CN1148380C - 菊芋凝集素、其编码基因及其在抗虫植物基因工程中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菊芋凝集素蛋白，其编码基因，携带所说基因的植物表达载体；本发明还涉及利用菊芋凝集素基因产生具有抗虫性的植物细胞和植株的方法。

Description

菊芋凝集素、其编码基因及其在抗虫植物基因工程中的应用

发明领域

本发明涉及菊芋凝集素蛋白，其编码基因，携带所说基因的植物表达载体；还涉及被所说的植物表达载体转化的植物细胞和由这些细胞再生的对同翅目害虫具有抗性的转基因植物及其后代，包括植物种子和植物组织；本发明尤其涉及抗同翅目害虫的水稻、棉花、小麦或十字花科的蔬菜。

技术背景

植物凝集素最早发现于1888年，Stillmark在蓖麻籽萃取物中发现了一种细胞凝集因子，具有凝集红细胞的作用，之后多种凝集素不断被发现，单子叶及双子叶植物中均发现了植物凝集素，存在于多种植物的储藏器官及繁殖器官中。植物凝集素曾经长期被认为是一种典型的种子蛋白，这是由于许多凝集素是在种子里发现的，已经在许多植物的营养器官中，如叶片、茎、茎皮、鳞茎、块茎、球茎、根状茎、根、果实、花子房、韧皮部汁液和花蜜中均发现了植物凝集素(Handbook of plant lectins：Van Damme et al.，Published by John Willey and Sons Ltd，Chichester，England1997)，非种子来源的植物凝集素同样分布广泛。

1888年凝集素被发现时，根据它的特性被命名为血细胞凝集素(haemagglutinin)，在随后的很长时期内一直沿用这个名称。直到发现一些植物凝集素选择性地凝集ABO血型系统中某种类型的血细胞，Lectin一词才被提出，用于说明植物凝集素凝集反应的选择性特征(Boyd andReguera，Jounal of Immunology 1949，62：333-339)。Lectin一词来源于希腊语lgere，意思是选择，但是这个名称并不十分严格，因为它同时包括了一些具有一般凝集活性单并非凝集素的蛋白质。从严格意义上说血细胞凝集素(haemagglutinin)一词更准确地说明了凝集素凝集红细胞的能力，但是由于血细胞凝集素同时具备凝集其它细胞的能力，所以，凝集素(agglutinin)一词更为合适。尽管haemagglutinin、lectin、agglutinin的准确含义并不相同，它们通常被用以描述同一类蛋白质，在三个名词中，lectin一词使用的相对较多。凝集素最初的定义是指非免疫来源的糖结合蛋白，可以凝集细胞或沉淀糖聚合物，Peumans和Van Damme(Peumans andVan Damme，Plant Physiol.1995，109：347-352)于1995年将植物凝集素定义为至少具有一个可与单糖或寡聚糖特异、可逆结合的非催化结构域的植物蛋白，根据这一定义，一大类具有不同凝集细胞或沉淀糖缀合物能力的植物蛋白均被包括在凝集素的范畴内。

根据凝集素氨基酸序列的同源性及其在进化上的关系，植物凝集素被分为7个家族：豆科凝集素，几丁质结合凝集素，单子叶甘露糖结合凝集素，2型核糖体失活蛋白，木菠萝素(jacalin)家族，葫芦科韧皮部凝集素和苋科凝集素(Peumans and Van Damme，Biotechnology and GeneticEngineering Reviews 1998，15：199-228)。

现在对植物凝集素的生理作用尚不清楚，但比较一致的看法是凝集素的糖结合活性及其专一性决定了它们的功能。专一性研究表明外源多糖可能是许多植物凝集素最可能的受体，外源多糖包括真菌及植物病毒表面、昆虫及草食动物肠道细胞表面的几丁质、糖缀合物。基于凝集素与糖的相互作用，对凝集素的生理作用有许多假说，例如，植物体内的凝集素与糖的相互作用，被认为和糖的运输、储藏物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控等过程有关。凝集素与外源多糖的互作被认为是植物/微生物互作、共生关系的建立及对外源生物防御机制建立的决定因素。后来人们认识到植物凝集素不仅在植物体内起作用，如作为氮源、特异的识别因子等，而且在植物抵抗外来生物如植物病毒、昆虫、草食动物的防御反应中起作用。许多植物凝集素存在于储藏器官中，它们既可以作为氮源，也可以在植物受到危害作为防御蛋白发挥功能，例如，黑刺槐和接骨木的树皮中积累了大量的凝集素，可以引起鼠类中毒，因而不受啮齿类等动物的危害，而树皮中不含凝集素的种类，如杨树、柳树、野苹果等极易啮齿类的危害(Peumans and Van Damme，Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews 1998，15：199-228)

人工饲养试验表明，许多植物凝集素对咀嚼式昆虫具有毒性，如麦胚凝集素(WGA)、马铃薯块茎凝集素、花生凝集素、刺苹果种子凝集素、荨麻属(stinging nettle)凝集素抑制豆象幼虫的发育(Murdock et al.，Phytochemistry 1990，29：85-89；Huesing et al.，Phytochemistry1991，30：3565-3568)。玉米螟幼虫在WGA、紫羊蹄甲种子凝集素剂量很低即可被毒杀，玉米根螟可以被商陆属凝集素毒杀，被其它几种凝集素抑制生长发育(Peumans and Van Damme，Biotechnology and GeneticEngineering Reviews 1998，15：199-228)。最近的工作发现刺吸式昆虫如椰粉虱、叶蝉、蚜虫等对一些单子叶植物甘露糖结合凝集素敏感，例如纯化的雪花莲外源凝集素(GNA)及转gna烟草的昆虫饲喂均表明，GNA对刺吸式昆虫具有抗性，而且还可以抗植物病原性线虫(Hilder etal.，Transgenic Research 1995，4：18-25)。植物凝集素对鞘翅目、双翅目害虫的毒性也有报道(Gatehouse et al.，Moluecular Breeding 1999，5：153-165)。上述结果说明植物凝集素在植物中具有防御功能。

植物凝集素对昆虫及动物产生毒害的机理尚不十分清楚，一般认为植物凝集素可能通过与糖蛋白，如昆虫围食膜表面的几丁质、消化道上皮细胞的糖缀合物、或糖基化的消化酶等结合而影响昆虫、动物对营养的吸收，促进消化道中细菌的繁殖及诱发病灶，抑制昆虫的生长发育、繁殖，最终达到杀虫、或对动物产生毒害的目的。

近年来，植物凝集素在抗虫基因工程中的应用，特别是针对蚜虫等同翅目害虫抗性的应用受到了愈来愈多的重视。报道的具有抗蚜活性基因除植物凝集素基因外，还有ipt基因(异戊烯基转移酶基因)及Mi基因(番茄抗线虫基因)，其中应用最多的是植物凝集素基因，包括雪花莲外源凝集素(GNA)基因、伴刀豆凝集素(ConA)基因、苋菜凝集素(AHA)基。报道的转凝集素基因的植物有烟草、水稻、马铃薯、小麦、番茄等，它们表现出对菜园夜蛾、桃蚜、水稻褐飞虱、麦长管蚜等害虫的抑制和抗性，例如，Shi等(Shi et al.，Journal of Experimental Botany 1994，45：623-631)将GNA置于韧皮部特异启动子RSsl的控制下，转化烟草，对GNA的免疫定位分析表明，GNA仅在韧皮部表达，同RSsl-uidA的GUS染色结果一致，对桃蚜蜜露的免疫检测也证明转基因烟草中表达的GNA被运输到韧皮部汁液中，认为韧皮部特异启动子RSsl可以用于控制杀虫蛋白，如GNA在植物韧皮部的特异表达，进而防治吸食韧皮部汁液的害虫。Stoger等(Stoger et al.，Molucular Breeding 1999，5：65-73)将GNA置于组成型启动子及韧皮部特异启动子控制之下，转入小麦，获得的转基因小麦显著降低了麦长管蚜的生殖力，若虫数量平均下降50％，蚜虫的存活率为对照的60％。Gatehouse等(Gatehouse et al.，Entomol.Exp.Appl.，1996，29：295-307)将GNA转入马铃薯，结果表明转基因马铃薯显著降低了桃蚜的繁殖力，每个雌蚜虫每天产卵4.1-4.2个，对照为5.4个。Rao等(Rao et al.，Plant Journal 1998，15：469-477)将GNA转入水稻，昆虫试验结果表明：水稻褐飞虱的生存率下降，开始每株接种25头，13天后，转基因植株上有7.6头，对照植株上有11.6头；发育受到抑制，13天后，转基因植株平均每株有0.8头发育到成熟阶段，而对照为6.4头；生殖力下降约30％。Gatehouse等(Gatehouse et al.，Moluecular Breeding1999，5：153-165)将ConA转入番茄后，ConA表达的植株抑制了番茄夜蛾幼虫的发育，幼虫体重下降的程度大于45％；使桃蚜的生殖力下降45％。周永刚等(周永刚等，生物工程学报，2001，17：34-39)从苋属植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)中克隆了苋菜凝集素基因的cDNA和基因组片段(AHAc和AHAg)，分别转化烟草，斑点免疫检测表明，转基因植株叶片中有AHA蛋白的表达，对蚜虫的虫试结果表明：AHAc和AHAg对蚜口密度的平均抑制率分别为48.8％和57.2％，有的植株高达90％以上，他们认为AHAg较AHAc具有更好的抗蚜性，表达AHA蛋白的转基因烟草主要通过对抑制蚜虫的繁殖而影响其群体的形成，对蚜虫死亡率的影响不大。

菊芋凝集素属于木菠萝素家族，由4个单体构成一个四聚体，具有甘露糖结合特异性。对其立体结构的研究表明，12条链构成的三个β片层排列成β棱柱状结构，β片层的方向与β棱柱的轴平行(Barre et al.Biochimie 2001 83：645-651)。菊芋凝集素在结晶时形成八聚体，八聚体呈环状排列，糖结合位点包括5个氨基酸残基(Gly¹⁸，Gly¹³⁵，Asp¹³⁶，Val¹³⁷，Asp¹³⁹)，它们与甘露糖通过8个氢键相连(Bourne et al.，Structure1999，7：1473-1482)。

本申请所披露的内容中，使用了很多术语。在申请中，“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面(5’非编码区)和后面(3’非编码区)的调控序列。“外源基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可是指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。

“启动子”是指一段可与RNA聚合酶及其他一些影响转录的反式因子结合而准确有效地起始转录的DNA序列。“组成型启动子”是能驱动目的基因在生物体各发育阶段和不同部位表达，且表达水平没有明显差异的一类启动子。“组织特异性启动子”是指驱动目的基因在生物体特定组织中表达的一类启动子。“器官特异性启动子”是指驱动目的基因在生物体特定器官中表达的一类启动子。“诱导型启动子”是指在一定的外界条件下(如光、温、化学物质等)诱导下驱动目的基因表达的一类启动子。

“复合启动子”是不同启动子之间或启动子和调控序列共同构成的。调控元件包括能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的各种来源的DNA序列。旨在增强外源基因表达的序列是水稻Actin1内含子1、玉米Ubiquitin内含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1内含子1、玉米乙醇脱氢酶1-S基因内含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外显子以及水稻EPSP合成酶基因第一内含子。

“增强子”是能够增强启动子转录活性的一段顺式调控序列。“内含子”是一段不转录的DNA序列，某些基因的个别内含子能增强启动子的转录活性。

“植物表达载体”是指能驱动目的基因在植物体内表达的载体。“整体水平的转化”是指以生物体为转化受体的转化方法，它包括花粉管通道法介导的基因转化、生殖细胞浸泡法、胚囊或子房注射法等。

“cDNA文库”是从mRNA逆转录成cDNA单链，经DNA聚合酶的作用转变成双链cDNA分子，然后插入到适当的载体中并克隆化而形成的集合。

“简并性”是由于遗传密码子第3位的可摇摆性而导致的多个密码子对应一种编码氨基酸的现象。

在本描述中，“植物”意味着任何能够进行光合作用的分化的多细胞有机体，“植物细胞”意味着来源于植物并能够形成未分化组织例如愈伤组织或分化的组织例如胚或植物部分或种子的任何细胞。

本发明通过测定菊芋块茎cDNA文库诱导表达产物对胰蛋白酶的抑制活性，进行了文库筛选，获得了4个同源的cDNA序列，推测的氨基酸序列与Jacalin家族的甘露糖结合凝集素具有同源性，其中与Van Damme等人(Van Damme et al.，Eur.J.Biochem.1999 259：135-142)报道的Heltuba具有高度同源性，核苷酸序列的同源性在85.2％～97.8％之间，氨基酸水平的同源性在91.3％～97.9％之间。将获得的cDNA序列在大肠杆菌中进行了诱导表达，细菌表达产物的抑制活性测定结果表明，该基因表达产物具有胰蛋白酶抑制活性，凝血试验也表明其具有凝集素的糖结合活性，因此本发明认为该基因编码一种双功能的蛋白质，具有凝集素的糖结合活性及蛋白酶抑制活性，将其命名为hta。

本发明的目的是针对以下两个事实：(1)蚜虫、稻飞虱、叶蝉等同翅目害虫在世界范围内对植物危害严重。同翅目昆虫的口器为刺吸式，其肠道内的消化酶水平很低，它们通过吸食植物韧皮部汁液获得营养，直接利用韧皮部中的自由氨基酸作为氮源，无法利用Bt毒蛋白或蛋白酶抑制剂的策略防制刺吸式害虫(Stoger et al.，Molecular Breeding 1999，5：65-73)，因而转Bt、SCK基因的植物对刺吸式害虫如蚜虫没有效果。蚜虫等同翅目害虫除通过吸取韧皮部汁液直接危害植物外，还通过携带多种植物病毒对植物造成间接危害。植物凝集素对同翅目害虫具有抗性，与Bt、SCK在抗虫上具有互补性，互补性包括两个方面，一是同Bt、SCK在抗虫谱上的互补，二是通过对凝集素摄取，可以加强Bt、SCK对鳞翅目昆虫的毒杀作用，降低昆虫产生抗性的机率。(2)化学杀虫剂的广泛使用，除造成环境污染外，在杀死害虫的同时也会杀死益虫，破坏生态平衡。利用转基因技术将杀虫基因导入植物，使植物获得抗虫能力，不仅可以减少农药的使用量，降低农药使用造成的环境污染，而且可以减轻对农田生态系统平衡的人为破坏，有助于生态平衡的重建及恢复，利于农业生产的可持续发展。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种菊芋凝集素蛋白。

本发明的菊芋凝集素蛋白具有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6或者SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的菊芋凝集素蛋白的基因。

本发明的菊芋凝集素蛋白的基因具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种利用菊芋凝集素基因产生具有抗虫性的植物细胞和植株的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将菊芋凝集素基因的上游端沿有义方向上连接于启动子的核酸片段之后，其下游端连接于编码一种用于控制转录终止的合适调控序列的核酸片段之前，进而构建植物表达载体；

(b)将构建好的植物表达载体转化植物细胞；

(c)在适宜的培养条件下将转化后的植物细胞再生，得到表达目的基因的植株。

在本发明的上述方法中，所述的启动子可以包括组成型启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或者由启动子和调控元件组成的复合启动子。所用的转化方法可以包括农杆菌介导的转化方法、基因枪法、原生质体介导的转化方法、电击法或者整体水平的转化方法。所述的植株可以是单子叶植物或者双子叶植物，例如水稻、小麦、大麦或者烟草、棉花、大豆、甘薯、马铃薯、白菜、青菜、芹菜、青椒。

本发明还提供了含有本发明所述的基因的植物表达载体。

附图简要说明

图1：质粒pET16的酶切图谱。含有T7启动子，Amp抗性部分和lacI部分。

图2：质粒pETHTA的酶切图谱。含有HTA基因cDNA全序列，质粒骨架来自pET16。

图3：质粒pSPROK的酶切图谱。P-35S是CaMV 35S启动子，属组成型启动子。

图4：质粒pCNPT-II的酶切图谱。该质粒可用来转化双子叶植物，含有左右边界序列，植物选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因。细菌选择标记为卡那霉素抗性。质粒骨架来自pCAMBIA2300

图5：质粒pCNHTA的酶切图谱。该质粒可用来转化双子叶植物。P-35S是CaMV 35S启动子，用于调控hta转录，Tnos终止子控制转录终止。NptII是新霉素磷酸转移酶基因作为筛选标记基因。质粒骨架来自pCNPT-II。

图6：pETHTA大肠杆菌诱导表达产物的PAGE电泳图谱。1：未诱导的含pET16空载体的大肠杆菌产物。2：诱导的含pET16空载体的大肠杆菌表达产物。3，5，7，8：诱导的含pETHTA载体的大肠杆菌达产物。4，6：未诱导的含pETHTA载体的大肠杆菌达产物。

图7：pETHTA大肠杆菌诱导表达产物对胰蛋白酶抑制活性的柱形图。对照：含有pET16空载体的大肠杆菌表达产物的Δ₄₀₅值。hta-a、hta-b、hta-c、hta-d：分别含有pETHTA表达载体的大肠杆菌表达产物的Δ₄₀₅值。

图8：T₀代转hta烟草的PCR检测。1.阳性质粒pCNHTA，2.非转化植株，3～11.转基因植株

图9：T₀代转hta基因烟草的Southern杂交。1：对照植株，2～12：转基因植株。

图10：T₀代转hta烟草的Northern杂交检测。1～4：阴性对照植株，其余为转基因植株。

图11：T₀代转hta烟草上桃蚜虫头数的柱形图。hta-a、hta-b、hta-c、hta-d分别为转hta基因的植株，CK为转pCNPT-II的对照植株。

图12：T₀代转hta烟草对桃蚜繁殖平均抑制率的柱形图。hta-a、hta-b、hta-c、hta-d分别为转hta基因的植株，CK为转pCNPT-II的对照植株。

图13：T₀代转hta烟草对桃蚜繁殖的抑制曲线图。hta-a、hta-b、hta-c、hta-d分别为转hta基因的植株，CK为转pCNPT-II的对照植株。

图14：T₁代转hta烟草上桃蚜虫头数的柱形图。hta-b、hta-c为转hta基因的植株，CK为转pCNPT-II的对照植株。

图15：T₁代转hta烟草对桃蚜繁殖平均抑制率的柱形图。hta-b、hta-c为转hta基因的植株，CK-1、CK-2、CK-3为三组转pCNPT-II的对照植株。

图16：T₁代转hta烟草对桃蚜若虫发育的影响。hta-c，hta-b为转基因烟草，CK-1、CK-2、CK-3为三组转pCNPT-II的对照植株。

下面结合实施例进一步阐明本发明，而不构成对本发明权利要求范围的限制。在实施例中，所用的术语和缩写是本领域技术人员通用的术语和缩写。

实施例1：菊芋块茎cDNA文库的构建

菊芋块茎cDNA文库的构建于表达型噬菌体载体λTripIEx2中，采用Clontech公司的Smart^TM cDNA文库构建试剂盒，按照所提供手册上的方法进行。

1.1RNA的提取

总RNA的提取按文献中的方法(Chomezynski and Sacchi，AnalyticalBoichemistry.1987，162：156～159)进行，并稍加改进。2.0g块茎(发育4周)于液氮中研磨成粉，转移到40ml的离心管中，加入5ml变性液，混匀，加入0.5ml 2M NaAc(pH4.5)，5ml水饱和酚，1ml氯仿，混匀后冰浴15分钟，10,000g离心10分钟，上清加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1小时，10,000g离心10分钟后，弃去上清，加入1ml 4M的LiCl洗涤沉淀，10,000g离心后弃上清，沉淀溶于1ml DEPC处理的水中，加1倍体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，上清加入1/10体积3M NaAc(pH4.5)，2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1小时，10,000g离心10分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤一次，干燥后溶于适当体积的DEPC处理的水中，-70℃保存备用。

1.2cDNA第一链的合成

1μl RNA(约1μg总RNA)

1μl SMART III引物

1μl CDS III/3′PCR引物

加RNase-free的无菌水至5μl，混匀后，72℃变性2分钟，冰上冷却2分钟后，加入：

2μl 5×First strand buffer

1μl DTT(20mM)

1μl dNTP(10mM)

1μl MMLV逆转录酶(200U)

混匀，42℃下进行逆转录反应1小时。

1.3cDNA第二链的合成

取2μl 1.2中的产物进行cDNA第二链的合成：

2μl First-strand cDNA

80μl H2O

10μl 10×cDNA PCR buffer

2μl dNTP(50mM)

2μl 5′PCR primer

2μl 3′PCR primer

2μl 50×Advantage cDNA Polymerose mix

用以下条件在GeneAmp 9600(PE公司)中进行PCR反应：95℃预变性60秒，95℃变性30秒，61℃复性30秒，72℃延伸6分钟，进行19个循环。

1.4cDNA的纯化、酶切、分级分离及与载体的连接

cDNA的纯化：取50μl 1.3中的产物，加入2μl蛋白酶K(20μg/μl)，混匀，45℃保温20分钟后，加入50水μl扩大体积后，经等体积的酚∶氯仿(50∶49∶1)抽提2次，加入10μl 3M NaAC(pH4.5)，1.3μl糖元(20μg/μl)，2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，10,000g离心10分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤一次，干燥后溶于79μl水中。

Sfi I酶切：

79μl cDNA(上一步的产物)

10μl 10×Sfi I buffer

10μl Sfi I酶

1μl 100×BSA

混匀，50℃保温2小时。加入2μl 1％二甲苯青。

cDNA的分级分离：按说明书中推荐的方法，经CHROMA SPIN-400柱进行分离，逐滴收集洗脱液，取5μl电泳检测cDNA的分布，将包含cDNA的第1、第2、第3滴合并后加入1/10体积3 M NaAC(pH4.5)，2倍体积的无水乙醇，1.3μl糖元(20μg/μl)-20℃沉淀过夜，10,000g离心10分钟，沉淀干燥后溶于7μl超纯水中。

cDNA与载体的连接：

cDNA          0.5μl

Vector        1.0μl

ATP(10mM)     0.5μl

T₄DNA连接酶  0.5μl

超纯水        2.0μl

混匀后，于16℃连接过夜。

1.5连接产物的包装、文库滴度的测定及扩繁

50μl包装蛋白(Promega公司的λDNA包装系统)中加入5μl连接产物，轻轻混匀，22℃保温3小时后，加入445μl phage buffer，25μl氯仿。按分子克隆中的方法进行文库滴度的测定及扩繁(分子克隆：实验室手册，Sambrook et al，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。获得的一级文库包含1.5～2×10⁶个噬菌体，重组率大于95％。文库扩增后分装保存于-70℃备用。

实施例2：菊芋块茎cDNA文库的的筛选及hta cDNA片段的获得

为了获得具有胰蛋白酶抑制活性的基因，本发明通过测定文库诱导表达产物对胰蛋白酶的抑制活性，在96孔板上进行文库的逐级筛选。取10⁶个来自二级文库的噬菌体与适量的宿主菌(XL1-Blue)、LB培养基(含有10mM MgSO₄，0.2％麦芽糖，0.1mM IPTG)混合后平均分配到96孔板的每个孔中，37℃于摇床中过夜培养扩繁后，按照胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法(工具酶的活力测定：蒋传葵，上海：上海科技出版社，1980，p105-107)，测定每个孔的胰蛋白酶抑制活性，具体方法如下：从96孔板每孔取50μl裂解产物，对应加入另一新的96孔板中，同时加入50μlTrypsin溶液(0.05mg/ml)，100μl反应缓冲液(Tris-HCl pH8.0，含10mMCa²⁺)，混匀，30℃反应2小时后，分别取50μl反应混合物转移到另一96孔板中，加入50μl反应缓冲液及100μl 10mM BApNA(含10mM Ca²⁺，Sigma公司)，立即在酶标仪上测定405nm下5分钟内光吸收的变化值，与对照比较，确定阳性孔。测定阳性孔的滴度，取10⁵个噬菌体用于下一轮筛选，每一轮所用的噬菌体均较上一轮稀释10倍，直到每孔稀释为仅有一个噬菌体时，取阳性孔连续铺两次平板，挑取单个的噬菌斑，侵染大肠杆菌BM25.8，通过LoxP位点的重组，带有外源片段的噬菌体部分环化成具有氨苄抗性(Amp^r)选择性的质粒。10⁶个噬菌体经过5轮筛选后，得到5个阳性孔，从中选取了3个分别连续铺两次平板挑取单个噬菌斑，侵染大肠杆菌BM25.8，挑取了24个抗性菌落提取质粒，Sfi I酶切分析插入片段表明，其中23个克隆的插入片段大小基本一致。测序后将cDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)比较的结果表明，该基因的编码产物与植物凝集素具有同源性，将其命名为hta。

实施例3：hta基因在大肠杆菌中的表达和胰蛋白酶抑制活性的测定

3.1大肠杆菌表达载体的构建

大肠杆菌表达载体pET16由中科院遗传所黄华梁研究员提供。质粒pET16经Nco I酶切后，加Klenow大片段补平末端后，再用Xho I酶切，回收载体部分。质粒pTripHTA经Sma I/Xho I双酶切，回收hta片段部分，hta片段与pET16载体经T₄DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物电击法转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得重组子pETHTA。质粒提取、酶切、DNA的回收、纯化均按分子克隆中的方法进行(分子克隆：实验室手册，Sambrook et al，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

3.2大肠杆菌的诱导表达及SDS-PAGE电泳

将pETHTA电击转入E.coli BL21(DE3)菌株中，挑取3个单菌落，于LB液体培养基中过夜培养，按1∶50的比例转接到新鲜的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度0.1mM，诱导表达3小时后，离心收集3ml诱导表达后的菌体，重悬于400μl无离子水中，超声波破菌，4℃、10,000g离心10min，上清即为电泳样品。SDS-PAGE蛋白电泳按分子克隆中的方法进行(分子克隆：实验室手册，Sambrook et al，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。蛋白电泳的结果表明，诱导后的大肠杆菌产物中具有特异表达HTA外源蛋白。

3.3胰蛋白酶抑制活性的测定

取3.2中的上清50μl，按下面的比例混合：

             标准管      样品管       对照管

缓冲液        100         100          100

水            350         300          300

牛胰蛋白酶    50          50           50

样品          0           50           50

注：单位：μl

    缓冲液：50mM Tris-HCl(pH8.0)含40mM Ca²⁺

    牛胰蛋白酶：1mg/ml

混匀，25℃保温60分钟，取100μl反应混合物加入1ml底物BApNA(1mM，含20mM Ca²⁺，Sigrna公司)，立即读出405nm处的光吸收，每隔30秒读一次，共读3分钟，计算Δ₄₀₅。结果表明：pETHTA大肠杆菌产物具有明显的胰蛋白酶抑制活性。

实施例4：双子叶植物表达载体pCNHTA的构建

选用CaMV35S组成型启动子和nos终止子控制hta在植物中的表达，构建植物表达载体。过程如下：首先从载体pTripHAT中Sma I/Sac I双酶切回收hta，插入质粒pSPROK的Sma I/Sac I位点，得到重组子pSRHTA。pSRHTA经Pvu II/Bgl II双酶切回收35Spromoter-hta-Tnos部分，插入植物表达载体pCNPT-II的Sma I/BamH I位点，得到植物表达载体pCNHTA。质粒提取、酶切、DNA的回收、纯化均按分子克隆中的方法进行(分子克隆：实验室手册，Sambrook et al，New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。

将质粒pCNHTA电击转入根农杆菌LBA4404，转化使用BIO-RAD公司的电激仪，感受态的制备和电激方法参照产品说明书进行，在YEB(Rif25，Km50)平板上28℃暗培养2天后即有转化菌落长出，进一步从转化菌中提取质粒予以鉴定。

实施例5：烟草转化苗的获得

利用改良叶盘法，通过农杆菌介导法转化烟草。具体操作过程如下，将实施例4中的含有植物表达载体的农杆菌LBA4404于含有相应抗生素的YEB固体培养基上划线，28℃避光培养至长出直径约1mm大小的单菌落(约36h)。取单菌落再度转接于同样的固体培养基上，培养至生长旺盛期(约36h)。取少许根农杆菌转接于20mlYEB液体培养基中(含有相应抗生素，使用100ml三角瓶)，于28℃，220rpm振荡培养过夜(约18h)。次日以2％～4％的接种量转接于20ml不含抗生素的YEB液体培养基中，并补加乙酰丁香酮至终浓度为100μM。继续振荡培养3～4 h，到达对数生长中期时，用三倍以上体积的液体基本培养基稀释至肉眼稍见浑浊即可(OD₆₀₀＝0.1)，以备转化之用。取完全展开的烟草无菌苗叶片，用打孔器(直径0.9cm)制成叶盘，在菌液中浸泡10min。取出叶盘，用无菌滤纸吸干后，转入覆盖有一层无菌滤纸的共培养培养基中于25℃暗培养2～3天后，将叶盘转入继代培养基中。在继代培养基中光照培养(光/暗周期为16/8h)3天后，将叶盘转入筛选培养基。继续培养7～10天后，将叶盘转入再生培养基。15～20天即可观察到叶片边缘长出愈伤或丛生再生芽，一个月左右可长至1～2cm，转入新的再生培养基中，待其长到3～4cm时，用解剖刀将再生芽切下，并转入生根培养基中。再生苗在含有卡那霉素(50mg/L)的生根培养基上生根，一个月后待根系发育完全后，将幼苗转移至温室生长。

实施例6：烟草转化苗的分子鉴定

6.1烟草DNA的提取

取T₀代烟草新鲜叶片0.3mg置于研钵中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml预热到60℃的CTAB缓冲液(30g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.2％的巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)。60℃保温30分钟，其间轻摇数次。然后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，上清液转移到新的离心管中加入2/3倍体积异丙醇，形成的沉淀既是DNA，加入少许洗液(体积分数为76％的乙醇，10mM NH₄AC)洗涤沉淀一次，干燥后用500μl TE缓冲液(10M Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)溶解DNA。随后加入RNase A(终浓度10mg/L)，37℃保温30分钟，依次用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，水相加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于100μl无菌水中。

6.2T₀代转基因植株的PCR检测

取1μl 6.1中的DNA为模板进行PCR反应。50μl的反应体系中包括：5μl 10×PCR反应缓冲液、引物P1(atggctgccagtgacattg)、P2(aggaacaactacgccacc)各1μl(10μM)、1μl DNA模板、4μl dNTP(2.5mM)，1U Taq酶补加无菌水至总体积50μl。PCR反应条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟、52℃复性1分钟、72℃延伸1.5分钟，进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。取10μl PCR产物进行琼脂糖电泳检测结果。PCR检测的结果显示转基因烟草基因组DNA可以扩增出与目的基因片段同样大小的单一条带。

6.3T₀代转基因植株的Southern检测

约20μg 6.1中的DNA加入适量的EcoR I(TaKaRa)酶切后，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，0.2N HCl脱嘌呤10分钟，用0.4N NaOH转移到Hybond-N⁺(Amersham pharmacia)膜上，转移后的膜在2×SSC中洗一下，80℃真空固定2小时。在含有7％SDS(W/V)的0.5M磷酸钠缓冲液中65℃预杂交2小时，加入[α-³²P]dCTP随机引物法标记的hta cDNA探针进行杂交(Promega随机引物标记试剂盒)。65℃杂交过夜，0.1×SSC(含0.1％SDS)中65℃洗膜，压X光片，放射性自显影。杂交结果表明hta已经整合到烟草基因组中。

6.4T₀代转基因植株的Northern检测

转基因烟草叶片总RNA的提取同1.1中的方法。约30μg转基因烟草的总RNA经含有0.1％甲醛变性胶(1.2％)电泳后，用20×SSC转移到Hybond-XL膜上(Amersham pharmacia)，转移后的膜先在水中洗10分钟，再于10×SSC中洗10分钟，80℃真空固定2小时后，即可用于杂交，过程同6.3中的方法。Northern杂交的结果表明hta在转基因烟草中进行了表达。

实施例7：转基因烟草的抗蚜性鉴定

转基因烟草对桃蚜的抗性鉴定委托中国农业科学院植物保护研究所农业昆虫系进行。

7.1抗蚜鉴定方法：

每株T₀代转基因烟草用毛笔接入1-2龄若蚜10头，接于植株顶部的嫩叶上，盆与盆之间保持一定距离以避免蚜虫在不同烟株上转移。烟株置于光照培养室内，光周期16/8h，温度25℃，每隔3日调查烟株上的蚜虫数量，共统计4次。

T₀代转基因烟草的种子经30％次氯酸钠消毒后，置于MS培养基中(平皿)发苗，待长出2-3片真叶后，转移到含有卡那霉素(50mg/L)的MS培养基中进行筛选，正常生根的幼苗被视为T₁代阳性转基因植株。待烟苗长出4～5片真叶后，每棵烟草苗上接一只2～3龄左右的桃蚜，每隔3天统计一次繁殖的若虫数目及若虫的发育状况，统计后将若虫全部取出，共统计3周次。

7.2抗蚜数据的统计分析

抗蚜数据的统计分析参照常规的统计方法进行(生物统计学：李春喜等，科学出版社，第二版，北京，2000)。统计分析的结果表明，T₀转hta烟草对桃蚜的繁殖具有明显的抑制作用(表1，2，3)，平均抑制率在46.9％～78％之间。统计分析表明转基因植株与对照植株上蚜虫后代数目的差异显著(表4，5，6)，T₁代转基因植株对桃蚜繁殖的平均抑制率分别为50.1％(hta-b)及64.6％(hta-c)，转基因植株除对桃蚜繁殖具有明显的抑制作用，还对若蚜的发育具有抑制作用。

表1T₀代转基因烟草上桃蚜后代群体数目方差分析表

变异来源    df        SS         s²         F        F_0.01

处理间      4      16287.27    4071.82    14.07^**    4.77

处理内      16     4630.54     289.41

总变异      20     20917.81

表2T₀代转基因烟草上桃蚜后代群体数目差异性显著性比较表

(新复极差法)

                                       差异性显著性

转化的基因       平均数             á＝0.05   á＝0.01

CK               93.75                 a           A

hta-c            49.75                 b           B

hta-b            22.67                 c           BC

hta-d            21.63                 c           C

hta-a            20.5                  c           C

表3T₀代转基因烟草上桃蚜后代群体数目的LSR值(新复极差法)

  M          2       3        4         5

SSR_0.05   3.00     3.14     3.24     3.30

SSR_0.01   4.13     4.31     4.42     4.51

LSR_0.05   25.53    26.72    27.57    28.08

LSR_0.01   35.15    36.68    37.61    38.38

表4T₁代转基因烟草上桃蚜后代群体数目方差分析表

变异来源   df       SS        s2        F        F0.01

处理间     4     6253.14   1563.29    26.87^**   3.72

处理内     50    2908.61     58.17

总变异     54    9161.75

表5T₁代转基因烟草上桃蚜后代群体数目差异性显著性比较表

(新复极差法)

                                       差异性显著性

转化的基因    平均数                 á＝0.05   á＝0.01

CK             34.73                    a           A

hta-b          16.59                    b           B

hta-c          12.47                    b           B

表6T₁代桃蚜后代群体数目的LSR值(新复极差法)

   M         2       3      4       5

SSR0.05    2.84    2.99    3.08    3.15

SSR0.01    3.79    3.96    4.06    4.20

LSR0.05    6.53    6.88    7.08    7.25

LSR0.01    8.72    9.11    9.34    9.66

                            序列表

<110>  中国科学院遗传研究所

<120>  菊芋凝集素基因及其在抗虫植物基因工程中的应用

<130>  I2001278

<160>  8

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  775

<212>  DNA

<213>  Helianthus tuberosus

<220>

<221>  CDS

<222>  (48)..(491)

<223>

<400>  1

cacaacataa gttacttaag aagctttgaa tttgcataga ccagaaa atg gct gcc    56

                                                    Met Ala Ala

                                                    1

act gac att gcg gta cag gcc gga cca tgg gga ggt aat ggt gga aaa    104

Thr Asp Ile Ala Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn Gly Gly Lys

    5                   10                  15

cgc tgg ttg caa aca gct cgt ggt ggt aag att act tcg atc att atc    152

Arg Trp Leu Gln Thr Ala Arg Gly Gly Lys Ile Thr Ser Ile Ile Ile

20                  25                  30                  35

aaa ggc gga act tgt att ttc tcc atc cag ttc gta tat aag gac aaa    200

Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Val Tyr Lys Asp Lys

                40                  45                  50

gat aat att gaa tac cat tct gga caa ttt ggt gtt cag ggt gac aaa    248

Asp Asn Ile Glu Tyr His Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln Gly Asp Lys

            55                  60                  65

gct gaa aca att acc ttt gcg gac gat gag gac atc act gcg atc agc    296

Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asp Glu Asp Ile Thr Ala Ile Ser

        70                  75                  80

gga act ttc gga gca tat tat cac ttg aca gtt gtt aca tcg ctc act    344

Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr His Leu Thr Val Val Thr Ser Leu Thr

    85                  90                   95

ttt cag acc aac aaa aag gtt tat ggg cca ttc ggc acg gtg gct agt    392

Phe Gln Thr Asn Lys Lys Val Tyr Gly Pro Phe Gly Thr Val Ala Ser

100                 105                 110                 115

tcg agt ttc tca ctg cct cta act aag ggt aag ttt gcc gga ttc ttt    440

Ser Ser Phe Ser Leu Pro Leu Thr Lys Gly Lys Phe Ala Gly Phe Phe

                120                 125                 130

ggg aac agt gga gac gtc ctt gac tcg att ggt ggc gta gtt gtt cct    488

Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val Val Val Pro

            135                 140                 145

taa tcacaacgcc tgatatgatg aaaataagaa gttaaggaaa gacttcacgt         541

ttgtaaaaga gttgtgacat tcagctcgta tttgtgtgta tgcatctttc aatttcgtct  601

ctcgtatttg tgtgtatgca tctttcaatt tcgtctctcg tttttctcgg gaaataagct  661

tttatgatat attccaataa gcccgagctt gtcgtgcact agacttctgt tctccgcaaa  721

aggttttaaa tgatcatttt ttcccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa        775

<210>  2

<211>  147

<212>  PRT

<213>  Helianthus tuberosus

<400>  2

Met Ala Ala Thr Asp Ile Ala Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn

1               5                   10                  15

Gly Gly Lys Arg Trp Leu Gln Thr Ala Arg Gly Gly Lys Ile Thr Ser

            20                  25                  30

Ile Ile Ile Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Val Tyr

        35                  40                  45

Lys Asp Lys Asp Asn Ile Glu Tyr His Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln

    50                  55                  60

Gly Asp Lys Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asp Glu Asp Ile Thr

65                  70                  75                  80

Ala Ile Ser Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr His Leu Thr Val Val Thr

                85                  90                  95

Ser Leu Thr Phe Gln Thr Asn Lys Lys Val Tyr Gly Pro Phe Gly Thr

            100                 105                 110

Val Ala Ser Ser Ser Phe Ser Leu Pro Leu Thr Lys Gly Lys Phe Ala

        115                 120                 125

Gly Phe Phe Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val

    130                 135                 140

Val Val Pro

145

<210>  3

<211>  784

<212>  DNA

<213>  Helianthus tuberosus

<220>

<221>  CDS

<222>  (48)..(491)

<223>

<400>  3

cacaacataa gttacttaag aagctttgaa tatgcataga ccagaaa atg gct gcc    56

                                                    Met Ala Ala

                                                    1

agt gac att ggg gta cag gcc gga cca tgg gga ggt aat ggt gga aaa    104

Ser Asp Ile Gly Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn Gly Gly Lys

    5                   10                  15

cgc tgg ttg caa aca gct cat ggc ggt aag att act tcg atc att atc    152

Arg Trp Leu Gln Thr Ala His Gly Gly Lys Ile Thr Ser Ile Ile Ile

20                  25                  30                  35

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Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Val Tyr Arg Asp Lys

                40                  45                  50

gat aat att gaa cac cat tct gga caa ttt ggt gtt cag ggt gac aaa    248

Asp Asn Ile Glu His His Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln Gly Asp Lys

            55                  60                  65

gct gaa aca att acc ttt gcg gac gat gag gac atc act ggg atc agc    296

Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asp Glu Asp Ile Thr Gly Ile Ser

        70                  75                  80

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Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Gln Met Thr Val Val Thr Ser Leu Thr

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100                 105                 110                 115

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Ser Ser Phe Ser Leu Pro Leu Thr Lys Gly Lys Phe Ala Gly Phe Phe

                120                 125                 130

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Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val Val Val Pro

            135                 140                 145

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<210>  4

<211>  147

<212>  PRT

<213>  Helianthus tuberosus

<400>  4

Met Ala Ala Ser Asp Ile Gly Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn

1               5                   10                  15

Gly Gly Lys Arg Trp Leu Gln Thr Ala His Gly Gly Lys Ile Thr Ser

            20                  25                  30

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    50                  55                  60

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65                  70                  75                  80

Gly Ile Ser Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Gln Met Thr Val Val Thr

                85                  90                  95

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            100                 105                 110

Val Ala Gly Ser Ser Phe Ser Leu Pro Leu Thr Lys Gly Lys Phe Ala

        115                 120                 125

Gly Phe Phe Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val

    130                 135                 140

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145

<210>  5

<211>  752

<212>  DNA

<213>  Helianthus tuberosus

<220>

<221>  CDS

<222>  (47)..(490)

<223>

<400>  5

cacaacataa gttacttaag aagctttgaa tttgcataac cagaaa atg gct gcc     55

                                                   Met Ala Ala

                                                   1

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    5                   10                  15

cgc tgg ttg caa aca gct cat ggc ggt aag att act gcg atc att atc    151

Arg Trp Leu Gln Thr Ala His Gly Gly Lys Ile Thr Ala Ile Ile Ile

20                  25                  30                  35

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Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Val Tyr Lys Asp Lys

                40                  45                  50

gat aat att gaa tac ctt tct gga caa ttt ggt gtt cag ggt gac aaa    247

Asp Asn Ile Glu Tyr Leu Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln Gly Asp Lys

            55                  60                  65

gct gaa aca att acc ttt gcg gac gat gag gac atc act ggg atc agc    295

Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asp Glu Asp Ile Thr Gly Ile Ser

        70                  75                  80

gga act ttc gga gca tat tat cag atg aca gtt gtt aca tcg ctc act    343

Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Gln Met Thr yal Val Thr Ser Leu Thr

    85                  90                  95

ttt cag acc aac aaa aag gtt tat ggg cca ttc ggc aca gtg gct ggt    391

Phe Gln Thr Asn Lys Lys Val Tyr Gly Pro Phe Gly Thr Val Ala Gly

100                 105                 110                 115

tcg cgt ttc tca ctg cct cta act aag ggt aag ttt gcc gga ttc ttt    439

Ser Arg Phe Ser Leu Pro Leu Thr Lys Gly Lys Phe Ala Gly Phe Phe

                120                 125                 130

ggg aac agt gga gac gtc ctt gac tcg att ggt ggc gta gtt gtt cct    487

Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val Val Val Pro

            135                 140                 145

taa tcacaaccgc ctgatatgat gaaaataaga agttaaggaa agacttcacg         540

tttgtaaaag agttgtggca ttcagctcgt atgtgtgtgt atgcatcttt caatttcgtc  600

tctcgttttt ctcgggaaat aagcttttat gatatattcc aataagcccg agcttgtcgt  660

gcactagact tttgttctcc gcaaaaggtt ttaaatgatc attaccatat tattaatttc  720

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa aa                               752

<210>  6

<211>  147

<212>  PRT

<213>  Helianthus tuberosus

<400>  6

Met Ala Ala Ser Asp Ile Gly Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn

1               5                   10                  15

Gly Gly Lys Arg Trp Leu Gln Thr Ala His Gly Gly Lys Ile Thr Ala

            20                  25                  30

Ile Ile Ile Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Val Tyr

        35                  40                  45

 Lys Asp Lys Asp Asn Ile Glu Tyr Leu Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln

     50                  55                  60

Gly Asp Lys Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asp Glu Asp Ile Thr

65                  70                  75                  80

Gly Ile Ser Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Gln Met Thr Val Val Thr

                85                  90                  95

Ser Leu Thr Phe Gln Thr Asn Lys Lys Val Tyr Gly Pro Phe Gly Thr

            100                 105                 110

Val Ala Gly Ser Arg Phe Ser Leu Pro Leu Thr Lys Gly Lys Phe Ala

        115                 120                 125

Gly Phe Phe Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val

    130                 135                140

Val Val Pro

145

<210>  7

<211>  718

<212>  DNA

<213>  Helianthus tuberosus

<220>

<221>  CDS

<222>  (48)..(491)

<223>

<400>  7

cacaacataa gttacttaag  aagctttgaa tttgcacaga ccagaaa atg gct gcc    56

                                                     Met Ala Ala

                                                     1

agt gac gtt gcg gta cag gcc gga cca tgg gga ggt aat ggt gga aaa    104

Ser Asp Val Ala Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn Gly Gly Lys

    5                   10                  15

cgc tgg ttg caa aca gct cat ggt ggt aag att act tcg atc att atc    152

Arg Trp Leu Gln Thr Ala His Gly Gly Lys Ile Thr Ser Ile Ile Ile

20                  25                  30                  35

aaa ggc gga act tgt att ttc tcc atc cag ttc gca tat aag gac aaa    200

Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Ala Tyr Lys Asp Lys

                40                  45                  50

gat aat att gaa tac ctt tct gga caa ttt ggt gtt cag ggt gac aaa    248

Asp Asn Ile Glu Tyr Leu Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln Gly Asp Lys

            55                  60                  65

gct gaa aca att acc ttt gcg gac aat gag gac atc act gcg atc agc    296

Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asn Glu Asp Ile Thr Ala Ile Ser

        70                  75                  80

gga act ttc gga gca tat tat caa atg aca gtt gtt aca tcg ctc act    344

Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Gln Met Thr Val Val Thr Ser Leu Thr

    85                  90                  95

ttt cag acc aac aaa aag gtt tat ggg cca ttc ggc acg gtg gct agt    392

Phe Gln Thr Asn Lys Lys Val Tyr Gly Pro Phe Gly Thr Val Ala Ser

100                 105                 110                 115

tcg agt ttc tca ctg cct cca act aag ggt aag ttt gcc gga ttc ttt    440

Ser Ser Phe Ser Leu Pro Pro Thr Lys Gly Lys Phe Ala Gly Phe Phe

                120                 125                 130

ggg aac agt gga gac gtg ctt gac tcg att ggt ggc gta gtt gtt cct      488

Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val Val Val Pro

            135                 140                 145

taa tcacaacgcc tgatatgatg aaaataagaa gttaaggaaa gacttcacgt           541

tcgtaaaaga gttgtgacat tcagctcgta tttgtgtgta tgcatctttc aatttcgtct    601

ctcgtatttg tgtgtatggg aaataagctt ttatgatata ttacaataag cacgagcttg    661

tcgtgcacta gacttctgtt ctccggtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa       718

<210>  8

<211>  147

<212>  PRT

<213>  Helianthus tuberosus

<400>  8

Met Ala Ala Ser Asp Val Ala Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn

1               5                   10                  15

Gly Gly Lys Arg Trp Leu Gln Thr Ala His Gly Gly Lys Ile Thr Ser

            20                  25                  30

Ile Ile Ile Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Ala Tyr

        35                  40                  45

Lys Asp Lys Asp Asn Ile Glu Tyr Leu Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln

    50                  55                  60

Gly Asp Lys Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asn Glu Asp Ile Thr

65                  70                  75                  80

Ala Ile Ser Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Gln Met Thr Val Val Thr

                85                  90                  95

Ser Leu Thr Phe Gln Thr Asn Lys Lys Val Tyr Gly Pro Phe Gly Thr

            100                 105                 110

Val Ala Ser Ser Ser Phe Ser Leu Pro Pro Thr Lys Gly Lys Phe Ala

        115                 120                 125

Gly Phe Phe Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val

    130                 135                 140

Val Val Pro

145

Claims (7)

1.一种菊芋凝集素蛋白，它具有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQID NO：6或者SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。

2.编码按权利要求1所述的蛋白的基因。

3.按照权利要求2所述的基因，它具有如下特征：

(a)具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

(b)因密码子的简并性引起的核苷酸序列与权利要求3(a)中所述的序列不同，但仍编码权利要求1所述氨基酸序列的蛋白的核酸分子；

(c)为cDNA分子或基因组DNA分子。

4.一种利用菊芋凝集素基因产生抗同翅目害虫的植物细胞和植株的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将编码权利要求1所述的菊芋凝集素蛋白的基因的上游端沿有义方向上连接于启动子的核酸片段之后，其下游端连接于一种用于控制转录终止的合适调控序列的核酸片段之前，进而构建植物表达载体；

(b)将构建好的植物表达载体转化植物细胞；

(c)在适宜的培养条件下将转化后的植物细胞再生，得到表达目的基因的植株。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的启动子是组成型启动子。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所用的转化方法包括农杆菌介导的转化方法、基因枪法、原生质体介导的转化方法、电击法、花粉管通道法或者整体水平的转化方法。

7.按照权利要求4所述的方法，所述的植株是烟草。

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