DE4309203C1 - Verfahren zur Produktion von transgenischen Pflanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Produktion von transgenischen - vor­ zugsweise monocotyledonischen - Pflanzen gemäß dem Gattungsbegriff des Anspruchs 1.

Es ist bekannt, dicotyledonische Pflanzen durch Infektion von undifferenzierten Callus- Zellen mit "Agrobacterium tumefaciences" - welche ein Ti-Plasmid mit dem oder den ge­ wünschten Gen(en) tragen - herzustellen (Hooykaas und Schilperoort, Plant Molec. Biol. 19, 15-38, 1992). Diese Gene sind zusammen mit den dazugehöri­ gen Kontrollelementen innerhalb des Plasmids an ihrer rechten und linken Grenze durch eine spezifische Oligo-Nukleotid-Sequenz von dem übrigen Genom des Plasmids abge­ grenzt. Nachstehend werden die linke und rechte Begrenzungsfrequenz nur mehr mit RB oder LB bezeichnet, ferner die so abgegrenzte DNS mit ssTDNS (singular strang T-Plas­ mid DNS).

Die RB und LB ermöglichen die Integration der ssTDNS in das eukariotische Genom und diejenige der ssDNS erfolgt durch die Aktivität der VIR-Proteine (virulenz-proteine), die Produkte der VIR-Gene sind, die wiederum Bestandteile von geeignet konstruierten Plas­ miden in "Agrobacterium tumefacience" sind. Die Produktion der VIR-Proteine ist essen­ tiell für die Übertragung der ssTDNS von dem infizierenden Agrobacterium in die Pflan­ zenzelle, ferner für die Produktion anderer Proteine, die notwendig sind, um die ssTDNA gegen pflanzliche Nucleasen - das sind DNS-abbauende Enzyme - während des Transpor­ tes des ssDNS durch die Pflanzenzelle zu schützen, oder für die Produktion katalytischer Proteine, welche die ssTDNS durch eine Serie enzymatischer Reaktionen - wie beispiels­ weise "nicking", Integration, und Ligase-Reaktion - in das Pflanzen-Genom integrieren.

Das ganze System der Reaktionsfolge ist das Ergebnis der Wirkung einer chemischen Sub­ stanz, nämlich des sogenannten Induktors, der von derZelle der dikotyledonischen Pflanze produziert wird (Stachel et al., PNAS, USA 83, 379-383, 1986), wobei dieser Induktor mit den VIR-Genen reagiert und die Synthese der VIR-Proteine induziert. Ohne den Induktor, welcher die VIR-Gene zur Produktion der VIR-Proteine in "Agrobacterium" induziert, finden Transferierung und Integration der ssTDNS nicht statt. Der Induktor wird von der dikotyledonischen Pflanzenzelle produziert, wenn die Plasmamembran dieser Pflanze verletzt worden ist. Die Struktur des am weitesten verbreiteten Induktors ist die des Azetosyringon (Stachel et al., Nature Vol. 318 19/26, 624-629, Dec. 1985).

Die Voraussetzung für die Produktion einer transgenischen Pflanze ist die Integration von ssTDNS in das Genom der Gametenstammzellen, also jener Zellen, die zur Bildung von Sperm und Eizelle führen. Calluszellen, die bei Verletzung einer dikotyledonischen Pflanze gebildet werden, sind undifferenzierte Zellen, welche durch geeignete Pflanzenhormon- Behandlung zu voll ausgewachsenen Pflanzen regeneriert werden können. Daher führt die Infektion mit "Agrobacterium" - welches geeignete Gene innerhalb der ssTDNS eines ihrer Plasmiden trägt - von Calluszellen letztlich zur Entstehung von transgenischen dikotyle­ donischen Pflanzen. Normalerweise werden Calluszellen in Dicotyledonen in einem Wundareal gebildet und dieses Callusgewebe kann auf geeignete Zellkulturmedien übertra­ gen werden und in der Kultur für verschieden lange Zeiten erhalten bleiben. In der Gewe­ bekultur kann der Callus durch "Agrobacterium" mit seinem transformierenden Plasmid infiziert werden und anschließend unter Zuhilfenahme geeigneter Pflanzenhormone, wird das Callusgewebe unter entsprechenden Bedingungen zu Pflanzen regeneriert, um schließ­ lich in Erdsubstrat für ein normales Wachstum verpflanzt zu werden.

Der transformierende Ti-Plasmid - also der Plasmid innerhalb des Agrobacteriums, der die gewünschten Gene aufweist - trägt außerdem auch innerhalb der RB- und LB-Grenzse­ quenzen sowie den TDNS-Grenzen ein Antibiotikum-Resistenz-Gen, wie beispielsweise das Kanamycin-Resistenz-Gen mit seinem dazugehörigen Promotor u. Terminator. Dieses Gen erlaubt nach der Übertragung in das Pflanzen-Genom die wachsenden Calluszellen in der Gewebekultur, welche Kanamycin enthält, zu selektieren, indem nur jene Calluszellen auf dem Nährboden wachsen, in welche die ssTDNS erfolgreich integriert worden sind. Antibiotikumresistente Zellen tragen daher mindestens zwei Gene mit ihren dazugehörigen Kontrollelementen - im allgemeinen das Antibiotikumresistenz-Gen -, um die Selektion von allen anderen nicht transformierten Calluszellen zu gewährleisten - und das gewünschte Gen für die Erzeugung einer neuen transgenischen Pflanzenvarietät.

Eine völlig andere Situation liegt jedoch bei monokotyledonischen Pflanzen vor, hier ins­ besondere bei den Getreidearten. Die Monokotyledonen bilden nämlich normalerweise kein undifferenziertes Callusgewebe bei Verletzungen und nur bei relativ wenigen Arten und dem Vorliegen ganz bestimmter Bedingungen gelang es Callusgewebe zu erzeugen. Wei­ terhin muß in Betracht gezogen werden, daß Monokotyledonen kein Azetosyringon oder einen vergleichbaren Induktor bei Verletzung sezernieren. Daher ist eine Infektion mit Ti- Plasmiden, getragen von "Agrobacterium tumefaciences", normalerweise nicht möglich, da die VIR-Gen-Produkte - also die VIR-Proteine - nicht im "Agrobacterium" produziert wer­ den und daher auch die Produktion von ssTDNS - wie sie in Dicotyledonen generell bei einer Verletzung stattfindet - nicht erfolgt.

Transgenische Monocotyledonen - insbesondere die Getreidearten - können daher bisher nicht routinemäßig durch Infektion mit "Agrobacterium" hergestellt werden. Bei den bisher durchgeführten Experimenten wurde der transformierende Plasmid direkt mit einem soge­ nannten, von ihm mantelartig überzogenen Mikrogeschoß aus kolloidalem Gold oder Molybdän in die Calluszelle eingeschossen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs ge­ nannten Art aufzuzeigen, mit dem insbesondere monocotyledonische Pflanzen - wie Rog­ gen, Weizen und andere Getreidearten -, aber auch dicotyledonische Pflanzen unabhängig von der Technologie der Calluszell- und -gewebekulturbildung durch Einbau von Genen transformierbar werden, das heißt, Pflanzen durch molekular-genetische Manipulationen in transgenische Pflanzen zu transformieren.

Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 aufgezeigten Maßnahmen gelöst. In den Un­ teransprüchen sind Ausgestaltungen und Weiterbildungen angegeben und in der nachfol­ genden Beschreibung sind Ausführungsbeispiele erläutert.

Zur Lösung der vorstehenden Aufgabe ist es erforderlich, die zu transformierenden Gene in das Genom der Gametenstammzellen zu integrieren, um nachfolgende Pflanzengeneratio­ nen mit dem neuen (ursprünglich fremden) Gen zu produzieren. Nun sieht die Erfindung hierfür drei Möglichkeiten vor, mit deren Hilfe fremde Gene in die sich entwickelnden Pflanzen eingebracht werden, und die nachstehend im einzelnen erläutert werden.

Die erste Möglichkeit ist die Injektion von "Agrobacterium tumefaciences"-Kulturen, die geeignete, mit konventionellen Methoden konstruierte Plasmide enthalten, beispielsweise ein Plasmid, das Virulenz-Gene (VIR) und ein anderes, das ein wünschenswertes Gen mit zugehörigen Kontrollelementen und einem Antibiotikum-Resistenzgen innerhalb der T- Begrenzungssequenzen enthält. Dieses "Agrobacterium" wird in ein Kulturmedium bei bestimmter Temperatur inkubiert. So ein Kulturmedium kann beispielsweise aus einigen g/l Bacto-tryptone, Bacto-yeast-Extrakt und NaCl gebildet sein.

Wenn dieses Kulturmedium nun einen bestimmten Wert für die OD₆₀₀ erreicht hat, wird ein Teil desselben in eine Menge MS-Medium gegeben, welches mit einem geringen Pro­ zentsatz Glukose versetzt und auf einen bestimmten pH-Wert eingestellt ist. Diese Kultur wird nach Ablauf einer mehrere Stunden dauernden Inkubationszeit mit Azetosyringon bestimmter Endkonzentration versetzt und erneut weitere Stunden inkubiert. Anschließend erfolgt eine Pelletierung der Bakterien durch Zentrifugation und deren Eingabe in das oben genannte supplementierte MS-Medium, jedoch ohne daß es mit Azetosyringon versetzt ist.

Von dieser Suspension wird nun ein Mikroliteranteil in den keimenden Embryo nahe der Basis des aus dem Caryopsis entwickelten Coleoptils in unmittelbarer Nähe zu dem apika­ len Meristem injiziert. Die Keimlinge stammen beispielsweise von gekeimten Roggen- oder Weizenkörnern, deren Oberflächen vor dem Keimen mit konventionellen Methoden sterilisiert worden sind. Die der Injektion vorausgehende Keimungsperiode beträgt bei Raumtemperatur etwa 48 Stunden. Nach der Injektion werden die Keimlinge auf autokla­ viertes Vermikulit übertragen, letzteres wird mit einem geeigneten Pflanzenkulturmedium feucht gehalten, zum Beispiel dem oben genannten supplementierten MS-Medium (jedoch ohne Azetosyringon). Nach weiteren 48 Stunden werden die Keimlinge in Humus bzw. Erdsubstrat zum normalen weiteren Wachstum eingepflanzt.

Nun kann eine gewünschte Integration von Genen in ein Pflanzengenom auch auf eine an­ dere Weise erfolgen. Hierzu ist anzuführen, daß es bekannt ist, bei Dicotyledonen dies mit der Agrobacterium-Technologie durchzuführen, die als ersten Schritt in der Reaktionsfolge die Bildung der ssTDNS benötigt. Es ist ferner bekannt, daß dies die Folge der Induktion der VIR-Gene in den Ti-Plasmid ist, welche in der Produktion der VIR-Proteine in Agrob­ acterium endet. Diese VIR-Proteine sind jedoch kommerziell nicht erhältlich und können nur mit äußerst komplizierten molekular-genetischen Techniken unter Benutzung geeigne­ ter Expressionsvektoren in kleinsten Mengen hergestellt werden. Aus diesem Grunde wurde auf eine solche Methode bis heute verzichtet.

Erst durch die vorliegende Erfindung wird nun ein Weg aufgezeigt, der die Herstellung ei­ nes biologisch aktiven - bisher jedoch unbekannten - ssTDNS-Proteinkomplexes ermög­ licht. Dieser besteht aus einem einzigen Protein, das in seinen Eigenschaften denen der VIR-Proteine als Gruppe sehr ähnlich ist und daher letztere ersetzen kann. Weiterhin be­ sitzt dieser Komplex entweder in sich oder nach weiterer Komplexierung zu einem anderen Protein die Eigenschaft den Eintritt des ssTDNS-Protein- Komplexes in die Pflanzenzelle durch ihre Plasmamembran zu erleichtern und damit die Integration der ssTDNS in das Pflanzengenom zu fördern.

Hierzu wird nun vorgeschlagen, das Histon H1 einzusetzen. Dieses Histon H1 wird mit bekannten Methoden - beispielsweise aus Hühner-Erythrozyten - hergestellt. H1 ist ein eukaryontisches, chromosomales Protein, welches nicht in Agrobacterium oder anderen Prokaryonten vorkommt. Dieses Histon spielt jedoch eine wichtige Rolle in der Erhaltung der geordneten Struktur des eukaryontischen Chromatins. Dieses chromosomale Protein bildet aufgrund seines basischen Charakters Komplexe mit DNS und zu seinen physiologi­ schen Eigenschaften ist zu zählen, daß es in den Zellkern eintreten kann. Die Möglichkeit einer technischen Ausnutzung der Eigenschaften des Histon H1, um letzteres zum Trans­ port des ssDNS in der Konstruktion von transgenischen Organismen zu verwenden, sind bisher unbekannt gewesen und werden hier erstmals vorgeschlagen.

Das Verfahren sieht als zweite Möglichkeit zur Lösung der gestellten Aufgabe vor, das ssDNS durch konventionelle Methoden aus einem geeigneten Plasmid herzustellen, wel­ cher beide Begrenzungssequenzen RB und LB oder nur eine davon trägt. Ein Plasmid, der nur die RB-Sequenz enthält und die zu transferierenden Gene, ist mit konventionellen Methoden konstruiert worden, indem die zu transferierenden Gene und ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz RB eingebracht worden sind. Von diesem Plasmid wird nun mit konventionellen Methoden und mit der Hilfe von geeigneten Restriktionsenzymen ssTDNs hergestellt. Letzteres wird dann mit Histon H1 in einem molekularen Verhältnis von 1 : 110 gemischt und mit einem Puffer versetzt. Dieser Komplex aus Histon H1 und ssTDNS wird nun - wie bereits erwähnt - in den keimenden Pflanzenembryo injiziert.

Nun läßt sich aber die gestellte Aufgabe noch auf eine dritte Art lösen. Der Komplex ssT DNS - Histon H1 - wie er vorstehend beschrieben worden ist - wird hierbei mit einem Pflanzenvirus, der spezifisch für die zu transformierende Pflanze ist, versehen. Dies erfolgt durch Bindung des ssTDNS-Histon-Komplexes mittels eines Antivirus-Antikörpers. Hier­ bei reagiert dieser Antikörper spezifisch mit dem Virus und unspezifisch mit dem Histon H1, weil dieses einen stark basischen Charakter aufweist. Dadurch stellt der Antikörper das Bindeglied zwischen Virus und ssTDNS-Komplex dar, was auch elektronenmikroskopisch sichtbar ist.

Die Menge dieses mit konventionellen Mitteln durch Affinitäts-Chromatographie gerei­ nigten Antikörpers in Relation zum Virus muß unter dem Elektronenmikroskop ermittelt werden, um die Bildung eines unlöslichen Aggregates aus Antikörper, Histon, ssTDNS und Virus zu verhindern. Die Gegenwart des Antikörpers verhindert die Wiederholung (Replication) des Virus. Zu erwähnen ist noch, daß Pflanzen, die auf diese vorbeschriebene Weise gewonnen worden sind, frei von Symptomen einer "Brome-Mosaic-Virus-Infektion" sind.

Zusammenfassend seien die drei vorbeschriebenen Lösungsmöglichkeiten zur Produktion von transgenischen - vorzugsweise monocotyledonischen - Pflanzen noch einmal kurz skizziert. Der erste Verfahrensvorschlag sieht vor, daß beispielsweise Roggen- oder Wei­ zensamenkörner mit "Agrobacterium fumefaciences" transformiert werden, welches geeig­ nete Plasmide trägt und in welchem die VIR-Gene eines ihrer Plasmide mit Acetosyringon in vitro induziert worden sind. Diese induzierte Agrobacterium-Suspension wird in das sprossende Coleoptil des keimenden Getreidekornes injiziert.

Beim zweiten Lösungsvorschlag erfolgt die Transformation durch die Injektion in keimen­ de Embryonen eines Komplexes von ssTDNS (singular strang T - Deoxyribonucleinsäure, wobei mit T der T-Plasmid bezeichnet ist) und Histon H1.

Beim dritten Lösungsvorschlag erfolgt die Transformation durch die Injektion in keimende Embryonen eines Komplexes aus ssTDNS, Histon H1, das mit einem Antikörper, der ein Brome-mosaic-virus einschließt, versehen ist.

Mittels dieser vorgeschlagenen Verfahren werden fremde Gene in sich entwickelnde Pflan­ zen injiziert, kurz nachdem sich der ruhende Embryo natürlich zu entwickeln begonnen hat. Durch die vorgeschlagenen Maßnahmen ist es nun möglich geworden, transgenische Pflanzen zu erzeugen, ohne daß hierzu Callus-Zellen erforderlich wären. Die bisher erfor­ derliche Gewebekultur-Technologie ist nicht mehr erforderlich. Damit aber können nun­ mehr transgenische Pflanzen erzeugt werden, die keinen Callus bilden, insbesondere Mo­ nocotyledonen und bei den Dicotyledonen kann die komplexe Gewebekultur-Technologie umgangen werden.

Claims (7)

1. Verfahren zur Produktion von transgenischen - vorzugsweise monocotyledonischen - Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß durch Injektion

• a) entweder von Kulturen von "Agrobacterium tumefaciences", deren Bakterien in vitro mit Azetosyringon induziert sind und Plasmide für Virusgene (VIR) mit ihren Kon­ trollelementen enthalten und ein weiteres Plasmid mit dem gewünschten neuen Gen und dessen Kontrollelement in keimende Pflanzenembryonen integriert werden, oder
• b) "singular strang T-Plasmid Deoxyribonuklein-Säure" (ssTDNS) mit nur einer oder beiden Begrenzungssequenzen (RB oder LB) in diese Pflanzen-Embryonen einge­ bracht wird, wobei die ssTDNS natürliche oder synthetische Gene innerhalb der T- Begrenzungssequenzen (RB, LB) trägt, welche mit Histon (H1) vervollständigt sind, oder
• c) vorgenanntes ssTDNS zusätzlich noch mit einem für die zu transformierende Pflan­ zenart geeigneten Pflanzenvirus durch den virus-spezifischen Antikörper gekoppelt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Histon (H1) zum Transport der ssDNS in der Struktur von transgenischen Organismen verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das molekulare Verhältnis von ssTDNS zu Histon (H1) 1 : 110 beträgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung von ssTDNS und Histon (H1) in einem Puffer erfolgt, der aus Glycerin, Tris-HCl, KCl, ED- TA und DTT mit einem pH-Wert von 7.9 gebildet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper spezifisch mit dem Virus und unspezifisch mit dem Histon (H1) reagiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper- Virus-Komplex gebildet wird einmal von einer Lösung mit einer bestimmten Menge Viren in Natriumazetat mit einem pH-Wert von 4.0 und zum andernmal von einer Antikörperlö­ sung in Natrium-Phosphat mit einem pH-Wert von 7.0.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Keimlinge nach ihrer Injizierung auf autoklaviertes Vermikulit übertragen und mit einem Pflanzen­ wachstums-Medium feucht gehalten werden und nach 48 Stunden in Erdsubstrat zum wei­ teren Wachstum verpflanzt werden.