BR112020009618A2 - plataforma, produtos e métodos de exibição de endósporo à base de paenibacillus - Google Patents

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Dilara ALLY
Florencia A. FICARRA
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Abstract

São fornecidas sequências de sinal úteis para alvejar proteínas e peptídeos na superfície de endósporos produzidos por membros da família de Paenibacillus e métodos de uso das mesmas. É fornecida a exibição de moléculas heterólogas, como peptídeos, polipeptídeos e outros construtos recombinantes, na superfície de esporo de membros da família de Paenibacillus, usando sequências de alvejamento Nterminais particulares e derivados das mesmas, e similares.

Description

“PLATAFORMA, PRODUTOS E MÉTODOS DE EXIBIÇÃO DE ENDÓSPORO À BASE DE PAENIBACILLUS” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade em relação ao Pedido de Patente Provisório nº US 62/587.371 depositado em 16 de novembro de 2017, cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE
[0002] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente através da EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo com o nome de “BCS178993WO_ST25.txt” criado em terça-feira, 13 de novembro de 2018, e que tem um tamanho de 80 quilobytes, e é depositada concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[0003] A revelação se refere geralmente à plataforma de exibição de endósporos, métodos de exibição relacionados, sequências de alvejamento de superfície de esporo e construtos de proteína de fusão que compreendem os mesmos, composições de endósporo recombinante e métodos para identificar sequências de alvejamento de superfície de esporo em Paenibacillus e outros gêneros bacterianos que são úteis para várias aplicações, como a entrega de uma molécula heteróloga de interesse, a uma planta, semente ou campo.
ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO
[0004] Técnicas agrícolas modernas dependem fortemente das composições que promovem ou melhoram o crescimento e a saúde da planta a fim de aprimorar a produtividade e qualidade das culturas. Tais composições incluem geralmente fertilizantes orgânicos ou inorgânicos, nutrientes e outros compostos químicos que promovem o desenvolvimento e o crescimento apropriados da planta. No entanto, é bem estabelecido que a longo prazo ou o uso excessivo de muitas dessas composições pode resultar em efeitos colaterais negativos, como desestabilização ou acidificação do solo do equilíbrio de nutrientes no solo. Ademais, o uso excessivo pode resultar no enriquecimento de produtos finais prejudiciais em culturas cultivadas para consumo humano.
[0005] Fazendas modernas também dependem tipicamente do uso de uma ampla variedade de produtos químicos (por exemplo, inseticidas, herbicidas, bactericidas, nematicidas e fungicidas) para controlar as pragas e garantir uma alta produtividade de culturas comercialmente cultivadas. Muitos desses compostos químicos exibem ampla atividade e podem ser potencialmente prejudiciais aos seres humanos e animais em altas concentrações. Além disso, alguns compostos químicos exibem efeitos equivocados. Ademais, pelo menos alguns desses compostos sintéticos são não biodegradáveis. Nos últimos anos, houve uma crescente pressão dos consumidores para produtos agrícolas que foram criados e colhidos com exposição reduzida ou sem exposição a inseticidas ou fungicidas sintéticos. Um problema adicional que surge com o uso de inseticidas ou fungicidas sintéticos consiste no fato de que o uso repetido e/ou exclusivo frequentemente leva à seleção de pragas resistentes. Normalmente, pragas resistentes também possuem resistência cruzada contra outros ingredientes ativos que têm o mesmo modo de ação. Como resultado, os compostos e as composições de controle de praga são difíceis e dispendiosos de serem desenvolvidos (por exemplo, devido às preocupações de segurança e o desenvolvimento rápido de resistência).
[0006] Os métodos de engenharia genética são usados para promover o crescimento e/ou a saúde vegetal sem depender de produtos químicos sintéticos. Por exemplo, as culturas podem ser modificadas para introduzir ou modificar genes relacionados ao crescimento e/ou à saúde vegetal, e/ou para introduzir genes que codificam os agentes de controle de praga sintéticos ou naturais. Transgenes podem ser introduzidos em uma planta-alvo com uso de um vetor viral. Nos últimos anos, houve algum sucesso relatado usando bactérias para entrega de proteínas recombinantes às plantas. Entretanto, até a presente data, tal sucesso é em grande parte limitado aos membros da família Bacillaceae e, mais especificamente, Bacillus subtilis, que são as bactérias gram-positivas mais bem caracterizadas e o modelo bacteriano primário para pesquisas sobre esporulação. O enfoque em B. subtilis como uma plataforma de entrega e expressão é adicionalmente devido ao fato de que o genoma B. subtilis e vias biológicas relacionadas à síntese proteica e secreção são bem entendidos. Entretanto, devido ao alto grau de diversidade genética entre as bactérias, os resultados de pesquisa com base nos estudos de B. subtilis frequentemente não são diretamente traduzíveis para os membros dentro e fora da família Bacillaceae.
[0007] Consequentemente, embora certos métodos de entrega de materiais genéticos heterólogos sejam conhecidos, há uma necessidade na técnica de desenvolver plataformas de entrega e expressão inovadoras para tais materiais genéticos.
BREVE SUMÁRIO DE MODALIDADES DA REVELAÇÃO
[0008] A revelação descreve métodos, composições e construtos genéticos que abordam as necessidades identificadas acima, por exemplo, pelo fornecimento, dentre outras coisas, de uma plataforma inovadora para entregar enzimas recombinantes e outras moléculas de interesse (por exemplo, peptídeo, proteína) a um ambiente (por exemplo, planta, campo) usando membros de formação de esporo do gênero Paenibacillus. A revelação também fornece métodos para identificar as sequências de alvejamento de superfície de esporo em Paenibacillus e outros gêneros bacterianos.
[0009] Em um aspecto, a revelação fornece células recombinantes de Paenibacillus produtoras de endósporo que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo heterólogo que confere ou modifica um traço ou atributo vegetal (por exemplo, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento vegetal; uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal; um composto microbicida ou microbiostático; ou uma enzima, proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou uma praga); e (ii) uma sequência de alvejamento N-terminal que localiza a proteína de fusão para a superfície de esporo das células de Paenibacillus. Essa composição geral pode incluir adicionalmente componentes adicionais (por exemplo, que promovem crescimento e/ou saúde vegetal). Ademais, modalidades particulares dos métodos reveladas no presente documento fornecem uma triagem eficaz de alto rendimento de peptídeo e proteínas heterólogas que conferem ou, de outro modo, modificam os traços ou atributos vegetais.
[0010] Em um aspecto alternativo, a revelação fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão, que compreende (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal N- terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: (i) uma sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal N- terminal; (ii) uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9; ou (iii) uma sequência de polinucleotídeos que compreende um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de alvejar a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus.
[0011] Em um outro aspecto alternativo, a revelação fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão, que compreende (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal N- terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: (i) uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 3,
5, 7 ou 9 ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos que compreende um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de alvejar a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus.
[0012] Em alguns aspectos, o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) pelo menos um dentre uma proteína imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Paenibacillus; ou (e) uma proteína terapêutica. Nos aspectos selecionados, a molécula de ácido nucleico que compreende adicionalmente uma terceira sequência de polinucleotídeos, que codifica: (a) um polipeptídeo que compreende um ou mais sítios de clivagem de protease, em que o polipeptídeo é posicionado entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo que compreende um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo que compreende um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo que compreende um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo que compreende um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
[0013] Em alguns aspectos, o endósporo de Paenibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Paenibacillus, que compreende: Paenibacillus sp. NRRL B-50972, Paenibacillus terrae, Paenibacillus polymyxa ou Paenibacillus peoriae.
[0014] Em outros aspectos, o endósporo de Paenibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Paenibacillus, que compreende: Paenibacillus abyssi, Paenibacillus aceti, Paenibacillus aestuarii, Paenibacillus agarexedens, Paenibacillus agaridevorans, Paenibacillus alginolyticus, Paenibacillus algorifonticola, Paenibacillus alkaliterrae, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus anaericanus, Paenibacillus antarcticus, Paenibacillus apiarius, Paenibacillus arachidis, Paenibacillus assamensis, Paenibacillus azoreducens, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus baekrokdamisoli, Paenibacillus barcinonensis, Paenibacillus barengoltzii, Paenibacillus borealis, Paenibacillus bovis, Paenibacillus brasilensis, Paenibacillus camelliae, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus castaneae, Paenibacillus catalpae, Paenibacillus cathormii, Paenibacillus cavernae, Paenibacillus célulaulosilyticus, Paenibacillus célulaulositrophicus, Paenibacillus chartarius, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus chinjuensis, Paenibacillus chitinolyticus, Paenibacillus chondroitinus, Paenibacillus chungangensis, Paenibacillus cineris, Paenibacillus cisolokensis, Paenibacillus contaminans, Paenibacillus cookii, Paenibacillus cucumis, Paenibacillus curdlanolyticus, Paenibacillus daejeonensis, Paenibacillus darwinianus, Paenibacillus dauci, Paenibacillus dendritiformis, Paenibacillus dongdonensis, Paenibacillus doosanensis, Paenibacillus durus, Paenibacillus edaphicus, Paenibacillus ehimensis, Paenibacillus elgii, Paenibacillus endophyticus, Paenibacillus etheri, Paenibacillus faecis, Paenibacillus favisporus, Paenibacillus ferrarius, Paenibacillus filicis, Paenibacillus fonticola, Paenibacillus forsythiae, Paenibacillus frigoriresistens,
Paenibacillus gansuensis, Paenibacillus gelatinilyticus, Paenibacillus ginsengarvi, Paenibacillus ginsengihumi, Paenibacillus ginsengisoli, Paenibacillus glacialis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus glycanilyticus, Paenibacillus gordonae, Paenibacillus graminis, Paenibacillus granivorans, Paenibacillus guangzhouensis ou Paenibacillus harenae.
[0015] Em alguns aspectos, o endósporo de Paenibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Paenibacillus, que compreende: Paenibacillus hemerocallicola, Paenibacillus hispanicus, Paenibacillus hodogayensis, Paenibacillus hordei, Paenibacillus humicus, Paenibacillus hunanensis, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus jamilae, Paenibacillus jilunlii, Paenibacillus kobensis, Paenibacillus koleovorans, Paenibacillus konsidensis, Paenibacillus koreensis, Paenibacillus kribbensis, Paenibacillus kyungheensis, Paenibacillus lactis, Paenibacillus larvae, Paenibacillus larvae, Paenibacillus larvae, Paenibacillus lautus, Paenibacillus lemnae, Paenibacillus lentimorbus, Paenibacillus lentus, Paenibacillus liaoningensis, Paenibacillus lupini, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus marchantiophytorum, Paenibacillus marinisediminis, Paenibacillus massiliensis, Paenibacillus medicaginis, Paenibacillus mendelii, Paenibacillus methanolicus, Paenibacillus montaniterrae, Paenibacillus motobuensis, Paenibacillus mucilaginosus, Paenibacillus nanensis, Paenibacillus naphthalenovorans, Paenibacillus nasutitermitis, Paenibacillus nematophilus, Paenibacillus nicotianae, Paenibacillus oceanisediminis, Paenibacillus odorifer, Paenibacillus oenotherae, Paenibacillus oryzae, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus panacisoli, Paenibacillus panaciterrae, Paenibacillus pasadenensis, Paenibacillus pectinilyticus, Paenibacillus periandrae ou Paenibacillus phoenicis.
[0016] Em alguns aspectos, o endósporo de Paenibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Paenibacillus, que compreende: Paenibacillus phyllosphaerae, Paenibacillus physcomitrellae, Paenibacillus pini, Paenibacillus pinihumi, Paenibacillus pinesoli, Paenibacillus pocheonensis, Paenibacillus popilliae, Paenibacillus populi, Paenibacillus prosopidis, Paenibacillus provencensis, Paenibacillus pueri, Paenibacillus puldeungensis, Paenibacillus pulvifaciens, Paenibacillus purispatii, Paenibacillus qingshengii, Paenibacillus quercus, Paenibacillus radicis, Paenibacillus relictisesami, Paenibacillus residui, Paenibacillus rhizoryzae, Paenibacillus rhizosphaerae, Paenibacillus rigui, Paenibacillus riograndensis, Paenibacillus ripae, Paenibacillus sabinae, Paenibacillus sacheonensis, Paenibacillus salinicaeni, Paenibacillus sanguinis, Paenibacillus sediminis, Paenibacillus segetis, Paenibacillus selenii, Paenibacillus selenitireducens, Paenibacillus senegalensis, Paenibacillus septentrionalis, Paenibacillus sepulcri, Paenibacillus shenyangensis, Paenibacillus shirakamiensis, Paenibacillus siamensis, Paenibacillus silagei, Paenibacillus sinopodophylli, Paenibacillus solani, Paenibacillus soli, Paenibacillus sonchi, Paenibacillus sophorae, Paenibacillus sputi, Paenibacillus stellifer, Paenibacillus susongensis,
Paenibacillus swuensis, Paenibacillus taichungensis, Paenibacillus taiwanensis, Paenibacillus tarimensis, Paenibacillus telluris, Paenibacillus terreus, Paenibacillus terrigena, Paenibacillus thailandensis, Paenibacillus thermophilus, Paenibacillus thiaminolyticus, Paenibacillus tianmuensis, Paenibacillus tibetensis, Paenibacillus timonensis, Paenibacillus tundrae, Paenibacillus turicensis, Paenibacillus typhae, Paenibacillus uliginis, Paenibacillus urinalis, Paenibacillus validus, Paenibacillus vini, Paenibacillus vulneris, Paenibacillus wenxiniae, Paenibacillus wooponensis, Paenibacillus woosongensis, Paenibacillus wulumuqiensis, Paenibacillus wynnii, Paenibacillus xanthinilyticus, Paenibacillus xinjiangensis, Paenibacillus xylanexedens, Paenibacillus xylanilyticus, Paenibacillus xylanisolvens, Paenibacillus yonginensis, Paenibacillus yunnanensis, Paenibacillus zanthoxyli ou Paenibacillus zeae.
[0017] Em alguns aspectos, a molécula de ácido nucleico é ligada operacionalmente a um elemento promotor que é heterólogo a pelo menos uma das segundas sequências de polinucleotídeos e Paenibacillus.
[0018] Em alguns aspectos, a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: (a) uma sequência de polinucleotídeos de códon otimizado que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9, que é expressa em uma taxa ou nível superior no endósporo de Paenibacillus em comparação com a respectiva original SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9, sob condições idênticas.
[0019] Em um aspecto alternativo, a revelação fornece uma proteína de fusão que compreende um peptídeo de sinal N- terminal operacionalmente ligado a um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, ou 80 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10; ou (b) um polipeptídeo que compreende um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de alvejar a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus.
[0020] Em alguns aspectos, o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) pelo menos um dentre uma proteína imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; (b) uma enzima; (c) um polipeptídeo heterólogo a Paenibacillus; (d) uma proteína terapêutica (por exemplo, uma proteína antibiótica ou anti- inflamatória); ou (e) uma proteína que fornece uma propriedade com importância agrícola, incluiu, porém sem limitação: atividade inseticida/insetistática, atividade bactericida/bacteriostática, atividade fungicida/fungistática, crescimento vegetal, atividade imunoestimulante ou de saúde e/ou resistência ambiental abiótica melhorada. Outras propriedades agricolamente significativas incluem características de cultura incluindo: emergência, produtividades da cultura, teor de proteína, teor de óleo, teor de amido, sistema radicular mais desenvolvido, sistema radicular melhorado, manutenção de tamanho radicular melhorada, eficácia radicular melhorada,
tolerância ao estresse melhorada (por exemplo, contra seca, calor, sal, UV, água, frio), etileno reduzido (produção reduzida e/ou inibição de recepção), aumento de perfilhamento, aumento na altura da planta, lâmina de folha maior, menos folhas basais mortas, perfilhos mais fortes, cor da folha mais verde, teor de pigmento, atividade fotossintética, menos entrada necessária (como fertilizantes ou água), menos sementes necessária, perfilhos mais produtivos, florescimento mais precoce, maturidade do grão mais precoce, menos "plant verse" (acamamento), crescimento de broto aumentado, vigor de planta intensificado, povoamento de planta aumentado e germinação precoce e melhor.
[0021] Em alguns aspectos, a proteína de fusão compreende adicionalmente: (a) um polipeptídeo contendo um ou mais sítios de clivagem de protease, posicionado entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo que compreende um marcador selecionável (por exemplo, uma proteína que confere resistência a um antibiótico); (c) um polipeptídeo que compreende um elemento de visualização (por exemplo, uma etiqueta fluorescente como GFP); (d) um polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio de reconhecimento/purificação de proteína (por exemplo, uma etiqueta His); ou (e) um polipeptídeo que compreende um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
[0022] Em um aspecto alternativo, a revelação fornece uma célula recombinante Paenibacillus que compreende um cromossomo bacteriano que compreende a molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos anteriores.
[0023] Em um aspecto alternativo, a revelação fornece um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o vetor compreende um plasmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral.
[0024] Em alguns aspectos, o vetor que compreende adicionalmente pelo menos um dos seguintes: (a) uma origem de replicação que fornece manutenção estável em uma célula de Paenibacillus; (b) uma origem de replicação que fornece seletivamente manutenção não estável em uma célula de Paenibacillus; (c) uma origem sensível à temperatura de replicação que fornece seletivamente manutenção não estável em uma célula de Paenibacillus; (d) um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; ou (e) um polinucleotídeo que codifica uma proteína estimuladora de crescimento vegetal, ligada operacionalmente a uma sequência de controle de expressão.
[0025] Em aspectos alternativos, a revelação fornece uma célula recombinante de Paenibacillus transformada com um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos revelados no presente documento.
[0026] Em alguns aspectos, a célula de Paenibacillus é uma espécie de Paenibacillus, que compreende: Paenibacillus sp. NRRL B-50972, Paenibacillus terrae, Paenibacillus polymyxa ou Paenibacillus peoriae. Em outros aspectos exemplificativos, a célula de Paenibacillus pode ser selecionada a partir de qualquer uma das espécies exemplificativas de Paenibacillus descritas no presente documento.
[0027] Em aspectos alternativos, a revelação fornece um método para exibir uma proteína de fusão heteróloga na superfície de esporo de um esdósporo de Paenibacillus, em que o método compreende: a) transformar uma célula de Paenibacillus capaz de esporular com um vetor recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos revelados no presente documento; e b) expressar a proteína de fusão codificada pela molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos revelados no presente documento sob as condições de esporulação de modo que a proteína de fusão seja alvejada para a superfície de esporo do endósporo de Paenibacillus que resulta da esporulação, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; ou (ii) um fragmento de pelo menos 5, 10, 15 ou 20 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2.
[0028] Em aspectos alternativos, a revelação fornece uma composição que compreende: a) uma ou mais células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam a proteína de fusão de qualquer um dos aspectos revelados no presente documento, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; e b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0029] Em aspectos alternativos, a revelação fornece uma semente tratada com pelo menos um dentre ácidos nucleicos, proteínas de fusão, células bacterianas ou composições de qualquer um dos aspectos revelados no presente documento.
[0030] Em aspectos alternativos, a revelação fornece um método para tratar uma planta, uma semente, uma parte de planta, ou o solo que circunda a planta para melhorar o crescimento vegetal e/ou promover saúde vegetal que compreende a etapa de aplicar simultânea ou sequencialmente: a) endósporos recombinantes produtores de endósporo Paenibacillus que expressam a proteína de fusão de qualquer um dos aspectos revelados no presente documento, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; e b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0031] Em aspectos alternativos, a revelação fornece um método de triagem de uma planta hospedeira tratada com um endósporo recombinante de Paenibacillus, que compreende as seguintes etapas: a) aplicar uma composição que compreende um endósporo de Paenibacillusmodificado para expressar uma proteína de fusão de acordo com qualquer um dos aspectos revelados no presente documento, a uma semente, uma muda ou uma planta vegetativa capaz de ser permanente ou transitoriamente colonizada por um Paenibacillus, para produzir uma semente, muda ou planta vegetativa tratada; b) triar a semente, muda ou planta vegetativa tratada pela detecção e medição opcional de um traço, componente ou atributo da semente, muda ou planta vegetativa tratada.
[0032] Em alguns aspectos, a etapa de triagem compreende uma ou mais das seguintes: a) pelo menos um ensaio in vitro que compreende detectar e opcionalmente quantificar a presença, o nível, a alteração em nível, a atividade ou a localização de um ou mais compostos contidos em um extrato preparado a partir de uma amostra de célula ou tecido obtido a partir da semente, muda ou planta vegetativa tratada; e/ou b) pelo menos um ensaio in vivo que compreende detectar e opcionalmente quantificar um traço, componente ou atributo da semente, muda ou planta vegetativa tratada.
[0033] Em aspectos alternativos, a revelação fornece um método de triar as proteínas ou peptídeos heterólogos expressados em uma célula de Paenibacillus para propriedades agricolamente significativas, que compreende: a) modificar uma célula de Paenibacillus para expressar uma proteína de fusão de acordo com os aspectos revelados no presente documento para produzir uma célula recombinante de Paenibacillus; e b) triar a célula de Paenibacillus pela detecção e quantificação opcional de um nível ou atividade de um composto produzido pela célula recombinante de Paenibacillus.
[0034] Em aspectos alternativos, a revelação fornece um método para identificar sequências de alvejamento de superfície de esporo em Paenibacillus e outros gêneros bacterianos adequados para exibição de endósporo, que compreende: triar um genoma de um Paenibacillus ou uma outra bactéria de formação de endósporo de interesse para quadros de leitura abertos que codificam as proteínas que têm múltiplas repetições de tripleto similares ao colágeno de “Gly-X-X” (“repetições de GXX” em que “X” representa qualquer aminoácido); e determinar que a proteína se localiza na superfície de esporo por microscopia ou experimentalmente. Em alguns aspectos, a localização de proteína é determinada usando microscopia eletrônica de transmissão ou espectrometria de massa. Em outros aspectos, a sequência de alvejamento N-terminal putativa a partir de uma proteína que se localiza na superfície de esporo é fusionada a um gene repórter e a proteína de fusão resultante é expressa em uma bactéria formadora de endósporo. Ainda em outros aspectos, a proteína de fusão resultante é analisada para expressão na superfície de tal bactéria formadora de endósporo. Em um outro aspecto, se tal expressão for detectada, o gene repórter é substituído por uma sequência de nucleotídeos de interesse e tal segunda proteína de fusão é expressa em uma bactéria formadora de endósporo.
[0035] Em alguns aspectos, a revelação fornece as sequências de alvejamento de superfície de esporo a partir de Paenibacillus e outros gêneros bacterianos que compreendem uma sequência de alvejamento N-terminal de uma proteína identificada através do método anteriormente mencionado. Essa sequência de alvejamento N-terminal pode compreender os primeiros 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ou 120 aminoácidos da proteína, ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em alguns aspectos, a sequência de alvejamento N-terminal é uma variante que é pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % idêntica à sequência endógena de alvejamento N-terminal. As sequências de alvejamento de superfície de esporo em Paenibacillus e outros gêneros bacterianos identificados usando esses métodos podem ser usados para gerar proteínas de fusão heterólogas de acordo com qualquer uma das modalidades descritas no presente documento.
[0036] Nos aspectos selecionados, a composição foi inativada por calor ou esterilizada de modo que nenhuma célula viável de Paenibacillus permanecesse.
[0037] Em aspectos alternativos, a revelação fornece uma composição que compreende uma proteína de fusão isolada e/ou purificada de acordo com qualquer um dos aspectos revelados no presente documento.
[0038] Em aspectos alternativos, a revelação fornece um método de entrega de uma proteína de interesse para uma planta, semente ou campo, que compreende: aplicar uma composição que compreende um endósporo recombinante de Paenibacillus a uma planta, semente ou campo; em que o endósporo recombinante de Paenibacillus foi modificado para expressar uma proteína de fusão de acordo com qualquer um dos aspectos revelados no presente documento.
[0039] Em alguns aspectos, a composição é aplicada a um campo: a) pré- ou pós-plantio; b) pré- ou pós-emergência; c) como um pó, suspensão ou solução; ou d) em que a composição compreende adicionalmente um ou mais compostos adicionais que estimulam o crescimento vegetal.
[0040] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão, que compreende (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal N- terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: (i) uma sequência de polinucleotídeos que compreende pelo menos 15, 30, 45, 60, 75 ou 90 nucleotídeos; (ii) uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 3, 5,
7, 9, 19, 23, 25, 27, ou 29; ou (iii) uma sequência de polinucleotídeos que compreende um fragmento de pelo menos 45, 90, 135, 180, 225, 270, 315, ou 345 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, ou 29; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de alvejar a proteína de fusão para uma superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus.
[0041] Em um aspecto, o fragmento começa no primeiro nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, ou
29. Em um outro aspecto, a primeira sequência de polinucleotídeos compreende uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 7, 19 ou 27. Em um outro aspecto, o fragmento codifica os aminoácidos 1-15 ou 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105 ou 1-115 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8.
[0042] Em uma modalidade, o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora de crescimento vegetal; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Paenibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora de vegetal.
[0043] Em uma outra modalidade, o ácido nucleico que compreende adicionalmente uma terceira sequência de polinucleotídeos, que codifica: (a) um polipeptídeo que compreende um ou mais sítios de clivagem de protease, em que o polipeptídeo é posicionado entre o peptídeo de sinal N- terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N- terminal; (b) um polipeptídeo que compreende um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo que compreende um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo que compreende um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo que compreende um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
[0044] Ainda em uma outra modalidade, o endósporo de Paenibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Paenibacillus, que compreende: Paenibacillus sp. NRRL B- 50972, Paenibacillus terrae, Paenibacillus polymyxa, ou Paenibacillus peoriae; ou um endósporo formado por uma bactéria que possui um gene de rRNA 16S que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99 % de identidade com um gene de rRNA 16S de uma espécie de Paenibacillus.
[0045] Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é ligada operacionalmente a um elemento promotor que é heterólogo a pelo menos uma das segundas sequências de polinucleotídeos e Paenibacillus.
[0046] Em um outro aspecto, a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: uma sequência de polinucleotídeos de códon otimizado que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, ou 29; ou um fragmento da mesma, que é expresso em uma taxa ou nível superior no endósporo de Paenibacillus em comparação com a sequência não otimizada correspondente sob condições idênticas.
[0047] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de fusão que compreende um peptídeo de sinal N-terminal operacionalmente ligado a um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo que compreende pelo menos 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, ou 115 resíduos; (ii) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 ou 32; ou (iii) um polipeptídeo que compreende um fragmento de pelo menos 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, ou 115 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 ou 32; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de alvejar a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus.
[0048] Em uma modalidade, o fragmento começa no primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 ou 32. Em uma outra modalidade, a sequência de polipeptídeos compreende uma sequência que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2, 8, 20, 21, 22, 28, 31 ou 32. Ainda em uma outra modalidade, o fragmento compreende aminoácidos 1-15, ou 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105 ou 1-115 de SEQ ID NO: 2, 8, 31 ou 32.
[0049] Em alguns aspectos, o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora de crescimento vegetal; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Paenibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora de vegetal.
[0050] Em outros aspectos, a proteína de fusão compreende adicionalmente: (a) um polipeptídeo contendo um ou mais sítios de clivagem de protease, posicionados entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo que compreende um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo que compreende um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo que compreende um elemento ligante flexível, conectando o peptídeo de sinal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
[0051] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma célula recombinante de Paenibacillus que compreende um cromossomo bacteriano que compreende uma molécula de ácido nucleico revelada no presente documento.
[0052] Em outras modalidades, a presente invenção se refere a um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico revelada no presente documento, em que o vetor compreende um plasmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral. Em um aspecto, o vetor compreende adicionalmente pelo menos um dos seguintes: (a) uma origem de replicação que fornece manutenção estável em uma célula de Paenibacillus; (b) uma origem de replicação que fornece seletivamente manutenção não estável em uma célula de Paenibacillus; (c) uma origem sensível à temperatura de replicação que fornece seletivamente manutenção não estável em uma célula de Paenibacillus; (d) um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; ou (e) um polinucleotídeo que codifica uma proteína estimuladora de crescimento vegetal, ligada operacionalmente a uma sequência de controle de expressão.
[0053] Ainda em outras modalidades, a presente invenção fornece uma célula recombinante de Paenibacillus transformada com um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico revelada no presente documento. Em um aspecto, a célula recombinante de Paenibacillus é uma espécie de Paenibacillus que compreende: Paenibacillus sp. NRRL B- 50972, Paenibacillus terrae, Paenibacillus polymyxa, ou Paenibacillus peoriae; ou uma bactéria que possui um gene de rRNA 16S que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99 % de identidade com um gene de rRNA 16S de uma espécie de Paenibacillus.
[0054] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para exibir uma proteína de fusão heteróloga em uma superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus, o método que compreende: a) transformar uma célula de Paenibacillus capaz de esporular com um vetor recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico revelada no presente documento; e b) expressar a proteína de fusão codificada por uma molécula de ácido nucleico revelada no presente documento sob as condições de esporulação de modo que a proteína de fusão seja alvejada para a superfície de esporo do endósporo de Paenibacillus resultante da esporulação, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo que compreende pelo menos 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 resíduos; (ii) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10; ou (iii) um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10.
[0055] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma composição que compreende: a) uma ou mais células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam uma proteína de fusão revelada no presente documento, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; e b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0056] Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma semente tratada com um ácido nucleico revelada no presente documento, uma proteína de fusão revelada no presente documento, uma célula bacteriana recombinante revelada no presente documento, ou uma composição revelada no presente documento.
[0057] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar uma planta, uma semente, uma parte de planta ou o solo que circunda a planta para melhorar o crescimento vegetal e/ou promover saúde vegetal que compreende a etapa de simultânea ou sequencialmente aplicar: a) endósporos recombinantes de Paenibacillus produtores de endósporo que expressam uma proteína de fusão revelada no presente documento, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; e b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0058] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um método de triagem de uma planta hospedeira tratada com um endósporo recombinante de Paenibacillus, que compreende as seguintes etapas: a) aplicar uma composição que compreende um endósporo de Paenibacillus modificado para expressar uma proteína de fusão revelada no presente documento, a uma semente, uma muda ou uma planta vegetativa capaz de ser permanente ou transitoriamente colonizada por um Paenibacillus, para produzir uma semente, muda ou planta vegetativa tratada; b) triar a semente, muda ou planta vegetativa tratada pela detecção e medição opcional de um traço, componente ou atributo da semente, muda ou planta vegetativa tratada.
[0059] Em algumas modalidades, a etapa de triagem compreende uma ou mais das seguintes: a) pelo menos um ensaio in vitro que compreende detectar e opcionalmente quantificar a presença, o nível, a alteração em nível, a atividade ou a localização de um ou mais compostos contidos em um extrato preparado a partir de uma amostra de célula ou tecido obtido a partir da semente, muda ou planta vegetativa tratada; e/ou b) pelo menos um ensaio in vivo que compreende detectar e opcionalmente quantificar um traço, componente ou atributo da semente, muda ou planta vegetativa tratada.
[0060] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método de triagem de proteínas ou peptídeos heterólogos expressados em uma célula de Paenibacillus para propriedades agricolamente significativas, que compreende: a) modificar uma célula de Paenibacillus para expressar uma proteína de fusão revelada no presente documento para produzir uma célula recombinante de Paenibacillus; e b) triar a célula de Paenibacillus pela detecção e quantificação opcional de um nível ou atividade de um composto produzido pela célula recombinante de Paenibacillus.
[0061] Também é fornecido um método para tratar uma planta, uma semente, um ser humano ou um animal, que compreende: administrar à planta, semente, humano ou animal uma composição que compreende um endósporo produzido por uma célula recombinante de Paenibacillus; em que a célula recombinante de Paenibacillus expressa uma proteína de fusão revelada no presente documento.
[0062] Em alguns aspectos, a composição foi inativada por calor ou esterilizada de modo que nenhuma célula viável de Paenibacillus permanecesse.
[0063] Em outros aspectos, a presente invenção se refere a uma composição que compreende uma proteína de fusão isolada e/ou purificada como revelado no presente documento.
[0064] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de entrega de uma proteína de interesse para uma planta, semente ou campo, que compreende: aplicar uma composição que compreende um endósporo recombinante de Paenibacillus a uma planta, semente ou campo; em que o endósporo recombinante de Paenibacillus foi modificado para expressar uma proteína de fusão revelada no presente documento.
[0065] Em certos aspectos, a composição é aplicada a um campo: a) pré- ou pós-plantio; b) pré- ou pós-emergência; c) como um pó, suspensão ou solução; e/ou d) em que a composição compreende adicionalmente um ou mais compostos adicionais que estimulam o crescimento vegetal ou proteger as plantas das pragas.
[0066] Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a um método para identificar uma sequência de sinal N-terminal que é capaz de alvejar uma proteína para uma superfície de esporo de uma bactéria formadora de endósporo,
que compreende: triar um genoma da bactéria formadora de endósporo para pelo menos um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína que tem múltiplas repetições de tripleto similar a colágeno que têm a sequência “GLY-X-X,” em que “X” representa “qualquer aminoácido”; e determinar que pelo menos uma das proteínas identificados na etapa de triagem se localiza na superfície de esporo da bactéria formadora de endósporo por microscopia ou experimentalmente.
[0067] Em um aspecto, a bactéria formadora de endósporo inclui uma estrutura semelhante a pelo que é proteoliticamente resistente. Em um outro aspecto, o método compreende adicionalmente identificar uma sequência de sinal N-terminal putativa de pelo menos uma proteína identificada na etapa de determinação como localizando na superfície de esporo e expressando na bactéria formadora de endósporo uma proteína de fusão que compreende a sequência de sinal N- terminal putativa e um gene repórter.
[0068] Em um outro aspecto, o método compreende adicionalmente selecionar a proteína de fusão com base na expressão da proteína de fusão na superfície de esporo. Ainda em um outro aspecto, o método compreende adicionalmente substituir o gene repórter na proteína de fusão que é selecionada com uma sequência de nucleotídeos de interesse para criar uma segunda proteína de fusão e expressar a segunda proteína de fusão na bactéria formadora de endósporo.
[0069] Em algumas modalidades, a bactéria é um membro do gênero Paenibacillus, Viridibacillus, Brevibacillus ou Lysinibacillus. Em uma modalidade, a bactéria é um membro do gênero Paenibacillus.
[0070] Em alguns aspectos, a localização é determinada usando microscopia eletrônica de transmissão ou espectrometria de massa.
[0071] Em outros aspectos, a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal compreende: a) um segmento contíguo de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ou 120 resíduos N- terminais de uma proteína determinada para localização em uma superfície de esporo de uma bactéria formadora de endósporo por um método revelado no presente documento; b) uma sequência que tem pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, ou 95 % de identidade de sequência para um segmento contíguo de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ou 120 resíduos N- terminais de uma proteína determinada para localização em uma superfície de esporo de uma bactéria formadora de endósporo por um método revelado no presente documento; em que o segmento ou sequência é capaz de alvejar uma proteína de fusão que compreende o segmento ou sequência para a superfície de esporo de uma bactéria formadora de endósporo quando expressada na bactéria.
[0072] Ainda em outros aspectos, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão, que compreende (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal N- terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende a sequência ou segmento revelada no presente documento e o peptídeo de sinal
N-terminal é capaz de alvejar a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo bacteriano.
[0073] Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência regulatória a montante que provoca transcrição da proteína de fusão durante a esporulação de uma célula bacteriana. Em uma modalidade, a célula bacteriana é um membro de família de Paenibacillus.
[0074] Em algumas modalidades, a sequência regulatória a montante compreende: (a) quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15; (b) uma sequência que compreende um fragmento de pelo menos 25, 50, 100, 150 nucleotídeos contíguos de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15; (c) uma sequência que tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % de identidade de sequência em comparação com quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15, ou a um fragmento de 25, 50, 100 ou 150 nucleotídeos da mesma; em que a sequência regulatória a montante compreende um promotor que é transcricionalmente ativo durante a esporulação da célula bacteriana.
[0075] Ainda em outras modalidades, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência regulatória a montante e uma proteína de interesse, que compreende: (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência regulatória a montante, ligada operacionalmente a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína de interesse; em que a proteína de interesse é heteróloga à sequência regulatória a montante e a sequência regulatória a montante causa a transcrição da proteína de interesse durante a esporulação de uma célula bacteriana. Em um aspecto, a célula bacteriana é um membro de família de
Paenibacillus.
[0076] Em um outro aspecto, a sequência regulatória a montante compreende: (a) quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15; (b) uma sequência que compreende um fragmento de pelo menos 25, 50, 100, 150 nucleotídeos contíguos de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15; (c) uma sequência que tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % de identidade de sequência em comparação com quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15, ou a um fragmento de 25, 50, 100 ou 150 nucleotídeos da mesma; em que a sequência regulatória a montante compreende um promotor que é transcricionalmente ativo durante a esporulação da célula bacteriana.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0077] A FIG. 1 descreve uma micrografia eletrônica de transmissão de um endósporo de Paenibacillus sp. NRRL B-
50972. A estrutura semelhante a pelo compreendida de proteína similar a colágeno são mostradas que se estende a partir da superfície de endósporo e tal estrutura é denotada por uma seta.
[0078] A FIG. 2A descreve micrografias de contraste de fase (esquerda) e epifluorescentes (direita) (ampliação de 1000x) de um endósporo de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 que expressa uma sequência exemplificativa de alvejamento N- terminal de acordo com a revelação, especificamente um construto de proteína de fusão de (SEQ ID NO: 2)-GFP que se localiza na superfície de endósporo como mostrado por essa figura. A fluorescência produzida pela proteína GFP no painel a direita corresponde à imagem da célula observada com microscopia de contraste de fase no painel a esquerda indicando a localização correta da GFP para a superfície de endósporo.
[0079] A FIG. 2B descreve um histograma de citometria de fluxo de endósporos de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 que expressa uma sequência exemplificativa de alvejamento N- terminal de acordo com a revelação, especificamente um construto de proteína de fusão de (SEQ ID NO: 2)-GFP, que se localiza na superfície de endósporo (área compartilhada). Os endósporos de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 do tipo selvagem sem fluorescência de GFP observável são mostrados para comparação (área de linha pontilhada aberta). 10.000 casos são mostrados para cada população de esporo nessa figura.
[0080] A FIG. 3 descreve um alinhamento de sequência local da porção N-terminal de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 8, que são sequências exemplificativas de alvejamento de superfície de esporo de acordo com a revelação. Uma sequência consenso (SEQ ID NO: 32) é mostrada abaixo do alinhamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0081] A revelação fornece construtos genéticos capazes de alvejar uma proteína de fusão para uma superfície de esporo de Paenibacillus, bem como composições e métodos que usam esses construtos para entregar moléculas heterólogas de interesse (por exemplo, peptídeos, proteínas) a vários ambientes, como plantas. Por exemplo, seguindo o tratamento com os endósporos recombinantes de Paenibacillus, as plantas tratadas podem ser triadas para detectar as alterações atribuíveis à proteína heteróloga entregue através dos endósporos de Paenibacillus. Tais alterações podem incluir alterações na produtividade ou taxa de crescimento da planta hospedeira; saúde vegetal melhorada (por exemplo, resistência ao estresse ambiental, doenças ou pragas); e a exibição de atributos melhorados, modificados ou, de outro modo, novos, em comparação ao crescimento de plantas hospedeiras sob as mesmas condições sem tratamento os endósporos recombinantes de Paenibacillus. O uso de uma sequência de alvejamento que alveja de modo eficaz a proteína heteróloga para a superfície de esporo também fornece uma plataforma para triagem de alto rendimento para proteínas heterólogas úteis que, por exemplo, são capazes de melhorar, modificar e/ou conferir novos traços ou atributos vegetais.
[0082] O processo de formação canônica de esporo (elucidado com base nos estudos usando B. subtilis) envolve a divisão de célula assimétrica de uma célula vegetativa para formar uma célula-mãe e um foresporo, que se desenvolvem como dois compartimentos distintos separados por um septo interveniente. Eventualmente, o peptidoglicano no septo é degradado e o foresporo é engolido pela célula-mãe, formando uma célula dentro de uma célula. A comunicação intracelular entre a célula-mãe e o foresporo coordena a expressão genética de célula específica em cada célula, resultando na produção de compostos de endósporo específico, formação de uma camada de córtex em torno do foresporo e deposição do revestimento.
[0083] Em algumas espécies de Bacillus, por exemplo, B. subtilis, B. licheniformis, e B. pumilus, esse revestimento se tornará a camada mais externa do endósporo. O foresporo é submetido a uma desidratação final e maturação em um endósporo completo. A célula-mãe é subsequentemente degradada através da morte celular programada, resultando em uma liberação do endósporo no ambiente. O endósporo permanecerá, tipicamente, em um estado inativo até que condições mais favoráveis ou estímulos específicos particulares desencadeiem a germinação e um retorno para o estado vegetativo.
[0084] Como a superfície mais externa entre o esporo e o ambiente, a camada de revestimento tem muitas funções críticas. Em particular, essa camada atua como uma barreira semipermeável aos insultos ambientais e medeia interações com o ambiente circundante e, desse modo, desempenha um papel importante na manutenção da viabilidade do esporo e na detecção de condições que desencadeiam a germinação do endósporo. A camada de revestimento é também um alvo de pesquisa clínica visto que contém moléculas de superfície de célula em cepas patogênicas de bactérias que contribuem para reconhecimento de célula imune hospedeira. Os métodos para exibir proteínas heterólogas no revestimento de esporo de B. subtilis foram desenvolvidos usando construtos de proteína de fusão contendo uma proteína de revestimento de esporo de B. subtilis como CotC fusionada a uma proteína de interesse. Entretanto, as proteínas de superfície de esporo de Paenibacillus são desconhecidas e, desse modo, os estudos usando B. subtilis não fornecem orientações sobre como as proteínas de fusão podem ser alvejadas para a superfície de esporo de outros gêneros bacterianos, como Paenibacillus.
[0085] Ao contrário, a revelação fornece construtos N- terminais e proteínas de fusão que compreendem os mesmos que são capazes de alvejar construtos de proteína de fusão para a superfície de esporo de células de Paenibacillus. A sequência de sinal N-terminal usada para alvejar a proteína de fusão para a superfície de esporo pode compreender um polipeptídeo que tem uma sequência como representado por SEQ
ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10. Alternativamente, nas modalidades particulares, essa sequência de sinal N-terminal pode compreender um fragmento ou variante de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 suficiente para reter a funcionalidade de alvejamento de superfície de esporo. Por exemplo, um fragmento pode compreender os primeiros 10, 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10. Os aspectos alternativos adicionais incluem sequências de sinal N-terminal codificadas por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9, ou um fragmento ou variante dos mesmos. Essas e outras modalidades são descritas no presente documento.
[0086] Ao longo de toda revelação, o termo “compreende” ou qualquer derivado do mesmo (por exemplo, que compreende, compreende) pode ser substituído por “consiste essencialmente em”, “consiste em” ou o derivado correspondente aplicável dos mesmos.
[0087] Como usado no presente documento, “Paenibacillus” se refere a bactérias produtoras de endósporo classificadas no gênero de Paenibacillus. Esse termo abrange, sem limitação, vários membros da família de Paenibacillus incluindo Paenibacillus sp. NRRL B-50972, Paenibacillus abyssi, Paenibacillus aceti, Paenibacillus aestuarii, Paenibacillus agarexedens, Paenibacillus agaridevorans, Paenibacillus alginolyticus, Paenibacillus algorifonticola, Paenibacillus alkaliterrae, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus anaericanus, Paenibacillus antarcticus, Paenibacillus apiarius, Paenibacillus arachidis, Paenibacillus assamensis, Paenibacillus azoreducens, Paenibacillus azotofixans,
Paenibacillus baekrokdamisoli, Paenibacillus barcinonensis, Paenibacillus barengoltzii, Paenibacillus borealis, Paenibacillus bovis, Paenibacillus brasilensis, Paenibacillus camelliae, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus castaneae, Paenibacillus catalpae, Paenibacillus cathormii, Paenibacillus cavernae, Paenibacillus célulaulosilyticus, Paenibacillus célulaulositrophicus, Paenibacillus chartarius, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus chinjuensis, Paenibacillus chitinolyticus, Paenibacillus chondroitinus, Paenibacillus chungangensis, Paenibacillus cineris, Paenibacillus cisolokensis, Paenibacillus contaminans, Paenibacillus cookii, Paenibacillus cucumis, Paenibacillus curdlanolyticus, Paenibacillus daejeonensis, Paenibacillus darwinianus, Paenibacillus dauci, Paenibacillus dendritiformis, Paenibacillus dongdonensis, Paenibacillus doosanensis, Paenibacillus durus, Paenibacillus edaphicus, Paenibacillus ehimensis, Paenibacillus elgii, Paenibacillus endophyticus, Paenibacillus etheri, Paenibacillus faecis, Paenibacillus favisporus, Paenibacillus ferrarius, Paenibacillus filicis, Paenibacillus fonticola, Paenibacillus forsythiae, Paenibacillus frigoriresistens, Paenibacillus gansuensis, Paenibacillus gelatinilyticus, Paenibacillus ginsengarvi, Paenibacillus ginsengihumi, Paenibacillus ginsengisoli, Paenibacillus glacialis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus glycanilyticus, Paenibacillus gordonae, Paenibacillus graminis, Paenibacillus granivorans, Paenibacillus guangzhouensis, Paenibacillus harenae, Paenibacillus hemerocallicola, Paenibacillus hispanicus, Paenibacillus hodogayensis,
Paenibacillus hordei, Paenibacillus humicus, Paenibacillus hunanensis, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus jamilae, Paenibacillus jilunlii, Paenibacillus kobensis, Paenibacillus koleovorans, Paenibacillus konsidensis, Paenibacillus koreensis, Paenibacillus kribbensis, Paenibacillus kyungheensis, Paenibacillus lactis, Paenibacillus larvae, Paenibacillus larvae, Paenibacillus larvae, Paenibacillus lautus, Paenibacillus lemnae, Paenibacillus lentimorbus, Paenibacillus lentus, Paenibacillus liaoningensis, Paenibacillus lupini, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus marchantiophytorum, Paenibacillus marinisediminis, Paenibacillus massiliensis, Paenibacillus medicaginis, Paenibacillus mendelii, Paenibacillus methanolicus, Paenibacillus montaniterrae, Paenibacillus motobuensis, Paenibacillus mucilaginosus, Paenibacillus nanensis, Paenibacillus naphthalenovorans, Paenibacillus nasutitermitis, Paenibacillus nematophilus, Paenibacillus nicotianae, Paenibacillus oceanisediminis, Paenibacillus odorifer, Paenibacillus oenotherae, Paenibacillus oryzae, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus panacisoli, Paenibacillus panaciterrae, Paenibacillus pasadenensis, Paenibacillus pectinilyticus, Paenibacillus peoriae, Paenibacillus periandrae, Paenibacillus phoenicis, Paenibacillus phyllosphaerae, Paenibacillus physcomitrellae, Paenibacillus pini, Paenibacillus pinihumi, Paenibacillus pinesoli, Paenibacillus pocheonensis, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae, Paenibacillus populi, Paenibacillus prosopidis,
Paenibacillus provencensis, Paenibacillus pueri, Paenibacillus puldeungensis, Paenibacillus pulvifaciens, Paenibacillus purispatii, Paenibacillus qingshengii, Paenibacillus quercus, Paenibacillus radicis, Paenibacillus relictisesami, Paenibacillus residui, Paenibacillus rhizoryzae, Paenibacillus rhizosphaerae, Paenibacillus rigui, Paenibacillus riograndensis, Paenibacillus ripae, Paenibacillus sabinae, Paenibacillus sacheonensis, Paenibacillus salinicaeni, Paenibacillus sanguinis, Paenibacillus sediminis, Paenibacillus segetis, Paenibacillus selenii, Paenibacillus selenitireducens, Paenibacillus senegalensis, Paenibacillus septentrionalis, Paenibacillus sepulcri, Paenibacillus shenyangensis, Paenibacillus shirakamiensis, Paenibacillus siamensis, Paenibacillus silagei, Paenibacillus sinopodophylli, Paenibacillus solani, Paenibacillus soli, Paenibacillus sonchi, Paenibacillus sophorae, Paenibacillus sputi, Paenibacillus stellifer, Paenibacillus susongensis, Paenibacillus swuensis, Paenibacillus taichungensis, Paenibacillus taiwanensis, Paenibacillus tarimensis, Paenibacillus telluris, Paenibacillus terrae, Paenibacillus terreus, Paenibacillus terrigena, Paenibacillus thailandensis, Paenibacillus thermophilus, Paenibacillus thiaminolyticus, Paenibacillus tianmuensis, Paenibacillus tibetensis, Paenibacillus timonensis, Paenibacillus tundrae, Paenibacillus turicensis, Paenibacillus typhae, Paenibacillus uliginis, Paenibacillus urinalis, Paenibacillus validus, Paenibacillus vini, Paenibacillus vulneris, Paenibacillus wenxiniae, Paenibacillus wooponensis, Paenibacillus woosongensis, Paenibacillus wulumuqiensis, Paenibacillus wynnii, Paenibacillus xanthinilyticus, Paenibacillus xinjiangensis, Paenibacillus xylanexedens, Paenibacillus xylanilyticus, Paenibacillus xylanisolvens, Paenibacillus yonginensis, Paenibacillus yunnanensis, Paenibacillus zanthoxyli, e Paenibacillus zeae.
[0088] Em certos aspectos, o membro de Paenibacillus usado para expressar a proteína de fusão é Paenibacillus sp. NRRL B-50972, uma bactéria formadora de esporo, aeróbica e gram-positiva isolada do solo. Uma amostra de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 foi depositada junto à Agricultural Research Service Culture Collection located at the National Center for Agricultural Utilization Research [Coleção de Cultura de Serviço de Pesquisa Agrícola situada no Centro Nacional para Pesquisa de Utilização Agrícola], Agricultural Research Service [Serviço de pesquisa Agrícola], U.S. Department of Agriculture [Departamento de Agricultura dos EUA] (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA, Tratado de Budapeste em 28 de agosto de 2014. Dada a falta de conhecimento geral sobre a composição ou estrutura básica do esporo de Paenibacillus, pouco se sabe sobre o processo pelo qual as proteínas são alvejadas para a superfície de esporo durante a formação dessa camada.
[0089] Em certos aspectos, o membro de Paenibacillus usado para expressar a proteína de fusão é uma bactéria que possui um gene de rRNA 16S que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99 por cento de identidade com um gene de rRNA 16S de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou qualquer um dos membros exemplificativos de família de Paenibacillus revelados no presente documento. Alternativamente, o membro de Paenibacillus usado para expressar a proteína de fusão é uma bactéria que possui um valor de hibridização de DNA-DNA de pelo menos 70 por cento em relação àquele de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou qualquer um dos membros exemplificativos de família de Paenibacillus revelados no presente documento. Em um outro caso, o membro de Paenibacillus usado para expressar a proteína de fusão é uma bactéria que possui um identidade de nucleotídeo média de 95, 96, 97, 98, ou 99 por cento em relação àquele de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou qualquer um dos membros exemplificativos de família de Paenibacillus revelados no presente documento.
[0090] O termo “sequência de sinal N-terminal” geralmente se refere a uma sequência de polipeptídeos localizada em ou próxima à terminação amino de um polipeptídeo, que direciona a localização do polipeptídeo para um compartimento subcelular, ou para secreção. É reconhecido e entendido que esse termo pode ser usado de forma intercambiável com os termos “sequência de alvejamento N-terminal”, “sequência de alvejamento”, “sequência de sinal” e “peptídeo de sinal” dependendo do contexto. A sequência de sinal N-terminal pode ser retida como parte da sequência de polipeptídeos de uma proteína madura ou alternativamente clivada durante ou após o processo de localização. Esse termo pode ser usado para se referir especificamente a uma sequência de polipeptídeos localizada em ou próximo à terminação amino de um polipeptídeo, que direciona a localização do polipeptídeo para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus. Nesse contexto, a única funcionalidade exigida da sequência de sinal N-terminal é a capacidade de alvejar o polipeptídeo do qual faz parte para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus.
[0091] Uma “planta” ou “planta hospedeira” inclui qualquer planta que possui um rizosfera ou filosfera que Paenibacillus pode colonizar, bem como plantas que podem servir como hospedeiros transitórios para bactérias de Paenibacillus. A colonização não é uma exigência para os métodos descritos no presente documento e para as composições funcionarem, embora possa ser preferencial em certos aspectos da revelação.
[0092] Como usado no presente documento, o “controle biológico” é definido como controle de um patógeno e/ou inseto e/ou um aracnídeo e/ou um nematódeo pelo uso de um segundo organismo ou uma molécula biológica. Os mecanismos conhecidos de controle biológico incluem bactérias que controlam a podridão de raiz por fungos deslocados para espaço ou nutrientes na superfície da raiz. Toxinas bacterianas, como antibióticos, foram usadas para controlar patógenos. A toxina pode ser isolada e aplicada diretamente para a planta ou as espécies bacterianas podem ser administradas, desse modo, produzem a toxina in situ. Outros meios de exercer controle biológico incluem a aplicação de certos ingredientes produtores de fungos ativos contra um fitopatógeno, inseto, ácaro ou nematódeo-alvo ou atacar a praga/patógeno-alvo. “Controle biológico” também pode abranger microrganismos que tem um efeito benéfico na saúde vegetal, crescimento, vigor, resposta ao estresse ou produtividade. As vias de aplicação incluem aplicação por aspersão, aplicação no solo e tratamento de semente.
[0093] "Hibridização" se refere a uma reação em que um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por pareamento de bases de Watson - Crick, ligação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira específica de sequência. O complexo pode compreender duas fitas que formam uma estrutura duplex, três ou mais fitas que formam um complexo com múltiplas fitas, uma única fita auto- hibridizante, ou qualquer combinação das mesmas. As reações de hibridização podem ser realizadas sob as condições de “estringência” diferente. Em geral, uma reação de hibridização de baixa estringência é executada a cerca de 40 °C em SSC de 10x ou uma solução de resistência/temperatura iônica equivalente. Uma hibridização de estringência moderada é tipicamente realizada a cerca de 50 °C em SSC de 6x, e uma reação de hibridização de alta estringência é, em geral, realizada a cerca de 60 °C em SSC de 1x.
[0094] Como usado no presente documento, o termo “identidade de sequência” se refere ao grau ao qual o polinucleotídeo ou sequências de aminoácidos são idênticas (isto é, em uma base de nucleotídeo-por-nucleotídeo ou resíduo-por-resíduo, respectivamente) na janela de comparação. A porcentagem de identidade de sequência é calculada pela comparação de duas sequências idealmente alinhadas na janela de comparação, determinação do número de posições em que a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G para uma sequência de polinucleotídeos) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondidas, divisão do número de posições correspondidas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho de janela) e multiplicação do resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Um cálculo equivalente pode ser realizado pela comparação de suas sequências de aminoácidos alinhadas.
[0095] Em relação à comparação de sequências de aminoácidos, além da medição da identidade de sequência, uma comparação também pode ser levada em consideração se as alterações residuais constituem substituições “conservativas”. As substituições conservativas de aminoácido se referem à intercambialidade de resíduos que têm cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais de hidroxila alifática é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina, e triptofano; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos preferenciais de substituição conservativa são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, e asparagina-glutamina. Sequências de alvejamento N-terminal
[0096] A revelação fornece sequências de alvejamento N- terminal da bactéria de Paenibacillus. Sob condições ambientais estressantes, as bactérias da família de Paenibacillus são submetidas à esporulação e formam endósporos que podem ficar dormentes por períodos estendidos de tempo. Conforme descrito em detalhes no presente documento, a camada mais externa de endósporos de
Paenibacillus é conhecida como a superfície de esporo e compreende uma camada de proteína. Apesar do crescimento do corpo da literatura disponível referente às sequências de alvejamento de superfície de esporo de Bacillus, não há estudos relatados que identificam sequências homólogas de alvejamento N-terminal em Paenibacillus. Uma análise de bioinformática das proteínas alvejadas por superfície de esporo conhecidas CotC, BclA, BclB ou BetA não revela quaisquer sequências homólogas de alvejamento N-terminal em Paenibacillus, sugerindo que as sequências de alvejamento de superfície de esporo dessas proteínas não é conservada no gênero de Paenibacillus. Dada a caracterização limitada de proteínas que forma e se localiza na superfície de esporo de Paenibacillus, não se pode deduzir facilmente as sequências de sinal N-terminal necessárias para alvejar as proteínas para a superfície de esporo em geralmente ou em particular espécies de Paenibacillus dentro desse gênero (por exemplo, Paenibacillus sp. NRRL B-50972).
[0097] Apesar da falta de orientação na literatura disponível, os inventores identificaram sequências de alvejamento N-terminal capazes de direcionar proteínas de fusão e endógenas para a superfície de esporo de células de Paenibacillus.
[0098] Para facilitar a referência, a SEQ ID NOs. para o nucleotídeo e sequências de polipeptídeos referidas no presente documento são listadas na Tabela 1 abaixo.
TABELA 1: Sequências de alvejamento N-terminal de Paenibacillus exemplificativas (isto é, SEQ ID NOs: 1-10 e 18) e sequências regulatórias a montante (isto é, SEQ ID NOs: 11-15). Identificador Sequência de Sequência
ATGGTAGTATTATCTACTGGACCTATTGCAAACGATCCTGTTCTAGGAGTCAGACCCACCCAACTGGTCACAGTAA
AAATAGATAACCGAGATTCTGTAAATTCTTCTATCGTTTTGATCGAGGGTTTTATTTTAAACGGTAGCAGAACATT SEQ ID NO: 1 ATATGTACAACAATTAGTGGTAGTGGGACCAAATGCGGTTATAACGAGGAATTTCTTTGCAAATGTAGACGCATTT
GAATTCGTTTTTACCACTAGCGGACCAGCAGAGAATGAAACTCAAATTTCTGTTTGGGGTAAAGATGCATTGGGGC AATTAGTACCTGCCCATCGGTTAGTATCTGACGAACTTTTAGGAACCGATCGA
MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDAF SEQ ID NO: 2
EFVFTTSGPAENETQISVWGKDALGQLVPAHRLVSDELLGTDR ATGCCTGCCTTGGATGAATGGAGTAGTATACAACAAATCGATATGGAGGTGTTTGTATTGGGTCGTCCCGAATTGA
AACGAAAGAAAGGCCGTAAAAAAGACGTTTTTATCCGCTCTTGGTTTAGTAAAAAACGTCCGAAGAGAAAATGCCA SEQ ID NO: 3
TTCGAAACGAAAGTGCTTTTGCAAGGAAATCGTCGTCAGAAAGCAAATCGTCCGTGTAAATATACCTCAAAATGTT TTA
MPALDEWSSIQQIDMEVFVLGRPELKRKKGRKKDVFIRSWFSKKRPKRKCHSKRKCFCKEIVVRKQIVRVNIPQNV SEQ ID NO: 4
L ATGAAACACAGAAAACCGTTCAGGTTCAGTGGTGCTTCAAAAAAAGACGAGGACTGCAAACCACCTAAAATTAGCA GAGAAACGGAAGAACTTCTCAAACTGATTAAGGAATTAGTCGCCATCATCCCGCTCGTTTTCGCAAACCCGTCTGT
GGCTAATGTAACTTCATTGCAACAGATTTTACAGCGATTATTAGCTCTCGCAAATAAATTGAGACTTAGAGGCTCG SEQ ID NO: 5
GCTAAGACAGATTTATTAGCGGCGTTGGAACTGGCTATCGTGGCGTCGGAAGCCACTCTTTTCTCCCCGATCGGTG TTGGAACGACACTGCAACAACTGCTGGAAGTCTTATTGTCTATTATTTTGCAGGAACCCCTTGATCCTGCTCTTAA AGACAGTTTGATCAGTGCAATCAGAAATGCCGAAACGGCTATCAGTATTGCGTTGGGT
MKHRKPFRFSGASKKDEDCKPPKISRETEELLKLIKELVAIIPLVFANPSVANVTSLQQILQRLLALANKLRLRGS SEQ ID NO: 6
AKTDLLAALELAIVASEATLFSPIGVGTTLQQLLEVLLSIILQEPLDPALKDSLISAIRNAETAISIALG
Identificador Sequência de Sequência
ATGGCGGTTATATCAACTGGACCCATAGAAAATAATTATGTCAGTGGTATTCGGCCTACTCATCGAGTTACCGTGA
AAATTGATAATCGTGATACTGTGAATTCTTCTACGGTATTGATTCAGGGTTTTTATCTAAATGGTACAAGAACGTT SEQ ID NO: 7 ATATGTGCTTGATTTTATAACTGTAAATTCAAATGAAGTGATTACAAAAGATTATTATGCTGATTTTAATTCATTT
GAGTTTGTTTTTACCACTGAAAGTGTTACAGAAAATGAGATTCAAGTTTCAGTCTGGGGTAAAAATTCAATGGGGC AGTTAGTGACAGCTCACCGTGTTGTATCTTCCGAATTGCTTGTAGCAAAAGGCGCG
MAVISTGPIENNYVSGIRPTHRVTVKIDNRDTVNSSTVLIQGFYLNGTRTLYVLDFITVNSNEVITKDYYADFNSF SEQ ID NO: 8
EFVFTTESVTENEIQVSVWGKNSMGQLVTAHRVVSSELLVAKGA TTGGGAAATTTATTGTTGCGTAAAAGATATCGCTTGACCCAGGTGGCAAGGAAAAAAAAGAAGGAAAGAGATCAAA
AGATGGGAGCGTTCCGTTTTATGCCCATTTATCGTACAGGAACGAGCTGCATTCGTAACAAAAAGGGAAATAAACG SEQ ID NO: 9 TATTTATAGACAGGGTAGAAGAAGAGAGAGAATATGCGCTTATAGACATCATTTGCACGCTGAGCGGGTGCCCTCA
GGTTTATCAAATAAAAAAATCTGTTTTATGAAATTCAAAGGTCAACGAAGACTGCGAGGCGGCGAACAGGAGCCTC AAGGCAATTCAGGAGGAGCAGTTCAA
LGNLLLRKRYRLTQVARKKKKERDQKMGAFRFMPIYRTGTSCIRNKKGNKRIYRQGRRRERICAYRHHLHAERVPS SEQ ID NO: 10
GLSNKKICFMKFKGQRRLRGGEQEPQGNSGGAVQ
MGNLLLRKRYRLTQVARKKKKERDQKMGAFRFMPIYRTGTSCIRNKKGNKRIYRQGRRRERICAYRHHLHAERVPS SEQ ID NO: 18
GLSNKKICFMKFKGQRRLRGGEQEPQGNSGGAVQ
GAAACGGGAGTGGTGAAATCATTGATGCTCAGCGCATTGTTGCGGATGAGCAACTAGATTCTTGAAACACAACATA SEQ ID NO: 11 TGTACAGAGATAGAACCACAATCGTAACAAATGGTTGAGACATAAAATAGAGGGAACAGGATCTTGAGAAAGATCT
CATTGTTCACAAAAAAGCTTGATTTTACTAGAAAGGAGGGAGTATCCA
CTATATACATGCGCAAAAAACGGCTTCAAACTGCTTCATAATTACGGCACGTTTCTTCTGGCGCCTTCGGCTGTTC SEQ ID NO: 12 CTTGGTGTGAACCAAGGTAACAGCCGGGGGCGCTATTTTTATATAACTAGATGAATGTACCTGTACAAAGACCCAT
TTTTATCCAAAATTAGATCATTGCCTATCAACCACAGGACAGATGTCC
AGCGTTACAAGTTGGAAGCCCGGTTTGGAAATACAGAAAATCGATATTAAAGCTTATGTACAAGCATCCAATAATA SEQ ID NO: 13 ATTCTTGTGTGGTGATTCACCCTTTTCGCTTCAGTAAATATATTGTTAATATCTGCGAAACGGGGCGATGATCCAC
CTGTCACCTCTACAGTAGGGAGAAATGTGAAGGAGGAGATATTTGAAC
Identificador Sequência de Sequência
AGCGGTATTTTTTGTGCCCCACAAAAAAGGCTCCCTTATCAAAAGGGGTTTTTATCACATAGGAAATGTCCACACG SEQ ID NO: 14 TATATATAGATGTTACATATTATATAAATCGTGAACATTCGAATCTCAATACTAGTTATAGAAGAGGTGGCATTAG
TGATAGGATTATAGCTTCGTTACTTTAGACAAAAGGAGAATCCAATAT
ATTTATTTTTTTGAAAAATTACAGGGGATTCAGTCCCACTTTCAGTAAATTCAGAAAGAAAAATAATGTAACGGCG SEQ ID NO: 15 AAATGGAAGTGAGCATTAAAAATTTATTTTTTTGGAAAAAAATTTAAGGAGGTCATCTGTCCAATCAGGTTCGTTT
AGATTCCATAAGATAATGAAACTGTACTTAATTATGGAGGTGTCAGTA
TABELA 2: Sequências de alvejamento N-terminal de Paenibacillus exemplificativas adicionais Identificador Sequência de Sequência
ATGGTAGTATTATCTACTGGACCTATTGCAAACGATCCTGTTCTAGGAGTCAGACCCACCCAACTGGTCACAGTA AAAATAGATAACCGAGATTCTGTAAATTCTTCTATCGTTTTGATCGAGGGTTTTATTTTAAACGGTAGCAGAACA TTATATGTACAACAATTAGTGGTAGTGGGACCAAATGCGGTTATAACGAGGAATTTCTTTGCAAATGTAGACGCA TTTGAATTCGTTTTTACCACTAGCGGACCAGCAGAGAATGAAACTCAAATTTCTGTTTGGGGTAAAGATGCATTG GGGCAATTAGTACCTGCCCATCGGTTAGTATCTGACGAACTTTTAGGAACCGATCGAGGAATCCAAGGACCTCAA GGAGTTCAGGGAGCCCAAGGCGACCAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGACCTCAAGGAGTTCAGGGA GCCCAAGGAGACCAAGGAGTTCAAGGCGTACAAGGAGACCAAGGACCTCAAGGAGTCCAAGGCGACCAAGGTGAC CAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGAGCGCAAGGTGACCAAGGCCCTCAAGGAGTTCAGGGAGCCCAAGGTGACCAA GGACCTCAAGGCGTTCAGGGAGCGCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGTGATCAAGGACCTCAGGGAGTTCAAGGA GACCAAGGCGATCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGCGTACAAGGTGATCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGAGAC CAAGGCGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAA
GGTGACCAAGGACCTCAGGGAGTTCAAGGAGACCAAGGCGATCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGCGTACAAGGT SEQ ID NO: 19
GATCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGAGACCAAGGCGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGAC CAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAA GGACCTCAAGGAGTTCAGGGAGCCCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGA CCTCAAGGAGTTCAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGCGTTCAAGGATCCCAAGGTGATCAAGGACCTCAAGGAGTT CAAGGCGTACAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGCGTACAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGTGTTCAGGGAGCCCAA GGCGACCAAGGCCCTCAAGGAGTTCAAGGAGTCCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGACCGCAAGGT GACCAAGGACCACAGGGAGTTCAGGGAGTCCAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGAGTCCAAGGCGACCAAGGTGAC CAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGAGCGCAAGGTGACCAAGGCCCTCAAGGAGTTCAGGGAGCCCAAGGTGACCAA GGACCTCAAGGCGTTCAGGGAGCGCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGTGATCAAGGACCTCAGGGAGTTCAAGGA GACCAAGGCGATCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGCGTACAAGGTGATCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGAGAC CAAGGCGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAA GGTGACCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGAGTTCAGGGAGCCCAAGGT GACCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGTGACCAAGGACCT CAGGGCGTTCAAGGATCCCAAGGTGATCAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGCGTACAAGGACCTCAAGGAGTTCAA GGCGTACAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGTGTTCAGGGAGCCCAAGGCGACCAAGGCCCTCAAGGAGTTCAAGGA GTCCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGACCGCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGAGTTCAGGGAGTC CAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGTGTTCAAGGTGACCAA GGACCTCAAGGAGTTCAGGGAGCCCAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGACCGCAAGGTGACCAAGGA CCTCAAGGAGTTCAAGGCGTACAAGGTGATCAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCA CAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGTGTTCAAGGAGTCCAAGGTGATCAAGGACCTCAA GGAGTTCAGGGAGCCCAAGGCGACCAAGGACCTCAGGGAGTTCAGGGAGCCCAAGGCGACCAAGGACCTCAGGGA GTTCAGGGAGCCCAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGCGTTCAAGGAGTACAAGGTGACCAAGGATCTCAAGGAGTT CAAGGACCGCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGAGTTCAA GGAGTCCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGTGTTCAGGGAGCCCAAGGTGGCCAAGGACCTCAGGGCGTTCAAGGC GACCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGTGTTCAAGGATCTCAAGGTGACCAAGGACCACAAGGCGTTCAAGGAGCC CAAGGCGACCAAGGACCACAGGGTGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGCCCTCAAGGAGTTCAAGGAGTTCAA GGTGACCAAGGACCACAGGGAGTTCAAGGTGTTCAAGGACCGCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGTGTTCAAGGA GCCCAAGGCGACCAAGGACCACAGGGTGTTCAAGGAGTGCAAGGTGACCAAGGACCGCAAGGCGACCAAGGTGAC CAAGGACCTCAAGGTGTTCAGGGAGTCCAAGGCGACCAAGGACCTCAAGGTGTTCAGGGAGTCCAAGGCGACCAA GGACCTCAAGGTGTTCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGAGTTCAGGGAGCCCAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGA GTTCAAGGTGACCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGTGTACAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGTGTT CAGGGAGCCCAAGGTGACCAAGGACCTCAGGGCGTACAAGGCGACCAAGGTGACCAAGGACCACAGGGTGTTCAA GGCGTACAAGGTGATCAAGGACCTCAAGGAGTTCAAGGCGTACAAGGTGACCAAGGACCACAGGGTGTTCAAGGC GTACAAGGTGACCAAGGACCACAGGGTGTTCAAGGCGACCAAGGTGACCAAGGACCTCAAGGCGTACAAGGCGAT CAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGACCTCAGGGTGTTCAAGGACCTCAAGGCGACCAA GGAGCTCAAGGTGTTCAAGGACCACAAGGTGACCAAGGACCGCAAGGCATTCTGTAA
Identificador Sequência de Sequência
MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDA FEFVFTTSGPAENETQISVWGKDALGQLVPAHRLVSDELLGTDRGIQGPQGVQGAQGDQGDQGPQGVQGPQGVQG AQGDQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGDQGPQGVQG DQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGVQG DQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGDQGPQG PQGVQGDQGPQGVQGSQGDQGPQGVQGVQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGPQG DQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGDQGPQGVQG
DQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQG SEQ ID NO: 20
DQGPQGVQGDQGPQGPQGVQGDQGPQGVQGSQGDQGPQGVQGVQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQG VQGDQGPQGVQGPQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGDQGPQGDQGPQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGPQGDQG PQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQG VQGAQGDQGPQGVQGVQGDQGSQGVQGPQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQGGQGPQGVQG DQGDQGPQGVQGSQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGPQGDQGPQGVQG AQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQG VQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQG VQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGDQGPQGVQGPQGVQGPQGVQGPQGDQGAQGVQGPQGDQGPQGIL MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDA FEFVFTTSGPAENETQISVWGKDALGQLVPAHRLVSDELLGTDRGIQGPQGVQGAQGDQGDQGPQGVQGPQGVQG AQGDQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGDQGPQGVQG
DQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQG SEQ ID NO: 21
DQGPQGVQGDQGPQGLQGVQGDQGPQGVQGSQGDQGPQGVQGVQGPQGGQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQG DQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGDQGTKELKEYKVTKELKEFKEPKVTKDLRAFKATKVTKD HRVFKEFKVTKDLKEFKEYKVTKDHRVFKAYKVTKDLKVFKATKVTKDLKAYKAIKDLRVFKDLRVFKDLRVFKD LKATKELKVFKDHKVTKDRKAFCKLKVKVYLDDSKVIITFGSFFVLS
Identificador Sequência de Sequência
MVVLSTGPIANDPVLGVRPTQLVTVKIDNRDSVNSSIVLIEGFILNGSRTLYVQQLVVVGPNAVITRNFFANVDA FEFVFTTSGPAENETQISVWGKDALGQLVPAHRLVSDELLGTDRGIQGPQGVQGAQGDQGDQGPQGVQGPQGVQG
AQGDQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGDQGPQGVQG SEQ ID NO: 22
DQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQG DQGPQGVQGDQGPQGPQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGVQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQG VQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGVQGDQGPQGVQGDQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQGDQGPQGVQGAQG ATGCCTGCCTTGGATGAATGGAGTAGTATACAACAAATCGATATGGAGGTGTTTGTATTGGGTCGTCCCGAATTG AAACGAAAGAAAGGCCGTAAAAAAGACGTTTTTATCCGCTCTTGGTTTAGTAAAAAACGTCCGAAGAGAAAATGC CATTCGAAACGAAAGTGCTTTTGCAAGGAAATCGTCGTCAGAAAGCAAATCGTCCGTGTAAATATACCTCAAAAT GTTTTAGGTATAACAGGCGCAACTGGAGCTATAGGTGTAGCAGGTAACGTAGGTGCAGCGGGCACTGTGGGTGCT GCTGGAGCCGTCGGAACTGCGGGAAATGTCGGGGCTGCCGGTAATGTGGGTACTGCGGGCACCGTTGGGACTGCC GGAAATGTAGGCGCAGCGGGGGCTGTGGGCACTGCGGGCGCTGTTGGAGCTGCGGGTGCGGTAGGACCAGTAGGT
CCCGTAGGTCCTGCGGGCATTCCAGGGGCAGTCGGTCCAGCAGGTCCTGCGGGCGTTGCAGGGGCGGTCGGTCCT SEQ ID NO: 23
GTAGGTCCTGCGGGTGCGGTAGGTGCCACTGGGGCTACGGGTACCGCAGGAGCGACGGGGTCCACCGGGGCTACG GGAGCTACAGGAACCGCAGGTGGAATAGCTCAGTTTGGTTATATCTACAACTTAGGATCCCGAGTCGTTCCAATA GAAGCGGATGTCATTTTCGATACGAACGGTATACTTACACCTGGAATTACCCACGCTCCCGGCACTACGCAGATT GCAGTTACCGATGCGGGGAACTATGAAGTTAACTTTTCAGTATCGGGTGTAGAGCCAGGCCAATTTGCCATATTT ATCAATGGCACTCTGGCAGCAGGAACCATATACGGCTCAGGAGCTGGTACGCAGCAAAACACAGGGCAGGCCATC CTCGCTCTAGCATCCGGTGATGTTCTTACCCTGCGAAATCATAGCTCTGCCGCTGCGGTTACCCTGCAAACCTTG GCTGGAGGTACCCAAGCCAACGTAAACGCTTCTGTCGTTATCAAAAAATTAAGTTAG MPALDEWSSIQQIDMEVFVLGRPELKRKKGRKKDVFIRSWFSKKRPKRKCHSKRKCFCKEIVVRKQIVRVNIPQN
VLGITGATGAIGVAGNVGAAGTVGAAGAVGTAGNVGAAGNVGTAGTVGTAGNVGAAGAVGTAGAVGAAGAVGPVG SEQ ID NO: 24 PVGPAGIPGAVGPAGPAGVAGAVGPVGPAGAVGATGATGTAGATGSTGATGATGTAGGIAQFGYIYNLGSRVVPI
EADVIFDTNGILTPGITHAPGTTQIAVTDAGNYEVNFSVSGVEPGQFAIFINGTLAAGTIYGSGAGTQQNTGQAI LALASGDVLTLRNHSSAAAVTLQTLAGGTQANVNASVVIKKLS
Identificador Sequência de Sequência
ATGAAACACAGAAAACCGTTCAGGTTCAGTGGTGCTTCAAAAAAAGACGAGGACTGCAAACCACCTAAAATTAGC AGAGAAACGGAAGAACTTCTCAAACTGATTAAGGAATTAGTCGCCATCATCCCGCTCGTTTTCGCAAACCCGTCT GTGGCTAATGTAACTTCATTGCAACAGATTTTACAGCGATTATTAGCTCTCGCAAATAAATTGAGACTTAGAGGC TCGGCTAAGACAGATTTATTAGCGGCGTTGGAACTGGCTATCGTGGCGTCGGAAGCCACTCTTTTCTCCCCGATC GGTGTTGGAACGACACTGCAACAACTGCTGGAAGTCTTATTGTCTATTATTTTGCAGGAACCCCTTGATCCTGCT CTTAAAGACAGTTTGATCAGTGCAATCAGAAATGCCGAAACGGCTATCAGTATTGCGTTGGGTGGCACGGCAGGA ACCCCCGGTCCACAAGGGCCCGCTGGGCCTGCTGGTCCGGGCGGTGCTCCAGGACCTGTCGGTGGACCAGGGCCG GTGGGTGCGGCAGGACCAGCAGGTCCAGTTGGACCTGCTGGTCCTGTCGGACCTGTCGGGGCTGCCGGACCTGTT GGAGCCGCCGGACCTGTTGGAGCCGCCGGACCTATCGGCGCCGCTGGGCCAGTAGGCGCCGCCGGGGCTGCTGGA
GCCACCGGGGCTACAGGAGCTACAGGCGCGGCAGGACCTGCCGGGGGGGCTACCGGGGCCACGGGCGCCGTTGGA SEQ ID NO: 25
GCCACAGGCGCTACGGGCGCAGCGGGGGTCGCTGGGGCTACAGGAACTACGGGCACGGCGGGCGCTGTCGGAGCT ACCGGGGCCACGGGCACGGCGGGGGCCATTGGAGCTACCGGGGCCACAGGCACGGCGGGGGCCGTCGGAGCTACC GGGGCCACAGGCACGGCGGGCGCTGTCGGAGCTACCGGGGCCACGGGTACAGCAGGGGTTACTGGAGCCACCGGT TCGGGGGCAATCATTCCATTTGCTTCGGGTGGACCAGCAATTTTGACAACCATTGTCGGCGGGCTGGTTGGAACC ACAAGTTTGATCGGCTTTGGAAGCTCAGCAACAGGCATTAGCCTTGTGGGTGGAACCATTGACCTGACAGGCACA CTTGCAGGGCCACTGATTAACTTTGCTTTTTCTGTACCACGGGATGGCGTAATTACATCCATCGCTGGATATTTT AGTACAACAGCTGCGCTAACTCTCGTTGGATCAACCGCGACGATTACTGCCCAGTTGTTTAGTTCGACTACACCT GATAACACCTTTACAGCGGTCCCTGGGGCTACCGTTACATTAGCTCCACCACTGACTGGCATCATTGCCTTGGGT ACCATTTCCAATGGCATCACTACCGGATTGGCTATACCAGTAACCGCGCAGACTCGTCTGCTCCTTGTCTTCTCT GCAACAGCTACGGGACTCTCCCTCGTAAACACCATCGTGGGTTATGCGAGCGCAGGCATTACCATCACCTGA MKHRKPFRFSGASKKDEDCKPPKISRETEELLKLIKELVAIIPLVFANPSVANVTSLQQILQRLLALANKLRLRG SAKTDLLAALELAIVASEATLFSPIGVGTTLQQLLEVLLSIILQEPLDPALKDSLISAIRNAETAISIALGGTAG
TPGPQGPAGPAGPGGAPGPVGGPGPVGAAGPAGPVGPAGPVGPVGAAGPVGAAGPVGAAGPIGAAGPVGAAGAAG SEQ ID NO: 26 ATGATGATGAAGPAGGATGATGAVGATGATGAAGVAGATGTTGTAGAVGATGATGTAGAIGATGATGTAGAVGAT
GATGTAGAVGATGATGTAGVTGATGSGAIIPFASGGPAILTTIVGGLVGTTSLIGFGSSATGISLVGGTIDLTGT LAGPLINFAFSVPRDGVITSIAGYFSTTAALTLVGSTATITAQLFSSTTPDNTFTAVPGATVTLAPPLTGIIALG TISNGITTGLAIPVTAQTRLLLVFSATATGLSLVNTIVGYASAGITIT ATGGCGGTTATATCAACTGGACCCATAGAAAATAATTATGTCAGTGGTATTCGGCCTACTCATCGAGTTACCGTG AAAATTGATAATCGTGATACTGTGAATTCTTCTACGGTATTGATTCAGGGTTTTTATCTAAATGGTACAAGAACG TTATATGTGCTTGATTTTATAACTGTAAATTCAAATGAAGTGATTACAAAAGATTATTATGCTGATTTTAATTCA TTTGAGTTTGTTTTTACCACTGAAAGTGTTACAGAAAATGAGATTCAAGTTTCAGTCTGGGGTAAAAATTCAATG GGGCAGTTAGTGACAGCTCACCGTGTTGTATCTTCCGAATTGCTTGTAGCAAAAGGCGCGGGACCGACAGGGCTA ACGGGAGCCACTGGCGCTACCGGAGCTACTGGCGTCACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGCGCTACCGGAACTACG GGCGTTATGGGTGATACCGGAGTCACTGGAGTTACCGGAGTTACTGGCGTTACCGGGGCTATCGGAGTCACTGGC GCTATCGGAGTCACGGGGGCTACCGGAGCCACAGGAGTTACGGGGGCCACTGGAGTTACCGGGGCTATTGGAGTT ACTGGCGCTATCGGAGTCACTGGCGCTACCGGAGCTACTGGCGTTACTGGGGCTACTGGCGCTACTGGAGTCACA GGAGTTACCGGGGCTACTGGCGTTACCGGAGTTACCGGAGTTACTGGCATCACCGGGGCTATCGGAGCTACTGGC GTTACCGGAGCTACTGGCGTCACGGGTATTACCGGAGTCACTGGCGTTACCGGGGCTACTGGCGTTACTGGAGTT ACTGGCATCACAGGCGTTACCGGAGTTACTGGTGTTACTGGTGTTACTGGAGCTACTGGCGTTACCGGGGCTACT GGCGCTACCGGAGCCACTGGCGTTACTGGAGTTACTGGCGTTACTGGCGCTACTGGAGCTACTGGTGTTACCGGG
GCTACCGGGGCTACCGGTGTCACGGGTGATACCGGTGTCACTGGCGCTACCGGGGCTACCGGAGTTTCTGGCGCT SEQ ID NO: 27 ACTGGGGCTACTGGTGTCACGGGTGATACCGGAGTTACCGGAGCTACTGGCGCTACAGGTGCTACCGGAGTTACT
GGCGGAACAGGTGCAACCGGAGTTACTGGAGTTACTGGCGTTACCGGGGCTATCGGAGTCACTGGCGCTACTGGA GCTACTGGAGCTGCTGGAATCACGGGTGTTACCGGAGTTACTGGCATCACCGGTGCTACCGGGGCTACGGGCGCT ACCGGAGTTACTGGCATCACAGGAGTCACTGGCGCTACCGGAGTTACTGGCGTAACAGGTGCAACCGGAGTTACT GGAGTTACCGGGGCTATCGGAGTTACTGGTGTCACCGGAGCTACTGGCGTCACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGC GCTACCGGAGCTACTGGCGTTACGGGTGTTACCGGAGTTACCGGAGTTACTGGCGTTACCGGAGCTACTGGCGTT ACCGGAGTTACTGGAGTTACTGGAGTTATTGGAGTTACTGGAGTTACTGGAGTTACTGGAGTTACTGGAGTTACC GGAGTTACCGGAGTTACTGGAGTTACCGGGGCTATCGGAGTCACTGGCGCTATCGGAGTCACGGGGGCTACCGGG GTCACTGGCGCTACCGGAGCTACTGGCGTAACAGGGGCTACTGGAGTTACCGGGGCTATCGGAGTCACTGGCGCT ACTGGAGCTGCTGGAATCACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGTGTTACTGGAGTTACCGGAGCTACTGGCATCACG GGTGATACCGGAGTCACTGGCGCTACCGGAGCTACTGGCGTTACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGGGCTACCGGA GCTACTGGCGTCACGGGTGATACCGGAGTTACTGGAGTCACTGGCGCTACCGGAGTTACTGGCGTAACAGGTGCA GCCGGAGTTACTGGCATCACGGGGGCTACCGGAGTTACTGGAGTTACCGGGGCTATTGGAGTCACTGGCGCTATC GGAGTCACGGGGGCTACCGGAGCCACAGGAGTTACGGGTATTACCGGAGCTACTGGCGCTACTGGAGCCACAGGT GCTACCGGAGTTACTGGAGTTACTGGCGCTACCGGAGCTACTGGCGCTACTGGCGTCACGGGTTCTACTGGGGTC
Identificador Sequência de Sequência
ACTGGCGCTACTGGCGTTACCGGAGCTACTGGCGTCACGGGTTCTACTGGGGTCACTGGCGCTACTGGCGTTACC GGAGCTACTGGCGTCACGGGTATTACCGGAGTCACTGGCGTTACCGGAGTTACTGGTGCTACTGGAGCTACTGGC GTTACCGGGGCTACCGGAGTCACTGGGGCTACCGGAGCTACTGGCGTCACGGGTATTACCGGAGTCACTGGGGCT ACCGGAGCTACTGGCGTCACGGGTGTTACCGGAGTCACCGGAGTCACTGGAGTTACTGGAGTTACTGGCGCTACC GGAGCTACTGGCGTTACCGGAGCTACTGGCGCTACTGGCGTCACGGGTGATACCGGAGTCACTGGGGCTACCGGA GTTACCGGAGTCACTGGCGCTACTGGGGCTACTGGTGTCACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGCGCTACCGGGGCT ACTGGTGTCACGGGTGTTACCGGGGCTACCGGAGCTACTGGCGACACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGAGTCACT GGAGTTACCGGAGTTTCTGGCGCTACCGGAGTTACCGGAGTTTCTGGCGCTACCGGAGTTACCGGAGCTACTGGC GTTACCGGGGCTGGGGCTACCGGAGCTACTGGCGCTACTGGAGTCACAGGTGTTACCGGAGTCACTGGCGCTACC GGAGCTACTGGCGCTACTGGAGTCACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGCGCTACCGGGGCTACTGGTGTCACGGGT GTTACCGGGGCTACCGGAGCTACTGGCGACACGGGTGTTACCGGAGTCACTGGAGTCACTGGAGTTACCGGAGTT TCTGGCGCTACCGGAGTTACCGGAGCTACTGGCGTTACCGGGGCTGGGGCTACCGGAGCTACTGGCGCTACTGGA GTCACAGGTGTTACCGGAGTCACTGGCGCTACCGGAGCTACTGGCGCTACTGGAGTCACGGGTGTTACCGGAGTC ACTGGCGCTACCGGGGCTACTGGCGCTACTGGAGTCACGGGTGTTACTGGCGTTACGGGTGTTACCGGAGTTTCT GGCATCACCGGTGCTACCGGGGCTATTGGACCTACTGGTGCCACAGGTGTTGGTATAACAGGTTCAACAGGTTCA ACCGGCCCCACTGGCCCACCTCCTACGTTTATAGACGCATACTTTAACGGTAATATTCAACCTCAGACAATTGCT TCGGGATCAAACATTTTAAATATTACTCCAAACCAATCTACTGCACTTACTTATAACGCAGTAACAAGTGTTTTC ACAATACAAAATGCGGGGTTGTATAACATTAGTGTTGTAATAAATCTTGCAACTGCCACACTACCAGAAGCAACA ATTGGGTTATCACTAAATAATTCTACAGCATATCTCGCTCCTGCTGTAACCACGGCAACAAGTGGTCAATTGGTT TTAGTTCAAATTGAGGCTCTTGCTGTCGGAGATACAATTCAATTTAGAAATATATCTGGGTTTCCTATTACCATT GCTAATTCACCAGTAATAGCTAACAGCTCAGGTCATGTAGCTATTTCGAGATTCTCAGCTTTTTCATAA
Identificador Sequência de Sequência
MAVISTGPIENNYVSGIRPTHRVTVKIDNRDTVNSSTVLIQGFYLNGTRTLYVLDFITVNSNEVITKDYYADFNS FEFVFTTESVTENEIQVSVWGKNSMGQLVTAHRVVSSELLVAKGAGPTGLTGATGATGATGVTGVTGVTGATGTT GVMGDTGVTGVTGVTGVTGAIGVTGAIGVTGATGATGVTGATGVTGAIGVTGAIGVTGATGATGVTGATGATGVT GVTGATGVTGVTGVTGITGAIGATGVTGATGVTGITGVTGVTGATGVTGVTGITGVTGVTGVTGVTGATGVTGAT GATGATGVTGVTGVTGATGATGVTGATGATGVTGDTGVTGATGATGVSGATGATGVTGDTGVTGATGATGATGVT GGTGATGVTGVTGVTGAIGVTGATGATGAAGITGVTGVTGITGATGATGATGVTGITGVTGATGVTGVTGATGVT GVTGAIGVTGVTGATGVTGVTGVTGATGATGVTGVTGVTGVTGVTGATGVTGVTGVTGVIGVTGVTGVTGVTGVT
GVTGVTGVTGAIGVTGAIGVTGATGVTGATGATGVTGATGVTGAIGVTGATGAAGITGVTGVTGVTGVTGATGIT SEQ ID NO: 28 GDTGVTGATGATGVTGVTGVTGATGATGVTGDTGVTGVTGATGVTGVTGAAGVTGITGATGVTGVTGAIGVTGAI
GVTGATGATGVTGITGATGATGATGATGVTGVTGATGATGATGVTGSTGVTGATGVTGATGVTGSTGVTGATGVT GATGVTGITGVTGVTGVTGATGATGVTGATGVTGATGATGVTGITGVTGATGATGVTGVTGVTGVTGVTGVTGAT GATGVTGATGATGVTGDTGVTGATGVTGVTGATGATGVTGVTGVTGATGATGVTGVTGATGATGDTGVTGVTGVT GVTGVSGATGVTGVSGATGVTGATGVTGAGATGATGATGVTGVTGVTGATGATGATGVTGVTGVTGATGATGVTG VTGATGATGDTGVTGVTGVTGVTGVSGATGVTGATGVTGAGATGATGATGVTGVTGVTGATGATGATGVTGVTGV TGATGATGATGVTGVTGVTGVTGVSGITGATGAIGPTGATGVGITGSTGSTGPTGPPPTFIDAYFNGNIQPQTIA SGSNILNITPNQSTALTYNAVTSVFTIQNAGLYNISVVINLATATLPEATIGLSLNNSTAYLAPAVTTATSGQLV LVQIEALAVGDTIQFRNISGFPITIANSPVIANSSGHVAISRFSAFS
Identificador Sequência de Sequência
TTGGGAAATTTATTGTTGCGTAAAAGATATCGCTTGACCCAGGTGGCAAGGAAAAAAAAGAAGGAAAGAGATCAA AAGATGGGAGCGTTCCGTTTTATGCCCATTTATCGTACAGGAACGAGCTGCATTCGTAACAAAAAGGGAAATAAA CGTATTTATAGACAGGGTAGAAGAAGAGAGAGAATATGCGCTTATAGACATCATTTGCACGCTGAGCGGGTGCCC TCAGGTTTATCAAATAAAAAAATCTGTTTTATGAAATTCAAAGGTCAACGAAGACTGCGAGGCGGCGAACAGGAG CCTCAAGGCAATTCAGGAGGAGCAGTTCAAGGGGTGCATGGATTAAGGGGGACCGATGGTAATGCTGGGCATCAA
GGCATACAAGGTCCGGCTGGGCCACAGGGCATTCCGGGTAGTGCCGGACCCCAGGGCCAGGCGGGCGCCATAGGC SEQ ID NO: 29
CCCCAAGGTGAACAGGGTCTTCAGGGGGTTCCAGGGATTCAAGGCTTGCAAGGAGAGGCTGGGCCACAGGGAGAG CAGGGACCACCGCTTAATTTGGATGGGATCACGGTTGTGCCTGAGGTACAGCGATATTTCTATTTTGCCGATTCA GATCTGACGGGTACGGTTGAAATCCCTATTTCCCAGTTTACGAATGATGATGGACAGTTGGCAAGTCAGCTTCCA GAATTGGGTGCGAACAGCTACACGGATTTGTATATTAATGGGGTACTGCAGGAAAGCAGGTTGTACCAGATAAGT AGTACCACATTGACTGTTGAATTGGAAGAAGCTCTTGTAATTGCGGGTACGCCGTTTATTTTCGAGGTTTTTCAA TTTACATTAAGAATGGCGAACTGA MGNLLLRKRYRLTQVARKKKKERDQKMGAFRFMPIYRTGTSCIRNKKGNKRIYRQGRRRERICAYRHHLHAERVP
SGLSNKKICFMKFKGQRRLRGGEQEPQGNSGGAVQGVHGLRGTDGNAGHQGIQGPAGPQGIPGSAGPQGQAGAIG SEQ ID NO: 30
PQGEQGLQGVPGIQGLQGEAGPQGEQGPPLNLDGITVVPEVQRYFYFADSDLTGTVEIPISQFTNDDGQLASQLP ELGANSYTDLYINGVLQESRLYQISSTTLTVELEEALVIAGTPFIFEVFQFTLRMAN
[0099] Além das sequências exemplificativas de alvejamento N-terminal listadas na Tabela 1 (isto é, SEQ ID NOs: 1-10 e 18) e na Tabela 2 (isto é, SEQ ID NOs: 19-30), em modalidade adicionais, sequências variantes que compartilham pelo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com qualquer das sequências anteriormente mencionadas podem ser usadas, desde que a sequência retenha a capacidade de alvejar a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus. Em algumas modalidades, um fragmento de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos contíguos selecionados a partir de qualquer das sequências de polipeptídeos listadas na Tabela 1 pode ser usado. Em alguns aspectos, a única funcionalidade exigida consiste na sequência que mantém a capacidade de alvejar uma proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus.
[0100] Em algumas modalidades, essa sequência de sinal N- terminal ou uma variante ou fragmento da mesma, pode ser usada para alvejar uma proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus que compreende um peptídeo ou sequência de polipeptídeos de interesse que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal ligada. Em algumas modalidades, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50 %,
51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer das sequências individuais listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, a sequência de sinal N-terminal compreende pelo menos uma sequência contígua de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos que é idêntica a uma sequência contígua do mesmo número de aminoácidos de qualquer das sequências de polipeptídeos individuais listadas na Tabela 1.
[0101] Como discutido no presente documento, construtos de proteína de fusão de acordo com vários aspectos da revelação compreendem uma sequência de sinal N-terminal ou uma variante ou fragmento da mesma que alveja a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus e uma sequência de polipeptídeos que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal. Entretanto, em aspectos adicionais, qualquer das sequências reveladas, bem como as variantes sequenciais e fragmentos das mesmas de acordo com qualquer um dos aspectos revelados, pode ser usada para outros propósitos. O objetivo da revelação nos aspectos em que essas sequências funcionam como sequências de alvejamento de superfície de esporo N-terminal não deve ser interpretado como uma ressalva de outras funcionalidades.
[0102] Em algumas modalidades, a sequência de sinal N- terminal compreende um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos como representado por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou
10. Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N- terminal compreende um fragmento de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 (por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma subsequência contígua encontrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10). Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N-terminal compreende uma variante de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 (por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compartilha um grau mínimo ou de porcentagem de identidade com a sequência representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10). Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal pode quantificar tanto como um fragmento quanto como uma variante, como definido acima (por exemplo, uma sequência de sinal N-terminal que compreende uma subsequência contígua encontrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 seguido de uma sequência divergente que se situa em uma faixa de identidade de sequência revelada).
[0103] Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10.
[0104] Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência contígua de pelo menos 5, 10, 15, 20 ou 25 aminoácidos que é idêntica a uma sequência contígua de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10.
[0105] Em algumas modalidades, a sequência de sinal N- terminal compreende um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9. Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N-terminal compreende um fragmento de um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 (por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma subsequência contígua encontrada em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9). Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N-terminal compreende uma variante de um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 (por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compartilha um grau mínimo ou exato de porcentagem de identidade com um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos representada por qualquer das sequências representadas por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9). Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal pode quantificar tanto como um fragmento quanto como uma variante, como definido acima (por exemplo, uma sequência de sinal N-terminal que compreende uma subsequência contígua encontrada em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 seguido de uma sequência divergente que se situa em uma faixa de identidade de sequência mínima).
[0106] Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9.
[0107] Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza uma sonda de ácido nucleico complementar à SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 sob estringência moderada ou alta.
[0108] Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência contígua de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 nucleotídeos que é idêntica a uma sequência contígua do mesmo número de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9.
[0109] em relação a qualquer das sequências de alvejamento N-terminal alternativas contempladas por essa revelação, como as modalidades anteriormente mencionadas, a funcionalidade mínima exigida de tais sequências em aspectos selecionados tem a capacidade de alvejar uma proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus. Sequências Reguladores Associadas à Esporulação
[0110] A revelação fornece múltiplas sequências regulatórias a montante que podem ser usadas para expressar proteínas de fusão e outros construtos de acordo com a revelação durante a esporulação (por exemplo, SEQ ID NOs: 11-15). Como descrito em detalhes no presente documento, essas sequências regulatórias a montante podem ser usadas para expressar proteínas de fusão que têm uma sequência de alvejamento N-terminal que direciona uma proteína de interesse para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus. Em alguns aspectos, essas sequências regulatórias a montante (ou fragmentos ou variantes dos mesmos) também podem ser usadas para expressar qualquer proteína heteróloga de interesse durante a esporulação independentemente da possibilidade de a proteína de interesse incluir uma sequência de alvejamento N-terminal.
[0111] Em alguns aspectos, a transcrição da proteína de interesse é controlada por um promotor presente em qualquer das sequências regulatórias a montante descritas no presente documento (por exemplo, quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15, ou um fragmento ou variante dos mesmos que permanece transcricionalmente ativo durante esporulação). Em alguns aspectos, um construto de DNA pode compreender uma sequência que codifica uma proteína de interesse a jusante de qualquer das sequências reguladoras descritas no presente documento (por exemplo, quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15), ou um fragmento ou variante dos mesmos que permanece transcricionalmente ativa durante a esporulação. Tais fragmentos podem compreender quaisquer 25, 50, 100, 150 ou 200 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 11-15, que permanecem transcricionalmente ativos durante a esporulação. De modo similar, as variantes podem compreender uma sequência que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % de identidade de sequência em comparação com quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15 (ou um fragmento da mesma), que permanece transcricionalmente ativa durante a esporulação. DNA que codifica a proteína de interesse e qualquer sequência (ou sequências) regulatória a montante podem ser integrados no DNA cromossômico de uma célula de Paenibacillus ou outra célula. Proteínas de Fusão
[0112] A revelação fornece proteínas de fusão que compreende uma sequência de alvejamento N-terminal ligada, direta ou indiretamente, a pelo menos uma molécula de interesse (por exemplo, sequência de polipeptídeos de uma proteína ou peptídeo de interesse, como pelo menos um peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal). Nas modalidades selecionadas, a ligação indireta pode ser um espaçador interveniente, ligante ou uma sequência reguladora. A proteína ou o peptídeo pode compreender, porém sem limitação, um hormônio de peptídeo, um peptídeo sem hormônio, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento vegetal ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal. Em geral, qualquer proteína de interesse capaz de expressão em um endósporo de Paenibacillus e heterólogo à sequência selecionada de alvejamento N-terminal pode ser usada. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína que é expressa em bactérias do gênero de Paenibacillus. Em outras modalidades, a proteína de interesse é isolada de bactéria das mesmas espécies como o endósporo de Paenibacillus em que a proteína de fusão será expressa. Ainda em outras modalidades, a proteína de interesse é isolada da cepa de Paenibacillus em que a proteína de fusão será expressa no endósporo. A sequência de alvejamento pode ser qualquer das sequências de alvejamento descritas acima.
[0113] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão podem compreender uma sequência de alvejamento e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno. A sequência de alvejamento pode ser qualquer das sequências de alvejamento descritas acima.
[0114] A proteína de fusão pode ser feita usando métodos de biologia molecular e clonagem padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo (por exemplo, um gene que codifica um peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal) pode ser amplificado pela reação de cadeia de polimerase (PCR) e ligado à codificação de DNA para qualquer das sequências de alvejamento descritas acima para formar uma molécula de DNA que codifica a proteína de fusão. A molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser clonada em qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor de plasmídeo. O vetor compreende adequadamente um sítio de clonagem múltipla em que a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém adequadamente um marcador selecionável, como um gene de resistência a antibiótico, de modo que a bactéria transformada,
transfectada ou correspondida com o vetor possa ser prontamente identificada e isolada.
Ondo o vetor é um plasmídeo, o plasmídeo também compreende adequadamente uma origem de replicação.
O DNA que codifica a proteína de fusão está adequadamente sob o controle de um promotor de esporulação que causará a expressão da proteína de fusão na superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus (por exemplo, um promotor nativo de um membro de família de Paenibacillus). Em alguns aspectos, a transcrição da proteína de fusão é controlada por um promotor presente em qualquer das sequências regulatórias a montante descritas no presente documento (por exemplo, quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15, ou um fragmento ou variante dos mesmos que permanece transcricionalmente ativo durante esporulação). Em alguns aspectos, um construto de DNA pode compreender uma sequência que codifica uma proteína de fusão de acordo com a revelação a jusante de qualquer das sequências reguladoras descritas no presente documento (por exemplo, quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15), ou um fragmento ou variante dos mesmos que permanece transcricionalmente ativa durante a esporulação.
Tais fragmentos podem compreender quaisquer 50, 100, 150 ou 200 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 11-15, que permanece transcricionalmente ativa durante esporulação.
De modo similar, as variantes podem compreender uma sequência que tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % de identidade de sequência em comparação com quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15 (ou um fragmento da mesma), que permanece transcricionalmente ativa durante a esporulação.
DNA que codifica a proteína de fusão (por exemplo, uma sequência de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 ou uma variante ou fragmento da mesma), com uma ou mais sequências (ou sequências) regulatória a montante pode ser integrado no DNA cromossômico de uma célula de Paenibacillus ou outra célula.
[0115] A proteína de fusão também pode compreender sequências de polipeptídeos adicionais que não fazem parte da sequência de alvejamento, ou a proteína ligada de interesse (por exemplo, o peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que melhora resistência ao estresse em uma planta, ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta). Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir etiquetas ou marcadores para facilitar a purificação (por exemplo, um etiqueta de poli-histidina) ou visualização (por exemplo, uma proteína fluorescente, como GFP ou YFP) da própria proteína de fusão ou dos esporos das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam a proteína de fusão.
[0116] A expressão de proteínas de fusão na superfície de esporo usando as sequências de alvejamento descritas no presente documento é melhorada devido à falta da estrutura secundária na terminação amino dessas sequências, que permite o dobramento nativo das proteínas fusionadas e retenção de atividade. O dobramento apropriado pode ser adicionalmente melhorado pela inclusão de um ligante de aminoácido curto entre a sequência de alvejamento e a proteína parceira de fusão.
[0117] Desse modo, qualquer uma das proteínas de fusão descritas no presente documento pode compreender um ligante de aminoácido entre a sequência de alvejamento e a proteína ligada de interesse (por exemplo, o peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que melhora resistência ao estresse em uma planta, ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta).
[0118] O ligante pode compreender um ligante de polialanina ou um ligante de poliglicina. Um ligante que compreende uma mistura de resíduos tanto de alanina quanto de glicina também pode ser usado. Por exemplo, em que a sequência de alvejamento compreende SEQ ID NO: 2, uma proteína de fusão pode ter uma das seguintes estruturas: Nenhum ligante: SEQ ID NO: 2-Proteína Parceira de Fusão Ligante de Alanina: SEQ ID NO: 2—An-Proteína Parceira de Fusão Ligante de Glicina: SEQ ID NO: 2—Gn-Proteína Parceira de Fusão Ligante de Alanina e Glicina Misturado: SEQ ID NO: 2— (A/G)n-Proteína Parceira de Fusão em que An, Gn, e (A/G)n são qualquer número de alaninas, qualquer número de glicinas, ou qualquer número de uma mistura de alaninas e glicinas, respectivamente.
[0119] Por exemplo, n pode ser qualquer número inteiro entre 1 a 25, como um número inteiro entre 6 a 10. Em que o ligante compreende uma mistura de resíduos de alanina e glicina, qualquer combinação de resíduos de glicina e alanina pode ser usada. A sequência de alvejamento N-terminal é representada por SEQ ID NO: 2, como mostrado acima. Entretanto, qualquer uma das outras sequências de alvejamento N-terminal reveladas no presente documento pode ser substituída no lugar de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, SEQ
ID Nos: 4, 6, 8 ou 10 ou fragmentos ou as variantes dos mesmos) nas configurações exemplificativas acima. Nas estruturas mostradas acima, “Proteína Parceira de Fusão” representa a proteína ligada de interesse (por exemplo, um peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que melhora resistência ao estresse em uma planta, ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta).
[0120] Alternativa ou adicionalmente, o ligante pode compreender um sítio de reconhecimento de protease. A inclusão de um sítio de reconhecimento de protease permite a remoção alvejada, sob exposição a uma protease que reconhece o sítio de reconhecimento de protease, da proteína de interesse (por exemplo, um peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que melhora resistência ao estresse em uma planta, ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta).
[0121] Em certos aspectos, a proteína de fusão compreende uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento vegetal, como uma acetoína redutase, uma indol-3-acetamida hidrolase, uma triptofano mono-oxigenase, uma acetolactato sintetase, uma α- acetolactato decarboxilase, uma piruvato decarboxilase, uma diacetil redutase, uma butanodiol desidrogenase, uma aminotransferase, uma triptofano decarboxilase, uma amina oxidase, uma indol-3-piruvato decarboxilase, uma indol-3- acetaldeído desidrogenase, uma oxidase de cadeia lateral de triptofano, uma nitrila hidrolase, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma adenosina fosfato isopenteniltransferase, uma fosfatase, uma adenosina quinase, uma adenina fosforribosiltransferase, CYP735A, uma 5'-ribonucleotídeo fosfo-hidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma zeatina cis-trans isomerase, uma zeatina O-glucosiltransferase, uma β-glucosidase, uma cis- hidroxilase, uma CK cis-hidroxilase, uma CK N- glucosiltransferase, uma 2,5-ribonucleotídeo fosfo- hidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma purina nucleosídeo fosforilase, uma zeatina redutase, uma hidroxilamina redutase, uma 2-oxoglutarato dioxigenase, uma hidrolase 2B/3B giberélica, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20-oxidase, uma quitosanase, uma quitinase, uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4-glucanase, uma β-1,6-glucanase, uma ácido aminociclopropano-1-carboxílico deaminase, uma enzima envolvida na produção de um fator nod, ou qualquer combinação dos mencionados acima.
[0122] Em outros aspectos, a proteína de fusão compreende uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal, como uma celulase, uma lipase, uma lignina oxidase, uma protease, uma glicosídeo hidrolase, uma fosfatase, uma nitrogenase, uma nuclease, uma amidase, um nitrato redutase, uma nitrito redutase, uma amilase, uma amônia oxidase, uma ligninase, uma glucosidase, uma fosfolipase, uma fitase, uma pectinase, uma glucanase, uma sulfatase, uma urease, uma xilanase, uma sideróforo ou qualquer combinação dos mencionados acima.
[0123] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é expressa sob o controle de um promotor de esporulação nativo para a sequência de alvejamento, proteína de superfície de esporo ou fragmento de proteína de superfície de esporo da proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. Em certos aspectos, o promotor de esporulação de alta expressão compreende uma sequência promotora de polimerase de esporulação específica de sigma-K. Nos aspectos selecionados, a proteína de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor que é nativo para a sequência de alvejamento da proteína de fusão. Em alguns casos, o promotor que é nativo para a sequência de alvejamento será um promotor de esporulação de alta expressão. Em outros casos, o promotor que é nativo para a sequência de alvejamento não será um promotor de esporulação de alta expressão. Nos últimos casos, pode ser vantajoso substituir o promotor nativo com um promotor de esporulação de alta expressão. A expressão da proteína de fusão sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão fornece expressão aumentada da proteína de fusão na superfície de esporo do endósporo de Paenibacillus. O promotor de esporulação de alta expressão pode compreender uma ou mais sequências promotoras de esporulação específica de sigma-K.
[0124] Como descrito acima, as proteínas de fusão podem compreender uma sequência de alvejamento e pelo menos uma proteína heteróloga que pode compreender um peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento. O peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal pode compreender, dentre outras coisas, um hormônio de peptídeo, um peptídeo sem hormônio, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento vegetal, ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente bacteriana,
fúngica ou vegetal. O peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal pode compreender uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento vegetal. A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento vegetal pode ser qualquer enzima que catalisa qualquer etapa em uma via de síntese biológica para um composto que estimula o crescimento vegetal ou altera a estrutura de planta, ou qualquer enzima que catalisa a conversão de um derivado menos ativo ou inativo de um composto que estimula o crescimento vegetal ou altera a estrutura de planta em uma forma ativa ou mais ativa do composto. Alternativamente, o composto estimulador de crescimento vegetal pode compreender um hormônio do crescimento vegetal, por exemplo, uma citocinina ou um derivado de citocinina, etileno, uma auxina ou um derivado de auxina, um ácido giberélico ou um derivado de ácido giberélico, ácido abscísico ou um derivado de ácido abscísico, ou um ácido jasmônico ou um derivado de ácido jasmônico.
[0125] Onde a enzima compreende uma protease ou peptidase, a protease ou peptidase pode ser uma protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, proproteínas ou pré-proproteínas para criar um peptídeo bioativo. O peptídeo bioativo pode ser qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica. A protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, proproteínas ou pré-proproteínas para criar um peptídeo bioativo pode compreender subtilisina, um ácido protease, uma alcalina protease, uma proteinase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, termolisina, papaína, pepsina, tripsina, pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma protease glutâmica, um aspartato protease, uma cisteína protease, uma treonina protease ou uma metaloprotease.
[0126] A proteína estimuladora de crescimento vegetal também pode compreender uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal. Tais enzimas incluem celulases, lipases, lignina oxidases, proteases, glicosida hidrolases, fosfatases, nitrogenases, nucleases, amidases, nitrato redutases, nitrito redutases, amilases, amônia oxidases, ligninases, glucosidases, fosfolipases, fitases, pectinases, glucanases, sulfatases, ureases, xilanases e sideróforos. Quando introduzidas em um meio de crescimento vegetal ou aplicadas para uma planta, semente ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, as proteínas de fusão que compreendem as enzimas que degradam ou modificam uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal pode auxiliar no processamento de nutrientes na proximidade da planta e resultar em absorção melhorada de nutrientes pela planta ou pelas bactérias ou fungos benéficos na proximidade da planta. As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de alvejamento e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno. A proteína ou o peptídeo pode compreender uma proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune de planta. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune de planta pode compreender um peptídeo ou proteína melhoradora de sistema imune de planta. O peptídeo ou proteína melhoradora de sistema imune de planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que tem um efeito benéfico no sistema imune de uma planta. Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno pode ser uma proteína ou peptídeo que tem atividade antibacteriana, atividade antifúngica ou atividade tanto antibacteriana quanto antifúngica. A proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno também pode ser uma proteína ou peptídeo que tem atividade inseticida, atividade helminticida, suprime a predação de insetos ou vermes, ou uma combinação dos mesmos. A proteína que protege uma planta de um patógeno pode compreender uma enzima. As enzimas adequadas incluem proteases e lactonases. As proteases e lactonases podem ser específicas para um molécula de sinalização bacteriana (por exemplo, uma molécula bacteriana de sinalização de homoserina lactona). A enzima também pode ser uma enzima que é específica para um componente celular de uma bactéria ou fungo.
[0127] As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de alvejamento e pelo menos uma proteína ou peptídeo que melhora resistência ao estresse em uma planta. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que melhora a resistência ao estresse em uma planta compreende uma enzima que degrada um composto relacionado ao estresse. Os compostos relacionados ao estresse incluem, porém sem limitação, ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico, oxilipinas e fenólicos. As espécies reativas de oxigênio específicas incluem hidroxila, peróxido de hidrogênio, oxigênio e superóxido. A enzima que degrada um composto relacionado ao estresse pode compreender uma superóxido dismutase, uma oxidase, uma catalase, uma ácido aminociclopropano-1-carboxílico deaminase, uma peroxidase, uma enzima antioxidante ou um peptídeo antioxidante.
[0128] A proteína ou peptídeo que melhora resistência ao estresse em uma planta também pode compreender uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um estresse ambiental. O estresse ambiental pode compreender, por exemplo, seca, inundação, calor, congelamento, sal, metais pesados, baixo pH, alto pH ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um estresse ambiental pode compreender uma proteína de nucleação de gelo, uma prolinase, uma fenilalanina amônia liase, uma isocorismato sintase, uma isocorismato piruvato liase ou uma colina desidrogenase.
[0129] As proteínas de fusão podem compreender uma sequência de alvejamento e pelo menos proteína ou peptídeo de ligação à planta. A proteína ou peptídeo de ligação à planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que é capaz de específica ou não especificamente se ligar a qualquer parte de uma planta (por exemplo, uma raiz de planta ou uma porção aérea de uma planta, como folha, caule, flor ou frutos) ou para plantar matéria. Desse modo, por exemplo, a proteína ou peptídeo de ligação à planta pode ser uma proteína ou peptídeo de ligação à raiz, ou uma proteína ou peptídeo de ligação à folha. Endósporos Recombinantes de Paenibacillus e Células que Expressam as Proteínas de Fusão
[0130] As proteínas de fusão descritas no presente documento podem ser expressas por células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus (por exemplo, P. terrae). A proteína de fusão pode ser qualquer uma das proteínas de fusão discutidas acima. As células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus pode coexpressar duas ou mais dentre qualquer uma das proteínas de fusão discutidas acima. Por exemplo, as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus podem coexpressar pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação à planta, juntamente com pelo menos uma proteína de fusão que compreende um peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal, pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que melhora a resistência ao estresse em uma planta.
[0131] As células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus podem compreender células de Paenibacillus, como Paenibacillus sp. NRRL B-50972, Paenibacillus terrae, Paenibacillus polymyxa, ou células de Paenibacillus peoriae. Em outros aspectos, a célula produtora de endósporo de Paenibacillus pode ser selecionada a partir de qualquer uma das espécies exemplificativas de Paenibacillus descritas no presente documento.
[0132] Para gerar células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam uma proteína de fusão, qualquer bactéria de Paenibacillus pode ser transformada usando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, por eletroporação com um vetor que codifica a proteína de fusão). As bactérias podem, desse modo, ser triadas para identificar transformantes por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, onde o vetor inclui um gene de resistência a antibiótico, as bactérias podem ser triadas para resistência a antibiótico. Alternativamente, DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado no
DNA cromossômico de uma célula de Paenibacillus. As células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus pode, então, ser expostas às condições que induzirão a esporulação. Condições adequadas para induzir a esporulação são conhecidas na técnica. Por exemplo, as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus podem ser laminadas em placas de ágar e incubadas a uma temperatura de cerca de 30 °C por vários dias (por exemplo, 3 dias), ou alternativamente cultivadas em meio de esporulação de Schaeffer.
[0133] Cepas inativadas, cepas não tóxicas ou cepas geneticamente manipuladas de qualquer uma das espécies acima também podem adequadamente ser usadas. Alternativa ou adicionalmente, uma vez que os esporos recombinantes de família de Paenibacillus que expressam a proteína de fusão tiverem sido gerados, os mesmos podem ser inativados para impedir germinação adicional uma vez em uso. Qualquer método para inativar os esporos bacterianos que são conhecidos na técnica pode ser usado. Métodos adequados incluem, sem limitação, tratamento de calor, irradiação gama, irradiação de raios-x, irradiação de UV-A, irradiação de UV-B, tratamento químico (por exemplo, tratamento com gluteraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante ou qualquer combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, os esporos derivados das cepas não toxigênicas ou cepas genética ou fisicamente inativadas, podem ser usados.
[0134] Os construtos de proteína de fusão de acordo com a presente revelação compreendem uma sequência de sinal N- terminal ou uma variante ou fragmento da mesma que alveja a proteína de fusão para a superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus e uma sequência de polipeptídeos que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal. Nas modalidades particulares, a sequência de sinal N-terminal e a sequência de polipeptídeos que é heteróloga à sequência de sinal N- terminal são diretamente ligadas. Em outros aspectos, uma sequência espaçadora ou ligante interveniente pode estar presente. Em aspectos adicionais, uma sequência de clivagem ou outra sequência reguladora pode ser posicionada entre as duas regiões. A sequência de polipeptídeos que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal pode compreender uma ou mais proteínas funcionais. Em aspectos em que as múltiplas proteínas funcionais estão contidas na sequência de polipeptídeos que é heteróloga à sequência de sinal N- terminal, pelo menos um espaçador, sequência de clivagem ou outro elemento regulador pode estar localizado entre as duas ou mais proteínas funcionais.
[0135] A sequência de polipeptídeos que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal pode ser, por exemplo: (a) um peptídeo ou proteína estimuladora de crescimento vegetal; (b) uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno; (c) uma proteína ou peptídeo que melhora resistência ao estresse de uma planta; (d) uma proteína ou peptídeo de ligação à planta; (e) uma peptídeo ou proteína melhoradora de sistema imune de planta; ou (f) uma proteína ou peptídeo que melhora absorção de nutriente. Quando expressadas em Paenibacillus, essas proteínas de fusão são alvejadas para a superfície de esporo do endósporo de Paenibacillus e são fisicamente orientadas de modo que a proteína ou peptídeo seja exibida na parte externa do esporo.
[0136] Esse sistema de exibição de superfície de esporo de Paenibacillus pode ser usado para entregar peptídeos, enzimas e outras proteínas para as plantas (por exemplo, para folhagem, frutos, flores, caules ou raízes da planta) ou para um meio de crescimento vegetal, como solo. Os peptídeos, enzimas e proteínas entregues ao solo ou a um outro meio de crescimento vegetal, dessa maneira, persistem e exibem atividade no solo por períodos estendidos de tempo. A introdução de células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam as proteínas de fusão descritas no presente documento no solo ou a rizosfera de uma planta pode levar a uma melhora benéfica do crescimento vegetal em condições de solo muito diferentes. O uso do sistema de exibição de superfície de esporo de Paenibacillus para criar essas enzimas permite que continuem a exercer seus efeitos benéficos na planta e na rizosfera pelos primeiros meses da vida de uma planta e, em alguns aspectos, por períodos de tempo mais longos até e incluindo a vida da planta.
[0137] Em alguns aspectos, as composições que compreendem endósporos ou células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus produzidas por tais células de acordo com qualquer aspecto descrito no presente documento podem ser aplicadas diretamente a uma planta (por exemplo, como um pó, suspensão ou solução, a uma semente ou a um campo). Em alguns aspectos, tais composições são aplicadas a um campo antes ou após a semeadura, ou alternativamente antes ou após a formação de broto (por exemplo, pré- ou pós-plantio, ou pré- ou pós-emergência).
[0138] Em aspectos alternativos, as proteínas de fusão e/ou composições reveladas no presente documento podem ser entregues a uma planta, semente e/ou campo indiretamente pela aplicação de esporos ou células recombinantes de Paenibacillus à planta, à semente ou ao campo. Nesses aspectos, uma proteína de fusão pode ser expressa ou gerada pelas células recombinantes de Paenibacillus (por exemplo, no campo), resultando na entrega da proteína de fusão para a planta, semente ou campo. Células Recombinantes Produtoras de Endósporo de Paenibacillus que Têm Efeitos Promotores de Crescimento de Planta e/ou Outros Atributos Benéficos
[0139] Algumas bactérias de Paenibacillus são conhecidas por terem atributos benéficos inerentes. Por exemplo, algumas cepas têm efeitos inseticidas (por exemplo, mosquitocida) ou promotores de crescimento da planta. Qualquer uma das proteínas de fusão descritas no presente documento pode ser expressa em tais cepas.
[0140] Por exemplo, as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus podem compreender uma cepa promotora de crescimento da planta de Paenibacillus. A cepa promotora de crescimento da planta de bactéria pode compreender uma cepa de bactéria que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Bin), produz um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3-glucanase, uma citosinase, uma liticase ou uma combinação das mesmas), produz um composto nematocida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto bacteriocida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, se liga às raízes da planta, coloniza as raízes da planta, forma biofilmes, solubiliza os nutrientes, secreta os ácidos orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos. Agentes de Controle Biológico
[0141] Composições fornecidas pela revelação podem incluir adicionalmente agentes de controle biológico. Os agentes de controle biológico podem incluir, em particular, bactérias, fungos ou leveduras, protozoários, vírus, nematódeos entomapatogênicos, inoculantes e botânicos e/ou mutantes dos mesmos que têm todas as características de identificação da respectiva cepa e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos. A revelação fornece combinações dos endósporos recombinantes de Paenibacillus descritos acima com os agentes de controle biológico particulares descritos no presente documento e/ou para mutantes das cepas específicas de microrganismos descritos no presente documento, em que os mutantes têm todas as características de identificação da respectiva cepa, e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos ou promove crescimento vegetal e/ou melhora a saúde vegetal. De acordo com a revelação, os agentes de controle biológico descritos no presente documento podem ser empregados ou usados em qualquer estado fisiológico, como ativo ou dormente. Composições Exemplificativas
[0142] Nos aspectos selecionados, a revelação fornece composições que compreendem a) uma célula recombinante produtora de endósporo de Paenibacillus que expressa uma proteína de fusão que compreende: uma sequência de alvejamento que localiza a proteína de fusão, que compreende uma proteína heteróloga de interesse, para a superfície de esporo de um membro de família de Paenibacillus; e b) pelo menos um agente de controle biológico particular adicional e diferente revelado no presente documento e/ou um mutante de uma cepa específica de um microrganismo revelado no presente documento que tem todas as características de identificação da respectiva cepa e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos em uma quantidade sinergicamente eficaz. Em aspectos alternativos, a composição compreende pelo menos um fungicida adicional e/ou pelo menos um inseticida, com a condição de que as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus, o inseticida e o fungicida não são idênticos. Em um outro aspecto, a composição é usada para reduzir os danos gerais das plantas e parte das plantas, bem como, perdas nas frutas ou vegetais colhidos provocadas por insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos. Em um outro aspecto, a composição aumenta a saúde vegetal geral.
[0143] O termo “saúde da planta” geralmente compreende vários tipos de aprimoramentos de plantas que não estão conectados ao controle de pragas. Por exemplo, propriedades vantajosas que podem ser mencionadas são características de cultura aprimoradas que incluem: emergência, produtividades da cultura, teor de proteína, teor de óleo, teor de amido, sistema radicular mais desenvolvido, sistema radicular melhorado, manutenção de tamanho radicular melhorada, eficácia radicular melhorada, tolerância ao estresse melhorada (por exemplo, contra seca, calor, sal, UV, água,
frio), etileno reduzido (produção reduzida e/ou inibição de recepção), aumento de perfilhamento, aumento da altura da planta, lâmina de folha maior, menos folhas basais mortas, perfilhos mais fortes, cor da folha mais verde, teor de pigmento, atividade fotossintética, menos entrada necessária (como fertilizantes ou água), menos sementes necessária, perfilhos mais produtivos, florescimento mais precoce, maturidade do grão mais precoce, menos "plant verse" (acamamento), crescimento de broto aumentado, vigor de planta intensificado, povoamento de planta aumentado e germinação precoce e melhor.
[0144] As composições fornecidas pela revelação podem ser triadas para identificar benefícios potenciais ao crescimento vegetal, saúde da planta ou outros atributos positivos pela comparação das plantas que são cultivadas sob as mesmas condições ambientais, através disso, uma parte das ditas plantas é tratada com uma composição de acordo com a presente revelação e uma outra parte das ditas plantas não é tratada com uma composição de acordo com a presente revelação. Em vez disso, a dita outra parte não é tratada de fato ou é tratada com um controle adequado (isto é, uma aplicação sem uma composição de acordo com a revelação como uma aplicação sem todos os ingredientes ativos), uma aplicação sem as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus como descrito no presente documento, ou uma aplicação sem um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento.
[0145] A composição de acordo com a presente revelação pode ser aplicada de qualquer maneira desejada, como na forma de um revestimento de semente, encharcamento do solo e/ou diretamente no sulco e/ou como uma aspersão foliar e aplicada pré-emergência, pós-emergência ou ambas. Em outras palavras, a composição pode ser aplicada à semente, à planta ou aos frutos ou vegetais colhidos ou ao solo em que a planta cresce ou em que deseja-se que a planta cresça (localização de crescimento da planta).
[0146] A redução dos danos gerais das plantas e parte de plantas resulta frequentemente em plantas mais saudáveis e/ou em um aumento da produtividade e vigor da planta. De preferência, a composição de acordo com a presente revelação é usada para tratar plantas convencionais ou transgênicas ou semente das mesmas.
[0147] Em um outro aspecto, as composições fornecidas pela revelação aprimorar a saúde animal ou a condição física total geral de tais animais. Os indicadores de saúde melhorada incluem um ou mais dos seguintes itens: melhoria ou reversão de um estado de doença em um animal; aumento no ganho de peso, que pode incluir um aumento no peso de uma parte específica do animal ou um aumento no peso total; manutenção da microflora intestinal; aumento da eficiência na utilização de ração; redução no risco de mortalidade; aumento da resistência a doenças; redução de morbidade; aumento da resposta imune; diminuição na ocorrência de diarreia, aumento na produtividade; e/ou redução do derramamento de patógenos. A presente revelação também se refere aos métodos para aprimorar a saúde do animal ao administrar a um animal uma quantidade terapêutica ou eficaz de qualquer uma das composições descritas acima compreendendo células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam uma proteína de fusão. Em alguns aspectos, tal proteína de fusão inclui uma enzima que auxilia na digestão da ração, como amilase, glucanase, glucoamilase, celulase, xilanase, glucanase e pectinase ou um modulador imune, como um anticorpo. Uma quantidade eficaz de uma composição é uma quantidade eficaz para melhorar a saúde de um animal em comparação a um animal que não foi administrado com a composição, mas, de outro modo, foi administrado com a mesma dieta (incluindo ração e outros compostos) visto que tem o animal que recebe as composições da presente invenção. O termo “quantidade terapêutica” se refere a uma quantidade suficiente para melhorar ou reverter um estado de doença em um animal.
[0148] Em um outro aspecto, as composições fornecidas pela revelação removem a poluição ou os contaminantes dos meios, como solo, lençóis freáticos, sedimento ou água de superfície. A presente revelação também se refere a métodos para remover a poluição ou contaminantes dos meios, como solo, lençóis freáticos, sedimento ou água de superfície ao aplicar a tais meios uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições descritas acima compreendendo células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam uma proteína de fusão na superfície de esporo. Métodos de Uso de Construtos Recombinantes de Paenibacillus e Composições
[0149] A presente revelação também se refere a métodos para estimular o crescimento vegetal usando qualquer uma das composições descritas acima compreendendo as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam uma proteína de fusão e pelo menos um dos agentes de controle biológico particulares adicionais descritos no presente documento. O método para estimular o crescimento vegetal compreende aplicar a uma planta, uma semente, uma parte de planta, na localização que circunda a planta ou na qual a planta será plantada (por exemplo, solo ou outros meios de crescimento) uma composição que compreende células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus que expressam uma proteína de fusão que compreende: (i) uma proteína heteróloga (por exemplo, pelo menos uma proteína estimuladora de crescimento vegetal); e (ii) uma sequência de alvejamento; e pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento e/ou um mutante de uma cepa específica de um microrganismo revelado no presente documento que tem todas as características de identificação da respectiva cepa e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0150] Em um outro aspecto da presente revelação, é fornecido um método para reduzir os danos totais de plantas e parte de plantas bem como perdas nas frutas e vegetais colhidos provocadas por insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos que compreende a etapa de simultânea ou sequencialmente aplicar as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e pelo menos um agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0151] Em uma modalidade do presente método, a composição compreende adicionalmente pelo menos um fungicida. Em um aspecto, o pelo menos um fungicida é um fungicida sintético.
Em uma outra modalidade, a composição compreende pelo menos um inseticida além do fungicida ou no lugar do fungicida, visto que o inseticida, o fungicida, as células recombinantes produtoras de endósporo dePaenibacillus e o agente de controle biológico particular revelado no presente documento não são idênticos.
[0152] O método da presente revelação inclui os seguintes métodos de aplicação, a saber tanto as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus quanto o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento podem ser formulados em uma única composição estável com um tempo de prateleira agricolamente aceitável (assim chamado de “formulação do solo”), ou sendo combinados antes ou no momento do uso (assim chamado de “formulações combinadas”).
[0153] Se não mencionada de outra forma, a expressão “combinação” permanece para as várias combinações das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida, em uma formulação no solo, em uma forma única de “mistura pronta”, em uma mistura de aspersão combinada composta de formulações no solo, como uma “mistura de tanque”, e especialmente em um uso combinado dos únicos ingredientes ativos quando aplicados de uma maneira sequencial, isto é, uma após a outra em um período de tempo razoável, como algumas horas ou dias, por exemplo, 2 horas a 7 dias. A ordem de aplicar a composição de acordo com a presente revelação não é essencial para o funcionamento da presente revelação. Consequentemente, o termo “combinação” também abrange a presença das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou inseticida ou em uma planta a ser tratada ou seu entorno, habitat ou espaço de armazenamento, por exemplo, após aplicar simultânea ou consecutivamente as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida a uma planta ou seu entorno, habitat ou espaço de armazenamento.
[0154] Se as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida são empregados ou usados de uma maneira sequencial, é preferencial tratar as plantas ou parte das plantas (que inclui sementes e plantas que se originam da semente), frutos ou vegetais colhidos de acordo com o método a seguir: Em primeiro lugar, aplicar pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida na planta ou parte de plantas e, em segundo lugar, aplicar o agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento e as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus na mesma planta ou parte de plantas. Através desse modo de aplicação, a quantidade de resíduos de inseticidas/fungicidas na planta após a colheita é tão baixa quanto possível. Os períodos de tempo entre a primeira e a segunda aplicações em um ciclo de crescimento (cultura) pode variar e depender do efeito a ser alcançado. Por exemplo, a primeira aplicação é feita para impedir uma infestação da planta ou parte de plantas com insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos (esse é particularmente o caso ao tratar as sementes) ou para combater a infestação com insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos (esse é particularmente o caso ao tratar as plantas e parte de plantas) e a segunda aplicação é feita para impedir ou controlar a infestação com insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos e/ou para promover o crescimento vegetal. O controle nesse contexto significa que a composição que compreende as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o agente de controle biológico particular revelado no presente documento não são capazes de exterminar completamente as pragas ou fungos fitopatogênicos, mas são capazes de manter a infestação em um nível aceitável.
[0155] A presente revelação também fornece métodos para melhorar a atividade de extermínio, inibição, preventiva e/ou repelente das composições da presente revelação por múltiplas aplicações. Em algumas outras modalidades, as composições da presente revelação são aplicadas a uma planta e/ou parte de planta por duas vezes, durante quaisquer estágios de desenvolvimento desejados ou sob qualquer pressão da praga predeterminada, em um intervalo de cerca de 1 hora, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 24 horas, cerca de dois dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 1 semana, cerca de 10 dias, cerca de duas semanas, cerca de três semanas, cerca de 1 mês ou mais. Ainda em outras modalidades, as composições da presente revelação são aplicadas a uma planta e/ou parte de planta por mais de duas vezes, por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, ou mais, durante quaisquer estágios de desenvolvimento desejados ou sob qualquer pressão da praga predeterminada, em um intervalo de cerca de 1 hora, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 24 horas, cerca de dois dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 1 semana, cerca de 10 dias, cerca de duas semanas, cerca de três semanas, cerca de 1 mês ou mais. Os intervalos entre cada aplicação podem variar se for desejado. Um elemento versado na técnica será capaz de determinar as vezes de aplicação e tamanho de intervalo dependendo da espécie de planta, espécie de praga da planta e outros fatores.
[0156] Ao seguir as etapas mencionadas acima, um nível muito baixo de resíduos de pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida na planta tratada, parte de plantas e nos frutos ou vegetais colhidos pode ser alcançado.
[0157] Se não mencionado de outra forma, o tratamento de plantas ou parte de plantas (que inclui sementes e plantas que se originam da semente), frutos ou vegetais colhidos com a composição de acordo com a revelação é executado diretamente ou por ação de seus arredores, habitat ou espaço de armazenamento usando métodos de tratamento, por exemplo imersão, aspersão, atomização, irrigação, evaporação, pulverização, vaporização, difusão, formação de espuma, pintura, espalhamento, alimentação com água (demolhagem), irrigação por gotejamento. É adicionalmente possível aplicar as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus, o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida como formulação no solo ou formulações combinadas pelo método de volume ultra baixo, ou injetar a composição de acordo com a presente revelação como uma composição ou como formulações únicas no solo (no sulco).
[0158] O termo “planta a ser tratada” abrange cada parte de uma planta incluindo seu sistema radicular e o material- -por exemplo, solo ou meio de nutrição--que está em um raio de pelo menos 10 cm, 20 cm, 30 cm em torno do caule ou bole de uma planta a ser tratada ou que está pelo menos 10 cm, 20 cm, 30 cm em torno do sistema radicular de dita planta a ser tratada, respectivamente.
[0159] A quantidade das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus, que são usadas ou empregadas em combinação com pelo menos um agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento, opcionalmente na presença de pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida, depende da formulação final bem como do tamanho ou tipo da planta, parte de plantas, sementes, frutos ou vegetais colhidos a serem tratados. Geralmente, as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus a serem empregadas ou usadas de acordo com a revelação estão presentes em cerca de 1 % a cerca de 80 % (p/p), de preferência, em cerca de 1 % a cerca de 60 % (p/p), mais de preferência, cerca de 10 % a cerca de 50 % (p/p) de sua formulação no solo ou formulação combinada com o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento, e opcionalmente o fungicida e/ou o pelo menos um inseticida.
[0160] Além disso, a quantidade do pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento que é usado ou empregado em combinação com as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus, opcionalmente na presença de pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida, depende da formulação final bem como o tamanho ou tipo da planta, parte de plantas, sementes, vegetais ou frutos colhidos a serem tratados. Geralmente, o agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento a ser empregado ou usado de acordo com a revelação está presente em cerca de 0,1 % a cerca de 80 % (p/p), de preferência 1 % a cerca de 60 % (p/p), mais de preferência cerca de 10 % a cerca de 50 % (p/p) de sua formulação no solo ou formulação combinada com as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida.
[0161] A aplicação das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus pode ser efetuada como uma aspersão foliar, como um tratamento de solo, e/ou como um tratamento/peliculização de semente. Quando usados como um tratamento foliar, em uma modalidade, cerca de 1/16 a cerca de 5 galões de caldo integral são aplicados por acre. Quando usados como um tratamento de solo, em uma modalidade, cerca de 1 a cerca de 5 galões de caldo integral são aplicados por acre. Quando usados para tratamento de semente cerca de 1/32 a cerca de 1/4 galões de caldo integral são aplicados por acre. Para tratamento de semente, a formulação de uso final contém pelo menos 1 × 104, pelo menos 1 × 105, pelo menos 1 × 106, 1 × 107, pelo menos 1 ×x 108, pelo menos 1 × 109, pelo menos 1 × 1010 unidades de formação de colônia por grama.
[0162] A razão pode ser calculada com base na quantidade de pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento, no ponto no tempo de aplicar o dito componente de uma combinação de acordo com a revelação a uma planta ou parte de planta e a quantidade das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus brevemente antes (por exemplo, 48 h, 24 h, 12 h, 6 h, 2 h, 1 h) ou no ponto no tempo de aplicar o dito componente de uma combinação de acordo com a revelação a uma planta ou parte de planta.
[0163] A aplicação das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento a uma planta ou uma parte de planta pode ocorrer simultaneamente ou em vezes diferentes à medida que ambos os componentes estejam presentes em ou na planta após a aplicação (ou aplicações). Em casos em que as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento são aplicadas em vezes diferentes e o agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento é aplicado antes às células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus, a pessoa versada pode determinar a concentração de agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento sobre/em uma planta por análise química conhecida na técnica, no ponto no tempo ou pouco antes do ponto no tempo de aplicar as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus. Vice versa, quando as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus são aplicadas a uma primeira planta, a concentração das células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus pode ser determinada usando testes que também são conhecidos na técnica, no ponto no tempo ou pouco antes o ponto no tempo de aplicar o agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento.
[0164] Em um outro aspecto da presente revelação, uma semente tratada com a composição como descrito acima é fornecida. O controle de insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos através do tratamento da semente de plantas foi conhecido por um longo tempo e é um objeto de aprimoramento contínuos. Não obstante, o tratamento de semente implica uma série de problemas que nem sempre podem ser solucionados de maneira satisfatória. Desse modo, é desejável desenvolver métodos para proteger a semente e germinar a planta que dispensam, ou pelo menos significativamente reduzem, a necessidade da entrega adicional de composições de proteção de cultura no curso de armazenamento, após semeadura ou após a emergência das plantas. É adicionalmente desejável otimizar a quantidade de ingrediente ativo empregado de tal modo que forneça melhor proteção possível para a semente e a planta de germinação do ataque de insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos, porém sem danificar a própria planta pelo composto ativo empregado. Em particular, os métodos para o tratamento de sementes também devem levar em consideração as propriedades inseticidas e/ou nematicidas intrínsecas das plantas transgênicas resistentes a pragas ou tolerantes a pragas, a fim de obter a proteção ideal da semente e da planta de germinação com um uso mínimo de composições de proteção de culturas.
[0165] Portanto, a presente revelação também se refere em particular a um método para proteger a semente e as plantas de germinação do ataque de pragas, através do tratamento da semente com as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus como definido acima e pelo menos um agente de controle biológico adicional selecionado a partir de microrganismos particulares revelados no presente documento e/ou um mutante de uma cepa específica de microrganismo revelada no presente documento que tem todas as características de identificação da respectiva cepa e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou opcionalmente pelo menos um inseticida da revelação. O método da revelação para proteger a semente e as plantas de germinação do ataque de pragas abrange um método em que a semente é tratada simultaneamente em uma operação com as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida. O mesmo também abrange um método em que a semente é tratada em vezes diferentes com as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida.
[0166] A revelação fornece adicionalmente métodos para tratar sementes com o propósito de proteger a semente e a planta resultante contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos. A revelação também se refere à semente que, ao mesmo tempo, foi tratada com células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e pelo menos um agente de controle biológico particular adicional descrito no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida. A revelação se refere adicionalmente à semente que foi tratada em vezes diferentes com as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida. No caso de sementes que foram tratadas em vezes diferentes com as células recombinantes produtoras de endósporo de Paenibacillus e o pelo menos um agente de controle biológico particular adicional revelado no presente documento, e opcionalmente o pelo menos um fungicida e/ou o pelo menos um inseticida, os ingredientes ativos individuais na composição da revelação podem estar presentes em diferentes camadas na semente.
[0167] Além disso, a revelação se refere à semente que, após o tratamento com a composição da revelação, é submetida a um processo de revestimento por película a fim de evitar a abrasão por pó da semente.
[0168] Uma das vantagens da presente revelação consiste no fato de que, devido às propriedades sistêmicas particulares das composições da revelação, o tratamento da semente com essas composições fornece proteção contra insetos, ácaros, nematódeos e/ou fitopatógenos não apenas para a própria semente, mas também para as plantas que se originam da semente, após terem crescido. Desse modo, não pode ser necessário tratar a cultura diretamente no momento da semeadura ou pouco depois. Uma vantagem adicional consiste no fato de que, através do tratamento da semente com a composição da revelação, a germinação e a emergência da semente tratada podem ser promovidas.
[0169] As composições da revelação são adequadas para proteger a semente de qualquer variedade de planta que é usada na agricultura, em estufas, em florestas ou em horticultura. Mais particularmente, a semente em questão é aquela de cereais (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e painço), maís, algodão, feijão de soja, arroz, batatas, girassol, café, tabaco, canola, colza oleaginosa, beterrabas (por exemplo, beterraba sacarina e beterraba forrageira), amendoins, vegetais (por exemplo, tomate, pepino, feijão, brássicas, cebolas e alface), plantas frutíferas, gramados e plantas ornamentais. É particularmente importante o tratamento da semente de cereais (como trigo, cevada, centeio e aveias) maís, feijões de soja, algodão, canola, colza oleaginosa e arroz.
[0170] Com o propósito da presente revelação, a composição da revelação é aplicada sozinha ou em uma formulação adequada à semente. A semente é, de preferência, tratada em uma condição em que sua estabilidade esteja de modo que nenhum dano ocorra no curso do tratamento. Em termos gerais, a semente pode ser tratada em qualquer momento entre a colheita e semeadura. Tipicamente, usa-se a semente que foi separada da planta e teve espigas, cascos, caules, cascas, pelos ou polpa removida. Desse modo, por exemplo,
pode ser usada a semente que foi colhida, limpa e Seca até um teor de umidade menor que 15 % em peso. Alternativamente, a semente também pode ser usada após a secagem a qual foi tratada com água, por exemplo, e, então, seca novamente.
[0171] Ao tratar sementes, é necessário, em termos gerais, garantir que a quantidade da composição da revelação e/ou de outros aditivos, que é aplicada à semente seja selecionada de modo que a germinação da semente não seja afetada de modo adverso, e/ou que a planta que emerge da semente não seja danificada. Esse é o caso em particular com ingredientes ativos que podem exibir efeitos fitotóxicos em certas taxas de aplicação.
[0172] As composições da revelação podem ser aplicadas diretamente, em outras palavras, sem compreender adicionalmente componentes e sem terem diluídas. Como uma regra geral, é preferencial aplicar as composições na forma de uma formulação adequada à semente. As formulações e métodos adequados para o tratamento de semente são conhecidos pela pessoa versada e são descritos, por exemplo, nos seguintes documentos: Patentes US nº 4.272.417 A; 4.245.432 A; 4.808.430 A; 5.876.739 A; Publicação de Patente US nº 2003/0176428 A1; documento WO 2002/080675 A1; documento WO 2002/028186 A2, cujos conteúdos de cada um são incorporados ao presente documento a título de referência.
[0173] As combinações que podem ser usadas de acordo com a revelação podem ser convertidas nas formulações para peliculização de semente comuns, tais como soluções, emulsões, suspensões, pó, espumas, pastas fluidas ou outras composições de revestimento para sementes e também formulações de ULV. Essas formulações são preparadas de uma maneira conhecida, misturando-se a composição com adjuvantes comuns, como, por exemplo, extensores comuns e também solventes ou diluentes, corantes, agentes molhantes, dispersantes, emulsionantes, antiespumantes, conservantes, espessantes secundários, autocolantes, giberelinas e também água. Os corantes que podem estar presentes nas formulações para tratamento de sementes que podem ser usados de acordo com a invenção incluem todos os corantes que são comuns para tais fins. Nesse contexto, é possível usar não apenas os pigmentos, que são de baixa solubilidade em água, mas também corantes solúveis em água. Os exemplos incluem os corantes conhecidos sob as designações de Rhodamine B, C.I. Pigment Red 112 e C.I. Solvent Red 1.
[0174] Dependendo da espécie da planta ou dos cultivares da planta, de suas condições de localização e crescimento (solos, clima, período da vegetação, dieta), usando ou empregando a composição de acordo com a presente revelação, o tratamento de acordo com a revelação também pode resultar em efeitos superaditivos (“sinergéticos”). Assim, por exemplo, ao usar ou empregar a composição inventiva no tratamento de acordo com a revelação, as taxas de aplicação reduzida e/ou uma extensão do espectro de atividade e/ou um aumento na atividade de melhor crescimento vegetal, tolerância aumentada a temperaturas altas ou baixas, tolerância aumentada à seca ou ao teor de sal em água ou solo, desempenho de florescimento aumentado, colheita mais fácil, maturação acelerada, rendimentos de colheita maiores, frutos maiores, maior altura da planta, cor da folha mais verde, florescimento mais precoce, maior qualidade e/ou um valor nutricional maior dos produtos colhidos, maior concentração de açúcar nos frutos, melhor estabilidade para armazenamento e/ou maior facilidade de processamento dos produtos colhidos são possíveis, que excedem os efeitos que eram realmente esperados.
[0175] Em certas taxas de aplicação da composição inventiva no tratamento de acordo com a revelação também podem ter um efeito de reforço nas plantas. O sistema defensivo da planta contra o ataque por fungos fitopatogênicos e/ou microrganismos e/ou vírus indesejados é mobilizado. Substâncias de reforço de planta (indutoras de resistência) devem ser compreendidas como, no presente contexto, aquelas substâncias ou combinações de substâncias que são capazes de estimular o sistema de defesa de plantas de tal modo que, quando subsequentemente inoculadas com fungos fitopatogênicos e/ou microrganismos e/ou vírus indesejados, as plantas tratadas exibam um grau substancial de resistência a esses fungos fitopatogênicos e/ou microrganismos e/ou vírus. Desse modo, ao usar ou empregar a composição de acordo com a presente revelação no tratamento de acordo com a revelação, as plantas podem ser protegidas contra o ataque pelos patógenos mencionados acima em um certo período de tempo após o tratamento. O período de tempo no qual a proteção é realizada se estende, em geral, de 1 a 10 dias, de preferência, 1 a 7 dias, após o tratamento das plantas com os compostos ativos.
[0176] Qualquer uma das composições reveladas no presente documento pode incluir um ou mais produtos agroquímicos. De modo similar, os métodos para aplicar composições de acordo com a revelação podem compreender adicionalmente introduzir pelo menos um produto agrícola no meio de crescimento vegetal ou aplicar pelo menos um produto agrícola às plantas ou sementes.
[0177] O produto agrícola pode compreender um fertilizante (por exemplo, um fertilizante líquido), um material de fertilizante de micronutriente (por exemplo, ácido bórico, um borato, uma frita de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um tetraborato de sódio deca-hidratado, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, sulfato de amônio e ferro, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdíco, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação dos mesmos), um inseticida (por exemplo, um organofosfato, um carbamato, um piretroide, um acaricida, um ftalato de alquila, ácido bórico, um borato, um fluoreto, enxofre, um ureia substituída haloaromática, um éster de hidrocarboneto, um inseticida com base biológica ou uma combinação dos mesmos), um herbicida (por exemplo, um composto de clorofenóxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto de dipiridila, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benzamida, um ácido benzoico, um derivado de ácido benzoico, ácido anísico, um derivado de ácido anísico, uma benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinila, um derivado de ciclo- hexenona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, ácido nicotínico, isopropilamina, derivados de isopropilamina, oxadiazolinona,
um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, uma uracila, um derivado de ureia, endothall, clorato de sódio ou uma combinação dos mesmos), um fungicida (por exemplo, um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, um tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organotina, um composto de cádmio, anilazina, benomila, ciclo-hexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxila, tiamimefona, triforina ou uma combinação dos mesmos), um moluscicida, uma algicida, uma alteração do crescimento vegetal, um inoculante bacteriano (por exemplo, um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella, ou uma combinação dos mesmos), um inoculante fúngico (por exemplo, um inoculante fúngico da família Glomeraceae, um inoculante fúngico da família Claroidoglomeraceae, um inoculante fúngico da família Gigasporaceae, um inoculante fúngico da família Acaulosporaceae, um inoculante fúngico da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inoculante fúngico da família Ambisporaceae, um inoculante fúngico da família Scutellosporaceae, um inoculante fúngico da família Dentiscultataceae, um inoculante fúngico da família Racocetraceae, um inoculante fúngico da família Basidiomycota, um inoculante fúngico da família Ascomycota, um inoculante fúngico da família Zygomycota, ou uma combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos.
[0178] O fertilizante pode compreender sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato de sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfeto de amônio, triossulfato de amônio, amônia aquosa, amônia anidra, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de amônio e de cálcio, sulfato de cálcio, magnesita calcinada, calcário calcítico, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, calcário dolomítico, lima hidratada, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de potássio e magnésio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, calcário magnesiano, magnésia, ureia, formaldeídos de ureia, nitrato de amônio e ureia, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutilideno diureia, K2SO4- (MgSO4)2, cainita, silvinita, kieserita, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, conchas de ostras moídas, farinha de peixe, tortas de óleo, esterco de peixe, farinha de sangue, fosfato de rocha, super fosfatos, escória, farinha de osso, cinzas de madeira, adubo, fezes (guano) de morcego, musgo de turfa, composto, areia verde, farinha de semente de algodão, farinha de penas, farinha de carangueijo, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação dos mesmos. O produto agrícola pode compreender qualquer fungicida, inoculante bacteriano ou herbicida, como descrito no presente documento. A bactéria de formação de esporo, em separado ou em combinação com o inseticida, pode compreender adicionalmente uma quantidade eficaz de pelo menos um fungicida.
[0179] Em geral, um “fungicida” é uma substância para aumentar mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de fungos. O termo “fungo” ou “fungos” inclui uma ampla variedade de organismos de esporo-rolamento nucleados que são desprovidos de clorofila. Exemplos de fungos incluem leveduras, moldes, mofos ferrugens e cogumelos. Os ingredientes fungicidas típicos também incluem captano, fludioxonila, iprodiona, tebuconazol, tiabendazol, azoxistrobina, procloraz e oxadixila. As composições particulares, sementes de planta ou inóculos de acordo com a revelação podem compreender qualquer fungicida natural ou sintético, como: aldimorfo, ampropilfós, ampropilfós-
potássio, andoprim, anilazina, azaconazol, azoxistrobina, benalaxila, benodanila, benomila, benzamacrila, benzamacril- isobutila, bialafós binapacrila, bifenila, bitertanol, blasticidina-S, boscalida, bromuconazol, bupirimato, butiobato, polissulfureto de cálcio, capsimicina, captafol, captano, carbendazim, carvona, quinometionato, clobentiazona, clorfenazol, cloroneb, cloropicrina, clorotalonila, clozolinato, clozilacona, cufraneb, cimoxanila, ciproconazol, ciprodinila, ciprofuram, debacarb, diclorofeno, diclobutrazol, diclofluanida, diclomezina, diclorano, dietofencarb, dimetirimol, dimetomorfo, dimoxistrobina, diniconazol, diniconazol-M, dinocap, difenilamina, dipiritiona, ditalimfós ditianona, dodemorfo, dodina, drazoxolona, edifenfós epoxiconazol, etaconazol, etirimol, etridiazol, famoxadona, fenapanila, fenarimol, fenbuconazol, fenfuram, fenitropano, fenpiclonila, fenpropidina, fenpropimorfo, acetato de fentina, hidróxido de fentina, ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluopiram, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanila, flutriafol, folpete, fosetil-alumínio, fosetil-sódio, ftalida, fuberidazol, furalaxila, furametpir, furcarbonila, furconazol, furconazol-cis, furmeciclox, guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalila, imibenconazol, iminoctadina, iminoctadina albesilato, iminoctadina triacetato, iodocarbe, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, kasugamicina, cresoxim-metílico, preparações de cobre, como: hidróxido de cobre, naftenato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, óxido de cobre, oxina-cobre e mistura Bordeaux,
mancopper, mancozebe, manebe, meferimzona, mepanipirim, mepronila, metalaxila, metconazol, metassulfocarbe, metfuroxam, metiram, metomeclam, metsulfovax, mildiomicina, miclobutanila, miclozolina, dimetilditiocarbamato de níquel, nitrotal-isopropila, nuarimol, ofurace, oxadixila, oxamocarb, ácido oxolínico, oxicarboxim, oxifenti-ina, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, pencicurona, fosdifeno, pimaricina, piperalina, polioxina, polioxorim, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarb, propanosina-sódica, propiconazol, propineb, protiocinazol, pirazofós pirifenox, pirimetanila, piroquilona, piroxifur, quinconazol, quintozeno (PCNB), enxofre e preparações de enxofre, tebuconazol, tecloftalam, tecnazeno, tetciclases, tetraconazol, tiabendazol, ticiofeno, tifluzamida, tiofanato-metílico, tioximida, tolclofós-metílico, tolilfluanida, triadimefona, triadimenol, triazbutila, triazoxida, triclamida, triciclazol, tridemorfo, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, uniconazol, validamicina A, vinclozolina, viniconazol, zarilamida, zineb, ziramor ou uma combinação dos mesmos.
O fungicida também pode compreender um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organotina, um composto de cádmio, anilazina, benomila, ciclo-hexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxila, tiamimefona, triforina ou uma combinação dos mesmos.
Um elemento versado na técnica verificará prontamente que outros fungicidas sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos usados com propósitos agrícolas também podem ser selecionados para inclusão em uma composição, semente de planta ou inóculo de acordo com a revelação.
[0180] Se uma composição, semente de planta ou inóculo compreende um fungicida, o fungicida pode ser um fungicida foliar. Os fungicidas foliares incluem cobre, mancozebe, pentiopirad, triazóis, ciproconazol, metconazol, propiconazol, protioconazol, tebuconazol, azoxistrobina, piraclastobina, fluoxastrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, enxofre, boscalida, tiofanato metílico, clorotanonila, pentiopirad, difenconazol, flutriafol, ciprodinila, fluzinam, iprodiona, penflufeno, ciazofamida, flutolanila, cimoxanila, dimetomorfo, pirimetanila, zoxamida, mandipropamida, metrinam, propamocarbe, fenamidona, tetraconazol, cloronabe, himexazol, tolclofos e fenbuconazol. Um elemento versado na técnica verificará prontamente que outros fungicidas foliares sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos usados com propósitos agrícolas também podem ser selecionados para inclusão em uma composição, semente de planta ou inóculo de acordo com a revelação.
[0181] Composições, sementes e inoculantes de acordo com a revelação que compreendem um inseticida, possuem a capacidade de aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de insetos. Como usado no presente documento, o termo “insetos” inclui todos organismos na classe “Insecta”. O termo insetos “pré-adultos” se refere a qualquer forma de um organismo antes do estágio adulto, incluindo, por exemplo, ovos, larvas e ninfas. Como usado no presente documento, o termo “inseticida” também abrange “nematicida” e “acaricida”. “Nematicidas” se refere à capacidade de uma substância aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de nematódeos. Em geral, o termo “nematódeo” compreende ovos, larvas, formas maduras e jovens do dito organismo. “Acaricida” se refere à capacidade de uma substância aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de ectoparasitas pertencentes à classe Arachnida, sub-classe Acari.
[0182] De acordo com um aspecto da presente revelação, o pelo menos um inseticida compreende: (1) Inibidores de acetilcolinesterase (AChE), como, por exemplo, carbamatos, por exemplo, alanicarbe, bendiocarbe, benfuracarbe, butocarboxima, butoxicarboxima, carbofurano, carbosulfano, etiofencarbe, furatiocarbe, isoprocarbe, metolcarbe, oxamila, pirimicarbe, propoxur, tiofanox, triazamato, trimetacarbe, XMC e xililcarbe; ou organofosfatos, por exemplo, acefato, azametifós azinfós- etila, azinfós-metila, cadusafós cloretoxifós clorfenvinfós, clormefós, clorpirifós-metila, coumafós, cianofós, demeton- S-metila, diazinona, diclorvos/DDVP, dicrotofós, dimetoato, dimetilvinfós, dissulfotano, EPN, etiona, fanfur, fenitrotiona, fostiazato, heptenofós, imiciafós isofenfós, O-(metoxiaminotiofosforil)salicilato de isopropila, isoxationa, malationa, mecarbam, metidationa, mevinfós, monocrotofós, naled, ometoato, paration-metila, fentoato, forato, fosmet, fosfamidona, foxima, pirimifós-metila, profenofós propetamfós, protiofós, piraclofós, piridafentiona, quinalfós, sulfotep, tebupirimfós, temefós, terbufós, tetraclorvinfós, tiometona e triclorfona. (2) Antagonistas de canal de cloreto controlado por GABA, como, por exemplo, ciclodieno-organoclorinas, por exemplo,
clordano e/ou fenilpirazóis. (3) Moduladores de canal de sódio/bloqueadores de canal de sódio com porta de tensão como, por exemplo, piretroides, por exemplo, acrinatrina, aletrina, d-cis-trans aletrina, d-trans aletrina, bifentrina, bioaletrina, isômero de bioaletrina s- ciclopentenila, bioresmetrina, cicloprotrina, cialotrina, lambda-cialotrina, gama-cialotrina, enfentrina [isômeros (EZ)-trans], esfenvalerato, etofenprox, fenpropatrina, fenvalerato, flucitrinato, flumetrina, tau-fluvalinato, halfenprox, imiprotrina, cadetrina, permetrina, fenotrina [isômeros (1R)-trans], praletrina, piretrinas (piretro), resmetrina, teflutrina, tetrametrina, tetrametrina [isômeros (1R))] e transflutrina ou DDT ou metoxiclor. (4) Agonistas de receptor de acetilcolina nicotinérgica (nAChR), como, por exemplo, neonicotinoides, por exemplo, dinotefurano, nitenpiram, e tiametoxama ou nicotina ou sulfoxaflor. (5) Ativadores alostéricos do receptor de acetilcolina nicotinérgica (nAChR) como, por exemplo, espinosinas, por exemplo, espinetorama e espinosade. (6) Ativadores de canal de cloreto como, por exemplo, avermectinas/milbemicinas, por exemplo, abamectina, benzoato de emamectina, lepimectina e milbemectina. (7) Imitadores de hormônio juvenil como, por exemplo, análogos de hormônio juvenil, por exemplo, hidropreno, quinopreno e metopreno ou fenoxicarbe ou piriproxifeno. (8) Compostos ativos com mecanismos de ação desconhecidos ou não específicos como, por exemplo, haletos de alquila, por exemplo, brometo de metila e outros haletos de alquila ou cloropicrina ou fluoreto de sulfurila ou borax ou tártaro emético. (9) Redutores de apetite seletivos, por exemplo, pimetrozina ou flonicamida. (10) Inibidores de crescimento de ácaro, por exemplo, clofentezina, hexitiazox e diflovidazina ou etoxazol. (11) Disruptores microbianos da membrana de intestino médio de inseto, por exemplo, Bacillus thuringiensis subespécie israelensis, Lysinibacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis subespécie aizawai, Bacillus thuringiensis subespécie kurstaki, Bacillus thuringiensis subespécie tenebrionis e proteínas de planta Bt: CrylAb, CrylAc, CrylFa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Abl. (12) Inibidores de fosforilação oxidativa, disruptores de ATP como, por exemplo, diafentiurona ou compostos de organotina, por exemplo, azociclotina, ciexatina e óxido de fenbutatina ou propargita ou tetradifona. (13) Desacopladores de fosforilação oxidativa que atuam interrompendo o gradiente de próton H como, por exemplo, clorfenapira, DNOC e sulfluramida. (14) Antagonistas de receptor de acetilcolina nicotinérgica como, por exemplo, bensultape, cloridrato de cartape, tiociclama e tiosultap-sódio. (15) Inibidores de biossíntese de quitina, tipo 0 como, por exemplo, bistriflurona, clorfluazurona, diflubenzurona, flucicloxurona, flufenoxurona, hexaflumurona, lufenurona, novalurona, noviflumurona e teflubenzurona. (16) Inibidores de biossíntese de quitina, tipo 1, por exemplo, buprofezina. (17) Inbidores de muda (em particular, para Diptera, isto é, dipteranos), como, por exemplo, ciromazina. (18) Agonistas de receptor de ecdisona, como, por exemplo, cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida e tebufenozida. (19) Agonistas de octopaminérgicos. (20) Inibidores de transporte de elétron de complexo III, como, por exemplo, hidrametilnona ou acequinocila ou fluacripirim. (21) Inibidores de transporte de elétron de complexo I, por exemplo, do grupo dos acaricidas METI, por exemplo, fenazaquino, fenpiroximato, pirimidifeno, piridabeno, tebufenpirade e tolfenpirade ou rotenona (Derris). (22) Bloqueadores de canal de sódio com porta de tensão, por exemplo, indoxacarbe ou metaflumizona. (23) Inibidores de acetil-CoA carboxilase. (24) Inibidores de transporte de elétron de complexo IV como, por exemplo, fosfinas, por exemplo, fosfeto de alumínio, fosfeto de cálcio, fosfina e fosfeto de zinco ou cianeto. (25) Inibidores de transporte de elétron de complexo II como, por exemplo, cienopirafeno e ciflumetofeno. (26) Efetores de receptor de rianodina, como, por exemplo, diamidas, por exemplo, clorantraniliprol, que é também conhecido pelo nome comercial RYNAXYPYR™, e ciantraniliprol, ou qualquer combinação de um ou mais dos compostos ou classes de compostos identificados acima.
[0183] Um elemento de conhecimento comum na técnica observará prontamente que outros inseticidas sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos usados para propósitos agrícolas também podem ser selecionados para inclusão em uma composição, semente de planta ou inóculo de acordo com a revelação. Métodos de Triagem Usando as Plataformas de Exibição de Endósporo Descritas no Presente Documento
[0184] Os construtos de proteína de fusão e as células recombinantes de Paenibacillus reveladas no presente documento podem ser usados como uma plataforma para triagem de alto rendimento de proteínas heterólogas que geram atributos de planta novos e/ou modificados, como discutido por toda a revelação. Tais atributos podem incluir aprimoramentos comercialmente significativos em rendimentos de planta e outras características de planta, como: teor/composição de óleo ou proteína de planta alterado, teor/composição de carboidrato de planta alterado; teor/composição de carboidrato de semente alterado, composição de óleo ou proteína de semente alterada; tolerância aumentada a estresses ambientais ou químicos (por exemplo, resistência a frio ou calor, aridez, inseticidas ou herbicidas); senescência atrasada ou resistência à doença; aprimoramento de crescimento, melhoria de saúde; resistência a herbívoro; fixação de nitrogênio ou utilização de nitrogênio aprimoradas; arquitetura ou comprimento de raiz aprimorado; eficiência de uso de água aprimorada; biomassa aumentada; peso de semente aumentado; comprimento de broto aumentado; rendimento aumentado; massa de núcleo ou teor de umidade modificado; tolerância a metal; resistência a patógeno ou praga; aprimoramento de capacidade fotossintética; tolerância à salinidade; aprimoramento de vigor; peso seco e/ou fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta; teor de clorofila aumentado; uma modulação detectável no nível de um metabólito ou no metaboloma em relação a uma planta/semente de referência; uma modulação detectável no nível de um transcrito ou no transcritoma em relação a uma planta/semente de referência; uma modulação detectável no nível de uma proteína ou no proteoma em relação a uma planta de referência; e combinações de quaisquer dos traços ou atributos acima.
Além disso, a lista precedente se destina a ser um conjunto não limitante de exemplos.
Um elemento de conhecimento comum observará que a plataforma de entrega de alto rendimento revelada no presente documento é adequada para triar vários outros traços e atributos de planta discutidos em qualquer parte na revelação ou de outro modo conhecidos na técnica.
[0185] Os endósporos produzidos por células recombinantes de Paenibacillus modificadas para expressar uma proteína de fusão de acordo com a revelação podem ser aplicados a células de planta crescidas in vitro, uma semente de planta hospedeira, muda, ou a uma planta vegetativa ou de outro modo madura. A proteína heteróloga pode, por sua vez, modificar ou conferir um traço ou atributo às células de planta crescidas in vitro, semente de planta hospedeira, muda ou planta madura. Nas modalidades particulares, os endósporos de Paenibacillus podem ser usados para inocular uma semente e o traço ou atributo resultante novo ou modificado pode ser imediatamente evidente, enquanto que, em outras modalidades, pode não se tornar evidente até um estágio de desenvolvimento posterior da planta hospedeira.
[0186] Em algumas modalidades, a bactéria de Paenibacillus bactéria usada para entregar a proteína de fusão é exógena à espécie de planta hospedeira. Em outras modalidades, a bactéria de Paenibacillus selecionada é um endófito endógeno conhecido por colonizar a espécie de planta hospedeira. A planta hospedeira pode ser qualquer planta adequada aqui revelada (uma monocotiledônea, dicotiledônea, conífera, etc.)
[0187] A bactéria de Paenibacillus recombinante usada para entregar a proteína de fusão pode ser usada para inocular uma semente de planta hospedeira, muda, espécime de planta vegetativa ou de outro modo madura por meio de um revestimento ou aspersão, ou qualquer outro método de aplicação de endósporos a uma planta hospedeira conhecida na técnica. Quando aplicados como um líquido, por exemplo, como uma solução ou suspensão, os endósporos de Paenibacillus podem ser misturados ou suspensos em soluções aquosas. Os diluentes ou carreadores líquidos adequados incluem soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros carreadores líquidos. As composições sólidas podem ser preparadas pela dispersão dos endósporos de Paenibacillus em e sobre um carreador sólido apropriadamente dividido, como turfa, trigo, farelo, vermiculite, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado e similares. Quando tais formulações compreendem pós molháveis, agentes dispersantes como agentes dispersantes e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos podem ser usados.
[0188] Os endósporos de Paenibacillus podem ser aplicados diretamente à superfície de sementes de planta hospedeira ou às folhas e tronco de uma planta vegetativa diretamente, ou como parte de uma composição que compreende componentes adicionais. Os componentes adicionais podem incluir um ou mais compostos que melhoram a taxa de colonização, compostos que melhoram o crescimento ou saúde vegetal, pesticidas ou herbicidas, ou quaisquer outros compostos revelados no presente documento como adequados para promover cultivo e crescimento de plantas. Além disso, a composição pode incluir endósporos de Paenibacillus adicionais que foram modificados para expressar proteínas de fusão que compreendem diferentes sequências de aminoácidos. Por exemplo, uma composição pode compreender um primeiro endósporo de Paenibacillus que expressa uma proteína de fusão que compreende um fator promotor de crescimento vegetal assim como um segundo endósporo de Paenibacillus que expressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína que melhora resistência à pesticida.
[0189] Em modalidades particulares, o endósporo recombinante de Paenibacillus que é revestido sobre a semente de uma planta hospedeira tem capacidade, mediante a germinação da semente em um estado vegetativo, de localização em um diferente tecido da planta. Por exemplo, as células recombinantes de Paenibacillus podem ser capazes de localização em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, fio de raiz, broto, folha, flor, botão, borla, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células protetores, hidatódio, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em outras modalidades, as células recombinantes de Paenibacillus podem ser capazes de localização na raiz e/ou no fio de raiz da planta. Em modalidades alternativas, as células recombinantes de Paenibacillus podem ser capazes de localização nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta; ou nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema.
[0190] Em outras modalidades, as células recombinantes de Paenibacillus são capazes de localização nos tecidos reprodutores (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto) da planta. Ainda em uma outra modalidade, as células recombinantes de Paenibacillus colonizam um tecido de fruto ou semente da planta. Ainda em uma outra modalidade, as células recombinantes de Paenibacillus são capazes para colonizar a planta de modo que esteja presente n a superfície da planta (por exemplo, o exterior de planta ou a filosfera da planta). Ainda em outras modalidades, as células recombinantes de Paenibacillus são capazes de localização em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta.
[0191] As composições que compreendem os endósporos recombinantes de Paenibacillus projetados para aplicação a uma planta hospedeira pode compreender uma composição de revestimento de semente, um tratamento de raiz ou uma composição de aplicação foliar. A composição de revestimento de semente, ou de tratamento de raiz, ou a composição de aplicação foliar pode compreender um fungicida, um agente antibacteriano, uma herbicida, uma nematicida, uma inseticida, um regulador de crescimento vegetal, um nutriente, ou combinações dos mesmos. A composição de revestimento de semente, ou de tratamento de raiz, ou a composição de aplicação foliar pode compreender adicionalmente um carreador agricolamente aceitável, um agente de pegajosidade, um estabilizante microbiano ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, a composição de revestimento de semente, ou de tratamento de raiz, ou a composição de aplicação foliar pode conter uma segunda bactéria, incluindo, mas sem limitação a, uma preparação bacteriana rizobiana. As composições também podem conter um tensoativo. Em uma modalidade, o tensoativo está presente a uma concentração entre 0,01 % v/v a 10 % v/v. Em uma outra modalidade, o tensoativo está presente a uma concentração entre 0,1 % v/v a 1 % v/v. Em algumas modalidades, a composição pode incluir um estabilizante microbiano (por exemplo, um estabilizante).
[0192] Mediante a inoculação, uma planta hospedeira tratada (por exemplo, uma semente, muda, planta vegetativa ou de outro modo madura tratada) pode ser triada em relação à existência de atributos ou traços novos ou modificados. A triagem pode ocorrer em qualquer ponto no tempo após o tratamento. Em modalidades particulares, uma semente pode ser tratada e a triagem pode não ocorrer até que a semente tenha germinado ou alcançado um estágio mais avançado de desenvolvimento. Em outras modalidades, uma semente, muda ou planta vegetativa pode ser tratada e a triagem pode não ocorrer até a planta tratada ter produzido um produto final colhido que pode compreender a amostra a ser triada para um traço ou atributo novo ou modificado.
[0193] Durante a triagem, vários testes podem ser realizados tanto in vitro quanto in vivo para determinar quais benefícios, se houver, são conferidos à planta hospedeira tratada. Os ensaios de triagem in vivo incluem testes que medem os traços ou atributos fenotípicos de uma planta ou semente (por exemplo, ensaios que medem a altura ou taxa de crescimento vegetal; rendimento de cultura; resistência a um estresse ambiental como calor, frio ou salinidade; resistência a patógenos biológicos ou pragas de inseto; resistência aos tratamentos químicos, como inseticidas ou herbicidas). Os ensaios de triagem in vitro incluem, porém sem limitação, testes que medem a composição ou propriedades de extratos de planta, amostras de tecido, amostras de célula e similares. Em algumas modalidades, a triagem in vitro pode compreender purificar e medir a quantidade ou atividade de uma determinada proteína, enzima,
transcrição genética, metabólito ou outro composto encontrado nas células ou no tecido da planta hospedeira tratada. Em outras modalidades, a triagem pode compreender inspeção visual da estrutura de células ou tecido da planta hospedeira tratada, seja a olho nu ou por microscopia.
[0194] Em modalidades alternativas, a triagem pode compreender ensaios de endósporos ou células recombinantes vegetativas de Paenibacillus modificadas para expressar uma proteína de fusão de acordo com a presente revelação, como oposto aos ensaios direcionados às plantas hospedeiras tratadas. Nessas modalidades, os endósporos ou células de membro de família de Paenibacillus podem ser submetidas aos ensaios in vitro de uma ou mais atividade, como, porém sem limitação, a capacidade de liberar os fosfatos complexados ou ferro complexado (por exemplo, através de secreção de sideróforos); produção de fitormônios; produção de compostos antibacterianos, antifúngicos ou inseticidas ou nematicidas; produção e/ou secreção de ACC deaminase, acetoína, pectinase, celulalase, ou RNase. Os métodos de triagem direcionados aos endósporos ou células de membro de família de Paenibacillus, em vez das plantas vegetativas, são particularmente vantajosos no fato de que tais métodos pode permitir a detecção de proteínas heterólogas úteis mais cedo que os métodos direcionados às plantas hospedeiras tratadas. Métodos para Identificar Sequências de Alvejamento de Superfície de Esporo
[0195] A presente revelação revela várias sequências de alvejamento de superfície de esporo N-terminal identificados em Paenibacillus, que são úteis como parte de uma plataforma de exibição de superfície de esporo para proteínas heterólogas como descrito no presente documento. Entretanto, a revelação não é limitada a essas sequências particulares, fragmentos e variantes dos mesmos. Os métodos de triagem de acordo com a revelação podem ser amplamente usados em Paenibacillus e outros gêneros bacterianos de formação de endósporo para identificar sequências de alvejamento de superfície de esporo N-terminal adicionais que podem ser similarmente úteis como parte de uma plataforma de exibição de endósporo ou para outros propósitos. Em uma modalidade, a bactéria formadora de endósporo que é útil para essa invenção tem uma estrutura semelhante a pelo que é proteoliticamente resistente, como mostrado na FIG. 1. Por exemplo, os métodos de triagem revelados no presente documento podem ser usados para identificar sequências de alvejamento de superfície de esporo N-terminal em membros de formação de endósporo de Lysinibacillus, Viridibacillus e Brevibacillus.
[0196] Em alguns aspectos exemplificativos, tais sequências podem ser identificadas pela triagem de um genoma de um Paenibacillus ou uma outra bactéria de formação de endósporo de interesse para quadros de leitura abertos (“ORFs”) que codificam as proteínas que têm múltiplas repetições de aminoácido de tripleto similar a colágeno de “glicina--qualquer resíduo--qualquer resíduo” (“repetições de GXX”) e que determinam que a proteína se localiza na superfície de esporo por microscopia ou experimentalmente. Essas repetições de GXX podem ser regiões adjacentes ou Separadas da sequência de polipeptídeos. Em alguns aspectos, as sequências de polipeptídeos podem ser triadas para um número particular de repetições adjacentes ou totais de GXX
(por exemplo, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 repetições de GXX). Em alguns aspectos, a localização de proteína é determinada visualmente (por exemplo, usando microscopia eletrônica de transmissão) ou experimentalmente (por exemplo, usando espectrometria de massa). Em alguns aspectos, os métodos para identificar uma sequência de alvejamento N-terminal podem compreender adicionalmente uma etapa de testar a sequência de alvejamento N-terminal putativa expressando-se uma proteína de fusão que compreende a sequência de alvejamento N-terminal putativa e uma repórter (por exemplo, GFP) em um Paenibacillus ou outra célula bacteriana.
[0197] Em alguns aspectos, a revelação fornece sequências de alvejamento de superfície de esporo de Paenibacillus e outros gêneros bacterianos (por exemplo, Lysinibacillus, Viridibacillus e Brevibacillus) que compreendem a porção N- terminal de uma proteína identificada através do processo de triagem anteriormente mencionado. Essa sequência de alvejamento N-terminal de tais sequências de alvejamento podem compreender os primeiros 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ou 50 aminoácidos da sequência endógena ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em alguns aspectos, a sequência de alvejamento N-terminal é uma variante que é pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % idêntica à sequência endógena ou um fragmento da mesma. As sequências de alvejamento de superfície de esporo em Paenibacillus e outros gêneros bacterianos identificados de acordo com esses métodos podem ser usados para gerar proteínas de fusão heterólogas de acordo com qualquer uma das modalidades descritas no presente documento.
[0198] Os seguintes exemplos não limitativos são fornecidos para ilustrar adicionalmente a presente revelação.
EXEMPLOS Exemplo 1: Protocolo Geral para Identificar Proteínas de Superfície de Esporo Similares a Colágeno Adequadas para Exibição de Endósporo.
[0199] O genoma completo de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 foi pesquisado por ORFs que contêm repetições de GXX similares a colágeno. As proteínas de superfície de esporo similares a colágeno foram, desse modo, visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (FIG 1). A presença de proteínas de superfície de esporo similares a colágeno também foi experimentalmente confirmada por espectrometria de massa. Brevemente, esporos de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 foram diferidos com tripsina para remover proteínas de superfície. Os esporos foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi analisada por espectrometria de massa para validar a presença de proteínas de superfície de esporo similares a colágeno. Esse protocolo geral foi usado para identificar proteínas endógenas de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 que têm as sequências de alvejamento N-terminal identificadas por SEQ ID NOs: 1-10). O mesmo método pode ser usado para identificar proteínas de superfície de esporo a partir de Viridibacillus, Lysinibacillus ou Brevibacillus e sequências de alvejamento N-terminal correspondentes. Exemplo 2: Protocolo Geral para Preparar Endósporos Recombinantes de Paenibacillus que Exibem Proteína Fluorescente Verde (GFP).
[0200] Para criar construtos de fusão, a codificação genética para GFP foi fusionada a um segmento de DNA que codifica os aminoácidos da sequência de alvejamento N- terminal revelada (SEQ ID NO: 1) de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 sob controle do promotor nativo das sequências reveladas de alvejamento N-terminal por síntese genética e clonada em um vetor bifuncional de E. coli/Paenibacillus, pAP13. O construto de vetor resultante foi introduzido em Paenibacillus sp. NRRL B-50972. Os transformantes corretos foram, então, cultivados em caldo de Meio de Esporulação de Schaeffer a 30 ºC até esporulação. Os esporos de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 que expressam o construto de fusão foram, desse modo, examinados por microscopia epifluorescente. GFP é visível em esporos que expressam o construto de fusão (FIG. 2A). Os esporos de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 também foram examinados por citometria de fluxo. Os esporos que expressam o construto de fusão são significativamente mais fluorescentes que os esporos do tipo selvagem (FIG. 2B). Exemplo 3. Protocolo Geral para Preparar Endósporos Recombinantes de Paenibacillus que Exibem uma Proteína Comum de Interesse.
[0201] As células de Paenibacillus (por exemplo, Paenibacillus sp. NRRL B-50972) podem ser cultivadas, transformadas e triadas como descrito acima no Exemplo 2 para produzir um construto de fusão que tem uma sequência de alvejamento de superfície de esporo N-terminal de acordo com a revelação. A triagem pode prosseguir por espectrometria de massa ou quaisquer outros meios bioquímicos ou visuais conhecidos na técnica (por exemplo, a proteína de interesse pode ser etiquetada com GFP ou uma outra etiqueta de seleção/triagem). A sequência de alvejamento N-terminal usada para gerar o construto de fusão pode compreender o polipeptídeo de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, ou 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em alguns aspectos, a sequência de alvejamento N-terminal pode compreender uma sequência que tem um ou mais resíduos que correspondem aos resíduos idênticos no alinhamento em pares de SEQ ID NOs: 2 e 8 (FIG. 3), que é capaz de alvejar um polipeptídeo para a superfície de esporo. De modo similar, pode ser usada uma sequência de alvejamento N-terminal que compreende uma sequência que tem um ou mais resíduos que correspondem aos resíduos idênticos/conservados no alinhamento em linhas de SEQ ID NOs: 2 e 8 fornecidos como FIG. 3.
[0202] Por exemplo, a sequência de alvejamento N-terminal pode compreender M-X-V-X-S-T-G-P-I-X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X- X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V-L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T- L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X (SEQ ID NO: 31) (em que “X” representa qualquer aminoácido), ou que compreende qualquer segmento de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 resíduos contíguos da mesma. Em um outro exemplo, a sequência de alvejamento N-terminal pode compreender M-X-V-X-S-T-G-P-I- X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X-X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V- L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T-L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X-X-N-X-V-I-T-X- X-X-X-um-X-X-X-X-F-E-F-V-F-T-T-X-X-X-X-E-N-E-X-Q-X-S-V-W-G- K-X-X-X-G-Q-L-V-X-um-H-R-X-V-S-X-E-L-L-V-X-X-X-X (SEQ ID NO: 32) (em que “X” representa qualquer aminoácido), ou que compreende qualquer segmento de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, ou 120 resíduos contíguos da mesma.
[0203] Em alguns aspectos, a sequência de alvejamento N- terminal selecionada pode compartilhar pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência com essas sequências e permanecer capaz de alvejar o construto de fusão para a superfície de esporo. Exemplo 4: Métodos para Entregar uma Proteína de Fusão Envolvida na Produção de um Composto que Promove Crescimento Vegetal para uma Semente, Muda, Planta ou Parte de Planta Com Uso de Endósporos Recombinantes de Paenibacillus.
[0204] As enzimas responsáveis pela produção de compostos que promovem crescimento vegetal podem ser entregues às plantas usando o sistema de entrega de endósporos de Paenibacillus revelado no presente documento. Por exemplo, butanodiol desidrogenase converte acetoína em 2,3- butanodiol. 2,3-butanodiol é um composto que promove crescimento vegetal. OS endósporos de Paenibacillus que expressam essa enzima podem ser aplicados como um tratamento de semente ou revestimento de semente ou entregues para a área que circunda uma semente, muda, planta ou parte de planta por imersão ou aspersão. Exemplo 5: Métodos para Entregar Múltiplas Proteínas de Fusão em um Único Endósporo de Paenibacillus para uma Semente, Muda, Planta ou Parte de Planta Com Uso de Endósporos Recombinantes de Paenibacillus.
[0205] Um único endósporo recombinante de Paenibacillus pode ser usado para exibir mais que uma proteína de fusão heteróloga. Isso é realizado através da construção de duas (ou mais) proteínas de fusão separadas. A sequência de codificação para cada proteína heteróloga a ser exibida na superfície de endósporo de Paenibacillus é fusionada separadamente a uma sequência de alvejamento N-terminal sob controle de seus promotores nativos. Os construtos de proteína de fusão podem ser clonados no mesmo vetor de plasmídeo ou diferentes vetores de plasmídeo e introduzidos em um membro de Paenibacillus por eletroporação. Os endósporos de Paenibacillus resultantes expressarão, desse modo, uma mistura de ambas as proteínas heterólogas na superfície de esporo. Isto é particularmente útil para o empilhamento de múltiplas toxinas proteináceas invertebradas para mitigar a resistência a pragas. Exemplo 6: Métodos para Fornecer Uma ou Mais Proteínas de Fusão Diferentes para uma Semente, Muda, Planta ou Parte de planta Com Uso de uma Combinação de Múltiplos Endósporos Recombinantes de Paenibacillus, Cada Um Exibindo Uma ou Mais Proteínas de Fusão Diferentes.
[0206] Em certos casos, a entrega de mais de um endósporo de Paenibacillus em combinação, cada um expressando uma ou mais proteínas heterólogas diferentes (como descrito acima) é fornecida. Por exemplo, a entrega de enzimas de fixação de nitrogênio para a área que circunda as raízes de uma planta reduz a necessidade de fertilizantes químicos de nitrogênio. A fixação de nitrogênio em bactérias pode exigir, no mínimo, oito ou nove enzimas diferentes e potencialmente mais de vinte enzimas diferentes dependendo das espécies. Aqui, a entrega de uma combinação de endósporos de Paenibacillus cada um expressando diferentes componentes de enzima da via de fixação de nitrogênio pode ser útil. Por exemplo, os endósporos de Paenibacillus que exibem de modo heterólogo NifH, NifD e NifK podem ser combinados em uma mistura com endósporos de Paenibacillus que exibem de modo heterólogo
NifE, NifN e NifD e entregues para a área que circunda as raízes. Exemplo 7: Métodos para Entregar uma Toxina de Invertebrado que Extermina as Pragas de Planta de Invertebrados para a Área que Circunda uma Semente, Muda, Planta ou Parte de Planta ou como um Tratamento de Semente Com Uso de Endósporos Recombinantes de Paenibacillus.
[0207] As toxinas proteináceas antagonísticas para os invertebrados que incluem, porém sem limitação, insetos ou nematódeos podem ser entregues usando o sistema de endósporo de Paenibacillus. Por exemplo, as toxinas Cry que incluem, porém sem limitação, Cry5B e Cry21A que são tanto insecticidas quanto nematicidas podem ser fusionadas para a sequência de alvejamento N-terminal para expressão em endósporos de Paenibacillus. Os endósporos de Paenibacillus que expressam toxinas Cry ou outras toxinas proteináceas de invertebrados podem ser aplicados como um tratamento de semente ou revestimento de semente ou entregues à área que circunda uma semente, muda, planta ou parte de planta por imersão ou aspersão para proteção contra patógenos invertebrados de planta. Exemplo 8: Métodos para Entregar um Peptídeo, Proteína ou Enzima que é Antagonística Para as Pragas de Planta Bacterianas para a Área que Circunda uma Semente, Muda, Planta ou Parte de Planta ou como um Tratamento de Semente Com uso de Endósporos de Paenibacillus.
[0208] Bacteriocinas são pequenos peptídeos produzidos por bactérias com atividade antagonística para outras bactérias. Devido ao fato de que as bacteriocinas são ribossomicamente sintetizadas como oposto a outras moléculas antimicrobianas (por exemplo, bacitracina), que são sintetizadas por sintetases de peptídeos não ribossomais, bacteriocinas são especialmente bem adequadas para entrega usando o sistema de endósporo de Paenibacillus. A sequência de codificação para uma ou mais bacteriocinas pode ser fusionada à sequência de alvejamento N-terminal para expressão em endósporos de Paenibacillus. Os endósporos de Paenibacillus que expressam bacteriocinas podem ser aplicados como um tratamento de semente ou revestimento de semente ou entregues à área que circunda uma semente, muda, planta ou parte de planta por imersão ou aspersão para proteção contra patógenos de planta bacterianos. Exemplo 9: Métodos para Entregar um Peptídeo, Proteína ou Enzima que é Antagonística Para as Pragas de Planta Fúngicas para a Área que Circunda uma Semente, Muda, Planta ou Parte de Planta ou como um Tratamento de Semente Com uso de Endósporos de Paenibacillus.
[0209] O componente de parede celular primária de fungos é citina. Citinase é uma enzima que degrada citina e pode ser expressa na superfície de endósporos de Paenibacillus para proteger contra patógenos de planta fúngicos destruindo-se suas paredes celulares. Os endósporos de Paenibacillus que expressam citinase podem ser aplicados como um tratamento de semente ou revestimento de semente ou entregues para a área que circunda uma semente, muda, planta ou parte de planta por imersão ou aspersão. Exemplo 10: Métodos para Entregar uma Enzima que Degrada ou Modifica uma Fonte de Nutriente Bacteriano, Fúngico ou Vegetal para a Área que Circunda uma Semente, Muda, Planta ou Parte de Planta ou como um Tratamento de Semente Com Uso de Endósporos de Paenibacillus.
[0210] As enzimas responsáveis pela degradação ou modificação de uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal podem ser entregues às plantas usando endósporos recombinantes de Paenibacillus. Por exemplo, uma hidrolase de glicosídeo que decompõe polissacarídeos complexos pode ser usada para tornar disponível os açúcares simples para rizobactérias benéficas tratando-se uma planta ou semente com endósporos recombinantes de Paenibacillus que expressam essa (ou uma outra) enzima de interesse. Exemplo 11: Métodos para Avaliar as Respostas aos Agentes de Biocontrole Promotores de Crescimento Vegetal Através da Triagem de Bibliotecas de DNA Genômico Derivadas dos Agentes de Biocontrole Promotores de Crescimento Vegetal Com Uso de Endósporos de Paenibacillus.
[0211] Muitas das cepas de biocontrole usadas atualmente são recalcitrantes da absorção de DNA exógeno tornando os pesquisadores incapazes de gerar modificações genéticas alvejadas das citas cepas. Devido a esse desafio, a elucidação do mecanismo de ação dos efeitos promotores de crescimento vegetal dessas cepas de biocontrole é incrivelmente difícil. Os endósporos de Paenibacillus apresentam uma abordagem inovadora para identificar genes específicos responsáveis para os efeitos promotores de crescimento vegetal subjacentes das cepas de biocontrole. Em primeiro lugar, a sequência de alvejamento N-terminal e promotor nativo são clonados em um vetor bifuncional adequado de E. coli/Bacillus (por exemplo, pHP13), resultando em um vetor adequado para expressão de proteína heteróloga em endósporos de Paenibacillus. Todas as etapas de clonagem e propagação de plasmídeo são realizadas em E. coli.
Em seguida, gDNA total é extraído de uma cepa de biocontrole promotora de crescimento vegetal alvo.
O gDNA é cortado em fragmentos (enzimática ou sonicamente) e ligado no vetor descrito acima para expressão de proteínas heterólogas em endósporos de Paenibacillus para gerar uma biblioteca de gDNA compreendida de todo o material genético que se origina da cepa de biocontrole de interesse.
A biblioteca de vetor resultante é introduzida em um membro de Paenibacillus por eletroporação e as bactérias são laminadas nas placas de ágar contendo um agente de seleção de antibiótico apropriado para selecionar transformantes de endósporo de Paenibacillus.
Os transformantes de endósporo individuais de Paenibacillus que expressam, cada um, um fragmento diferente do gDNA da cepa de biocontrole alvo são avaliados para efeitos promotores de crescimento vegetal.
Esses efeitos podem incluir, porém sem limitação, enverdecimento melhorado, germinação aprimorada, vigor de planta aumentado, comprimento de raiz aumentado, massa de raiz aumentada, altura de raiz aumentada, área de folha aumentada ou resistência a pragas.
O vetor em transformantes de endósporo de Paenibacillus que são encontrados para modular os parâmetros de saúde vegetal mencionados acima pode ser sequenciado para identificar os determinantes genéticos que se originam da cepa de biocontrole responsável pelos efeitos promotores de crescimento vegetal observadas.
Exemplo 12: Métodos para Identificar Toxinas Inovadoras ou Não Caracterizadas Antagonísticas Contra Patógenos de Planta de Invertebrados de Planta, Bacterianos e Fúngicos Com Uso de Endósporos de Paenibacillus.
[0212] Muitas das cepas de biocontrole em uso atualmente são recalcitrantes da absorção de DNA exógeno tornando os pesquisadores incapazes de gerar modificações genéticas alvejadas das citas cepas.
Devido a esse desafio, a elucidação do mecanismo de ação pelo qual as cepas de biocontrole são tóxicas para patógenos de planta de invertebrados, bacterianos e fúngicos patógenos de planta é incrivelmente difícil.
Os endósporos de Paenibacillus apresentam uma abordagem inovadora para identificar genes específicos responsáveis para os efeitos protetores de planta subjacentes das cepas de biocontrole.
Em primeiro lugar, a sequência de alvejamento N-terminal e promotor nativo são clonados em um vetor bifuncional adequado de E. coli/Bacillus (por exemplo, pHP13) resultando em um vetor adequado para expressão de proteína heteróloga em endósporos de Paenibacillus.
Todas as etapas de clonagem e propagação de plasmídeo são realizadas em E. coli.
Em seguida, gDNA total é extraído de uma cepa de biocontrole promotora de crescimento vegetal alvo.
O gDNA é cortado em fragmentos (enzimática ou sonicamente) e ligado no vetor descrito acima para expressão de proteínas heterólogas em endósporos de Paenibacillus para gerar uma biblioteca de gDNA compreendida de todo o material genético que se origina da cepa de biocontrole de interesse.
A biblioteca de vetor resultante é introduzida em um membro de Paenibacillus por eletroporação e as bactérias são laminadas nas placas de ágar contendo um agente de seleção de antibiótico apropriado para selecionar transformantes de endósporo de Paenibacillus.
Os transformantes de endósporo individuais de Paenibacillusque expressam, cada um, um fragmento diferente do gDNA da cepa de biocontrole alvo são avaliados para atividade de antagonista para patógenos de planta de invertebrados, bacterianos e fúngicos. O vetor em transformantes de endósporos de Paenibacillus que são encontrados para serem antagonísticos para os patógenos de planta acima pode ser sequenciado para identificar os determinantes genéticos que se originam da cepa de biocontrole responsável pelos efeitos protetores de planta observados. Exemplo 13: Métodos para Tratar uma Semente, Muda, Planta ou Parte de Planta com os Propósitos de Proteger as Plantas dos Patógenos ou Aprimorar a Saúde Vegetal Com Uso de Endósporos de Paenibacillus Não Viáveis.
[0213] Pode haver uma necessidade de entregar proteínas/enzimas promotoras de saúde vegetal ou proteínas/enzimas de proteção de planta usando o sistema de entrega de endósporo de Paenibacillus com endósporos de Paenibacillus não viáveis (mortos). Os endósporos de Paenibacillus podem ser inativados e tornados não viáveis através do tratamento suficiente de calor, luz UV, irradiação gama ou processamento de alta pressão. Os endósporos de Paenibacillus resultantes não viáveis podem ser aplicados como um tratamento de semente ou revestimento de semente ou entregues à área que circunda uma semente, muda, planta ou parte de planta por imersão ou aspersão. Exemplo 14. Protocolo Geral para Preparar Endósporos Recombinantes de Paenibacillus que Exibem Beta-Galactosidase (Β-Gal) de Escherichia coli.
[0214] Para criar construtos de fusão, a codificação genética para β-gal foi fusionada a um segmento de DNA que codifica os aminoácidos da sequência de alvejamento N-
terminal revelada (SEQ ID NO: 1) de Paenibacillus sp.
NRRL B-50972 sob controle do promotor nativo das sequências reveladas de alvejamento N-terminal por síntese genética e clonada em um vetor bifuncional de E. coli/Paenibacillus derivado do vetor pMiniMad descrito em Patrick, JE e Kearns, DB. 2008. MinJ (YvjD) é um Determinante Topológico de Divisão de Célula em Bacillus subtilis.
Molecular Microbiology. 70: 1166-1179. O construto de vetor resultante foi introduzido em uma cepa Paenibacillus polymyxa (Cepa 1) por eletroporação similar àquela descrita por Kim e Timmusk (2013), “A Simplified Method for Gene Knockout and Direct Screening of Recombinant Clones for Application in Paenibacillus polymyxa”, PLoSONE, 8(6): e68092, doi: doi:10.1371/journal.pone.0068092. Também foi preparado um controle que continha o vetor bifuncional sem a sequência de alvejamento.
Os transformantes corretos foram, então, cultivados em caldo de Meio de Esporulação de Schaeffer a 30 ºC até esporulação.
A cultura resultante foi centrifugada para separar o sobrenadante dos esporos.
Os esporos de Paenibacillus polymyxa que expressam o construto de fusão ou que contêm o vetor bifuncional vazio apenas e sobrenadante correspondente foram, então, examinados por ensaio in vitro. β-gal é funcional nos esporos que expressam o construto de fusão à base de hidrólise de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galacto-piranosida (X-Gal). Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 3. Tabela 3. Atividade de beta-galactosidase de sobrenadantes e esporos.
Amostra Hidrólisea de X-Gal Sobrenadante de vetor bifuncional vazio de P. polymyxa - Sobrenadante de sequência-β-galactosidase de alvejamento N-terminal de P. polymyxa - Esporos de vetor bifuncional vazio de P. polymyxa - Esporos de sequência-β-galactosidase-pAP13 de alvejamento N-terminal de P. polymyxa + A hidrólisea de X-gal foi pontuada como (-) para sem cor ou (+) para cor azul denotando a hidrólise de X-gal por β- galactosidase.
Exemplo 15. Protocolo Geral para Preparar Endósporos Recombinantes de Paenibacillus que Exibem proteína Inseticida Vegetativa 3 (Vip3) de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NO: 17).
[0215] Para criar construtos de fusão, a codificação genética para vip3 (SEQ ID NO: 16) foi fusionada a um segmento de DNA que codifica os aminoácidos da sequência de alvejamento N-terminal revelada (SEQ ID NO: 1) de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 por Montagem de Gibson no vetor bifuncional de E. coli/Paenibacillus descrito no Exemplo 14. A expressão da fusão é sob controle do promotor nativo da sequência de alvejamento N-terminal revelada. O construto de vetor resultante foi introduzido em uma cepa Paenibacillus polymyxa (Cepa 1) por eletroporação, como descrito acima. Os transformantes corretos foram, então, cultivados em caldo de Meio de Esporulação de Schaeffer a 30oC até esporulação.
Exemplo 16. Atividade da Cepa Paenibacillus polymyxa que Expressa Vip3 Contra Spodoptera exigua.
[0216] A atividade inseticida da cepa Paenibacillus polymyxa que expressa Vip3, do Exemplo 15, foi avaliada contra Spodotera exigua (larva de beterraba). Um teste de placa de 96 poços foi realizado para testar a atividade inseticida de cada cepa Paenibacillus polymyxa incluindo um controle de vetor vazio e uma carga ativa (SEQ ID NO: 2- Vip3). Os esporos das cepas foram produzidos pelo crescimento das cepas no caldo de Meio de Esporulação de Schaeffer até a esporulação e centrifugação da cultura de caldo integral resultante separar os esporos do sobrenadante. As amostras de esporo das cepas foram, então, aplicadas às microplacas de 96 poços contendo um substrato de ágar similar àquele descrito em Marrone et al., (1985), “Improvements in Laboratory Rearing fo the Southern Corn Rootworm, Diabrotica undecimpuncta howardi Barber (Coleoptera: Chrysomelidae), on an Artificial Diet and Corn”, J. Econ. Entomol., 78: 290-
293. As amostras de esporo foram, então, diluídas em água e aplicadas em concentrações de 100 %, 33 %, 11 %, 3,7 % e 1,2 % às placas.
[0217] Depois que os tratamentos tenham sido deixados a secar, cerca de 20 ovos de Spodotera exigua (larva de beterraba) foram adicionados a cada poço. Vários dias depois, a atividade inseticida foi determinada avaliando-se as pontuações de estatura e pontuações de mortalidade das larvas tratadas. As pontuações de estatura de inseto foram classificadas de acordo com a seguinte escala: 1 = crescimento mínimo drasticamente retardado; 2 = crescimento mínimo altamente retardado; 3 = ligeiramente menor que o controle não tratado; 4 = mesmo tamanho que o controle não tratado. A pontuação de mortalidade de inseto tem como base a seguinte escala: 4 = 0-25 % de mortalidade, 3 = 26-50 % de mortalidade, 2 = 51-79 % de mortalidade, 1 = 80-100 % de mortalidade.
[0218] As larvas Spodotera exigua tratadas com 11 % de esporos de Paenibacillus que expressam Vip3 alvejado (isto é, SEQ ID NO: 2-Vip3) experimentaram estatura 2 vezes maior que aquele tratado com a mesma concentração de esporos de Paenibacillus expressando o vetor vazio (consulte a Tabela 4). De modo similar, as larvas tratadas com 11 % de esporos de Paenibacillus que expressam o Vip3 alvejado experimentaram mortalidade 1,5 vezes maior que aquela tratada com a mesma concentração de esporos de Paenibacillus que expressam o vetor vazio (consulte a Tabela 5). Tabela 4. Classificações de estatura de Spodotera exigua tratada (larva de beterraba). Pontuação de Estatura Taxa de SEQ ID NO:2-Vip3 Vetor Vazio Aplicação Média Erro Padrão Média Erro Padrão 1 1 0 1 0 0,33 1 0 1,7 0,7 0,11 1,5 0,5 3 1 0,037 3,3 0,7 4 0 0,012 4 0 4 0
Tabela 5. Classificações de mortalidade de Spodotera exigua tratada (larva de beterraba). Pontuação de Mortalidade Taxa de SEQ ID NO:2-Vip3 Vetor Vazio Aplicação Média Erro Padrão Média Erro Padrão 1 1 0 1 0 0,33 1 0 1,3 0,3 0,11 1,5 0,5 2,3 0,9 0,037 3,7 0,3 4 0 0,012 4 0 4 0
[0219] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos do presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica a que esta invenção pertence. Todas as publicações, patentes e publicações de patente citadas são incorporadas a título de referência no presente documento em sua totalidade para todos os propósitos.
[0220] Entende-se que a invenção revelada não é limitada à metodologia, protocolos e materiais particulares descritos, visto que esses podem variar. Entende-se também que a terminologia usada no presente documento é apenas para o propósito de descrever as modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[0221] Os versados na técnica observarão, ou poderão verificar com o uso de não mais que a experimentação de rotina, diversos equivalentes das modalidades específicas da invenção descritas neste documento. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES EMENDADAS
    1. Molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão caracterizada por compreender (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal N-terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: (i) uma sequência de polinucleotídeos que tem 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, ou 29; ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos que compreende um fragmento de 5 a 345 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, ou 29.
    2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento começa no primeiro nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, ou 29.
    3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende uma sequência de polinucleotídeos que tem 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 7, 19 ou
    27.
    4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o fragmento codifica os aminoácidos 1-15, ou 1-30, 1- 45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105, ou 1-115 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8.
    5. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N- terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora de crescimento vegetal; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Paenibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora de vegetal.
    6. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender ainda uma terceira sequência de polinucleotídeos que codifica: (a) um polipeptídeo que compreende um sítio de clivagem de protease, em que o polipeptídeo é posicionado entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo que compreende um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo que compreende um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo que compreende um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo que compreende um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
    7. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser ligada operacionalmente a um elemento promotor que é heterólogo à segunda sequência de polinucleotídeos.
    8. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: uma sequência de polinucleotídeos de códon otimizado que tem 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, ou 29; ou um fragmento da mesma.
    9. Proteína de fusão caracterizada por compreender um peptídeo de sinal N-terminal operacionalmente ligado a um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 ou 32; ou (ii) um polipeptídeo que compreende um fragmento de 5 a 115 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 ou 32.
    10. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o fragmento começa no primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31 ou 32.
    11. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que a sequência de polipeptídeos compreende uma sequência que tem 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2, 8, 20, 21, 22, 28, 31 ou 32.
    12. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que o fragmento compreende os aminoácidos 1-15, ou 1-30, 1-45, 1-
    60, 1-75, 1-90, 1-105, ou 1-115 de SEQ ID NO: 2, 8, 31 ou
    32.
    13. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora de crescimento vegetal; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Paenibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora de vegetal.
    14. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, sendo a proteína de fusão caracterizada por compreender ainda: (a) um polipeptídeo contendo um sítio de clivagem de protease, posicionados entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo que compreende um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo que compreende um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo que compreende um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo que compreende um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
    15. Célula recombinante de Paenibacillus caracterizada por compreender um cromossomo bacteriano que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
    16. Vetor isolado caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o vetor compreende um plasmídeo, um cromossomo artificial, ou um vetor viral.
    17. Vetor isolado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender adicionalmente um dos seguintes: (a) um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; ou (b) um polinucleotídeo que codifica uma proteína estimuladora de crescimento vegetal, ligada operacionalmente a uma sequência de controle de expressão.
    18. Célula recombinante de Paenibacillus caracterizada por ser transformada com um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
    19. Célula recombinante de Paenibacillus, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por a célula de Paenibacillus ser uma espécie de Paenibacillus, em que compreende: Paenibacillus sp. NRRL B-50972, Paenibacillus terrae, Paenibacillus polymyxa, ou Paenibacillus peoriae; ou uma bactéria que possui um gene de rRNA 16S que compartilha 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com um gene de rRNA 16S de uma espécie de Paenibacillus.
    20. Método de exibição de uma proteína de fusão heteróloga em uma superfície de esporo de um endósporo de Paenibacillus, sendo o método caracterizado por compreender: a) transformar uma célula de Paenibacillus com um vetor recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-6; e b) expressar a proteína de fusão codificada pela molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10; ou (ii) um fragmento de 5, a 30 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10.
    21. Composição caracterizada por compreender: a) uma célula recombinante de Paenibacillus produtora de endósporo que expressam a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; e b) um agente de controle biológico.
    22. Método de tratamento de uma planta, uma semente, uma parte de planta, ou o solo que circunda a planta caracterizado por ser para melhorar o crescimento vegetal e/ou promover a saúde vegetal compreendendo a etapa de aplicar simultânea ou sequencialmente: a) endósporos recombinantes de Paenibacillus produtores de endósporo que expressam a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que o polipeptídeo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína heterólogo imunoestimuladora ou estimuladora de crescimento vegetal; e b) um agente de controle biológico.
    23. Método de triagem de uma planta hospedeira tratada com um endósporo recombinante de Paenibacillus caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) aplicar uma composição que compreende um endósporo de Paenibacillus modificado para expressar uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, a uma semente, uma muda, ou uma planta vegetativa, para produzir uma semente, muda, ou planta vegetativa tratada; b) triar a semente, muda, ou planta vegetativa tratada pela detecção e medição de um traço, componente, ou atributo da semente, muda, ou planta vegetativa tratada.
    24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a etapa de triagem compreende as seguintes etapas: a) um ensaio in vitro que compreende detectar e quantificar a presença, nível, alteração em nível, atividade, ou localização de um composto contido em um extrato preparado a partir de uma amostra de célula ou tecido obtida a partir da semente, muda, ou planta vegetativa tratada; e/ou b) um ensaio in vivo que compreende detectar e quantificar um traço, componente, ou atributo da semente, muda, ou planta vegetativa tratada.
    25. Método de triagem de proteínas ou peptídeos heterólogos expressados em uma célula de Paenibacillus para propriedades agricolamente significativas caracterizado por compreender:
    a) modificar uma célula de Paenibacillus para expressar uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14 para produzir uma célula recombinante de Paenibacillus; e b) triar a célula de Paenibacillus pela detecção e quantificação de um nível ou atividade de um composto produzido pela célula recombinante de Paenibacillus.
    26. Método de tratamento de uma planta, uma semente, um ser humano, ou um animal, caracterizado por compreender: administrar à planta, semente, humano, ou animal uma composição que compreende um endósporo produzido por uma célula recombinante de Paenibacillus; em que a célula recombinante de Paenibacillus expressa a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, excluindo usos para o tratamento cirúrgico e terapêutico do corpo humano ou animal e métodos de diagnóstico realizados no corpo humano ou animal.
    27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a célula de Paenibacillus não é viável.
    28. Composição caracterizada por compreender uma proteína de fusão isolada e/ou purificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14.
    29. Método de entrega de uma proteína de interesse a uma planta, semente ou campo, caracterizado por compreender: aplicar uma composição que compreende um endósporo recombinante de Paenibacillus a uma planta, semente ou campo; em que o endósporo recombinante de Paenibacillus foi modificado para expressar uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14.
    30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada a um campo: a) pré- ou pós-plantio; b) pré- ou pós-emergência; c) como um pó, suspensão ou solução.
    31. Método para identificar uma sequência de sinal N- terminal caracterizado por compreender: triar um genoma de uma bactéria formadora de endósporo para um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína que tem múltiplas repetições de tripleto similar a colágeno que têm a sequência “GLY-X-X,” em que “X” representa “qualquer aminoácido”; e determinar que uma proteína identificada na etapa de triagem se localiza na superfície de esporo da bactéria formadora de endósporo por microscopia ou experimentalmente.
    32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por compreender adicionalmente identificar uma sequência de sinal N-terminal putativa de uma proteína identificada na etapa de determinação como localizando na superfície de esporo e expressando na bactéria formadora de endósporo uma proteína de fusão que compreende a sequência de sinal N-terminal putativa e um gene repórter.
    33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por compreender adicionalmente selecionar a proteína de fusão com base em expressão da proteína de fusão na superfície de esporo.
    34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por compreender adicionalmente substituir o gene repórter na proteína de fusão que é selecionada com uma sequência de nucleotídeos de interesse para criar uma segunda proteína de fusão e expressar a segunda proteína de fusão na bactéria formadora de endósporo.
    35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado pelo fato de que a bactéria é um membro do gênero Paenibacillus, Viridibacillus, Brevibacillus ou Lysinibacillus.
    36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a bactéria é um membro do gênero Paenibacillus.
    37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizado pelo fato de que a localização é determinada usando microscopia eletrônica de transmissão ou espectrometria de massa.
    38. Molécula de ácido nucleico caracterizada por codificar um peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal compreende: a) um segmento contíguo de 5 a 120 resíduos N-terminais de uma proteína determinada para localização em uma superfície de esporo de uma bactéria formadora de endósporo pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 37; b) uma sequência que tem 70%, 80%, 90%, ou 100% de identidade de sequência com um segmento contíguo de 5 a 120 resíduos N-terminais de uma proteína determinada para localização em uma superfície de esporo de uma bactéria formadora de endósporo pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 37.
    39. Molécula de ácido nucleico caracterizada por codificar uma proteína de fusão que compreende (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal N-terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende a sequência ou segmento conforme definido na reivindicação 38.
    40. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a sequência regulatória a montante que compreende: (a) quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15; (b) uma sequência que compreende um fragmento de 5 a 150 nucleotídeos contíguos de quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15; (c) uma sequência que tem 70%, 80%, 90%, ou 100% de identidade de sequência em comparação com quaisquer dentre SEQ ID NOs: 11-15, ou 5, 15, 25, 50, 100 ou 150 fragmentos de nucleotídeo da mesma; em que a sequência regulatória a montante compreende um promotor que é transcricionalmente ativo durante a esporulação da célula bacteriana.
    41. Molécula de ácido nucleico caracterizada por codificar uma sequência regulatória a montante em que sequência regulatória a montante compreende: (a) qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 11-15; ou (b) uma sequência compreendendo um fragmento de 5 a 150 nucleotídeos contíguos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 11-15; e um promotor que é transcricionalmente ativo durante esporolação da célula bacteriana, e uma proteína de interesse compreendendo:(a) uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência regulatória a montante, ligada operacionalmente a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína de interesse; em que a proteína de interesse é heteróloga à sequência regulatória a montante.
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