品种259株，其中阳性植株57株，检测铁丰29品种78株，其中阳性植株6株。
SOUTHERN BLOT分析  PCR检测阳性植株的玉米和大豆基因组DNA经EcoRI酶切，琼脂糖电泳，转膜。以R4和F4为引物，以pBI121/phyII质粒为模板进行PCR扩增获得约0.5KbDNA片段，用ECL试剂盒(amersham pharmaciabiotech)标记探针，进行SOUTHERN杂交。SOUTHERN杂交分析表明，转化的植酸酶基因已经整合到玉米和大豆的基因组上。
酶活性分析  取PCR检测阳性的玉米或大豆叶片及对照植株叶片于研钵中，加入适量的pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，研磨、离心，取上清液用于植酸酶活性测定。取0.1ml待测液(空白对照为0.1ml蒸馏水)，加0.9ml 1.25mM植酸钠溶液摇匀，37℃水浴保温反应15min后，立即加入1ml 10％TCA摇匀终止反应(对照样品为先加入1ml 10％TCA，然后37℃水浴保温反应15min)，加入2ml 0.5％对苯二酚溶液摇匀，用蒸馏水定容至20ml，静置30min后，在660nm处用分光光度计测定吸光值。酶活性计算公式如下：
Figure C0213283800151
U：酶活性单位(nmol/min.ml)
OD：测定样品660nm下的吸光度
ODO：对照样品660nm下的吸光度
N：样品的稀释倍数
31：磷的原子量
K：标准曲线斜率
T：酶作用时间
透明圈筛选  首先配制植酸钙溶液：3克醋酸钙溶于100毫升去离子水中，1克植酸溶于400毫升去离子水中。将醋酸钙溶液在不断搅拌下缓缓加入到植酸溶液中，将混合液加热至沸，并不断搅拌，混合液冷至室温后于4℃下过夜。用此植酸钙溶液中，按PDA培养基配方加入各种组分，151bf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min，倒平板备用。
选取8株玉米转基因幼苗，接种于植酸酶菌株筛选培养基上，30℃，倒置培养72小时。水解培养基中的不溶性植酸钙形成水解圈。8株被检幼苗中，5株有水解圈，证明植酸酶基因已获得表达。
(e)转基因植株遗传稳定性分析
对于子二代的玉米植株采用上述检测手段分析。实验数据表明外源植酸酶基因已在玉米基因组内稳定遗传，其它形态性状没有变化。
实施例2  含有核基质区(MAR)边界序列和胆碱单加氧酶(CMO)基因转化元件的构建及花粉管通道法转化水稻
(a)胆碱单加氧酶(choline monooxygenase，CMO)基因的获得
用RT-PCR和RACE技术获得盐生植物辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensiskitag)胆碱单加氧酶基因(CMO，GenBank，AF354442)cDNA全序列。CMOcDNA全长1820bp，5′端非编码区123bp，3′端非编码区368bp，含有2个可能的加polyA信号：AATAA、AATTAA，开放阅读框1329个核苷酸，编码442个氨基酸，其中含有成熟肽链起始区“AVA”，具备Rieske-type〔2Fe-S〕蛋白的保守Cys-His对“CTH”和“CPYH”，包括保守的多铁原子核结合域“DNYLD”和“HVPYAH”。
CMO基因序列如下：
   1 gcacaaactt gttagttgta taactctaca caacacaagc aagaagctaa gccaaaccaa
  61 gctaagctta aggaggaata acatttcatc atataatctt aatttaattt aaggtcttgt
 121 ttgatggctg catcagcaag tgctaccaca atgttgctaa aatacccaac tatttgtgga
 181 gtaccaaaca atgaatcttc atcttgttca ccaaaagata atcatctcaa tgtttctcaa
 241 caacaaaaca acaacaaccc tttactcaaa tttagaacac aaccaactaa actagttgcc
 301 aacgcagtcg cttcgccggt tttccctgct tcttcaacca caacatcatc accttcttct
 361 tcttccatca atcaacttgt tcatgaattt gatcctaaaa ttccacctga agatgctttt
 421 actcctccta gctcttggta tactgaacct gccttctact ctcatgaact tgaccgtatc
 481 ttttacaaag gatggcaagt tgcaggaata agtgaccaaa tcaaggagaa aaaccagtac
 541 ttcactggca ctttaggaaa tgttgaatat gtggtgagcc gagatggtga aggaaaagtt
 601 catgcatttc acaatgtttg cactcaccgt gcttctattc ttgcttgtgg aagtggcaaa
 661 aagtcctgct ttgtgtgccc ttaccatgga tgggtgtttg gcatggatgg agacctcaca
 721 aaagccaccc aaacaactga tgcacaaaca tttgatccta aagaatatgg cttaaaaccc
 781 ctaaaggttg cagtatgggg accattcgtt ctcatcagtt tggacaaaac tcttccggaa
 841 agtgatgttg gcactgagtg gcttggttct agtgccgaag atgttaaggc ccatgccttt
 901 gatccctctc tcaaattcat tcatagaagt gaattcccca tggaatgtaa ctggaaggtc
 961 tttagtgaca actacttgga tagctcatac catgttcctt acgcacacaa atactatgca
1021 actgaacttg actttgatac ttatgacact caaacaatcg gcaaagttgt gatccaaaga
1081 gttggaagca acacaaacag gcctgatggt ttcgatagac ttggagagaa agcattctat
1141 gcttttactt atcccaactt tgctgtggaa aggtatggcc cttggatgac aacaatgcat
1201 gttcagccaa tagctcaaag gaaatgcaaa ttagtggtgg actattacat tgaagactct
1261 ttgctggata acaaggatta Gatcgaaaaa ggaatagcaa tcaacgacaa cgtacagaaa
1321 gaagataagg tgttgtgtga aagtgtccaa aagggtctgg agacaccagc atatcgttct
1381 ggcagatatg tgatgccaat tgagaaagga atccaccatt tccactgctg gttgcaccaa
1441 attttgaagt gatttaattt gccctaagtt tcattgttcc atggatatta attataaaga
1501 gtcgaagtcg aattccgcat aattaaaact gttgtcaaac atatggtctt aatgtagtat
1561 tttttatgta tgttgtatgg tcataagcaa atgttttatt gcttgtgttc ttggaaaaca
1621 atttggtgct aatgtctatt ataaataaac accaccatag caccctctcc ccgaaaagaa
1681 tctcgaatat tcccaaagag gatgggaatc tgagattgtt gatgaatgat gaacatgtat
1741 tgagaactat gtatgatttt tcatcagtta tattatagaa tgaaagaaca atgtgtgttg
1801 attaaaaaaa aaaaaaaaaa
(b)基因转化元件MCCNM的构建
基因转化元件MCCNM结构为：
5’-MAR-CaMV35S-CMO-Nos-MAR-3’
具体策略如下：
利用PCR方法获得CMO基因的编码区，克隆到植物表达载体pBI121中，构成pBI121/CMO重组质粒，引物序列如下：
CF 5’-GGGGATCCAATTTAAGGTCTTGTTTGATGGCTG-3’
CR 5’-GGGAGCTCTCACTTCAAAATTTGGTGCAACC-3’
通过PCR方法从烟草基因组DNA中获得MAR序列(上游引物5’-CGATTAAAAATCCCAATTATATTTGG-3’，下游引物5’-CCCTTGAAGAAGACTTTTATCA-3’)，长度为1167bp。将两个MAR片段同向连接在pUC19载体上。
MAR序列如下：
  1 cgattaaaaa tcccaattat atttggtcta atttagtttg gtattgagta aaacaaattc
 61 gaaccaaacc aaaatataaa tatatagttt ttatatatat gcctttaaga ctttttatag
121 aattttcttt aaaaaatatc tagaaatatt tgcgactctt ctggcatgta atatttcgtt
181 aaatatgaag tgctccattt ttattaactt taaataattg gttgtacgat cactttctta
241 tcaagtgtta ctaaaatgcg tcaatctctt tgttcttcca tattcatatg tcaaaatcta
301 tcaaaattct tatatatctt tttcgaattt gaagtgaaat ttcgataatt taaaattaaa
361 tagaacatat cattatttag gtatcatatt gatttttata cttaattact aaatttggtt
421 aactttgaaa gtgtacatca acgaaaaatt agtcaaacga ctaaaataaa taaatatcat
481 gtgttattaa gaaaattctc ctataagaat attttaatag atcatatgtt tgtaaaaaaa
 541 attaattttt actaacacat atatttactt atcaaaaatt tgacaaagta agattaaaat
 601 aatattcatc taacaaaaaa aaaaccagaa aatgctgaaa acccggcaaa accgaaccaa
 661 tccaaaccga tatagttggt ttggtttgat tttgatataa accgaaccaa ctcggtccat
 721 ttgcacccct aatcataata gctttaatat ttcaagatat tattaagtta acgttgtcaa
 781 tatcctggaa attttgcaaa atgaatcaag cctatatggc tgtaatatga atttaaaagc
 841 agctcgatgt ggtggtaata tgtaatttac ttgattctaa aaaaatatcc caagtattaa
 901 taatttctgc taggaagaag gttagctacg atttacagca aagccagaat acaaagaacc
 961 ataaagtgat tgaagctcga aatatacgaa ggaacaaata tttttaaaaa aatacgcaat
1021 gacttggaac aaaagaaagt gatatatttt ttgttcttaa acaagcatcc cctctaaaga
1081 atggcagttt tcctttgcat gtaactatta tgctcccttc gttacaaaaa ttttggacta
1141 ctattgggaa cttcttctga aaatagt
用PstI/EcoRI酶切pBI121/CMO重组质粒，获得含有CaMV35S-CMO-Nos的片段，并插入到pUC19/MAR片段之间，构成基因转化元件MCCNM。
酶切获得MCCNM片段大小约4.9kb，经氯仿/异戊醇抽提，吸取上清，无水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，终浓度为300ng/ul，待用于转化。
(c)花粉管通道法转化水稻
选择水稻品种辽粳294、辽粳454和铁粳4号。在水稻开花后1-3小时内，剪掉已开过的颖花和当日不能开的颖花，选择当日开放的颖花，逐个将颖壳剪掉1/3，用微量注射器滴注MCCNM溶液，每朵颖花10ul，套袋。对照植株只转化0.1×SSC溶液(不含MCCNM)。成熟后收获种子。
(d)转化植株的检测
PCR检测  用CF和CR引物，以转化的水稻幼苗基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得1.4kb的目的基因片段。
SOUTHERN BLOT分析  PCR检测阳性植株的水稻基因组DNA经EcoRI酶切，琼脂糖电泳，转膜。以CF和CR1(5’-GAATAGAAGCACGGTGAGTGC-3’)为引物，以pBU121/CMO质粒为模板进行PCR扩增获得约0.52KbDNA片段，用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)标记探针，进行SOUTHERN杂交。SOUTHERN杂交分析表明，转化的CMO基因已经整合到水稻基因组上。
甜菜碱含量测定  取1.5g植物材料加入10ml甜菜碱提取液(甲醇∶氯仿∶水＝12∶5∶3(V/V))后进行研磨。匀浆液在60～70℃水浴中保温10min。冷却后，于20℃下1000×g离心10min，收集水相。氯仿相再加入10ml提取液，反复振荡，离心取上层水相合并，调pH至5～7，在70℃下蒸干，用3ml超纯水重新溶解。
在10～400g/ml范围内分别制作甜菜碱和胆碱标准曲线。
甜菜碱的标准曲线：配制QACs沉淀溶液。每个浓度的标准溶液0.5ml加入0.2mlQACs沉淀溶液混匀，0℃下保温90min，间歇振荡。加入2ml预冷水，迅速加入20ml经10℃预冷的二氯乙烷，在4℃下剧烈振荡5min，4℃下静置至两相完全分开。恢复至室温，取下相测OD365。
胆碱的标准曲线：步骤同上，但反应试剂为胆碱沉淀溶液。
按标准曲线制作方法分别测得四价铵化合物与胆碱在365nm处的吸收值，通过标准曲线得到相应的四价铵化合物与胆碱的含量，两项相减，即求出甜菜碱的含量。
耐盐能力检测  在转化水稻三叶期开始用1％-1.5％Nacl溶液浇灌，每2-3天一次，共筛选4-6周，存活植株经缓苗后移栽。
相对电导率测定  将新鲜叶片用300mmol/L NaCl胁迫处理4h，分别称取0.2g叶片两份，各加5ml超纯水，一份于25℃、170rpm/min振荡2h，另一份于沸水浴中加热30min，分别用DDS-12数字电导仪测定电导率(所用的电极参数为0.95)。前者定义为Rc，后者定义为Rc′，相对电导率为Rc/Rc′×100％。
(e)转基因植株遗传稳定性分析
对于子代的水稻植株采用上述检测手段分析，实验数据表明外源CMO基因在水稻基因组内稳定遗传。
实施例3  含有核基质区(MAR)边界序列和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化元件的构建及花粉管通道法转化小麦
(a)甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)基因的获得
用RT-PCR和RACE技术获得辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis kitag)甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH，GenBank，AF359282)cDNA全序列。BADH cDNA全长1901bp，5’端非编码区66bp，3’端非编码区329bp，含有2个可能的加polyA信号：AATAA，开放阅读框1506bp，编码502个氨基酸，其中有醛脱氢酶的保守序列VTLELGGKSP和半胱氨酸残基C。
BADH序列如下：
   1 gcttctcact ctttcccttt tctctcctcc catttttcat cgtcaactca atttctttct
  61 gcaacaatgt cgatccctat accttctcgt cagctattca ttgatggaga gtggagagaa
 121 cccatcaaac gaaatcgtct cccaattatt aatccttcca ctgaagaaac cattggggaa
 181 attccagcag caacagctga ggatgttgaa gcagcagtaa gtgctgctag aagagcactt
 241 aagaggaaca aagggagaga ttgggctgct acttctggag ctcaccgtgc tagatacttg
 301 cgtgctattg ctgctaaggt atcagaaaaa aaagaccatt ttgttaaact tgaaaccatg
 361 gattctggga aaccactgga tgaagcagtg ttggacatag atgacgtttc gacatgtttt
 421 gaatattttg ctgatcaagc agaagctctg gacaacaagc aaaagtatcc agtcaaactt
 481 cctatggaca gatttaaaag tcatgttctc aggcagccta ttggtgttgt gggattaatt
 541 tcgccatgga attacccact tttgatggcg acatggaaaa tcgctccagc tcttgctgca
 601 ggctgtacag ctgtacttaa gccatccgag ttggcatctg tgacttgtct agaattcggt
 661 gaagtttgca acgaagtggg acttcctcct ggtgtgttaa atattttgac gggattaggt
 721 ccagatgcgg gtgcaccatt agtgtctcat cctgatgttg acaaggttgc attcactggg
 781 agtagtgcta ctggaagcaa ggttatgggt tctgctgccc aattggttaa gcctgtcacc
 841 ttggaacttg gaggtaaaag tcctataatc gtgttcgaag atgttgttga tcttgatgta
 901 gctgctgaat ggactatctt tggtgttttc tggacaaatg gtcaaatatg tagcgcaact
 961 tctagactgc ttgtgcatga gagtattgca gctgaatttg ttgaaaagct tgtaaaatgg
1021 tccaagaaaa taaagatttc tgatccattt gaagaaggat gccggcttgg ccctgttatt
1081 agcaagggac agtatgacaa aattatgaag tacatatcga cagcaaagag tgagggggca
1141 actattttgt gtggaggatc tcgtcctgag catctgaaga agggatactt cattgagcca
1201 accattgtaa ctgatatcac cacatccatg caaatttgga aggaggaagt ttttggccct
1261 gtcttatgtg ttaaaacatt tagtaccgaa gaggaagccc ttgaattagc aaatgacaca
1321 gaatatggtt tagctgctgc tgtgttttct aaagaccttg aaaggtgtga gagggtaaca
1381 aaggctctag aagttggggc tgtctgggtg aattgctcac agccatgctt ttgccatgct
1441 ccatggggag gcgtcaagcg tagcggtttt ggacgtgagc ttggagaatg gggtattgaa
1501 aattacttga acattaagca agtgactagc gatatttccg atgaaccatg ggggtggtac
1561 aagtctcctt aaaggcaaaa gaggatattt gcaagataat gctgttatca agtgaactgt
1621 gacacaagag tgacgaccat gtaatgttgt ataacgatct agctcacagt ttgtctattt
1681 gattaaataa gggtcgtgcg atgctggagt tccataggca ttgattgatt ttgctatttg
1741 tgttattttg gaccattgag aaaatttttg gaccagggat aagatgcttg catataacat
1801 taagcctgtt atatttgcaa gtttaaatta tatttgggtg tgttatgtaa ctaatgtttc
1861 attaataaaa ttctccttcg tctcgaaaaa aaaaaaaaaa a
(b)基因转化元件MCBNM的构建
基因转化元件MCBNM结构为：
5’-MAR-CaMV35S-BADH-Nos-MAR-3’
具体策略如下：
利用PCR方法获得BADH基因的编码区，克隆到植物表达载体pBI121中，构成pBI121/BADH重组质粒。引物序列如下：
BF：5’-TCGATCCCTATACCTTCTTCGTC-3’
BR：5’-CATGGTCACCTTAAGGAGACTTGTACCACC-3’
SphI/EcoRI酶切pBI121/BADH重组质粒，获得含有CaMV35S-CMO-Nos的片段，并按照实施例2方法构成基因转化元件MCBNM。
酶切获得MCBNM片段大小约5.1kb，经氯仿/异戊醇抽提，吸取上清，无水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，终浓度为300ng/ul，待用于转化。
(c)花粉管通道法转化小麦
选择小麦品种辽春9、辽春10和辽春13。在小麦开花后1-3小时内，剪掉已开过的颖花和当日不能开的颖花，选择当日开放的颖花，逐个将颖壳剪掉1/3，用微量注射器滴注MCCNM溶液，每朵颖花10ul，套袋。对照植株只转化0.1×SSC溶液(不含MCBNM)。成熟后收获种子。
(d)转化植株的检测
PCR检测  用BF和BR引物，以小麦幼苗基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得1.5kb的目的基因片段。
SOUTHERN BLOT分析  PCR检测阳性植株的小麦基因组DNA经EcoRI酶切，琼脂糖电泳，转膜。以BF和BR1(5’-TAGGCTGCCTGAGAACAT GAC-3’)为引物，以pBIl21/BADH质粒为模板进行PCR扩增获得约0.45Kb DNA片段，用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)标记探针，进行SOUTHERN杂交。SOUTHERN杂交分析表明，转化的BADH基因已经整合到小麦基因组上。
甜菜碱含量测定  同实施例2。
耐盐能力检测  同实施例2。
相对电导率测定  同实施例2。
(e)转基因植株遗传稳定性分析
对于子代的小麦植株采用上述检测手段分析。实验数据表明外源BADH基因在小麦基因组内稳定遗传。
实施例4  含有玉米LKRSDH基因边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化玉米
(a)植酸酶基因的获得  同实施例1。
(b)基因转化元件LCPNL的构建
基因转化元件LCPNL结构为：
-LKRSDH5’端部分序列-CaMV35S-phyII-Nos-LKRSDH3’端部分序列-
具体策略为：根据LKRSDH基因序列设计合成引物，从玉米的基因组DNA中分别获得5’和3’端部分序列，连接在pUC19上。
用DNA Extraction Kit for GMO Detection试剂盒，提取玉米的DNA后，用引物L1(5’-TGGCTACTACTGAGAGTGATCGTTG-3’)和L2(5’-GTCATCATACTTACGCTGTCCGAGAC-3’)，获得LKRSDH基因的5’端部分序列，长度为1350bp。LKRSDH基因5’端部分序列如下：
   1 tggctactac tgagagtgat cgttgcgccg ttcaagccgt gcgaagacca gttcatagta
  61 caggagaaaa ggaagcggac atgttcttca atcatcttac actagtagtg aagtcacatg
 121 ctacactact atcgtctctt tgtcgggtag taatcttgat ttggaacctt ccgttgcttt
 181 ggagtttgga ctggttcatt cagtggctga cactgggatg gtgtactctg tccgacagct
 241 acctttccga cagctacctg gttggactac tagctttctc ttttgtttct ttgcccgcca
 301 gcgcctggcg actatattca gattcagtaa aatgggcgaa tttcaactag taatttgtta
 361 tcgtagctcg tagcaccaga ttgccatgcc gtctttgaac tgtattccgt cccctgacaa
 421 catctcactg tattaatttt gacactttct aacggcctga ctgtgtaaac tcacttcatt
 481 ttcaggaggt tgtggatttc atgtccgtga tctaggcgcc ttacttggac tcaggtatgg
 541 gttctgctgc tactgaggtg tgtaatctga ccccttttgt tgttgcaaac cgtgcggtgt
 601 ttgataacct tgttctttaa tgtgacggtt aattatgttg attcaatttc cactcgcagg
 661 gcaatgacac cttgctgggc aatggagttg ttgggattct tgctgagact tgtaatatgt
 721 gggaaagaag ggcgccgtta actccttccc attgtgcccg ccttctgcta ggaggaggca
 781 agaacggacc tcgagtaaac cggattattg tgcagccaag cacaaggagg atccatcatg
 841 acgctcagta tgaggatgca ggatgcgaga tttcagaaga cctgtcagaa tgcggcctta
 901 tcataggcat caaacaaccc aaggtcatat ttctcattaa gttagatact ctattggaca
 961 gtgctctata ccaatatcag atatcaccat ggttctgaaa cgcttggagg tgtcttcact
1021 tgggcagctg cagatgattc tttcagatag agcgtacgct ttcttttcac acacacacaa
1081 agcccaaaaa gagaatatgc cactgttaga caaggtatta aacataagct cgtaccttca
1141 tcatttcagt cgtcaactgc cattgtcatt catgtaggat attaaatcat tgactaatgt
1201 cctcagatcc ttgaagaaag ggtgtccttg tttgattatg agctaattgt tggagatgat
1261 gggaaaagat cactagcatt tgggaaattt gctggtagag ctggactgat agatttctta
1321 catggtctcg gacagcgtaa gtatgatgac
用另一对引物L3(5’-TAAAGATAGTATGATATAGCAGG-3’)和L4(5’-TTTCGGTGATTGTGTCATCGTGAG-3’)进行PCR扩增获得LKRSDH基因的3’端部分序列，长度为0.9Kb。LKRSDH基因3’端部分序列如下：
  1 taaagatagt atgatatagc agggcacatg tatcttttgt attaactccg ttctggaata
 61 tatatttgtg aactaaaatg tgacaaataa aaagaacggg tggagtatat tgtaagagac
121 ggcaaagaaa cctctgtata tatgacctgt cgatatcaaa taatgccgat cagttagttg
181 gcttggctct tttgagggtt tagtttatac tagtaaatga gagcaaccag cgaagcataa
241 acaagatgag acgtcagagc agcaacaaca acctgcgttg cctttggttt atattgcatc
301 ggttctccga atgaactttg catcctgtgc acatcagaca tgtcccagag ggatttcatt
361 ttcattaaat tgacatatca gcaaatctgc ttatgcgtcg agatatttat gagaggggaa
421 gagagcttca tgaaaccaaa ccggtcctca cgactaccca ggcgatgaaa tccccgctag
481 gctgattgct tgatctatct actgcggctg ctccagttcc tcaggtgggc accggcgcct
541 ccttccacgg ctgctacagt ccagactctt cctgtttcgc gccaactccc tcaagcccct
601 accctacaaa cccgcttcaa cggctgttcc tcaggtggac agtttctttt tcagtcagta
661 atacaacgct atatttaaac aggcacccac tgtatttctt ccttttcaac actcactgta
721 gcctgtttct gactttatgt tcagttcggt gtcggcaaca attgccacag gtacagtgaa
781 ccaccaagcg gataaccttg tcttaaaaac atgtggtaca ggatgcaatc cctggggatc
841 cagatttcaa aacaaacaac aatccttgca tagaacctca cgatgacaca atcaccgaaa
酶切实施例1中的pBI121/phyII重组质粒，获得含有CaMV35S-phyII-Nos的片段，并插入到pUC19/LKRSDH片段之间，构成基因转化元件LCPNL。
酶切获得LCPNL片段大小约4.55kb，经氯仿/异戊醇抽提，吸取上清，无水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，终浓度为300ng/ul，待用于转化。
(c)花粉管通道法转化玉米  同实施例1。
(b)转化植株的检测
赖氨酸含量检测  赖氨酸含量以每100克玉米所含赖氨酸克数或每100克玉米总蛋白质所含赖氨酸克数表示。玉米种子粉碎后，采用剀氏定氮法测出总蛋白含量。酶法水解(6mol/L HCl于110℃，在真空或充氮的安瓶内进行水解10-24小时)获得样液，利用氨基酸分析仪进行HPLC(茚三酮柱后衍生)检测氨基酸组成，并计算氨基酸含量。
其它检测方法  同实施例1。
实施例5  含有玉米绒毡层特异表达的MZm3-4基因边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化玉米
(a)植酸酶基因的获得  同实施例1。
(b)基因转化元件MCPNM的构建基因转化元件MCPNM结构为：
5’-MZm3-4部分序列-CaMV35S-phyII-Nos-MZm3-4部分序列-
具体策略为：根据MZm3-4基因cDNA序列设计引物，从玉米基因组DNA中分别获得5’和3’端部分MZm3-4序列，连接在pUC19上。
用引物MZ1(5’-GACTAGAGTGGGATCGCGAGGAAGAA-3’)和MZ2(5’-GTCGCAGGTGCAGCTGGC-3’)进行PCR扩增，获得MZm3-4基因的5’端部分序列，长度为约0.24Kb。碱基序列如下：
  1 gactagagtg ggatcgcgag gaagaaggat gtcgtgctgc ggaggaaact gcgggtgcgg
 61 cagcggatgc aagtgcggca gcgggtgcgg agggtgcaag atgtacccgg acatggctga
121 gcaggtgacc accaccacca ccatcatggg tgttgcacca tccaagggcg ggttcgaggc
181 ggccgccgga gctgagaacg gcgggtgcaa gtgcggcgcc gccagctgca cctgcgac
用引物MZ3(5’-TGCACCTGCAAGTGAGGA-3’)和MZ4(5’-CCATGTGGATTAGGCGTTATTGAGTCG-3’)进行PCR扩增，获得MZm3-4基因的3’端部分序列，长度为约0.41Kb。碱基序列如下：
  1 tgcacctgca agtgaggatg accgggtgca gcatgcaggc ccgtgacgat ggaggaagta
 61 gatcggaagg acacccttca gtatctctag ctaaatcaag ctctgagagt atgttgtagc
121 agcgtcgtct gtgtttgccg ccatgcgtag ctagctagct agtggtggta aacgaataat
181 tgtcctgttc ttcttcctcc tcggcccctg ccagtgttgc gtcgtgtggg ccggccgggt
241 gcatgcacag caccaggcca tgcccgctgc tatgtaagtg ctcgagccag tagcatcgta
301 actcggtttg ttaccgctag agctcgagcc agttcgagag tagccatttt aaaatgaagt
361 ctgcgcttgt gtgttatgga tttaaatcga ctcaataacg cctaatccac atgg
酶切实施例1中构建的pBI121/phyII重组质粒，获得含有CaMV35S-phyII-Nos的片段，并插入到pUC19/MZm3-4片段之间，构成基因转化元件MCPNM。
酶切获得MCPNM片段大小约3.4kb，经氯仿/异戊醇抽提，吸取上清，无水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，终浓度为300ng/ul，待用于转化。
(c)花粉管通道法转化玉米  同实施例1。
(b)转化植株的检测
花粉败育检测  取转化植株雄花穗，挑取花药在解剖镜下观察花粉粒，根据花粉形态判断败育的花粉比例情况。
其它检测方法  同实施例1。
实施例6  含有水稻醇溶蛋白(种子贮藏蛋白)基因ssp边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化水稻
(a)植酸酶基因的获得  同实施例1。
(b)基因转化元件SPS的构建
基因转化元件SPS结构为：
5’-ssp5’调控序列(包括启动子区)-phyII-ssp3’调控序列-3’
具体策略为：根据水稻ssp基因序列设计引物，从水稻基因组DNA中分别获得ssp基因5’调控序列(包括启动子区)和3’端调控序列，连接在pUC19上。
用引物1(5’-CTTGCATGGTGTCAGTAGTGCCTG-3’)和引物2(5’-GGGCAAAGATCTTGCTGGTGTATG-3’)进行PCR扩增，获得ssp基因的5’端调控序列(包括启动子区序列)，长度为约0.8Kb。碱基序列如下：
  1 cttgcatggt gtcagtagtg cctgcctaag aaatgtgtct tgtcataata tgattacatg
 61 aaatatgttt acttcctcgt ttctctttat ttgtaagata aagaactaga tatgtggaaa
121 gtaggatagc aaagagtatg gccaaactct aatctttgct ttattttttg ggatggaccc
181 aaaatttgtt tctcctttac ttctttccct ttacaacaat gttctttact tccaattctt
241 attaacaaaa ctccaaatac atgccaaact gcatatgtat gtatgctatt aaggcacatt
301 tacaaagctc caagtttacc tactcaatca ttcacatatg gcgatgactc aaactcttaa
361 ttgttatctg tgtaagctgt gacttgtgta acacattcta caagtcccat acgaattctg
421 ttcacaaaag tttctttgtc cagctcataa tttacaaaac tgcaaaatgc caaagcaatc
481 tggcacaacc ttatcatcat attttctttc cacgcattaa agcactggca gaattatctt
541 tgtgtagata ttccaaaagt attggttgaa taaatgtcca aataaattcc atgcctcatg
601 atttccagct tatgtggcct ccactaggtg gttttgcaaa ggccaaactc tttcctggct
661 tacacagcta ccagcatgta taaataggcc cctaggcaac cattattcca tcatcctcaa
721 caatattgtc tacaccatct ggaatcttgt ttaacactag tattgtagaa tcagcaatgg
781 cagcatacac cagcaagatc tttgccc
用引物3(5’-ATCAAACGTTGGTTACATGTACTC-3’)和引物4(5’-ATAGGGATATGTTAATGAGACATC-3’)进行PCR扩增，获得ssp基因的3’端调控序列，长度为约0.3Kb。碱基序列如下：
  1 atcaaacgtt ggttacatgt actctagtaa taaggtgttg catactatcg tgtgcaaaca
 61 ctagaaataa gaaccattga ataaaatatc aatcattttc agacttgcaa atattgggta
121 tttggatttc tgtcccatgt ccctcttgaa agccatgctg tacatgttgg agttccccct
181 tggacccaac ctactccatg ctcccatgtt gatcttaaat tccctgttcc cccagagcat
241 gtaaattttc ttatgctaat cagagcaagc tcgatgtctc attaacatat ccctatttga
酶切实施例1中构建的pBI121/phyII重组质粒，获得含有phyII的片段，并插入到pUC19/ssp片段之间，构成基因转化元件SPS。
酶切获得片段SPS大小约2.2kb，经氯仿/异戊醇抽提，吸取上清，无水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，终浓度为300ng/ul，待用于转化。
(c)花粉管通道法转化水稻  同实施例2。
(b)转化植株的检测  同实施例1。

Claims (10)

1、一种具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：①构建由外源基因和调控序列，以及两侧的边界序列共同组成的基因转化元件；②通过花粉管通道、种子浸泡法、胚囊注射法途径进行基因转化操作；③根据转化后边界序列插入植物基因组和外源基因的表达引起转化植株性状的变化，建立相应的筛选转化植株的检测方法。
2、按照权利要求1所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述供转化的基因转化元件是一段线性的脱氧核糖核苷酸序列，包括编码某一功能蛋白的结构基因和表达调控序列，以及位于表达调控序列两侧的边界序列。
3、按照权利要求2所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的基因转化元件中的边界序列，在基因转化过程中使基因转化元件定向或非定向地整合到植物基因组中。
4、按照权利要求3所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的有助于基因转化元件非定向地整合到植物基因组中的边界序列，是T-DNA的边界序列，或是转座子的全部或部分DNA序列。
5、按照权利要求3所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的有助于基因转化元件定向地整合到植物基因组中的边界序列，可以是所转化的植物基因组中某一编码区的全部或部分序列，是植物基因组某一结构基因的调控序列，或是植物基因组某一非编码区的DNA序列。
6、按照权利要求5所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的基因转化元件中由所转化的植物基因组中某一编码区的全部或部分序列构建的边界序列，通过同源重组方式使基因转化元件定向地插入到植物基因组中，导致编码决定植物某一性状基因的失活。
7、按照权利要求5所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的基因转化元件中由植物基因组某一结构基因的调控序列构建的边界序列，包括启动子区域及部分结构基因序列和3’端调控区域及部分结构基因序列，在转化过程中通过同源重组方式使基因转化元件替换掉该结构基因，使外源基因特异性表达。
8、按照权利要求5所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的基因转化元件中由植物基因组中某一非编码区序列构建的边界序列，是真核生物染色质中的核基质结合区DNA序列，或是在真核生物基因组中的中度或高度重复序列。
9、按照权利要求6所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的将所转化的植物基因组中作为边界序列的某一编码区的全部或部分序列，是编码决定植物某一形态性状的结构基因。
10、按照权利要求6所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是：上述提供的将所转化的植物基因组中作为边界序列的某一编码区的全部或部分序列，是编码决定植物体内某一生理、生化性状的结构基因。
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