CN101619307B

CN101619307B - Estp突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法

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Publication number: CN101619307B
Application number: CN200810043591A
Authority: CN
Inventors: 杨柏成
Original assignee: SHANGHAI UNI BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Shanghai Putianxin Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2008-07-03
Filing date: 2008-07-03
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2028-07-03
Also published as: CN101619307A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及Estp突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法。本发明公开了一种Estp突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白质；(b)至少与(a)中的氨基酸序列35％同源性且具有水解的疏水酯类杀虫剂或毒素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所述的蛋白。与现有的Estp蛋白比较，本发明所述的Estp突变体蛋白活性更高，能有效水解的疏水酯类杀虫剂或毒素，并且稳定、易复性，可开发为工业应用低成本和高质量的酶制剂。这为解决疏水酯类杀虫剂或毒素残留或污染提供了新的选择。

Description

Estp突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及Estp突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法。

背景技术

拟除虫菊酯化合物为一种疏水酯类杀虫剂或毒素，是目前仅次于有机磷和氨基甲酸酯农药的一类杀虫剂，约占世界杀虫剂的20％。广谱性菊酯类农药如氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯在现代农业中广泛应用，其残留对生态环境产生了一定的影响。农药残留已成为突出的环境问题，越来越受到人们的关注。农药残留的去除方法主要有生物降解、物理方法、化学方法等，其中生物降解是指通过生物(包括各种微生物、植物和动物)的作用将大分子分解成小分子化合物的过程。生物降解因不带入二次污染、条件温和，而越来越受到重视，已成为当前食品安全领域的研究热点。化学农药的生物降解主要是通过微生物、降解酶、工程菌、植物来进行，其中降解酶往往比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，而且酶的降解效果远胜于微生物本身，尤其是在残留农药质量浓度低的情况下。

现在疏水酯类杀虫剂或毒素如拟除虫菊酯类农药的使用越来越为广泛，因而其残留问题也凸显了出来。但到目前为止，发现的菊酯降解酶(pyrethroid-hydrolyzingesterase，Estp)一般是羧酸酯酶，但其对拟除虫菊酯农药的水解能力相当有限。因此，寻找一种的酶蛋白和方法，能有效水解的疏水酯类杀虫剂或毒素，尤其是菊酯类农药，显得愈发重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是一种具有有效降解疏水酯类杀虫剂或毒素活性的蛋白。

为了解决上述问题

一方面，本发明公开了一种Estp突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；

(b)至少与(a)中的氨基酸序列35％同源性且具有水解的疏水酯类杀虫剂或毒素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所述的蛋白。

其中所述Estp突变体蛋白与SEQ ID NO.1所述氨基酸序列具有50％的同源性。更优选地，该Estp突变体蛋白与SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列具有90％的同源性。

在实施方案里，本发明(b)中所述Estp突变体蛋白优选自氨基酸序列如SEQ IDNO.2所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所述的蛋白、或氨基酸序列如SEQ ID NO.6所述的蛋白中之一，最优选为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述的蛋白。

一方面，本发明公开了一种多核苷酸分子，其特征在于该多核苷酸分子编码本发明所述Estp突变体蛋白。

一方面，本发明公开了一种包含本发明所述多核苷酸分子的重组表达载体。

一方面，本发明公开了一种包含本发明所述重组表达载体的转化体。

在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。

另一方面，本发明公开了一种本发明所述Estp突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

①Estp突变体蛋白表达载体的构建；

②Estp突变体蛋白转化体的制备；

③Estp突变体蛋白的表达；

④Estp突变体蛋白的纯化。

另一方面，本发明公开了一种降解疏水酯类杀虫剂或毒素的组合物，包括本发明所述Estp突变体蛋白和一种或多种可接受的载体。

另一方面，本发明公开了本发明所述Estp突变体蛋白在去除或降低疏水酯类杀虫剂或毒素残留或污染方面的用途。

特别优选的疏水酯类杀虫剂或毒素是拟除虫菊酯。该拟除虫菊酯可以是I型拟除虫菊酯或II型拟除虫菊酯。优选地，拟除虫菊酯是溴氰菊酯。

与现有的Estp蛋白比较，本发明所述的Estp突变体蛋白活性更高，能有效水解地疏水酯类杀虫剂或毒素，并且稳定、易复性，可开发为工业应用低成本和高质量的酶制剂。这为解决疏水酯类杀虫剂或毒素残留或污染提供了新的选择。

附图说明

图1.纯化后不同Estp突变体蛋白的电泳图。

图2.不同Estp突变体蛋白对溴氰菊酯的降解效果。

具体实施方式

下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。

疏水酯类杀虫剂或毒素可以是任何具有疏水性质、包含酯基并对活的生物体具有一定程度的毒性的分子。

拟除虫菊酯是除虫菊杀虫剂的合成类似物。例如，拟除虫菊酯包括(每种的常用名与The Pesticide Manual(第12版)一致)：苄氯菊酯、睛二氯苯醚菊酯、溴氢菊酯、氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、溴氰菊酯、醚菊酯、氯氟胺氰戊菊酯、杀灭菊酯、氟氯氰菊酯、氟酯菊酯、氟胺氰菊酯、乙氰菊酯、氯氟氰菊酯、七氟苯菊酯、氟氯菊酯、四氟菊酯、己体氟氰菊酯和氟溴醚菊酯。

I型拟除虫菊酯化合物(如苄氯菊酯)与II型拟除虫菊酯化合物的不同之处在于，II型化合物在苯氧基苄基部分的α-碳原子上具有氰基基团。II型拟除虫菊酯的一些实例为氯氰菊酯、嗅氰菊酯和睛二氯苯醚菊酯。能用本发明的方法水解的拟除虫菊酯杀虫剂的实例包括但不限于如下这些化合物：3-苯氧基苄基(1RS)-顺，反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸盐[苄氯菊酯〕，α-氰基-3-苯氧基苄基-1-(4-乙氧苯基)-2，2-二氯环丙烷羧酸盐[乙氰菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(RS)-2-(4-氯苯)-3-异戊酸盐[杀灭菊酯]，(S)-α-氰基-3-苯氧基苯基(S)-2-(4-氯苯)异戊酸盐[高氰戊菊酯]，α-氰基-3-苯氧基苄基(S)-2-(4-2氟甲氧苯基)异戊酸盐[氟氰戊菊酯]，α-氰基-3-苯氧基苄基2-(2-氯-4-三氟甲基苯氨)异戊酸盐[氟胺氰菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基2，2，3，3-四甲基环丙烷羧酸盐[甲氰菊酯]，3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-菊酸盐[d-拟除虫菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-菊酸盐[cyfenothrin]，(RS)3-烯丙基-2-甲基-4-环氧戊基-2-烯炔基(1RS)-顺，反-菊酸盐[丙烯除虫菊]，α-氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸盐[氯氰菊酯]，(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸盐[溴氰菊酯]，(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺-2，2-二甲基-3-(1，2，2，2-溴乙基)环丙烷羧酸盐[氟胺氰菊酯]，3，4，5，6-四氢化亚氨甲基(1RS)-顺，反-菊酸盐[胺菊酯]，5-苯基-3-氟-3-呋喃甲基(1RS)-顺，反-菊酸盐[灭虫菊]，α-氰基-4-氟-3-苯氧基苄基(1R，反)2，2二甲基3(2，2-二氯乙烯基)环丙烷羧酸盐[氟氯氰菊酯]。

Estp突变体蛋白

蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh，1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creation penalty＝5，gap extension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。

此处使用的术语“Estp突变体蛋白”是指天然存在的Estp蛋白的突变体，优选为Estp蛋白(ID：AAX93318)的突变体。相比于天然存在的Estp蛋白，Estp突变体蛋白保留了至少一些对疏水酯类杀虫剂或毒素的水解活性。优选地，该突变体与它们起源的天然存在的Estp蛋白相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。天然存在的Estp蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最终的蛋白产品。

本发明涉及的方面还包括Estp突变体蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些修饰可以用来增加本发明Estp突变体蛋白的稳定性和/或生物活性。

Estp突变体蛋白的表达

本发明包括编码本发明的Estp突变体蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。

本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。

本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的Estp突变体蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。

用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F.Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates andWiley-Interscience(1992)和Sambrook et al.(1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。

已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3’，5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。

多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体久PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO，COS，NSO，293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。

为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase，GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-ChelatingSepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得可获得天然的目标蛋白。

本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。

通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al.，Basic Methods In MolecularBiology(1986)。

编码本发明的Estp突变体蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。

通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使用如Southem(1975)J.Mol.Biol.95，503或Berent et al(1985)Biotech.3，208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。

通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的Estp突变体蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。

在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的Estp突变体蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的Estp突变体蛋白，所述层析柱有：Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose HighPerformance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAESepharose FF、Ni-Chelating Sepharose FF柱或Methyl柱等。

另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的Estp突变体蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的Estp突变体蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的Estp突变体蛋白。

组合物

组合物用于本发明或者含有本发明Estp突变体蛋白的组合物，包括赋形剂，此处也指“可接受的载体”。赋形剂是可以被处理的动物、植物、植物或动物材料、或环境(包括土壤或水样品)可进行处理的任何材料。这种赋形剂的例子包括水、盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液和其它生理平衡盐溶液。非水载体，如固态油、芝麻油、油酸乙酯或一甘油三酯都可以使用。其它有用的剂型包括含有粘度增强剂的悬浮液，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。赋形剂液可含有微量添加剂，如增强等渗压性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的例子包括硫柳汞或0-甲酚，福尔马林和苯甲醇。赋形剂也可用于增加组分的半衰期，例如，但不限于，聚合控释载体、生物可降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、其它细胞、油、酯和乙二醇。

此外，Estp突变体蛋白可被固化到一组分中，该组分可增加疏水酯类杀虫剂或毒素的降解率和/或降解度，或可增加蛋白的稳定性。所述固化方法如本领域技术人员所理解的，可参考W00064539公开了昆虫酯酶或其突变体能够固化在海绵或泡沫中使用的方法，它们的内容在此处完全引入。

本发明的一个实施方案是一种控释剂型，它能将含有Estp突变体蛋白的组分缓慢释放到动物、植物、动物或植物材料或环境(包括土壤和水样品)中。如此处所用，控释剂型配方是在一种控释载体中包含Estp突变体蛋白。合适的控释载体包括，但不限于，生物相容聚合物、其它聚合基质、胶囊、微囊剂、微粒、大丸剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂球(liposphere)和透皮输送体系。优选的控释剂型是生物降解的(即生物可侵蚀的)。

本发明优选的控释剂型能将Estp突变体蛋白释放到用疏水酯类杀虫剂或毒素喷射区域的土壤或水中。该剂型优选释放1至12个月的时间段。本发明优选的控释剂型能有效处理优选至少约1个月，更优选至少约3个月，甚至更优选至少约6个月，甚至更优选至少约9个月，甚至更优选至少约12个月。Estp突变体蛋白(或表达Estp突变体蛋白的转化体)的浓度要必须产生有效降解疏水酯类杀虫剂或毒素的组分，该浓度的选择取决于被净化样品的性质、样品中疏水酯类杀虫剂或毒素的浓度和组分的配方。组分中Estp突变体蛋白(或表达Estp突变体蛋白的转化体)的有效浓度可用本领域技术人员所了解的实验方法容易地确定。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。无需进一步描述，可以相信本领域技术人员可使用上文的描述和下文性的实施例来制备和利用本发明中检测到的改变并且实践所要求的方法。因此，下述工作实施例具体描述了本发明的某些实施方案，不能将其看成是对其余内容的限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

实施例1.Estp(1-627)突变体转化体的制备

1.Estp(1-627)突变体编码基因的制备

Estp野生型的基因是通过全基因合成获得的，在其5‘端加入了编码6×His标签EK酶位点的DNA序列(SEQ ID NO.8)，并克隆在pET30的Nde I和NotI位点之间。将Estp(1-627)突变体的正向引物(5’＞gcccatatggaattccaccatcaccatcac＜3’SEQID NO.9)和反向引物(5’＞ggcgcggccgcttactcgccattcttaattaatcg＜3’SEQ ID NO.10)用灭菌重蒸水溶解为终浓度为50μM。按以下体系组织反应(100μl体系)

按以下参数进行循环扩增：

94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s。共30个循环，最后一个循环延伸增加10min。

2.Estp(1-627)突变体的克隆

收集实施例1中扩增得到的各个反应体系，向体系中加入1/10体积的预冷乙酸钠(3M，pH5.2)，再加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃冰箱放置30min，沉淀DNA。4℃，12,000rpm离心15min将沉淀收集到管底。弃去上清，用70％乙醇洗沉淀。弃去上清，短暂离心后吸弃尽可能多的剩余液体，自然风干DNA。用20μl灭菌重蒸水重溶DNA。

按以下体系组织酶切反应体系(限制性内切酶购自Takara公司)。

10×buffer H 5μl

0.1％BSA 5μl

DNA(PCR产物) 20μl

Nde I(20u) 2μl

Not I(20u) 2μl

ddH₂O 16μl

同样的反应体系酶切消化pET30a(+)，37℃酶切消化4小时。

将酶切后的DNA用0.7％琼脂糖电泳分离，EB染色，紫外灯下切下含有对应大小片段的胶条。用胶回收试剂盒(MBI)回收DNA。

按以下体系组织连接反应(连接酶购自Progema公司)

10×连接酶缓冲液 1μl

pET30载体片段 1μl

DNA片段 7μl

T4 DNA连接酶(5u) 1μl

16℃连接过夜

用CaCl₂法制备TOP 10感受态细胞，取5μl连接产物用热冲击法转化TOP 10感受态细胞。转化产物涂布含卡那50μg/ml的LB平板，37℃培养箱培养14-18h。挑选分离良好的菌落接种于含卡那50μg/ml的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。用碱裂解法小量抽提质粒，按以下体系组织酶切反应。

10×buffer H 2μl

0.1％BSA 2μl

DNA 10μl

Nde I(20u) 1μl

Not I(20u) 1μl

ddH₂O 4μl

37℃酶切反应4小时，走0.7％TAE琼脂糖电泳检测，挑选插入片段大小合适的克隆，通过自动测序仪进一步测序鉴定，挑选序列正确的克隆。

实施例2-6.其它Estp突变体蛋白转化体的制备

Estp(1-540)突变体、Estp(1-450)突变体、Estp(1-364)突变体、Estp(98-364)突变体和Estp(183-364)突变体编码基因的制备中各自特异性引物如下：

除Estp(98-364)和Estp(183-364)突变体外，其它突变体的PCR扩增反应同上，只是将相应的正向和反向引物换为相应的正向和反向引物。

Estp(98-364)和Estp(183-364)突变体的PCR扩增分为两步，第一步由正向引物1和反向引物扩增，体系和条件同上。第二步由正向引物2和反向引物扩增，模板换为第一步扩增出来的产物，其余条件同上。

其它操作同实施例1。

实施例7.Estp突变体蛋白的诱导表达

用CaCl₂法制备BL21(DE3)感受态细胞。用碱裂解法分别提取实施例1-6中得到的重组质粒，热冲击法转化BL21(DE3)感受态细胞。转化产物涂布含卡那50μg/ml的LB平板，37℃培养箱培养14-18h。挑选分离良好的菌落接种于含卡那50μg/ml的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按1∶100转接于4L含同样抗生素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.8左右，加入IPTG至终浓度为0.5mM，转至30℃诱导表达4-6小时。取部分诱导后的产品电泳鉴定。同样的方法诱导野生型Estp表达。

实施例8.Estp突变体蛋白的分离纯化

4℃，6000rpm离心收集菌体，弃去上清液。按每克菌体湿重：20ml的比例用A液(50m M Tris-HCl，pH 8.0)重悬菌体，超声波破碎细胞。12,000rpm离心15min，收集上清。用A液平衡Ni-Chelating Sepharose FF，将离心后收集的上清上Ni-ChelatingSepharose FF柱，用A液洗平，再用0-100％B(50mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH8.0)对目的蛋白进行梯度洗脱.收集目的蛋白所在组份。用等体积A液稀释收集到的蛋白溶液，将稀释液上用A液预平衡的Q-Sepharose FF柱，用A液洗平，再用0-100％C(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0)对目的蛋白进行洗脱。收集目的蛋白所在的组分，电泳分析表明蛋白质的纯度已达到90％以上(见图1)。图1：M，分子量标准，1.野生型Estp，2.Estp(1-627)，3.Estp(1-540)，4.Estp(1-450)，5.Estp(1-364)，6.Estp(98-364)，7.Estp(183-364).分子量标准的大小(kDa)依次是(从上往下)116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4。

与Estp(183-364)突变体蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.1)比较，Estp(98-364)突变体蛋白(SEQ ID NO.2)同源性约为70％，Estp(1-364)突变体蛋白(SEQ ID NO.3)同源性约为50％，Estp(1-450)突变体蛋白(SEQ ID NO.4)同源性约为40％，Estp(1-540)突变体蛋白(SEQ ID NO.5)同源性约为35％，Estp(1-627)突变体蛋白(SEQ ID NO.6)同源性约为30％。

实施例9.Estp突变体蛋白降解溴氰菊酯的活性

用Bradford法测定蛋白的浓度，用50mMTris-HCl，pH8.0调整浓度为0.1mg/ml，用无水甲醇将溴氰菊酯纯药溶解为1mg/ml的溶液，按下述体系组织2个反应体系(5ml)。

1.对照体系

溴氰菊酯 0.1ml

蛋白溶液 0ml

50mM PB，pH7.0 4.9ml

2.反应体系

溴氰菊酯 0.1ml

蛋白溶液 0.1ml

50mM PB，pH7.0 4.8ml

37℃反应30分钟后，按GB/T 19648-2006用GC-MS检测反应体系中的溴氰菊酯浓度。以对照体系的峰面积为100.0％，按以下公式计算各反应体系中农药的降解百分比，

降解溴氰菊酯百分比＝(对照峰面积-样品峰面积)/对照峰面积×100％

结果见图2：1.Estp，2.Estp(1-627)突变体，3.Estp(1-540)突变体，4.Estp(1-450)突变体，5.Estp(1-364)突变体，6.Estp(98-364)突变体，7.Estp(183-364)突变体。

上述结果表明：与野生型的Estp蛋白(SEQ ID NO.7)比较，Estp突变体蛋白降解溴氰菊酯能力更强，活性更高。

实施例10.Estp突变体蛋白对农药降解的动物实验

按以下体系组织反应

1.对照体系

溴氰菊酯 0.1ml

酶溶液 0ml

50mM PB，pH7.0 4.9ml

2.反应体系

溴氰菊酯 0.1ml

酶溶液 0.1ml

50mM PB，pH7.0 4.8ml

37℃反应2h后，取两只2L的烧杯，各加入1L自来水。一只烧杯里加入0.5ml加有酶(Estp突变体蛋白)的反应产物，另一只加入0.5ml未加酶的反应产物，并混匀。挑选10只大小一致，活性较强的小龙虾，每只烧杯里放入5只龙虾，观察龙虾的生存情况。加入未用酶处理样品的烧杯中的龙虾，在3小时内全部死亡，而加入用酶处理样品的烧杯中的龙虾，24h后无一死亡。

实施例11.用Estp(183-364)突变体蛋白清除蔬菜上残留的农药

按常规使用方法向小青菜喷洒敌杀死。第二天一早，等露水干后采集小青菜。取3等份小青菜，每份500g。一等分不作任何处理，另外一等分用清水洗涤，第三等分按如下方式处理：

准备4L清水，将Estp(183-364)突变体蛋白作1∶1000稀释在清水中。把第三份蔬菜放入溶液中浸泡30分，取出后用清水洗净。

按GB/T 19648-2006检测蔬菜中残留的敌杀死含量，结果如下表

样品	未处理	清水洗涤	处理
				残留	2.6mg/kg	2.4mg/kg	0.5mg/kg

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

序列表

<110>上海普天欣生物技术有限公司

<120>Estp突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法

<130>序列表

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>182

<212>PRT

<213>Klebsiella sp.

<400>1

Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ala Lys Ile Pro Leu Pro Leu Arg Arg Gly

1 5 10 15

Lys Ala Val Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Ile Ser Arg Ile Cys Val Leu

20 25 30

Pro Glu Ser Arg Ser Ile Gln Arg Glu Gln Glu Asn Phe Thr Lys Leu

35 40 45

Arg Asp Lys Gly Ile Ala Leu Ser Lys Lys Asp Trp Gln Ala Lys Leu

50 55 60

Thr Thr Asp Glu Leu Ala Glu Gln Glu Lys Glu Arg Ala Thr Ile Asn

65 70 75 80

Lys Arg Leu Gly Tyr Phe Ala Thr Glu His Glu Lys Val Gly Ile Val

85 90 95

His Lys Ala Leu Glu Pro Lys Leu Lys Pro Phe Gln Gln Ile Glu Lys

100 105 110

Glu Trp Arg Gln Cys Lys Val Lys Ser Lys Ser Thr Phe Pro Asn Ser

115 120 125

Met Thr Phe Val Gln Asn Pro Ala Tyr Gln Ala Val His Ser Gly Phe

130 135 140

Lys Lys Leu Lys Glu Gln Ile Gly Leu Ala Asp Glu Asp Ile Leu Leu

145 150 155 160

Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Ile Gly Leu Val Asn Met Pro Leu Leu

165 170 175

Tyr Glu Arg Trp Cys Leu

180

<210>2

<211>267

<212>PRT

<213>Klebsiella sp.

<400>2

Glu Arg Leu Lys Lys Arg Phe Asp Thr Glu Val Ile Asn Ala Glu Leu

1 5 10 15

Ser Glu Gln Leu Ala Lys Ile Asn Val Asn Leu Ser Arg Ser Tyr Ser

20 25 30

Glu Lys Gly Tyr Leu Arg Leu Glu Lys Ala Thr Gly Ser Glu Asn Glu

35 40 45

Trp Trp Ala Lys Ile Lys Pro Ser Gln Asn Asp Asp Trp Gln Gln Phe

50 55 60

Glu Pro Asp Gly Tyr Thr Ile Phe Ser Ser Arg Asp His Tyr Ala Ser

65 70 75 80

Leu Phe Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ala Lys Ile Pro Leu

85 90 95

Pro Leu Arg Arg Gly Lys Ala Val Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Ile Ser

100 105 110

Arg Ile Cys Val Leu Pro Glu Ser Arg Ser Ile Gln Arg Glu Gln Glu

115 120 125

Asn Phe Thr Lys Leu Arg Asp Lys Gly Ile Ala Leu Ser Lys Lys Asp

130 135 140

Trp Gln Ala Lys Leu Thr Thr Asp Glu Leu Ala Glu Gln Glu Lys Glu

145 150 155 160

Arg Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Gly Tyr Phe Ala Thr Glu His Glu

165 170 175

Lys Val Gly Ile Val His Lys Ala Leu Glu Pro Lys Leu Lys Pro Phe

180 185 190

Gln Gln Ile Glu Lys Glu Trp Arg Gln Cys Lys Val Lys Ser Lys Ser

195 200 205

Thr Phe Pro Asn Ser Met Thr Phe Val Gln Asn Pro Ala Tyr Gln Ala

210 215 220

Val His Ser Gly Phe Lys Lys Leu Lys Glu Gln Ile Gly Leu Ala Asp

225 230 235 240

Glu Asp Ile Leu Leu Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Ile Gly Leu Val

245 250 255

Asn Met Pro Leu Leu Tyr Glu Arg Trp Cys Leu

260 265

<210>3

<211>364

<212>PRT

<213>Klebsiella sp.

<400>3

Met Glu Phe His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Met Glu

1 5 10 15

Ile Cys Thr Lys Gly Ser Arg Lys His Leu Thr Ser Arg Ala Ser Glu

20 25 30

Pro Ser Tyr Asn Val Pro Glu Asn Gln Tyr Val Leu Tyr Val Val Ser

35 40 45

Ser Thr Leu Ser Ile Val Lys Gln Leu Val Lys Val Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Lys Ser Arg Phe Ser Gly Ala Ile Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Asp

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asp Tyr Arg Ile Ile Asn Arg Asp Leu Val Val Lys Asp

85 90 95

Leu Glu Arg Leu Lys Lys Arg Phe Asp Thr Glu Val Ile Asn Ala Glu

100 105 110

Leu Ser Glu Gln Leu Ala Lys Ile Asn Val Asn Leu Ser Arg Ser Tyr

115 120 125

Ser Glu Lys Gly Tyr Leu Arg Leu Glu Lys Ala Thr Gly Ser Glu Asn

130 135 140

Glu Trp Trp Ala Lys Ile Lys Pro Ser Gln Asn Asp Asp Trp Gln Gln

145 150 155 160

Phe Glu Pro Asp Gly Tyr Thr Ile Phe Ser Ser Arg Asp His Tyr Ala

165 170 175

Ser Leu Phe Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ala Lys Ile Pro

180 185 190

Leu Pro Leu Arg Arg Gly Lys Ala Val Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Ile

195 200 205

Ser Arg Ile Cys Val Leu Pro Glu Ser Arg Ser Ile Gln Arg Glu Gln

210 215 220

Glu Asn Phe Thr Lys Leu Arg Asp Lys Gly Ile Ala Leu Ser Lys Lys

225 230 235 240

Asp Trp Gln Ala Lys Leu Thr Thr Asp Glu Leu Ala Glu Gln Glu Lys

245 250 255

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Gly Tyr Phe Ala Thr Glu His

260 265 270

Glu Lys Val Gly Ile Val His Lys Ala Leu Glu Pro Lys Leu Lys Pro

275 280 285

Phe Gln Gln Ile Glu Lys Glu Trp Arg Gln Cys Lys Val Lys Ser Lys

290 295 300

Ser Thr Phe Pro Asn Ser Met Thr Phe Val Gln Asn Pro Ala Tyr Gln

305 310 315 320

Ala Val His Ser Gly Phe Lys Lys Leu Lys Glu Gln Ile Gly Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Asp Ile Leu Leu Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Ile Gly Leu

340 345 350

Val Asn Met Pro Leu Leu Tyr Glu Arg Trp Cys Leu

355 360

<210>4

<211>450

<212>PRT

<213>Klebsiella sp.

<400>4

Met Glu Phe His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Met Glu

1 5 10 15

Ile Cys Thr Lys Gly Ser Arg Lys His Leu Thr Ser Arg Ala Ser Glu

20 25 30

Pro Ser Tyr Asn Val Pro Glu Asn Gln Tyr Val Leu Tyr Val Val Ser

35 40 45

Ser Thr Leu Ser Ile Val Lys Gln Leu Val Lys Val Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Lys Ser Arg Phe Ser Gly Ala Ile Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Asp

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asp Tyr Arg Ile Ile Asn Arg Asp Leu Val Val Lys Asp

85 90 95

Leu Glu Arg Leu Lys Lys Arg Phe Asp Thr Glu Val Ile Asn Ala Glu

100 105 110

Leu Ser Glu Gln Leu Ala Lys Ile Asn Val Asn Leu Ser Arg Ser Tyr

115 120 125

Ser Glu Lys Gly Tyr Leu Arg Leu Glu Lys Ala Thr Gly Ser Glu Asn

130 135 140

Glu Trp Trp Ala Lys Ile Lys Pro Ser Gln Asn Asp Asp Trp Gln Gln

145 150 155 160

Phe Glu Pro Asp Gly Tyr Thr Ile Phe Ser Ser Arg Asp His Tyr Ala

165 170 175

Ser Leu Phe Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ala Lys Ile Pro

180 185 190

Leu Pro Leu Arg Arg Gly Lys Ala Val Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Ile

195 200 205

Ser Arg Ile Cys Val Leu Pro Glu Ser Arg Ser Ile Gln Arg Glu Gln

210 215 220

Glu Asn Phe Thr Lys Leu Arg Asp Lys Gly Ile Ala Leu Ser Lys Lys

225 230 235 240

Asp Trp Gln Ala Lys Leu Thr Thr Asp Glu Leu Ala Glu Gln Glu Lys

245 250 255

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Gly Tyr Phe Ala Thr Glu His

260 265 270

Glu Lys Val Gly Ile Val His Lys Ala Leu Glu Pro Lys Leu Lys Pro

275 280 285

Phe Gln Gln Ile Glu Lys Glu Trp Arg Gln Cys Lys Val Lys Ser Lys

290 295 300

Ser Thr Phe Pro Asn Ser Met Thr Phe Val Gln Asn Pro Ala Tyr Gln

305 310 315 320

Ala Val His Ser Gly Phe Lys Lys Leu Lys Glu Gln Ile Gly Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Asp Ile Leu Leu Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Ile Gly Leu

340 345 350

Val Asn Met Pro Leu Leu Tyr Glu Arg Trp Cys Leu Leu Gln Ile Ile

355 360 365

Lys Val Leu Thr Gln Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Glu Asp Asn Trp Lys

370 375 380

Arg Lys Leu Ile Ala Asn Ile Gln Gly Asn Glu Glu Gln Ile Ser Ile

385 390 395 400

Gln Phe Phe Asn Pro Ser Val Ser Arg Ala Ile Thr Leu Gln Tyr Glu

405 410 415

Pro Phe Leu Ala Asn Gly Lys Arg Pro Asp Phe Val Leu Asp Val Glu

420 425 430

Ala Ile Thr Lys Ser Gly Asn Gln Ile Ser Lys Arg Leu Val Val Asp

435 440 445

Ala Lys

450

<210>5

<211>540

<212>PRT

<213>Klebsiella sp.

<400>5

Met Glu Phe His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Met Glu

1 5 10 15

Ile Cys Thr Lys Gly Ser Arg Lys His Leu Thr Ser Arg Ala Ser Glu

20 25 30

Pro Ser Tyr Asn Val Pro Glu Asn Gln Tyr Val Leu Tyr Val Val Ser

35 40 45

Ser Thr Leu Ser Ile Val Lys Gln Leu Val Lys Val Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Lys Ser Arg Phe Ser Gly Ala Ile Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Asp

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asp Tyr Arg Ile Ile Asn Arg Asp Leu Val Val Lys Asp

85 90 95

Leu Glu Arg Leu Lys Lys Arg Phe Asp Thr Glu Val Ile Asn Ala Glu

100 105 110

Leu Ser Glu Gln Leu Ala Lys Ile Asn Val Asn Leu Ser Arg Ser Tyr

115 120 125

Ser Glu Lys Gly Tyr Leu Arg Leu Glu Lys Ala Thr Gly Ser Glu Asn

130 135 140

Glu Trp Trp Ala Lys Ile Lys Pro Ser Gln Asn Asp Asp Trp Gln Gln

145 150 155 160

Phe Glu Pro Asp Gly Tyr Thr Ile Phe Ser Ser Arg Asp His Tyr Ala

165 170 175

Ser Leu Phe Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ala Lys Ile Pro

180 185 190

Leu Pro Leu Arg Arg Gly Lys Ala Val Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Ile

195 200 205

Ser Arg Ile Cys Val Leu Pro Glu Ser Arg Ser Ile Gln Arg Glu Gln

210 215 220

Glu Asn Phe Thr Lys Leu Arg Asp Lys Gly Ile Ala Leu Ser Lys Lys

225 230 235 240

Asp Trp Gln Ala Lys Leu Thr Thr Asp Glu Leu Ala Glu Gln Glu Lys

245 250 255

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Gly Tyr Phe Ala Thr Glu His

260 265 270

Glu Lys Val Gly Ile Val His Lys Ala Leu Glu Pro Lys Leu Lys Pro

275 280 285

Phe Gln Gln Ile Glu Lys Glu Trp Arg Gln Cys Lys Val Lys Ser Lys

290 295 300

Ser Thr Phe Pro Asn Ser Met Thr Phe Val Gln Asn Pro Ala Tyr Gln

305 310 315 320

Ala Val His Ser Gly Phe Lys Lys Leu Lys Glu Gln Ile Gly Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Asp Ile Leu Leu Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Ile Gly Leu

340 345 350

Val Asn Met Pro Leu Leu Tyr Glu Arg Trp Cys Leu Leu Gln Ile Ile

355 360 365

Lys Val Leu Thr Gln Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Glu Asp Asn Trp Lys

370 375 380

Arg Lys Leu Ile Ala Asn Ile Gln Gly Asn Glu Glu Gln Ile Ser Ile

385 390 395 400

Gln Phe Phe Asn Pro Ser Val Ser Arg Ala Ile Thr Leu Gln Tyr Glu

405 410 415

Pro Phe Leu Ala Asn Gly Lys Arg Pro Asp Phe Val Leu Asp Val Glu

420 425 430

Ala Ile Thr Lys Ser Gly Asn Gln Ile Ser Lys Arg Leu Val Val Asp

435 440 445

Ala Lys Tyr Tyr Ser Ala Ala Tyr Leu Lys Gln Arg Gly Gly Ile Gly

450 455 460

Gly Val Ile His Glu Leu Tyr Asn Gly Lys Asp Tyr Ser Glu Cys Gln

465 470 475 480

Glu Asn Ser Val Phe Val Leu His Pro Val Leu Asp Ala Val Glu Lys

485 490 495

Val Val Ser Pro Gln Glu Trp Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Gly Glu Leu

500 505 510

Ser Met Phe Asp Trp Glu Pro Ala His His Gln Arg Gln Ala Thr Asn

515 520 525

Tyr Gly Ala Val Cys Ala Asn Pro Met Lys Ser Gln

530 535 540

<210>6

<211>627

<212>PRT

<213>Klebsiella sp.

<400>6

Met Glu Phe His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Met Glu

1 5 10 15

Ile Cys Thr Lys Gly Ser Arg Lys His Leu Thr Ser Arg Ala Ser Glu

20 25 30

Pro Ser Tyr Asn Val Pro Glu Asn Gln Tyr Val Leu Tyr Val Val Ser

35 40 45

Ser Thr Leu Ser Ile Val Lys Gln Leu Val Lys Val Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Lys Ser Arg Phe Ser Gly Ala Ile Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Asp

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asp Tyr Arg Ile Ile Asn Arg Asp Leu Val Val Lys Asp

85 90 95

Leu Glu Arg Leu Lys Lys Arg Phe Asp Thr Glu Val Ile Asn Ala Glu

100 105 110

Leu Ser Glu Gln Leu Ala Lys Ile Asn Val Asn Leu Ser Arg Ser Tyr

115 120 125

Ser Glu Lys Gly Tyr Leu Arg Leu Glu Lys Ala Thr Gly Ser Glu Asn

130 135 140

Glu Trp Trp Ala Lys Ile Lys Pro Ser Gln Asn Asp Asp Trp Gln Gln

145 150 155 160

Phe Glu Pro Asp Gly Tyr Thr Ile Phe Ser Ser Arg Asp His Tyr Ala

165 170 175

Ser Leu Phe Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ala Lys Ile Pro

180 185 190

Leu Pro Leu Arg Arg Gly Lys Ala Val Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Ile

195 200 205

Ser Arg Ile Cys Val Leu Pro Glu Ser Arg Ser Ile Gln Arg Glu Gln

210 215 220

Glu Asn Phe Thr Lys Leu Arg Asp Lys Gly Ile Ala Leu Ser Lys Lys

225 230 235 240

Asp Trp Gln Ala Lys Leu Thr Thr Asp Glu Leu Ala Glu Gln Glu Lys

245 250 255

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Gly Tyr Phe Ala Thr Glu His

260 265 270

Glu Lys Val Gly Ile Val His Lys Ala Leu Glu Pro Lys Leu Lys Pro

275 280 285

Phe Gln Gln Ile Glu Lys Glu Trp Arg Gln Cys Lys Val Lys Ser Lys

290 295 300

Ser Thr Phe Pro Asn Ser Met Thr Phe Val Gln Asn Pro Ala Tyr Gln

305 310 315 320

Ala Val His Ser Gly Phe Lys Lys Leu Lys Glu GlnIle Gly Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Asp Ile Leu Leu Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Ile Gly Leu

340 345 350

Val Asn Met Pro Leu Leu Tyr Glu Arg Trp Cys Leu Leu Gln Ile Ile

355 360 365

Lys Val Leu Thr Gln Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Glu Asp Asn Trp Lys

370 375 380

Arg Lys Leu Ile Ala Asn Ile Gln Gly Asn Glu Glu Gln Ile Ser Ile

385 390 395 400

Gln Phe Phe Asn Pro Ser Val Ser Arg Ala Ile Thr Leu Gln Tyr Glu

405 410 415

Pro Phe Leu Ala Asn Gly Lys Arg Pro Asp Phe Val Leu Asp Val Glu

420 425 430

Ala Ile Thr Lys Ser Gly Asn Gln Ile Ser Lys Arg Leu Val Val Asp

435 440 445

Ala Lys Tyr Tyr Ser Ala Ala Tyr Leu Lys Gln Arg Gly Gly Ile Gly

450 455 460

Gly Val Ile His Glu Leu Tyr Asn Gly Lys Asp Tyr Ser Glu Cys Gln

465 470 475 480

Glu Asn Ser Val Phe Val Leu His Pro Val Leu Asp Ala Val Glu Lys

485 490 495

Val Val Ser Pro Gln Glu Trp Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Gly Glu Leu

500 505 510

Ser Met Phe Asp Trp Glu Pro Ala His His Gln Arg Gln Ala Thr Asn

515 520 525

Tyr Gly Ala Val Cys Ala Asn Pro Met Lys Ser Gln Arg Tyr Leu Asp

530 535 540

Glu Ile Gln Arg Met Leu Gly Met Phe Leu Gln Tyr Gly Ile Glu Asp

545 550 555 560

Asn Thr Ser Phe Arg Gly Ala Ser Asp Asp Thr His Ala Val Asn Phe

565 570 575

Cys Val Ser Cys Gly Ser Glu Lys Val Val Asp Val Thr Lys Ser Met

580 585 590

Ser Ser Asn Asn Gln Lys Arg Trp Tyr Arg Cys Asn Glu Cys Thr His

595 600 605

Phe Thr Val Tyr Thr His Cys Gly Thr Cys Asn Thr Arg Leu Ile Lys

610 615 620

Asn Gly Glu

625

<210>7

<211>637

<212>PRT

<213>Klebsiella sp.

<400>7

Met Glu Ile Cys Thr Lys Gly Ser Arg Lys His Leu Thr Ser Arg Ala

1 5 10 15

Ser Glu Pro Ser Tyr Asn Val Pro Glu Asn Gln Tyr Val Leu Tyr Val

20 25 30

Val Ser Ser Thr Leu Ser Ile Val Lys Gln Leu Val Lys Val Ala Glu

35 40 45

Ser Lys Lys Ser Arg Phe Ser Gly Ala Ile Glu Lys Leu Asn Glu Arg

50 55 60

Leu Asp Ser Leu Lys Asp Tyr Arg Ile Ile Asn Arg Asp Leu Val Val

65 70 75 80

Lys Asp Leu Glu Arg Leu Lys Lys Arg Phe Asp Thr Glu Val Ile Asn

85 90 95

Ala Glu Leu Ser Glu Gln Leu Ala Lys Ile Asn Val Asn Leu Ser Arg

100 105 110

Ser Tyr Ser Glu Lys Gly Tyr Leu Arg Leu Glu Lys Ala Thr Gly Ser

115 120 125

Glu Asn Glu Trp Trp Ala Lys Ile Lys Pro Ser Gln Asn Asp Asp Trp

130 135 140

Gln Gln Phe Glu Pro Asp Gly Tyr Thr Ile Phe Ser Ser Arg Asp His

145 150 155 160

Tyr Ala Ser Leu Phe Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ala Lys

165 170 175

Ile Pro Leu Pro Leu Arg Arg Gly Lys Ala Val Val Leu Tyr Pro Glu

180 185 190

Tyr Ile Ser Arg Ile Cys Val Leu Pro Glu Ser Arg Ser Ile Gln Arg

195 200 205

Glu Gln Glu Asn Phe Thr Lys Leu Arg Asp Lys Gly Ile Ala Leu Ser

210 215 220

Lys Lys Asp Trp Gln Ala Lys Leu Thr Thr Asp Glu Leu Ala Glu Gln

225 230 235 240

Glu Lys Glu Arg Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Gly Tyr Phe Ala Thr

245 250 255

Glu His Glu Lys Val Gly Ile Val His Lys Ala Leu Glu Pro Lys Leu

260 265 270

Lys Pro Phe Gln Gln Ile Glu Lys Glu Trp Arg Gln Cys Lys Val Lys

275 280 285

Ser Lys Ser Thr Phe Pro Asn Ser Met Thr Phe Val Gln Asn Pro Ala

290 295 300

Tyr Gln Ala Val His Ser Gly Phe Lys Lys Leu Lys Glu Gln Ile Gly

305 310 315 320

Leu Ala Asp Glu Asp Ile Leu Leu Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Ile

325 330 335

Gly Leu Val Asn Met Pro Leu Leu Tyr Glu Arg Trp Cys Leu Leu Gln

340 345 350

Ile Ile Lys Val Leu Thr Gln Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Glu Asp Asn

355 360 365

Trp Lys Arg Lys Leu Ile Ala Asn Ile Gln Gly Asn Glu Glu Gln Ile

370 375 380

Ser Ile Gln Phe Phe Asn Pro Ser Val Ser Arg Ala Ile Thr Leu Gln

385 390 395 400

Tyr Glu Pro Phe Leu Ala Asn Gly Lys Arg Pro Asp Phe Val Leu Asp

405 410 415

Val Glu Ala Ile Thr Lys Ser Gly Asn Gln Ile Ser Lys Arg Leu Val

420 425 430

Val Asp Ala Lys Tyr Tyr Ser Ala Ala Tyr Leu Lys Gln Arg Gly Gly

435 440 445

Ile Gly Gly Val Ile His Glu Leu Tyr Asn Gly Lys Asp Tyr Ser Glu

450 455 460

Cys Gln Glu Asn Ser Val Phe Val Leu His Pro Val Leu Asp Ala Val

465 470 475 480

Glu Lys Val Val Ser Pro Gln Glu Trp Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Gly

485 490 495

Glu Leu Ser Met Phe Asp Trp Glu Pro Ala His His Gln Arg Gln Ala

500 505 510

Thr Asn Tyr Gly Ala Val Cys Ala Asn Pro Met Lys Ser Gln Arg Tyr

515 520 525

Leu Asp Glu Ile Gln Arg Met Leu Gly Met Phe Leu Gln Tyr Gly Ile

530 535 540

Glu Asp Asn Thr Ser Phe Arg Gly Ala Ser Asp Asp Thr His Ala Val

545 550 555 560

Asn Phe Cys Val Ser Cys Gly Ser Glu Lys Val Val Asp Val Thr Lys

565 570 575

Ser Met Ser Ser Asn Asn Gln Lys Arg Trp Tyr Arg Cys Asn Glu Cys

580 585 590

Thr His Phe Thr Val Tyr Thr His Cys Gly Thr Cys Asn Thr Arg Leu

595 600 605

Ile Lys Asn Gly Glu Tyr Trp Thr Tyr Leu Ser Leu Met Pro Met Ser

610 615 620

Ser Ile Asn Ile Lys Cys Pro Asn Cys Glu Ser Pro Val

625 630 635

<210>8

<211>1967

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>artificial sequence

<400>8

catatggaat tccaccatca ccatcaccat gacgatgacg ataaaatgga gatttgtacc 60

aaaggttcgc gtaagcattt aacgagccgc gcatctgagc cgagttacaa cgtgccagaa 120

aaccagtatg tgctgtatgt ggtttcgagc acgctgagca ttgtaaagca attggttaag 180

gtggctgaga gcaaaaagag tcgtttttct ggggctattg aaaagctcaa tgagcgttta 240

gacagtttaa aagactatcg tattatcaac cgtgacctag tagttaaaga cttagaacga 300

cttaaaaagc gctttgatac agaagtaatc aatgccgagt tatcggaaca gttagcgaaa 360

atcaacgtta atctgtctcg aagttactct gaaaaaggtt acctaagatt ggaaaaagca 420

acaggctctg agaatgagtg gtgggctaaa attaaaccat cgcaaaatga tgactggcaa 480

cagtttgagc cagatggata taccattttt agttctagag atcattacgc cagcttgttt 540

aaatcttata gcgactatga gatagaagcg aagatccctt taccgttaag aaggggaaaa 600

gcggtggtct tgtatccaga atacatctca cgaatttgcg tattaccaga gtctcgttct 660

attcaaagag agcaagaaaa tttcactaaa ttgcgtgaca aaggcattgc tctaagtaaa 720

aaggattggc aagcgaagct gacaacagat gaactcgctg aacaggaaaa agaacgtgct 780

accatcaata agcgcttggg ttatttcgca actgaacatg aaaaggtggg aatcgtacac 840

aaagcgcttg agccaaaact gaaacctttc cagcaaatag aaaaagaatg gcgtcaatgc 900

aaagtcaaaa gtaaaagcac ctttcctaac tctatgactt ttgtgcaaaa ccctgcctat 960

caagcggttc actcgggttt taaaaagtta aaagagcaga ttggcttggc cgatgaggac 1020

attttgcttt cgctggagaa gatcgaagcg attgggttag tcaacatgcc actactttat 1080

gaacgctggt gtttgctgca aatcatcaaa gtgctgactc aggcattccg ctatcagcca 1140

gaggacaact ggaaacgaaa attgattgcg aatattcaag gcaatgaaga acaaatcagc 1200

attcagtttt tcaacccaag tgtttcaaga gctatcactc tgcaatacga accgttctta 1260

gcaaatggta agcgccctga ttttgttttg gatgtagaag cgattaccaa aagtggtaac 1320

cagatttcaa agcggttagt cgtcgatgca aagtactatt ctgctgccta tctcaagcaa 1380

agaggtggga tcggtggggt tatccatgaa ctttacaacg gcaaagatta tagcgaatgc 1440

caagagaaca gtgtgtttgt tcttcacccc gtgttagatg cggttgagaa agtcgtctct 1500

ccacaggaat gggcgaaaga cagttatttg ggcgaactat ccatgtttga ttgggaacct 1560

gcacaccatc aacgccaagc tacaaactat ggtgcagtat gtgcaaaccc aatgaagtcg 1620

caacgctatc ttgatgaaat ccaacgtatg ctagggatgt ttctacagta cggcattgaa 1680

gacaatacat cttttcgagg agcatcggat gatactcatg cggtgaattt ttgtgtttct 1740

tgcgggtctg aaaaagtagt tgatgtaacg aaatcaatga gttcaaataa tcaaaagcgt 1800

tggtatcggt gcaatgagtg tacacacttt accgtgtata cccactgtgg tacatgcaat 1860

acacgattaa ttaagaatgg cgagtattgg acctatttgt ctttgatgcc tatgtcttca 1920

attaacataa agtgtccaaa ctgcgagtct cccgtatgag cggccgc 1967

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial sequence

<400>9

gcccatatgg aattccacca tcaccatcac 30

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificial sequence

<400>10

ggcgcggccg cttactcgcc attcttaatt aatcg 35

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Aritificial sequence

<400>11

ggcgcggccg cttattgcga cttcattggg tttgc 35

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial sequence

<400>12

ggcgcggccg cttactttgc atcgacgact aaccg 35

<210>13

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial sequence

<400>13

ggcgcggccg cttacaaaca ccagcgttca taaag 35

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial sequence

<400>14

ccatcaccat gaacgactta aaaagcgctt tg 32

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<211>38

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial sequence

<400>15

ccgaattcca ccatcaccat caccatgaac gacttaaa 38

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

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<400>16

ggcgcggccg cttacaaaca ccagcgttca taaag 35

<210>17

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial sequence

<400>17

ccatcaccat agcgactatg agatagaagc g 31

<210>18

<211>38

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial sequence

<400>18

ccgaattcca ccatcaccat caccatagcg actatgag 38

Claims

1.一种Estp突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；

(b)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述的蛋白质、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所述的蛋白、或氨基酸序列如SEQ ID NO.6所述的蛋白中之一。

2.一种编码权利要求1所述Estp突变体蛋白的多核苷酸分子。

3.一种包含权利要求2所述多核苷酸分子的重组表达载体。

4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的转化体。

5.一种降解疏水酯类杀虫剂的组合物，其特征在于其包括权利要求1所述Estp突变体蛋白和一种或多种可接受的载体。

6.权利要求1所述Estp突变体蛋白在去除或降低疏水酯类杀虫剂残留或污染方面的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述疏水酯类杀虫剂是拟除虫菊酯。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于所述拟除虫菊酯是I型拟除虫菊酯或II型拟除虫菊酯。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于所述I型拟除虫菊酯是溴氰菊酯。

10.一种权利要求1所述Estp突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

①编码权利要求1所述Estp突变体蛋白表达载体的构建；

②编码权利要求1所述Estp突变体蛋白转化体的制备；

③Estp突变体蛋白的表达；

④Estp突变体蛋白的纯化。