KR20220008867A - 파에니바실루스-기반 내생포자 디스플레이 플랫폼을 위한 표적화 서열 - Google Patents

파에니바실루스-기반 내생포자 디스플레이 플랫폼을 위한 표적화 서열 Download PDF

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KR20220008867A
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다미안 커티스
카일 팁튼
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바이엘 크롭사이언스 엘피
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Abstract

단백질 및 펩티드를 파에니바실루스 과 구성원에 의해 생산된 내생포자의 표면에 표적화하는데 유용한 신호 서열 및 그의 사용 방법이 제공된다. 특정한 N-말단 표적화 서열 및 그의 유도체를 사용하여, 파에니바실루스 과 구성원의 포자 표면 상에 이종 분자, 예컨대 펩티드, 폴리펩티드 및 다른 재조합 구축물을 디스플레이하는 것이 또한 제공된다.

Description

파에니바실루스-기반 내생포자 디스플레이 플랫폼을 위한 표적화 서열
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 5월 15일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/848,533을 우선권 주장하며, 이의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 사본은 2020년 5월 14일에 생성되고 85 킬로바이트의 크기를 갖는 파일명 BCS199006_WO_ST25.txt인 ASCII-포맷화 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되고, 본 명세서와 공동으로 출원된다. 이러한 ASCII-포맷화의 문서에 담긴 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 내생포자 디스플레이 플랫폼, 관련 디스플레이 방법, 포자 표면 표적화 서열 및 그를 포함하는 융합 단백질 구축물, 재조합 내생포자 조성물, 및 다양한 적용, 예컨대 관심 이종 분자의 식물, 종자 또는 재배지로의 전달에 유용한 파에니바실루스(Paenibacillus) 및 다른 박테리아 속에서의 포자 표면-표적화 서열을 확인하는 방법에 관한 것이다.
현대 농업 기술은 작물의 수확량 및 품질을 개선시키기 위해 식물 건강 및 성장을 촉진 또는 증진시키는 조성물에 크게 의존한다. 이러한 조성물은 일반적으로 유기 또는 무기 비료, 영양소 및 적절한 식물 성장 및 발달을 촉진하는 다른 화학적 화합물을 포함한다. 그러나, 많은 이들 조성물의 장기간 또는 과사용이 토양 산성화 또는 토양 내 영양소 균형의 탈안정화와 같은 부정적 부작용을 초래할 수 있다는 것은 잘 확립되어 있다. 더욱이, 과사용은 인간 소비를 위해 재배된 작물에 유해한 최종-생성물의 풍부화를 초래할 수 있다.
현대 농장은 또한 전형적으로 해충을 방제하고 상업적으로-재배된 작물의 높은 수확량을 보장하기 위해 매우 다양한 화학물질 (예를 들어, 살곤충제, 제초제, 살박테리아제, 살선충제 및 살진균제)의 사용에 의존한다. 이들 화학적 화합물 중 다수는 광범위한 활성을 나타내고, 고농도에서 인간 및 동물에게 잠재적으로 유해할 수 있다. 추가로, 일부 화학적 화합물은 오프-타겟 효과를 나타낸다. 더욱이, 이들 합성 화합물의 적어도 일부는 비-생분해성이다. 최근 수년간, 합성 살곤충제 또는 살진균제에 대한 노출을 감소시키거나 전혀 노출시키지 않으면서 재배 및 수확한 농업 제품에 대한 소비자의 압력이 증가해 왔다. 합성 살곤충제 또는 살진균제의 사용으로 발생하는 추가의 문제는 반복적 및/또는 배타적 사용이 종종 저항성 해충의 선택으로 이어진다는 것이다. 통상, 저항성 해충은 또한 동일한 작용 방식을 갖는 다른 활성 성분에 대해 교차-저항성이다. 그 결과, 해충 방제 조성물 및 화합물은 개발하기가 어렵고 고비용이 든다 (예를 들어, 안전성 우려 및 급속한 저항성 발달로 인해).
유전자 조작 방법은 합성 화학물질에 의존하지 않으면서 식물 성장 및/또는 건강을 촉진하는데 사용된다. 예를 들어, 식물 성장 및/또는 건강과 관련된 유전자를 도입 또는 변형시키고/거나 천연 또는 합성 해충 방제제를 코딩하는 유전자를 도입하도록 작물을 변형시킬 수 있다. 바이러스 벡터를 사용하여 트랜스진을 표적 식물 내로 도입할 수 있다. 최근 수년간, 재조합 단백질을 식물에 전달하기 위해 박테리아를 사용한 일부 성공이 보고되었다. 그러나, 지금까지, 이러한 성공은 대부분 바실라세아에(Bacillaceae) 과 구성원, 보다 구체적으로는 가장 잘 특징화된 그람-양성 박테리아이며 포자형성 연구를 위한 주요 박테리아 모델인 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 제한된다. 전달 및 발현 플랫폼으로서의 비. 서브틸리스에 대한 집중은 추가로 비. 서브틸리스 게놈 및 단백질 합성 및 분비와 관련된 생물학적 경로가 널리 이해되어 있다는 사실에 기인한다. 그러나, 박테리아 사이의 높은 정도의 유전적 다양성으로 인해, 비. 서브틸리스 연구에 기초한 연구 발견은 종종 바실라세아에 과의 내부 및 외부의 구성원으로 직접적으로 적용가능하지 않다.
따라서, 이종 유전 물질을 전달하는 특정 방법이 공지되어 있지만, 이러한 유전 물질에 대한 새로운 전달 및 발현 플랫폼을 개발할 필요성이 관련 기술분야에 존재한다.
본 개시내용은, 예를 들어 특히 파에니바실루스 속의 포자-형성 구성원을 사용하여 재조합 효소 및 다른 관심 분자 (예를 들어, 펩티드, 단백질)를 환경 (예를 들어, 식물, 재배지)에 전달하기 위한 새로운 플랫폼을 제공함으로써 상기 확인된 필요를 다루는 방법, 조성물 및 유전자 구축물을 기재한다. 본 개시내용은 또한 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속에서의 포자 표면-표적화 서열을 확인하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 식물 형질 또는 속성을 부여하거나 변형시키는 적어도 1종의 이종 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 수반되는 효소; 박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원을 분해하거나 변형시키는 효소; 살미생물 또는 미생물증식억제 화합물; 또는 식물을 병원체 또는 해충으로부터 보호하는 효소, 단백질 또는 펩티드); 및 (ii) 융합 단백질을 파에니바실루스 포자의 포자 표면에 국재화시키는 N-말단 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 제공한다. 이러한 일반적 조성물은 (예를 들어, 식물 성장 및/또는 건강을 촉진하는) 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 본원에 개시된 방법의 특정한 실시양태는 식물 형질 또는 속성을 부여하거나 또는 달리 변형시키는 이종 단백질 및 펩티드의 효율적인 고처리량 스크리닝을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 (a) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 (i) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (iii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 핵산 분자를 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 (a) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 (i) 서열식별번호: 33, 39, 41 또는 45; (ii) 서열식별번호: 33, 39, 41 또는 45와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; (iii) 서열식별번호: 34, 40, 42, 46 또는 49를 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (iv) 하기 폴리펩티드 서열: "MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDAFEFVFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 34), "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49) 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 여기서 (i)-(iv) 각각의 경우에 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 핵산 분자를 제공한다.
대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 복수의 N-말단 표적화 서열을 포함하며, 여기서 각각의 N-말단 표적화 서열은 독립적으로 "MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDAFEFVFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 34), "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49)으로부터 선택되되, 단 적어도 1개의 이러한 N-말단 표적화 서열은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있다. 일부 대안적 측면에서, N-말단 표적화 서열 중 2개 이상은 서로 인접하고, 다른 측면에서, N-말단 표적화 서열 중 2개 이상은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 아미노산을 포함하는 개재 스페이서 서열에 의해 분리된다.
대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 "MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDAFEFVFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 34), "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49) 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진다.
대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49) 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 최대 10, 20, 30 또는 40개 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열을 코딩한다.
대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 최대 10, 20, 30 또는 40개 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열을 코딩하고, "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49)의 말단절단된 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 말단절단된 형태는 N-말단 메티오닌 잔기를 생략한다.
대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49) 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 33, 39, 41 또는 45와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 또는 그로 이루어지며, 이는 동일한 조건 하에 상응하는 비최적화된 서열과 비교하여 파에니바실루스 내생포자에서 더 높은 비율 또는 수준으로 발현된다.
대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 34, 40, 42, 46 또는 49의 임의의 개별 폴리펩티드 서열의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산의 인접 서열과 동일한, 상기 동일 개수의 아미노산의 인접 서열을 코딩하는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
또 다른 대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 2의 아미노산 80-90, 90-100 또는 91-98을 코딩하는 서열로 본질적으로 이루어진다.
또 다른 대안적 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 폴리펩티드 서열: "FTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 2의 아미노산 80-100) (30 또는 40개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드 서열에 관하여), "TQISVWGKDAL" (서열식별번호: 2의 아미노산 90-100) 또는 "QISVWGK(D/N)" 중 어느 것을 포함하는, 최대 20, 30 또는 40개의 아미노산을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리펩티드 서열을 코딩한다. 추가 측면에서, 최대 20, 30 또는 40개의 아미노산을 갖는 이러한 코딩된 폴리펩티드 서열은 적용가능한 경우에 서열식별번호: 2의 아미노산 80-100, 서열식별번호: 2의 아미노산 90-100 또는 QISVWGK(D/N)에 상응하지 않는 이러한 제1 폴리펩티드 서열의 부분에 관하여 서열식별번호: 2에 대해 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70% 미만의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 대안적 측면에서, 본 개시내용은 (a) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 (i) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 (ii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 핵산 분자를 제공한다.
일부 측면에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 (a) 식물 성장 또는 면역 자극 단백질 중 적어도 하나; (b) 효소; (c) 단백질; (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; 또는 (e) 치료 단백질을 포함한다. 선택된 측면에서, 핵산 분자는 (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치하는, 1개 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드; (b) 선택 마커를 포함하는 폴리펩티드; (c) 가시화 마커를 포함하는 폴리펩티드; (d) 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는, 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에(Paenibacillus terrae), 파에니바실루스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) 또는 파에니바실루스 페오리아에(Paenibacillus peoriae)를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다.
다른 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 다음을 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다: 파에니바실루스 아비씨(Paenibacillus abyssi), 파에니바실루스 아세티(Paenibacillus aceti), 파에니바실루스 아에스투아리이(Paenibacillus aestuarii), 파에니바실루스 아가렉세덴스(Paenibacillus agarexedens), 파에니바실루스 아가리데보란스(Paenibacillus agaridevorans), 파에니바실루스 알기놀리티쿠스(Paenibacillus alginolyticus), 파에니바실루스 알고리폰티콜라(Paenibacillus algorifonticola), 파에니바실루스 알칼리테라에(Paenibacillus alkaliterrae), 파에니바실루스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실루스 아밀롤리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실루스 아나에리카누스(Paenibacillus anaericanus), 파에니바실루스 안타르크티쿠스(Paenibacillus antarcticus), 파에니바실루스 아피아리우스(Paenibacillus apiarius), 파에니바실루스 아라키디스(Paenibacillus arachidis), 파에니바실루스 아싸멘시스(Paenibacillus assamensis), 파에니바실루스 아조레두센스(Paenibacillus azoreducens), 파에니바실루스 아조토픽산스(Paenibacillus azotofixans), 파에니바실루스 바에크로크다미솔리(Paenibacillus baekrokdamisoli), 파에니바실루스 바르시노넨시스(Paenibacillus barcinonensis), 파에니바실루스 바렌골치이(Paenibacillus barengoltzii), 파에니바실루스 보레알리스(Paenibacillus borealis), 파에니바실루스 보비스(Paenibacillus bovis), 파에니바실루스 브라실렌시스(Paenibacillus brasilensis), 파에니바실루스 카멜리아에(Paenibacillus camelliae), 파에니바실루스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실루스 카스타네아에(Paenibacillus castaneae), 파에니바실루스 카탈파에(Paenibacillus catalpae), 파에니바실루스 카토르미이(Paenibacillus cathormii), 파에니바실루스 카베르나에(Paenibacillus cavernae), 파에니바실루스 셀룰로실리티쿠스(Paenibacillus cellulosilyticus), 파에니바실루스 셀룰로시트로피쿠스(Paenibacillus cellulositrophicus), 파에니바실루스 카르타리우스(Paenibacillus chartarius), 파에니바실루스 키벤시스(Paenibacillus chibensis), 파에니바실루스 킨주엔시스(Paenibacillus chinjuensis), 파에니바실루스 키티놀리티쿠스(Paenibacillus chitinolyticus), 파에니바실루스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실루스 쿤간겐시스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실루스 시네리스(Paenibacillus cineris), 파에니바실루스 시솔로켄시스(Paenibacillus cisolokensis), 파에니바실루스 콘타미난스(Paenibacillus contaminans), 파에니바실루스 쿠키이(Paenibacillus cookii), 파에니바실루스 쿠쿠미스(Paenibacillus cucumis), 파에니바실루스 쿠르들라놀리티쿠스(Paenibacillus curdlanolyticus), 파에니바실루스 다에제오넨시스(Paenibacillus daejeonensis), 파에니바실루스 다르위니아누스(Paenibacillus darwinianus), 파에니바실루스 다우시(Paenibacillus dauci), 파에니바실루스 덴드리티포르미스(Paenibacillus dendritiformis), 파에니바실루스 동도넨시스(Paenibacillus dongdonensis), 파에니바실루스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실루스 두루스(Paenibacillus durus), 파에니바실루스 에다피쿠스(Paenibacillus edaphicus), 파에니바실루스 에히멘시스(Paenibacillus ehimensis), 파에니바실루스 엘기이(Paenibacillus elgii), 파에니바실루스 엔도피티쿠스(Paenibacillus endophyticus), 파에니바실루스 에테리(Paenibacillus etheri), 파에니바실루스 파에시스(Paenibacillus faecis), 파에니바실루스 파비스포루스(Paenibacillus favisporus), 파에니바실루스 페라리우스(Paenibacillus ferrarius), 파에니바실루스 필리시스(Paenibacillus filicis), 파에니바실루스 폰티콜라(Paenibacillus fonticola), 파에니바실루스 포르시티아에(Paenibacillus forsythiae), 파에니바실루스 프리고리레시스텐스(Paenibacillus frigoriresistens), 파에니바실루스 간수엔시스(Paenibacillus gansuensis), 파에니바실루스 겔라티닐리티쿠스(Paenibacillus gelatinilyticus), 파에니바실루스 긴센가르비(Paenibacillus ginsengarvi), 파에니바실루스 긴센기후미(Paenibacillus ginsengihumi), 파에니바실루스 긴센기솔리(Paenibacillus ginsengisoli), 파에니바실루스 글라시알리스(Paenibacillus glacialis), 파에니바실루스 글루카놀리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실루스 글리카닐리티쿠스(Paenibacillus glycanilyticus), 파에니바실루스 고르도나에(Paenibacillus gordonae), 파에니바실루스 그라미니스(Paenibacillus graminis), 파에니바실루스 그라니보란스(Paenibacillus granivorans), 파에니바실루스 구앙조우엔시스(Paenibacillus guangzhouensis), 또는 파에니바실루스 하레나에(Paenibacillus harenae).
일부 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 다음을 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다: 파에니바실루스 헤메로칼리콜라(Paenibacillus hemerocallicola), 파에니바실루스 히스파니쿠스(Paenibacillus hispanicus), 파에니바실루스 호도가이엔시스(Paenibacillus hodogayensis), 파에니바실루스 호르데이(Paenibacillus hordei), 파에니바실루스 후미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실루스 후나넨시스(Paenibacillus hunanensis), 파에니바실루스 일리노이센시스(Paenibacillus illinoisensis), 파에니바실루스 자밀라에(Paenibacillus jamilae), 파에니바실루스 질룬리이(Paenibacillus jilunlii), 파에니바실루스 코벤시스(Paenibacillus kobensis), 파에니바실루스 콜레오보란스(Paenibacillus koleovorans), 파에니바실루스 콘시덴시스(Paenibacillus konsidensis), 파에니바실루스 코레엔시스(Paenibacillus koreensis), 파에니바실루스 크립벤시스(Paenibacillus kribbensis), 파에니바실루스 ?r헤엔시스(Paenibacillus kyungheensis), 파에니바실루스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실루스 라르바에(Paenibacillus larvae), 파에니바실루스 라르바에(Paenibacillus larvae), 파에니바실루스 라르바에(Paenibacillus larvae), 파에니바실루스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실루스 렘나에(Paenibacillus lemnae), 파에니바실루스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실루스 렌투스(Paenibacillus lentus), 파에니바실루스 리아오닌겐시스(Paenibacillus liaoningensis), 파에니바실루스 루피니(Paenibacillus lupini), 파에니바실루스 마세란스(Paenibacillus macerans), 파에니바실루스 막쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실루스 막쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실루스 막쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실루스 마르칸티오피토룸(Paenibacillus marchantiophytorum), 파에니바실루스 마리니세디미니스(Paenibacillus marinisediminis), 파에니바실루스 마실리엔시스(Paenibacillus massiliensis), 파에니바실루스 메디카기니스(Paenibacillus medicaginis), 파에니바실루스 멘델리이(Paenibacillus mendelii), 파에니바실루스 메타놀리쿠스(Paenibacillus methanolicus), 파에니바실루스 몬타니테라에(Paenibacillus montaniterrae), 파에니바실루스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실루스 무실라기노수스(Paenibacillus mucilaginosus), 파에니바실루스 나넨시스(Paenibacillus nanensis), 파에니바실루스 나프탈레노보란스(Paenibacillus naphthalenovorans), 파에니바실루스 나수티테르미티스(Paenibacillus nasutitermitis), 파에니바실루스 네마토필루스(Paenibacillus nematophilus), 파에니바실루스 니코티아나에(Paenibacillus nicotianae), 파에니바실루스 오세아니세디미니스(Paenibacillus oceanisediminis), 파에니바실루스 오도리페르(Paenibacillus odorifer), 파에니바실루스 오에노테라에(Paenibacillus oenotherae), 파에니바실루스 오리자에(Paenibacillus oryzae), 파에니바실루스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실루스 파나시솔리(Paenibacillus panacisoli), 파에니바실루스 파나시테라에(Paenibacillus panaciterrae), 파에니바실루스 파사데넨시스(Paenibacillus pasadenensis), 파에니바실루스 펙티닐리티쿠스(Paenibacillus pectinilyticus), 파에니바실루스 페리안드라에(Paenibacillus periandrae), 또는 파에니바실루스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis).
일부 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 다음을 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다: 파에니바실루스 필로스파에라에(Paenibacillus phyllosphaerae), 파에니바실루스 피스코미트렐라에(Paenibacillus physcomitrellae), 파에니바실루스 피니(Paenibacillus pini), 파에니바실루스 피니후미(Paenibacillus pinihumi), 파에니바실루스 피네솔리(Paenibacillus pinesoli), 파에니바실루스 포케오넨시스(Paenibacillus pocheonensis), 파에니바실루스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실루스 포풀리(Paenibacillus populi), 파에니바실루스 프로소피디스(Paenibacillus prosopidis), 파에니바실루스 프로벤센시스(Paenibacillus provencensis), 파에니바실루스 푸에리(Paenibacillus pueri), 파에니바실루스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실루스 풀비파시엔스(Paenibacillus pulvifaciens), 파에니바실루스 푸리스파티이(Paenibacillus purispatii), 파에니바실루스 킹센기이(Paenibacillus qingshengii), 파에니바실루스 퀘르쿠스(Paenibacillus quercus), 파에니바실루스 라디시스(Paenibacillus radicis), 파에니바실루스 렐릭티세사미(Paenibacillus relictisesami), 파에니바실루스 레시두이(Paenibacillus residui), 파에니바실루스 리조리자에(Paenibacillus rhizoryzae), 파에니바실루스 리조스파에라에(Paenibacillus rhizosphaerae), 파에니바실루스 리구이(Paenibacillus rigui), 파에니바실루스 리오그란덴시스(Paenibacillus riograndensis), 파에니바실루스 리파에(Paenibacillus ripae), 파에니바실루스 사비나에(Paenibacillus sabinae), 파에니바실루스 사케오넨시스(Paenibacillus sacheonensis), 파에니바실루스 살리니카에니(Paenibacillus salinicaeni), 파에니바실루스 산구이니스(Paenibacillus sanguinis), 파에니바실루스 세디미니스(Paenibacillus sediminis), 파에니바실루스 세게티스(Paenibacillus segetis), 파에니바실루스 셀레니이(Paenibacillus selenii), 파에니바실루스 셀레니티레두센스(Paenibacillus selenitireducens), 파에니바실루스 세네갈렌시스(Paenibacillus senegalensis), 파에니바실루스 셉텐트리오날리스(Paenibacillus septentrionalis), 파에니바실루스 세풀크리(Paenibacillus sepulcri), 파에니바실루스 세니안겐시스(Paenibacillus shenyangensis), 파에니바실루스 시라카미엔시스(Paenibacillus shirakamiensis), 파에니바실루스 시아멘시스(Paenibacillus siamensis), 파에니바실루스 실라게이(Paenibacillus silagei), 파에니바실루스 시노포도필리(Paenibacillus sinopodophylli), 파에니바실루스 솔라니(Paenibacillus solani), 파에니바실루스 솔리(Paenibacillus soli), 파에니바실루스 손키(Paenibacillus sonchi), 파에니바실루스 소포라에(Paenibacillus sophorae), 파에니바실루스 스푸티(Paenibacillus sputi), 파에니바실루스 스텔리페르(Paenibacillus stellifer), 파에니바실루스 수손겐시스(Paenibacillus susongensis), 파에니바실루스 스우엔시스(Paenibacillus swuensis), 파에니바실루스 타이쿤겐시스(Paenibacillus taichungensis), 파에니바실루스 타이와넨시스(Paenibacillus taiwanensis), 파에니바실루스 타리멘시스(Paenibacillus tarimensis), 파에니바실루스 텔루리스(Paenibacillus telluris), 파에니바실루스 테레우스(Paenibacillus terreus), 파에니바실루스 테리게나(Paenibacillus terrigena), 파에니바실루스 타일란덴시스(Paenibacillus thailandensis), 파에니바실루스 써모필루스(Paenibacillus thermophilus), 파에니바실루스 티아미놀리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실루스 티안무엔시스(Paenibacillus tianmuensis), 파에니바실루스 티베텐시스(Paenibacillus tibetensis), 파에니바실루스 티모넨시스(Paenibacillus timonensis), 파에니바실루스 툰드라에(Paenibacillus tundrae), 파에니바실루스 투리센시스(Paenibacillus turicensis), 파에니바실루스 티파에(Paenibacillus typhae), 파에니바실루스 울리기니스(Paenibacillus uliginis), 파에니바실루스 우리날리스(Paenibacillus urinalis), 파에니바실루스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실루스 비니(Paenibacillus vini), 파에니바실루스 불네리스(Paenibacillus vulneris), 파에니바실루스 웬시니아에(Paenibacillus wenxiniae), 파에니바실루스 우포넨시스(Paenibacillus wooponensis), 파에니바실루스 우손겐시스(Paenibacillus woosongensis), 파에니바실루스 울루무키엔시스(Paenibacillus wulumuqiensis), 파에니바실루스 윈니이(Paenibacillus wynnii), 파에니바실루스 크산티닐리티쿠스(Paenibacillus xanthinilyticus), 파에니바실루스 크신지안겐시스(Paenibacillus xinjiangensis), 파에니바실루스 크실라넥세덴스(Paenibacillus xylanexedens), 파에니바실루스 크실라닐리티쿠스(Paenibacillus xylanilyticus), 파에니바실루스 크실라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 파에니바실루스 욘기넨시스(Paenibacillus yonginensis), 파에니바실루스 윤나넨시스(Paenibacillus yunnanensis), 파에니바실루스 잔톡실리(Paenibacillus zanthoxyli), 또는 파에니바실루스 제아에(Paenibacillus zeae).
일부 측면에서, 핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 파에니바실루스 중 적어도 하나에 대해 이종인 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된다.
일부 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 (a) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 동일한 조건 하에 각각의 원래의 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9와 비교하여 파에니바실루스 내생포자에서 더 높은 비율 또는 수준으로 발현된다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 N-말단 신호 펩티드와 이에 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 (a) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70% 또는 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (b) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 융합 단백질을 제공한다.
일부 측면에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 (a) 식물 성장 또는 면역 자극 단백질 중 적어도 하나; (b) 효소; (c) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; (d) 치료 단백질 (예를 들어, 항생제 또는 항염증 단백질); 또는 (e) 살곤충/정곤충 활성, 살박테리아/정박테리아 활성, 살진균/정진균 활성, 식물 성장, 건강 또는 면역-자극 활성 및/또는 개선된 비생물적 환경 저항성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 농업상 유의한 특성을 제공하는 단백질을 포함한다. 다른 농업상 유의한 특성은 출아, 작물 수확량, 단백질 함량, 오일 함량, 전분 함량, 보다 발달된 뿌리계, 개선된 뿌리 성장, 개선된 뿌리 크기 유지, 개선된 뿌리 유효성, 개선된 스트레스 내성 (예를 들어, 가뭄, 열, 염, UV, 물, 추위에 대한), 감소된 에틸렌 (감소된 생산 및/또는 수용의 억제), 분얼 증가, 식물 높이의 증가, 보다 큰 잎새, 보다 적은 죽은 기부 잎, 보다 강한 분얼경, 보다 푸른 잎 색, 색소 함량, 광합성 활성, 보다 적은 투입물 필요량 (예컨대 비료 또는 물), 보다 적은 종자 필요량, 보다 생산적인 분얼경, 보다 이른 개화, 이른 곡물 성숙, 보다 적은 식물 쓰러짐 (도복), 증가된 싹 성장, 증진된 식물 활력, 증가된 식물 생립 및 이르고 보다 우수한 발아를 포함한 개선된 작물 특징을 포함한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치하는, 1개 이상의 프로테아제 절단 부위를 함유하는 폴리펩티드; (b) 선택 마커 (예를 들어, 항생제에 대한 저항성을 부여하는 단백질)를 포함하는 폴리펩티드; (c) 가시화 요소 (예를 들어, 형광 태그, 예컨대 GFP)를 포함하는 폴리펩티드; (d) 적어도 1개의 단백질 인식/정제 도메인 (예를 들어, His-태그)을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는, 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 이전 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 염색체를 포함하는 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 이전 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터이며, 플라스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 측면에서, 벡터는 하기: (a) 파에니바실루스 세포에서 안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (b) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 비-안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (c) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 비-안정한 유지를 제공하는 온도-감수성 복제 기점; (d) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (e) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 식물 성장 자극 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종이다. 다른 예시적인 측면에서, 파에니바실루스 세포는 본원에 기재된 임의의 예시적인 파에니바실루스 종으로부터 선택될 수 있다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 a) 포자형성이 가능한 파에니바실루스 세포를 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계; 및 b) 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 코딩된 융합 단백질을, 융합 단백질이 포자형성으로부터 생성된 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화되도록 하는 포자형성 조건 하에 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 (i) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (ii) 서열식별번호: 2로부터의 적어도 5, 10, 15 또는 20개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 것인, 이종 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에 디스플레이하는 방법을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 a) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함하는 것인 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 융합 단백질을 발현하는 1종 이상의 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포; 및 b) 적어도 1종의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산, 융합 단백질, 박테리아 세포 또는 조성물 중 적어도 하나로 처리된 종자를 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 a) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함하는 것인 본원에 개시된 임의의 측면의 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 내생포자; 및 b) 적어도 1종의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 성장을 증진시키고/거나 식물 건강을 촉진하기 위해 식물, 종자, 식물 부분 또는 식물 주위의 토양을 처리하는 방법을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계: a) 본원에 개시된 임의의 측면에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을, 파에니바실루스가 영구적으로 또는 일시적으로 콜로니화할 수 있는 종자, 묘목 또는 영양 식물에 적용하여, 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물을 생산하는 단계; b) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물의 형질, 성분 또는 속성을 검출하고 임의로 측정함으로써 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리된 숙주 식물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 스크리닝 단계는 하기: a) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플로부터 제조된 추출물에 함유된 1종 이상의 화합물의 존재, 수준, 수준의 변화, 활성 또는 국재화를 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 1종의 시험관내 검정; 및/또는 b) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물의 형질, 성분 또는 속성을 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 1종의 생체내 검정 중 하나 이상을 포함한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 a) 파에니바실루스 세포를 본원에 개시된 측면에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형시켜 재조합 파에니바실루스 세포를 생산하는 단계; 및 b) 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 화합물의 수준 또는 활성을 검출하고 임의로 정량화함으로써 파에니바실루스 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 파에니바실루스 세포에서 발현된 이종 단백질 또는 펩티드를 농업상 유의한 특성에 대해 스크리닝하는 방법을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 파에니바실루스 또는 또 다른 관심 내생포자-형성 박테리아의 게놈을 "Gly-X-X" ("GXX 반복부", 여기서 "X"는 임의의 아미노산을 나타냄)의 다수의 콜라겐-유사 트리플렛 반복부를 갖는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 대해 스크리닝하는 단계; 및 단백질이 포자 표면에 국재화하는지를 현미경검사에 의해 또는 실험적으로 결정하는 단계를 포함하는, 내생포자 디스플레이에 적합한 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속에서의 포자 표면-표적화 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 단백질 국재화는 투과 전자 현미경검사 또는 질량 분광측정법을 사용하여 결정된다. 다른 측면에서, 포자 표면에 국재화하는 단백질로부터의 추정 N-말단 표적화 서열은 리포터 유전자에 융합되고, 생성된 융합 단백질은 내생포자-형성 박테리아에서 발현된다. 또 다른 측면에서, 생성된 융합 단백질은 이러한 내생포자-형성 박테리아의 표면 상의 발현에 대해 분석된다. 또 다른 측면에서, 이러한 발현이 검출되는 경우에, 리포터 유전자는 관심 뉴클레오티드 서열로 대체되고, 이러한 제2 융합 단백질은 내생포자-형성 박테리아에서 발현된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 방법을 통해 확인된 단백질의 N-말단 표적화 서열을 포함하는 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속으로부터의 포자 표면-표적화 표적화 서열을 제공한다. 이러한 N-말단 표적화 서열은 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 처음 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열은 내인성 N-말단 표적화 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 변이체이다. 이들 방법을 사용하여 확인된 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속에서의 포자 표면 표적화 서열은 본원에 기재된 임의의 다양한 실시양태에 따른 이종 융합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다.
선택된 측면에서, 생존 파에니바실루스 세포가 남아있지 않도록 조성물이 열-불활성화 또는 멸균되었다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 측면 중 어느 하나에 따른 단리 및/또는 정제된 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자 또는 재배지에 적용하는 단계를 포함하며; 여기서 재조합 파에니바실루스 내생포자는 본원에 개시된 임의의 측면에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 것인, 관심 단백질을 식물, 종자 또는 재배지에 전달하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 조성물은 a) 식재전 또는 식재후; b) 출아전 또는 출아후; c) 분말, 현탁액 또는 용액으로서 재배지에 적용되거나; 또는 d) 여기서 조성물은 식물 성장을 자극하는 1종 이상의 추가의 화합물을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 (i) 적어도 15, 30, 45, 60, 75 또는 90개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27 또는 29와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (iii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27 또는 29의 적어도 45, 90, 135, 180, 225, 270, 315 또는 345개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 단편은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27 또는 29의 제1 뉴클레오티드에서 시작한다. 또 다른 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1, 7, 19 또는 27과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 단편은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 1-15 또는 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105 또는 1-115를 코딩한다.
한 실시양태에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 (a) 식물 성장-자극 단백질; (b) 효소; (c) 단백질; (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; (e) 치료 단백질; 또는 (f) 식물 면역-자극 단백질을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산은 (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치하는, 1개 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드; (b) 선택 마커를 포함하는 폴리펩티드; (c) 가시화 마커를 포함하는 폴리펩티드; (d) 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는, 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 파에니바실루스 내생포자는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아에 의해 형성된 내생포자이다.
한 측면에서, 핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 파에니바실루스 중 적어도 하나에 대해 이종인 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된다.
또 다른 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27 또는 29와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 그의 단편을 포함하며, 이는 동일한 조건 하에 상응하는 비최적화된 서열과 비교하여 파에니바실루스 내생포자에서 더 높은 비율 또는 수준으로 발현된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 펩티드와 이에 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 (i) 적어도 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 또는 115개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드; (ii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 또는 32의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 또는 32의 적어도 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 또는 115개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 융합 단백질에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 단편은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 또는 32의 제1 아미노산에서 시작한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 2, 8, 20, 21, 22, 28, 31 또는 32와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 서열식별번호: 2, 8, 31 또는 32의 아미노산 1-15 또는 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105 또는 1-115를 포함한다.
한 실시양태에서, 단편은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 또는 32의 제80 아미노산에서 시작한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 서열식별번호: 2, 8, 31 또는 32의 아미노산 80-100, 85-100, 90-100, 91-100, 92-100, 93-100, 94-100, 90-99, 90-98, 90-97, 90-96, 91-98, 92-98, 93-98, 91-97 또는 91-96을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 서열식별번호: 2의 아미노산 91-98, 90-100, 85-95, 80-100 또는 여전히 아미노산 91-98을 함유하는 아미노산 80-100의 임의의 인접 부분으로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 이러한 실시양태에서 이러한 단편은 다른 아미노산에 연결되며, 이는 단편을 함유하지 않는 서열식별번호: 2의 부분에 대해 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만 또는 80% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 이러한 측면에서, 단편을 함유하는 1-120의 폴리펩티드 서열 (여기서 단편은 상기 아미노산 잔기 번호 (예를 들어, 91-98, 90-100, 85-95 또는 80-100)가 배정됨)은 단편 이외의 (1-120의) 폴리펩티드 서열 내의 아미노산에 관하여 서열식별번호: 2에 대해 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만의 서열 동일성을 갖는다.
일부 측면에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 (a) 식물 성장-자극 단백질; (b) 효소; (c) 단백질; (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; (e) 치료 단백질; 또는 (f) 식물 면역-자극 단백질을 포함한다.
다른 측면에서, 융합 단백질은 (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치하는, 1개 이상의 프로테아제 절단 부위를 함유하는 폴리펩티드; (b) 선택 마커를 포함하는 폴리펩티드; (c) 가시화 마커를 포함하는 폴리펩티드; (d) 적어도 1개의 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는, 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 박테리아 염색체를 포함하는 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터이며, 플라스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 측면에서, 벡터는 하기: (a) 파에니바실루스 세포에서 안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (b) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 비-안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (c) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 비-안정한 유지를 제공하는 온도-감수성 복제 기점; (d) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (e) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 식물 성장 자극 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다. 한 측면에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아이다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 포자형성이 가능한 파에니바실루스 세포를 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계; 및 b) 본원에 개시된 핵산 분자에 의해 코딩된 융합 단백질을 포자형성 조건 하에 발현시켜, 융합 단백질이 포자형성으로부터 생성된 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화되도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 (i) 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드; (ii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 것인, 이종 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에 디스플레이하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 a) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함하는 것인 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 1종 이상의 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포; 및 b) 적어도 1종의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산, 본원에 개시된 융합 단백질, 본원에 개시된 재조합 박테리아 세포 또는 본원에 개시된 조성물로 처리된 종자를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 a) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함하는 것인 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 내생포자; 및 b) 적어도 1종의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 성장을 증진시키고/거나 식물 건강을 촉진하기 위해 식물, 종자, 식물 부분 또는 식물 주위의 토양을 처리하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계: a) 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하도록 변형된 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을, 파에니바실루스가 영구적으로 또는 일시적으로 콜로니화할 수 있는 종자, 묘목 또는 영양 식물에 적용하여, 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물을 생산하는 단계; b) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물의 형질, 성분 또는 속성을 검출하고 임의로 측정함으로써 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리된 숙주 식물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 스크리닝 단계는 하기: a) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플로부터 제조된 추출물에 함유된 1종 이상의 화합물의 존재, 수준, 수준의 변화, 활성 또는 국재화를 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 1종의 시험관내 검정; 및/또는 b) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물의 형질, 성분 또는 속성을 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 1종의 생체내 검정 중 하나 이상을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 a) 파에니바실루스 세포를 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하도록 변형시켜 재조합 파에니바실루스 세포를 생산하는 단계; 및 b) 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 화합물의 수준 또는 활성을 검출하고 임의로 정량화함으로써 파에니바실루스 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 파에니바실루스 세포에서 발현된 이종 단백질 또는 펩티드를 농업상 유의한 특성에 대해 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
또한, 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자, 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 파에니바실루스 세포는 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 것인, 식물, 종자, 인간 또는 동물을 처리하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 조성물은 생존 파에니바실루스 세포가 남아있지 않도록 열-불활성화 또는 멸균되었다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 단리 및/또는 정제된 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자 또는 재배지에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 파에니바실루스 내생포자는 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하도록 변형된 것인, 관심 단백질을 식물, 종자 또는 재배지에 전달하는 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 조성물은 a) 식재전 또는 식재후; b) 출아전 또는 출아후; c) 분말, 현탁액 또는 용액으로서 재배지에 적용되고/거나; d) 여기서 조성물은 식물 성장을 자극하거나 식물을 해충으로부터 보호하는 1종 이상의 추가의 화합물을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 서열 "GLY-X-X" (여기서 "X"는 "임의의 아미노산"을 나타냄)를 갖는 다수의 콜라겐-유사 트리플렛 반복부를 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 1종의 오픈 리딩 프레임에 대해 내생포자-형성 박테리아의 게놈을 스크리닝하는 단계; 및 스크리닝 단계에서 확인된 단백질 중 적어도 1종이 내생포자-형성 박테리아의 포자 표면에 국재화하는지를 현미경검사에 의해 또는 실험적으로 결정하는 단계를 포함하는, 단백질을 내생포자-형성 박테리아의 포자 표면에 표적화할 수 있는 N-말단 신호 서열을 확인하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 내생포자-형성 박테리아는 단백질분해에 저항성인 모발-유사 구조를 포함한다. 또 다른 측면에서, 방법은 결정 단계에서 포자 표면에 국재화하는 것으로 확인된 적어도 1종의 단백질로부터 추정 N-말단 신호 서열을 확인하는 단계 및 추정 N-말단 신호 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 융합 단백질을 내생포자-형성 박테리아에서 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 방법은 포자 표면 상의 융합 단백질의 발현에 기초하여 융합 단백질을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 방법은 선택된 융합 단백질 내의 리포터 유전자를 관심 뉴클레오티드 서열로 대체하여 제2 융합 단백질을 생성하는 단계 및 제2 융합 단백질을 내생포자-형성 박테리아에서 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 박테리아는 파에니바실루스(Paenibacillus), 비리디바실루스(Viridibacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus) 또는 리시니바실루스(Lysinibacillus) 속의 구성원이다. 한 실시양태에서, 박테리아는 파에니바실루스 속의 구성원이다.
일부 측면에서, 국재화는 투과 전자 현미경검사 또는 질량 분광측정법을 사용하여 결정된다.
다른 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 신호 펩티드는 a) 본원에 개시된 방법에 의해 내생포자-형성 박테리아의 포자 표면에 국재화하는 것으로 결정된 단백질의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120개의 N-말단 잔기의 인접 절편; b) 본원에 개시된 방법에 의해 내생포자-형성 박테리아의 포자 표면에 국재화하는 것으로 결정된 단백질의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120개의 N-말단 잔기의 인접 절편에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 여기서 절편 또는 서열은 절편 또는 서열을 포함하는 융합 단백질을 내생포자-형성 박테리아의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 (박테리아에서 발현되는 경우에) 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 서열 또는 절편을 포함하고, N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 박테리아 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 핵산 분자는 박테리아 세포의 포자형성 동안 융합 단백질의 전사를 유발하는 상류 조절 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 박테리아 세포는 파에니바실루스 과 구성원이다.
일부 실시양태에서, 상류 조절 서열은 (a) 서열식별번호: 11-15 중 어느 것; (b) 서열식별번호: 11-15 중 어느 것의 적어도 25, 50, 100, 150개의 인접 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 서열; (c) 서열식별번호: 11-15 중 어느 것과 비교하여 또는 그의 25, 50, 100 또는 150개의 뉴클레오티드 단편과 비교하여 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 여기서 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 전사상 활성인 프로모터를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 상류 조절 서열을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) 관심 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며; 여기서 관심 단백질은 상류 조절 서열에 대해 이종이고, 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 관심 단백질의 전사를 유발하는 것인, 상류 조절 서열 및 관심 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 박테리아 세포는 파에니바실루스 과 구성원이다.
또 다른 측면에서, 상류 조절 서열은 (a) 서열식별번호: 11-15 중 어느 것; (b) 서열식별번호: 11-15 중 어느 것의 적어도 25, 50, 100, 150개의 인접 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 서열; (c) 서열식별번호: 11-15 중 어느 것과 비교하여 또는 그의 25, 50, 100 또는 150개의 뉴클레오티드 단편과 비교하여 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 여기서 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 전사상 활성인 프로모터를 포함한다.
도 1은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자의 투과 전자 현미경사진을 도시한다. 콜라겐-유사 단백질로 구성된 모발-유사 구조가 내생포자 표면으로부터 뻗어 있는 것으로 제시되고, 하나의 이러한 구조가 화살표로 표시된다.
도 2a는 본 개시내용에 따른 예시적인 N-말단 표적화 서열을 발현하는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자, 구체적으로 이 도면에 의해 제시된 바와 같이 내생포자 표면에 국재화된 (서열식별번호: 2)-GFP 융합 단백질 구축물의 위상 대조 (좌측) 및 에피형광 (우측) 현미경사진 (1000x 배율)을 도시한다. 우측 패널에서 GFP 단백질에 의해 생성된 형광은 좌측 패널에서 위상 대조 현미경으로 관찰된 세포의 영상에 상응하며, 이는 GFP의 내생포자 표면으로의 정확한 국재화를 나타낸다.
도 2b는 내생포자 표면에 국재화된 본 개시내용에 따른 예시적인 N-말단 표적화 서열, 구체적으로 (서열식별번호: 2)-GFP 융합 단백질 구축물을 발현하는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자의 유동 세포측정 히스토그램을 도시한다 (음영 영역). 관찰가능한 GFP 형광이 없는 야생형 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자가 비교를 위해 제시된다 (개방 점선 영역). 이 도면에서 각각의 포자 집단에 대해 10,000 사건이 제시된다.
도 3은 본 개시내용에 따른 예시적인 포자 표면-표적화 서열인 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 8의 N-말단 부분의 국부 서열 정렬을 도시한다. 컨센서스 서열 (서열식별번호: 32)이 정렬 아래에 제시된다.
도 4는 서열식별번호: 2 및 파에니바실루스 균주에 의해 발현된 추정 상동체의 N-말단 콜라겐-유사 반복 도메인을 보여주는 다수의 서열 정렬을 도시한다. 이 도면에서 컨센서스 서열 및 포자 표면-표적화를 위한 최소 N-말단 표적화 도메인이 주석달려 있다.
본 개시내용은 융합 단백질을 파에니바실루스 포자 표면에 표적화할 수 있는 유전자 구축물, 뿐만 아니라 관심 이종 분자 (예를 들어, 펩티드, 단백질)를 다양한 환경, 예컨대 식물에 전달하기 위해 이들 구축물을 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 재조합 파에니바실루스 내생포자로의 처리 후, 처리된 식물을 스크리닝하여 파에니바실루스 내생포자를 통해 전달된 이종 단백질에 기인하는 변화를 검출할 수 있다. 이러한 변화는 재조합 파에니바실루스 내생포자로의 처리가 부재하는 동일한 조건 하에 성장한 숙주 식물과 비교하여 숙주 식물의 성장 속도 또는 수확량에서의 변경; 증진된 식물 건강 (예를 들어, 환경적 스트레스, 질환 또는 해충에 대한 저항성); 및 증진된, 변형된 또는 달리 새로운 속성의 디스플레이를 포함할 수 있다. 이종 단백질을 포자 표면에 효율적으로 표적화하는 표적화 서열의 사용은 또한, 예를 들어 새로운 식물 형질 또는 속성을 증진, 변형 및/또는 부여할 수 있는 유용한 이종 단백질에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공한다.
정규 포자 형성 과정 (비. 서브틸리스를 사용한 연구에 기초하여 규명됨)은 영양 세포의 비대칭 세포 분열을 수반하여 모세포 및 전포자를 형성하며, 이들은 개재 격막에 의해 분리된 2개의 별개의 구획으로서 발생한다. 결국, 격막 내의 펩티도글리칸은 분해되고, 전포자는 모세포에 의해 포식되어, 세포 내에 세포를 형성한다. 모세포와 전포자 사이의 세포간 소통은 각각의 세포에서 세포-특이적 유전자 발현을 조정하여, 내생포자-특이적 화합물의 생산, 전포자 주위에 피질 층의 형성 및 코트의 침착을 유발한다.
일부 바실루스 종, 예를 들어 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) 및 비. 푸밀루스(B. pumilus)에서, 이 코트는 계속되어 내생포자의 최외각 층이 될 것이다. 전포자는 최종 탈수 및 완전한 내생포자로의 성숙을 겪는다. 모세포는 후속적으로 프로그램화된 세포 사멸을 통해 분해되어, 내생포자의 환경으로의 방출을 유발한다. 이어서, 내생포자는 전형적으로 보다 유리한 조건 또는 특정한 자극이 발아 및 영양 상태로의 복귀를 촉발할 때까지 휴면 상태로 남아있을 것이다.
포자와 환경 사이의 최외각 표면으로서, 코트 층은 많은 중요한 기능을 한다. 특히, 이러한 층은 환경적 손상에 대한 반투과성 장벽으로서 작용하고, 주위 환경과의 상호작용을 매개하며, 따라서 포자의 생존력을 유지하고 내생포자의 발아를 촉발하는 조건을 감지하는데 중요한 역할을 한다. 코트 층은 또한 숙주 면역 세포 인식에 기여하는 병원성 박테리아 균주에서 세포 표면 분자를 함유하기 때문에 임상 연구의 표적이다. 비. 서브틸리스의 포자 코트 상에 이종 단백질을 디스플레이하는 방법은 비. 서브틸리스 포자 코트 단백질을 함유하는 융합 단백질 구축물, 예컨대 관심 단백질에 융합된 CotC를 사용하여 개발되었다. 그러나, 파에니바실루스의 포자 표면 단백질은 공지되어 있지 않고, 따라서 비. 서브틸리스를 사용한 연구는 어떻게 융합 단백질이 다른 박테리아 속, 예컨대 파에니바실루스의 포자 표면에 표적화될 수 있는지에 관한 지침을 제공하지 못한다.
대조적으로, 본 개시내용은 융합 단백질 구축물을 파에니바실루스 세포의 포자 표면에 표적화할 수 있는 N-말단 구축물 및 그를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 융합 단백질을 포자 표면에 표적화하기 위해 사용되는 N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로 나타내어지는 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 선택된 실시양태에서, 이러한 N-말단 신호 서열은 포자 표면 표적화 기능성을 유지하기에 충분한 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단편은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 처음 10, 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가의 대안적 측면은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 N-말단 신호 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 이들 및 다른 실시양태가 본원에 기재된다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다" 또는 그의 임의의 파생어 (예를 들어, 포함하는, 포함한다)는 "본질적으로 이루어지다", "이루어지다" 또는 그의 적용가능한 상응하는 파생어로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 "파에니바실루스"는 파에니바실루스 속으로 분류되는 내생포자-생산 박테리아를 지칭한다. 이러한 용어는 비제한적으로 하기를 포함한 다양한 파에니바실루스 과 구성원을 포괄한다: 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 아비씨(Paenibacillus abyssi), 파에니바실루스 아세티(Paenibacillus aceti), 파에니바실루스 아에스투아리이(Paenibacillus aestuarii), 파에니바실루스 아가렉세덴스(Paenibacillus agarexedens), 파에니바실루스 아가리데보란스(Paenibacillus agaridevorans), 파에니바실루스 알기놀리티쿠스(Paenibacillus alginolyticus), 파에니바실루스 알고리폰티콜라(Paenibacillus algorifonticola), 파에니바실루스 알칼리테라에(Paenibacillus alkaliterrae), 파에니바실루스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실루스 아밀롤리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실루스 아나에리카누스(Paenibacillus anaericanus), 파에니바실루스 안타르크티쿠스(Paenibacillus antarcticus), 파에니바실루스 아피아리우스(Paenibacillus apiarius), 파에니바실루스 아라키디스(Paenibacillus arachidis), 파에니바실루스 아싸멘시스(Paenibacillus assamensis), 파에니바실루스 아조레두센스(Paenibacillus azoreducens), 파에니바실루스 아조토픽산스(Paenibacillus azotofixans), 파에니바실루스 바에크로크다미솔리(Paenibacillus baekrokdamisoli), 파에니바실루스 바르시노넨시스(Paenibacillus barcinonensis), 파에니바실루스 바렌골치이(Paenibacillus barengoltzii), 파에니바실루스 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thiaminolyticus), 파에니바실루스 티안무엔시스(Paenibacillus tianmuensis), 파에니바실루스 티베텐시스(Paenibacillus tibetensis), 파에니바실루스 티모넨시스(Paenibacillus timonensis), 파에니바실루스 툰드라에(Paenibacillus tundrae), 파에니바실루스 투리센시스(Paenibacillus turicensis), 파에니바실루스 티파에(Paenibacillus typhae), 파에니바실루스 울리기니스(Paenibacillus uliginis), 파에니바실루스 우리날리스(Paenibacillus urinalis), 파에니바실루스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실루스 비니(Paenibacillus vini), 파에니바실루스 불네리스(Paenibacillus vulneris), 파에니바실루스 웬시니아에(Paenibacillus wenxiniae), 파에니바실루스 우포넨시스(Paenibacillus wooponensis), 파에니바실루스 우손겐시스(Paenibacillus woosongensis), 파에니바실루스 울루무키엔시스(Paenibacillus wulumuqiensis), 파에니바실루스 윈니이(Paenibacillus wynnii), 파에니바실루스 크산티닐리티쿠스(Paenibacillus xanthinilyticus), 파에니바실루스 크신지안겐시스(Paenibacillus xinjiangensis), 파에니바실루스 크실라넥세덴스(Paenibacillus xylanexedens), 파에니바실루스 크실라닐리티쿠스(Paenibacillus xylanilyticus), 파에니바실루스 크실라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 파에니바실루스 욘기넨시스(Paenibacillus yonginensis), 파에니바실루스 윤나넨시스(Paenibacillus yunnanensis), 파에니바실루스 잔톡실리(Paenibacillus zanthoxyli), 및 파에니바실루스 제아에(Paenibacillus zeae).
특정 측면에서, 융합 단백질을 발현시키는데 사용된 파에니바실루스 구성원은 토양으로부터 단리된 그람-양성, 호기성 및 포자-형성 박테리아인 파에니바실루스 종 NRRL B-50972이다. 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 샘플은 2014년 8월 28일에 부다페스트 조약 하에 미국 61604 일리노이주 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815 소재 미국 농무부 농업 연구소 국립 농업 이용 연구 센터 (NRRL)에 위치한 아그리컬쳐럴 리서치 서비스 컬쳐 콜렉션(Agricultural Research Service Culture Collection)에 기탁되었다. 파에니바실루스 포자의 기본 조성 또는 구조에 대한 지식의 일반적 결여를 고려하면, 단백질이 이러한 층의 형성 동안 포자 표면에 표적화되는 과정에 대해 거의 알려져 있지 않다.
특정 측면에서, 융합 단백질을 발현시키는데 사용된 파에니바실루스 구성원은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 또는 본원에 개시된 임의의 다른 예시적인 파에니바실루스 과 구성원의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99 퍼센트 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아이다. 대안적으로, 융합 단백질을 발현시키는데 사용된 파에니바실루스 구성원은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 또는 본원에 개시된 임의의 다른 예시적인 파에니바실루스 과 구성원의 것에 대해 적어도 70 퍼센트인 DNA-DNA 혼성화 값을 보유하는 박테리아이다. 또 다른 경우에, 융합 단백질을 발현시키는데 사용된 파에니바실루스 구성원은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 또는 본원에 개시된 임의의 다른 예시적인 파에니바실루스 과 구성원의 것에 대해 95, 96, 97, 98 또는 99 퍼센트 평균 뉴클레오티드 동일성을 보유하는 박테리아이다.
용어 "N-말단 신호 서열"은 일반적으로, 폴리펩티드의 세포하 구획으로의 국재화 또는 분비를 지시하는, 폴리펩티드의 아미노 말단에 또는 그에 근접하게 위치한 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 이러한 용어는 문맥에 따라 용어 "N-말단 표적화 서열", "표적화 서열", "신호 서열" 및 "신호 펩티드"와 상호교환가능하게 사용될 수 있는 것으로 인식되고 이해된다. N-말단 신호 서열은 성숙 단백질의 폴리펩티드 서열의 일부로서 유지될 수 있거나 또는 대안적으로 국재화 과정 동안 또는 그 후에 절단될 수 있다. 이러한 용어는 구체적으로, 폴리펩티드의 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면으로의 국재화를 지시하는, 폴리펩티드의 아미노 말단에 또는 그에 근접하게 위치한 폴리펩티드 서열을 지칭하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, N-말단 신호 서열의 유일한 요구되는 기능성은 그가 일부인 폴리펩티드를 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 능력이다.
"식물" 또는 "숙주 식물"은 파에니바실루스가 콜로니화할 수 있는 근권 또는 엽권을 보유하는 임의의 식물, 뿐만 아니라 파에니바실루스 박테리아에 대한 일시적 숙주로서의 역할을 할 수 있는 식물을 포함한다. 콜로니화는 본원에 기재된 방법 및 조성물이 기능하기 위한 요건은 아니지만, 본 개시내용의 특정 측면에서 바람직할 수 있다.
본원에 사용된 "생물학적 방제"는 제2 유기체 또는 생물학적 분자의 사용에 의한 병원체 및/또는 곤충 및/또는 진드기 및/또는 선충류의 방제로서 정의된다. 공지된 생물학적 방제 메카니즘은 뿌리의 표면 상의 공간 또는 영양소에 대해 진균을 능가함으로써 뿌리썩음병을 방제하는 박테리아를 포함한다. 박테리아 독소, 예컨대 항생제는 병원체를 방제하는데 사용되어 왔다. 독소를 단리하여 식물에 직접적으로 적용할 수 있거나 또는 박테리아 종을 투여하여 그것이 계내에서 독소를 생산하도록 할 수 있다. 생물학적 방제를 발휘하는 다른 수단은 표적 식물병원체, 곤충, 응애 또는 선충류에 대해 활성인 성분을 생산하거나 표적 해충/병원체를 공격하는 특정 진균의 적용을 포함한다. "생물학적 방제"는 또한 식물 건강, 성장, 활력, 스트레스 반응 또는 수확량에 대해 유익한 효과를 갖는 미생물을 포괄할 수 있다. 적용 경로는 분무 적용, 토양 적용 및 종자 처리를 포함한다.
"혼성화"는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기들 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨-크릭 염기 쌍형성, 후그스타인 결합에 의해 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자기-혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 상이한 "엄격도"의 조건 하에 수행될 수 있다. 일반적으로, 저 엄격도 혼성화 반응은 약 40℃에서 10x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액 중에서 수행된다. 중간 엄격도 혼성화는 전형적으로 약 50℃에서 6x SSC 중에서 수행되고, 고 엄격도 혼성화 반응은 일반적으로 약 60℃에서 1x SSC 중에서 수행된다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 비교 윈도우에 걸쳐 (즉, 각각 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 잔기-대-잔기 기준으로) 동일한 정도를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 A, T, C, G)가 둘 다의 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 동등한 계산이 2개의 정렬된 아미노산 서열을 비교함으로써 수행될 수 있다.
아미노산 서열의 비교와 관련하여, 서열 동일성의 측정에 추가로, 비교는 잔기 변화가 "보존적" 치환을 구성하는지 여부를 또한 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다.
N-말단 표적화 서열
본 개시내용은 파에니바실루스 박테리아로부터의 N-말단 표적화 서열을 제공한다. 스트레스성 환경 조건 하에, 파에니바실루스 과 박테리아는 포자형성을 겪고, 장기간 동안 휴면상태로 유지될 수 있는 내생포자를 형성한다. 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 파에니바실루스 내생포자의 최외각 층은 포자 표면으로 공지되어 있고, 단백질 층을 포함한다. 바실루스 포자 표면 표적화 서열에 관한 이용가능한 문헌이 증가하고 있음에도 불구하고, 파에니바실루스에서 상동 N-말단 표적화 서열을 확인하는 연구는 보고되어 있지 않다. 공지된 포자 표면-표적화된 단백질 CotC, BclA, BclB 또는 BetA의 생물정보학 분석은 파에니바실루스에서의 임의의 상동 N-말단 표적화 서열을 밝혀내지 못했으며, 이는 이들 단백질의 포자 표면 표적화 서열이 파에니바실루스 속에서 보존되지 않는다는 것을 시사한다. 파에니바실루스의 포자 표면을 형성하고 그에 국재화되는 단백질의 제한된 특징화를 고려하면, 일반적으로 파에니바실루스 또는 특히 이 속 내의 종 (예를 들어, 파에니바실루스 종 NRRL B-50972)에서 단백질을 포자 표면에 표적화하는데 필요한 N-말단 신호 서열을 용이하게 추론할 수 없다.
이용가능한 문헌에서의 이러한 지침의 결여에도 불구하고, 본 발명자들은 내인성 및 융합 단백질을 파에니바실루스 세포의 포자 표면으로 지시할 수 있는 N-말단 표적화 서열을 확인하였다.
참조의 용이성을 위해, 본원에 언급된 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열에 대한 서열식별번호가 하기 표 1에 열거된다.
표 1: 예시적인 파에니바실루스 N-말단 표적화 서열 (즉, 서열식별번호: 1-10, 18, 33, 34, 39-42, 45 및 49) 및 상류 조절 서열 (즉, 서열식별번호: 11-15)
Figure pct00001
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표 2: 추가의 예시적인 파에니바실루스 N-말단 표적화 서열
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표 1 (즉, 서열식별번호: 1-10, 18, 33, 34, 39-42, 45 및 49) 및 표 2 (즉, 서열식별번호: 19-30)에 열거된 예시적인 N-말단 표적화 서열에 추가로, 추가 실시양태에서, 상기 언급된 서열 중 어느 것과 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 변이체 서열은, 이러한 서열이 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 능력을 유지하는 한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 1에 열거된 폴리펩티드 서열 중 어느 것으로부터 선택된 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 아미노산의 단편이 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 유일한 요구되는 기능성은 서열이 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 능력을 유지하는 것이다.
일부 실시양태에서, 이러한 N-말단 신호 서열 또는 그의 변이체 또는 단편은 연결된 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 관심 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 표 1에 열거된 개별 서열 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 표 1에 열거된 개별 폴리펩티드 서열 중 어느 것의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산의 인접 서열과 동일한, 상기 동일 개수의 아미노산의 적어도 1개의 인접 서열을 포함한다.
본원에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 여러 측면에 따른 융합 단백질 구축물은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 N-말단 신호 서열 또는 그의 변이체 또는 단편 및 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 그러나, 추가 측면에서, 임의의 개시된 서열, 뿐만 아니라 임의의 개시된 측면에 따른 그의 순차적 변이체 및 단편은 다른 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용은 이들 서열이 N-말단 포자 표면 표적화 서열로서 기능하는 측면에 초점을 맞추며, 다른 기능성을 부인하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10에서 발견되는 적어도 1개의 인접 하위서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)을 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로 나타내어지는 서열과 최소 또는 정확한 정도의 백분율 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)를 포함한다. 선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 상기 정의된 바와 같은 단편 및 변이체 둘 다로서 적격일 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10에서 발견되는 인접 하위서열에 이어서 개시된 서열 동일성 범위 내에 속하는 분기 서열을 포함하는 N-말단 신호 서열).
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로 나타내어지는 아미노산 서열의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산의 인접 서열과 동일한 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25개의 아미노산의 인접 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 발견되는 적어도 1개의 인접 하위서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)을 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 서열 중 어느 것으로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 최소 또는 정확한 정도의 백분율 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)를 포함한다. 선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 상기 정의된 바와 같은 단편 및 변이체 둘 다로서 적격일 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 발견되는 인접 하위서열에 이어서 최소 서열 동일성 범위 내에 속하는 분기 서열을 포함하는 N-말단 신호 서열).
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 중간 또는 고 엄격도 하에 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9에 상보적인 핵산 프로브에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 33, 39, 41 또는 45로 나타내어지는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드의 인접 서열과 동일한, 상기 동일 개수의 뉴클레오티드의 인접 서열을 포함한다.
본 개시내용, 예컨대 상기 언급된 실시양태에 의해 고려되는 임의의 대안적 N-말단 표적화 서열과 관련하여, 선택된 측면에서 이러한 서열의 최소 요구되는 기능성은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 능력이다.
포자형성-연관 조절 서열
본 개시내용은 포자형성 동안 본 개시내용에 따른 융합 단백질 및 다른 구축물을 발현시키는데 사용될 수 있는 다수의 상류 조절 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15)을 제공한다. 본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 이들 상류 조절 서열은 관심 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면으로 지시하는 N-말단 표적화 서열을 갖는 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 이들 상류 조절 서열 (또는 그의 단편 또는 변이체)은 또한 포자형성 동안 임의의 관심 이종 단백질을, 이러한 관심 단백질이 N-말단 표적화 서열을 포함하는지 여부와 관계없이, 발현시키는데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 관심 단백질의 전사는 본원에 기재된 임의의 상류 조절 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15 중 어느 것 또는 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는 그의 단편 또는 변이체)에 존재하는 프로모터에 의해 제어된다. 일부 측면에서, DNA 구축물은 본원에 기재된 임의의 조절 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15 중 어느 것) 또는 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는 그의 단편 또는 변이체의 하류에 관심 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15의 임의의 인접 25, 50, 100, 150 또는 200개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 변이체는 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15, 33, 39, 41 또는 45 중 어느 것 (또는 그의 단편)과 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 관심 단백질 및 임의의 상류 조절 서열(들)을 코딩하는 DNA는 파에니바실루스 또는 다른 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질
본 개시내용은 적어도 1종의 관심 분자 (예를 들어, 관심 단백질 또는 펩티드, 예컨대 적어도 1종의 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드의 폴리펩티드 서열)에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 N-말단 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 선택된 실시양태에서, 간접 연결은 개재 스페이서, 링커 또는 조절 서열일 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 펩티드 호르몬, 비-호르몬 펩티드, 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 수반되는 효소, 또는 박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원을 분해 또는 변형시키는 효소를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 파에니바실루스 내생포자에서 발현될 수 있고 선택된 N-말단 표적화 서열에 대해 이종인 임의의 관심 단백질이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 파에니바실루스 속의 박테리아에서 발현되는 단백질이다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 융합 단백질이 발현될 파에니바실루스 내생포자와 동일한 종의 박테리아로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 융합 단백질이 내생포자 상에서 발현될 파에니바실루스 균주로부터 단리된다. 표적화 서열은 본원에 기재된 임의의 표적화 서열일 수 있다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표적화 서열 및 식물을 병원체로부터 보호하는 적어도 1종의 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 표적화 서열은 상기 기재된 임의의 표적화 서열일 수 있다.
융합 단백질은 관련 기술분야에 공지된 표준 클로닝 및 분자 생물학 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자)는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되고 임의의 상기 기재된 표적화 서열을 코딩하는 DNA에 라이게이션되어 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 형성할 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 적합하게는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자가 용이하게 삽입될 수 있는 다수의 클로닝 부위를 포함한다. 벡터는 또한 적합하게는, 벡터로 형질전환되거나, 형질감염되거나, 메이팅된 박테리아가 용이하게 확인되고 단리될 수 있도록, 선택 마커, 예컨대 항생제 저항성 유전자를 함유한다. 벡터가 플라스미드인 경우, 플라스미드는 적합하게는 또한 복제 기점을 포함한다. 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 적합하게는 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에서 융합 단백질의 발현을 유발할 포자형성 프로모터 (예를 들어, 파에니바실루스 과 구성원으로부터의 천연 프로모터)의 제어 하에 있다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 전사는 본원에 기재된 임의의 상류 조절 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15 중 어느 것 또는 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는 그의 단편 또는 변이체)에 존재하는 프로모터에 의해 제어된다. 일부 측면에서, DNA 구축물은 본원에 기재된 임의의 조절 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15 중 어느 것) 또는 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는 그의 단편 또는 변이체의 하류에 본 개시내용에 따른 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15의 임의의 인접 50, 100, 150 또는 200개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 변이체는 포자형성 동안 전사상 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15 중 어느 것 (또는 그의 단편)과 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 1개 이상의 상류 조절 서열(들)을 갖는 융합 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9 중 어느 것의 서열 또는 그의 변이체 또는 단편)을 코딩하는 DNA는 파에니바실루스 또는 다른 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질은 또한 표적화 서열의 일부가 아닌 추가의 폴리펩티드 서열 또는 연결된 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 융합 단백질 자체 또는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포의 포자의 정제를 용이하게 하는 태그 또는 마커 (예를 들어, 폴리히스티딘 태그) 또는 가시화를 용이하게 하는 태그 또는 마커 (예를 들어, 형광 단백질, 예컨대 GFP 또는 YFP)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 표적화 서열을 사용한 포자 표면 상의 융합 단백질의 발현은 융합된 단백질의 천연 폴딩 및 활성의 유지를 가능하게 하는 이들 서열의 아미노-말단에서의 2차 구조의 결여로 인해 증진된다. 적절한 폴딩은 표적화 서열과 융합 파트너 단백질 사이에 짧은 아미노산 링커를 포함시킴으로써 추가로 증진될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 임의의 융합 단백질은 표적화 서열과 연결된 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드) 사이에 아미노산 링커를 포함할 수 있다.
링커는 폴리알라닌 링커 또는 폴리글리신 링커를 포함할 수 있다. 알라닌 및 글리신 잔기 둘 다의 혼합물을 포함하는 링커가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적화 서열이 서열식별번호: 2를 포함하는 경우, 융합 단백질은 하기 구조 중 하나를 가질 수 있다:
링커 없음: 서열식별번호: 2-융합 파트너 단백질
알라닌 링커: 서열식별번호: 2-An-융합 파트너 단백질
글리신 링커: 서열식별번호: 2-Gn-융합 파트너 단백질
혼합 알라닌 및 글리신 링커: 서열식별번호: 2-(A/G)n-융합 파트너 단백질
여기서 An, Gn 및 (A/G)n은 각각 임의의 수의 알라닌, 임의의 수의 글리신, 또는 임의의 수의 알라닌 및 글리신의 혼합물이다.
예를 들어, n은 1 내지 25의 임의의 정수, 예컨대 6 내지 10의 정수일 수 있다. 링커가 알라닌 및 글리신 잔기의 혼합물을 포함하는 경우, 글리신 및 알라닌 잔기의 임의의 조합이 사용될 수 있다. N-말단 표적화 서열은 상기 제시된 바와 같은 서열식별번호: 2로 나타내어진다. 그러나, 본원에 개시된 임의의 다른 N-말단 표적화 서열이 상기 예시적인 구성에서 서열식별번호: 2 대신에 치환될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 4, 6, 8 또는 10 또는 그의 단편 또는 변이체). 상기 제시된 구조에서, "융합 파트너 단백질"은 연결된 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드)을 나타낸다.
대안적으로 또는 추가로, 링커는 프로테아제 인식 부위를 포함할 수 있다. 프로테아제 인식 부위의 포함은 프로테아제 인식 부위를 인식하는 프로테아제에 노출 시, 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서의 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드)의 표적화된 제거를 가능하게 한다.
특정 측면에서, 융합 단백질은 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 수반되는 효소, 예컨대 아세토인 리덕타제, 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제, 트립토판 모노옥시게나제, 아세토락테이트 신테타제, α-아세토락테이트 데카르복실라제, 피루베이트 데카르복실라제, 디아세틸 리덕타제, 부탄디올 데히드로게나제, 아미노트랜스퍼라제, 트립토판 데카르복실라제, 아민 옥시다제, 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제, 인돌-3-아세트알데히드 데히드로게나제, 트립토판 측쇄 옥시다제, 니트릴 히드롤라제, 니트릴라제, 펩티다제, 프로테아제, 아데노신 포스페이트 이소펜테닐트랜스퍼라제, 포스파타제, 아데노신 키나제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제, CYP735A, 5'-리보뉴클레오티드 포스포히드롤라제, 아데노신 뉴클레오시다제, 제아틴 시스-트랜스 이소머라제, 제아틴 O-글루코실트랜스퍼라제, β-글루코시다제, 시스-히드록실라제, CK 시스-히드록실라제, CK N-글루코실트랜스퍼라제, 2,5-리보뉴클레오티드 포스포히드롤라제, 아데노신 뉴클레오시다제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 제아틴 리덕타제, 히드록실아민 리덕타제, 2-옥소글루타레이트 디옥시게나제, 지베렐산 2B/3B 히드롤라제, 지베렐린 3-옥시다제, 지베렐린 20-옥시다제, 키토사나제, 키티나제, β-1,3-글루카나제, β-1,4-글루카나제, β-1,6-글루카나제, 아미노시클로프로판-1-카르복실산 데아미나제, nod 인자를 생산하는데 수반되는 효소 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다.
다른 측면에서, 융합 단백질은 박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원을 분해 또는 변형시키는 효소, 예컨대 셀룰라제, 리파제, 리그닌 옥시다제, 프로테아제, 글리코시드 히드롤라제, 포스파타제, 니트로게나제, 뉴클레아제, 아미다제, 니트레이트 리덕타제, 니트라이트 리덕타제, 아밀라제, 암모니아 옥시다제, 리그니나제, 글루코시다제, 포스포리파제, 피타제, 펙티나제, 글루카나제, 술파타제, 우레아제, 크실라나제, 시데로포어 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표적화 서열, 포자 표면 단백질 또는 융합 단백질의 포자 표면 단백질 단편에 천연인 포자형성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 융합 단백질은 고-발현 포자형성 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 특정 측면에서, 고-발현 포자형성 프로모터는 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열을 포함한다. 선택된 측면에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 표적화 서열에 천연인 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 일부 경우에, 표적화 서열에 천연인 프로모터는 고-발현 포자형성 프로모터일 것이다. 다른 경우에, 표적화 서열에 천연인 프로모터는 고-발현 포자형성 프로모터가 아닐 것이다. 후자의 경우에, 천연 프로모터를 고-발현 포자형성 프로모터로 대체하는 것이 유리할 수 있다. 고-발현 포자형성 프로모터의 제어 하의 융합 단백질의 발현은 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상의 융합 단백질의 증가된 발현을 제공한다. 고-발현 포자형성 프로모터는 1개 이상의 시그마-K 포자형성-특이적 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 융합 단백질은 표적화 서열 및 성장 자극 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있는 적어도 1종의 이종 단백질을 포함할 수 있다. 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드는 특히 펩티드 호르몬, 비-호르몬 펩티드, 식물 성장-자극 화합물의 생산 또는 활성화에 수반되는 효소, 또는 박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원을 분해 또는 변형시키는 효소를 포함할 수 있다. 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드는 식물 성장-자극 화합물의 생산 또는 활성화에 수반되는 효소를 포함할 수 있다. 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 수반되는 효소는 식물 성장을 자극하거나 식물 구조를 변경시키는 화합물에 대한 생물학적 합성 경로의 임의의 단계를 촉매하는 임의의 효소, 또는 식물 성장을 자극하거나 식물 구조를 변경시키는 화합물의 불활성 또는 덜 활성인 유도체에서 화합물의 활성 또는 더 활성인 형태로의 전환을 촉매하는 임의의 효소일 수 있다. 대안적으로, 식물 성장-자극 화합물은 식물 성장 호르몬, 예를 들어 시토키닌 또는 시토키닌 유도체, 에틸렌, 옥신 또는 옥신 유도체, 지베렐산 또는 지베렐산 유도체, 아브시스산 또는 아브시스산 유도체, 또는 자스몬산 또는 자스몬산 유도체를 포함할 수 있다.
효소가 프로테아제 또는 펩티다제를 포함하는 경우, 프로테아제 또는 펩티다제는 단백질, 펩티드, 전구단백질 또는 전전구단백질을 절단하여 생물활성 펩티드를 생성하는 프로테아제 또는 펩티다제일 수 있다. 생물활성 펩티드는 생물학적 활성을 발휘하는 임의의 펩티드일 수 있다. 단백질, 펩티드, 전구단백질 또는 전전구단백질을 절단하여 생물활성 펩티드를 생성하는 프로테아제 또는 펩티다제는 서브틸리신, 산 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 프로테이나제, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제, 써모리신, 파파인, 펩신, 트립신, 프로나제, 카르복실라제, 세린 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제 또는 메탈로프로테아제를 포함할 수 있다.
식물 성장 자극 단백질은 또한 박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원을 분해하거나 변형시키는 효소를 포함할 수 있다. 이러한 효소는 셀룰라제, 리파제, 리그닌 옥시다제, 프로테아제, 글리코시드 히드롤라제, 포스파타제, 니트로게나제, 뉴클레아제, 아미다제, 니트레이트 리덕타제, 니트라이트 리덕타제, 아밀라제, 암모니아 옥시다제, 리그니나제, 글루코시다제, 포스포리파제, 피타제, 펙티나제, 글루카나제, 술파타제, 우레아제, 크실라나제 및 시데로포어를 포함한다. 식물 성장 배지 내로 도입되거나 또는 식물, 종자, 또는 식물 또는 식물 종자 주위의 영역에 적용되는 경우에, 박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원을 분해 또는 변형시키는 효소를 포함하는 융합 단백질은 식물 근처에서 영양소의 프로세싱을 보조하고, 식물에 의한 또는 식물 근처에서 유익한 박테리아 또는 진균에 의한 영양소의 증진된 흡수를 유발할 수 있다. 융합 단백질은 표적화 서열 및 식물을 병원체로부터 보호하는 적어도 1종의 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 식물 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 펩티드는 식물 면역계 증진제 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 식물 면역계 증진제 단백질 또는 펩티드는 식물의 면역계에 유익한 효과를 갖는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드는 항박테리아 활성, 항진균 활성 또는 항박테리아 및 항진균 활성 둘 다를 갖는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드는 또한 살곤충 활성을 갖거나, 살연충 활성을 갖거나, 곤충 또는 벌레 포식을 억제하거나 또는 그의 조합인 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질은 효소를 포함할 수 있다. 적합한 효소는 프로테아제 및 락토나제를 포함한다. 프로테아제 및 락토나제는 박테리아 신호전달 분자 (예를 들어, 박테리아 락톤 호모세린 신호전달 분자)에 특이적일 수 있다. 효소는 또한 박테리아 또는 진균의 세포 성분에 특이적인 효소일 수 있다.
융합 단백질은 표적화 서열 및 식물에서 스트레스 저항성을 증진시키는 적어도 1종의 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물에서 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 또는 펩티드는 스트레스-관련 화합물을 분해하는 효소를 포함한다. 스트레스-관련 화합물은 아미노시클로프로판-1-카르복실산 (ACC), 반응성 산소 종, 산화질소, 옥시리핀 및 페놀계를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 구체적 반응성 산소 종은 히드록실, 과산화수소, 산소 및 슈퍼옥시드를 포함한다. 스트레스-관련 화합물을 분해하는 효소는 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 옥시다제, 카탈라제, 아미노시클로프로판-1-카르복실산 데아미나제, 퍼옥시다제, 항산화제 효소 또는 항산화제 펩티드를 포함할 수 있다.
식물에서 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 또는 펩티드는 또한 식물을 환경적 스트레스로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 환경적 스트레스는, 예를 들어 가뭄, 홍수, 열, 동결, 염, 중금속, 낮은 pH, 높은 pH 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물을 환경적 스트레스로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드는 빙핵형성 단백질, 프롤리나제, 페닐알라닌 암모니아 리아제, 이소코리스메이트 신타제, 이소코리스메이트 피루베이트 리아제 또는 콜린 데히드로게나제를 포함할 수 있다.
융합 단백질은 표적화 서열 및 적어도 식물 결합 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 식물 결합 단백질 또는 펩티드는 식물의 임의의 부분 (예를 들어, 식물 뿌리 또는 식물의 공중 부분, 예컨대 잎, 줄기, 꽃 또는 과실) 또는 식물 물질에 특이적으로 또는 비-특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 따라서, 예를 들어 식물 결합 단백질 또는 펩티드는 뿌리 결합 단백질 또는 펩티드, 또는 잎 결합 단백질 또는 펩티드일 수 있다.
융합 단백질을 발현하는 재조합 파에니바실루스 내생포자 및 세포
본원에 기재된 융합 단백질은 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 (예를 들어, 피. 테라에)에 의해 발현될 수 있다. 융합 단백질은 상기 논의된 임의의 융합 단백질일 수 있다. 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포는 상기 논의된 임의의 융합 단백질 중 2종 이상을 공동-발현할 수 있다. 예를 들어, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포는 식물 결합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 적어도 1종의 융합 단백질을, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드를 포함하는 적어도 1종의 융합 단백질, 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드를 포함하는 적어도 1종의 융합 단백질, 또는 식물에서 스트레스 저항성을 증진시키는 적어도 1종의 단백질 또는 펩티드와 함께 공동-발현할 수 있다.
재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스 세포, 예컨대 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사 또는 파에니바실루스 페오리아에 세포를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 내생포자-생산 파에니바실루스 세포는 본원에 기재된 임의의 예시적인 파에니바실루스 종으로부터 선택될 수 있다.
융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 생성하기 위해, 임의의 파에니바실루스 박테리아를 관련 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 (예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 사용한 전기천공에 의해) 형질전환시킬 수 있다. 이어서 박테리아는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 형질전환체를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 벡터가 항생제 저항성 유전자를 포함하는 경우, 박테리아는 항생제 저항성에 대해 스크리닝될 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 파에니바실루스 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포는 이어서 포자형성을 유도할 조건에 노출될 수 있다. 포자형성을 유도하기 위한 적합한 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 약 30℃의 온도에서 수일 (예를 들어, 3일) 동안 인큐베이션하거나 또는 대안적으로 쉐퍼 포자형성 배지에서 배양할 수 있다.
임의의 상기 종의 불활성화된 균주, 비-독성 균주 또는 유전자 조작된 균주가 또한 적합하게 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 융합 단백질을 발현하는 재조합 파에니바실루스 과 포자가 생성되면, 이들은 사용시에 추가의 발아를 방지하기 위해 불활성화될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 박테리아 포자를 불활성화시키는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은, 비제한적으로, 열 처리, 감마선 조사, X선 조사, UV-A 조사, UV-B 조사, 화학적 처리 (예를 들어, 글루타르알데히드, 포름알데히드, 과산화수소, 아세트산, 표백제 또는 그의 임의의 조합으로의 처리) 또는 그의 조합을 포함한다. 대안적으로, 비독소생성 균주 또는 유전적으로 또는 물리적으로 불활성화된 균주로부터 유래된 포자가 사용될 수 있다.
본 개시내용에 따른 융합 단백질 구축물은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 N-말단 신호 서열 또는 그의 변이체 또는 단편 및 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열 및 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열은 직접적으로 연결된다. 다른 측면에서, 개재 링커 또는 스페이서 서열이 존재할 수 있다. 추가 측면에서, 절단 서열 또는 다른 조절 서열이 2개의 영역 사이에 위치할 수 있다. N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열은 1개 이상의 기능적 단백질을 포함할 수 있다. 다수의 기능적 단백질이 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열에 함유되는 측면에서, 적어도 1개의 스페이서, 절단 서열 또는 다른 조절 요소는 2개 이상의 기능적 단백질 사이에 위치할 수 있다.
N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열은, 예를 들어 (a) 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드; (b) 식물을 병원체로부터 보호하는 단백질 또는 펩티드; (c) 식물의 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 또는 펩티드; (d) 식물 결합 단백질 또는 펩티드; (e) 식물 면역계 증진제 단백질 또는 펩티드; 또는 (f) 영양소 흡수를 증진시키는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 파에니바실루스에서 발현되는 경우에, 이들 융합 단백질은 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화되고, 단백질 또는 펩티드가 포자의 외부에 디스플레이되도록 물리적으로 배향된다.
이러한 파에니바실루스 포자 표면 디스플레이 시스템은 펩티드, 효소 및 다른 단백질을 식물 (예를 들어, 식물 잎, 과실, 꽃, 줄기 또는 뿌리) 또는 식물 성장 배지, 예컨대 토양에 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 토양 또는 또 다른 식물 성장 배지에 전달되는 펩티드, 효소 및 단백질은 장기간 동안 토양에서 지속되고 활성을 나타낸다. 본원에 기재된 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 토양 또는 식물의 근권 내로 도입하는 것은 많은 상이한 토양 조건에서 식물 성장의 유익한 증진으로 이어질 수 있다. 파에니바실루스 포자 표면 디스플레이 시스템을 사용하여 이들 효소를 생성하는 것은 이들이 식물 수명의 제1 개월에 걸쳐 및 일부 측면에서는 식물의 수명을 포함한 보다 긴 기간에 걸쳐 식물 및 근권에 대한 그의 유익한 효과를 계속 발휘하도록 한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 임의의 측면에 따른 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 또는 이러한 세포에 의해 생산된 내생포자를 포함하는 조성물은 식물에 (예를 들어, 분말, 현탁액 또는 용액으로서, 종자에 또는 재배지에) 직접적으로 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 조성물은 파종 전 또는 후에 또는 대안적으로 발아 전 또는 후에 (예를 들어, 식재전 또는 식재후 또는 출아전 또는 출아후) 재배지에 적용된다.
대안적 측면에서, 본원에 개시된 융합 단백질 및/또는 조성물은 재조합 파에니바실루스 세포 또는 포자를 식물, 종자 또는 재배지에 적용함으로써 식물, 종자 및/또는 재배지에 간접적으로 전달될 수 있다. 이들 측면에서, 융합 단백질은 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 (예를 들어 재배지에서) 발현 또는 생성되어, 융합 단백질의 식물, 종자 또는 재배지로의 전달을 유발할 수 있다.
식물-성장 촉진 효과 및/또는 다른 유익한 속성을 갖는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포
일부 파에니바실루스 박테리아는 고유한 유익한 속성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 균주는 식물-성장 촉진 또는 살곤충 (예를 들어, 살모기) 효과를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 융합 단백질은 이러한 균주에서 발현될 수 있다.
예를 들어, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스의 식물-성장 촉진 균주를 포함할 수 있다. 박테리아의 식물-성장 촉진 균주는 살곤충 독소 (예를 들어, 빈 독소)를 생산하거나, 살진균 화합물 (예를 들어, β-1,3-글루카나제, 키토사나제, 리티카제 또는 그의 조합)을 생산하거나, 살선충 화합물 (예를 들어, Cry 독소)을 생산하거나, 살박테리아 화합물을 생산하거나, 1종 이상의 항생제에 대해 저항성이거나, 1종 이상의 자유롭게 복제하는 플라스미드를 포함하거나, 식물 뿌리에 결합하거나, 식물 뿌리에 콜로니화하거나, 바이오필름을 형성하거나, 영양소를 가용화하거나, 유기 산을 분비하거나 또는 그의 임의의 조합인 박테리아의 균주를 포함할 수 있다.
생물학적 방제제
본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 생물학적 방제제를 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 방제제는 특히 박테리아, 진균 또는 효모, 원충, 바이러스, 곤충병원성 선충류, 접종물 및 식물 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징을 갖는 그의 돌연변이체 및/또는 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 대해 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 1종의 대사물을 포함할 수 있다. 본 개시내용은 상기 기재된 재조합 파에니바실루스 내생포자와 본원에 기재된 특정한 생물학적 방제제 및/또는 본원에 기재된 미생물의 특정 균주의 돌연변이체 (여기서 돌연변이체는 각각의 균주의 모든 식별 특징을 가짐) 및/또는 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 대해 활성을 나타내거나 식물 성장을 촉진하고/거나 식물 건강을 증진시키는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 1종의 대사물과의 조합물을 제공한다. 본 개시내용에 따르면, 본원에 기재된 생물학적 방제제는 임의의 생리학적 상태, 예컨대 활성 또는 휴면 상태로 이용 또는 사용될 수 있다.
예시적인 조성물
선택된 측면에서, 본 개시내용은 a) 관심 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 파에니바실루스 과 구성원의 포자 표면에 국재화시키는 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포; 및 b) 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 및 상이한 특정한 생물학적 방제제 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징을 갖는 본원에 개시된 미생물의 특정 균주의 돌연변이체 및/또는 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 대해 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 1종의 대사물을 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물을 제공한다. 대안적 측면에서, 조성물은 적어도 1종의 추가의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제를 포함하며, 단 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포, 살곤충제 및 살진균제는 동일하지 않다. 또 다른 측면에서, 조성물은 식물 및 식물 부분의 전반적 손상, 뿐만 아니라 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 의해 유발된 수확된 과실 또는 채소의 손실을 감소시키는데 사용된다. 또 다른 측면에서, 조성물은 전반적 식물 건강을 증가시킨다.
용어 "식물 건강"은 일반적으로 해충 방제와 연관되지 않은 식물의 다양한 종류의 개선을 포함한다. 예를 들어, 언급될 수 있는 유리한 특성은 출아, 작물 수확량, 단백질 함량, 오일 함량, 전분 함량, 보다 발달된 뿌리계, 개선된 뿌리 성장, 개선된 뿌리 크기 유지, 개선된 뿌리 유효성, 개선된 스트레스 내성 (예를 들어, 가뭄, 열, 염, UV, 물, 추위에 대한 것), 감소된 에틸렌 (감소된 생산 및/또는 수용의 억제), 분얼 증가, 식물 높이의 증가, 보다 큰 잎새, 보다 적은 죽은 기부 잎, 보다 강한 분얼경, 보다 푸른 잎 색, 색소 함량, 광합성 활성, 보다 적은 투입물 필요량 (예컨대 비료 또는 물), 보다 적은 종자 필요량, 보다 생산적인 분얼경, 보다 이른 개화, 이른 곡물 성숙, 보다 적은 식물 쓰러짐 (도복), 증가된 싹 성장, 증진된 식물 활력, 증가된 식물 생립 및 이르고 보다 우수한 발아를 포함한 개선된 작물 특징이다.
본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 동일한 환경 조건 하에 대해 성장한 식물을 비교함으로써 식물 성장, 건강 또는 다른 양성 속성에 대한 잠재적 이익을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있으며, 여기서 상기 식물의 한 부분은 본 개시내용에 따른 조성물로 처리되고, 상기 식물의 또 다른 부분은 본 개시내용에 따른 조성물로 처리되지 않는다. 대신에, 상기 다른 부분은 전혀 처리되지 않거나 또는 적합한 대조군 (즉, 본 개시내용에 따른 조성물이 없는 적용, 예컨대 모든 활성 성분이 없는 적용), 본원에 기재된 바와 같은 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포가 없는 적용, 또는 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제가 없는 적용으로 처리된다.
본 개시내용에 따른 조성물은 임의의 목적하는 방식으로, 예컨대 종자 코팅, 토양 드렌치의 형태로 및/또는 고랑내로 직접적으로 및/또는 잎 분무로서 적용될 수 있고, 출아전, 출아후 또는 둘 다에 적용될 수 있다. 다시 말해서, 조성물은 종자, 식물 또는 수확된 과실 및 채소에 또는 식물이 성장하고 있거나 성장하기에 바람직한 토양 (식물의 성장 생육지)에 적용될 수 있다.
식물 및 식물 부분의 전반적 손상을 감소시키는 것은 종종 보다 건강한 식물 및/또는 식물 활력 및 수확량의 증가를 가져온다. 바람직하게는, 본 개시내용에 따른 조성물은 통상적인 또는 트랜스제닉인 식물 또는 그의 종자를 처리하는데 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 동물 건강 또는 이러한 동물의 일반적인 전반적 신체 상태를 개선시킨다. 증진된 건강의 지표는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 동물에서의 질환 상태의 호전 또는 역전; 동물의 특정 부분의 체중 증가 또는 전체 체중 증가를 포함할 수 있는 체중 증가의 증가; 장 미생물총의 유지; 사료 이용 효율의 증가; 사망 위험의 감소; 질환 저항성의 증가; 이환율의 감소; 면역 반응의 증가; 설사 발생의 감소, 생산성의 증가; 및/또는 병원체 배출의 감소. 본 개시내용은 또한 동물에게 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 포함하는 상기 기재된 임의의 조성물의 치료량 또는 유효량을 투여함으로써 동물 건강을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 이러한 융합 단백질은 사료의 소화를 보조하는 효소, 예컨대 아밀라제, 글루카나제, 글루코아밀라제, 셀룰라제, 크실라나제, 글루카나제 및 펙티나제 또는 면역 조정제, 예컨대 항체를 포함한다. 조성물의 유효량은, 조성물을 투여받지는 않았지만 달리 본 발명의 조성물을 받은 동물과 동일한 식이 (사료 및 다른 화합물 포함)를 투여받은 동물과 비교하여 동물의 건강을 증진시키는데 유효한 양이다. 용어 "치료량"은 동물에서 질환 상태를 호전 또는 역전시키기에 충분한 양을 지칭한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 배지, 예컨대 토양, 지하수, 유사수 또는 지표수로부터 오염 또는 오염물을 제거한다. 본 개시내용은 또한 포자 표면 상에 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 포함하는 상기 기재된 임의의 조성물의 유효량을 배지, 예컨대 토양, 지하수, 유사수 또는 지표수에 적용함으로써 상기 배지로부터 오염 또는 오염물을 제거하는 방법에 관한 것이다.
재조합 파에니바실루스 구축물 및 조성물의 사용 방법
본 개시내용은 또한 융합 단백질 및 본원에 기재된 추가의 특정한 생물학적 방제제 중 적어도 1종을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 포함하는 상기 기재된 임의의 조성물을 사용하여 식물 성장을 자극하는 방법에 관한 것이다. 식물 성장을 자극하는 방법은 (i) 이종 단백질 (예를 들어, 적어도 1종의 식물 성장 자극 단백질); 및 (ii) 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포; 및 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징을 갖는 본원에 개시된 미생물의 특정 균주의 돌연변이체 및/또는 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 대해 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 1종의 대사물을 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물을 식물, 종자, 식물 부분, 식물 주위 또는 식물이 식재될 생육지 (예를 들어, 토양 또는 다른 성장 배지)에 적용하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제를 상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 및 식물 부분의 전반적 손상뿐만 아니라 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 의해 유발된 수확된 과실 또는 채소의 손실을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 방법의 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 살진균제를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 적어도 1종의 살진균제는 합성 살진균제이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 살진균제에 추가로 또는 살진균제 대신에 적어도 1종의 살곤충제를 포함하며, 단 살곤충제, 살진균제, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 특정한 생물학적 방제제는 동일하지 않다.
본 개시내용의 방법은 하기 적용 방법을 포함하며, 즉 본원에 개시된 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 둘 다는 농업상 허용되는 보관 수명을 갖는 단일의 안정한 조성물로 제제화되거나 (소위 "단독-제제") 또는 사용 전에 또는 사용 시에 조합될 수 있다 (소위 "조합-제제").
달리 언급되지 않는 한, 표현 "조합"은 단독-제제, 단일 "레디-믹스" 형태, 단독-제제로부터 구성된 조합 분무 혼합물, 예컨대 "탱크-믹스", 및 특히 순차적 방식으로, 즉 하나를 적용한 후에 합리적으로 짧은 기간, 예컨대 수시간 또는 수일, 예를 들어 2시간 내지 7일 이내에 다른 것을 적용하는 경우의 단일 활성 성분의 조합 사용에서, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제의 다양한 조합을 나타낸다. 본 개시내용에 따른 조성물을 적용하는 순서는 본 개시내용을 실시하는데 본질적이지 않다. 따라서, 용어 "조합"은 또한, 예를 들어 본원에 개시된 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제를 식물 또는 그의 주위, 서식지 또는 저장 공간에 동시에 또는 연속적으로 적용한 후에, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 살곤충제가 처리될 식물 또는 그의 주위, 서식지 또는 저장 공간 상에 또는 그 내에 존재하는 것을 포괄한다.
본원에 기재된 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제가 순차적 방식으로 이용 또는 사용되는 경우에, 하기 방법에 따라 식물 또는 식물 부분 (이는 종자 및 종자로부터 출아한 식물을 포함함), 수확된 과실 및 채소를 처리하는 것이 바람직하다: 첫째로, 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제를 식물 또는 식물 부분 상에 적용하고, 둘째로, 본원에 기재된 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 동일한 식물 또는 식물 부분에 적용한다. 이러한 적용 방식에 의해 수확시의 식물 상에서의 살곤충제/살진균제의 잔류량이 가능한 한 낮아진다. (작물) 성장 주기 내에서의 제1 적용과 제2 적용 사이의 기간은 달성하고자 하는 효과에 따라 달라지고, 그에 의존할 수 있다. 예를 들어, 제1 적용은 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 의한 식물 또는 식물 부분의 침입을 방지하기 위해 (이는 특히 종자를 처리하는 경우임) 또는 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 의한 침입을 퇴치하기 위해 (이는 특히 식물 및 식물 부분을 처리하는 경우임) 수행되고, 제2 적용은 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 의한 침입을 방지 또는 방제하고/거나 식물 성장을 촉진하기 위해 수행된다. 이와 관련하여 방제는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 특정한 생물학적 방제제를 포함하는 조성물이 해충 또는 식물병원성 진균을 완전히 근절할 수는 없지만, 침입을 허용되는 수준으로 유지할 수 있다는 것을 의미한다.
본 개시내용은 또한 다중 적용에 의해 본 개시내용의 조성물의 사멸, 억제, 방지 및/또는 기피 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 식물 및/또는 식물 부분에 2회 동안, 임의의 목적하는 발달 단계 동안 또는 임의의 미리 결정된 해충 압박 하에 약 1시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 1주, 약 10일, 약 2주, 약 3주, 약 1개월 또는 그 초과의 간격으로 적용된다. 또한 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 식물 및/또는 식물 부분에 2회 초과, 예를 들어 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과 동안 임의의 목적하는 발달 단계 동안 또는 임의의 미리 결정된 해충 압박 하에 약 1시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 1주, 약 10일, 약 2주, 약 3주, 약 1개월 또는 그 초과의 간격으로 적용된다. 각각의 적용 사이의 간격은 원하는 경우에 달라질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 식물 종, 식물 해충 종 및 다른 인자에 따라 적용 시간 및 간격의 길이를 결정할 수 있을 것이다.
상기 언급된 단계를 따름으로써, 처리된 식물, 식물 부분 및 수확된 과실 및 채소 상의 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제의 매우 낮은 잔류 수준이 달성될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용에 따른 조성물을 사용한 식물 또는 식물 부분 (이는 종자 및 종자로부터 출아한 식물을 포함함), 수확된 과실 및 채소의 처리는 직접적으로 또는 통상의 처리 방법, 예를 들어 침지, 분무, 아토마이징, 관개, 증발, 살분, 연무, 산포, 발포, 도장, 확산, 살수 (드렌칭), 점적 관개를 사용하여 그의 주위, 서식지 또는 저장 공간에 대한 작용에 의해 수행된다. 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포, 본원에 기재된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제를 단독-제제 또는 조합-제제로서 초저부피 방법에 의해 적용하거나 또는 본 개시내용에 따른 조성물을 조성물 또는 단독-제제로서 토양 내로 (고랑내로) 주입하는 것이 추가로 가능하다.
용어 "처리될 식물"은 그의 뿌리계 및 처리될 식물의 줄기(caulis/bole) 주위의 적어도 10 cm, 20 cm, 30 cm의 반경에 있거나 또는 각각 처리될 상기 식물의 뿌리계 주위의 적어도 10 cm, 20 cm, 30 cm인 물질--예를 들어, 토양 또는 영양 배지--을 포함한 식물의 모든 부분을 포괄한다.
임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제의 존재 하에 본원에 기재된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제와 조합되어 사용 또는 이용되는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포의 양은 최종 제제뿐만 아니라 처리되는 식물, 식물 부분, 종자, 수확된 과실 및 채소의 크기 또는 유형에 따라 달라진다. 통상적으로, 본 개시내용에 따라 이용 또는 사용되는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포는 그의 단독-제제 또는 본원에 기재된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제와의 조합-제제 중 약 1% 내지 약 80% (w/w), 바람직하게는 약 1% 내지 약 60% (w/w), 보다 바람직하게는 약 10% 내지 약 50% (w/w)로 존재한다.
또한, 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제의 존재 하에 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포와 조합되어 사용 또는 이용되는 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제의 양은 최종 제제뿐만 아니라 처리될 식물, 식물 부분, 종자, 수확된 과실 또는 채소의 크기 또는 유형에 따라 달라진다. 통상적으로, 본 개시내용에 따라 이용 또는 사용되는 본원에 기재된 추가의 특정한 생물학적 방제제는 그의 단독-제제 또는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제와의 조합-제제 중 약 0.1% 내지 약 80% (w/w), 바람직하게는 1% 내지 약 60% (w/w), 보다 바람직하게는 약 10% 내지 약 50% (w/w)로 존재한다.
재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포의 적용은 잎 분무로서, 토양 처리로서 및/또는 종자 처리/드레싱으로서 실시될 수 있다. 잎 처리로서 사용되는 경우에, 한 실시양태에서 에이커당 약 1/16 내지 약 5 갤런의 전체 브로쓰가 적용된다. 토양 처리로서 사용되는 경우에, 한 실시양태에서 에이커당 약 1 내지 약 5 갤런의 전체 브로쓰가 적용된다. 종자 처리에 사용되는 경우에, 에이커당 약 1/32 내지 약 1/4 갤런의 전체 브로쓰가 적용된다. 종자 처리를 위해, 최종-사용 제제는 그램당 적어도 1 x 104, 적어도 1 x 105, 적어도 1 x 106, 1 x 107, 적어도 1 x 108, 적어도 1 x 109, 적어도 1 x 1010 콜로니 형성 단위를 함유한다.
비는 본 개시내용에 따른 조합의 상기 성분을 식물 또는 식물 부분에 적용하는 시점에서의 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제의 양 및 본 개시내용에 따른 조합의 상기 성분을 식물 또는 식물 부분에 적용하기 직전 (예를 들어, 48시간, 24시간, 12시간, 6시간, 2시간, 1시간 전) 또는 그 시점에서의 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포의 양을 기준으로 하여 계산될 수 있다.
재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제의 식물 또는 식물 부분에 대한 적용은 동시에 또는 성분 둘 다가 적용(들) 후에 식물 상에 또는 식물 내에 존재하는 한 상이한 시간에 수행될 수 있다. 본원에 개시된 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 추가의 특정한 생물학적 방제제가 상이한 시간에 적용되고 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제가 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 전에 적용되는 경우에, 통상의 기술자는 식물 상/중 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제의 농도를 관련 기술분야에 공지된 화학적 분석에 의해, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 적용하는 시점에 또는 그 시점 직전에 결정할 수 있다. 그 반대로, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포를 먼저 식물에 적용하는 경우에, 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포의 농도는 또한 관련 기술분야에 공지된 시험을 사용하여, 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제를 적용하는 시점에 또는 그 시점 직전에 결정될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 바와 같은 조성물로 처리된 종자가 제공된다. 식물의 종자를 처리하는 것에 의한 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체의 방제는 오랫동안 공지되어 왔고, 계속적인 개선의 대상이다. 그럼에도 불구하고, 종자의 처리는 항상 만족스러운 방식으로 해결될 수는 없는 일련의 문제를 수반한다. 따라서, 저장 과정에서, 파종 후에 또는 식물의 출아 후에 작물 보호 조성물의 추가의 전달에 대한 필요를 제거하거나 또는 적어도 유의하게 감소시키는, 종자 및 발아 식물을 보호하는 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 추가로, 사용되는 활성 성분의 양을, 사용되는 활성 성분에 의한 식물 자체에 대한 손상을 초래하지 않으면서도 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 의한 공격으로부터 종자 및 발아 식물에 대해 가능한 한 가장 우수한 보호를 제공하도록 하는 방식으로 최적화하는 것이 바람직하다. 특히, 종자를 처리하는 방법은 또한 종자 및 발아 식물의 최적 보호를 작물 보호 조성물의 최소 사용으로 달성하기 위해, 해충-저항성 또는 해충-내성 트랜스제닉 식물의 고유 살곤충 및/또는 살선충 특성을 고려해야 한다.
따라서 본 개시내용은 또한 특히 종자를 본 개시내용의 상기 정의된 바와 같은 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 특정한 미생물 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징을 갖는 본원에 개시된 미생물의 특정 균주의 돌연변이체 및/또는 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 대해 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 1종의 대사물로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 임의로 적어도 1종의 살곤충제로 처리함으로써, 종자 및 발아 식물을 해충에 의한 공격으로부터 보호하는 방법에 관한 것이다. 종자 및 발아 식물을 해충에 의한 공격으로부터 보호하는 본 개시내용의 방법은 종자를 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제로 하나의 작업에서 동시에 처리하는 방법을 포괄한다. 이는 또한 종자를 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제로 상이한 시간에 처리하는 방법을 포괄한다.
본 개시내용은 종자 및 생성된 식물을 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체에 대해 보호할 목적으로 종자를 처리하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 또한 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제로 동시에 처리된 종자에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제로 상이한 시간에 처리된 종자에 관한 것이다. 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 1종의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 1종의 살진균제 및/또는 적어도 1종의 살곤충제로 상이한 시간에 처리된 종자의 경우에, 본 개시내용의 조성물 중 개별 활성 성분은 종자 상의 상이한 층에 존재할 수 있다.
추가로, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물로 처리한 후, 종자의 분진 마모를 방지하기 위해 필름-코팅 공정에 적용되는 종자에 관한 것이다.
본 개시내용의 이점 중 하나는, 본 개시내용의 조성물의 특정한 침투성 특성으로 인해, 이들 조성물을 사용한 종자의 처리가 종자 자체에 대해서뿐만 아니라 이들이 출아한 후에 종자로부터 기원하는 식물에 대해 곤충, 응애, 선충류 및/또는 식물병원체로부터의 보호를 제공한다는 것이다. 이러한 방식으로, 파종 시점에 또는 그 직후에 작물을 직접적으로 처리하는 것이 필요하지 않을 수 있다. 추가의 이점은, 종자를 본 개시내용의 조성물로 처리함으로써, 처리된 종자의 발아 및 출아가 촉진될 수 있다는 사실에서 보여진다.
본 개시내용의 조성물은 농업, 온실, 임업 또는 원예에 사용되는 임의의 다양한 식물의 종자를 보호하는데 적합하다. 보다 특히, 해당 종자는 곡류 (예를 들어, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 기장), 옥수수, 목화, 대두, 벼, 감자, 해바라기, 커피, 담배, 카놀라, 유지종자 평지, 비트 (예를 들어, 사탕무 및 사료용 비트), 땅콩, 채소 (예를 들어, 토마토, 오이, 콩, 브라시카, 양파 및 상추), 과실 식물, 잔디 및 관상식물의 종자이다. 곡류 (예컨대, 밀, 보리, 호밀 및 귀리), 옥수수, 대두, 목화, 카놀라, 유지종자 평지 및 벼의 종자의 처리가 특히 중요하다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본 개시내용의 조성물은 단독으로 또는 적합한 제제로 종자에 적용된다. 종자는 바람직하게는 그의 안정성이 처리 과정에서 손상이 발생하지 않을 정도인 조건으로 처리된다. 일반적으로 말하면, 종자는 수확과 파종 사이의 시간 중 임의의 시점에 처리될 수 있다. 전형적으로, 식물로부터 분리하고, 속대, 겨, 줄기, 껍질, 털 또는 펄프를 제거한 종자가 사용된다. 따라서, 예를 들어 수확하고, 세척하고, 15 중량% 미만의 수분 함량으로 건조시킨 종자가 사용될 수 있다. 대안적으로, 건조 후에 예를 들어 물로 처리한 다음 다시 건조시킨 종자가 또한 사용될 수 있다.
종자를 처리하는 경우, 일반적으로 말하면, 종자에 적용되는 본 개시내용의 조성물 및/또는 다른 첨가제의 양이 종자의 발아가 유해한 영향을 받지 않고/거나 종자로부터 출아하는 식물이 손상되지 않도록 선택되는 것을 보장하는 것이 필요하다. 이는 특정 적용률에서 식물독성 효과를 나타낼 수 있는 활성 성분의 경우에 특히 그러하다.
본 개시내용의 조성물은 직접적으로, 다시 말해서 추가의 성분을 포함하지 않고 희석되지 않고 적용될 수 있다. 일반적으로, 조성물을 적합한 제제 형태로 종자에 적용하는 것이 바람직하다. 적합한 제제 및 종자 처리 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 4,272,417 A; 4,245,432 A; 4,808,430 A; 5,876,739 A; 미국 특허 공개 번호 2003/0176428 A1; WO 2002/080675 A1; WO 2002/028186 A2 (이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함됨).
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 조합은 통상의 종자-드레싱 제제, 예컨대 용액, 에멀젼, 현탁액, 분말, 발포체, 슬러리 또는 종자를 위한 다른 코팅 조성물 및 또한 ULV 제제로 전환될 수 있다. 이들 제제는 공지된 방식으로, 조성물을 통상적인 아주반트, 예컨대, 예를 들어 통상적인 증량제 및 또한 용매 또는 희석제, 착색제, 습윤제, 분산제, 유화제, 소포제, 보존제, 2차 증점제, 점착제, 지베렐린 및 또한 물과 혼합함으로써 제조된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 종자-드레싱 제제 중에 존재할 수 있는 착색제는 이러한 목적에 통상적인 모든 착색제를 포함한다. 이와 관련하여, 물 중에서 낮은 용해도를 갖는 안료뿐만 아니라 수용성 염료를 사용하는 것이 가능하다. 예는 명칭 로다민 B, C.I. 피그먼트 레드 112 및 C.I. 솔벤트 레드 1 하에 공지된 착색제를 포함한다.
식물 종 또는 식물 재배품종, 그의 위치 및 성장 조건 (토양, 기후, 식생 기간, 식이)에 따라, 본 개시내용에 따른 조성물을 사용 또는 이용하는 것은 또한 초상가적 ("상승작용적") 효과를 유발할 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 개시내용에 따른 처리에서 본 발명의 조성물을 사용 또는 이용함으로써, 감소된 적용률 및/또는 활성 스펙트럼의 확장 및/또는 활성의 증가, 보다 우수한 식물 성장, 고온 또는 저온에 대한 증가된 내성, 가뭄 또는 물 또는 토양 염 함량에 대한 증가된 내성, 증가된 개화 성능, 보다 용이한 수확, 가속화된 성숙, 보다 높은 수확량, 보다 큰 과실, 보다 큰 식물 높이, 보다 푸른 잎 색, 보다 이른 개화, 수확된 생성물의 보다 높은 품질 및/또는 보다 높은 영양가, 과실 내의 보다 높은 당 농도, 수확된 생성물의 보다 우수한 저장 안정성 및/또는 가공성이 가능하며, 이는 실제로 예상되는 효과를 능가한다.
본 개시내용에 따른 처리에서 본 발명의 조성물의 특정 적용률에서 또한 식물에 강화 효과를 가질 수 있다. 원치않는 식물병원성 진균 및/또는 미생물 및/또는 바이러스에 의한 공격에 대한 식물의 방어 시스템이 동원된다. 식물-강화 (저항성-유도) 물질은, 본 발명의 문맥에서, 원치않는 식물병원성 진균 및/또는 미생물 및/또는 바이러스로 후속적으로 접종되는 경우에, 처리된 식물이 이들 식물병원성 진균 및/또는 미생물 및/또는 바이러스에 대해 상당한 정도의 저항성을 디스플레이하는 방식으로 식물의 방어 시스템을 자극할 수 있는 물질 또는 물질의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 조성물을 본 개시내용에 따른 처리에 사용 또는 이용함으로써, 식물은 처리 후 특정 기간 내에 상기 언급된 병원체에 의한 공격에 대해 보호될 수 있다. 보호가 효과를 발휘하는 기간은 일반적으로 활성 화합물로 식물을 처리한 후 1 내지 10일, 바람직하게는 1 내지 7일에 이른다.
본원에 개시된 임의의 조성물은 1종 이상의 농약을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 개시내용에 따른 조성물을 적용하는 방법은 적어도 1종의 농약을 식물 성장 배지 내로 도입하거나 또는 적어도 1종의 농약을 식물 또는 종자에 적용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
농약은 비료 (예를 들어, 액체 비료), 미량영양소 비료 물질 (예를 들어, 붕산, 보레이트, 붕소 프릿, 황산구리, 구리 프릿, 구리 킬레이트, 사붕산나트륨 10수화물, 황산철, 산화철, 황산암모늄철, 철 프릿, 철 킬레이트, 황산망가니즈, 산화망가니즈, 망가니즈 킬레이트, 염화망가니즈, 망가니즈 프릿, 몰리브데넘산나트륨, 몰리브데넘산, 황산아연, 산화아연, 탄산아연, 아연 프릿, 인산아연, 아연 킬레이트 또는 그의 조합), 살곤충제 (예를 들어, 유기포스페이트, 카르바메이트, 피레트로이드, 살진드기제, 알킬 프탈레이트, 붕산, 보레이트, 플루오라이드, 황, 할로방향족 치환된 우레아, 탄화수소 에스테르, 생물학적-기반 살곤충제 또는 그의 조합), 제초제 (예를 들어, 클로로페녹시 화합물, 니트로페놀계 화합물, 니트로크레졸계 화합물, 디피리딜 화합물, 아세트아미드, 지방족 산, 아닐리드, 벤즈아미드, 벤조산, 벤조산 유도체, 아니스산, 아니스산 유도체, 벤조니트릴, 벤조티아디아지논 디옥시드, 티오카르바메이트, 카르바메이트, 카르바닐레이트, 클로로피리디닐, 시클로헥세논 유도체, 디니트로아미노벤젠 유도체, 플루오로디니트로톨루이딘 화합물, 이속사졸리디논, 니코틴산, 이소프로필아민, 이소프로필아민 유도체, 옥사디아졸리논, 포스페이트, 프탈레이트, 피콜린산 화합물, 트리아진, 트리아졸, 우라실, 우레아 유도체, 엔도탈, 염소산나트륨 또는 그의 조합), 살진균제 (예를 들어, 치환된 벤젠, 티오카르바메이트, 에틸렌 비스 디티오카르바메이트, 티오프탈리다미드, 구리 화합물, 유기수은 화합물, 유기주석 화합물, 카드뮴 화합물, 아닐라진, 베노밀, 시클로헥사미드, 도딘, 에트리디아졸, 이프로디온, 메탈락실, 티아미메폰, 트리포린 또는 그의 조합), 살연체동물제, 살조제, 식물 성장 개량제, 박테리아 접종물 (예를 들어, 리조비움(Rhizobium) 속의 박테리아 접종물, 브라디리조비움(Bradyrhizobium) 속의 박테리아 접종물, 메소리조비움(Mesorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 아조리조비움(Azorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 알로리조비움(Allorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 시노리조비움(Sinorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 클루이베라(Kluyvera) 속의 박테리아 접종물, 아조토박터(Azotobacter) 속의 박테리아 접종물, 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 박테리아 접종물, 아조스피릴룸(Azospirillum) 속의 박테리아 접종물, 바실루스(Bacillus) 속의 박테리아 접종물, 스트렙토미세스(Streptomyces) 속의 박테리아 접종물, 파에니바실루스(Paenibacillus) 속의 박테리아 접종물, 파라코쿠스(Paracoccus) 속의 박테리아 접종물, 엔테로박터(Enterobacter) 속의 박테리아 접종물, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속의 박테리아 접종물, 미코박테리움(Mycobacterium) 속의 박테리아 접종물, 트리코더마(Trichoderma) 속의 박테리아 접종물, 글리오클라디움(Gliocladium) 속의 박테리아 접종물, 글로무스(Glomus) 속의 박테리아 접종물, 클레브시엘라(Klebsiella) 속의 박테리아 접종물 또는 그의 조합), 진균 접종물 (예를 들어, 글로메라세아에(Glomeraceae) 과의 진균 접종물, 클라로이도글로메라세아에(Claroidoglomeraceae) 과의 진균 접종물, 기가스포라세아에(Gigasporaceae) 과의 진균 접종물, 아카울로스포라세아에(Acaulosporaceae) 과의 진균 접종물, 사쿨로스포라세아에(Sacculosporaceae) 과의 진균 접종물, 엔트로포스포라세아에(Entrophosporaceae) 과의 진균 접종물, 파시드스포라세아에(Pacidsporaceae) 과의 진균 접종물, 디베르시스포라세아에(Diversisporaceae) 과의 진균 접종물, 파라글로메라세아에(Paraglomeraceae) 과의 진균 접종물, 아르카에오스포라세아에(Archaeosporaceae) 과의 진균 접종물, 게오시포나세아에(Geosiphonaceae) 과의 진균 접종물, 암비스포라세아에(Ambisporaceae) 과의 진균 접종물, 스쿠텔로스포라세아에(Scutellosporaceae) 과의 진균 접종물, 덴티스쿨타타세아에(Dentiscultataceae) 과의 진균 접종물, 라코세트라세아에(Racocetraceae) 과의 진균 접종물, 바시디오미코타(Basidiomycota) 문의 진균 접종물, 아스코미코타(Ascomycota) 문의 진균 접종물, 지고미코타(Zygomycota) 문의 진균 접종물 또는 그의 조합) 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
비료는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산황산암모늄, 염화암모늄, 중황산암모늄, 폴리황화암모늄, 티오황산암모늄, 수성 암모니아, 무수 암모니아, 폴리인산암모늄, 황산알루미늄, 질산칼슘, 질산암모늄칼슘, 황산칼슘, 소성 마그네사이트, 방해석질 석회석, 산화칼슘, 질산칼슘, 돌로마이트질 석회석, 수화 석회, 탄산칼슘, 인산이암모늄, 인산일암모늄, 질산마그네슘, 황산마그네슘, 질산칼륨, 염화칼륨, 황산마그네슘칼륨, 황산칼륨, 질산나트륨, 마그네시아질 석회석, 마그네시아, 우레아, 우레아-포름알데히드, 우레아 질산암모늄, 황-코팅된 우레아, 중합체-코팅된 우레아, 이소부틸리덴 디우레아, K2SO4-(MgSO4)2, 카이나이트, 실비나이트, 키저라이트, 엡솜 염, 원소상 황, 이회토, 분쇄된 굴 껍질, 어분, 오일 케이크, 어비, 혈분, 암석 포스페이트, 과인산염, 슬래그, 골분, 목재 회분, 거름, 박쥐 구아노, 토탄 이끼, 퇴비, 녹사, 목화씨분, 우모분, 갑각류분, 어류 에멀젼, 흄산 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 농약은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 살진균제, 박테리아 접종물 또는 제초제를 포함할 수 있다. 포자-형성 박테리아는 단독으로 또는 살곤충제와 조합되어 유효량의 적어도 1종의 살진균제를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, "살진균제"는 진균의 사멸률을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 물질이다. 용어 "진균" 또는 "진균류"는 클로로필이 결여된 매우 다양한 유핵 포자보유 유기체를 포함한다. 진균의 예는 효모, 곰팡이, 흰곰팡이, 녹병 및 버섯을 포함한다. 전형적인 살진균제 성분은 또한 캅탄, 플루디옥소닐, 이프로디온, 테부코나졸, 티아벤다졸, 아족시스트로빈, 프로클로라즈 및 옥사딕실을 포함한다. 본 개시내용에 따른 선택된 조성물, 식물 종자 또는 접종물은 임의의 천연 또는 합성 살진균제, 예컨대: 알디모르프, 암프로필포스, 암프로필포스 포타슘, 안도프림, 아닐라진, 아자코나졸, 아족시스트로빈, 베날락실, 베노다닐, 베노밀, 벤자마크릴, 벤자마크릴-이소부틸, 비알라포스, 비나파크릴, 비페닐, 비테르타놀, 블라스티시딘-S, 보스칼리드, 브로무코나졸, 부피리메이트, 부티오베이트, 칼슘 폴리술피드, 캅시마이신, 캅타폴, 캅탄, 카르벤다짐, 카르본, 퀴노메티오네이트, 클로벤티아존, 클로르페나졸, 클로로네브, 클로로피크린, 클로로탈로닐, 클로졸리네이트, 클로질라콘, 쿠프라네브, 시목사닐, 시프로코나졸, 시프로디닐, 시프로푸람, 데바카르브, 디클로로펜, 디클로부트라졸, 디클로플루아니드, 디클로메진, 디클로란, 디에토펜카르브, 디메티리몰, 디메토모르프, 디목시스트로빈, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 디노캅, 디페닐아민, 디피리티온, 디탈림포스, 디티아논, 도데모르프, 도딘, 드라족솔론, 에디펜포스, 에폭시코나졸, 에타코나졸, 에티리몰, 에트리디아졸, 파목사돈, 페나파닐, 페나리몰, 펜부코나졸, 펜푸람, 페니트로판, 펜피클로닐, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜틴 아세테이트, 펜틴 히드록시드, 페르밤, 페림존, 플루아지남, 플루메토베르, 플루오피람, 플루오로마이드, 플루퀸코나졸, 플루르프리미돌, 플루실라졸, 플루술파미드, 플루톨라닐, 플루트리아폴, 폴페트, 포세틸-알루미늄, 포세틸-소듐, 프탈리드, 푸베리다졸, 푸랄락실, 푸라메트피르, 푸르카르보닐, 푸르코나졸, 푸르코나졸-시스, 푸르메시클록스, 구아자틴, 헥사클로로벤젠, 헥사코나졸, 히멕사졸, 이마잘릴, 이미벤코나졸, 이미녹타딘, 이미녹타딘 알베실레이트, 이미녹타딘 트리아세테이트, 아이오도카르브, 이프로벤포스 (IBP), 이프로디온, 이루마마이신, 이소프로티올란, 이소발레디온, 카수가마이신, 크레속심-메틸, 구리 제제, 예컨대: 수산화구리, 나프텐산구리, 옥시염화구리, 황산구리, 산화구리, 옥신-구리 및 보르도 혼합물, 만코퍼, 만코제브, 마네브, 메페림존, 메파니피림, 메프로닐, 메탈락실, 메트코나졸, 메타술포카르브, 메트푸록삼, 메티람, 메토메클람, 메트술포박스, 밀디오마이신, 미클로부타닐, 미클로졸린, 니켈 디메틸디티오카르바메이트, 니트로탈-이소프로필, 누아리몰, 오푸레이스, 옥사딕실, 옥사모카르브, 옥솔린산, 옥시카르복심, 옥시펜티인, 파클로부트라졸, 페푸라조에이트, 펜코나졸, 펜시쿠론, 포스디펜, 피마리신, 피페랄린, 폴리옥신, 폴리옥소림, 프로베나졸, 프로클로라즈, 프로시미돈, 프로파모카르브, 프로파노신-소듐, 프로피코나졸, 프로피네브, 프로티오시나졸, 피라조포스, 피리페녹스, 피리메타닐, 피로퀼론, 피록시푸르, 퀸코나졸, 퀸토젠 (PCNB), 황 및 황 제제, 테부코나졸, 테클로프탈람, 테크나젠, 테트시클라시스, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티시오펜, 티플루자미드, 티오파네이트-메틸, 티옥시미드, 톨클로포스-메틸, 톨릴플루아니드, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리아즈부틸, 트리아족시드, 트리클라미드, 트리시클라졸, 트리데모르프, 트리플록시스트로빈, 트리플루미졸, 트리포린, 유니코나졸, 발리다마이신 A, 빈클로졸린, 비니코나졸, 자릴아미드, 지네브, 지라모르 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 살진균제는 또한 치환된 벤젠, 티오카르바메이트, 에틸렌 비스 디티오카르바메이트, 티오프탈리다미드, 구리 화합물, 유기수은 화합물, 유기주석 화합물, 카드뮴 화합물, 아닐라진, 베노밀, 시클로헥사미드, 도딘, 에트리디아졸, 이프로디온, 메탈락실, 티아미메폰, 트리포린 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 농업 목적을 위해 사용되는 다른 공지된 합성 또는 자연-발생 살진균제가 또한 본 개시내용에 따른 조성물, 식물 종자 또는 접종물에 포함되도록 선택될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
조성물, 식물 종자 또는 접종물이 살진균제를 포함하는 경우에, 살진균제는 잎 살진균제일 수 있다. 잎 살진균제는 구리, 만코제브, 펜티오피라드, 트리아졸, 시프로코나졸, 메트코나졸, 프로피코나졸, 프로티오코나졸, 테부코나졸, 아족시스트로빈, 피라클로스트로빈, 플루옥사스트로빈, 피콕시스트로빈, 트리플록시스트로빈, 황, 보스칼리드, 티오파네이트 메틸, 클로로탈로닐, 펜티오피라드, 디펜코나졸, 플루트리아폴, 시프로디닐, 플루아지남, 이프로디온, 펜플루펜, 시아조파미드, 플루톨라닐, 시목사닐, 디메토모르프, 피리메타닐, 족사미드, 만디프로파미드, 메트리남, 프로파모카르브, 페나미돈, 테트라코나졸, 클로로납, 히멕사졸, 톨클로포스 및 펜부코나졸을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 농업 목적을 위해 사용되는 다른 공지된 합성 또는 자연-발생 잎 살진균제가 또한 본 개시내용에 따른 조성물, 식물 종자 또는 접종물에 포함되도록 선택될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
살곤충제를 포함하는 본 개시내용에 따른 조성물, 종자 및 접종물은 곤충의 사멸률을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 능력을 보유한다. 본원에 사용된 용어 "곤충"은 "곤충강"의 모든 유기체를 포함한다. 용어 "성충전" 곤충은, 예를 들어 알, 유충 및 약충을 포함한, 성충 단계 전의 임의의 형태의 유기체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "살곤충제" 및 "살곤충"은 또한 "살선충제" 및 "살선충" 및 "살진드기제" 및 "살진드기"를 포괄한다. "살선충제" 및 "살선충"은 선충류의 사멸률을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 물질의 능력을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "선충류"는 상기 유기체의 알, 유충, 미숙 및 성숙 형태를 포함한다. "살진드기제" 및 "살진드기"는 거미강, 응애아강에 속하는 외부기생충의 사멸률을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 물질의 능력을 지칭한다.
본 개시내용의 한 측면에 따르면, 적어도 1종의 살곤충제는 다음을 포함한다:
(1) 아세틸콜린에스테라제 (AChE) 억제제, 예컨대, 예를 들어 카르바메이트, 예를 들어 알라니카르브, 벤디오카르브, 벤푸라카르브, 부토카르복심, 부톡시카르복심, 카르보푸란, 카르보술판, 에티오펜카르브, 푸라티오카르브, 이소프로카르브, 메톨카르브, 옥사밀, 피리미카르브, 프로폭수르, 티오파녹스, 트리아자메이트, 트리메타카르브, XMC 및 크실릴카르브; 또는 유기포스페이트, 예를 들어 아세페이트, 아자메티포스, 아진포스-에틸, 아진포스-메틸, 카두사포스, 클로르에톡시포스, 클로르펜빈포스, 클로르메포스, 클로르피리포스-메틸, 쿠마포스, 시아노포스, 데메톤-S-메틸, 디아지논, 디클로르보스/DDVP, 디크로토포스, 디메토에이트, 디메틸빈포스, 디술포톤, EPN, 에티온, 팜푸르, 페니트로티온, 포스티아제이트, 헵테노포스, 이미시아포스, 이소펜포스, 이소프로필 O-(메톡시아미노티오포스포릴) 살리실레이트, 이속사티온, 말라티온, 메카르밤, 메티다티온, 메빈포스, 모노크로토포스, 날레드, 오메토에이트, 파라티온-메틸, 펜토에이트, 포레이트, 포스메트, 포스파미돈, 폭심, 피리미포스-메틸, 프로페노포스, 프로페탐포스, 프로티오포스, 피라클로포스, 피리다펜티온, 퀴날포스, 술포텝, 테부피림포스, 테메포스, 테르부포스, 테트라클로르빈포스, 티오메톤 및 트리클로르폰. (2) GABA-게이팅 클로라이드 채널 길항제, 예컨대, 예를 들어 시클로디엔-유기염소, 예를 들어 클로르단 및/또는 페닐피라졸. (3) 나트륨 채널 조정제/전압-게이팅 나트륨 채널 차단제 예컨대, 예를 들어 피레트로이드, 예를 들어 아크리나트린, 알레트린, d-시스-트랜스 알레트린, d-트랜스 알레트린, 비펜트린, 비오알레트린, 비오알레트린 s-시클로펜테닐 이성질체, 비오레스메트린, 시클로프로트린, 시할로트린, 람다-시할로트린, 감마-시할로트린, 엠펜트린 [(EZ)-(IR)-이성질체], 에스펜발레레이트, 에토펜프록스, 펜프로파트린, 펜발레레이트, 플루시트리네이트, 플루메트린, 타우-플루발리네이트, 할펜프록스, 이미프로트린, 카데트린, 페르메트린, 페노트린 [(lR)-트랜스-이성질체], 프랄레트린, 피레트린 (피레트룸), 레스메트린, 테플루트린, 테트라메트린, 테트라메트린 [(1R)-이성질체)] 및 트랜스플루트린 또는 DDT 또는 메톡시클로르. (4) 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR) 효능제, 예컨대, 예를 들어 네오니코티노이드, 예를 들어 디노테푸란, 니텐피람 및 티아메톡삼 또는 니코틴 또는 술폭사플로르. (5) 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 알로스테릭 활성화제, 예컨대, 예를 들어 스피노신, 예를 들어 스피네토람 및 스피노사드. (6) 클로라이드 채널 활성화제, 예컨대, 예를 들어 아베르멕틴/밀베마이신, 예를 들어 아바멕틴, 에마멕틴 벤조에이트, 레피멕틴 및 밀베멕틴. (7) 유충 호르몬 모방자, 예컨대, 예를 들어 유충 호르몬 유사체, 예를 들어 히드로프렌, 키노프렌 및 메토프렌 또는 페녹시카르브 또는 피리프록시펜. (8) 미지의 또는 비특이적 작용 메카니즘을 갖는 활성 화합물, 예컨대, 예를 들어 알킬 할라이드, 예를 들어 메틸 브로마이드 및 다른 알킬 할라이드; 또는 클로로피크린 또는 술푸릴 플루오라이드 또는 보락스 또는 토주석. (9) 선택적 항섭식제, 예를 들어 피메트로진 또는 플로니카미드. (10) 응애 성장 억제제, 예를 들어 클로펜테진, 헥시티아족스 및 디플로비다진 또는 에톡사졸. (11) 곤충 장 막의 미생물 교란제, 예를 들어 바실루스 투린기엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subspecies israelensis), 리시니바실루스 스파에리쿠스(Lysinibacillus sphaericus), 바실루스 투린기엔시스 아종 아이자와이(Bacillus thuringiensis subspecies aizawai), 바실루스 투린기엔시스 아종 쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki), 바실루스 투린기엔시스 아종 테네브리오니스(Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis) 및 Bt 식물 단백질: Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Abl. (12) 산화성 인산화 억제제, ATP 교란제, 예컨대, 예를 들어 디아펜티우론 또는 유기주석 화합물, 예를 들어 아조시클로틴, 시헥사틴 및 펜부타틴 옥시드 또는 프로파르기트 또는 테트라디폰. (13) H 양성자 구배를 방해함으로써 작용하는 산화성 인산화 탈커플링제, 예컨대, 예를 들어 클로르페나피르, DNOC 및 술플루라미드. (14) 니코틴성 아세틸콜린 수용체 길항제, 예컨대, 예를 들어 벤술탑, 카르탑 히드로클로라이드, 티오시클람 및 티오술탑-소듐. (15) 키틴 생합성 억제제 0형, 예컨대, 예를 들어 비스트리플루론, 클로르플루아주론, 디플루벤주론, 플루시클록수론, 플루페녹수론, 헥사플루무론, 루페누론, 노발루론, 노비플루무론 및 테플루벤주론. (16) 키틴 생합성 억제제 1형, 예를 들어 부프로페진. (17) 탈피 억제제 (특히 파리목, 즉 쌍시류에 대한 것), 예컨대, 예를 들어 시로마진. (18) 엑디손 수용체 효능제, 예컨대, 예를 들어 크로마페노지드, 할로페노지드, 메톡시페노지드 및 테부페노지드. (19) 옥토파민성 효능제. (20) 복합체-III 전자 수송 억제제, 예컨대, 예를 들어 히드라메틸논 또는 아세퀴노실 또는 플루아크리피림. (21) 예를 들어 METI 살진드기제의 군으로부터의 복합체-I 전자 수송 억제제, 예를 들어 페나자퀸, 펜피록시메이트, 피리미디펜, 피리다벤, 테부펜피라드 및 톨펜피라드 또는 로테논 (데리스). (22) 전압-게이팅 나트륨 채널 차단제, 예를 들어 인독사카르브 또는 메타플루미존. (23) 아세틸-CoA 카르복실라제의 억제제. (24) 복합체-IV 전자 수송 억제제, 예컨대, 예를 들어 포스핀, 예를 들어 알루미늄 포스피드, 칼슘 포스피드, 포스핀 및 아연 포스피드 또는 시아나이드. (25) 복합체 II 전자 수송 억제제, 예컨대, 예를 들어 시에노피라펜 및 시플루메토펜. (26) 리아노딘 수용체 이펙터, 예컨대, 예를 들어 디아미드, 예를 들어 클로란트라닐리프롤 (이는 또한 상표명 리낙시피르(RYNAXYPYR)™로 공지됨) 및 시안트라닐리프롤 또는 상기 확인된 화합물 또는 화합물의 부류 중 1종 이상의 임의의 조합.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 농업 목적을 위해 사용되는 다른 공지된 합성 또는 자연-발생 살곤충제가 또한 본 개시내용에 따른 조성물, 식물 종자 또는 접종물에 포함되도록 선택될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
본원에 기재된 내생포자 디스플레이 플랫폼을 사용하는 스크리닝 방법
본원에 개시된 융합 단백질 구축물 및 재조합 파에니바실루스 세포는 본 개시내용 전반에 걸쳐 논의된 바와 같이 새로운 및/또는 변형된 식물 속성을 생성하는 이종 단백질의 고처리량 스크리닝을 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 이러한 속성은 식물 수확량 및 다른 식물 특징, 예컨대: 변경된 식물 단백질 또는 오일 함량/조성, 변경된 식물 탄수화물 함량/조성; 변경된 종자 탄수화물 함량/조성, 변경된 종자 오일 또는 단백질 조성; 환경적 또는 화학적 스트레스에 대한 증가된 내성 (예를 들어, 추위 또는 열, 가뭄, 살곤충제 또는 제초제에 대한 저항성); 지연된 노쇠 또는 질환 저항성; 성장 개선, 건강 증진; 초식동물 저항성; 개선된 질소 고정 또는 질소 이용; 개선된 뿌리 아키텍처 또는 길이; 개선된 물 사용 효율; 증가된 바이오매스; 증가된 종자 중량; 증가된 싹 길이; 증가된 수확량; 변형된 커넬 질량 또는 수분 함량; 금속 내성; 병원체 또는 해충 저항성; 광합성 능력 개선; 염분 내성; 활력 개선; 성숙 종자의 증가된 건조 중량 및/또는 생중량, 식물당 성숙 종자의 증가된 수; 증가된 클로로필 함량; 참조 식물/종자에 비해 대사물의 수준 또는 메타볼롬에서의 검출가능한 조정; 참조 식물/종자에 비해 전사체의 수준 또는 트랜스크립톰에서의 검출가능한 조정; 참조 식물에 비해 단백질의 수준 또는 프로테옴에서의 검출가능한 조정; 및 상기 형질 또는 속성 중 임의의 것의 조합에서의 상업적으로 유의한 개선을 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 목록은 비제한적 세트의 예로서 의도된다. 통상의 기술자는 본원에 개시된 고처리량 전달 플랫폼이 본 개시내용의 다른 곳에서 논의되거나 또는 달리 관련 기술분야에 공지된 다양한 다른 식물 형질 및 속성에 대해 스크리닝하기에 적합하다는 것을 인지할 것이다.
본 개시내용에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 내생포자는 시험관내에서 성장한 식물 세포, 숙주 식물 종자, 묘목 또는 영양 식물 또는 달리 성숙한 식물에 적용될 수 있다. 이종 단백질은 다시 시험관내에서 성장한 식물 세포, 숙주 식물 종자, 묘목 또는 성숙 식물에 대한 형질 또는 속성을 변형시키거나 그에 부여할 수 있다. 선택된 실시양태에서, 파에니바실루스 내생포자는 종자를 접종하는데 사용될 수 있고, 생성된 새로운 또는 변형된 형질 또는 속성은 즉시 분명할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서는 숙주 식물의 후기 발달 단계까지 분명해지지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 전달하는데 사용되는 파에니바실루스 박테리아는 숙주 식물 종에 대해 외인성이다. 다른 실시양태에서, 선택된 파에니바실루스 박테리아는 숙주 식물 종에 콜로니화하는 것으로 공지된 내인성 내생생물이다. 숙주 식물은 본원에 개시된 임의의 적합한 식물 (단자엽식물, 쌍자엽식물, 침엽수 등)일 수 있다.
융합 단백질을 전달하는데 사용되는 재조합 파에니바실루스 박테리아는 숙주 식물 종자, 묘목, 영양 식물 또는 달리 성숙한 식물 시편을 코팅 또는 분무 또는 관련 기술분야에 공지된 숙주 식물에 대해 내생포자를 적용하는 임의의 다른 방법에 의해 접종하는데 사용될 수 있다. 액체로서, 예를 들어 용액 또는 현탁액으로서 적용되는 경우에, 파에니바실루스 내생포자는 수용액 중에 혼합 또는 현탁될 수 있다. 적합한 액체 희석제 또는 담체는 수용액, 석유 증류물 또는 다른 액체 담체를 포함한다. 고체 조성물은 파에니바실루스 내생포자를 적절하게 분할된 고체 담체, 예컨대 토탄, 밀, 겨, 버미큘라이트, 점토, 활석, 벤토나이트, 규조토, 풀러토, 저온살균 토양 등 중에 및 상에 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 제제가 습윤성 분말을 포함하는 경우에, 분산제, 예컨대 비-이온성, 음이온성, 양쪽성 또는 양이온성 분산제 및 유화제가 사용될 수 있다.
파에니바실루스 내생포자는 숙주 식물 종자의 표면에 직접적으로, 또는 영양 식물의 잎 및 줄기에 직접적으로, 또는 추가의 성분을 포함하는 조성물의 일부로서 적용될 수 있다. 추가의 성분은 콜로니화 속도를 증진시키는 1종 이상의 화합물, 식물 성장 또는 건강을 증진시키는 화합물, 살충제 또는 제초제, 또는 식물의 재배 및 성장을 촉진하기에 적합한 것으로 본원에 개시된 임의의 다른 화합물을 포함할 수 있다. 더욱이, 조성물은 상이한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 변형된 추가의 파에니바실루스 내생포자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 식물 성장 촉진 인자를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 제1 파에니바실루스 내생포자, 뿐만 아니라 살충제-저항성을 증진시키는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 제2 파에니바실루스 내생포자를 포함할 수 있다.
선택된 실시양태에서, 숙주 식물의 종자 상에 코팅된 재조합 파에니바실루스 내생포자는, 종자가 영양 상태로 발아할 때, 식물의 상이한 조직에 국재화할 수 있다. 예를 들어, 재조합 파에니바실루스 세포는 뿌리, 부정근, 종근, 근모, 싹, 잎, 꽃, 눈, 웅수, 분열조직, 화분, 암술, 씨방, 수술, 과실, 기는줄기, 근경, 혹, 괴경, 모상체, 공변 세포, 배수조직, 화판, 악편, 영, 꽃대, 유관속 형성층, 체관부 및 물관부를 포함한, 식물 내의 조직 중 어느 하나에 국재화할 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 뿌리 및/또는 근모에 국재화할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 광합성 조직, 예를 들어 식물의 잎 및 싹에; 또는 식물의 유관속 조직에, 예를 들어 물관부 및 체관부에 국재화할 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 생식 조직 (꽃, 화분, 암술, 씨방, 수술, 과실)에 국재화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 과실 또는 종자 조직에 콜로니화한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 표면 (예를 들어, 식물 외부 또는 식물의 엽권) 상에 존재하도록 식물에 콜로니화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 실질적으로 모든 또는 모든 조직에 국재화할 수 있다.
숙주 식물에의 적용을 위해 설계된 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물은 종자 코팅 조성물, 뿌리 처리 또는 잎 적용 조성물을 포함할 수 있다. 종자 코팅 조성물 또는 뿌리 처리 또는 잎 적용 조성물은 살진균제, 항박테리아제, 제초제, 살선충제, 살곤충제, 식물 성장 조절제, 영양소 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 종자 코팅 조성물 또는 뿌리 처리 또는 잎 적용 조성물은 농업상 허용되는 담체, 점착제, 미생물 안정화제 또는 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 선택된 실시양태에서, 종자 코팅 조성물 또는 뿌리 처리 또는 잎 적용 조성물은 리조비아 박테리아 제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 제2 박테리아를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 계면활성제를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 계면활성제는 0.01% v/v 내지 10% v/v의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 0.1% v/v 내지 1% v/v의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 미생물 안정화제 (예를 들어, 안정화제)를 포함할 수 있다.
접종 시, 처리된 숙주 식물 (예를 들어, 처리된 종자, 묘목, 영양 식물 또는 달리 성숙한 식물)은 새로운 또는 변형된 속성 또는 형질의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 처리 후 임의의 시점에 이루어질 수 있다. 선택된 실시양태에서, 종자가 처리될 수 있고, 종자가 발아하거나 보다 진행된 발달 단계에 도달할 때까지 스크리닝이 이루어지지 않을 수 있다. 다른 실시양태에서, 종자, 묘목 또는 영양 식물이 처리될 수 있고, 처리된 식물이 새로운 또는 변형된 형질 또는 속성에 대해 스크리닝될 샘플을 포함할 수 있는 수확된 최종 생성물을 생산할 때까지 스크리닝이 이루어지지 않을 수 있다.
스크리닝 동안, 다양한 시험이 시험관내 및 생체내 둘 다에서 수행되어 처리된 숙주 식물에 어떤 이익 (존재한다면)이 부여되는지를 결정할 수 있다. 생체내 스크리닝 검정은 식물 또는 종자의 표현형 형질 또는 속성을 측정하는 시험 (예를 들어, 식물 성장 속도 또는 높이; 작물 수확량; 환경적 스트레스, 예컨대 열, 추위 또는 염분에 대한 저항성; 생물학적 병원체 또는 곤충 해충에 대한 저항성; 화학적 처리, 예컨대 살곤충제 또는 제초제에 대한 저항성을 측정하는 검정)을 포함한다. 시험관내 스크리닝 검정은 식물 추출물, 조직 샘플, 세포 샘플 등의 조성 또는 특성을 측정하는 시험을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 시험관내 스크리닝은 처리된 숙주 식물의 세포 또는 조직에서 발견되는 주어진 단백질, 효소, 유전자 전사체, 대사물 또는 다른 화합물을 정제하고 그의 양 또는 활성을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 스크리닝은 육안으로든 또는 현미경검사를 통해서든, 처리된 숙주 식물의 세포 또는 조직의 구조를 시각적으로 검사하는 것을 포함할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 스크리닝은 처리된 숙주 식물에 대해 지시된 검정과는 대조적으로, 본 개시내용에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 영양 세포 또는 재조합 파에니바실루스 내생포자의 검정을 포함할 수 있다. 이들 실시양태에서, 파에니바실루스 과 구성원 세포 또는 내생포자는 1종 이상의 활성, 예컨대 비제한적으로 (예를 들어, 시데로포어의 분비를 통해) 복합체화된 포스페이트 또는 복합체화된 철을 유리시키는 능력; 식물호르몬의 생산; 항박테리아, 항진균 또는 살곤충 또는 살선충 화합물의 생산; ACC 데아미나제, 아세토인, 펙티나제, 셀룰라제 또는 RNase의 생산 및/또는 분비의 시험관내 검정에 적용될 수 있다. 영양 식물보다는 파에니바실루스 과 구성원 세포 또는 내생포자에 대해 지시된 스크리닝 방법은 이러한 방법이 처리된 숙주 식물에 대해 지시된 방법보다 더 빨리 유용한 이종 단백질의 검출을 가능하게 할 수 있다는 점에서 특히 유리하다.
포자 표면 표적화 서열을 확인하는 방법
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 이종 단백질에 대한 포자 표면 디스플레이 플랫폼의 일부로서 유용한, 파에니바실루스에서 확인된 여러 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 개시한다. 그러나, 본 개시내용은 이들 특정한 서열, 그의 단편 및 변이체에 제한되지는 않는다. 본 개시내용에 따른 스크리닝 방법은 내생포자 디스플레이 플랫폼의 일부로서 또는 다른 목적을 위해 유사하게 유용할 수 있는 추가의 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 확인하기 위해 파에니바실루스 및 다른 내생포자-형성 박테리아 속에서 광범위하게 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 유용한 내생포자-형성 박테리아는 도 1에 제시된 바와 같이 단백질분해에 저항성인 모발-유사 구조를 갖는다. 예를 들어, 본원에 개시된 스크리닝 방법은 리시니바실루스, 비리디바실루스 및 브레비바실루스의 내생포자-형성 구성원에서 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 예시적인 측면에서, 이러한 서열은 파에니바실루스 또는 또 다른 관심 내생포자-형성 박테리아의 게놈을 "글리신--임의의 잔기--임의의 잔기" ("GXX 반복부")의 다수의 콜라겐-유사 트리플렛 아미노산 반복부를 갖는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 ("ORF")에 대해 스크리닝하고, 단백질이 포자 표면에 국재화하는지를 현미경검사에 의해 또는 실험적으로 결정함으로써 확인될 수 있다. 이들 GXX 반복부는 폴리펩티드 서열의 인접한 또는 별개의 영역일 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 서열은 특정한 수의 인접한 또는 총 GXX 반복부 (예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 GXX 반복부)에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 측면에서, 단백질 국재화는 시각적으로 (예를 들어, 투과 전자 현미경검사를 사용하여) 또는 실험적으로 (예를 들어, 질량 분광측정법을 사용하여) 결정된다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열을 확인하는 방법은 추정 N-말단 표적화 서열 및 리포터 (예를 들어, GFP)를 포함하는 융합 단백질을 파에니바실루스 또는 다른 박테리아 세포에서 발현시킴으로써 추정 N-말단 표적화 서열을 시험하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 스크리닝 과정을 통해 확인된 단백질의 N-말단 부분을 포함하는 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속 (예를 들어, 리시니바실루스, 비리디바실루스 및 브레비바실루스)으로부터의 포자 표면-표적화 서열을 제공한다. 상기 표적화 서열의 이러한 N-말단 표적화 서열은 내인성 서열 또는 그의 단편 또는 변이체의 처음 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열은 내인성 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 변이체 또는 그의 단편이다. 이들 방법에 따라 확인된 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속에서의 포자 표면 표적화 서열은 본원에 기재된 임의의 다양한 실시양태에 따른 이종 융합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다.
하기 비제한적 실시예는 본 개시내용을 추가로 예시하기 위해 제공된다.
실시예
실시예 1: 내생포자 디스플레이에 적합한 콜라겐-유사 포자 표면 단백질을 확인하기 위한 일반적 프로토콜
파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 완전한 게놈을 콜라겐-유사 GXX 반복부를 함유하는 ORF에 대해 검색하였다. 이어서, 콜라겐-유사 포자 표면 단백질을 투과 전자 현미경검사에 의해 가시화하였다 (도 1). 또한, 콜라겐-유사 포자 표면 단백질의 존재를 질량 분광측정법에 의해 실험적으로 확인하였다. 간략하게, 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 포자를 트립신으로 소화시켜 표면 단백질을 분리하였다. 포자를 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 콜라겐-유사 포자 표면 단백질의 존재를 검증하였다. 이러한 일반적 프로토콜을 사용하여 서열식별번호: 1-10으로 확인된 N-말단 표적화 서열을 갖는 내인성 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 단백질을 확인하였다. 동일한 방법을 사용하여 비리디바실루스, 리시니바실루스 또는 브레비바실루스로부터의 포자 표면 단백질 및 상응하는 N-말단 표적화 서열을 확인할 수 있다.
실시예 2: 녹색 형광 단백질 (GFP)을 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 제조하기 위한 일반적 프로토콜
융합 구축물을 생성하기 위해, GFP를 코딩하는 유전자를 유전자 합성에 의해 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 개시된 N-말단 표적화 서열 (서열식별번호: 1)의 아미노산을 코딩하는 DNA 절편에 융합시키고, 이. 콜라이/파에니바실루스 셔틀 벡터 pAP13 내로 클로닝하였다. 생성된 벡터 구축물을 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내로 도입하였다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성까지 30℃에서 쉐퍼 포자형성 배지 브로쓰에서 성장시켰다. 이어서, 융합 구축물을 발현하는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 포자를 에피형광 현미경검사에 의해 검사하였다. GFP는 융합 구축물을 발현하는 포자 상에서 가시적이다 (도 2a). 또한, 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 포자를 유동 세포측정법에 의해 검사하였다. 융합 구축물을 발현하는 포자는 야생형 포자보다 유의하게 더 형광이다 (도 2b).
실시예 3: 임의적 관심 단백질을 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 제조하기 위한 일반적 프로토콜
파에니바실루스 세포 (예를 들어, 파에니바실루스 종 NRRL B-50972)를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 배양, 형질전환 및 스크리닝하여 본 개시내용에 따른 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 갖는 융합 구축물을 생산할 수 있다. 스크리닝을 질량 분광측정법 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 생화학적 또는 시각적 수단에 의해 진행할 수 있다 (예를 들어, 관심 단백질을 GFP 또는 또 다른 선택/스크리닝 태그로 태그부착할 수 있음). 융합 구축물을 생성하는데 사용된 N-말단 표적화 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30 중 어느 것의 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열은 폴리펩티드를 포자 표면에 표적화할 수 있는, 서열식별번호: 2 및 8의 쌍별 정렬에서 동일한 잔기에 상응하는 1개 이상의 잔기를 갖는 서열을 포함할 수 있다 (도 3). 유사하게, 도 3에 제공된 서열식별번호: 2 및 8의 쌍별 정렬에서 동일한/보존된 잔기에 상응하는 1개 이상의 잔기를 갖는 서열을 포함하는 N-말단 표적화 서열이 사용될 수 있다.
예를 들어, N-말단 표적화 서열은 M-X-V-X-S-T-G-P-I-X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X-X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V-L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T-L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X (서열식별번호: 31) (여기서 "X"는 임의의 아미노산을 나타냄)를 포함할 수 있거나 또는 그의 임의의 인접 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개의 잔기 절편을 포함한다. 또 다른 예에서, N-말단 표적화 서열은 M-X-V-X-S-T-G-P-I-X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X-X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V-L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T-L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X-X-N-X-V-I-T-X-X-X-X-A-X-X-X-X-F-E-F-V-F-T-T-X-X-X-X-E-N-E-X-Q-X-S-V-W-G-K-X-X-X-G-Q-L-V-X-A-H-R-X-V-S-X-E-L-L-V-X-X-X-X (서열식별번호: 32) (여기서 "X"는 임의의 아미노산을 나타냄)를 포함할 수 있거나 또는 그의 임의의 인접 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120개의 잔기 절편을 포함한다.
일부 측면에서, 선택된 N-말단 표적화 서열은 이들 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 공유할 수 있고, 여전히 융합 구축물을 포자 표면에 표적화할 수 있다.
실시예 4: 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물 성장 촉진 화합물의 생산에 수반되는 융합 단백질을 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분에 전달하는 방법
식물 성장 촉진 화합물의 생산을 담당하는 효소는 본원에 개시된 파에니바실루스 내생포자 전달 시스템을 사용하여 식물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 부탄디올 데히드로게나제는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환시킨다. 2,3-부탄디올은 식물 성장 촉진 화합물이다. 이러한 효소를 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용될 수 있거나 또는 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달될 수 있다.
실시예 5: 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 단일 파에니바실루스 내생포자 상의 다수의 융합 단백질을 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분에 전달하는 방법
단일 재조합 파에니바실루스 내생포자는 1종 초과의 이종 융합 단백질을 디스플레이하는데 사용될 수 있다. 이는 2종 (또는 그 초과)의 별개의 융합 단백질을 구축함으로써 달성된다. 파에니바실루스 내생포자 표면 상에 디스플레이될 각각의 이종 단백질에 대한 코딩 서열은 그의 천연 프로모터의 제어 하에 N-말단 표적화 서열에 개별적으로 융합된다. 융합 단백질 구축물은 동일한 플라스미드 벡터 또는 상이한 플라스미드 벡터 내로 클로닝되고, 전기천공에 의해 파에니바실루스 구성원 내로 도입될 수 있다. 이어서, 생성된 파에니바실루스 내생포자는 포자 표면 상에 두 이종 단백질의 혼합물을 발현할 것이다. 이는 해충 저항성을 완화시키기 위해 다수의 단백질성 무척추동물 독소를 스택킹하는데 특히 유용하다.
실시예 6: 각각 1종 이상의 상이한 융합 단백질을 디스플레이하는 다수의 재조합 파에니바실루스 내생포자의 조합을 사용하여 1종 이상의 상이한 융합 단백질을 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분에 제공하는 방법
특정 경우에, 각각 1종 이상의 상이한 이종 단백질 (상기 기재된 바와 같음)을 발현하는 1종 초과의 파에니바실루스 내생포자를 조합하여 전달하는 것이 제공된다. 예를 들어, 질소 고정 효소를 식물의 뿌리 주위의 영역에 전달하는 것은 화학적 질소 비료의 필요성을 감소시킨다. 박테리아에서의 질소 고정은 종에 따라 최소 8 또는 9종의 상이한 효소 및 잠재적으로 20종 초과의 상이한 효소를 요구할 수 있다. 여기서, 질소 고정 경로의 상이한 효소 성분을 각각 발현하는 파에니바실루스 내생포자의 조합의 전달이 유용할 수 있다. 예를 들어, NifH, NifD 및 NifK를 이종으로 디스플레이하는 파에니바실루스 내생포자가 NifE, NifN 및 NifD를 이종으로 디스플레이하는 파에니바실루스 내생포자와의 혼합물로 조합되어, 뿌리 주위의 영역에 전달될 수 있다.
실시예 7: 무척추동물 식물 해충을 사멸시키는 무척추동물 독소를 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달하는 방법
곤충 또는 선충류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 무척추동물에 대해 길항적인 단백질성 독소는 파에니바실루스 내생포자 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 살곤충 및 살선충 둘 다인 Cry5B 및 Cry21A를 포함하나 이에 제한되지는 않는 Cry 독소는 파에니바실루스 내생포자에서의 발현을 위해 N-말단 표적화 서열에 융합될 수 있다. Cry 독소 또는 다른 단백질성 무척추동물 독소를 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 무척추동물 식물 병원체에 대한 보호를 위해 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나 또는 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달될 수 있다.
실시예 8: 박테리아 식물 해충에 대해 길항적인 펩티드, 단백질 또는 효소를 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달하는 방법
박테리오신은 다른 박테리아에 대한 길항 활성을 갖는 박테리아에 의해 생산된 소형 펩티드이다. 박테리오신이 대형 비-리보솜 펩티드 신테타제에 의해 합성되는 다른 항미생물 분자 (예를 들어, 바시트라신)와 대조적으로 리보솜에 의해 합성된다는 사실로 인해, 박테리오신은 파에니바실루스 내생포자 시스템을 사용하는 전달에 특히 매우 적합하다. 1종 이상의 박테리오신에 대한 코딩 서열은 파에니바실루스 내생포자에서의 발현을 위해 N-말단 표적화 서열에 융합될 수 있다. 박테리오신을 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 박테리아 식물 병원체에 대한 보호를 위해 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나 또는 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달될 수 있다.
실시예 9: 진균 식물 해충에 대해 길항적인 펩티드, 단백질 또는 효소를 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달하는 방법
진균의 1차 세포벽 성분은 키틴이다. 키티나제는 키틴을 분해하는 효소이고, 파에니바실루스 내생포자의 표면 상에서 발현되어 진균 식물 병원체의 세포벽을 파괴함으로써 그에 대해 보호할 수 있다. 키티나제를 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용될 수 있거나 또는 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달될 수 있다.
실시예 10: 박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원을 분해하거나 변형시키는 효소를 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달하는 방법
박테리아, 진균 또는 식물 영양소 공급원의 분해 또는 변형을 담당하는 효소는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 복합 폴리사카라이드를 분해하는 글리코시드 히드롤라제는 식물 또는 종자를 이러한 (또는 또 다른) 관심 효소를 발현하는 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리함으로써 유익한 리조박테리아에 이용가능한 단순 당을 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예 11: 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물 성장 촉진 생물방제제로부터 유래된 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 식물 성장 촉진 생물방제제에 대한 반응을 평가하는 방법
오늘날 사용되는 많은 생물방제 균주는 외인성 DNA 흡수에 대해 저항성이어서, 연구원들이 상기 균주의 표적화된 유전자 변형을 생성할 수 없게 한다. 이러한 난제로 인해, 이들 생물방제 균주의 식물 성장 촉진 효과의 작용 메카니즘을 규명하는 것은 매우 어렵다. 파에니바실루스 내생포자는 생물방제 균주의 기저 식물 성장 촉진 효과를 담당하는 특이적 유전자를 확인하기 위한 신규 접근법을 제시한다. 먼저, N-말단 표적화 서열 및 천연 프로모터를 적합한 이. 콜라이/바실루스 셔틀 벡터 (예를 들어, pHP13) 내로 클로닝하여, 파에니바실루스 내생포자 상의 이종 단백질 발현에 적합한 벡터를 생성한다. 모든 클로닝 단계 및 플라스미드 증식을 이. 콜라이에서 수행한다. 이어서, 총 gDNA를 표적 식물 성장 촉진 생물방제 균주로부터 추출한다. gDNA를 단편으로 (효소적으로 또는 초음파적으로) 전단하고, 파에니바실루스 내생포자 상의 이종 단백질의 발현을 위한 상기 기재된 벡터 내로 라이게이션하여 관심 생물방제 균주로부터 기원하는 모든 유전 물질로 구성된 gDNA 라이브러리를 생성한다. 생성된 벡터 라이브러리를 전기천공에 의해 파에니바실루스 구성원 내로 도입하고, 박테리아를 적절한 항생제 선택제를 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 선택한다. 각각 표적 생물방제 균주의 gDNA의 상이한 단편을 발현하는 개별 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 식물 성장 촉진 효과에 대해 평가한다. 이들 효과는 증진된 녹색화, 개선된 발아, 증가된 식물 활력, 증가된 뿌리 길이, 증가된 뿌리 질량, 증가된 식물 높이, 증가된 잎 면적 또는 해충에 대한 저항성을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 언급된 식물 건강 파라미터를 조정하는 것으로 밝혀진 파에니바실루스 내생포자 형질전환체의 벡터를 서열분석하여, 관찰된 식물 성장 촉진 효과를 담당하는 생물방제 균주로부터 기원하는 유전자 결정기를 확인할 수 있다.
실시예 12: 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물 무척추동물, 박테리아 및 진균 식물 병원체에 대해 길항적인 신규 또는 비특징화된 독소를 확인하는 방법
오늘날 사용되는 많은 생물방제 균주는 외인성 DNA 흡수에 대해 저항성이어서, 연구원들이 상기 균주의 표적화된 유전자 변형을 생성할 수 없게 한다. 이러한 난제로 인해, 생물방제 균주가 무척추동물, 박테리아 및 진균 식물 병원체에 대해 독성인 작용 메카니즘을 규명하는 것은 매우 어렵다. 파에니바실루스 내생포자는 생물방제 균주의 기저 식물 보호 효과를 담당하는 특이적 유전자를 확인하기 위한 신규 접근법을 제시한다. 먼저, N-말단 표적화 서열 및 천연 프로모터를 적합한 이. 콜라이/바실루스 셔틀 벡터 (예를 들어, pHP13) 내로 클로닝하여, 파에니바실루스 내생포자 상의 이종 단백질 발현에 적합한 벡터를 생성한다. 모든 클로닝 단계 및 플라스미드 증식을 이. 콜라이에서 수행한다. 이어서, 총 gDNA를 표적 식물 성장 촉진 생물방제 균주로부터 추출한다. gDNA를 단편으로 (효소적으로 또는 초음파적으로) 전단하고, 파에니바실루스 내생포자 상의 이종 단백질의 발현을 위한 상기 기재된 벡터 내로 라이게이션하여 관심 생물방제 균주로부터 기원하는 모든 유전 물질로 구성된 gDNA 라이브러리를 생성한다. 생성된 벡터 라이브러리를 전기천공에 의해 파에니바실루스 구성원 내로 도입하고, 박테리아를 적절한 항생제 선택제를 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 선택한다. 각각 표적 생물방제 균주의 gDNA의 상이한 단편을 발현하는 개별 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 무척추동물, 박테리아 및 진균 식물 병원체에 대한 길항제 활성에 대해 평가한다. 상기 식물 병원체에 대해 길항적인 것으로 밝혀진 파에니바실루스 내생포자 형질전환체의 벡터를 서열분석하여, 관찰된 식물 보호 효과를 담당하는 생물방제 균주로부터 기원하는 유전자 결정기를 확인할 수 있다.
실시예 13: 비-생존 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물을 병원체로부터 보호하거나 또는 식물 건강을 개선시킬 목적으로 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분을 처리하는 방법
비-생존 (사멸) 파에니바실루스 내생포자를 갖는 파에니바실루스 내생포자 전달 시스템을 사용하여 식물 건강 촉진 단백질/효소 또는 식물 보호 단백질/효소를 전달할 필요가 있을 수 있다. 파에니바실루스 내생포자는 충분한 열 처리, UV 광, 감마선 조사 또는 고압 가공을 통해 불활성화되고 비-생존성이 될 수 있다. 생성된 비-생존 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나 또는 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 전달될 수 있다.
실시예 14: 에스케리키아 콜라이로부터 베타-갈락토시다제 (B-Gal)를 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 제조하기 위한 일반적 프로토콜
융합 구축물을 생성하기 위해, β-gal을 코딩하는 유전자를 유전자 합성에 의해 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 개시된 N-말단 표적화 서열 (서열식별번호: 1)의 아미노산을 코딩하는 DNA 절편에 융합시키고, 문헌 [Patrick, JE and Kearns, DB. 2008. MinJ (YvjD) is a Topological Determinant of Cell Division in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 70: 1166-1179]에 기재된 pMiniMad 벡터로부터 유래된 이. 콜라이/파에니바실루스 셔틀 벡터 내로 클로닝하였다. 생성된 벡터 구축물을 문헌 [Kim and Timmusk (2013), "A Simplified Method for Gene Knockout and Direct Screening of Recombinant Clones for Application in Paenibacillus polymyxa," PLoSONE, 8(6): e68092, doi: doi:10.1371/journal.pone.0068092]에 기재된 것과 유사한 전기천공에 의해 파에니바실루스 폴리믹사 균주 (균주 1) 내로 도입하였다. 표적화 서열 없이 셔틀 벡터를 함유한 대조군을 또한 제조하였다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성까지 30℃에서 쉐퍼 포자형성 배지 브로쓰에서 성장시켰다. 생성된 배양물을 원심분리하여 상청액을 포자로부터 분리하였다. 이어서, 융합 구축물을 발현하거나 또는 공 셔틀 벡터만을 함유하는 파에니바실루스 폴리믹사 포자 및 상응하는 상청액을 시험관내 검정에 의해 검사하였다. β-gal은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토-피라노시드 (X-Gal)의 가수분해에 기초하여 융합 구축물을 발현하는 포자 상에서 기능적이다. 결과가 하기 표 3에 제시된다.
표 3. 상청액 및 포자의 베타-갈락토시다제 활성
Figure pct00011
실시예 15: 바실루스 투린기엔시스로부터의 영양 살곤충 단백질 3 (Vip3) (서열식별번호: 17)을 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 제조하기 위한 일반적 프로토콜
융합 구축물을 생성하기 위해, vip3을 코딩하는 유전자 (서열식별번호: 16)를 실시예 14에 기재된 이. 콜라이/파에니바실루스 셔틀 벡터 내로의 깁슨 어셈블리에 의해 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 개시된 N-말단 표적화 서열 (서열식별번호: 1)의 아미노산을 코딩하는 DNA 절편에 융합시켰다. 융합체의 발현은 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 있다. 생성된 벡터 구축물을 상기 기재된 바와 같이 전기천공에 의해 파에니바실루스 폴리믹사 균주 (균주 1) 내로 도입하였다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성까지 30℃에서 쉐퍼 포자형성 배지 브로쓰에서 성장시켰다.
실시예 16: 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua)에 대한 Vip3을 발현하는 파에니바실루스 폴리믹사 균주의 활성
실시예 15로부터의 Vip3을 발현하는 파에니바실루스 폴리믹사 균주의 살곤충 활성을 스포도프테라 엑시구아 (비트 거염벌레)에 대해 평가하였다. 96-웰 플레이트 검정을 수행하여 공벡터 대조군 및 활성 적재물 (서열식별번호: 2-Vip3)을 포함하는 각각의 파에니바실루스 폴리믹사 균주의 살곤충 활성을 시험하였다. 균주를 포자형성까지 쉐퍼 포자형성 배지 브로쓰에서 성장시키고, 생성된 전체 브로쓰 배양물을 원심분리하여 상청액으로부터 포자를 분리함으로써 균주의 포자를 생산하였다. 이어서, 균주로부터의 포자 샘플을 문헌 [Marrone et al., (1985), "Improvements in Laboratory Rearing of the Southern Corn Rootworm, Diabrotica undecimpuncta howardi Barber (Coleoptera: Chrysomelidae), on an Artificial Diet and Corn," J. Econ. Entomol., 78: 290-293]에 기재된 것과 유사한 한천 기질을 함유하는 96-웰 마이크로플레이트에 적용하였다. 이어서, 포자 샘플을 물에 희석하고, 플레이트에 100%, 33%, 11%, 3.7% 및 1.2%의 농도로 적용하였다.
처리가 건조되도록 한 후, 스포도프테라 엑시구아 (비트 거염벌레)로부터의 약 20개의 알을 각각의 웰에 첨가하였다. 수일 후에, 처리된 유충의 발육부진 점수 및 사멸률 점수를 평가함으로써 살곤충 활성을 결정하였다. 곤충 발육부진 점수를 하기 척도에 따라 등급화하였다: 1 = 심하게 발육부진; 2 = 고도로 발육부진, 최소 성장; 3 = 비처리 대조군보다 약간 더 작음; 4 = 비처리 대조군과 동일한 크기. 곤충 사멸률 점수는 하기 척도에 기초한다: 4 = 0-25% 사멸률, 3 = 26-50% 사멸률, 2 = 51-79% 사멸률, 1 = 80-100% 사멸률.
표적화된 Vip3 (즉, 서열식별번호: 2-Vip3)을 발현하는 11% 파에니바실루스 포자로 처리된 스포도프테라 엑시구아 유충은 공벡터를 발현하는 동일한 농도의 파에니바실루스 포자로 처리된 스포도프테라 엑시구아 유충보다 2배 더 큰 발육부진을 경험하였다 (표 4 참조). 유사하게, 표적화된 Vip3을 발현하는 11% 파에니바실루스 포자로 처리된 유충은 공벡터를 발현하는 동일한 농도의 파에니바실루스 포자로 처리된 유충보다 1.5배 더 큰 사멸률을 경험하였다 (표 5 참조).
표 4. 처리된 스포도프테라 엑시구아 (비트 거염벌레)의 발육부진 등급화
Figure pct00012
표 5. 처리된 스포도프테라 엑시구아 (비트 거염벌레)의 사멸률 등급화
Figure pct00013
실시예 17: 내생포자 디스플레이에 필요한 파에니바실루스 N-말단 표적화 서열의 최소 부분의 확인
말단절단된 표적화 서열이 관심 단백질을 포자 표면에 표적화하기에 충분할 것인지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 하기는 디스코소마 종 산호로부터의 탠덤 이량체 토마토 (tdTom) 형광 단백질을 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 제조하기 위한 일반적 프로토콜이다. 융합 구축물을 생성하기 위해, tdTom을 코딩하는 유전자를 유전자 합성에 의해 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 개시된 N-말단 표적화 서열 (서열식별번호: 2)의 아미노산을 코딩하는 DNA 절편에 융합시키고, 이. 콜라이/파에니바실루스 셔틀 벡터 (pAP13) 내로 클로닝하였다. 추가적으로, tdTom을 코딩하는 유전자를 서열식별번호: 2의 N-말단 표적화 서열의 말단절단물; 즉 아미노산 1-100, 1-80, 1-40, 80-100, 90-100, 90-95, 91-98 및 95-100에 융합시켰다. 말단절단물 80-100, 90-100, 90-95, 91-98 및 95-100은 적절한 번역 개시를 위한 초기 메티오닌을 포함한다. 이들 구축물에 사용된 말단절단된 표적화 서열의 구체적 서열은 표 8에 제공된다. 생성된 벡터 구축물을 문헌 [Kim and Timmusk (2013), "A Simplified Method for Gene Knockout and Direct Screening of Recombinant Clones for Application in Paenibacillus polymyxa," PLoSONE, 8(6): e68092, doi: doi:10.1371/journal.pone.0068092]에 기재된 것과 유사한 전기천공에 의해 파에니바실루스 종 균주 1 내로 도입하였다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성까지 30℃에서 글루코스-기반 브로쓰에서 성장시켰다. 이어서, 융합 구축물을 발현하는 파에니바실루스 종 균주 1 포자를 현미경검사에 의해 검사하였다. 표 6은 TdTomato가 현미경검사를 통한 형광 포자의 검출에 기초하여 융합 구축물을 발현하는 포자 상에서 기능적인 구축물의 요약을 제공한다. 초기에 1-100 말단절단물이 잘 작용한 반면, 1-80 및 1-40 말단절단물은 그렇지 않은 것으로 관찰되었다. 이어서, 본 출원인은 80-100 말단절단물을 시험하였으며, 이는 또한 형광을 제공하였다. 마지막으로, 본 출원인은 100개를 초과하는 파에니바실루스 균주에서 서열식별번호: 2에 상응하는 콜라겐-유사 반복 영역을 분석하여, 이들 표적화 서열들 사이에 컨센서스 서열이 존재하는지 여부를 결정하였다. 도 4는 분석된 균주의 샘플링 및 표적화 서열의 아미노산 91-98로부터 생성된 컨센서스 서열을 제공한다. 초기 메티오닌을 갖는 상기 컨센서스 서열은 하기 표 6에서 서열식별번호: 49로서 제공된다. 실험 연구는 아미노산 잔기 98로서 아스파르트산을 사용한 상기 컨센서스 서열의 사용이 포자 표면 상에서 형광을 유발하였다는 것을 확인시켜 주었다. 보다 짧은 표적화 서열을 갖는 구축물은 형광을 발하지 않았다.
파에니바실루스 종 균주 1 포자를 또한 항체 염색을 동반한 유동 세포측정법에 의해 검사하였다. 전장, 1-100 및 91-98 표적화 서열에 융합된 tdTom을 발현하는 포자는 야생형 포자보다 유의하게 더 형광이다.
표 6. 포자 표면 표적화 활성에 요구되는 최소 도메인을 확인하기 위해 사용된 서열식별번호: 2 말단절단 시리즈
Figure pct00014
실시예 18: 선택된 말단절단 돌연변이체의 β-갈락토시다제 활성 검정의 결과
특정 말단절단된 표적화 서열이 관심 효소를 포자 표면에 표적화하기에 충분할 것인지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 하기는 에스케리키아 콜라이로부터 베타-갈락토시다제 (β-gal)를 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 제조하기 위한 일반적 프로토콜이다. 융합 구축물을 생성하기 위해, β-gal을 코딩하는 유전자를 유전자 합성에 의해 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 부가된 초기 메티오닌을 갖는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 N-말단 표적화 서열 (서열식별번호: 2임)의 아미노산 80-100을 코딩하는 DNA 절편에 융합시키고, 이. 콜라이/파에니바실루스 셔틀 벡터 (pAP13) 내로 클로닝하였다. 부가된 초기 메티오닌을 갖는 아미노산 80-100을 코딩하는 DNA 절편은 하기 표 8에서 서열식별번호: 40이다. 생성된 벡터 구축물을 상기 기재된 것과 유사한 전기천공에 의해 파에니바실루스 종 균주 1 내로 도입하였다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성까지 30℃에서 글루코스-기반 브로쓰에서 성장시켰다. 이어서, 융합 구축물을 발현하는 파에니바실루스 종 균주 1 포자를 시험관내 검정에 의해 검사하였다. 80-100 말단절단물은 기능적 β-갈락토시다제를 디스플레이하였다.
표 7. β-갈락토시다제 검정 결과
Figure pct00015
표 8. 실시예 17 및 18에서 분석된 말단절단된 N-말단 표적화 서열 구축물
Figure pct00016
Figure pct00017
달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공개는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
개시된 발명은 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 물질이 달라질 수 있기 때문에 이들에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 목적의 것이며, 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience LP <120> TARGETING SEQUENCES FOR PAENIBACILLUS-BASED ENDOSPORE DISPLAY PLATFORM <130> BCS199006 WO <150> 62/848,533 <151> 2019-05-15 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 1 atggtagtat tatctactgg acctattgca aacgatcctg ttctaggagt cagacccacc 60 caactggtca cagtaaaaat agataaccga gattctgtaa attcttctat cgttttgatc 120 gagggtttta ttttaaacgg tagcagaaca ttatatgtac aacaattagt ggtagtggga 180 ccaaatgcgg ttataacgag gaatttcttt gcaaatgtag acgcatttga attcgttttt 240 accactagcg gaccagcaga gaatgaaact caaatttctg tttggggtaa agatgcattg 300 gggcaattag tacctgccca tcggttagta tctgacgaac ttttaggaac cgatcga 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 2 Met Val Val Leu Ser Thr Gly Pro Ile Ala Asn Asp Pro Val Leu Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Thr Gln Leu Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Ser 20 25 30 Val Asn Ser Ser Ile Val Leu Ile Glu Gly Phe Ile Leu Asn Gly Ser 35 40 45 Arg Thr Leu Tyr Val Gln Gln Leu Val Val Val Gly Pro Asn Ala Val 50 55 60 Ile Thr Arg Asn Phe Phe Ala Asn Val Asp Ala Phe Glu Phe Val Phe 65 70 75 80 Thr Thr Ser Gly Pro Ala Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ser Val Trp Gly 85 90 95 Lys Asp Ala Leu Gly Gln Leu Val Pro Ala His Arg Leu Val Ser Asp 100 105 110 Glu Leu Leu Gly Thr Asp Arg 115 <210> 3 <211> 231 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 3 atgcctgcct tggatgaatg gagtagtata caacaaatcg atatggaggt gtttgtattg 60 ggtcgtcccg aattgaaacg aaagaaaggc cgtaaaaaag acgtttttat ccgctcttgg 120 tttagtaaaa aacgtccgaa gagaaaatgc cattcgaaac gaaagtgctt ttgcaaggaa 180 atcgtcgtca gaaagcaaat cgtccgtgta aatatacctc aaaatgtttt a 231 <210> 4 <211> 77 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. 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ctaaagttaa aaaagacggt 600 tctcctgctg atattttaga tgaattaact gaattaactg aacttgctaa atctgtaact 660 aaaaacgatg ttgacggttt cgaattctac cttaacactt tccacgatgt aatggtaggc 720 aacaaccttt tcggtcgctc tgctcttaaa actgctagtg aattaatcac taaagaaaac 780 gttaaaactt ctggtagcga agtaggtaac gtttacaatt tcttaatcgt actaacagct 840 cttcaagcac aagcattcct tactcttact acttgccgta aattacttgg tttagctgat 900 attgattaca cttctatcat gaacgaacat cttaacaaag aaaaagaaga attccgtgtt 960 aatatccttc cgacattatc taacactttt tctaacccaa attacgctaa ggttaaaggt 1020 agcgatgaag atgcaaaaat gatcgtagaa gctaaaccag gtcacgcatt aatcggtttc 1080 gagatctcaa acgacagcat cacagtttta aaagtttatg aagctaaact taaacaaaac 1140 taccaagtag ataaagacag cctgtctgaa gttatctacg gtgacatgga taaattatta 1200 tgtccagatc aaagtgaaca aatctactac actaataaca tcgtattccc aaacgaatat 1260 gtaatcacta aaatcgattt cacaaagaaa atgaaaactc ttcgttacga ggtaactgct 1320 aacttttacg attcatctac tggtgaaatt gatcttaaca agaaaaaagt tgaatcttct 1380 gaagctgaat accgtacatt atctgctaac gatgatggtg tttatatgcc tttaggtgta 1440 atttctgaaa cattcttaac tcctatcaac ggtttcggtc ttcaagctga tgaaaactct 1500 cgcttaatca ctttaacatg caaatcttac cttcgcgaac ttttattagc tacagattta 1560 tctaacaaag aaactaaact tattgttcct ccatctggat tcattagcaa tatcgttgag 1620 aacggtagca ttgaagaaga taaccttgaa ccttggaaag ctaacaacaa aaacgcatac 1680 gttgatcata caggtggtgt taacggtaca aaagctcttt acgtacacaa agatggtggt 1740 attagccaat tcatcggcga caaattaaag ccaaaaactg aatacgttat ccaatacact 1800 gtaaaaggta aaccatcaat tcatttaaaa gatgaaaata ctggttacat tcattacgaa 1860 gacactaaca acaaccttga agattaccaa acaatcaaca aacgttttac aacaggaact 1920 gacttaaaag gtgtttactt aattttaaaa tctcaaaacg gtgacgaggc atggggcgac 1980 aacttcatca ttctagaaat ttctccttct gaaaaattac tttctcctga attaatcaat 2040 actaacaact ggacttctac aggttctact aacatttctg gaaacacttt aacactttac 2100 caaggtggtc gtggtatctt aaaacaaaac ttacaattag attcattctc tacataccgt 2160 gtttatttct ctgtatctgg tgacgctaac gtacgtatcc gtaactctcg tgaagtatta 2220 tttgaaaaac gttacatgtc aggagctaaa gatgtatctg aaatgttcac 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Pro Ile Ser Gln Phe Thr Asn Asp Asp Gly Gln Leu Ala Ser Gln Leu 210 215 220 Pro Glu Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Thr Asp Leu Tyr Ile Asn Gly Val 225 230 235 240 Leu Gln Glu Ser Arg Leu Tyr Gln Ile Ser Ser Thr Thr Leu Thr Val 245 250 255 Glu Leu Glu Glu Ala Leu Val Ile Ala Gly Thr Pro Phe Ile Phe Glu 260 265 270 Val Phe Gln Phe Thr Leu Arg Met Ala Asn 275 280 <210> 31 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (54)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 31 Met Xaa Val Xaa Ser Thr Gly Pro Ile Xaa Asn Xaa Xaa Val Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Pro Thr Xaa Xaa Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Xaa 20 25 30 Val Asn Ser Ser Xaa Val Leu Ile Xaa Gly Phe Xaa Leu Asn Gly Xaa 35 40 45 Arg Thr Leu Tyr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa 50 55 60 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (54)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (83)..(86) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (92)..(92) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(100) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (112)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (117)..(120) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 32 Met Xaa Val Xaa Ser Thr Gly Pro Ile Xaa Asn Xaa Xaa Val Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Pro Thr Xaa Xaa Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Xaa 20 25 30 Val Asn Ser Ser Xaa Val Leu Ile Xaa Gly Phe Xaa Leu Asn Gly Xaa 35 40 45 Arg Thr Leu Tyr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Asn Xaa Val 50 55 60 Ile Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Glu Phe Val Phe 65 70 75 80 Thr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Glu Xaa Gln Xaa Ser Val Trp Gly 85 90 95 Lys Xaa Xaa Xaa Gly Gln Leu Val Xaa Ala His Arg Xaa Val Ser Xaa 100 105 110 Glu Leu Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 <210> 33 <211> 300 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 33 atggtagtat tatctactgg acctattgca aacgatcctg ttctaggagt cagacccacc 60 caactggtca cagtaaaaat agataaccga gattctgtaa attcttctat cgttttgatc 120 gagggtttta ttttaaacgg tagcagaaca ttatatgtac aacaattagt ggtagtggga 180 ccaaatgcgg ttataacgag gaatttcttt gcaaatgtag acgcatttga attcgttttt 240 accactagcg gaccagcaga gaatgaaact caaatttctg tttggggtaa agatgcattg 300 <210> 34 <211> 100 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 34 Met Val Val Leu Ser Thr Gly Pro Ile Ala Asn Asp Pro Val Leu Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Thr Gln Leu Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Ser 20 25 30 Val Asn Ser Ser Ile Val Leu Ile Glu Gly Phe Ile Leu Asn Gly Ser 35 40 45 Arg Thr Leu Tyr Val Gln Gln Leu Val Val Val Gly Pro Asn Ala Val 50 55 60 Ile Thr Arg Asn Phe Phe Ala Asn Val Asp Ala Phe Glu Phe Val Phe 65 70 75 80 Thr Thr Ser Gly Pro Ala Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ser Val Trp Gly 85 90 95 Lys Asp Ala Leu 100 <210> 35 <211> 240 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 35 atggtagtat tatctactgg acctattgca aacgatcctg ttctaggagt cagacccacc 60 caactggtca cagtaaaaat agataaccga gattctgtaa attcttctat cgttttgatc 120 gagggtttta ttttaaacgg tagcagaaca ttatatgtac aacaattagt ggtagtggga 180 ccaaatgcgg ttataacgag gaatttcttt gcaaatgtag acgcatttga attcgttttt 240 <210> 36 <211> 80 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 36 Met Val Val Leu Ser Thr Gly Pro Ile Ala Asn Asp Pro Val Leu Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Thr Gln Leu Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Ser 20 25 30 Val Asn Ser Ser Ile Val Leu Ile Glu Gly Phe Ile Leu Asn Gly Ser 35 40 45 Arg Thr Leu Tyr Val Gln Gln Leu Val Val Val Gly Pro Asn Ala Val 50 55 60 Ile Thr Arg Asn Phe Phe Ala Asn Val Asp Ala Phe Glu Phe Val Phe 65 70 75 80 <210> 37 <211> 120 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 37 atggtagtat tatctactgg acctattgca aacgatcctg ttctaggagt cagacccacc 60 caactggtca cagtaaaaat agataaccga gattctgtaa attcttctat cgttttgatc 120 <210> 38 <211> 40 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 38 Met Val Val Leu Ser Thr Gly Pro Ile Ala Asn Asp Pro Val Leu Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Thr Gln Leu Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Ser 20 25 30 Val Asn Ser Ser Ile Val Leu Ile 35 40 <210> 39 <211> 66 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 39 atgtttacca ctagcggacc agcagagaat gaaactcaaa tttctgtttg gggtaaagat 60 gcattg 66 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 40 Met Phe Thr Thr Ser Gly Pro Ala Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ser Val 1 5 10 15 Trp Gly Lys Asp Ala Leu 20 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 41 atgactcaaa tttctgtttg gggtaaagat gcattg 36 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 42 Met Thr Gln Ile Ser Val Trp Gly Lys Asp Ala Leu 1 5 10 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 43 atgactcaaa tttctgtttg g 21 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 44 Met Thr Gln Ile Ser Val Trp 1 5 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 45 atgcaaattt ctgtttgggg taaagat 27 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 46 Met Gln Ile Ser Val Trp Gly Lys Asp 1 5 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 47 atgtggggta aagatgcatt g 21 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 48 Met Trp Gly Lys Asp Ala Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated N-terminal targeting sequence derived from Paenibacillus <400> 49 Met Gln Ile Ser Val Trp Gly Lys Asx 1 5

Claims (35)

  1. (a) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은
    (i) 서열식별번호: 39, 41 또는 45;
    (ii) 서열식별번호: 39, 41 또는 45 중 어느 것과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (iii) 하기 폴리펩티드 서열: "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49) 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
    (iv) "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49)을 포함하는, 최대 20, 30 또는 40개의 아미노산의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
    을 포함하고, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스(Paenibacillus) 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드 서열: "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49)을 코딩하는 서열로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 것인 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 복수의 N-말단 표적화 서열을 코딩하고, 여기서 각각의 N-말단 표적화 서열이 독립적으로 "MFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 40), "MTQISVWGKDAL" (서열식별번호: 42) 또는 "MQISVWGK(D/N)" (서열식별번호: 49)으로부터 선택된 것인 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 2의 아미노산 80-90, 90-100 또는 91-98 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 2-9를 코딩하는 서열로 본질적으로 이루어진 것인 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가
    (a) 식물 성장-자극 단백질;
    (b) 효소;
    (c) 단백질;
    (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드;
    (e) 치료 단백질; 또는
    (f) 식물 면역-자극 단백질
    을 포함하는 것인 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치하는, 1개 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 선택 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 가시화 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (d) 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (e) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는, 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드
    를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 파에니바실루스 내생포자가 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에(Paenibacillus terrae), 파에니바실루스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) 또는 파에니바실루스 페오리아에(Paenibacillus peoriae)를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이거나; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아에 의해 형성된 내생포자인 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 파에니바실루스 중 적어도 하나에 대해 이종인 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 39, 41 또는 45와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함하며, 이는 동일한 조건 하에 상응하는 비최적화된 서열과 비교하여 파에니바실루스 내생포자에서 더 높은 비율 또는 수준으로 발현되는 것인 핵산 분자.
  10. N-말단 신호 펩티드와 이에 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는
    (i) 서열식별번호: 40, 42, 46 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) 서열식별번호: 40, 42, 46 또는 49의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;
    (iii) 서열식별번호: 40, 42, 46 또는 49 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리펩티드; 또는
    (iv) 서열식별번호: 40, 42, 46 또는 49 중 어느 하나의 적어도 7개의 연속 아미노산의 단편을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리펩티드
    를 포함하고; 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, N-말단 신호 펩티드가 최대 10, 15, 20, 25, 30 또는 35개의 아미노산으로 이루어진 것인 융합 단백질.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가
    (a) 식물 성장-자극 단백질;
    (b) 효소;
    (c) 단백질;
    (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드;
    (e) 치료 단백질; 또는
    (f) 식물 면역-자극 단백질
    을 포함하는 것인 융합 단백질.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치하는, 1개 이상의 프로테아제 절단 부위를 함유하는 폴리펩티드;
    (b) 선택 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 가시화 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (d) 적어도 1개의 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (e) 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는, 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드
    를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 파에니바실루스 내생포자가 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아에 의해 형성된 내생포자인 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 염색체를 포함하는 재조합 파에니바실루스 세포.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터이며, 플라스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터를 포함하는 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 하기:
    (a) 파에니바실루스 세포에서 안정한 유지를 제공하는 복제 기점;
    (b) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 비-안정한 유지를 제공하는 복제 기점;
    (c) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 비-안정한 유지를 제공하는 온도-감수성 복제 기점;
    (d) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (e) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 식물 성장 자극 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
    중 적어도 하나를 추가로 포함하는 벡터.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 파에니바실루스 세포.
  19. 제18항에 있어서, 파에니바실루스 세포가 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아인 재조합 파에니바실루스 세포.
  20. a) 포자형성이 가능한 파에니바실루스 세포를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계; 및
    b) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 융합 단백질을, 융합 단백질이 포자형성으로부터 생성된 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화되도록 하는 포자형성 조건 하에 발현시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 것인, 이종 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에 디스플레이하는 방법.
  21. a) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함하는 것인 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 1종 이상의 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 세포; 및
    b) 적어도 1종의 생물학적 방제제를; 임의로
    상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제18항 또는 제19항의 재조합 박테리아 세포 또는 제21항의 조성물로 처리된 종자.
  23. a) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함하는 것인 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자-생산 파에니바실루스 내생포자; 및
    b) 적어도 1종의 생물학적 방제제를; 임의로
    상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 성장을 증진시키고/거나 식물 건강을 촉진하기 위해 식물, 종자, 식물 부분 또는 식물 주위의 토양을 처리하는 방법.
  24. a) 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을, 파에니바실루스가 영구적으로 또는 일시적으로 콜로니화할 수 있는 종자, 묘목 또는 영양 식물에 적용하여, 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물을 생산하는 단계; 및
    b) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물의 형질, 성분 또는 속성을 검출하고 임의로 측정함으로써 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물을 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리된 숙주 식물을 스크리닝하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 스크리닝 단계가 하기:
    a) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플로부터 제조된 추출물에 함유된 1종 이상의 화합물의 존재, 수준, 수준의 변화, 활성 또는 국재화를 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 1종의 시험관내 검정; 및/또는
    b) 처리된 종자, 묘목 또는 영양 식물의 형질, 성분 또는 속성을 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 1종의 생체내 검정
    중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  26. a) 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하도록 파에니바실루스 세포를 변형시켜 재조합 파에니바실루스 세포를 생산하는 단계; 및
    b) 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 화합물의 수준 또는 활성을 검출하고 임의로 정량화함으로써 파에니바실루스 세포를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 파에니바실루스 세포에서 발현된 이종 단백질 또는 펩티드를 농업상 유의한 특성에 대해 스크리닝하는 방법.
  27. 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자, 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 파에니바실루스 세포는 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 것인, 식물, 종자, 인간 또는 동물을 처리하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 생존 파에니바실루스 세포가 남아있지 않도록 조성물이 열-불활성화 또는 멸균된 것인 방법.
  29. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 단리 및/또는 정제된 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  30. 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자 또는 재배지에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 파에니바실루스 내생포자는 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 것인, 관심 단백질을 식물, 종자 또는 재배지에 전달하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 조성물이
    a) 식재전 또는 식재후;
    b) 출아전 또는 출아후;
    c) 분말, 현탁액 또는 용액으로서 재배지에 적용되고/거나;
    d) 여기서 조성물이 식물 성장을 자극하거나 식물을 해충으로부터 보호하는 1종 이상의 추가의 화합물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  32. (a) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 이에 작동가능하게 연결된 (b) N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은
    (i) 서열식별번호: 33의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (ii) 서열식별번호: 33 중 어느 것과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 N-말단 신호 펩티드를 코딩하고 최대 20, 30 또는 40개 아미노산의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
    (iii) 하기 폴리펩티드 서열: "MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDAFEFVFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 34)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
    로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 핵산 분자.
  33. 제32항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 복수의 N-말단 표적화 서열을 코딩하고, 여기서 각각의 N-말단 표적화 서열이 "MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDAFEFVFTTSGPAENETQISVWGKDAL" (서열식별번호: 34)인 핵산 분자.
  34. N-말단 신호 펩티드와 이에 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는
    (i) 서열식별번호: 34의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드; 또는
    (ii) 서열식별번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드
    를 포함하고; 여기서 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 것인 융합 단백질.
  35. 제34항 또는 제35항에 있어서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가
    (a) 식물 성장-자극 단백질;
    (b) 효소;
    (c) 단백질;
    (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드;
    (e) 치료 단백질; 또는
    (f) 식물 면역-자극 단백질
    을 포함하는 것인 융합 단백질.
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