CN1651571A

CN1651571A - 一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用

Info

Publication number: CN1651571A
Application number: CNA2004100427126A
Authority: CN
Inventors: 乔传令; 兰文生; 黄菁
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2024-05-21
Also published as: CN100425691C

Abstract

本发明涉及一种可以降解农药残留的超级工程菌和其表达的解毒酶。该超级工程菌含有编码解毒酯酶和水解酶的基因，能诱导表达解毒酯酶和水解酶。其构建方法包括：分别克隆解毒酯酶和水解酶的基因；将此基因分别克隆到表达载体pETDuet－1上，构建融合表达载体pETDuet－b1－opd：最后转化得到重组菌株并进行诱导培养。本发明的解毒酶是由上述超级工程菌经诱导表达后而制备的。该超级工程菌和解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。该超级工程菌和解毒酶为利用真核和原核生物的自然资源对残留在水源、土壤等中农药等有毒有害化合物污染的生物治理提供了一条新途径，消除农药残留污染。

Description

一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种超级工程菌及其构建和应用，以及该超级工程菌表达的解毒酶及其应用，具体地说是涉及一种可以降解农药残留的超级工程菌和其表达的解毒酶，以及它们的构建方法和应用。

技术背景

现代农业生产为满足人们粮食高产的愿望，发挥了巨大的作用，一度被奉为第三世界国家摆脱贫困和饥饿的灵丹妙药。然而面对现代农业中农副产品品质的下降、生物多样性的减少，面对农作物病虫害的日益猖獗、农业资源的浪费、农业环境的退化，面对非洲粮食危机的有增无减，人们在欣喜之余，逐渐产生了一种困惑、一种疑虑，开始重新审视现代农业的利弊，重新认识农业资源环境的内涵，重新思考农业科研与决策的方向。

杀虫剂(即农药)是一把双刃剑，一方面，害虫大量的侵食农作物，例如在印度，几乎30％的农作物被害虫侵食，而全球性的食物短缺危机又要求农作物丰产以满足人类的生存需求，因而作为保护农作物所使用的杀虫剂在农业上的应用越来越广泛，占到了世界消耗量的3％(Bharati J.Bhadnhade et al.，2002)。另一方面，杀虫剂的过度使用导致环境的极度农药污染，同时造成全球范围的昆虫杀虫剂抗药性和动物及农作物体内的农药残余(Ch.L Qiao，2003)。这个矛盾将是未来亟待解决的尖锐问题。

常用的杀虫剂主要有有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类三大类，这三类都会对哺乳动物造成神经毒性。普遍存在于昆虫体内各种组织中的酯酶(Esterase，简称EST)是可以对杀虫剂解毒的重要水解酶之一，其参与酯类杀虫剂的解毒作用。不同的水解酶都有着其特定的作用部位，并与之相互作用，将大分子化合物间的键水解掉，使之成为小分子化合物或无毒的离子。现已从微生物细胞内分离得到的磷酸三酯酶是一种细菌的有机磷水解酶(OPH)，可以有效水解有机磷类化合物，显著降低其毒性，但是这种酶不能水解羧酸酯键，因而对于氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类的杀虫剂起不到降毒作用。

我国作为一个农业生产大国，更是生产和使用农药的大国。大量使用农药以减轻农产品遭受病虫害损失的同时，也带来了日益严重的农药残留问题。而且由于我国农药使用缺乏规范管理，农产品农药残留普遍超标，导致我国农产品外贸出口遭受重大损失，传统的出口产品，如水果、茶叶和中草药等屡屡发生大批量退货，出口规模严重受制。此外，高农残的蔬菜和水果也会给人的身体健康带来极大的危害，据卫生部门统计，1999年1～10月，共收到食物中毒报告78起，中毒人数4394人，79人死亡，其中由农药引起中毒1108人，死亡59人，超过死亡人数的70％。统计还显示，近年来在食物中毒中，由农药残留引起所占的比例越来越高。同时，长期食用高农残的食品，会形成慢性神经性中毒，严重的会引发老年痴呆等病症。

发明内容

本发明的目的在于为了解决我国作为一个农业生产大国而不得不大量使用农药，在环境中存在着严重的农药残留的污染问题，为了消除农药残留污染对国民经济造成的损失和对人民健康的危害，从而提供一种能同时有效降解有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农药的超级工程菌。

本发明的另一目的在于提供上述超级工程菌表达的解毒酶。

本发明的再一目的在于提供上述超级工程菌和解毒酶的构建方法。

本发明的还一目的在于提供上述超级工程菌和解毒酶的应用。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供一种降解农药残留的超级工程菌，该超级工程菌含有编码解毒酯酶和水解酶的基因，能表达解毒酯酶和水解酶。

所述的解毒酯酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(i)具有图1所述的氨基酸序列；或

(ii)将图1所述的氨基酸序列经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸残基且具有与(i)相同的解毒酯酶功能的衍生的蛋白质。

所述的水解酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(iii)具有图2所述的氨基酸序列；或

(iv)将图2所述的氨基酸序列经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸残基且具有与(iii)相同的水解酶功能的衍生的蛋白质。

本发明提供一种上述降解农药残留的超级工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)按常规方法分别克隆解毒酯酶和水解酶的基因：

所述的解毒酯酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(i)具有图1所述的氨基酸序列；或

(ii)将图1所述的氨基酸序列经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸残基且具有与(i)相同的解毒酯酶功能的衍生的蛋白质；

所述的水解酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(iii)具有图2所述的氨基酸序列；或

(iv)将图2所述的氨基酸序列经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸残基且具有与(iii)相同的水解酶功能的衍生的蛋白质；

2)将步骤1)得到的解毒酯酶和水解酶的基因分别克隆到表达载体pETDuet-1上，构建融合表达载体pETDuet-b1-opd：

根据pET28a-b1载体上的解毒酯酶基因序列和pPNCO33载体上的水解酶基因序列分别设计引物，并以此质粒为模板作PCR扩增；

解毒酯酶基因的引物：

上游引物5′-GC AGATCTCATGAGTTTGGAAAGCTTAACCGTTC-3′

下游引物5′-CG CTCGAGAAACAGCTCATCAT TCACGTACATTG-3′

水解酶基因的引物：

上游引物5′AC GGATCCCATGCAAACGAGAAGGG-3′

下游引物5′-GT AAGCTTCATG ACGCCCGCAAGG-3′

用PCR方法在解毒酯酶基因b1和水解酶基因opd的前面加上NC的接头，所述的NC接头分别为

5’-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3’和

5’-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3’；

将带有NC接头的水解酶基因opd的上游引物引入双表达载体pETDuet的BamHI位点，下游引物引入双表达载体pETDuet的HindIII位点，5’端各引入两个酶切位点保护碱基；将带有NC接头的解毒酶基因b1的上游引物引入双表达载体pETDuet的BglII位点，下游引物引入双表达载体pETDuet的XhoI位点，5’端各引入两个酶切位点保护碱基；经PCR扩增得到的解毒酯酶和水解酶的基因分别插入双表达载体pETDuet的多克隆位点，构建得到融合表达载体pETDuet-b1-opd；

3)转化重组菌株并进行诱导培养：

将步骤2)构建得到的表达载体pETDuet-b1-opd转化到大肠杆菌，筛选得到重组菌株；将此重组菌株用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在14～25℃诱导16～22小时，得到本发明的超级工程菌。

所述步骤1)为分别从抗双硫磷致倦库蚊的蚊虫中克隆得到全长解毒酯酶b1基因，和从细菌中克隆得到全长水解酶opd基因；所述的解毒酯酶b1为具有图1所述的氨基酸序列的蛋白质；所述的水解酶opd为具有图2所述的氨基酸序列的蛋白质。

本发明提供一种由上述超级工程菌表达的解毒酶，其为由如下的方法得到的：将上述超级工程菌的培养液，在5000xg离心5分钟，收集经诱导的超级工程菌，重新用PBS调节细菌的浓度为OD₆₀₀＝1,5000xg离心，5分钟重新收集细胞，再次加入培养液的1/10的体积(OD₆₀₀＝1)的PBS，10倍浓缩菌液，细菌菌液中加入溶菌酶使其终浓度为100μg/ml，加入1/10体积的1％Triton X-100，30℃温浴15分钟，在冰浴条件下超声波裂解处理，再离心去除沉淀，得到的上清液即为本发明的超级工程菌表达的解毒酶(B1-OPH)粗酶液。

本发明提供一种上述降解农药残留的超级工程菌和解毒酶的用途，该超级工程菌和解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。

本发明提供的降解农药残留的超级工程菌的解毒酶的优益之处在于，其为用分子生物学方法构建的超级工程菌，该超级工程菌利用了可以共表达两个目的基因的表达载体pETDuet，在载体的多克隆位点上同时引入了表达编码昆虫的解毒酯酶基因和细菌的有机磷水解酶的基因，其中酯酶基因在微生物细胞内的融合表达量占总蛋白量的56％。因而，该超级工程菌和解毒酶同时具有解毒酯酶和水解酶的功能，对农药残留的降解谱加宽，对有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类等都能有效降解。该超级工程菌和解毒酶具有较高的降解有机酸酯类农药的能力，在30min即可降解马拉硫磷67.0％、对硫磷66.7％。此外，该超级工程菌对敌敌畏急慢性中毒的鸡有一定的解毒作用。本发明提供的降解残留农药的超级工程菌和解毒酶为利用真核和原核生物的自然资源对残留在水源、土壤中农药等有毒有害化合物污染的生物治理提供了一条新途径，其可以降解污染水中的有机磷类农药残留、有机磷神经毒剂和一些内分泌干扰化合物，氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类以及部分有机氯农药等。

附图说明

图1为解毒酯酶的氨基酸序列；

图2为水解酶的氨基酸序列；

图3为重组质粒pETDuet-b1-opd的构建示意图；

图4为解毒酶在E.Coli BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE分析图；其中，1为蛋白分子量标准；2为纯化的OPH；3为纯化的B1；4为本发明的超级工程菌；5、7、9为对照；6为含pETDuet-opd的菌株表达的OPH；8为含pETDuet-b1的菌株表达的B1。

具体实施方式

实施例1、构建本发明的重组质粒pETDuet-b1-opd表达的超级工程菌和解毒酶

本发明提供的解毒酶和水解酶基因超级工程菌的克隆如下：

1.1质粒和受体菌

Escherichia coli strain BL-21(DE3)用作表达菌，质粒pETDuet购自Novagen公司用作表达opd基因和b1基因的载体，该质粒在大肠杆菌E.coli.DH5α增殖，所有宿主菌株BL-21(DE3)，E.coli.DH5α由本室保存，携带水解酶opd基因的质粒pPNCO33由Wilfred Chen(University of California，Riverside，California.)惠赠，用作opd基因的模板；携带解毒酯酶b1基因的质粒pET28a-b1作为b1基因来源，由中国科学院动物所抗性分子遗传学组提供。

所述的解毒酯酶为具有图1所述的氨基酸序列的蛋白质；所述的水解酶为具有图2所述的氨基酸序列的蛋白质。

解毒酯酶b1基因也可从抗双硫磷致倦库蚊的蚊虫中克隆得到，水解酶opd基因也可从细菌中克隆得到。

1.2工具酶及试剂

Ex.Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶BamHI，BglII，XhoI and HindIII、T₄ DNA连接酶均为TaKaRa产品，其余试剂为分析纯。

1.3培养基和培养条件

细菌增殖培养所使用培养基为LB培养基，含质粒菌体的培养基中加氨苄青霉素终浓度为50μg/ml，经转化重组质粒的细菌培养至菌体密度为OD₆₀₀＝0.6时加入终浓度为1mM IPTG，诱导1小时后加入CoCl₂，使其终浓度为1mM，为研究菌体细胞内活性蛋白的形成规律，在不同温度下继续诱导培养。

1.4表达载体的构建

用PCR方法在水解酶基因opd的前面加上NC的接头，所述的NC接头为

5’-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3’和

5’-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3’；

根据Wilfred Chen提供的pPNCO33载体上的opd序列设计引物，以此质粒为模板作PCR扩增opd基因。引物由上海博雅生物工程公司合成，序列为：

opd-up(5′-A CGGATCCCATGCAAACGAGAAGGG-3′)，

opd-down(5′-GT AAGCTTCATG ACGCCCGCAAGG-3′)，

上游引物引入BamHI位点，下游引物引入HindIII位点，5’端各引入两个酶切位点保护碱基。

用PCR方法在解毒酯酶基因b1的前面加上NC的接头，所述的NC接头为

5’-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3’和

5’-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3’；

根据本研究室保存的pET28a-b1载体上的b1序列设计引物，以此质粒为模板作PCR扩增b1基因。引物由上海博雅生物工程公司合成，序列为：

b1-up(5′GC AGATCTCATGAGTTTGGAAAGCTTAACCGTTC-3′)，

b1-down(5′CG CTCGAGAAACAGCTCATCAT TCACGTACATTG-3′)，

上游引物引入BglII位点，下游引物引入XhoI位点，5’端各引入两个酶切位点保护碱基。经PCR扩增得到的opd基因和b1基因分别插入双表达载体pETDuet的多克隆位点，并且保证两个基因阅读框正确。opd基因自身具有完整的开放阅读框，并且与载体上的His-Tag融合表达。b1基因自带起始密码子，它的终止密码子克隆时被缺失，在载体上与S-Tag序列正确通读，使用载体上自带的终止密码子，使表达的B1蛋白携带有S-Tag标签。两个基因均带有融合标签，以利于表达产物的检测和纯化。

构建程序如图3所示，经过克隆程序，得到融合表达载体pETDuet-b1-opd。

1.5转化大肠杆菌BL-21(DE3)和诱导表达

将构建得到的表达载体pETDuet-b1-opd参照pET System Manual的转化程序转化到大肠杆菌BL-21(DE3)，得到重组菌株。从新鲜转化的平板分别挑取此重组菌株的单克隆菌落，加入含50μg/ml氨苄青霉素的2ml LB培养基37℃震荡培养8-10小时，然后将2ml培养液注入50ml含氨苄青霉素的培养液继续培养。当细胞的浓度OD₆₀₀＝0.6时加入500μl IPTG(浓度为100mM)使IPTG终浓度为1mM，在14～25℃诱导16～22小时，得到本发明的超级工程菌。

由超级工程菌制得解毒酶的方法：将经过IPTG(浓度为100mM)在14～25℃诱导16～22小时而得到的上述超级工程菌培养液，在5000xg离心5分钟收集经诱导的超级工程菌，重新用PBS调节细菌的浓度为OD₆₀₀＝1,5000xg离心5分钟重新收集细胞，再次加入1/10体积(OD₆₀₀＝1)的PBS，使菌液浓缩倍数为10x，细菌菌液中加入溶菌酶使其终浓度为100μg/ml，加入1/10体积的1％Triton X-100，30℃温浴15分钟，在冰浴条件下超声波裂解处理，再离心去除沉淀，其上清液即为本发明的超级工程菌表达的解毒酶(B1-OPH)粗酶液。

以同样的方法分别构建融合表达载体pETDuet-b1和pETDuet-opd，并转化到大肠杆菌，，分别得到解毒酯酶基因工程菌(b1)和水解酶基因工程菌(opd)，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，分别表达得到解毒酯酶B1和水解酶OPH。

如图4所示的各种菌在E.Coli BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE分析图可知超级工程菌诱导表达产生的解毒酶的效率与解毒酯酶基因工程菌(b1)和水解酶基因工程菌(opd)单独表达的效率是一致的，既超级工程菌有效地达到了解毒酯酶基因工程菌(b1)和水解酶基因工程菌(opd)两者共有的作用。这样就可以用一次诱导表达发酵培养的时间同时得到2种解毒酶，从而大大减少了诱导表达发酵培养生产工程菌所需要的各种原材料，缩短时间，节约能源，降低成本。

实施例2、本发明的超级工程菌对马拉硫磷的降解作用

在100ml三角瓶中加入20ml水，1ml 2％TritonX-100，5μl(165μg)马拉硫磷，将其充分混匀后，加入固定化的超级工程菌基因的细胞小球后，置30℃摇床摇动。每隔一段时间取出1ml处理液置于5ml试管中，加入1ml重蒸正己烷，在混旋器上振荡3min充分混匀、提取，然后于6500rpm离心15min，取上清液，重复提取一次，将取出的上清液合并后使用气相色谱仪和氮磷检测器测定不同时间正己烷提取液中马拉硫磷的残留量的含量，以检测超级工程菌对马拉硫磷的降解速率，具体测试条件如下：使用惠普5890 II型气相色谱仪，色谱柱30m×0.53mm×0.5μm(膜厚)的BPX-50毛细管柱；柱温230℃；进样口温度250℃；监测器温度300℃；载气(N₂)30.1ml/min，空气81.94ml/min，氢气3.2ml/min；进样量1μl。其实验结果列于表1。

以同样的方法测试转水解酶基因的工程菌、转解毒酯酶基因的工程菌以及转空质粒的菌(作为对照)对马拉硫磷的降解速率，实验结果列于表1。

表1、各种菌对马拉硫磷的降解后的残留量

时间超级工程菌转水解酶基因转解毒酯酶基转空质粒的菌

(min) (mg/kg) 的工程菌因的工程菌 (mg/kg)

(mg/kg) (mg/kg)

0 9.6898 9.4456 9.4691 9.4022

15 6.5872 8.3572 7.3742 8.8906

30 3.2341 7.5623 4.8896 8.5337

45 1.8923 6.9345 3.7766 8.0747

60 0.8234 5.4698 2.8121 7.7071

75 0.3563 4.6988 1.6859 7.3523

90 0.1268 4.2456 1.3208 7.0607

表2、各种菌对马拉硫磷的降解效率

时间超级工程菌转水解酶基因的转解毒酯酶基因的

(min) (％) 工程菌(％) 工程菌(％)

15 31.2 10.6 21.3

30 67.0 19.1 48.3

45 80.5 26.6 60.1

60 91.5 41.8 70.4

90 98.8 54.8 86.1

由表1和表2的数据可见，本发明提供的超级工程菌降解马拉硫磷的效率比转水解酶基因的工程菌和转解毒酯酶基因的工程菌的降解效率都高，在15min时超级工程菌比转水解酶基因的工程菌和转解毒酯酶基因的工程菌分别高20.6％和9.9％；在90min时超级工程菌比转水解酶基因的工程菌和转解毒酯酶基因的工程菌分别高44％％和12.7％.从而可以得出结论：超级工程菌用一次诱导表达发酵培养的时间同时得到2种解毒酶，b1+opd共表达后有一定的增效地作用，在大大减少了诱导表达发酵培养生产工程菌所需要的各种原材料，缩短时间，节约能源，降低成本的同时，其诱导产生的解毒酶的活性均高于转单基因的工程菌，这样便可以提高在单位时间内大大降解毒物的速率，在处理水污染时将可以有效降低运行的成本，减少开支。

实施例3、实验鸡的敌敌畏中毒的解毒实验

成年来航母鸡(Gallus gallus)(12月龄，鸡重约1.5kg左右)购自北京农业大学实验鸡场，鸡购回后单独喂养，至少适应环境一周后才开始试验。自由取食和饮水，实验期间，鸡舍温度控制在20℃左右，每天光照约10h。实验鸡分成4组：

实验一组：同时给予敌敌畏(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)和表达解毒酯酶基因工程菌(0.5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；

实验二组，先给予敌敌畏(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)，40min后给予表达解毒酯酶基因工程菌(0.5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；

实验三组：同时给予敌敌畏(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)和表达解毒酯酶基因和水解酶基因的超级工程菌(0.5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；

实验四组：先给予敌敌畏(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)，40min后给予表达解毒酯酶基因和水解酶基因超级工程菌(0.5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；

对照一组只给予敌敌畏(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)；

对照二组同时给予敌敌畏(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)和转空质粒的超级工程菌(0.5g湿菌体装入空胶囊中，口服)。

给药后密切观察被试鸡的急性中毒情况，在给药后10天称重，处死被试鸡。

实验鸡按170mg/kg体重给予敌敌畏后，实验二组、四组和对照组约在40min内出现了急性中毒症状。实验一组、三组症状较轻，没有明显急性中毒和迟发性神经毒性症状，在给转解毒酯酶基因和水解酶基因超级工程菌3h后逐渐恢复正常；实验二组、四组出现的急性中毒症状为衰弱无力，口吐粘液，给予转解毒酯酶基因和水解酶基因超级工程菌后症状开始减轻，直至恢复正常，没有明显迟发性神经毒性症状。实验结束时，实验组鸡的体重没有明显下降。

对照一组和对照二组都出现了严重的急性中毒症状和迟发性神经毒性症状，部分实验鸡死亡，存活的实验鸡出现了不同程度的迟发性神经毒性症状，体重显著下降。

其实验结果表明鸡敌敌畏的中毒非常快，如果及时给予转解毒酯酶基因工程菌或给予转解毒酯酶基因和水解酶基因超级工程菌解毒的话，实验用鸡则没有明显急性中毒和迟发性神经毒性症状；如果给敌敌畏40分钟后再给转解毒酯酶基因工程菌或给转解毒酯酶和水解酶基因超级工程菌，那么，鸡将会出现一定程度的急性中毒症状；但是如果继续给予转解毒酯酶基因工程菌或给转解毒酯酶和水解酶基因超级工程菌，中毒的鸡还可以恢复正常。并由此得出转解毒酯酶基因工程菌或给转解毒酯酶和水解酶基因超级工程菌可以降解鸡体内的敌敌畏，从而使鸡不中毒结论。

实施例4、用4龄蚊幼虫测定本发明的解毒酶对对硫磷的降解作用

在一次性使用的塑料杯中加50ml水，加入足量的可以杀死4龄蚊幼虫的对硫磷化合物，在实验杯子中加入20ul实施例1制得的解毒酶，对照杯子中只加入待测对硫磷化合物，每个实验设3个重复，30min后分别加入20头4龄蚊幼虫，24小时后检测结果。由于解毒酶可以将对硫磷降解，所以加入解毒酶杯子的蚊幼虫不能被对硫磷杀死，没有加解毒酶的杯子的蚊幼虫册全部被杀死。

由此实验结果说明，该解毒酶可以有效降解对硫磷，从而使对硫磷失去对蚊幼虫的毒杀作用。从试验得知，用同等剂量的b1或opd基因表达的解毒酶不能够如此快速高效地降解对硫磷，而转b1+opd基因的超级工程菌研制的解毒酶可以迅速高效地降解对硫磷，从而使蚊幼虫不能被对硫磷杀死。

从以上结果可知只有转b1+opd基因的超级工程菌研制的解毒酶可以快速降解对硫磷，b1+opd共表达后有一定的增效地作用，通过本实验能让我们更直观地了解双转基因的效率、效果。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院动物研究所

<120>一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用

<130>PI04136

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1110

<212>DNA

<213>Flavobacterium sp.

<220>

<221>CDS

<222>(8)..(1102)

<223>

<400>1

ggatccc atg caa acg aga agg gtt gtg ctc aag tct gcg gcc gcc gca 49

Met Gln Thr Arg Arg Val Val Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala

1 5 10

gga act ctg ctc ggc ggc ctg gct ggg tgc gcg agc gtg gct gga tcg 97

Gly Thr Leu Leu Gly Gly Leu Ala Gly Cys Ala Ser Val Ala Gly Ser

15 20 25 30

atc ggc aca ggc gat cgg atc aat acc gtg cgc ggt cct atc aca atc 145

Ile Gly Thr Gly Asp Arg Ile Asn Thr Val Arg Gly Pro Ile Thr Ile

35 40 45

tct gaa gcg ggt ttc aca ctg act cac gag cac atc tac ggc agc tcg 193

Ser Glu Ala Gly Phe Thr Leu Thr His Glu His Ile Tyr Gly Ser Ser

50 55 60

gca gga ttc ttg cgt gct tgg cca gag ttc ttc ggt agc cgc aaa gct 241

Ala Gly Phe Leu Arg Ala Trp Pro Glu Phe Phe Gly Ser Arg Lys Ala

65 70 75

cta gcg gaa aag gct gtg aga gga ttg cgc cgc gcc aga gcg gct ggc 289

Leu Ala Glu Lys Ala Val Arg Gly Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala Gly

80 85 90

gtg cga acg att gtc gat gtg tcg act ttc gat atc ggt cgc gac gtc 337

Val Arg Thr Ile Val Asp Val Ser Thr Phe Asp Ile Gly Arg Asp Val

95 100 105 110

agt tta ttg gcc gag gtt tcg cgg gct gcc gac gtt cat atc gtg gcg 385

Ser Leu Leu Ala Glu Val Ser Arg Ala Ala Asp Val His Ile Val Ala

115 120 125

gcg acc ggc ttg tgg ttc gac ccg cca ctt tcg atg cga ttg agg agt 433

Ala Thr Gly Leu Trp Phe Asp Pro Pro Leu Ser Met Arg Leu Arg Ser

130 135 140

gta gag gaa ctc aca cag ttc ttc ctg cgt gag att caa tat ggc atc 481

Val Glu Glu Leu Thr Gln Phe Phe Leu Arg Glu Ile Gln Tyr Gly Ile

145 150 155

gaa gac acc gga att agg gcg ggc att atc aag gtc gcg acc aca ggc 529

Glu Asp Thr Gly Ile Arg Ala Gly Ile Ile Lys Val Ala Thr Thr Gly

160 165 170

aag gcg acc ccc ttt cag gag tta gtg tta aag gcg gcc gcc cgg gcc 577

Lys Ala Thr Pro Phe Gln Glu Leu Val Leu Lys Ala Ala Ala Arg Ala

175 180 185 190

agc ttg gcc acc ggt gtt ccg gta acc act cac acg gca gca agt cag 625

Ser Leu Ala Thr Gly Val Pro Val Thr Thr His Thr Ala Ala Ser Gln

195 200 205

cgc gat ggt gag cag cag gcc gcc att ttt gag tcc gaa ggc ttg agc 673

Arg Asp Gly Glu Gln Gln Ala Ala Ile Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ser

210 215 220

ccc tca cgg gtt tgt att ggt cac agc gat gat act gac gat ttg agc 721

Pro Ser Arg Val Cys Ile Gly His Ser Asp Asp Thr Asp Asp Leu Ser

225 230 235

tat ctc acc gcc ctc gct gcg cgc gga tac ctc atc ggt cta gac cac 769

Tyr Leu Thr Ala Leu Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Ile Gly Leu Asp His

240 245 250

atc ccg cac agt gcg att ggt cta gaa gat aat gcg agt gca tca gcc 817

Ile Pro His Ser Ala Ile Gly Leu Glu Asp Asn Ala Ser Ala Ser Ala

255 260 265 270

ctc ctg ggc atc cgt tcg tgg caa aca cgg gct ctc ttg atc aag gcg 865

Leu Leu Gly Ile Arg Ser Trp Gln Thr Arg Ala Leu Leu Ile Lys Ala

275 280 285

ctc atc gac caa ggc tac atg aaa caa atc ctc gtt tcg aat gac tgg 913

Leu Ile Asp Gln Gly Tyr Met Lys Gln Ile Leu Val Ser Asn Asp Trp

290 295 300

ctg ttc ggg ttt tcg agc tat gtc acc aac atc atg gac gtg atg gat 961

Leu Phe Gly Phe Ser Ser Tyr Val Thr Asn Ile Met Asp Val Met Asp

305 310 315

cgc gtg aac ccc gac ggg atg gcc ttc att cca ctg aga gtg atc cca 1009

Arg Val Asn Pro Asp Gly Met Ala Phe Ile Pro Leu Arg Val Ile Pro

320 325 330

ttc cta cga gag aag ggc gtc cca cag gaa acg ctg gca ggc atc act 1057

Phe Leu Arg Glu Lys Gly Val Pro Gln Glu Thr Leu Ala Gly Ile Thr

335 340 345 350

gtg act aac ccg gcg cgg ttc ttg tca ccg acc ttg cgg gcg tca 1102

Val Thr Asn Pro Ala Arg Phe Leu Ser Pro Thr Leu Arg Ala Ser

355 360 365

tgaagctt 1110

<210> 2

<211> 365

<212> PRT

<213> Flavobacterium sp.

<400> 2

Met Gln Thr Arg Arg Val Val Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala Gly Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Leu Ala Gly Cys Ala Ser Val Ala Gly Ser Ile Gly

20 25 30

Thr Gly Asp Arg Ile Asn Thr Val Arg Gly Pro Ile Thr Ile Ser Glu

35 40 45

Ala Gly Phe Thr Leu Thr His Glu His Ile Tyr Gly Ser Ser Ala Gly

50 55 60

Phe Leu Arg Ala Trp Pro Glu Phe Phe Gly Ser Arg Lys Ala Leu Ala

65 70 75 80

Glu Lys Ala Val Arg Gly Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala Gly Val Arg

85 90 95

Thr Ile Val Asp Val Ser Thr Phe Asp Ile Gly Arg Asp Val Ser Leu

100 105 110

Leu Ala Glu Val Ser Arg Ala Ala Asp Val His Ile Val Ala Ala Thr

115 120 125

Gly Leu Trp Phe Asp Pro Pro Leu Ser Met Arg Leu Arg Ser Val Glu

130 135 140

Glu Leu Thr Gln Phe Phe Leu Arg Glu Ile Gln Tyr Gly Ile Glu Asp

145 150 155 160

Thr Gly Ile Arg Ala Gly Ile Ile Lys Val Ala Thr Thr Gly Lys Ala

165 170 175

Thr Pro Phe Gln Glu Leu Val Leu Lys Ala Ala Ala Arg Ala Ser Leu

180 185 190

Ala Thr Gly Val Pro Val Thr Thr His Thr Ala Ala Ser Gln Arg Asp

195 200 205

Gly Glu Gln Gln Ala Ala Ile Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ser Pro Ser

210 215 220

Arg Val Cys Ile Gly His Ser Asp Asp Thr Asp Asp Leu Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Thr Ala Leu Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Ile Gly Leu Asp His Ile Pro

245 250 255

His Ser Ala Ile Gly Leu Glu Asp Asn Ala Ser Ala Ser Ala Leu Leu

260 265 270

Gly Ile Arg Ser Trp Gln Thr Arg Ala Leu Leu Ile Lys Ala Leu Ile

275 280 285

Asp Gln Gly Tyr Met Lys Gln Ile Leu Val Ser Asn Asp Trp Leu Phe

290 295 300

Gly Phe Ser Ser Tyr Val Thr Asn Ile Met Asp Val Met Asp Arg Val

305 310 315 320

Asn Pro Asp Gly Met Ala Phe Ile Pro Leu Arg Val Ile Pro Phe Leu

325 330 335

Arg Glu Lys Gly Val Pro Gln Glu Thr Leu Ala Gly Ile Thr Val Thr

340 345 350

Asn Pro Ala Arg Phe Leu Ser Pro Thr Leu Arg Ala Ser

355 360 365

<210> 3

<211> 1633

<212> DNA

<213> Culex quinquefasciatus

<220>

<221> CDS

<222> (8)..(1633)

<223>

<400> 3

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1 5 10

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Val Arg Gly Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Gly Gln Glu Tyr Val Ser

15 20 25 30

ttt cag gga att ccg tac gcc cgg gca ccg gaa ggg gag ctg cgg ttt 145

Phe Gln Gly Ile Pro Tyr Ala Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Arg Phe

35 40 45

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Lys Ala Pro Val Pro Pro Gln Lys Trp Thr Glu Thr Leu Asp Cys Thr

50 55 60

cag caa tgc gag ccc tgc tat cac ttc gac cgg cgc ctc cag aag atc 241

Gln Gln Cys Glu Pro Cys Tyr His Phe Asp Arg Arg Leu Gln Lys Ile

65 70 75

gtc ggc tgc gag gac agt ctg aag atc aac gtg ttt gcg aag gag atc 289

Val Gly Cys Glu Asp Ser Leu Lys Ile Asn Val Phe Ala Lys Glu Ile

80 85 90

aac cct tca acc cct ctt ccg gtg atg ctg tac atc tac ggc ggg ggc 337

Asn Pro Ser Thr Pro Leu Pro Val Met Leu Tyr Ile Tyr Gly Gly Gly

95 100 105 110

ttc acg gaa gga acc agc gga acc gaa ctg tac ggg ccg gat ttc ctg 385

Phe Thr Glu Gly Thr Ser Gly Thr Glu Leu Tyr Gly Pro Asp Phe Leu

115 120 125

gtt cag aag gat atc gtg ttg gtg tcg ttc aat tac cgt att ggg gcg 433

Val Gln Lys Asp Ile Val Leu Val Ser Phe Asn Tyr Arg Ile Gly Ala

130 135 140

tta ggt ttt ctg tgt tgt caa tcg gag cag gat ggc gta ccc ggt aat 481

Leu Gly Phe Leu Cys Cys Gln Ser Glu Gln Asp Gly Val Pro Gly Asn

145 150 155

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Ala Gly Leu Lys Asp Gln Asn Leu Ala Ile Arg Trp Val Leu Glu Asn

160 165 170

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Ile Ala Ala Leu Gly Gly Asp Pro Lys Arg Val Thr Leu Ala Gly His

175 180 185 190

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Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Gln Tyr His Leu Ile Ser Asp Ala Ser

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235

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Ala Ile Gly Trp Asp Gly Gln Gly Gly Glu Ser Gly Ala Leu Arg Phe

240 245 250

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Leu Arg Arg Ala Lys Pro Glu Asp Ile Val Ala His Gln Glu Lys Leu

255 260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Phe Glu Met Ala Arg Thr Ala Trp Gly Asp Lys Ile Asp Ile Met Ile

305 310 315

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320 325 330

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335 340 345 350

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355 360 365

ctg aaa caa cgt tac tac ccc gac agc att cct tca atg gag aac aac 1153

Leu Lys Gln Arg Tyr Tyr Pro Asp Ser Ile Pro Ser Met Glu Asn Asn

370 375 380

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Leu Gly Tyr Val His Met Met Ser Asp Arg Val Phe Trp His Gly Leu

385 390 395

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400 405 410

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415 420 425 430

atg atg atc gac ccg aag ctg cgc ggc acg gcc cat gcc gac gag ctg 1345

Met Met Ile Asp Pro Lys Leu Arg Gly Thr Ala His Ala Asp Glu Leu

435 440 445

tcc tat ctg ttt tcc aac ttt acc cag cag gtc ccc ggc aag gaa acg 1393

Ser Tyr Leu Phe Ser Asn Phe Thr Gln Gln Val Pro Gly Lys Glu Thr

450 455 460

ttc gag tac cgc ggt ctg caa acg ctg gtc gat gtg ttc agc gcg ttc 1441

Phe Glu Tyr Arg Gly Leu Gln Thr Leu Val Asp Val Phe Ser Ala Phe

465 470 475

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Val Ile Asn Gly Asp Pro Asn Cys Gly Met Thr Ala Lys Gly Gly Val

480 485 490

gtc ttt gag ccg aac gcg cag acg aag ccc acg ttc aag tgt ctg gac 1537

Val Phe Glu Pro Asn Ala Gln Thr Lys Pro Thr Phe Lys Cys Leu Asp

495 500 505 510

att gcc aac gac ggg gtg gcg ttc gtt gac tat ccg gat gcg gac cgg 1585

Ile Ala Asn Asp Gly Val Ala Phe Val Asp Tyr Pro Asp Ala Asp Arg

515 520 525

ttg gac atg tgg gac gca atg tac gtg aat gat gag ctg ttt ctc gag 1633

Leu Asp Met Trp Asp Ala Met Tyr Val Asn Asp Glu Leu Phe Leu Glu

530 535 540

<210> 4

<211> 542

<212> PRT

<213> Culex quinquefasciatus

<400> 4

Met Ser Leu Glu Ser Leu Thr Val Gln Thr Lys Tyr Gly Pro Val Arg

1 5 10 15

Gly Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Gly Gln Glu Tyr Val Ser Phe Gln

20 25 30

Gly Ile Pro Tyr Ala Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala

35 40 45

Pro Val Pro Pro Gln Lys Trp Thr Glu Thr Leu Asp Cys Thr Gln Gln

50 55 60

Cys Glu Pro Cys Tyr His Phe Asp Arg Arg Leu Gln Lys Ile Val Gly

65 70 75 80

Cys Glu Asp Ser Leu Lys Ile Asn Val Phe Ala Lys Glu Ile Asn Pro

85 90 95

Ser Thr Pro Leu Pro Val Met Leu Tyr Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Thr

100 105 110

Glu Gly Thr Ser Gly Thr Glu Leu Tyr Gly Pro Asp Phe Leu Val Gln

115 120 125

Lys Asp Ile Val Leu Val Ser Phe Asn Tyr Arg Ile Gly Ala Leu Gly

130 135 140

Phe Leu Cys Cys Gln Ser Glu Gln Asp Gly Val Pro Gly Asn Ala Gly

145 150 155 160

Leu Lys Asp Gln Asn Leu Ala Ile Arg Trp Val Leu Glu Asn Ile Ala

165 170 175

Ala Leu Gly Gly Asp Pro Lys Arg Val Thr Leu Ala Gly His Ser Ala

180 185 190

Gly Ala Ala Ser Val Gln Tyr His Leu Ile Ser Asp Ala Ser Lys Asp

195 200 205

Leu Phe Gln Arg Ala Ile Val Met Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Ser Trp

210 215 220

Ser Leu Thr Arg Gln Arg Asn Trp Val Glu Lys Leu Ala Lys Ala Ile

225 230 235 240

Gly Trp Asp Gly Gln Gly Gly Glu Ser Gly Ala Leu Arg Phe Leu Arg

245 250 255

Arg Ala Lys Pro Glu Asp Ile Val Ala His Gln Glu Lys Leu Leu Thr

260 265 270

Asp Gln Asp Met Gln Asp Asp Ile Phe Thr Pro Phe Gly Pro Thr Val

275 280 285

Glu Pro Tyr Leu Thr Glu Gln Cys Ile Ile Pro Lys Ala Pro Phe Glu

290 295 300

Met Ala Arg Thr Ala Trp Gly Asp Lys Ile Asp Ile Met Ile Gly Gly

305 310 315 320

Thr Ser Glu Glu Gly Leu Leu Leu Leu Gln Lys Ile Lys Leu His Pro

325 330 335

Glu Leu Leu Ser His Pro His Leu Phe Leu Gly Asn Val Pro Pro Asn

340 345 350

Leu Lys Ile Ser Met Glu Lys Arg Ile Glu Phe Ala Ala Lys Leu Lys

355 360 365

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370 375 380

Tyr Val His Met Met Ser Asp Arg Val Phe Trp His Gly Leu His Arg

385 390 395 400

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405 410 415

Arg Ile Cys Leu Asp Ser Glu Phe Tyr Asn His Tyr Arg Ile Met Met

420 425 430

Ile Asp Pro Lys Leu Arg Gly Thr Ala His Ala Asp Glu Leu Ser Tyr

435 440 445

Leu Phe Ser Asn Phe Thr Gln Gln Val Pro Gly Lys Glu Thr Phe Glu

450 455 460

Tyr Arg Gly Leu Gln Thr Leu Val Asp Val Phe Ser Ala Phe Val Ile

465 470 475 480

Asn Gly Asp Pro Asn Cys Gly Met Thr Ala Lys Gly Gly Val Val Phe

485 490 495

Glu Pro Asn Ala Gln Thr Lys Pro Thr Phe Lys Cys Leu Asp Ile Ala

500 505 510

Asn Asp Gly Val Ala Phe Val Asp Tyr Pro Asp Ala Asp Arg Leu Asp

515 520 525

Met Trp Asp Ala Met Tyr Val Asn Asp Glu Leu Phe Leu Glu

530 535 540

Claims

1、一种降解农药残留的超级工程菌，该超级工程菌含有编码解毒酯酶和水解酶的基因，能表达解毒酯酶和水解酶。

2、如权利要求1所述的降解农药残留的超级工程菌，其特征在于，所述的解毒酯酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(i)具有图1所述的氨基酸序列；或

3、如权利要求1所述的降解农药残留的超级工程菌，其特征在于，所述的水解酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(iii)具有图2所述的氨基酸序列；或

4、一种权利要求1所述的超级工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)按常规方法分别克隆解毒酯酶和水解酶的基因：

所述的解毒酯酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(i)具有图1所述的氨基酸序列；或

所述的水解酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(iii)具有图2所述的氨基酸序列；或

解毒酯酶基因的引物：

上游引物5′-GC AGATCTCATGAGTTTGGAAAGCTTAACCGTTC-3′

下游引物5′-CG CTCGAGAAACAGCTCATCAT TCACGTACATTG-3′

水解酶基因的引物：

上游引物5′-AC GGATCCCATGCAAACGAGAAGGG-3′

下游引物5′-GT AAGCTTCATG ACGCCCGCAAGG-3′

5’-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3’和

5’-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3’；

将带有NC接头的水解酶基因opd的上游引物引入双表达载体pETDuet的BamHI位点，下游引物引入双表达载体pETDuet的HindIII位点，5’端各引入两个酶切位点保护碱基；将带有NC接头的解毒酶基因b1的上游引物引入双表达载体pETDuet的BglII位点，下游引物引入双表达载体pETDuet的XhoI位点，5’端各引入两个酶切位点保护碱基；经PCR扩增得到的解毒酯酶和水解酶的基因分别插入双表达载体pETDuet的第一和第二多克隆位点，构建得到融合表达载体pETDuet-b1-opd；

3)转化重组菌株并进行诱导培养：

将步骤2)构建得到的表达载体pETDuet-b1-opd转化到大肠杆菌，得到重组菌株；将此重组菌株用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，在14～25℃诱导16～22小时，得到本发明的超级工程菌。

5、如权利要求4所述的超级工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤1)为分别从抗双硫磷致倦库蚊的蚊虫中克隆得到全长解毒酯酶b1基因，和从细菌中克隆得到全长水解酶opd基因；所述的解毒酯酶b1为具有图1所述的氨基酸序列的蛋白质；所述的水解酶opd为具有图2所述的氨基酸序列的蛋白质。

6、一种由权利要求1所述的超级工程菌表达的解毒酶，其为由如下的方法得到的：将上述超级工程菌的培养液，在5000xg离心5分钟，收集经诱导的超级工程菌，重新用PBS调节细菌的浓度为OD₆₀₀＝1,5000xg离心，5分钟重新收集细胞，再次加入培养液的1/10的体积的PBS，10倍浓缩菌液，细菌菌液中加入溶菌酶使其终浓度为100μg/ml，加入1/10体积的1％Triton X-100，30℃温浴15分钟，在冰浴条件下超声波裂解处理，再离心去除沉淀，得到的上清液即为本发明的超级工程菌表达的解毒酶。

7、一种权利要求1所述的降解农药残留的超级工程菌的用途，该超级工程菌可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。

8、一种权利要求6所述的解毒酶的用途，该解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。