CN111630172A - 基于类芽孢杆菌属的内生孢子呈现平台、产品和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了可用于将蛋白质和肽靶向至由类芽孢杆菌属的家族成员产生的内生孢子的表面的信号序列以及使用其的方法。并且同样地提供了使用特定的N端靶向序列及其衍生物在类芽孢杆菌属的家族成员的孢子表面呈现异源分子，例如肽、多肽和其他重组构建体。

Description

基于类芽孢杆菌属的内生孢子呈现平台、产品和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月16日提交的美国临时专利申请号62/587,371的优先权，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
引用电子提交的序列表
通过EFS-Web将序列表的正式副本作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，该文件名称为“BCS179003WO_ST25.txt”的，创建于2018年11月13日，大小为80千字节，并与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文档中的序列表是本说明书的一部分，并且该序列表以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本公开内容总体上涉及内生孢子呈现平台、相关呈现方法、孢子表面靶向序列和包含其的融合蛋白构建体、重组内生孢子组合物以及用于鉴定在类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和其他细菌属中的孢子表面靶向序列的方法，该鉴定方法可用于多种应用，例如将目的异源分子递送至植物、种子或田地。
背景技术
现代农业技术在很大程度上依赖于促进或增强植物健康和生长的组合物，以提高作物的产量和质量。这样的组合物通常包括有机或无机肥料、营养物质和其他促进植物正常生长和发育的化合物。然而，已经充分确定的是，许多这样的组合物的长期或过度使用可能导致负面副作用，例如土壤酸化或土壤中养分平衡的不稳定。而且，过度使用可能导致有害的终产物在为供人类消费而种植的作物中富集。
现代农场通常还依赖于使用多种化学物质(例如，杀虫剂、除草剂、杀菌剂、杀线虫剂和杀真菌剂)来防治害虫，并确保商业化种植作物的高产量。许多这样的化合物表现出广泛的活性，并且在高浓度下可能对人类和动物有害。另外，某些化合物表现出脱靶效应。此外，这些合成化合物中的至少一些是不可生物降解的。近年来，存在着来自消费者对在减少暴露或不暴露合成杀虫剂或杀真菌剂的情况下种植和收获的农产品越来越大的压力。使用合成杀虫剂或杀真菌剂引起的另一个问题是，重复和/或专一地使用往往导致选择出抗性害虫。通常，抗性害虫对具有相同作用模式的其他活性成分也具有交叉抗性。因此，害虫防治组合物和化合物的开发困难且昂贵(例如，由于安全考虑和抗性的迅速发展)。
基因工程方法被用于促进植物生长和/或健康，而不依赖合成化学物质。例如，可以修饰作物以引入或修饰与植物生长和/或健康有关的基因，和/或引入编码天然或合成害虫防治剂的基因。可以使用病毒载体将转基因引入目标植物。近年来，报道称使用细菌将重组蛋白递送至植物取得了部分成功。然而，迄今为止，这种成功在很大程度上局限于芽孢杆菌科(Bacillaceae)的家族成员，更具体地说，局限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，枯草芽孢杆菌是被最充分表征的革兰氏阳性细菌，并且是孢子形成研究的主要细菌模型。枯草芽孢杆菌作为递送和表达平台的关注进一步归因于以下事实：人们已经充分了解了枯草芽孢杆菌的基因组和与蛋白质合成和分泌相关的生物学途径。但是，由于细菌之间的高度遗传多样性，基于枯草芽孢杆菌研究的研究结果通常无法直接转换到芽孢杆菌科的家族内部和外部成员。
因此，尽管已知某些递送异源遗传物质的方法，但是在本领域中需要开发用于此类遗传物质的新的递送和表达平台。
发明内容
本公开内容描述了解决上述需要的方法、组合物和遗传构建体，例如，通过提供一种使用类芽孢杆菌属的孢子形成成员将重组酶和其他目的分子(例如，肽或蛋白质)递送至环境(例如，植物或田地)的新平台等。本公开内容还提供了鉴定类芽孢杆菌属和其他细菌属中的孢子表面靶向序列的方法。
在一方面，本公开内容提供了表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)赋予或修饰植物性状或属性的至少一种异源蛋白或肽(例如，植物生长刺激化合物的产生或活化中所涉及的酶；或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶；杀微生物或抑微生物的化合物；或保护植物免受病原体或害虫侵害的酶、蛋白质或肽)；以及(ii)将融合蛋白定位至类芽孢杆菌属细胞的孢子表面的N端靶向序列。该一般组合物可进一步包含其他组分(例如，促进植物生长和/或健康的组分)。此外，本文公开的方法的具体实施方案提供了赋予或以其他方式修饰植物性状或属性的异源蛋白和肽的高效高通量筛选。
在可选方面，本公开内容提供了一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含：(i)编码N端信号肽的多核苷酸序列；(ii)与SEQ ID NO：1、3、5、7或9具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列；或(iii)包含SEQ ID NO：1、3、5、7或9的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个连续核苷酸的片段的多核苷酸序列；其中所述N端信号肽能够将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。
在另一可选方面，本公开内容提供了一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含：(i)与SEQ ID NO：1、3、5、7或9具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列；或(ii)包含SEQ IDNO：1、3、5、7或9的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个连续核苷酸的片段的多核苷酸序列；其中所述N端信号肽能够将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。
在一些方面，与所述N端信号肽异源的多肽包含：(a)植物生长或免疫刺激蛋白中的至少一种；(b)酶；(c)蛋白质；(d)与类芽孢杆菌属异源的多肽；或(e)治疗性蛋白质。在选择的方面，所述核酸分子进一步包含第三多核苷酸序列，其编码：(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其中所述多肽位于N端信号肽和与N端信号肽异源的多肽之间；(b)包含选择性标记的多肽；(c)包含可视化标记的多肽；(d)包含蛋白质识别/纯化结构域的多肽；或(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接N端信号肽和与该N端信号肽异源的多肽。
在一些方面，类芽孢杆菌属内生孢子是类芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述类芽孢杆菌属种包括：类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.)NRRL B-50972、土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)或皮奥利亚类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)。
在其他方面，类芽孢杆菌属内生孢子是由类芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述类芽孢杆菌属种包括：Paenibacillus abyssi、醋醅类芽孢杆菌(Paenibacillus aceti)、沼泽类芽孢杆菌(Paenibacillus aestuarii)、吃琼脂类芽孢杆菌(Paenibacillusagarexedens)、Paenibacillus agaridevorans、解藻酸类芽孢杆菌(Paenibacillusalginolyticus)、冷泉类芽孢杆菌(Paenibacillus algorifonticola)、居冷泉类芽孢杆菌(Paenibacillus alkaliterrae)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、厌氧生长类芽孢杆菌(Paenibacillusanaericanus)、南极类芽孢杆菌(Paenibacillus antarcticus)、蜜蜂类芽孢杆菌(Paenibacillus apiarius)、Paenibacillus arachidis、阿萨姆类芽孢杆菌(Paenibacillus assamensis)、氮还原类芽孢杆菌(Paenibacillus azoreducens)、固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)、Paenibacillus baekrokdamisoli、巴塞罗那类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)、Paenibacillus barengoltzii、北风类芽孢杆菌(Paenibacillus borealis)、牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)、巴西类芽孢杆菌(Paenibacillus brasilensis)、Paenibacillus camelliae、坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)、粟树类芽孢杆菌(Paenibacillus castaneae)、梓树类芽孢杆菌(Paenibacillus catalpae)、Paenibacillus cathormii、Paenibacilluscavernae、解纤维素类芽孢杆菌(Paenibacillus cellulosilyticus)、纤维素营养型类芽孢杆菌(Paenibacillus cellulositrophicus)、Paenibacillus chartarius、千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、晋州类芽孢杆菌(Paenibacillus chinjuensis)、解几丁质类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus)、软骨素类芽孢杆菌(Paenibacilluschondroitinus)、长安类芽孢杆菌(Paenibacillus chungangensis)、Paenibacilluscineris、Paenibacillus cisolokensis、Paenibacillus contaminans、库氏类芽孢杆菌(Paenibacillus cookii)、黄瓜类芽孢杆菌(Paenibacillus cucumis)、解凝乳类芽孢杆菌(Paenibacillus curdlanolyticus)、内类芽孢杆菌(Paenibacillus daejeonensis)、Paenibacillus darwinianus、Paenibacillus dauci、Paenibacillus dendritiformis、Paenibacillus dongdonensis、Paenibacillus doosanensis、坚韧类芽孢杆菌(Paenibacillus durus)、土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus edaphicus)、爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)、埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)、Paenibacillusendophyticus、Paenibacillus etheri、粪类芽孢杆菌(Paenibacillus faecis)、Paenibacillus favisporus、Paenibacillus ferrarius、Paenibacillus filicis、泉生类芽孢杆菌(Paenibacillus fonticola)、Paenibacillus forsythiae、Paenibacillusfrigoriresistens、Paenibacillus gansuensis、解明胶类芽孢杆菌(Paenibacillusgelatinilyticus)、Paenibacillus ginsengarvi、人参土类芽孢杆菌(Paenibacillusginsengihumi)、人参土地类芽孢杆菌(Paenibacillus ginsengisoli)、冰川类芽孢杆菌(Paenibacillus glacialis)、解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)、解聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glycanilyticus)、戈氏类芽孢杆菌(Paenibacillusgordonae)、草类芽孢杆菌(Paenibacillus graminis)、Paenibacillus granivorans、广州类芽孢杆菌(Paenibacillus guangzhouensis)、或Paenibacillus harenae。
在一些方面，类芽孢杆菌属内生孢子是由类芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述类芽孢杆菌属种包括：Paenibacillus hemerocallicola、Paenibacillus hispanicus、Paenibacillus hodogayensis、大麦类芽孢杆菌(Paenibacillus hordei)、腐殖质类芽孢杆菌(Paenibacillus humicus)、湖南类芽孢杆菌(Paenibacillus hunanensis)、依利诺斯类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)、加米那类芽孢杆菌(Paenibacillusjamilae)、李季伦氏类芽孢杆菌(Paenibacillus jilunlii)、神户类芽孢杆菌(Paenibacillus kobensis)、Paenibacillus koleovorans、Paenibacillus konsidensis、韩国类芽孢杆菌(Paenibacillus koreensis)、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis)、Paenibacillus kyungheensis、乳类芽孢杆菌(Paenibacillus lactis)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)、Paenibacillus lemnae、Paenibacillus lentimorbus、迟缓类芽孢杆菌(Paenibacilluslentus)、辽宁类芽孢杆菌(Paenibacillus liaoningensis)、Paenibacillus lupini、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillusmacquariensis)、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)、苔类芽孢杆菌(Paenibacillus marchantiophytorum)、Paenibacillus marinisediminis、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus massiliensis)、Paenibacillus medicaginis、Paenibacillus mendelii、甲醇类芽孢杆菌(Paenibacillusmethanolicus)、Paenibacillus montaniterrae、Paenibacillus motobuensis、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、Paenibacillus nanensis、食萘类芽孢杆菌(Paenibacillus naphthalenovorans)、鼻白蚁类芽孢杆菌(Paenibacillusnasutitermitis)、嗜线虫类芽孢杆菌(Paenibacillus nematophilus)、烟草类芽孢杆菌(Paenibacillus nicotianae)、海洋沉积物类芽孢杆菌(Paenibacillusoceanisediminis)、Paenibacillus odorifer、Paenibacillus oenotherae、稻类芽孢杆菌(Paenibacillus oryzae)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、Paenibacilluspanacisoli、Paenibacillus panaciterrae、Paenibacillus pasadenensis、解果胶类芽孢杆菌(Paenibacillus pectinilyticus)、Paenibacillus periandrae、或Paenibacillusphoenicis。
在一些方面，类芽孢杆菌属内生孢子是由类芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述类芽孢杆菌属种包括：叶际类芽孢杆菌(Paenibacillus phyllosphaerae)、小立碗藓类芽孢杆菌(Paenibacillus physcomitrellae)、Paenibacillus pini、松树土类芽孢杆菌(Paenibacillus pinihumi)、Paenibacillus pinesoli、Paenibacillus pocheonensis、日本类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)、Paenibacillus populi、Paenibacillusprosopidis、普罗旺斯类芽孢杆菌(Paenibacillus provencensis)、Paenibacilluspueri、Paenibacillus puldeungensis、尘埃类芽孢杆菌(Paenibacillus pulvifaciens)、Paenibacillus purispatii、庆盛类芽孢杆菌(Paenibacillus qingshengii)、Paenibacillus quercus、Paenibacillus radicis、Paenibacillus relictisesami、Paenibacillus residui、Paenibacillus rhizoryzae、Paenibacillus rhizosphaerae、湿地类芽孢杆菌(Paenibacillus rigui)、Paenibacillus riograndensis、Paenibacillusripae、Paenibacillus sabinae、泗川类芽孢杆菌(Paenibacillus sacheonensis)、Paenibacillus salinicaeni、Paenibacillus sanguinis、Paenibacillus sediminis、土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus segetis)、Paenibacillus selenii、还原硒酸盐类芽孢杆菌(Paenibacillus selenitireducens)、Paenibacillus senegalensis、Paenibacillusseptentrionalis、Paenibacillus sepulcri、沈阳类芽孢杆菌(Paenibacillusshenyangensis)、Paenibacillus shirakamiensis、暹罗类芽孢杆菌(Paenibacillussiamensis)、Paenibacillus silagei、Paenibacillus sinopodophylli、Paenibacillussolani、土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus soli)、Paenibacillus sonchi、槐树类芽孢杆菌(Paenibacillus sophorae)、Paenibacillus sputi、星孢类芽孢杆菌(Paenibacillusstellifer)、Paenibacillus susongensis、Paenibacillus swuensis、台中类芽孢杆菌(Paenibacillus taichungensis)、台湾类芽孢杆菌(Paenibacillus taiwanensis)、Paenibacillus tarimensis、Paenibacillus telluris、Paenibacillus terreus、Paenibacillus terrigena、泰国类芽孢杆菌(Paenibacillus thailandensis)、嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)、解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillusthiaminolyticus)、天目山类芽孢杆菌(Paenibacillus tianmuensis)、西藏类芽孢杆菌(Paenibacillus tibetensis)、提蒙类芽孢杆菌(Paenibacillus timonensis)、Paenibacillus tundrae、Paenibacillus turicensis、香蒲类芽孢杆菌(Paenibacillustyphae)、Paenibacillus uliginis、尿类芽孢杆菌(Paenibacillus urinalis)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)、Paenibacillus vini、伤口类芽孢杆菌(Paenibacillusvulneris)、Paenibacillus wenxiniae、Paenibacillus wooponensis、Paenibacilluswoosongensis、Paenibacillus wulumuqiensis、Paenibacillus wynnii、PaenibacillusxanthinilyticuS、新疆类芽孢杆菌(Paenibacillus xinjiangensis)、Paenibacillusxylanexedens、解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)、Paenibacillusxylanisolvens、Paenibacillus yonginensis、云南类芽孢杆菌(Paenibacillusyunnanensis)、Paenibacillus zanthoxyli或Paenibacillus zeae。
在一些方面，核酸分子可操作地连接至与第二多核苷酸序列和类芽孢杆菌属中的至少一个异源的启动子元件。
在一些方面，该第一多核苷酸序列包含：(a)与SEQ ID NO：1、3、5、7或9具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的密码子优化的多核苷酸序列，在相同条件下，与相应的原始SEQ ID NO：1、3、5、7或9相比，其在类芽孢杆菌属内生孢子中以更高的速率或水平表达。
在可选方面，本公开内容提供了一种包含N端信号肽的融合蛋白，所述N端信号肽可操作地连接至与N端信号肽异源的多肽，其中所述N端信号肽包含：(a)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％或80％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(b)包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的至少5、10、15、20、25或30个连续氨基酸的片段的多肽；其中所述N端信号肽能够将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。
在一些方面，与N端信号肽异源的多肽包括：(a)植物生长或免疫刺激蛋白中的至少一种；(b)酶；(c)与类芽孢杆菌属异源的多肽；(d)治疗性蛋白质(例如，抗生素或抗炎蛋白质)；或(e)提供农业重要特性的蛋白质，该农业重要特性包括但不限于：杀虫/抑虫活性，杀菌/抑菌活性，杀真菌/抑真菌活性，植物生长、健康或免疫刺激活性，和/或改善非生物环境的抵抗力。其他农业重要特性包括改善的作物特征，其包括：出苗、作物产量、蛋白质含量、油含量、淀粉含量、更发达的根系、改善的根部生长、改善的根部尺寸维持、改善的根部效率、改善的胁迫耐受性(例如，耐干旱、热、盐、紫外线、水、寒冷)、乙烯减少(减少产生和/或抑制接收)、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、更少的死基生叶、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、色素含量、光合活性、需要更少的输入(例如，肥料或水)、需要更少的种子、更高产的分蘖产量、开花更早、谷粒成熟更早、植物倒逆(倒伏)减少、枝条生长增加、植物活力增强、植物直立性增加以及早且更好的萌芽。
在一些方面，融合蛋白还包含：(a)含有一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，该多肽位于N端信号肽和与N端信号肽异源的多肽之间；(b)包含选择性标记的多肽(例如，赋予抗生素抗性的蛋白质)；(c)包含可视化元件(例如荧光标签，如绿色荧光蛋白(GFP))的多肽；(d)包含至少一种蛋白质识别/纯化结构域(例如，His标签)的多肽；或(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接信号肽和与N端信号肽异源的多肽。
在可选方面，本公开内容提供了一种包含细菌染色体的重组类芽孢杆菌属细胞，该细菌染色体包含前述方面中任一项的核酸分子。
在可选方面，本公开内容提供了一种包含前述方面中任一项的核酸分子的载体，其中所述载体包含质粒、人工染色体或病毒载体。
在一些方面，所述载体进一步包含以下至少一种：(a)在类芽孢杆菌属细胞中提供稳定维持的复制起点；(b)在类芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的复制起点；(c)在类芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的对温度敏感的复制起点；(d)编码选择标记的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列；或(e)编码植物生长刺激蛋白的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列。
在可选方面，本公开内容提供了一种用载体转化的重组类芽孢杆菌属细胞，该载体包含本文公开的任一方面的核酸分子。
在一些方面，类芽孢杆菌属细胞是类芽孢杆菌属种，其包含：类芽孢杆菌属种NRRLB-50972、土地类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或皮奥利亚类芽孢杆菌。在其他示例性方面，类芽孢杆菌属细胞可选自本文所述的任何示例性类芽孢杆菌属种。
在可选方面，本公开内容提供了一种在类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面上呈现异源融合蛋白的方法，该方法包括：a)用重组载体转化能够形成孢子的类芽孢杆菌属细胞，该重组载体包含本文公开的任一方面的核酸分子；以及b)在孢子形成条件下表达由本文公开的任一方面的核酸分子编码的融合蛋白，使得该融合蛋白被靶向至产生自孢子形成的类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面，其中所述N端信号肽包含：(i)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(ii)来自SEQ ID NO：2的至少5、10、15或20个连续氨基酸的片段。
在可选方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含：a)一种或多种表达本文公开的任一方面的融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，其中与N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及b)至少一种生物防治剂；任选地，以协同有效量。
在可选方面，本公开内容提供了用本文公开的任一方面的核酸、融合蛋白、细菌细胞或组合物中的至少一种处理的种子。
在可选方面，本公开内容提供了一种处理植物、种子、植物部位或植物周围土壤以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：同时或依次施用：a)表达本文公开的任一方面的融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属内生孢子，其中与N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及b)至少一种生物防治剂；任选地，以协同有效量。
在可选方面，本公开内容提供了一种筛选用重组类芽孢杆菌属内生孢子处理的寄主植物的方法，其包括以下步骤：a)施用包含经修饰以表达根据本文公开的任一方面的融合蛋白的类芽孢杆菌属内生孢子的组合物至能够被类芽孢杆菌属永久或暂时定殖的种子、幼苗或植物营养体(vegetative plant)，以产生处理的种子、幼苗或植物营养体；b)通过检测和任选地测量处理的种子、幼苗或植物营养体的性状、成分或属性来筛选处理的种子、幼苗或植物营养体。
在一些方面，筛选步骤包括以下一个或多个：a)至少一种包括检测并任选地量化一种或多种化合物的存在、水平、水平变化、活性或定位的体外(in vitro)试验，该一种或多种化合物被包含在由从处理的种子、幼苗或植物营养体获得的细胞或组织样品制备的提取物中；和/或b)至少一种包括检测和任选地量化处理的种子、幼苗或植物营养体的性状、成分或属性的体内(in vivo)试验。
在可选方面，本公开内容提供了一种筛选在类芽孢杆菌属细胞中表达农业重要特性的异源蛋白或肽的方法，其包括：a)修饰类芽孢杆菌属细胞以表达根据本文公开的方面的融合蛋白以产生重组类芽孢杆菌属细胞；以及b)通过检测和任选地量化由重组类芽孢杆菌属细胞产生的化合物的水平或活性来筛选类芽孢杆菌属细胞。
在可选方面，本公开内容提供了一种用于鉴定适合于内生孢子呈现的类芽孢杆菌属和其他细菌属中的孢子表面靶向序列的方法，其包括：筛选类芽孢杆菌属或其他目的内生孢子形成细菌的基因组中编码具有多个“Gly-X-X”(“GXX重复”，其中“X”代表任何氨基酸)胶原样三联体重复的蛋白质的开放阅读框；以及通过显微镜或实验确定蛋白质是否定位至孢子表面。在一些方面，使用透射电子显微镜或质谱分析法确定蛋白质定位。在其他方面，来自定位至孢子表面的蛋白质的假定的N端靶向序列与报告基因融合，并且将得到的融合蛋白在形成内生孢子的细菌中表达。在又其他方面，分析得到的融合蛋白在此类形成内生孢子的细菌的表面上的表达。在另一方面，如果检测到这种表达，则将报告基因替换为目的核苷酸序列，并且将这种第二融合蛋白在形成内生孢子的细菌中表达。
在一些方面，本公开内容提供了来自类芽孢杆菌属和其他细菌属的孢子表面靶向序列，其包含通过前述方法鉴定的蛋白质的N端靶向序列。该N端靶向序列可包含蛋白质的前5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110或120个氨基酸，或其片段或变体。在一些方面，该N端靶向序列是与内源N端靶向序列至少60％、70％、80％、90％或95％相同的变体。使用这些方法鉴定的类芽孢杆菌属和其他细菌属中的孢子表面靶向序列可以用于产生根据本文所述的各种实施方案中的任一种的异源融合蛋白。
在选择的方面，所述组合物已经被热灭活或灭菌，使得无活力的类芽孢杆菌属细胞保留。
在可选方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含根据本文公开的任一方面的分离的和/或纯化的融合蛋白。
在可选方面，本公开内容提供了一种将目的蛋白递送至植物、种子或田地的方法，包括：将包含重组类芽孢杆菌属内生孢子的组合物施用于植物、种子或田地；其中所述重组类芽孢杆菌属内生孢子已被修饰以表达根据本文公开的任一方面的融合蛋白。
在一些方面，所述组合物被施用于田地：a)种植前或种植后；b)出苗前或出苗后；c)作为粉末，悬浮液或溶液；或d)其中所述组合物进一步包含一种或多种刺激植物生长的其他化合物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与该N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中第一多核苷酸序列包含：(i)包含至少15、30、45、60、75或90个核苷酸的多核苷酸序列；(ii)与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列；或(iii)包含SEQ 1D NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29的至少45、90、135、180、225、270、315或345个连续核苷酸的片段的多核苷酸序列；其中该N端信号肽能够将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。
在一方面，所述片段起始于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29的第一个核苷酸。在另一方面，所述第一多核苷酸序列包含与SEQ 1D NO：1、7、19或27具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列。在另一方面，所述片段编码SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：8的氨基酸1-15或1-30、1-45、1-60、1-75、1-90、1-105或1-115。
在一实施方案中，与N端信号肽异源的多肽包括：(a)植物生长刺激蛋白；(b)酶；(c)蛋白质；(d)与类芽孢杆菌属异源的多肽；(e)治疗性蛋白质；或(f)植物免疫刺激蛋白。
在另一实施方案中，所述核酸进一步包含第三多核苷酸序列，其编码：(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其中该多肽位于N端信号肽和与该N端信号肽异源的多肽之间；(b)包含选择性标记的多肽；(c)包含可视化标记的多肽；(d)包含蛋白质识别/纯化结构域的多肽；或(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接N端信号肽和与该N端信号肽异源的多肽。
在又另一实施方案中，类芽孢杆菌属内生孢子是由类芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述类芽孢杆菌属种包括：类芽孢杆菌属种NRRL B-50972，土地类芽孢杆菌，多粘类芽孢杆菌或皮奥利亚类芽孢杆菌；或由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，该16SrRNA基因与类芽孢杆菌属种的16S rRNA基因有至少97、98或99％的同一性。
在一方面，所述核酸分子可操作地连接至与第二多核苷酸序列和类芽孢杆菌属中的至少一个异源的启动子元件。
在另一方面，第一多核苷酸序列包含：与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的密码子优化的多核苷酸序列；或其片段，在相同条件下，与相应的未优化序列相比，所述多核苷酸序列或其片段在类芽孢杆菌属内生孢子中以更高的速率或水平表达。
在又另一方面，本发明涉及一种包含N端信号肽的融合蛋白，所述N端信号肽可操作地连接至与N端信号肽异源的多肽，其中所述N端信号肽包含：(i)包含至少15、30、45、60、75、90、105或115个残基的多肽；(ii)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、18、20、21、22、24、26、28、30、31或32的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(iii)包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、18、20、21、22、24、26、28、30、31或32的至少15、30、45、60、75、90、105或115个连续氨基酸的片段的多肽；其中所述N端信号肽能够将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。
在一实施方案中，所述片段起始于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、18、20、21、22、24、26、28、30、31或32的第一个氨基酸。在另一实施方案中，所述多肽序列包含与SEQ ID NO：2、8、20、21、22、28、31或32具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的序列。在又另一实施方案中，所述片段包含SEQ ID NO：2、8、31或32的氨基酸1-15或1-30、1-45、1-60、1-75、1-90、1-105或1-115。
在一些方面，与N端信号肽异源的多肽包括：(a)植物生长刺激蛋白；(b)酶；(c)蛋白质；(d)与类芽孢杆菌属异源的多肽；(e)治疗性蛋白质；或(f)植物免疫刺激蛋白。
在其他方面，所述融合蛋白进一步包含：(a)含有一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其位于N端信号肽和与N端信号肽异源的多肽之间；(b)包含选择性标记的多肽；(c)包含可视化标记的多肽；(d)包含至少一个蛋白质识别/纯化结构域的多肽；或(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接信号肽和与N端信号肽异源的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含细菌染色体的重组类芽孢杆菌属细胞，该细菌染色体包含本文公开的核酸分子。
在其他实施方案中，本发明涉及一种包含本文公开的核酸分子的载体，其中所述载体包括质粒、人工染色体或病毒载体。在一方面，所述载体进一步包含以下至少一种：(a)在类芽孢杆菌属细胞中提供稳定维持的复制起点；(b)在类芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的复制起点；(c)在类芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的对温度敏感的复制起点；(d)编码选择标记的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列；或(e)编码植物生长刺激蛋白的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列。
在又其他实施方案中，本发明提供了用包含本文公开的核酸分子的载体转化的重组类芽孢杆菌属细胞。在一方面，所述重组类芽孢杆菌属细胞是类芽孢杆菌属种，其包含：类芽孢杆菌属种NRRL B-50972，土地类芽孢杆菌，多粘类芽孢杆菌或皮奥利亚类芽孢杆菌；或具有16S rRNA基因的细菌，该16S rRNA基因与类芽孢杆菌属种的16S rRNA基因具有至少97、98或99％同一性。
在一些方面，本发明提供了一种在类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面上呈现异源融合蛋白的方法，所述方法包括：a)用重组载体转化能够形成孢子的类芽孢杆菌属细胞，该重组载体包含本文公开的核酸分子；以及b)在孢子形成条件下表达由本文公开的核酸分子编码的融合蛋白，使得该融合蛋白被靶向至产生自孢子形成的类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面，其中所述N端信号肽包含：(i)包含至少5、10、15、20、25或30个残基的多肽；(ii)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(iii)SEQ ID NO：2、4、6、8或10的至少5、10、15、20、25或30个连续氨基酸的片段。
在一实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含：a)一种或多种表达本文公开的融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，其中与N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及b)至少一种生物防治剂；任选地，以协同有效量。
在又另一实施方案中，本发明提供了用本文公开的核酸、本文公开的融合蛋白、本文公开的重组细菌细胞或本文公开的组合物处理的种子。
在一方面，本发明提供了一种处理植物、种子、植物部位或植物周围土壤以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：同时或依次施用：a)表达本文公开的融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属内生孢子，其中与N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及b)至少一种生物防治剂；任选地，以协同有效量。
在另一方面，本发明涉及一种筛选用重组类芽孢杆菌属内生孢子处理的寄主植物的方法，其包括以下步骤：a)施用包含经修饰以表达本文公开的融合蛋白的类芽孢杆菌属内生孢子的组合物至能够被类芽孢杆菌属永久或暂时定殖的种子、幼苗或植物营养体，以产生处理的种子、幼苗或植物营养体；b)通过检测和任选地测量处理的种子、幼苗或植物营养体的性状，成分或属性来筛选处理的种子、幼苗或植物营养体。
在一些实施方案中，筛选步骤包括以下一个或多个：a)包括检测并任选地量化一种或多种化合物的存在、水平、水平变化、活性或定位的至少一种体外试验，该一种或多种化合物被包含在由从处理的种子，幼苗或植物营养体获得的细胞或组织样品制备的提取物中；和/或b)包括检测和任选地量化处理的种子、幼苗或植物营养体的性状、成分或属性的至少一种体内试验。
在一方面，本发明涉及一种筛选在类芽孢杆菌属细胞中表达农业重要特性的异源蛋白或肽的方法，其包括：a)修饰类芽孢杆菌属细胞以表达本文公开的融合蛋白以产生重组类芽孢杆菌属细胞；以及b)通过检测和任选地量化由重组类芽孢杆菌属细胞产生的化合物的水平或活性来筛选类芽孢杆菌属细胞。
还提供了一种处理植物、种子、人或动物的方法，其包括：向植物、种子、人或动物给予包含由重组类芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子的组合物；其中所述重组类芽孢杆菌属细胞表达本文公开的融合蛋白。
在一些方面，所述组合物已经被热灭活或灭菌，使得无活力的类芽孢杆菌属细胞保留。
在其他方面，本发明涉及一种组合物，其包含根据本文公开的分离的和/或纯化的融合蛋白。
在一实施方案中，本发明提供了一种将目的蛋白递送至植物、种子或田地的方法，其包括：将包含重组类芽孢杆菌属内生孢子的组合物施用于植物、种子或田地；其中所述重组类芽孢杆菌属内生孢子已被修饰以表达本文公开的融合蛋白。
在某些方面，所述组合物被施用于田地：a)种植前或种植后；b)出苗前或出苗后；c)作为粉末、悬浮液或溶液；和/或d)其中所述组合物进一步包含一种或多种刺激植物生长或保护植物免受害虫侵害的其他化合物。
在一特定实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定能够将蛋白质靶向至形成内生孢子的细菌的孢子表面的N端信号序列的方法，其包括：筛选形成内生孢子的细菌的基因组中至少一个开放阅读框，该开放阅读框编码具有多个胶原样三联体重复的蛋白质，该胶原样三联体重复具有序列“GLY-X-X”，其中“X”代表任何氨基酸；以及通过显微镜或实验确定在筛选步骤中鉴定出的至少一种蛋白质定位至形成内生孢子的细菌的孢子表面。
在一方面，形成内生孢子的细菌包括具有蛋白水解抗性的毛发状结构。在另一方面，该方法进一步包括：鉴定来自至少一种在确定步骤中鉴定为定位至孢子表面的蛋白质的假定的N端信号序列，并在形成内生孢子的细菌中表达包含假定的N端信号序列与报告基因的融合蛋白。
在另一方面，所述方法进一步包括：基于融合蛋白在孢子表面上的表达来选择融合蛋白。在又另一方面，所述方法进一步包括：用目的核苷酸序列替换选择的融合蛋白中的报告基因以产生第二融合蛋白，并在形成内生孢子的细菌中表达第二融合蛋白。
在一些实施方案中，所述细菌是类芽孢杆菌属、绿芽孢杆菌属(Viridibacillus)、短小芽孢杆菌属(Brevibacillus)或赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)的成员。在一实施方案中，所述细菌是类芽孢杆菌属的成员。
在一些方面，使用透射电子显微镜或质谱分析法确定定位。
在其他方面，本发明涉及一种编码N端信号肽的核酸分子，其中所述信号肽包含：a)蛋白质的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120个N端残基的连续区段，通过本文公开的方法确定该蛋白质定位至形成内生孢子的细菌的孢子表面；b)与蛋白质的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120个N端残基的连续区段具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的序列，通过本文公开的方法确定该蛋白质定位至形成内生孢子的细菌的孢子表面；其中当在细菌中表达时，所述区段或序列能够将包含该区段或序列的融合蛋白靶向至形成内生孢子的细菌的孢子表面。
在又其他方面，本发明提供了一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含本文公开的序列或区段，并且所述N端信号肽能够将融合蛋白靶向至细菌内生孢子的孢子表面。
在一方面，所述核酸分子进一步包含上游调控序列，该上游调控序列在细菌细胞的孢子形成过程中引起融合蛋白的转录。在一个实施方案中，细菌细胞是类芽孢杆菌属的家族成员。
在一些实施方案中，所述上游调控序列包含：(a)SEQ ID NO：11-15中的任一个；(b)包含SEQ ID NO：11-15中的任一个的至少25、50、100、150个连续核苷酸的片段的序列；(c)与SEQ ID NO：11-15中的任一个或其25、50、100或150个核苷酸片段相比具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的序列；其中所述上游调控序列包含在细菌细胞的孢子形成过程中具有转录活性的启动子。
在又其他实施方案中，本发明提供了一种编码上游调控序列和目的蛋白质的核酸分子，其包含：(a)编码上游调控序列的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码目的蛋白质的第二多核苷酸序列；其中所述目的蛋白质与所述上游调控序列是异源的，并且所述上游调控序列在细菌细胞的孢子形成过程中引起所述目的蛋白质的转录。在一方面，细菌细胞是类芽孢杆菌属的家族成员。
在另一方面，所述上游调控序列包含：(a)SEQ ID NO：11-15中的任一个；(b)包含SEQ ID NO：11-15中的任一个的至少25、50、100或150个连续核苷酸的片段的序列；(c)与SEQ ID NO：11-15中的任一个或其25、50、100或150个核苷酸片段相比具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的序列；其中所述上游调节序列包含在细菌细胞的孢子形成过程中具有转录活性的启动子。
附图说明
图1描绘了类芽孢杆菌属NRRL B-50972内生孢子的透射电子显微照片。示出了由胶原样蛋白构成的毛发状结构从内生孢子表面延伸，并且其中一个这样的结构由箭头表示。
图2A描绘了类芽孢杆菌属NRRL B-50972内生孢子的相差显微照片(左)和落射荧光显微照片(右)(放大1000倍)，该类芽孢杆菌属NRRL B-50972内生孢子表达根据本公开内容的示例性N端靶向序列，特别是(SEQ ID NO：2)-GFP融合蛋白构建体，其定位至内生孢子表面，如图所示。右图中由GFP蛋白产生的荧光与左图的由相差显微镜观察到的细胞图像相对应，表明GFP正确定位至内生孢子表面。
图2B描绘了类芽孢杆菌属NRRL B-50972内生孢子的流式细胞术直方图，该类芽孢杆菌属NRRL B-50972内生孢子表达根据本公开内容的示例性N端靶向序列，特别是(SEQ IDNO：2)-GFP融合蛋白构建体，其定位至内生孢子表面(阴影区域)。示出了未观察到GFP荧光的野生型类芽孢杆菌属NRRL B-50972内生孢子，用于比较(空心，虚线区域)。此图上每个孢子群显示10,000个事件(event)。
图3描绘了根据本公开内容的示例性孢子表面靶向序列SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：8的N端部分的局部序列比对。比对下方显示共有序列(SEQ ID NO：32)。
具体实施方式
本公开内容提供了能够将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属孢子表面的遗传构建体，以及组合物和使用这些构建体将目的异源分子(例如，肽、蛋白质)递送至各种环境(例如，植物)的方法。例如，在用重组类芽孢杆菌属内生孢子处理之后，可筛选处理的植物，以检测归因于由类芽孢杆菌属内生孢子递送的异源蛋白的变化。这些变化可能包括：寄主植物的生长速率或产量发生变化；增强的植物健康(例如，对环境胁迫、病害或害虫的抵抗)；以及与没有使用重组类芽孢杆菌属内生孢子处理的相同条件下生长的寄主植物相比，呈现出增强的、修饰的或其他新属性。有效地将异源蛋白靶向至孢子表面的靶向序列的使用还提供了用于高通量筛选有用异源蛋白的平台，例如，所述有用异源蛋白能够增强、修饰和/或赋予新的植物性状或属性。
典型的孢子形成过程(基于使用枯草芽孢杆菌的研究阐明)涉及营养细胞的不对称细胞分裂以形成母细胞和前孢子，其发展为由中间隔膜隔开的两个不同的隔室。最终，隔膜中的肽聚糖被降解，并且前孢子被母细胞吞没，在细胞内形成细胞。母细胞和前孢子之间的细胞间通讯协调了每个细胞中细胞特异性基因的表达，从而导致了内生孢子特异性化合物的产生、前孢子周围皮层(cortex layer)的形成以及壳(coat)的沉积。
在某些芽孢杆菌属种中，例如，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)，该壳将继续成为内生孢子的最外层。前孢子经过最后的脱水并成熟变成完整的内生孢子。随后，母细胞通过程序性细胞死亡而降解，导致内生孢子释放到环境中。然后，内生孢子通常将保持休眠状态，直到更有利的条件或特定刺激触发萌发并回到营养状态。
作为孢子与环境之间的最外层表面，壳层(coat layer)起到许多关键作用。特别地，该层充当环境侵害的半渗透屏障，并调节与周围环境的相互作用，因此在维持孢子的活力和感测触发内生孢子萌发的条件中起着重要的作用。壳层还是临床研究的目标，因为它包含有助于寄主免疫细胞识别的细菌致病菌株的细胞表面分子。在枯草芽孢杆菌的孢子壳上呈现异源蛋白的方法已经被开发，该方法使用了包含将枯草芽孢杆菌孢子壳蛋白(sporecoat protein)(例如CotC)融合到目的蛋白质的融合蛋白构建体。但是，类芽孢杆菌属的孢子表面蛋白是未知的，因此使用枯草芽孢杆菌进行的研究未能就融合蛋白如何被靶向至其他细菌属(例如，类芽孢杆菌属)的孢子表面提供指导。
相反，本公开内容提供了能够将融合蛋白构建体靶向至类芽孢杆菌属细胞的孢子表面的N端构建体和包含其的融合蛋白。用于将融合蛋白靶向至孢子表面的N端信号序列可包含具有如SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的序列的多肽。或者，在选择的实施方案中，该N端信号序列可包含足以保留孢子表面靶向功能的SEQ ID NO：2、4、6、8或10的片段或变体。例如，该片段可包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的前10、15、20、25或30个氨基酸。进一步的可选方面包括由包含SEQ ID NO：1、3、5、7或9的核苷酸序列的核酸编码的N端信号序列，或其片段或变体。这些和其他实施方案在本文中描述。
遍及本公开内容，术语“包含(comprise)”或其任何派生词(例如，包含(comprising，comprises)可以用“基本上由……组成”、“由……组成”或其适用的相应派生词替换。
如本文所用，“类芽孢杆菌属”是指分类为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的产内生孢子的细菌。该术语包括但不限于各种类芽孢杆菌属的家族成员，其包括类芽孢杆菌属种NRRL B-50972、Paenibacillus abyssi、醋醅类芽孢杆菌(Paenibacillus aceti)、沼泽类芽孢杆菌(Paenibacillus aestuarii)、吃琼脂类芽孢杆菌(Paenibacillusagarexedens)、Paenibacillus agaridevorans、解藻酸类芽孢杆菌(Paenibacillusalginolyticus)、冷泉类芽孢杆菌(Paenibacillus algorifonticola)、居冷泉类芽孢杆菌(Paenibacillus alkaliterrae)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、厌氧生长类芽孢杆菌(Paenibacillusanaericanus)、南极类芽孢杆菌(Paenibacillus antarcticus)、蜜蜂类芽孢杆菌(Paenibacillus apiarius)、Paenibacillus arachidis、阿萨姆类芽孢杆菌(Paenibacillus assamensis)、氮还原类芽孢杆菌(Paenibacillus azoreducens)、固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)、Paenibacillus baekrokdamisoli、巴塞罗那类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)、Paenibacillus barengoltzii、北风类芽孢杆菌(Paenibacillus borealis)、牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)、巴西类芽孢杆菌(Paenibacillus brasilensis)、Paenibacillus camelliae、坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)、粟树类芽孢杆菌(Paenibacillus castaneae)、梓树类芽孢杆菌(Paenibacillus catalpae)、Paenibacillus cathormii、Paenibacilluscavernae、解纤维素类芽孢杆菌(Paenibacillus cellulosilyticus)、纤维素营养型类芽孢杆菌(Paenibacillus cellulositrophicus)、Paenibacillus chartarius、千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、晋州类芽孢杆菌(Paenibacillus chinjuensis)、解几丁质类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus)、软骨素类芽孢杆菌(Paenibacilluschondroitinus)、长安类芽孢杆菌(Paenibacillus chungangensis)、Paenibacilluscineris、Paenibacillus cisolokensis、Paenibacillus contaminans、库氏类芽孢杆菌(Paenibacillus cookii)、Paenibacillus cucumis、解凝乳类芽孢杆菌(Paenibacilluscurdlanolyticus)、内类芽孢杆菌(Paenibacillus daejeonensis)、Paenibacillusdarwinianus、Paenibacillus dauci、Paenibacillus dendritiformis、Paenibacillusdongdonensis、Paenibacillus doosanensis、坚韧类芽孢杆菌(Paenibacillus durus)、土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus edaphicus)、爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillusehimensis)、埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)、Paenibacillus endophyticus、Paenibacillus etheri、粪类芽孢杆菌(Paenibacillus faecis)、Paenibacillusfavisporus、Paenibacillus ferrarius、Paenibacillus filicis、泉生类芽孢杆菌(Paenibacillus fonticola)、Paenibacillus forsythiae、Paenibacillusfrigoriresistens、Paenibacillus gansuensis、解明胶类芽孢杆菌(Paenibacillusgelatinilyticus)、Paenibacillus ginsengarvi、人参土类芽孢杆菌(Paenibacillusginsengihumi)、人参土地类芽孢杆菌(Paenibacillus ginsengisoli)、冰川类芽孢杆菌(Paenibacillus glacialis)、解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)、解聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glycanilyticus)、戈氏类芽孢杆菌(Paenibacillusgordonae)、草类芽孢杆菌(Paenibacillus graminis)、Paenibacillus granivorans、广州类芽孢杆菌(Paenibacillus guangzhouensis)、Paenibacillus harenae、Paenibacillushemerocallicola、Paenibacillus hispanicus、Paenibacillus hodogayensis、大麦类芽孢杆菌(Paenibacillus hordei)、腐殖质类芽孢杆菌(Paenibacillus humicus)、湖南类芽孢杆菌(Paenibacillus hunanensis)、依利诺斯类芽孢杆菌(Paenibacillusillinoisensis)、加米那类芽孢杆菌(Paenibacillusjamilae)、李季伦氏类芽孢杆菌(Paenibacillus jilunlii)、神户类芽孢杆菌(Paenibacillus kobensis)、Paenibacilluskoleovorans、Paenibacillus konsidensis、韩国类芽孢杆菌(Paenibacilluskoreensis)、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)、Paenibacilluskyungheensis、牛奶类芽孢杆菌(Paenibacillus lactis)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)、Paenibacilluslemnae、Paenibacillus lentimorbus、迟缓类芽孢杆菌(Paenibacillus lentus)、辽宁类芽孢杆菌(Paenibacillus liaoningensis)、Paenibacillus lupini、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillusmacquariensis)、苔类芽孢杆菌(Paenibacillus marchantiophytorum)、Paenibacillusmarinisediminis、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus massiliensis)、Paenibacillusmedicaginis、Paenibacillus mendelii、甲醇类芽孢杆菌(Paenibacillusmethanolicus)、Paenibacillus montaniterrae、Paenibacillus motobuensis、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、Paenibacillus nanensis、食萘类芽孢杆菌(Paenibacillus naphthalenovorans)、鼻白蚁类芽孢杆菌(Paenibacillusnasutitermitis)、嗜线虫类芽孢杆菌(Paenibacillus nematophilus)、烟草类芽孢杆菌(Paenibacillus nicotianae)、海洋沉积物类芽孢杆菌(Paenibacillusoceanisediminis)、Paenibacillus odorifer、Paenibacillus oenotherae、稻类芽孢杆菌(Paenibacillus oryzae)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、Paenibacilluspanacisoli、Paenibacillus panaciterrae、Paenibacillus pasadenensis、Paenibacillus pectinilyticus、Paenibacillus periandrae、或Paenibacillusphoenicis、叶际类芽孢杆菌(Paenibacillus phyllosphaerae)、小立碗藓类芽孢杆菌(Paenibacillus physcomitrellae)、Paenibacillus pini、松树土类芽孢杆菌(Paenibacillus pinihumi)、Paenibacillus pinesoli、Paenibacillus pocheonensis、日本类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)、Paenibacillus populi、Paenibacillusprosopidis、普罗旺斯类芽孢杆菌(Paenibacillus provencensis)、Paenibacilluspueri、Paenibacillus puldeungensis、尘埃类芽孢杆菌(Paenibacillus pulvifaciens)、Paenibacillus purispatii、庆盛类芽孢杆菌(Paenibacillus qingshengii)、Paenibacillus quercus、Paenibacillus radicis、Paenibacillus relictisesami、Paenibacillus residui、Paenibacillus rhizoryzae、Paenibacillus rhizosphaerae、湿地类芽孢杆菌(Paenibacillus rigui)、Paenibacillus riograndensis、Paenibacillusripae、Paenibacillus sabinae、泗川类芽孢杆菌(Paenibacillus sacheonensis)、Paenibacillus salinicaeni、Paenibacillus sanguinis、Paenibacillus sediminis、土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus segetis)、Paenibacillus selenii、还原硒酸盐类芽孢杆菌(Paenibacillus selenitireducens)、Paenibacillus senegalensis、Paenibacillusseptentrionalis、Paenibacillus sepulcri、沈阳类芽孢杆菌(Paenibacillusshenyangensis)、Paenibacillus shirakamiensis、暹罗类芽孢杆菌(Paenibacillussiamensis)、Paenibacillus silagei、Paenibacillus sinopodophylli、Paenibacillussolani、土壤类芽孢杆菌
(Paenibacillus soli)、Paenibacillus sonchi、槐树类芽孢杆菌(Paenibacillus sophorae)、Paenibacillus sputi、星孢类芽孢杆菌(Paenibacillusstellifer)、Paenibacillus susongensis、Paenibacillus swuensis、台中类芽孢杆菌(Paenibacillus taichungensis)、台湾类芽孢杆菌(Paenibacillus taiwanensis)、Paenibacillus tarimensis、Paenibacillus telluris、土地类芽孢杆菌(Paenibacillusterrae)、Paenibacillus terreus、Paenibacillus terrigena、泰国类芽孢杆菌(Paenibacillus thailandensis)、嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)、解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)、天目山类芽孢杆菌(Paenibacillustianmuensis)、西藏类芽孢杆菌(Paenibacillus tibetensis)、提蒙类芽孢杆菌(Paenibacillus timonensis)、Paenibacillus tundrae、Paenibacillus turicensis、香蒲类芽孢杆菌(Paenibacillus typhae)、Paenibacillus uliginis、尿类芽孢杆菌(Paenibacillus urinalis)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)、Paenibacillusvini、伤口类芽孢杆菌(Paenibacillus vulneris)、Paenibacillus wenxiniae、Paenibacillus wooponensis、Paenibacillus woosongensis、Paenibacilluswulumuqiensis、Paenibacillus wynnii、Paenibacillus xanthinilyticus、新疆类芽孢杆菌(Paenibacillus xinjiangensis)、Paenibacillus xylanexedens、解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)、Paenibacillus xylanisolvens、Paenibacillusyonginensis、云南类芽孢杆菌(Paenibacillus yunnanensis)、Paenibacilluszanthoxyli或Paenibacillus zeae。
在某些方面，用于表达融合蛋白的类芽孢杆菌属的成员是类芽孢杆菌属种NRRLB-50972，一种从土壤中分离出来的革兰氏阳性、需氧和形成孢子的细菌。类芽孢杆菌属NRRL B-50972的样品根据布达佩斯条约于2014年8月28日保藏在美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)，其地址是：美国伊利诺斯州，皮奥里亚市，北部大学街1815号，美国农业部农业研究服务局，农业应用研究国家中心，邮编61604。由于对类芽孢杆菌属孢子的基本组成或结构普遍缺乏了解，因此在该层形成过程中将蛋白质靶向至孢子表面的过程知之甚少。
在某些方面，用于表达融合蛋白的类芽孢杆菌属的成员是具有16S rRNA基因的细菌，该16S rRNA基因与类芽孢杆菌属种NRRL B-50972或本文公开的任何其他示例性类芽孢杆菌属的家族成员的16S rRNA基因有至少97、98或99％的同一性。或者，用于表达融合蛋白的类芽孢杆菌属的成员是这样的细菌，即其与类芽孢杆菌属种NRRL B-50972或本文公开的任何其他示例性类芽孢杆菌属的家族成员的DNA-DNA杂交值为至少70％。在另一种情况下，用于表达融合蛋白的类芽孢杆菌属的成员是这样的细菌，即其与类芽孢杆菌属种NRRL B-50972或本文公开的任何其他示例性类芽孢杆菌属的家族成员的平均核苷酸同一性为95、96、97、98或99％。
术语“N端信号序列”通常是指位于多肽的氨基末端处或附近的多肽序列，其引导多肽定位至亚细胞隔室或用于分泌。应了解并理解，根据上下文，该术语可以与术语“N端靶向序列(N-terminal targeting sequence)”、“靶向序列(targeting sequence)”、“信号序列(signal sequence)”和“信号肽(signal peptide)”可互换使用。N端信号序列可以作为成熟蛋白的多肽序列的一部分保留，或者在定位过程中或之后进行切割。该术语可用于特别指位于多肽的氨基末端处或附近的多肽序列，其引导多肽定位至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。在这种情况下，N端信号序列的唯一需要的功能是将多肽(N端信号序列是该多肽的一部分)靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面的能力。
“植物”或“寄主植物”包括具有类芽孢杆菌属可定殖的根际或叶际的任何植物，以及可用作类芽孢杆菌属的细菌的临时寄主的植物。定殖不是本文所述的方法和组合物起作用的必要条件，尽管在本公开内容的某些方面可能是优选的。
如本文所用，“生物防治”定义为通过使用第二生物体或生物分子防治病原体和/或昆虫和/或螨和/或线虫。已知的生物防治机制包括通过与真菌竞争根部表面空间或营养而胜出来控制根腐病的细菌。细菌毒素，例如抗生素，已被用于控制病原体。可以分离毒素并将其直接施用于植物，或者可以施用细菌种使其原位(in situ)产生毒素。进行生物防治的其他手段包括施用某些真菌，其产生针对目标植物病原体、昆虫、螨虫或线虫的活性成分或攻击目标害虫/病原体。“生物防治”还可以包括对植物健康、生长、活力、胁迫响应或产量具有有益作用的微生物。施用途径包括喷雾施用、土壤施用和种子处理。
“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残基的碱基间的氢键合稳定。氢键合可通过Watson-Crick碱基配对，Hoogstein结合或以任何其他序列特异的方式出现。所述复合物可包括形成双链结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，可自杂交的单链或它们的任何组合。杂交反应可以在不同的“严格”条件下进行。通常，低严格杂交反应在约40℃下在10x SSC中或等同的离子强度/温度的溶液中进行。中严格杂交通常是在6x SSC中约50℃下进行，以及高严格杂交反应通常是在1x SSC中在约60℃下进行。
如本文所用，术语“序列同一性”是指在比较窗口中两个多核苷酸或氨基酸序列相同的程度(即分别基于核苷酸-核苷酸或残基-残基)。通过以下步骤来计算序列同一性百分比：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中相同核酸碱基(例如，多核苷酸序列的A、T、C、G)出现的位置的数量，以产生匹配的位置数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，然后将结果乘以100得出序列同一性的百分比。可以通过比较两个比对的氨基酸序列来进行等效计算。
关于氨基酸序列的比较，除了测量序列同一性外，比较还可以考虑残基变化是否构成“保守”置换。保守氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺基的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
N端靶向序列
本公开内容提供了来自类芽孢杆菌属的细菌的N端靶向序列。在胁迫的环境条件下，类芽孢杆菌属的家族细菌经历孢子形成并形成可以长时间保持休眠的内生孢子。如本文中详细描述的，类芽孢杆菌属内生孢子的最外层被称为孢子表面，并包括蛋白质层。尽管有关芽孢杆菌属孢子表面靶向序列的可利用文献越来越多，但尚无鉴定类芽孢杆菌属中的同源N端靶向序列的研究报道。对已知的孢子表面靶向蛋白CotC、BclA、BclB或BetA的生物信息学分析未能揭示出类芽孢杆菌属中的任何同源N端靶向序列，这表明这些蛋白的孢子表面靶向序列在类芽孢杆菌属中并不保守。鉴于形成和定位至类芽孢杆菌属孢子表面的蛋白质的有限表征，人们无法轻易地推断出类芽孢杆菌属总体或该属内具体物种(例如，类芽孢杆菌属种NRRL B-50972)中将蛋白靶向到孢子表面所必需的N端信号序列。
尽管在现有文献中缺乏指导，但是发明人已经鉴定了能够将内源性和融合蛋白引导至类芽孢杆菌属细胞的孢子表面的N端靶向序列。
为了便于参考，本文中提及的核苷酸和多肽序列的SEQ ID NO.列于下表1中。
Figure BDA0002585354830000271
Figure BDA0002585354830000281
Figure BDA0002585354830000291
Figure BDA0002585354830000301
Figure BDA0002585354830000311
Figure BDA0002585354830000321
Figure BDA0002585354830000331
Figure BDA0002585354830000341
Figure BDA0002585354830000351
Figure BDA0002585354830000361
Figure BDA0002585354830000371
Figure BDA0002585354830000381
Figure BDA0002585354830000391
Figure BDA0002585354830000401
Figure BDA0002585354830000411
Figure BDA0002585354830000421
除了在表1(即SEQ ID NO：1-10和18)和表2(即SEQ ID NO：19-30)中列出的示例性N端靶向序列外，在进一步的实施方案中，可以使用与上述任何序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的变异序列，只要该序列保留将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面的能力。在一些实施方案中，可以使用选自表1中列出的任何多肽序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸的片段。在一些方面，唯一需要的功能是该序列保持将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面的能力。
在一些实施方案中，该N端靶向序列，或其变体或片段，可被用于将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面，所述融合蛋白包含与连接的N端信号序列异源的目的肽或多肽序列。在一些实施方案中，所述N端信号序列包含与表1中列出的任何单个序列的氨基酸序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述N端信号序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的至少一个连续序列，其与表1中列出的任何单个多肽序列的相同数量氨基酸的连续序列相同。
如本文所讨论，根据本公开内容的几个方面的融合蛋白构建体包含将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面的N端信号序列，或其变体或片段，以及与N端信号序列异源的多肽序列。然而，在进一步的方面，根据任何公开的方面的任何公开的序列及其顺序变体和片段可用于其他目的。本公开内容的重点在于其中这些序列用作N端孢子表面靶向序列的方面，不应被解释为对其他功能的放弃。
在一些实施方案中，N端信号序列包含具有如SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的氨基酸序列的多肽。在可选的实施方案中，N端信号序列包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的片段(例如，具有包含在SEQ ID NO：2、4、6、8或10中发现的至少一个连续子序列的氨基酸序列的多肽)。在可选的实施方案中，N端信号序列包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的变体(例如，具有与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的序列有最小或准确百分比同一性的氨基酸序列的多肽)。在选择的实施方案中，如上所述，作为片段和作为变体的N端信号序列都是合格的(例如，包含在SEQ ID NO：2、4、6、8或10中发现的连续子序列N端信号序列，随后是差异序列的N端信号序列，其落入公开的序列同一性范围内)。
在选择的实施方案中，N端信号序列包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的氨基酸序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在选择的实施方案中，N端信号序列包含至少5、10、15、20或25个氨基酸的连续序列，其与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的氨基酸序列至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的连续序列相同。
在一些实施方案中，N端信号序列包含具有由SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽。在可选的实施方案中，N端信号序列包含具有由SEQ IDNO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽的片段(例如，一种多肽，其氨基酸序列包含具有由SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽中存在的至少一个连续的子序列)。在选择的实施方案中，N端信号序列包含具有由SEQ IDNO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽的变体(例如，一种多肽，其氨基酸序列与由SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的任何序列所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽具有最小或准确百分比同一性)。在可选的实施方案中，如上所述，作为片段和作为变体的N端信号序列都是合格的(例如，包含在具有由SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽中发现的连续子序列，随后是差异序列的N端信号序列，其落入最小序列同一性范围内)。
在选择的实施方案中，N端信号序列包含与SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在选择的实施方案中，N端信号序列包含在中严格或高严格下与互补于SEQ IDNO：1、3、5、7或9的核酸探针杂交的核苷酸序列。
在选择的实施方案中，N端信号序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的连续序列，其与SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列中相同数量核苷酸的连续序列相同。
关于本公开内容考虑的任何可选的N端靶向序列，例如上述实施方案，在选择的方面，此类序列的最小需要的功能是将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面的能力。
与孢子形成相关的调控序列
本公开内容提供了多个上游调控序列，其可用于在孢子形成过程中表达根据本公开内容的融合蛋白和其他构建体(例如，SEQ ID NO：11-15)。如本文中详细描述的，这些上游调控序列可以用于表达具有N端靶向序列的融合蛋白，所述N端靶向序列将目的蛋白质引导至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。在一些方面，这些上游调控序列(或其片段或变体)也可用于在孢子形成过程中表达任何目的异源蛋白，而不管目的异源蛋白是否包括N端靶向序列。
在一些方面，目的蛋白质的转录由存在于本文所述的任何上游调控序列(例如，SEQ ID NO：11-15中的任一个，或在孢子形成过程保持转录活性的其片段或变体)中的启动子控制。在一些方面，DNA构建体可包含编码目的蛋白质的序列，其位于本文所述的任何调控序列(例如，SEQ ID NO：11-15中的任一个)或在孢子形成过程保持转录活性的其片段或变体的下游。这样的片段可包含SEQ ID NO：11-15的任何连续的25、50、100、150或200个核苷酸，其在孢子形成过程中保持转录活性。类似地，变体可包含与SEQ ID NO：11-15中的任一个(或其片段)相比具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的序列，其在孢子形成过程中保持转录活性。编码目的蛋白质和任何上游调控序列的DNA可整合到类芽孢杆菌属或其他细胞的染色体DNA中。
融合蛋白
本公开内容提供了融合蛋白，其包含直接或间接连接至至少一个目的分子(例如，目的蛋白质或肽的多肽序列，例如至少一种植物生长刺激蛋白或肽)的N端靶向序列。在选择的实施方案中，间接连接可以是插入间隔子、接头或调控序列。蛋白质或肽可包括但不限于，肽激素、非激素肽、产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶、或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。通常，可使用能够在类芽孢杆菌属内生孢子中表达并且与选择的N端靶向序列异源的任何目的蛋白质。在一些实施方案中，目的蛋白质是在类芽孢杆菌属的细菌中表达的蛋白质。在其他实施方案中，目的蛋白质分离自与融合蛋白将在其中表达的类芽孢杆菌属内生孢子相同种的细菌。在其他实施方案中，目的蛋白质分离自类芽孢杆菌属的菌株，其中融合蛋白将在该菌株的内生孢子上表达。靶向序列可以是上述的任何靶向序列。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含靶向序列和至少一种保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽。靶向序列可以是上述的任何靶向序列。
融合蛋白可使用本领域已知的标准克隆和分子生物学方法制得。例如，可以通过聚合酶链反应(PCR)来扩增编码蛋白质或肽的基因(例如，编码植物生长刺激蛋白或肽的基因)，并且连接至编码上述任何靶向序列的DNA，以形成编码融合蛋白的DNA分子。编码融合蛋白的DNA分子可被克隆到任何合适的载体(例如质粒载体)中。载体适当地包含多个克隆位点，编码融合蛋白的DNA分子可容易地插入其中。载体还适当地包含选择性标记，例如抗生素抗性基因，从而可容易地鉴定和分离用载体转化、转染或与载体配对的细菌。当载体是质粒时，质粒还适当地包含复制起点。编码融合蛋白的DNA适当地在孢子形成启动子的控制下，该启动子将引起融合蛋白在类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面上表达(例如，来自类芽孢杆菌属的家族成员的天然启动子)。在一些方面，融合蛋白的转录由存在于本文所述的任何上游调控序列(例如，SEQ ID NO：11-15中的任一个，或在孢子形成过程中保持转录活性的其片段或变体)中的启动子控制。在一些方面，DNA构建体可包含编码根据本公开内容的融合蛋白的序列，其位于本文所述的任何调控序列(例如，SEQ ID NO：11-15中的任一个)，或在孢子形成过程中保持转录活性的其片段或变体的下游。这样的片段可包含SEQ ID NO：11-15的任何连续的50、100、150或200个核苷酸，其在孢子形成过程中保持转录活性。类似地，变体可包含与SEQ ID NO：11-15中的任一个(或其片段)相比具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的序列，其在孢子形成过程中保持转录活性。编码融合蛋白(例如，SEQ ID NO：1、3、5、7、9的任何序列，或其变体或片段)的DNA以及一个或多个上游调控序列可被整合到类芽孢杆菌属或其他细胞的染色体DNA中。
融合蛋白还可包含其他多肽序列，该多肽序列不是靶向序列或连接的目的蛋白(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白质或肽、或植物结合蛋白或肽)的一部分。例如，融合蛋白可包括标签或标记，以促进融合蛋白本身或表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞的孢子的纯化(例如，多组氨酸标签)或可视化(例如，荧光蛋白，如GFP或YFP)。
使用本文所述的靶向序列增强了融合蛋白在孢子表面的表达，这是由于在这些序列的氨基端缺乏二级结构，这允许融合蛋白的天然折叠和活性的保持。适当的折叠可通过在靶向序列和融合伴侣蛋白之间包含短氨基酸接头来进一步增强。
因此，本文所述的任何融合蛋白可在靶向序列和连接的目的蛋白(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白质或肽、或植物结合蛋白或肽)之间包含氨基酸接头。
接头可包括聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。还可使用包含丙氨酸残基与甘氨酸残基的混合物的接头。例如，当靶向序列包含SEQ ID NO：2时，融合蛋白可具有以下结构中的一种：
Figure BDA0002585354830000481
其中An、Gn和(A/G)n分别是任意数量的丙氨酸、任意数量的甘氨酸或任意数量的丙氨酸和甘氨酸的混合物。
例如，n可以是1至25之间的任何整数，例如6至10之间的整数。当接头包含丙氨酸残基与甘氨酸残基的混合物时，可使用甘氨酸与丙氨酸残基的任何组合。如上所述，由SEQID NO：2所示的N端靶向序列。然而，在以上示例性配置中，本文公开的任何其他N端靶向序列可以代替SEQ ID NO：2(例如，SEQ ID NO：4、6、8或10，或其片段或变体)。在上面显示的结构中，“融合伴侣蛋白”表示连接的目的蛋白(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白质或肽、或植物结合蛋白或肽)。
可选地或另外地，接头可包含蛋白酶识别位点。包含蛋白酶识别位点使得能够在暴露于识别该蛋白酶识别位点的蛋白酶时靶向移除目的蛋白质(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白质或肽、或植物结合蛋白或肽)。
在某些方面，融合蛋白包含产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，例如乙缩醛还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、双乙酰基还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、腺苷磷酸异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5′-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-葡糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CK N-葡萄糖基转移酶、2，5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶，氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶或参与产生结瘤因子(nod factor)的酶或以上的任意组合。
在其他方面，融合蛋白包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶，例如纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶、铁载体，或以上的任何组合。
在一些实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的靶向序列、孢子表面蛋白或孢子表面蛋白片段的天然孢子形成启动子的控制下表达。融合蛋白可在高表达孢子形成启动子的控制下表达。在某些方面，高表达孢子形成启动子包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。在选择的方面，融合蛋白可以在融合蛋白的靶向序列的天然启动子的控制下表达。在某些情况下，靶向序列的天然启动子会是高表达孢子形成启动子。在其他情况下，靶向序列的天然启动子不会是高表达孢子形成启动子。在后一种情况下，用高表达孢子形成启动子代替天然启动子可能是有利的。融合蛋白在高表达孢子形成启动子的控制下的表达使融合蛋白在类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面上的表达增加。高表达孢子形成启动子可包含一个或多个σ-K孢子形成特异性启动子序列。
如上所述，融合蛋白可包含靶向序列和至少一种异源蛋白，该异源蛋白可包含生长刺激蛋白或肽。所述植物生长刺激蛋白或肽可包括肽激素、非激素肽、产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶、或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶，等。所述植物生长刺激蛋白或肽可包括产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶。产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶可以是在刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中催化任何步骤的任何酶，或将刺激植物生长或改变植物结构的化合物的无活性或活性较小的衍生物催化转化为化合物的活性或更大活性形式的任何酶。可选地，该植物生长刺激化合物可包括植物生长激素，例如细胞分裂素或细胞分裂素衍生物、乙烯、植物生长素或植物生长素衍生物、赤霉素或赤霉素衍生物、脱落酸或脱落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。
当所述酶包括蛋白酶或肽酶时，所述蛋白酶或肽酶可以是裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。生物活性肽可以是发挥生物活性的任何肽。裂解蛋白、肽，前蛋白或前蛋白原以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。
植物生长刺激蛋白还可包括降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。这样的酶包括纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶和铁载体。当被引入植物生长介质中或施用于植物、种子或植物或植物种子周围的区域时，包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶的融合蛋白可有助于加工植物附近的养分并增强植物或植物附近的有益细菌或真菌对营养的摄取。融合蛋白可包含靶向序列和保护植物免受病原体侵害的至少一种蛋白或肽。所述蛋白质或肽可包括刺激植物免疫应答的蛋白质或肽。例如，刺激植物免疫应答的蛋白质或肽可包括植物免疫系统增强蛋白或肽。所述植物免疫系统增强蛋白或肽可以是对植物免疫系统具有有益作用的任何蛋白质或肽。或者，保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽可以是具有抗菌活性、抗真菌活性或同时具有抗菌和抗真菌活性的蛋白质或肽。保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽也可以是具有杀虫活性、杀蠕虫活性，抑制昆虫或蠕虫的捕食，或其组合的蛋白质或肽。保护植物免受病原体侵害的蛋白质可包括酶。适合的酶包括蛋白酶和内酯酶。所述蛋白酶和内酯酶可特异性针对细菌信号转导分子(例如细菌内酯高丝氨酸信号分子)。所述酶还可以是特异性针对细菌或真菌的细胞成分的酶。
融合蛋白可包含靶向序列和至少一种提高植物胁迫抗性的蛋白质或肽。例如，提高植物胁迫抗性的蛋白质或肽包括降解胁迫相关化合物的酶。胁迫相关化合物包括但不限于，氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、活性氧种类、一氧化氮、氧脂素和酚类物质。具体的活性氧种类包括羟基、过氧化氢、氧和超氧化物。降解胁迫相关化合物的酶可包括超氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、过氧化物酶、抗氧化剂酶或抗氧化剂肽。
提高植物胁迫抗性的蛋白质或肽还可包括保护植物免受环境胁迫的蛋白质或肽。所述环境胁迫可包括，例如干旱、洪水、高温、冰冻、盐、重金属、低pH、高pH或其组合。例如，保护植物免受环境胁迫的蛋白质或肽可包括冰成核蛋白、脯氨酰肽酶、苯丙氨酸解氨酶、异分支酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶或胆碱脱氢酶。
融合蛋白可包括靶向序列和至少一种植物结合蛋白或肽。所述植物结合蛋白或肽可以是能够特异性或非特异性结合至植物的任何部位(例如，植物的根部或植物的地上部分，如叶、茎、花或果实)或植物物质的任何蛋白或肽。因此，例如，植物结合蛋白或肽可以是根结合蛋白或肽、或叶结合蛋白或肽。
表达融合蛋白的重组类芽孢杆菌属内生孢子和细胞
本文所述的融合蛋白可由重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞(例如，土地类芽孢杆菌)表达。所述融合蛋白可以是上述的任何融合蛋白。重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞可共表达上述的任何融合蛋白中的两种或多种。例如，重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞可共表达至少一种包含植物结合蛋白或肽的融合蛋白、与至少一种包含植物生长刺激蛋白或肽的融合蛋白、至少一种融合蛋白包含保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽的融合蛋白、或至少一种提高植物胁迫抗性的蛋白质或肽。
重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞可包括类芽孢杆菌属细胞，例如类芽孢杆菌属种NRRL B-50972、土地类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或皮奥利亚类芽孢杆菌。在其他方面，重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞可选自本文所述的任何示例性类芽孢杆菌属种。
为了产生表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，可使用本领域已知的标准方法(例如，通过用编码融合蛋白的载体进行电穿孔)来转化任何类芽孢杆菌属的细菌。然后，可通过本领域已知的任何方法筛选细菌以鉴定转化体。例如，当载体包括抗生素抗性基因时，可就抗生素抗性对细菌进行筛选。或者，可将编码融合蛋白的DNA整合到类芽孢杆菌属细胞的染色体DNA中。然后，可将重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞暴露于将诱发孢子形成的条件中。用于诱发孢子形成的适合的条件是本领域已知的。例如，可将重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞铺于琼脂板上，并且在约30℃的温度下孵育若干天(例如3天)，或者在Schaeffer孢子形成培养基中培养。
还可适当地使用上述任何种的失活菌株、无毒菌株或遗传操作的菌株。可选地或另外地，一旦表达融合蛋白的重组类芽孢杆菌属家族的孢子已经产生，便可使它们失活以防止一旦使用时的进一步萌发。可使用本领域中已知的使细菌孢子失活的任何方法。合适的方法包括但不限于，热处理、γ辐射、x射线辐射、UV-A辐射、UV-B辐射、化学处理(例如，用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂或其任何组合处理)或其组合。或者，可使用源自非产毒菌株或遗传上或生理上失活菌株的孢子。
根据本公开内容的融合蛋白构建体包含将融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面的N端信号序列，或其变体或片段，以及与N端信号序列异源的多肽序列。在选择的实施方案中，N端信号序列和与N端信号序列异源的多肽序列直接连接。在其他方面，可存在中间的接头或间隔基序列。在其他方面，切割序列或其他调控序列可位于两个区域之间。与N端信号序列异源的多肽序列可包含一个或多个功能蛋白。在多肽序列中包含多种与N端信号序列异源的功能蛋白的方面，至少一个间隔基、切割序列或其他调控元件可位于两种或多种功能蛋白之间。
与N端信号序列异源的多肽序列可以是，例如：(a)植物生长刺激蛋白或肽；(b)保护植物免受病原体侵害的蛋白质或肽；(c)提高植物的胁迫抗性的蛋白质或肽；(d)植物结合蛋白或肽；(e)植物免疫系统增强蛋白或肽；或(f)提高营养摄取的蛋白质或肽。当在类芽孢杆菌属中表达时，这些融合蛋白被靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面，并且被物理定向以使得蛋白质或肽呈现在孢子的外部。
该类芽孢杆菌属孢子表面呈现系统可用于将肽、酶和其他蛋白质递送至植物(例如，至植物的叶子、果实，花、茎或根)或植物生长介质例如土壤。以这种方式递送至土壤或另一种植物生长介质中的肽、酶和蛋白质在土壤中存留且长期表现出活性。将本文所述的表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞引入土壤或植物的根际中，使得在许多不同的土壤条件下有益增强植物生长。使用类芽孢杆菌属孢子表面呈现系统以产生这些酶使得它们在植物生命的最初几个月中，以及在一些方面，在长达且包括植物生命期的较长时期内，持续对植物和根际产生它们的有益作用。
在一些方面，可将包含根据本文所述的任一方面的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞或由此类细胞产生的内生孢子的组合物直接施用于植物(例如，以粉末、悬浮液或溶液的形式，施用于种子或田地)。在一些方面，将此类组合物在播种之前或之后，或可选地在萌芽之前或之后(例如，种植前或种植后，或出苗前或出苗后)施用于田地。
在可选方面，通过将重组类芽孢杆菌属细胞或孢子施用于植物、种子或田地，可将本文公开的融合蛋白和/或组合物间接递送至植物、种子和/或田地。在这些方面，融合蛋白可以由重组类芽孢杆菌属细胞表达或产生(例如，在田间)，使融合蛋白被递送至植物、种子或田间。
具有植物生长促进作用和/或其他有益属性的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞
已知某些类芽孢杆菌属细菌具有固有的有益属性。例如，某些菌株具有促进植物生长或杀虫(例如，灭蚊)作用。本文所述的任何融合蛋白均可在此类菌株中表达。
例如，重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞可包括促进植物生长的类芽孢杆菌属的菌株。促进植物生长的细菌菌株可包括产生杀虫毒素(例如，Bin毒素)、产生杀真菌化合物(例如β-1，3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合)，产生杀线虫化合物(例如，Cry毒素)、产生杀细菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一个或多个自主复制的质粒、结合至植物根部、定殖于植物根部、形成生物膜、溶解营养、分泌有机酸或其任何组合的细菌的菌株。
生物防治剂
本公开内容提供的组合物可进一步包含生物防治剂。生物防治剂可特别地包括细菌、真菌或酵母、原生动物、病毒、昆虫致病性线虫、接种体和植物，和/或具有各菌株全部识别特征的它们的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。本公开内容提供了上述重组类芽孢杆菌属内生孢子与本文所述的特定生物防治剂的组合，和/或与本文所述的微生物的特定菌株的突变体的组合，其中该突变体具有各自菌株的所有识别特征，和/或与由各自菌株产生的表现出对昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性或促进植物生长和/或增强植物健康的至少一种代谢物的组合。根据本公开内容，本文所述的生物防治剂可在任何生理状态例如活化状态或休眠状态下采用或使用。
示例性组合物
在可选的方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含协同有效量的：a)表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，该融合蛋白包含：将包含异源目的蛋白的融合蛋白定位至类芽孢杆菌属家族成员的孢子表面的靶向序列；以及b)至少一种本文公开的另外的且不同的特定生物防治剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的突变体(其具有各自菌株的所有识别特征)，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。在可选的方面，所述组合物包含至少一种另外的杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，条件是重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞、杀虫剂和杀真菌剂不相同。在另一方面，组合物用于降低由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部位的整体损害以及采收的果实或蔬菜的损失。在另一方面，所述组合物提高了整体植物健康。
术语“植物健康”通常包括与害虫防治无关的多种植物改善。例如，可以提及的有利特性是改善的作物特征，其包括：出苗、作物产量、蛋白质含量、油含量、淀粉含量、更发达的根系、改善的根部生长、改善的根部尺寸维持、改善的根部效率、改善的胁迫耐受性(例如，耐干旱、热、盐、紫外线、水、寒冷)、乙烯减少(减少产生和/或抑制接收)、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、更少的死基生叶、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、色素含量、光合活性、需要更少的输入(例如，肥料或水)、需要更少的种子、更高产的分蘖产量、开花更早、谷粒成熟更早、植物倒逆(倒伏)减少、枝条生长加快、植物活力增强、植物直立性增加以及早且更好的萌芽。
通过比较在相同环境条件下生长的植物，可筛选本公开内容提供的组合物以鉴定对植物生长、健康或其他有益属性的潜在作用，其中所述植物的一部分用根据本公开内容的组合物处理，以及所述植物的另一部分未用根据本公开内容的组合物处理。相反，所述其他部分完全不经处理，或用合适的对照处理(即没有施用根据本公开内容的组合物，例如没有施用所有活性成分，没有施用如本文所述的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，或没有施用本文公开的其他特定生物防治剂)。
根据本公开内容的组合物可以任何所需方式施用，例如以种子包衣、土壤浸液和/或直接施用于犁沟中、和/或以叶面喷雾的形式，并且在出苗前、出苗后或出苗前后都施用。换言之，所述组合物可被施用于种子、植物或采收的果实和蔬菜，或植物正生长于其中或需要在其中生长的土壤(植物的生长地点)。
降低植物和植物部位的整体损害通常得到更健康的植物和/或使植物活力和产量提高。优选地，根据本公开内容的组合物用于处理传统或转基因植物或其种子。
在另一方面，本公开内容提供的组合物改善动物健康或此类动物的总体身体状况。提高健康的标志包括以下一种或多种：改善或逆转动物的疾病状态；体重增加，其可能包括动物特定部位的重量增加或整体重量的增加；肠道菌群的维持；提高饲料利用率；降低死亡风险；增强抗病能力；降低发病率；增强免疫应答；减少腹泻的发生；提高生产率；和/或减少病原体脱落(shedding)。本公开内容还涉及通过给予动物治疗量或有效量的上述任何组合物来改善动物健康的方法，该组合物包含表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞。在一些方面，此类融合蛋白包括有助于饲料消化的酶，例如淀粉酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果胶酶或免疫调节剂，例如抗体。组合物的有效量是，与未给予该组合物但另外已经给予与接受本发明的组合物的动物相同饮食(包括饲料和其他化合物)的动物相比，有效提高动物健康的量。术语“治疗量”是指足以改善或逆转动物疾病状态的量。
在另一方面，本公开内容提供的组合物从介质(例如，土壤、地下水、沉积物或地表水)中去除污染或污染物。本公开内容还涉及通过向此类介质中施用有效量的上述任何组合物，从介质(例如，土壤、地下水、沉积物或地表水)中去除污染或污染物的方法，该组合物包含在孢子表面表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞。
使用重组类芽孢杆菌属构建体和组合物的方法
本公开内容还涉及使用上述任何组合物刺激植物生长的方法，该组合物包含表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂。刺激植物生长的方法包括：将组合物施用于植物、种子、植物部位、植物周围的地点或植物将在其中生长的地点(例如，土壤或其他生长介质)，所述组合物包括协同有效量的表达融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，该融合蛋白包含：(i)异源蛋白(例如，至少一种植物生长刺激蛋白)；和(ii)靶向序列；和至少一种本文公开的另外的特定生物防治剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的突变体(其具有各自菌株的所有识别特征)，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。
在本公开内容的另一方面，提供了一种降低由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部位的整体损害以及降低采收的果实或蔬菜的损失的方法，其包括同时或依次地施用协同有效量的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂的步骤。
在本方法的一实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种杀真菌剂。在一方面，所述至少一种杀真菌剂是合成杀真菌剂。在另一实施方案中，所述组合物除了杀真菌剂外还包含至少一种杀虫剂或包含至少一种杀虫剂以替代杀真菌剂，条件是杀虫剂、杀真菌剂、重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和本文公开的特定生物防治剂不相同。
本公开内容的方法包括以下施用方法，即可将重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治剂两者配制成具有农业上可接受的保质期的单一、稳定的组合物(所谓的“独配制剂”)，或在使用之前或使用时进行组合(所谓的“组合制剂”)。
如果没有另外提及，表达“组合”代表重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞与至少一种本文公开的其他特定生物防治剂以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的各种组合，以独配制剂形式、单一“预混”形式、以由独配制剂组成的组合喷雾混合物(例如“桶混”)形式，以及特别是以依次的方式(即在合理的短时期，例如几个小时或几天，例如2小时至7天内相继地)施用时，单一活性成分的组合使用。施用根据本公开内容的组合物的顺序不是实施本公开内容必需的。因此，术语“组合”还涵盖例如在同时或连续地向植物、其周围环境、生境或者储存空间施用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂之后，所述重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或杀虫剂存在于在待处理的植物或其周围环境、生境或者储存空间之上或之中。
如果以依次的方式利用或使用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，则优选按照以下方法处理植物或植物部位(包括种子和由种子萌发的植物)、采收的果实和蔬菜：首先，将至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂施用于植物或植物部位；其次，将本文所述的其他的特定生物防治剂和重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞施用于同一植物或植物部位。通过这种施用方式，采收时植物上杀虫剂/杀真菌剂的残留量尽可能地低。在(作物)生长周期内的第一次施用和第二次施用之间的时间段可以改变并且取决于所要达到的效果。例如，进行第一次施用以防止植物或植物部位被昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体侵害(特别是在处理种子的情况下)，或对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵害(特别是在处理植物和植物部位的情况下)；进行第二次施用以防止或防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵害和/或促进植物生长。在本文中，防治意指包含重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和本文公开的特定生物防治剂的组合物并不能够完全消灭害虫或植物病原性真菌，但是能够使侵害保持在可接受的水平上。
本公开内容还提供了通过多重施用而增强本公开内容的组合物的杀死、抑制、预防和/或抵抗活性的方法。在一些其他的实施方案中，在任何需要的发育阶段中或在任何预定的害虫压力下，以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间的间隔，将本公开内容的组合物施用于植物和/或植物部位两次。在一些实施方案中，在任何需要的发育阶段中或在任何预定的害虫压力下，以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间的间隔，将本公开内容的组合物施用于植物和/或植物部位多于两次(例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次)。如果需要，各施用之间的间隔可不同。本领域技术人员将能够根据植物种类、植物害虫种类和其他因素决定施用的次数和间隔长度。
通过按照前述步骤，可以实现在处理的植物、植物部位和采收的果实和蔬菜上至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的非常低水平的残留。
如果没有另外提及，用根据本公开内容的组合物对植物或植物部位(包括种子和由种子萌发的植物)、采收的果实和蔬菜的处理直接进行或通过作用于其周围环境、生境或储存空间，该处理使用常规的处理方法(例如浸渍、喷雾、雾化、灌溉、蒸发、撒粉、弥雾(fogging)、撒播、发泡、涂抹(painting)、涂布(spreading-on)、浇水(浸湿)、滴灌)。还可以独配制剂或组合制剂的形式以超低容量法施用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞、至少一种本文公开的其他的特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，或将根据本公开内容的组合物以组合物或独配制剂的形式注入到土壤中(犁沟中)。
术语“待处理的植物”涵盖植物的每个部位，包括其根系和分别在待处理的植物的主茎或树干周围至少10cm、20cm、30cm的半径内或在所述待处理植物的根系周围至少10cm、20cm、30cm的物质(例如土壤或营养基质)。
任选在至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂组合使用或利用的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部位、种子、采收的果实或蔬菜的大小或种类。通常，根据本公开内容待利用或使用的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞在其独配制剂或与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂和任选地杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂中以约1％至约80％(w/w)、优选约1％至约60％(w/w)、更优选约10％至约50％(w/w)存在。
同样，任选在至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞组合使用或利用的至少一种本文公开的其他特定生物防治剂的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部位、种子、采收的果实或蔬菜的大小或种类。通常，根据本公开内容的待施用或使用的本文所述的其他的特定生物防治剂在其独配制剂或与重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，和任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂中以约1％至约80％(w/w)、优选1％至约60％(w/w)、更优选约10％至约50％(w/w)存在。
重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞的施用可以作为叶面喷雾、土壤处理，和/或种子处理/拌种来进行。当用作叶面处理时，在一实施方案中，每英亩施用约1/16至约5加仑的全培养液。当用作土壤处理时，在一实施方案中，每英亩施用约1至约5加仑的全培养液。当用于种子处理时，每英亩施用约1/32至约1/4加仑的全培养液。对于种子处理，最终使用制剂包含至少1×104、至少1×105、至少1×106、1×107、至少1×108、至少1×109、至少1×1010个菌落形成单位/克。
该比例可基于如下进行计算：在将根据本公开内容的组合的所述组分施用于植物或植物部位的时间点时的至少一种本文公开的其他特定生物防治剂的量，以及在将本公开内容的组合的所述组分施用于植物或植物部位之前不久(例如，48h、24h、12h、6h、2h、1h)或该时间点时的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞的量。
可将重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文公开的其他特定生物防治剂同时或在不同时间施用于植物或植物部位，只要在施用后两种组分存在于植物上或植物内即可。在重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和本文公开的其他特定生物防治剂在不同时间施用，且本文公开的其他特定生物防治剂在重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞之前施用的情况下，技术人员可通过本领域已知的化学分析测定在施用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞的时间点或该时间点之前不久，本文公开的其他特定生物防治剂在植物上/内的浓度。反之亦然，当首先将重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞施用于植物时，可使用本领域已知的测试在施用本文公开的其他特定生物防治剂的时间点或该时间点之前不久测定重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞的浓度。
在本公开内容的另一方面，提供了用如上所述的组合物处理的种子。通过处理植物的种子来防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体是长期已知的并且是持续改进的主题。然而，种子的处理带来了一系列问题，它们无法总是以令人满意的方式解决的。因此，需要开发出用于保护种子和发芽植物的方法，该方法不需要在植物储过程中、播种后或出苗后额外递送作物保护组合物或至少显著减少这种需要。此外，需要以这样的方式来优化施用的活性成分的量，即为种子和发芽植物提供最可能的保护，使其免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的攻击，但所施用的活性成分不会造成损害植物本身。特别地，处理种子的方法还应当考虑抵抗害虫或耐受害虫的转基因植物固有的杀虫和/或杀线虫特性，以实现用最少量的作物保护组合物获得对种子和发芽植物的最佳保护。
因此，本发明还特别涉及通过用如上定义的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种选自本文公开的特定微生物的其他生物防治剂和/或具有各自菌株的所有识别特征的本文公开的微生物的特定菌株的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或任选地本公开内容的至少一种杀虫剂处理种子来保护种子和发芽植物免受害虫攻击的方法。本公开内容用于保护种子和发芽植物免受害虫攻击的方法涵盖了这样一种方法，其中用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，在一次操作中同时处理种子。其还涵盖这样一种方法，其中用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理种子。
本公开内容还提供了处理种子的方法，目的是保护种子和所得植物免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵害。本公开内容还涉及一种种子，将其同时用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂处理。本公开内容进一步涉及已经用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治剂以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理的种子。在已经用重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所述的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理的种子的情况中，本公开内容的组合物中的各个活性成分可存在于种子的不同层中。
此外，本发明涉及种子，其在用本公开内容的组合物处理后进行薄膜包衣过程以防止灰尘磨损种子。
本公开内容的优势之一是，由于本公开内容的组合物特有的系统性特性，用这些组合物对种子的处理不仅为种子本身还为来源自种子的植物(在其出苗后)提供保护以抵御昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。如此一来，可不必在播种时或其后不久直接处理作物。可以看到另一优势在于以下事实：通过用本公开内容的组合物处理种子，可促进处理的种子的萌发和出苗。
本公开内容的组合物适合于保护用于农业、温室、林业或园艺中的任何植物品种的种子。更具体地说，所研究的种子是谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦和黍)、玉米、棉花、大豆、稻、马铃薯、向日葵、咖啡豆、烟草、加拿大油菜、油菜、甜菜(例如，糖用甜菜和饲料用甜菜)、花生、蔬菜(例如，番茄、黄瓜、豆、十字花科蔬菜、洋葱和莴苣)、果实植物、草坪和观赏植物的种子。特别重要的是处理谷物(例如小麦、大麦、黑麦和燕麦)、玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、油菜和稻的种子。
为本公开内容的目的，将本公开内容的组合物单独或以合适的制剂施用于种子。优选地在这样的状态下处理种子：即种子的稳定性使得在处理过程中不发生损伤。一般而言，可在采收和播种之间的任何时间点处理种子。通常，使用已经从植物中分离并且已经去除穗轴、外壳、茎、英、毛或果肉的种子。因此，例如，可使用已采收、净化并干燥至水分含量小于15重量％的种子。或者，例如，还可使用干燥后已用水处理，然后再次干燥的种子。
一般而言，在处理种子时，必须确保选择施用于种子的本公开内容的组合物和/或其他添加剂的量，以使得种子的萌发不会受到不利影响，和/或从种子中萌发的植物没有受到损伤。特别是用在一定施用率下可表现出植物毒性作用的活性成分，情况就是如此。
本公开的组合物可直接施用，换句话说，不包含其他组分并且无需稀释。通常，优选将组合物以合适制剂的形式施用于种子。合适的制剂和用于种子处理的方法是技术人员已知的，并且记载于例如以下文献中：美国专利号4,272,417 A；4,245,432 A；4,808,430A；5,876,739 A；美国专利公开号2003/0176428 A1；WO 2002/080675 A1；WO 2002/028186A2，其每一个的内容通过引用纳入本文。
可根据本公开内容使用的组合可转化为常规的拌种制剂，例如溶液剂、乳剂、悬剂，粉剂、泡沫剂、浆液剂或其他用于种子的包衣组合物，以及ULV制剂。这些制剂以已知方式通过将组合物与常规佐剂混合而制备，该佐剂为，例如，常规填充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、湿润剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、粘着剂、赤霉素和还有水。可存在于可根据本发明使用的拌种剂中的着色剂包括常规用于此目的的所有着色剂。在本文中，不仅可使用低水溶性的颜料，还可使用水溶性染料。实例包括已知的命名为罗丹明B(Rhodamine B)、C.I.颜料红112和C.I.溶剂红1的着色剂。
根据植物种或植物栽培种，其位置和生长条件(土壤、气候、植物生长期、营养)，使用或采用根据本公开内容的组合物，根据本公开内容的处理还可能导致超加性的(“协同”)效应。因此，例如，通过在根据本公开内容的处理中使用或采用本发明的组合物，可取得超出实际预期的效果：施用率降低和/或活性谱的拓宽和/或提高活性，使植物更好地生长、提高对高温或低温的耐受性、提高对干旱或对水或土壤含盐量的耐受性、提高开花性能、使采收更容易、加速成熟、采收产量更高、果实更大、植株更高、叶色更绿、开花更早、采收产品的品质和/或营养价值更高、果实中糖的浓度更高、采收产品的储存稳定性和/或加工性更好。
在根据本公开内容的处理中，本发明的组合物在某些施用率下，也可在植物中具有强化作用。调动植物的防御系统以抵抗不需要的植物病原真菌和/或微生物和/或病毒的攻击。在本文中，植物强化(抗性诱导)物质应理解为是指能够以这样一种方式刺激植物防御系统的那些物质或物质的组合：即当随后接种不需要的植物病原真菌和/或微生物和/或病毒时，处理的植物对这些植物病原性真菌和/或微生物和/或病毒表现出很大程度的抗性。因此，通过在根据本公开内容的处理中使用或采用根据本公开内容的组合物，可保护植物在处理后的一定时期内抵御上述病原体的侵害。在用活性化合物处理植物后，实现保护作用的时间段通常持续1-10天，优选1-7天。
本文公开的任何组合物可包含一种或多种农业化学品。类似地，施用根据本公开内容的组合物的方法可进一步包括将至少一种农业化学品引入植物生长介质或将至少一种农业化学品施用于植物或种子。
农业化学品可包含肥料(例如液体肥料)、微量元素肥料材料(例如硼酸、硼酸盐、硼熔块、硫酸铜、铜熔块、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁熔块、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰熔块、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、锌熔块、磷酸锌，锌螯合物或其组合)、杀虫剂(例如有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯(pyrethroid)、杀螨剂、邻苯二甲酸烷基酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫磺、卤代芳香族取代的尿素、烃酯、生物基杀虫剂或其组合)，除草剂(例如，氯苯氧基化合物、硝基酚化合物、硝基甲酚化合物、联吡啶化合物、乙酰胺、脂肪酸、苯胺、苯甲酰胺、苯甲酸、苯甲酸衍生物、茴香酸、茴香酸衍生物、苄腈、苯并噻二嗪酮二氧化物(benzothiadiazinone dioxide)、硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、氯吡啶、环己烯酮衍生物、二硝基苯胺衍生物、氟二硝基甲苯胺化合物(fluorodinitrotoluidine compound)、异噁唑酮(isoxazolidinone)、烟酸、异丙胺、异丙胺衍生物、噁二唑啉酮(oxadiazolinone)、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、吡啶甲酸化合物、三嗪、三唑、尿嘧啶、尿素衍生物、草多索(endothall)、氯酸钠或其组合)、杀真菌剂(例如，取代的苯、硫代氨基甲酸酯、亚乙基双二硫代氨基甲酸酯(ethylene bis dithiocarbamate)、硫代邻苯二甲酰胺(thiophthalidamide)、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、敌菌灵(anilazine)、苯菌灵(benomyl)、放线菌酮(cyclohexamide)、多果定(dodine)、氯唑灵(etridiazole)、异菌脲(iprodione)、甲霜灵(metalaxyl)、thiamimefon、嗪氨灵(triforine)或其组合)、杀软体动物剂、杀藻剂、植物生长改良剂、细菌接种剂(例如，根瘤菌属(Bhizobium)的细菌接种剂、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的细菌接种剂、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)的细菌接种剂、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)的细菌接种剂、异根瘤菌属(Allorhizobium)的细菌接种剂、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的细菌接种剂、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)的细菌接种剂、固氮菌属(Azotobacter)的细菌接种剂、假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌接种剂、固氮螺菌属(Azospirillium)的细菌接种剂、芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌接种剂，链霉菌属(Streptomyces)的细菌接种剂、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌接种剂、副球菌属(Paracoccus)的细菌接种剂、肠杆菌属(Enterobacter)的细菌接种剂、产碱杆菌属(Alcaligenes)的细菌接种剂、分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌接种剂、木霉属(Trichoderma)的细菌接种剂、粘帚霉属(Gliocladium)的细菌接种剂、球囊霉属(Glomus)的细菌接种剂、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌接种剂或其组合)、真菌接种剂(例如，球囊霉科(Glomeraceae)的真菌接种剂、近明球囊霉科(Claroidoglomeraceae)的真菌接种剂，巨孢囊霉科(Gigasporaceae)家族的真菌接种剂、无梗囊霉科(Acaulosporaceae)家族的真菌接种剂、葡萄球菌科(Sacculosporace)家族的真菌接种剂、Entrophosporaceae家族的真菌接种剂、Pacidsporaceae家族的真菌接种剂、多样孢囊霉科(Diversisporaceae)的真菌接种剂、类球囊霉科(Paraglomeraceae)的真菌接种剂、原囊霉科(Archaeosporaceae)的真菌接种剂、地管囊霉科(Geogesisiphonae)的真菌接种剂、双型囊霉科(Ambisporaceae)的接种剂、Scutellosporaceae科的真菌接种剂、Dentiscultataceae科的真菌接种剂、Racocetraceae科的真菌接种剂、担子菌(Basidiomycota)门的真菌接种剂、子囊菌门(Ascomcom)的真菌接种剂、接合菌门(Zygomycota)的真菌接种剂或其组合)，或其组合。
肥料可包含硫酸铵、硝酸铵、硫硝酸铵(ammonium sulfate nitrate)、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸铵钙、硫酸钙、煅烧菱镁矿、钙质石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石灰石(dolomitic limestone)、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸氢二铵、磷酸一铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸钾镁、硫酸钾、硝酸钠、镁质石灰石(magnesian limestone)、氧化镁、脲、脲醛、硝酸铵脲、硫包衣尿素(sulfur-coated urea)、聚合物包衣尿素、异丁叉二脲(isobutylidene diurea)、K2SO4-(MgSO4)2、钾盐镁矶、钾石盐、硫酸镁石、泻盐(Epsom salts)、元素硫、泥灰(marl)、磨碎的牡蛎壳(ground oyster shells)、鱼粉、油饼、鱼肥(fish manure)、血粉、磷酸石、过磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、肥料(manure)、蝙蝠粪、泥炭藓(peat moss)、堆肥、湿砂(green sand)、棉籽粉、羽毛粉、蟹粉、鱼乳化剂、腐殖酸或其组合。如本文所述，农业化学品可包含任何杀真菌剂、细菌接种剂或除草剂。单独或与杀虫剂组合的形成孢子的细菌可进一步包含有效量的至少一种杀真菌剂。
通常，“杀真菌剂”是提高真菌死亡率或抑制其生长速率的物质。术语“真菌(fungus)”或“真菌(fungi)”包括多种不含叶绿素的有核产孢子的生物体。真菌的实例包括酵母、霉菌(molds)、霉(mildews)、锈菌类(rusts)和蕈类(mushrooms)。典型的杀真菌成分还包括克菌丹(captan)、咯菌腈(fludioxonil)、异菌脲(iprodione)、戊唑醇(tebuconazole)、噻苯咪唑(thiabendazole)、嘧菌酯(azoxystrobin)、咪鲜胺(prochloraz)和噁霜灵(oxadixyl)。根据本公开内容选择的组合物、植物种子或接种物可包含任何天然或合成的杀真菌剂，例如：艾敌吗啉(aldimorph)、氨丙磷酸(ampropylfos)、氨丙磷酸钾(ampropylfos potassium)、andoprim、敌菌灵(anilazine)、戊环唑(azaconazole)、腈嘧菌酯(azoxystrobin)、苯霜灵(benalaxyl)、麦锈灵(benodanil)、苯菌灵(benomyl)、苄烯酸(benzamacril)、异丁基苄烯酸(benzamacryl-isobutyl)、双丙氨酰膦(bialaphos)、乐杀螨(binapacryl)、联苯(biphenyl)、联苯三唑醇(bitertanol)、灭瘟素(blasticidin-S)、啶酰菌胺(boscalid)、糠菌唑(bromuconazole)、磺嘧菌灵(bupirimate)、丁硫啶(buthiobate)、多硫化钙(calcium polysulphide)、卡巴西霉素(capsimycin)、敌菌丹(captafo1)、克菌丹(captan)、多菌灵(carbendazim)、香芹酮(carvon)、灭螨锰(quinomethionate)、灭瘟唑(chlobenthiazone)、苯咪唑菌(chlorfenazole)、地茂散(chloroneb)、三氯硝基甲烷(chloropicrin)、百菌清(chlorothalonil)、乙菌利(chlozolinate)、clozylacon、硫杂灵(cuffaneb)、霜菌脲(cymoxanil)、环唑醇(cyproconazole)、嘧菌环胺(cyprodinil)、酯菌胺(cyprofuram)、双乙氧咪唑威(debacarb)、双氯酚(dichlorophen)、苄氯三唑醇(diclobutrazole)、diclofluanid、哒菌清(diclomezine)、氯硝胺(dicloran)、乙霉威(diethofencarb)、恶咪唑(dimethirimo1)、烯酰吗啉(dimethomorph)、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯唑醇(diniconazole)、烯唑醇-M(diniconazole-M)、敌螨普(dinocap)、二苯胺(diphenylamine)、双吡硫翁(dipyrithione)、灭菌磷(ditalimfos)、二噻农(dithianon)、吗菌灵(dodemorph)、多果定(dodine)、敌菌酮(drazoxolon)、克瘟散(edifenphos)、氧唑菌(epoxiconazole)、乙环唑(etaconazole)、乙菌定(ethirimol)、氯唑灵(etridiazole)、噁唑酮菌(famoxadon)、菌拿灵(fenapanil)、异嘧菌醇(fenarimol)、腈苯唑(fenbucoHazole)、呋菌胺(fenfuram)、种衣酯(fenitropan)、拌种咯(fenpiclonil)、苯锈啶(fenpropidin)、丁苯吗啉(fenpropimorph)、三苯基乙酸锡(fentin acetate)、毒菌锡(fentin hydroxide)、福美铁(ferbam)、嘧菌腙(ferimzone)、氟啶胺(fluazinam)、氟联苯菌(flumetover)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟菌安(fluoromide)、喹唑菌酮(fluquinconazole)、呋嘧醇(flurprimidol)、氟硅唑(flusilazole)、磺菌胺(flusulfamide)、氟酰胺(flutolanil)、粉唑醇(flutriafol)、灭菌丹(folpet)、乙膦铝(fosetyl-aluminium)、三乙膦酸钠(fosetyl-sodium)、四氟苯酞(fthalide)、麦穗宁(fuberidazole)、呋氨丙灵(furalaxyl)、呋吡唑灵(furametpyr)、灭菌安(furcarbonil)、呋菌唑(furconazole)、呋醚唑(furconazole-cis)、拌种胺(furmecyclox)、双胍盐(guazatine)、六氯苯(hexachlorobenzene)、己唑醇(hexaconazole)、土菌消(hymexazole)、烯菌灵(imazalil)、酰胺唑(imibenconazole)、双胍辛胺(iminoctadine)、双胍辛对十二烷基苯磺酸盐(iminoctadine albesilate)、双胍辛胺醋酸盐(iminoctadinetriacetate)、iodocarb、异稻瘟净(iprobenfos(IBP))、异丙定(iprodione)、人间霉素(irumamycin)、稻瘟灵(isoprothiolane)、氯苯咪菌酮(isovaledione)、春雷霉素(kasugamycin)、亚胺菌(kresoxim-methyl)、铜制剂例如氢氧化铜、环烷酸铜、氯氧化铜、硫酸铜、氧化铜、喹啉铜(oxine-copper)和波尔多液(Bordeaux mixture)、锰铜混剂(mancopper)、代森锰锌(mancozeb)、代森锰(maneb)、meferimzone、嘧菌胺(mepanipyrim)、丙氧灭锈胺(mepronil)、甲霜灵(metalaxyl)、环戊唑菌(metconazole)、磺菌威(methasulfocarb)、甲呋菌胺(methfuroxam)、代森联(metiram)、苯吡洛菌(metomeclam)、噻菌胺(metsulfovax)、米多霉素(mildiomycin)、腈菌唑(myclobutanil)、甲菌利(myclozolin)、福美镍(nickel dimethyldithiocarbamate)、异丙消(nitrothal-isopropyl)、氟苯嘧啶醇(nuarimol)、甲呋酰胺(ofurace)、噁霜灵(oxadixyl)、oxamocarb、喹菌酮(oxolinic acid)、氧化萎锈灵(oxycarboxim)、oxyfenthiin、多效唑(paclobutrazole)、稻瘟酯(pefurazoate)、戊菌唑(penconazole)、戊菌隆(pencycuron)、双氯苯磷(phosdiphen)、多马霉素(pimaricin)、粉病灵(piperalin)、多抗霉素(polyoxin)、polyoxorim、噻菌灵(probenazole)、丙氯灵(prochloraz)、杀菌利(procymidone)、百维灵(propamocarb)、propanosine-sodium、丙环唑(propiconazole)、丙森锌(propineb)、丙环唑(prothiocinazole)、定菌磷(pyrazophos)、啶斑肟(pyrifenox)、二甲嘧菌胺(pyrimethanil)、咯喹酮(pyroquilon)、氟吡呋醚(pyroxyfur)、唑喹菌酮(quinconazole)、五氯硝基苯(quintozene(PCNB))、硫和硫制剂、戊唑醇(tebuconazole)、叶枯酞(tecloftalam)、四氯硝基苯(tecnazene)、调环烯(tetcyclasis)、氟醚唑(tetraconazole)、涕必灵(thiabendazole)、噻菌腈(thicyofen)、溴氟唑菌(thifluzamide)、甲基托布津(thiophanate-methyl)、硫氰苯甲酰胺(tioxymid)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、对甲抑菌灵(tolylfluanid)、三唑酮(triadimefon)、唑菌醇(triadimenol)、丁三唑(triazbutil)、唑菌嗪(triazoxide)、杨菌胺(trichlamide)、三环唑(tricyclazole)、克啉菌(tridemorph)、肟菌酯(trifloxystrobin)、氟菌唑(triflumizole)、嗪氨灵(triforine)、烯效唑(uniconazole)、有效霉素A(validamycinA)、烯菌酮(vinclozolin)、烯霜苄唑(viniconazole)、氯菌胺(zarilamide)、代森锌(zineb)、福美锌(ziramor)或其组合。杀真菌剂还包含取代苯、硫代氨基甲酸酯、亚乙基双二硫代氨基甲酸酯(ethylene bis dithiocarbamate)、硫代邻苯二甲酰胺(thiophthalidamide)、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、敌菌灵(anilazine)、苯菌灵(benomyl)、放线菌酮(cyclohexamide)、多果定(dodine)、氯唑灵(etridiazole)、异菌脲(iprodione)、甲霜灵(metalaxyl)、thiamimefon、嗪氨灵(triforine)或其组合。本领域普通技术人员将容易理解，还可选择用于农业目的的其他已知的合成或天然存在的杀真菌剂以包含在根据本公开内容的组合物、植物种子或接种物中。
如果组合物、植物种子或接种物包含杀真菌剂，则该杀真菌剂可以是叶杀菌剂。叶杀菌剂包括铜、代森锰锌(mancozeb)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、三唑(triazoles)、环唑醇(cyproconazole)、环戊唑菌(metconazole)、丙环唑(propiconazole)、丙硫菌唑(prothioconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、嘧菌酯(azoxystrobin)、pyraclastobin、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、嘧氧菌酯(picoxystrobin)、肟菌酯(trifloxystrobin)、硫、啶酰菌胺(boscalid)、甲基托布津(thiophanate-methyl)、百菌清(chlorothanonil)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、恶醚唑(difenconazole)、粉唑醇(flutriafol)、嘧菌环胺(cyprodinil)、氟啶胺(fluazinam)、异菌脲(iprodione)、氟唑菌苯胺(penflufen)、氰霜唑(cyazofamid)、氟酰胺(flutolanil)、霜菌脲(cymoxanil)、烯酰吗啉(dimethomorph)、二甲嘧菌胺(pyrimethanil)、苯酰菌胺(zoxamide)、双炔酰菌胺(mandipropamid)、metrinam、百维灵(propamocarb)、咪唑菌酮(fenamidone)、氟醚唑(tetraconazole)、chloronab、恶霉灵(hymexazol)、立枯磷(tolclofos)和腈苯唑(fenbuconazole)。本领域普通技术人员将容易理解，还可选择用于农业目的的其他已知的合成或天然存在的杀真菌剂以包含在根据本公开内容的组合物、植物种子或接种物中。
根据本公开内容的包含杀虫剂的组合物、种子和接种剂具有提高昆虫死亡率或抑制其生长速率的能力。如本文所用，术语“昆虫(insects)”包括“昆虫纲(Insecta)”中的所有生物体。术语“成年前(pre-adult)”昆虫是指成年阶段之前的任何形式的生物体，包括例如卵、幼虫和若虫。如本文所用，术语“杀虫剂(insecticide)”和“杀虫剂的(insecticidal)”还包含“杀线虫剂(nematicide)”和“杀线虫剂的(nematicidal)”以及“杀螨剂(acaricide)”和“杀螨剂的(acaricidal)”。“杀线虫剂(nematicide)”和“杀线虫剂的(nematicidal)”是指物质提高线虫死亡率或抑制其生长速率的能力。通常，术语“线虫(nematode)”包括所述生物体的卵、幼虫、幼体(juvenile)和成熟形式。“杀螨剂(acaricide)”和“杀螨剂的(acaricidal)”是指物质提高属于“蛛形纲(Arachnida)”的蜱螨亚纲(Acari)的外寄生虫死亡率或抑制其生长速率的能力。
根据本公开内容的一方面，至少一种杀虫剂包括：
(1)乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，例如氨基甲酸酯类(carbamates)，如棉铃威(alanycarb)、恶虫威(bendiocarb)、丙硫克百威(benfuracarb)、丁酮威(butocarboxim)、丁酮砜威(butoxycarboxim)、克百威(carbofuran)、丁硫克百威(carbosulfan)、乙硫苯威(ethiofencarb)、呋线威(furathiocarb)、异丙威(isoprocarb)、速灭威(metolcarb)、杀线威(oxamyl)、抗蚜威(pirimicarb)、残杀威(propoxur)、久效威(thiofanox)、唑蚜威(triazamate)、混杀威(trimethacarb)、灭除威(XMC)和灭杀威(xylylcarb)；或有机磷酸酯类(organophosphates)，如乙酰甲胺磷(acephate)、甲基吡恶磷(azamethiphos)、乙基谷硫磷(azinphos-ethyl)、谷硫磷(azinphos-methyl)、硫线磷(cadusafos)、氯氧磷(chlorethoxyfos)、毒虫畏(chlorfenvinphos)、氯甲硫磷(chlormephos)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、蝇毒磷(coumaphos)、杀螟腈(cyanophos)、甲基内吸磷(demeton-S-methyl)、二嗪农(diazinon)、敌敌畏(dichlorvos)/DDVP、百治磷(dicrotophos)、乐果(dimethoate)、甲基毒虫畏(dimethylvinphos)、乙拌磷(disulfoton)、苯硫磷(EPN)、乙硫磷(ethion)、伐灭磷(famphur)、杀螟硫磷(fenitrothion)、噻唑酮磷(fosthiazate)、庚烯磷(heptenophos)、imicyafos、异柳磷(isofenphos)、O-(甲氧基氨基硫代磷酰基)水杨酸异丙酯(isopropylO-(methoxyaminothiophosphoryl)salicylate)、噁唑磷(isoxathion)、马拉硫磷(malathion)、灭蚜磷(mecarbam)、杀扑磷(methidathion)、速灭磷(mevinphos)、久效磷(monocrotophos)、二溴磷(naled)、氧化乐果(omethoate)、甲基对硫磷(parathion-methyl)、稻丰散(phenthoate)、甲拌磷(phorate)、亚胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、辛硫磷(phoxim)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、丙溴磷(profenofos)、胺丙畏(propetamphos)、丙硫磷(prothiofos)、吡唑硫磷(pyraclofos)、哒嗪硫磷(pyridaphenthion)、喹噁磷(quinalphos)、治螟磷(sulfotep)、丁基嘧啶磷(tebupirimfos)、双硫磷(temephos)、特丁硫磷(terbufos)、杀虫畏(tetrachlorvinphos)、甲基乙拌磷(thiometon)和敌百虫(triclorfon)。(2)GABA门控氯化物通道拮抗剂，例如环二烯有机氯类(cyclodiene-organochlorines)，如氯丹(chlordane)和/或苯基吡唑类(phenylpyrazoles)。(3)钠通道调节剂/电压门控钠通道阻断剂，例如拟除虫菊酯类(pyrethroids)，如氟丙菊酯(acrinathrin)、烯丙菊酯(allethrin)、d-顺-反烯丙菊酯(d-cis-trans allethrin)、d-反烯丙菊酯(d-trans allethrin)、联苯菊酯(bifenthrin)、生物烯丙菊酯(bioallethrin)、生物烯丙菊酯S-环戊烯基异构体(bioallethrin s-cyclopentenyl isomer)、生物苄呋菊酯(bioresmethrin)、乙氰菊酯(cycloprothrin)、氟氯氰菊酯(cyhalothrin)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-cyhalothrin)、烯炔菊酯[(EZ)-(IR)异构体](empenthrin[(EZ)-(IR)-isomer])、高氰戊菊酯(esfenvalerate)、醚菊酯(etofenprox)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)、氟氰戊菊酯(nucythrinate)、氟氯苯菊酯(flumethrin)、τ-氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、苄螨醚(halfenprox)、咪炔菊酯(imiprothrin)、噻恩菊酯(kadethrin)、氯菊酯(permethrin)、苯醚菊酯[(1R)-反式异构体]、炔丙菊酯(prallethrin)、除虫菊素(pyrethrins)(除虫菊(pyrethrum))、苄呋菊酯(resmethrin)、七氟菊酯(tefluthrin)、胺菊酯(tetramethrin)、胺菊酯[(1R)-异构体](tetramethrin[(1R)-isomer)])和四氟菊酯(transfluthrin)，或滴滴涕(DDT)或甲氧滴滴涕(methoxychlor)。(4)烟碱能乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂，例如新烟碱类(neonicotinoids)，如呋虫胺(dinotefuran)、烯啶虫胺(nitenpyram)和噻虫嗪(thiamethoxam)，或烟碱(nicotine)，或氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)。(5)烟碱能乙酰胆碱受体(nAChR)变构活化剂，例如多杀霉素类(spinosyns)，例如乙基多杀菌素(spinetoram)和多杀菌素(spinosad)。(6)氯化物通道活化剂，例如齐墩螨素类(avermectins)/米尔倍霉素类(milbemycins)，如阿维菌素(abamectin)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectinbenzoate)、雷皮菌素(lepimectin)和弥拜菌素(milbemectin)。(7)保幼激素模拟物，例如保幼激素类似物，例如烯虫乙酯(hydroprene)、烯虫炔酯(kinoprene)和烯虫酯(methoprene)，或苯氧威(fenoxycarb)，或吡丙醚(pyriproxyfen)。(8)具有未知的或未明确的作用机理的活性化合物，例如烷基卤化物(alkyl halides)，如溴甲烷(methylbromide)和其他烷基卤化物；或氯化苦(chloropicrine)，或硫酰氟(sulphurylfluoride)，或硼砂(borax)，或酒石酸氧锑钾(tartar emetic)。(9)选择性拒食剂，例如吡蚜酮(pymetrozine)或氟啶虫酰胺(flonicamid)。(10)螨虫生长抑制剂，例如四螨嗪(clofentezine)、噻螨酮(hexythiazox)和氟螨嗪(diflovidazin)，或乙螨唑(etoxazole)。(11)昆虫肠膜的微生物干扰剂，例如苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis subspecies israelensis)、球形芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subspeciesaizawai)、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subspecieskurstaki)、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subspeciestenebrionis)，和Bt植物蛋白质：CrylAb、Cry1Ac、Cry1Fa、Cry2Ab、mCry3A、Cry3Ab、Cry3Bb、Cry34/35Ab1。(12)氧化磷酸化抑制剂，ATP干扰剂，例如丁醚脲(diafenthiuron)或有机锡化合物类(organotin compounds)，例如三唑锡(azocyclotin)、三环锡(cyhexatin)和苯丁锡(fenbutatin oxide)，或炔螨特(propargite)，或三氯杀螨醇(tetradifon)。(13)通过中断H质子梯度起作用的氧化磷酸化解偶联剂，例如虫螨腈(chlorfenapyr)、4，6-二硝基邻甲酚(DNOC)和氟虫胺(sulfluramid)。(14)烟碱能乙酰胆碱受体拮抗剂，例如杀虫磺(bensultap)、杀螟丹盐酸盐(cartap hydrochloride)、杀虫环(thiocylam)和杀虫双(thiosultap-sodium)。(15)几丁质生物合成抑制剂，0型，例如双三氟虫脲(bistrifluron)、氟啶脲(chlorfluazuron)、除虫脲(diflubenzuron)、氟环脲(nucycloxuron)、氟虫脲(flufenoxuron)、氟铃脲(hexaflumuron)、虱螨脲(1ufenuron)、氟酰脲(novaluron)、多氟脲(noviflumuron)和氟苯脲(teflubenzuron)。(16)几丁质生物合成抑制剂，1型，例如噻嗪酮(buprofezin)。(17)蜕皮干扰剂(特别是对于双翅目(Diptera)，即双翅类昆虫)，例如，灭蝇胺(cyromazine)。(18)蜕皮激素受体激动剂，例如环虫酰肼(chromafenozide)、氯虫酰肼(halofenozide)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)和虫酰肼(tebufenozide)。(19)章鱼胺能激动剂。(20)复合物III电子转移抑制剂，例如氟蚁腙(hydramethylnone)，或灭螨醌(acequinocyl)，或嘧螨酯(fluacrypyrim)。(21)复合物I电子转移抑制剂，例如来自METI杀螨剂组，如喹螨醚(fenazaquin)、唑螨酯(fenpyroximate)、嘧螨醚(pyrimidifen)、哒螨灵(pyridaben)、吡螨胺(tebufenpyrad)和唑虫酰胺(tolfenpyrad)，或鱼藤酮(rotenone)(鱼藤属(Derris))。(22)电压门控钠通道阻断剂，例如茚虫威(indoxacarb)，或氰氟虫腙(metaflumizone)。(23)乙酰辅酶A羧化酶抑制剂。(24)复合物IV电子转移抑制剂，例如膦类，如磷化铝、磷化钙、膦、和磷化锌，或氰化物。(25)复合物II电子转移抑制剂，例如苯腈吡螨酯(cyenopyrafen)和丁氟螨酯(cyflumetofen)。(26)兰诺定(Ryanodine)受体效应物，例如，二酰胺类，如氯虫酰胺(chlorantraniliprole)，也以商品名RYNAXYPYRTM而已知，和氰虫酰胺(cyantraniliprole)；或上述限定的一种或多种化合物或化合物类别的任何组合。
本领域普通技术人员将容易理解，还可选择用于农业目的的其他已知的合成或天然存在的杀虫剂以包含在根据本公开内容的组合物、植物种子或接种物中。
使用本文所述的内生孢子呈现平台的筛选方法
如遍及本公开内容中所讨论的，本文公开的融合蛋白构建体和重组类芽孢杆菌属细胞可用作用于高通量筛选产生新的和/或改良的植物属性的异源蛋白的平台。这样的属性可包括在商业上显著提高植物产量和其他植物特性，例如：植物蛋白或油含量/组成改变、植物碳水化合物含量/组成改变；植物碳水化合物含量/组成改变、种子碳水化合物含量/组成改变、种子油或蛋白质组成改变；对环境或化学胁迫的耐受性增强(例如，抵抗寒冷或高温、干旱、杀虫剂或除草剂)；延迟衰老或抗病性；促进生长、增强健康；食草动物抗性；改善固氮作用或氮利用；改善根构型(rootarchitecture)或长度；提高水利用效率；生物量增加；种子重量增加；芽长增加；产量提高；改良籽粒质量或水分含量；耐受金属；病原体或害虫抗性；提高光合能力；耐盐；活力增强；提高成熟种子的干重和/或鲜重、增加单株成熟种子的数量；提高叶绿素含量；相对于参照植物/种子的代谢物或代谢组水平的可检测调节；相对于参照植物/种子的转录产物水平或转录组水平的可检测调节；相对于参照植物的蛋白质或蛋白质组水平的可检测调节；以及上述任何性状或属性的组合。此外，前述列表旨在作为非限制性实例集合。本领域普通技术人员将理解，本文公开的高通量递送平台适用于筛选本公开内容中其他地方讨论的或本领域已知的各种其他植物性状和属性。
经修饰以表达根据本公开内容的融合蛋白的重组类芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子可施用于体外生长的植物细胞、寄主植物种子、幼苗，或营养体，或其他成熟植物。异源蛋白可继而修饰或赋予体外生长的植物细胞、寄主植物种子、幼苗或成熟植物性状或属性。在选择的实施方案中，类芽孢杆菌属细胞内生孢子可用于接种种子，并且得到的新的或改良的性状或属性可能会立即明显，而在其他实施方案中，它可能直到寄主植物发育的后期才变得明显。
在一些实施方案中，用于递送融合蛋白的类芽孢杆菌属细菌对于寄主植物物种是外源的。在其他情况下，选择的类芽孢杆菌属细菌是已知定殖在寄主植物种中的内源内生菌。寄主植物可以是本文公开的任何合适的植物(单子叶植物、双子叶植物、松柏科植物等)。
通过包衣或喷雾的方式，或本领域已知的将内生孢子施用于寄主植物的任何其他方法，用于递送融合蛋白的重组类芽孢杆菌属细菌可用于接种寄主植物的种子、幼苗、营养体或其他成熟植物标本。当以液体，例如以溶液或悬浮液施用时，类芽孢杆菌属内生孢子可混合或悬浮在水溶液中。合适的液体稀释剂或载体包括水溶液、石油馏出物或其他液体载体。固体组合物可通过将类芽孢杆菌属内生孢子分散在适当分开的固体载体(例如泥炭、小麦、麸皮、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土(fuller′s earth)，巴氏消毒的土壤等)中和之上而制备。当此类制剂包含可湿性粉剂时，可使用分散剂(例如非离子、阴离子、两性或阳离子分散剂)和乳化剂。
类芽孢杆菌属内生孢子可直接施用于寄主植物种子的表面或直接施用于植物营养体的叶和茎，或作为包含其他成分的组合物的一部分。所述其他组分可包括一种或多种提高定殖率的化合物、增强植物生长或健康的化合物、杀虫剂或除草剂、或本文公开的适用于促进植物栽培和生长的任何其他化合物。此外，所述组合物可包含另外的已经被修饰以表达包含不同氨基酸序列的融合蛋白的类芽孢杆菌属内生孢子。例如，组合物可包含表达包含植物生长促进因子的融合蛋白的第一类芽孢杆菌属内生孢子，以及表达包含增强抗农药性的蛋白质的融合蛋白的第二类芽孢杆菌属内生孢子。
在选择的实施方案中，包被在寄主植物的种子上的重组类芽孢杆菌属内生孢子能够在种子萌发成营养状态时定位至植物的不同组织。例如，重组类芽孢杆菌属细胞可定位至植物中的任何组织，包括：根、不定根、种子根、根毛、芽(shoot)、叶、花、蓓蕾(bud)、穗(tassel)、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐枝、地下茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、排水器、花瓣、萼片、颖片、叶轴、维管束形成层、韧皮部和木质部。在其他实施方案中，重组类芽孢杆菌属细胞可能能够定位至植物的根和/或根毛。在可选的实施方案中，重组类芽孢杆菌属细胞可能能够定位至光合组织，例如植物的叶和芽；或定位至植物的维管组织，例如在木质部和韧皮部中。
在其他实施方案中，重组类芽孢杆菌属细胞能够定位至植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实)。在仍另一实施方案中，重组类芽孢杆菌属细胞定殖在植物的果实或种子组织中。在仍另一实施方案中，重组类芽孢杆菌属细胞能够定殖在植物上，以使其存在于植物的表面(例如植物的外部或植物的叶际)。在仍其他实施方案中，重组类芽孢杆菌属细胞能够定位至植物的基本上全部或全部组织。
包含设计用于施用于寄主植物的重组类芽孢杆菌属内生孢子的组合物可包含种子包衣组合物、根部处理剂、或叶面施用组合物。种子包衣组合物、或根部处理剂、或叶面施用组合物可包含杀真菌剂、抗菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀虫剂、植物生长调节剂、营养物或其组合。种子包衣组合物、或根部处理剂、或叶面施用组合物可进一步包含农业上可接受的载体、增粘剂、微生物稳定剂或其组合。在选择的实施方案中，种子包衣组合物、或根部处理剂、或叶面施用组合物可包含第二细菌，包括但不限于根瘤菌细菌制剂。所述组合物还可包含表面活性剂。在一实施方案中，表面活性剂的存在浓度为0.01％v/v至10％v/v。在另一实施方案中，表面活性剂的存在浓度为0.1％v/v至1％v/v。在一些实施方案中，组合物可包括微生物稳定剂(例如稳定剂)。
接种后，可筛选处理的寄主植物(例如，处理的种子、幼苗、营养体或其他成熟植物)是否存在新的或改良的性状或属性。筛选可在处理后的任何时间点进行。在选择的实施方案中，可处理种子并且直到种子发芽或达到更高级的发育阶段才进行筛选。在其他实施方案中，可处理种子、幼苗或植物营养体并且直到处理的植物已经产生收获的终产物时才进行筛选，该终产物可包含将要筛选的新的或改良的性状或属性的样品。
在筛选期间，可在体外和体内都进行各种测试以确定所处理的寄主植物被赋予了什么益处(如果有的话)。体内筛选试验包括测量植物或种子的表型性状或属性的测试(例如，测量植物生长速率或高度、作物产量、环境胁迫(如高温、寒冷或盐)抗性、生物病原体或害虫抗性、化学处理剂(例如杀虫剂或除草剂)抗性的试验)。体外筛选试验包括但不限于，测量植物提取物、组织样品、细胞样品等的组成或特性的测试。在一些实施方案中，体外筛选可包括纯化和测量在处理的寄主植物的细胞或组织中发现的给定蛋白、酶、基因转录物、代谢物或其他化合物的量或活性。在其他实施方案中，筛选可包括通过肉眼或通过显微镜目测检查处理的寄主植物的细胞或组织的结构。
在可选的实施方案中，筛选可包括经修饰以表达根据本公开内容的融合蛋白的重组类芽孢杆菌属内生孢子或营养细胞的试验，与针对处理的寄主植物的试验相反。在这些实施方案中，可对类芽孢杆菌属的家族成员细胞或内生孢子进行一种或多种活性的体外试验，例如但不限于，释放复合磷酸盐或复合铁的能力(例如，通过铁载体的分泌)；产生植物激素；产生抗细菌、抗真菌、或杀虫、或杀线虫化合物；产生和/或分泌ACC脱氨酶、乙偶姻(acetoin)、果胶酶、纤维素酶或RNase。针对类芽孢杆菌属的家族成员细胞或内生孢子而不是植物营养体的筛选方法是特别有利的，因为这种方法可能允许比针对处理的寄主植物的方法更快地检测有用的异源蛋白。
鉴定孢子表面靶向序列的方法
本公开内容公开了在类芽孢杆菌属中鉴定的几种N端孢子表面靶向序列，其可用作本文所述的异源蛋白的孢子表面呈现平台的一部分。但是，本公开内容不限于这些特定序列、其片段和变体。根据本公开内容的筛选方法可广泛用于类芽孢杆菌属和其他形成内生孢子的细菌属中以鉴定其他N端孢子表面靶向序列，其可类似地用作内生孢子呈现平台的一部分或用于其他目的。在一实施方案中，用于本发明的形成内生孢子的细菌具有抗蛋白水解的毛发状结构，如图1所示。例如，本文公开的筛选方法可用于鉴定在赖氨酸芽孢杆菌属、绿芽孢杆菌属和短小芽孢杆菌属的形成内生孢子的成员中的N端孢子表面靶向序列。
在一些示例性方面，可通过筛选类芽孢杆菌属或其他形成内生孢子的目的细菌的基因组中的开放阅读框(“ORF”)来鉴定此类序列，该开放阅读框编码具有“甘氨酸-任何残基-任何残基”的多个胶原样三联体氨基酸重复(“GXX重复”)的蛋白质，以及通过显微镜或实验确定蛋白质是否定位至孢子表面。这些GXX重复可以是多肽序列的相邻或分开的区域。在一些方面，可以筛选多肽序列中特定数量的相邻或全部GXX重复(例如，至少5、10、15、20、25或30个GXX重复)。在一些方面，蛋白质定位可通过视觉(例如，使用透射电子显微镜)或实验(例如，使用质谱分析法)确定。在一些方面，鉴定N端靶向序列的方法可进一步包括通过在类芽孢杆菌属或其他细菌细胞中表达包含假定的N端靶向序列和报告分子(例如GFP)的融合蛋白来测试假定的N端靶向序列的步骤。
在一些方面，本公开内容提供了来自类芽孢杆菌属和其他细菌属(例如，赖氨酸芽孢杆菌属、绿芽孢杆菌属和短小芽孢杆菌属)的孢子表面靶向序列，其包含通过上述筛选方法鉴定的蛋白质的N端部分。这种靶向序列的该N端靶向序列可包含内源序列的前5、10、15、20、25、30、35、40或50个氨基酸，或其片段或变体。在一些方面，N端靶向序列是与内源序列至少50％、60％、70％、80％、90％或95％相同的变体，或其片段。根据这些方法鉴定的在类芽孢杆菌属和其他细菌属中的孢子表面靶向序列可以用于产生根据本文所述的各种实施方案中的任一个的异源融合蛋白。
提供以下非限制性示例以进一步说明本公开内容。
实施例
实施例1：用于鉴定适用于内生孢子呈现的胶原样孢子表面蛋白的通用方案。
寻找类芽孢杆菌属种NRRL B-50972的完整基因组中含有胶原样GXX重复的ORF。然后通过透射电子显微镜观察胶原样孢子表面蛋白(图1)。通过质谱分析法也实验证实了胶原样孢子表面蛋白的存在。简而言之，用胰蛋白酶消化类芽孢杆菌属NRRL B-50972孢子以去除表面蛋白。通过离心去除孢子，并通过质谱分析法分析上清液以验证胶原样孢子表面蛋白的存在。该通用方案用于鉴定具有由SEQ ID NO：1-10确定的N端靶向序列的内源性类芽孢杆菌属种NRRL B-50972蛋白质。可使用相同的方法从绿芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或短小芽孢杆菌属中鉴定孢子表面蛋白以及相应的N端靶向序列。
实施例2：用于制备呈现绿色荧光蛋白(GFP)的重组类芽孢杆菌属内生孢子的通用方案。
为了产生融合构建体，通过基因合成，将编码GFP的基因与编码类芽孢杆菌属种NRRL B-50972的公开的N端靶向序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸的DNA区段(在公开的N端靶向序列的天然启动子的控制下)融合，并克隆到大肠杆菌/类芽孢杆菌属穿梭载体pAP13中。将得到的载体构建体引入到类芽孢杆菌属种NRRL B-50972中。然后将正确的转化子在Schaeffer孢子形成肉汤培养基中于30℃生长，直至形成孢子。然后通过落射荧光显微镜检查表达融合构建体的类芽孢杆菌属种NRRL B-50972孢子。GFP在表达融合构建体的孢子上可见(图2A)。还通过流式细胞术检查了类芽孢杆菌属种NRRL B-50972孢子。表达融合构建体的孢子比野生型孢子具有明显更高的荧光性(图2B)。
实施例3：用于制备呈现任意目的蛋白质的重组类芽孢杆菌属内生孢子的通用方案。
如上文实施例2中所描述的，可培养、转化和筛选类芽孢杆菌属细胞(例如，类芽孢杆菌属种NRRL B-50972)，以产生具有根据本公开内容的N端孢子表面靶向序列的融合构建体。筛选可以通过质谱分析法或本领域已知的任何其他生物化学或视觉手段(例如，目的蛋白质可以用GFP或其他选择/筛选标签标记)进行。用于产生融合构建体的N端靶向序列可包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10、18、20、21、22、24、26、28、30中的任一个的多肽，或其片段或变体。在一些方面，N端靶向序列可包含具有一个或多个残基的序列，该残基对应于SEQ IDNO：2和8的成对比对中的相同残基(图3)，其能够将多肽靶向至到孢子表面。类似地，可使用包含具有一个或多个残基的序列的N端靶向序列，该残基对应于如图3提供的SEQ ID NO：2和8的成对比对中的相同/保守残基。
例如，N端靶向序列可包含M-X-V-X-S-T-G-P-I-X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X-X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V-L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T-L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X(SEQID NO：31)(其中“X”代表任何氨基酸)，或包含其任何连续的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个残基区段。在另一个实施例中，N端靶向序列可包含M-X-V-X-S-T-G-P-I-X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X-X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V-L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T-L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X-X-N-X-V-I-T-X-X-X-X-A-X-X-X-X-F-E-F-V-F-T-T-X-X-X-X-E-N-E-X-Q-X-S-V-W-G-K-X-X-X-G-Q-L-V-X-A-H-R-X-V-S-X-E-L-L-V-X-X-X-X(SEQID NO：32)(其中“X”代表任何氨基酸)，或包含其任何连续的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120个残基区段。
在一些方面，选择的N端靶向序列可与这些序列有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性，并且仍然能够将融合构建体靶向至孢子表面。
实施例4：使用重组类芽孢杆菌属内生孢子将在促进植物生长的化合物的产生中涉及的融合蛋白递送至种子、幼苗、植物或植物部位的方法。
可使用本文公开的类芽孢杆菌属内生孢子递送系统将负责产生促进植物生长的化合物的酶递送至植物。例如，丁二醇脱氢酶将乙偶姻转化为2，3-丁二醇。2，3-丁二醇是一种促进植物生长的化合物。表达该酶的类芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域。
实施例5：使用重组类芽孢杆菌属内生孢子将在单个类芽孢杆菌属内生孢子上的多种融合蛋白递送至种子、幼苗、植物或植物部位的方法。
单个重组类芽孢杆菌属内生孢子可用于呈现一种以上的异源融合蛋白。这是通过构建两个(或多个)单独的融合蛋白来实现的。将要呈现在类芽孢杆菌属内生孢子表面上的每种异源蛋白的编码序列分别与在其天然启动子控制下的N端靶向序列融合。融合蛋白构建体可克隆到相同的质粒载体或不同的质粒载体中，并且通过电穿孔引入到类芽孢杆菌属成员中。然后得到的类芽孢杆菌属内生孢子在孢子表面上表达两种异源蛋白的混合物。这对于堆积多种蛋白质无脊椎动物毒素以减轻害虫抗性特别有用。
实施例6：使用多个重组类芽孢杆菌属内生孢子(各自呈现一种或多种不同的融合蛋白)的组合向种子、幼苗、植物或植物部位提供一种或多种不同的融合蛋白质的方法。
在某些情况下，提供一种以上的类芽孢杆菌属内生孢子的组合的递送，各个类芽孢杆菌属内生孢子都表达一种或多种不同的异源蛋白(如上所述)。例如，递送固氮酶至植物根部周围的区域减少了对化学氮肥的需求。细菌中的固氮作用可能至少需要八或九种不同的酶，并且根据物种的不同可能需要多达二十种不同的酶。在此，各自表达固氮途径中的不同酶成分的类芽孢杆菌属内生孢子的组合的递送可能是有用的。例如，异源呈现NifH、NifD和NifK的类芽孢杆菌属内生孢子可与异源呈现NifE、NifN和NifD的类芽孢杆菌属内生孢子以混合物组合，并递送到根周围的区域。
实施例7：使用重组类芽孢杆菌属内生孢子将杀死无脊椎动物植物害虫的无脊椎动物毒素递送到种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域或作为种子处理剂的方法。
对无脊椎动物(包括但不限于昆虫或线虫)有拮抗作用的蛋白质毒素可使用类芽孢杆菌属内生孢子系统递送。例如，同时具有杀虫性的和杀线虫性的Cry毒素(包括但不限于Cry5B和Cry21A)可与N末端靶向序列融合，以在类芽孢杆菌属内生孢子中表达。表达Cry毒素或其他蛋白质无脊椎动物毒素的类芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域，以保护其免受无脊椎动物植物病原体侵害。
实施例8：使用类芽孢杆菌属内生孢子将对细菌植物害虫有拮抗作用的肽、蛋白质或酶递送到种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域或作为种子处理剂的方法。
细菌素是由细菌产生的对其他细菌有拮抗活性的小肽。细菌素是通过核糖体合成的，不同于通过大的非核糖体肽合成酶合成的其他抗菌分子(例如杆菌肽)，基于该事实，细菌素特别适合于使用类芽孢杆菌属内生孢子系统递送。可将一种或多种细菌素的编码序列与N端靶向序列融合，以在类芽孢杆菌属内生孢子中表达。表达细菌素的类芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域，以保护其免受细菌植物病原体侵害。
实施例9：使用类芽孢杆菌属内生孢子将对真菌植物害虫有拮抗作用的肽、蛋白质或酶递送到种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域或作为种子处理剂的方法。
真菌的主要细胞壁成分是几丁质。几丁质酶是一种降解几丁质的酶，并且可在类芽孢杆菌属内生孢子的表面表达，以通过破坏真菌的细胞壁来保护其免受真菌植物病原体侵害。表达几丁质酶的类芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域。
实施例10：使用类芽孢杆菌属内生孢子将降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶递送到种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域或作为种子处理剂的方法。
可使用重组类芽孢杆菌属内生孢子将负责细菌、真菌或植物营养源的降解或修饰的酶递送至植物。例如，分解复杂多糖的糖苷水解酶可用于通过用表达这种(或另一种)目的酶的重组类芽孢杆菌属内生孢子处理植物或种子而使有益的根际细菌获得简单的糖。
实施例11：使用类芽孢杆菌属内生孢子通过筛选源自植物生长促进生物防治剂的基因组DNA文库用于评估对植物生长促进生物防治剂的响应的方法。
当今使用的许多生物防治菌株对外源DNA吸收是顽固的(recalcitrant)，致使研究人员无法产生所述菌株的靶向遗传修饰。由于这个挑战，阐明这些生物防治菌株的植物生长促进作用的作用机理是非常困难的。类芽孢杆菌属内生孢子提供了一种用于鉴定负责生物防治菌株的潜在植物生长促进作用的特定基因的新方法。首先，将N端靶向序列和天然启动子克隆到合适的大肠杆菌/芽孢杆菌属穿梭载体(例如，pHP13)中，得到适合在类芽孢杆菌属内生孢子上表达异源蛋白的载体。所有克隆步骤和质粒增殖均在大肠杆菌中进行。接下来，从目标植物生长促进生物防治菌株中提取总gDNA。将gDNA剪切成片段(酶促或超声)，并连接到上述载体中，以在类芽孢杆菌属内生孢子上表达异源蛋白以产生由源自目的生物防治菌株的所有遗传物质组成的gDNA文库。将得到的载体文库通过电穿孔引入到类芽孢杆菌属的成员中，并且将细菌铺于含有合适抗生素选择剂的琼脂平板上，以选择类芽孢杆菌属内生孢子转化子。评估了每个表达目标生物防治菌株的gDNA的不同片段的各个类芽孢杆菌属内生孢子转化子的植物生长促进作用。这些作用可包括但不限于，绿化增强、萌发改善、植物活力增加、根长度增加、根质量增加、植物高度增加、叶面积增加或抵抗害虫。可对发现能调节上述植物健康参数的类芽孢杆菌属内生孢子转化子中的载体进行测序，以鉴定源自负责观察到的植物生长促进作用的生物防治菌株的遗传决定子。
实施例12：使用类芽孢杆菌属内生孢子鉴定对植物无脊椎动物、细菌和真菌植物病原体有拮抗作用的新的或未表征的毒素的方法。
当今使用的许多生物防治菌株对外源DNA吸收是顽固的，致使研究人员无法产生所述菌株的靶向遗传修饰。由于这个挑战，阐明这些生物防治菌株对无脊椎动物、细菌和真菌植物病原体有毒的作用机理是非常困难的。类芽孢杆菌属内生孢子提供了一种用于鉴定负责生物防治菌株的潜在植物保护作用的特定基因的新方法。首先，将N端靶向序列和天然启动子克隆到合适的大肠杆菌/芽孢杆菌属穿梭载体(例如，pHP13)中，得到适合在类芽孢杆菌属内生孢子上表达异源蛋白的载体。所有克隆步骤和质粒繁殖均在大肠杆菌中进行。接下来，从目标植物生长促进生物防治菌株中提取总gDNA。将gDNA剪切成片段(酶促或超声)，并连接到上述载体中，以在类芽孢杆菌属内生孢子上表达异源蛋白以产生由源自目的生物防治菌株的所有遗传物质组成的gDNA文库。将得到的载体文库通过电穿孔引入到类芽孢杆菌属的成员中，并且将细菌铺于含有合适抗生素选择剂的琼脂平板上，以选择类芽孢杆菌属内生孢子转化子。评估了每个表达目标生物防治菌株的gDNA的不同片段的各个类芽孢杆菌属内生孢子转化子对无脊椎动物、细菌和真菌植物病原体的拮抗活性。可对发现对上述植物病原体有拮抗作用的类芽孢杆菌属内生孢子转化子中的载体进行测序，以鉴定源自负责观察到的植物保护作用的生物防治菌株的遗传决定子。
实施例13：使用无活力的类芽孢杆菌属内生孢子处理种子、幼苗、植物或植物部位以保护植物免受病原体侵害或改善植物健康的方法。
可能需要用无活力的(死的)类芽孢杆菌属内生孢子的类芽孢杆菌属内生孢子递送系统来递送促进植物健康的蛋白/酶或植物保护蛋白/酶。类芽孢杆菌属内生孢子可通过充分的热处理、UV照射、γ辐射或高压处理灭活并使其失去活力。得到的无活力的类芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部位周围的区域。
实施例14：制备呈现来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(β-Gal)的重组类芽孢杆菌属内生孢子的通用方案。
为了产生融合构建体，通过基因合成将编码β-gal的基因与编码类芽孢杆菌属种NRRL B-50972的公开的N端靶向序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸的DNA区段(在公开的N端靶向序列的天然启动子的控制下)融合，并克隆到源自pMiniMad载体的大肠杆菌/类芽孢杆菌属穿梭载体中，该pMiniMad载体在Patrick，JE和Kearns，DB中描述(参见Patrick，JE andKearns，DB.2008.MinJ(YvjD)is a Topological Determinant of Cell Division inBacillus subtilis.Molecular Microbiology.70：1166-1179)。将得到的载体构建体通过电穿孔引入到多粘类芽孢杆菌菌株(菌株1)中，类似于Kim和Timmusk的描述(参见Kim andTimmusk(2013)，“A Simplified Method for Gene Knockout and Direct Screening ofRecombinant Clones for Application in Paenibacillus polymyxa，”PLoSONE，8(6)：e68092，doi：doi：10.1371/journal.pone.0068092)。还制备了包含无靶向序列的穿梭载体的对照。然后将正确的转化子在Schaeffer孢子形成肉汤培养基中于30℃生长，直至形成孢子。将得到的培养物离心以将上清液与孢子分离。然后表达融合构建体或只包含空穿梭载体的多粘类芽孢杆菌孢子和相应的上清液通过体外试验检查。基于5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-Gal)的水解，在表达的融合构建体的孢子上β-gal具有功能。结果示于下表3。
表3.上清液和孢子的β-半乳糖苷酶活性。
Figure BDA0002585354830000821
Figure BDA0002585354830000831
对于无色，aX-gal水解得分为(-)；或对于蓝色，得分为(+)，表示X-gal被β-半乳糖苷酶水解。
实施例15：制备呈现来自苏云金芽孢杆菌的营养期杀虫蛋白3(Vip3)(SEQ ID NO：17)的重组类芽孢杆菌属内生孢子的通用方案。
为了产生融合构建体，通过Gibson组装将编码vip3的基因(SEQ ID NO：16)与编码类芽孢杆菌属种NRRL B-50972的公开的N端靶向序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸的DNA区段融合到实施例14中所述的大肠杆菌/类芽孢杆菌属穿梭载体中。融合体的表达在公开的N端靶向序列的天然启动子的控制下。如上所述，将得到的载体构建体通过电穿孔引入到多粘类芽孢杆菌菌株(菌株1)中。然后将正确的转化子在Schaeffer孢子形成肉汤培养基中于30℃生长，直至形成孢子。
实施例16：表达Vip3的多粘类芽孢杆菌菌株对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的活性。
评估了来自实施例15的表达Vip3的多粘类芽孢杆菌菌株对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)(甜菜夜蛾(beet armyworm))的杀虫活性。进行96孔板试验以测试包括空载体对照和活性组分(active cargo)(SEQ ID NO：2-Vip3)的每个多粘类芽孢杆菌菌株的杀虫活性。通过以下方法产生该菌株的孢子：在Schaeffer孢子形成肉汤培养基中生长直至形成孢子，然后将得到的整个肉汤培养物离心以将上清液与孢子分离。然后将来自所述菌株的孢子样品加到含有琼脂基质的96孔微孔板中，类似于Marrone等人的描述(参见Marrone et al.，(1985)，“Improvements in Laboratory Rearing of the Southern Corn Rootworm，Diabrotica undecimpuncta howardi Barber(Coleoptera：Chrysomelidae)，on anArtificial Diet and Corn，”J.Econ.Entomol.，78：290-293)。然后将孢子样品在水中稀释并以100％、33％、11％、3.7％和1.2％的浓度加到平板上。
在使处理干燥后，将大约20个来自甜菜夜蛾的卵添加到每个孔中。几天后，通过评估处理的幼虫的发育迟缓得分和死亡率得分来确定杀虫活性。根据以下等级对昆虫发育迟缓得分进行评定：1＝严重发育迟缓；2＝高度发育迟缓，生长最小；3＝略小于未处理的对照；4＝与未处理的对照相同的大小。昆虫死亡率得分基于以下等级：4＝0-25％死亡率，3＝26-50％死亡率，2＝51-79％死亡率，1＝80-100％死亡率。
用表达目标Vip3(即SEQ ID NO：2-Vip3)的11％类芽孢杆菌属孢子处理的甜菜夜蛾幼虫比用相同浓度的表达空载体的类芽孢杆菌属孢子处理的甜菜夜蛾幼虫表现出的发育迟缓高2倍(见表4)。类似地，用表达目标Vip3的11％类芽孢杆菌属孢子处理的幼虫比用相同浓度的表达空载体的类芽孢杆菌属孢子处理的甜菜夜蛾幼虫的死亡率高1.5倍(见表5)。
表4.处理的甜菜夜蛾的发育迟缓评定。
Figure BDA0002585354830000841
表5.处理的甜菜夜蛾的死亡率评定。
Figure BDA0002585354830000842
除非另外定义，本文中全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。所引用的全部出版物、专利和专利出版物因全部目的通过引用全文纳入本文。
应理解，所公开的发明不限于所述特定的方法、方案和材料，因为它们能够发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定的实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅通过所附的权利要求来限定。
本领域技术人员仅使用常规实验方法，就将了解或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被以下权利要求所涵盖。
序列表
<110> 拜耳作物科学有限合伙公司
<120> 基于类芽孢杆菌属的内生孢子呈现平台、产品和方法
<130> BCS179003 WO
<150> US 62/587,371
<151> 2017-11-16
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 1
atggtagtat tatctactgg acctattgca aacgatcctg ttctaggagt cagacccacc 60
caactggtca cagtaaaaat agataaccga gattctgtaa attcttctat cgttttgatc 120
gagggtttta ttttaaacgg tagcagaaca ttatatgtac aacaattagt ggtagtggga 180
ccaaatgcgg ttataacgag gaatttcttt gcaaatgtag acgcatttga attcgttttt 240
accactagcg gaccagcaga gaatgaaact caaatttctg tttggggtaa agatgcattg 300
gggcaattag tacctgccca tcggttagta tctgacgaac ttttaggaac cgatcga 357
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 2
Met Val Val Leu Ser Thr Gly Pro Ile Ala Asn Asp Pro Val Leu Gly
1 5 10 15
Val Arg Pro Thr Gln Leu Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Ser
20 25 30
Val Asn Ser Ser Ile Val Leu Ile Glu Gly Phe Ile Leu Asn Gly Ser
35 40 45
Arg Thr Leu Tyr Val Gln Gln Leu Val Val Val Gly Pro Asn Ala Val
50 55 60
Ile Thr Arg Asn Phe Phe Ala Asn Val Asp Ala Phe Glu Phe Val Phe
65 70 75 80
Thr Thr Ser Gly Pro Ala Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ser Val Trp Gly
85 90 95
Lys Asp Ala Leu Gly Gln Leu Val Pro Ala His Arg Leu Val Ser Asp
100 105 110
Glu Leu Leu Gly Thr Asp Arg
115
<210> 3
<211> 231
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 3
atgcctgcct tggatgaatg gagtagtata caacaaatcg atatggaggt gtttgtattg 60
ggtcgtcccg aattgaaacg aaagaaaggc cgtaaaaaag acgtttttat ccgctcttgg 120
tttagtaaaa aacgtccgaa gagaaaatgc cattcgaaac gaaagtgctt ttgcaaggaa 180
atcgtcgtca gaaagcaaat cgtccgtgta aatatacctc aaaatgtttt a 231
<210> 4
<211> 77
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 4
Met Pro Ala Leu Asp Glu Trp Ser Ser Ile Gln Gln Ile Asp Met Glu
1 5 10 15
Val Phe Val Leu Gly Arg Pro Glu Leu Lys Arg Lys Lys Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Asp Val Phe Ile Arg Ser Trp Phe Ser Lys Lys Arg Pro Lys Arg
35 40 45
Lys Cys His Ser Lys Arg Lys Cys Phe Cys Lys Glu Ile Val Val Arg
50 55 60
Lys Gln Ile Val Arg Val Asn Ile Pro Gln Asn Val Leu
65 70 75
<210> 5
<211> 438
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 5
atgaaacaca gaaaaccgtt caggttcagt ggtgcttcaa aaaaagacga ggactgcaaa 60
ccacctaaaa ttagcagaga aacggaagaa cttctcaaac tgattaagga attagtcgcc 120
atcatcccgc tcgttttcgc aaacccgtct gtggctaatg taacttcatt gcaacagatt 180
ttacagcgat tattagctct cgcaaataaa ttgagactta gaggctcggc taagacagat 240
ttattagcgg cgttggaact ggctatcgtg gcgtcggaag ccactctttt ctccccgatc 300
ggtgttggaa cgacactgca acaactgctg gaagtcttat tgtctattat tttgcaggaa 360
ccccttgatc ctgctcttaa agacagtttg atcagtgcaa tcagaaatgc cgaaacggct 420
atcagtattg cgttgggt 438
<210> 6
<211> 146
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 6
Met Lys His Arg Lys Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ala Ser Lys Lys Asp
1 5 10 15
Glu Asp Cys Lys Pro Pro Lys Ile Ser Arg Glu Thr Glu Glu Leu Leu
20 25 30
Lys Leu Ile Lys Glu Leu Val Ala Ile Ile Pro Leu Val Phe Ala Asn
35 40 45
Pro Ser Val Ala Asn Val Thr Ser Leu Gln Gln Ile Leu Gln Arg Leu
50 55 60
Leu Ala Leu Ala Asn Lys Leu Arg Leu Arg Gly Ser Ala Lys Thr Asp
65 70 75 80
Leu Leu Ala Ala Leu Glu Leu Ala Ile Val Ala Ser Glu Ala Thr Leu
85 90 95
Phe Ser Pro Ile Gly Val Gly Thr Thr Leu Gln Gln Leu Leu Glu Val
100 105 110
Leu Leu Ser Ile Ile Leu Gln Glu Pro Leu Asp Pro Ala Leu Lys Asp
115 120 125
Ser Leu Ile Ser Ala Ile Arg Asn Ala Glu Thr Ala Ile Ser Ile Ala
130 135 140
Leu Gly
145
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 7
atggcggtta tatcaactgg acccatagaa aataattatg tcagtggtat tcggcctact 60
catcgagtta ccgtgaaaat tgataatcgt gatactgtga attcttctac ggtattgatt 120
cagggttttt atctaaatgg tacaagaacg ttatatgtgc ttgattttat aactgtaaat 180
tcaaatgaag tgattacaaa agattattat gctgatttta attcatttga gtttgttttt 240
accactgaaa gtgttacaga aaatgagatt caagtttcag tctggggtaa aaattcaatg 300
gggcagttag tgacagctca ccgtgttgta tcttccgaat tgcttgtagc aaaaggcgcg 360
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 8
Met Ala Val Ile Ser Thr Gly Pro Ile Glu Asn Asn Tyr Val Ser Gly
1 5 10 15
Ile Arg Pro Thr His Arg Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Thr
20 25 30
Val Asn Ser Ser Thr Val Leu Ile Gln Gly Phe Tyr Leu Asn Gly Thr
35 40 45
Arg Thr Leu Tyr Val Leu Asp Phe Ile Thr Val Asn Ser Asn Glu Val
50 55 60
Ile Thr Lys Asp Tyr Tyr Ala Asp Phe Asn Ser Phe Glu Phe Val Phe
65 70 75 80
Thr Thr Glu Ser Val Thr Glu Asn Glu Ile Gln Val Ser Val Trp Gly
85 90 95
Lys Asn Ser Met Gly Gln Leu Val Thr Ala His Arg Val Val Ser Ser
100 105 110
Glu Leu Leu Val Ala Lys Gly Ala
115 120
<210> 9
<211> 330
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 9
ttgggaaatt tattgttgcg taaaagatat cgcttgaccc aggtggcaag gaaaaaaaag 60
aaggaaagag atcaaaagat gggagcgttc cgttttatgc ccatttatcg tacaggaacg 120
agctgcattc gtaacaaaaa gggaaataaa cgtatttata gacagggtag aagaagagag 180
agaatatgcg cttatagaca tcatttgcac gctgagcggg tgccctcagg tttatcaaat 240
aaaaaaatct gttttatgaa attcaaaggt caacgaagac tgcgaggcgg cgaacaggag 300
cctcaaggca attcaggagg agcagttcaa 330
<210> 10
<211> 110
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 10
Leu Gly Asn Leu Leu Leu Arg Lys Arg Tyr Arg Leu Thr Gln Val Ala
1 5 10 15
Arg Lys Lys Lys Lys Glu Arg Asp Gln Lys Met Gly Ala Phe Arg Phe
20 25 30
Met Pro Ile Tyr Arg Thr Gly Thr Ser Cys Ile Arg Asn Lys Lys Gly
35 40 45
Asn Lys Arg Ile Tyr Arg Gln Gly Arg Arg Arg Glu Arg Ile Cys Ala
50 55 60
Tyr Arg His His Leu His Ala Glu Arg Val Pro Ser Gly Leu Ser Asn
65 70 75 80
Lys Lys Ile Cys Phe Met Lys Phe Lys Gly Gln Arg Arg Leu Arg Gly
85 90 95
Gly Glu Gln Glu Pro Gln Gly Asn Ser Gly Gly Ala Val Gln
100 105 110
<210> 11
<211> 200
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 11
gaaacgggag tggtgaaatc attgatgctc agcgcattgt tgcggatgag caactagatt 60
cttgaaacac aacatatgta cagagataga accacaatcg taacaaatgg ttgagacata 120
aaatagaggg aacaggatct tgagaaagat ctcattgttc acaaaaaagc ttgattttac 180
tagaaaggag ggagtatcca 200
<210> 12
<211> 200
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 12
ctatatacat gcgcaaaaaa cggcttcaaa ctgcttcata attacggcac gtttcttctg 60
gcgccttcgg ctgttccttg gtgtgaacca aggtaacagc cgggggcgct atttttatat 120
aactagatga atgtacctgt acaaagaccc atttttatcc aaaattagat cattgcctat 180
caaccacagg acagatgtcc 200
<210> 13
<211> 200
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 13
agcgttacaa gttggaagcc cggtttggaa atacagaaaa tcgatattaa agcttatgta 60
caagcatcca ataataattc ttgtgtggtg attcaccctt ttcgcttcag taaatatatt 120
gttaatatct gcgaaacggg gcgatgatcc acctgtcacc tctacagtag ggagaaatgt 180
gaaggaggag atatttgaac 200
<210> 14
<211> 200
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 14
agcggtattt tttgtgcccc acaaaaaagg ctcccttatc aaaaggggtt tttatcacat 60
aggaaatgtc cacacgtata tatagatgtt acatattata taaatcgtga acattcgaat 120
ctcaatacta gttatagaag aggtggcatt agtgatagga ttatagcttc gttactttag 180
acaaaaggag aatccaatat 200
<210> 15
<211> 200
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 15
atttattttt ttgaaaaatt acaggggatt cagtcccact ttcagtaaat tcagaaagaa 60
aaataatgta acggcgaaat ggaagtgagc attaaaaatt tatttttttg gaaaaaaatt 120
taaggaggtc atctgtccaa tcaggttcgt ttagattcca taagataatg aaactgtact 180
taattatgga ggtgtcagta 200
<210> 16
<211> 2370
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 16
atgaacaaaa acaacactaa attatctact cgtgctcttc catctttcat tgactacttc 60
aacggtattt acggtttcgc tacaggtatc aaagacatta tgaacatgat cttcaaaact 120
gatactggtg gtgacttaac tcttgatgaa attcttaaga accaacaatt acttaacgac 180
atctctggta aacttgatgg tgttaacggt tctcttaacg acttaatcgc acaaggtaac 240
cttaacactg aactaagcaa agaaatccta aaaattgcta atgaacaaaa ccaagttctt 300
aatgatgtta acaacaaact agacgctatt aacactatgt tacgtgtata ccttccaaaa 360
atcacttcaa tgctttctga tgttatgaaa caaaactacg ctttatcttt acaaatcgaa 420
tacttatcta agcaattaca ggaaatctct gataaattag acatcatcaa cgttaacgta 480
ttaattaaca gcactcttac agaaattacg ccagcttacc aacgtatcaa atacgttaat 540
gaaaaattcg aagaacttac attcgctact gaaacttctt ctaaagttaa aaaagacggt 600
tctcctgctg atattttaga tgaattaact gaattaactg aacttgctaa atctgtaact 660
aaaaacgatg ttgacggttt cgaattctac cttaacactt tccacgatgt aatggtaggc 720
aacaaccttt tcggtcgctc tgctcttaaa actgctagtg aattaatcac taaagaaaac 780
gttaaaactt ctggtagcga agtaggtaac gtttacaatt tcttaatcgt actaacagct 840
cttcaagcac aagcattcct tactcttact acttgccgta aattacttgg tttagctgat 900
attgattaca cttctatcat gaacgaacat cttaacaaag aaaaagaaga attccgtgtt 960
aatatccttc cgacattatc taacactttt tctaacccaa attacgctaa ggttaaaggt 1020
agcgatgaag atgcaaaaat gatcgtagaa gctaaaccag gtcacgcatt aatcggtttc 1080
gagatctcaa acgacagcat cacagtttta aaagtttatg aagctaaact taaacaaaac 1140
taccaagtag ataaagacag cctgtctgaa gttatctacg gtgacatgga taaattatta 1200
tgtccagatc aaagtgaaca aatctactac actaataaca tcgtattccc aaacgaatat 1260
gtaatcacta aaatcgattt cacaaagaaa atgaaaactc ttcgttacga ggtaactgct 1320
aacttttacg attcatctac tggtgaaatt gatcttaaca agaaaaaagt tgaatcttct 1380
gaagctgaat accgtacatt atctgctaac gatgatggtg tttatatgcc tttaggtgta 1440
atttctgaaa cattcttaac tcctatcaac ggtttcggtc ttcaagctga tgaaaactct 1500
cgcttaatca ctttaacatg caaatcttac cttcgcgaac ttttattagc tacagattta 1560
tctaacaaag aaactaaact tattgttcct ccatctggat tcattagcaa tatcgttgag 1620
aacggtagca ttgaagaaga taaccttgaa ccttggaaag ctaacaacaa aaacgcatac 1680
gttgatcata caggtggtgt taacggtaca aaagctcttt acgtacacaa agatggtggt 1740
attagccaat tcatcggcga caaattaaag ccaaaaactg aatacgttat ccaatacact 1800
gtaaaaggta aaccatcaat tcatttaaaa gatgaaaata ctggttacat tcattacgaa 1860
gacactaaca acaaccttga agattaccaa acaatcaaca aacgttttac aacaggaact 1920
gacttaaaag gtgtttactt aattttaaaa tctcaaaacg gtgacgaggc atggggcgac 1980
aacttcatca ttctagaaat ttctccttct gaaaaattac tttctcctga attaatcaat 2040
actaacaact ggacttctac aggttctact aacatttctg gaaacacttt aacactttac 2100
caaggtggtc gtggtatctt aaaacaaaac ttacaattag attcattctc tacataccgt 2160
gtttatttct ctgtatctgg tgacgctaac gtacgtatcc gtaactctcg tgaagtatta 2220
tttgaaaaac gttacatgtc aggagctaaa gatgtatctg aaatgttcac tactaaattc 2280
gaaaaagata atttctacat tgaattatct caaggtaaca acctttacgg tggtccaatc 2340
gttcacttct acgatgtttc tatcaaataa 2370
<210> 17
<211> 789
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 17
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
<210> 18
<211> 110
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 18
Met Gly Asn Leu Leu Leu Arg Lys Arg Tyr Arg Leu Thr Gln Val Ala
1 5 10 15
Arg Lys Lys Lys Lys Glu Arg Asp Gln Lys Met Gly Ala Phe Arg Phe
20 25 30
Met Pro Ile Tyr Arg Thr Gly Thr Ser Cys Ile Arg Asn Lys Lys Gly
35 40 45
Asn Lys Arg Ile Tyr Arg Gln Gly Arg Arg Arg Glu Arg Ile Cys Ala
50 55 60
Tyr Arg His His Leu His Ala Glu Arg Val Pro Ser Gly Leu Ser Asn
65 70 75 80
Lys Lys Ile Cys Phe Met Lys Phe Lys Gly Gln Arg Arg Leu Arg Gly
85 90 95
Gly Glu Gln Glu Pro Gln Gly Asn Ser Gly Gly Ala Val Gln
100 105 110
<210> 19
<211> 3582
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 19
atggtagtat tatctactgg acctattgca aacgatcctg ttctaggagt cagacccacc 60
caactggtca cagtaaaaat agataaccga gattctgtaa attcttctat cgttttgatc 120
gagggtttta ttttaaacgg tagcagaaca ttatatgtac aacaattagt ggtagtggga 180
ccaaatgcgg ttataacgag gaatttcttt gcaaatgtag acgcatttga attcgttttt 240
accactagcg gaccagcaga gaatgaaact caaatttctg tttggggtaa agatgcattg 300
gggcaattag tacctgccca tcggttagta tctgacgaac ttttaggaac cgatcgagga 360
atccaaggac ctcaaggagt tcagggagcc caaggcgacc aaggtgacca aggacctcag 420
ggtgttcaag gacctcaagg agttcaggga gcccaaggag accaaggagt tcaaggcgta 480
caaggagacc aaggacctca aggagtccaa ggcgaccaag gtgaccaagg acctcaagga 540
gttcaaggag cgcaaggtga ccaaggccct caaggagttc agggagccca aggtgaccaa 600
ggacctcaag gcgttcaggg agcgcaaggt gaccaaggac ctcaaggtga tcaaggacct 660
cagggagttc aaggagacca aggcgatcaa ggaccacagg gagttcaagg cgtacaaggt 720
gatcaaggac ctcagggtgt tcaaggagac caaggcgacc aaggacctca gggtgttcaa 780
ggcgtacaag gtgaccaagg acctcagggt gttcaaggcg tacaaggtga ccaaggacct 840
cagggagttc aaggagacca aggcgatcaa ggaccacagg gagttcaagg cgtacaaggt 900
gatcaaggac ctcagggtgt tcaaggagac caaggcgacc aaggacctca gggtgttcaa 960
ggcgtacaag gtgaccaagg acctcagggt gttcaaggcg tacaaggtga ccaaggacct 1020
cagggtgttc aaggcgtaca aggtgaccaa ggacctcaag gagttcaggg agcccaaggt 1080
gaccaaggac cacagggagt tcaaggcgac caaggacctc aaggacctca aggagttcaa 1140
ggtgaccaag gacctcaggg cgttcaagga tcccaaggtg atcaaggacc tcaaggagtt 1200
caaggcgtac aaggacctca aggagttcaa ggcgtacaag gcgaccaagg acctcaaggt 1260
gttcagggag cccaaggcga ccaaggccct caaggagttc aaggagtcca aggtgaccaa 1320
ggaccacagg gagttcaagg accgcaaggt gaccaaggac cacagggagt tcagggagtc 1380
caaggcgacc aaggacctca aggagtccaa ggcgaccaag gtgaccaagg acctcaagga 1440
gttcaaggag cgcaaggtga ccaaggccct caaggagttc agggagccca aggtgaccaa 1500
ggacctcaag gcgttcaggg agcgcaaggt gaccaaggac ctcaaggtga tcaaggacct 1560
cagggagttc aaggagacca aggcgatcaa ggaccacagg gagttcaagg cgtacaaggt 1620
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<210> 20
<211> 1193
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 20
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Gly Val Gln Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Asp Gln Gly
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<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
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gctataccag taaccgcgca gactcgtctg ctccttgtct tctctgcaac agctacggga 1440
ctctccctcg taaacaccat cgtgggttat gcgagcgcag gcattaccat cacctga 1497
<210> 26
<211> 498
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 26
Met Lys His Arg Lys Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ala Ser Lys Lys Asp
1 5 10 15
Glu Asp Cys Lys Pro Pro Lys Ile Ser Arg Glu Thr Glu Glu Leu Leu
20 25 30
Lys Leu Ile Lys Glu Leu Val Ala Ile Ile Pro Leu Val Phe Ala Asn
35 40 45
Pro Ser Val Ala Asn Val Thr Ser Leu Gln Gln Ile Leu Gln Arg Leu
50 55 60
Leu Ala Leu Ala Asn Lys Leu Arg Leu Arg Gly Ser Ala Lys Thr Asp
65 70 75 80
Leu Leu Ala Ala Leu Glu Leu Ala Ile Val Ala Ser Glu Ala Thr Leu
85 90 95
Phe Ser Pro Ile Gly Val Gly Thr Thr Leu Gln Gln Leu Leu Glu Val
100 105 110
Leu Leu Ser Ile Ile Leu Gln Glu Pro Leu Asp Pro Ala Leu Lys Asp
115 120 125
Ser Leu Ile Ser Ala Ile Arg Asn Ala Glu Thr Ala Ile Ser Ile Ala
130 135 140
Leu Gly Gly Thr Ala Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Pro
145 150 155 160
Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Gly Pro Gly Pro Val
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly
180 185 190
Pro Val Gly Ala Ala Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Pro Val Gly Ala
195 200 205
Ala Gly Pro Ile Gly Ala Ala Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Ala
210 215 220
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
245 250 255
Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ala Gly Ala
260 265 270
Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Ala Gly Ala Ile Gly Ala Thr
275 280 285
Gly Ala Thr Gly Thr Ala Gly Ala Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
290 295 300
Thr Ala Gly Ala Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Ala Gly Val
305 310 315 320
Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gly Ala Ile Ile Pro Phe Ala Ser Gly Gly
325 330 335
Pro Ala Ile Leu Thr Thr Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Thr Thr Ser
340 345 350
Leu Ile Gly Phe Gly Ser Ser Ala Thr Gly Ile Ser Leu Val Gly Gly
355 360 365
Thr Ile Asp Leu Thr Gly Thr Leu Ala Gly Pro Leu Ile Asn Phe Ala
370 375 380
Phe Ser Val Pro Arg Asp Gly Val Ile Thr Ser Ile Ala Gly Tyr Phe
385 390 395 400
Ser Thr Thr Ala Ala Leu Thr Leu Val Gly Ser Thr Ala Thr Ile Thr
405 410 415
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Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Ala Pro Pro Leu Thr Gly Ile Ile Ala
435 440 445
Leu Gly Thr Ile Ser Asn Gly Ile Thr Thr Gly Leu Ala Ile Pro Val
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Thr Ala Gln Thr Arg Leu Leu Leu Val Phe Ser Ala Thr Ala Thr Gly
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Leu Ser Leu Val Asn Thr Ile Val Gly Tyr Ala Ser Ala Gly Ile Thr
485 490 495
Ile Thr
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<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 27
atggcggtta tatcaactgg acccatagaa aataattatg tcagtggtat tcggcctact 60
catcgagtta ccgtgaaaat tgataatcgt gatactgtga attcttctac ggtattgatt 120
cagggttttt atctaaatgg tacaagaacg ttatatgtgc ttgattttat aactgtaaat 180
tcaaatgaag tgattacaaa agattattat gctgatttta attcatttga gtttgttttt 240
accactgaaa gtgttacaga aaatgagatt caagtttcag tctggggtaa aaattcaatg 300
gggcagttag tgacagctca ccgtgttgta tcttccgaat tgcttgtagc aaaaggcgcg 360
ggaccgacag ggctaacggg agccactggc gctaccggag ctactggcgt cacgggtgtt 420
accggagtca ctggcgctac cggaactacg ggcgttatgg gtgataccgg agtcactgga 480
gttaccggag ttactggcgt taccggggct atcggagtca ctggcgctat cggagtcacg 540
ggggctaccg gagccacagg agttacgggg gccactggag ttaccggggc tattggagtt 600
actggcgcta tcggagtcac tggcgctacc ggagctactg gcgttactgg ggctactggc 660
gctactggag tcacaggagt taccggggct actggcgtta ccggagttac cggagttact 720
ggcatcaccg gggctatcgg agctactggc gttaccggag ctactggcgt cacgggtatt 780
accggagtca ctggcgttac cggggctact ggcgttactg gagttactgg catcacaggc 840
gttaccggag ttactggtgt tactggtgtt actggagcta ctggcgttac cggggctact 900
ggcgctaccg gagccactgg cgttactgga gttactggcg ttactggcgc tactggagct 960
actggtgtta ccggggctac cggggctacc ggtgtcacgg gtgataccgg tgtcactggc 1020
gctaccgggg ctaccggagt ttctggcgct actggggcta ctggtgtcac gggtgatacc 1080
ggagttaccg gagctactgg cgctacaggt gctaccggag ttactggcgg aacaggtgca 1140
accggagtta ctggagttac tggcgttacc ggggctatcg gagtcactgg cgctactgga 1200
gctactggag ctgctggaat cacgggtgtt accggagtta ctggcatcac cggtgctacc 1260
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accggagtta ctggagttac tggagttatt ggagttactg gagttactgg agttactgga 1560
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ggcgctatcg gagtcacggg ggctaccggg gtcactggcg ctaccggagc tactggcgta 1680
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atcacgggtg ttaccggagt cactggtgtt actggagtta ccggagctac tggcatcacg 1800
ggtgataccg gagtcactgg cgctaccgga gctactggcg ttacgggtgt taccggagtc 1860
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gctaccggag ttactggcgt aacaggtgca gccggagtta ctggcatcac gggggctacc 1980
ggagttactg gagttaccgg ggctattgga gtcactggcg ctatcggagt cacgggggct 2040
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ggttctactg gggtcactgg cgctactggc gttaccggag ctactggcgt cacgggttct 2220
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gttactggcg ctaccggagc tactggcgtt accggagcta ctggcgctac tggcgtcacg 2520
ggtgataccg gagtcactgg ggctaccgga gttaccggag tcactggcgc tactggggct 2580
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tcgagattct cagctttttc ataa 3744
<210> 28
<211> 1247
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 28
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Ile Arg Pro Thr His Arg Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Thr
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Ile Thr Lys Asp Tyr Tyr Ala Asp Phe Asn Ser Phe Glu Phe Val Phe
65 70 75 80
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Lys Asn Ser Met Gly Gln Leu Val Thr Ala His Arg Val Val Ser Ser
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Glu Leu Leu Val Ala Lys Gly Ala Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr
130 135 140
Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Val Met Gly Asp Thr Gly Val Thr Gly
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Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly Val Thr Gly Ala
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Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly Val Thr Gly
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Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr
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Gly Ile Thr Gly Ala Ile Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly
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Thr Gly Val Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr
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290 295 300
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Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr
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Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Ser Gly Ala Thr Gly
340 345 350
Ala Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala
355 360 365
Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr
370 375 380
Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly
385 390 395 400
Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ile
405 410 415
Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ile Thr
420 425 430
Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly
435 440 445
Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala
450 455 460
Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr
465 470 475 480
Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly
485 490 495
Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Ile Gly Val
500 505 510
Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr
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Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly
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Gly Ala Ala Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly
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Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly
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645 650 655
Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Ile Gly Val Thr
660 665 670
Gly Ala Ile Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly
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Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly
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Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Ser Gly Ala Thr Gly Val Thr
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Gly Val Ser Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly
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Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly
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Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asp Thr Gly Val Thr Gly Val Thr
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Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Ser Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly
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Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Ala
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Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Thr Gly Val
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Thr Gly Val Thr Gly Val Ser Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala
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<210> 29
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<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 29
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gcgaactga 849
<210> 30
<211> 282
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.) NRRL B-50972
<400> 30
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165 170 175
Gly Pro Pro Leu Asn Leu Asp Gly Ile Thr Val Val Pro Glu Val Gln
180 185 190
Arg Tyr Phe Tyr Phe Ala Asp Ser Asp Leu Thr Gly Thr Val Glu Ile
195 200 205
Pro Ile Ser Gln Phe Thr Asn Asp Asp Gly Gln Leu Ala Ser Gln Leu
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<210> 31
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(58)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 31
Met Xaa Val Xaa Ser Thr Gly Pro Ile Xaa Asn Xaa Xaa Val Xaa Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
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<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 32
Met Xaa Val Xaa Ser Thr Gly Pro Ile Xaa Asn Xaa Xaa Val Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Arg Pro Thr Xaa Xaa Val Thr Val Lys Ile Asp Asn Arg Asp Xaa
20 25 30
Val Asn Ser Ser Xaa Val Leu Ile Xaa Gly Phe Xaa Leu Asn Gly Xaa
35 40 45
Arg Thr Leu Tyr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Asn Xaa Val
50 55 60
Ile Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Glu Phe Val Phe
65 70 75 80
Thr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Glu Xaa Gln Xaa Ser Val Trp Gly
85 90 95
Lys Xaa Xaa Xaa Gly Gln Leu Val Xaa Ala His Arg Xaa Val Ser Xaa
100 105 110
Glu Leu Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120

Claims (49)

1.一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含：
(i)包含至少15、30、45、60、75或90个核苷酸的多核苷酸序列；
(ii)与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列；或
(iii)包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29的至少45、90、135、180、225、270、315或345个连续核苷酸的片段的多核苷酸序列；
其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述片段起始于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29的第一个核苷酸。
3.权利要求1或2的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含与SEQ 1D NO：1、7、19或27具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列。
4.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中所述片段编码SEQ ID NO：2或SEQ 1D NO：8的氨基酸1-15或1-30、1-45、1-60、1-75、1-90、1-105或1-115。
5.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中与所述N端信号肽异源的多肽包括；
(a)植物生长刺激蛋白；
(b)酶；
(c)蛋白质；
(d)与类芽孢杆菌属异源的多肽；
(e)治疗性蛋白质；或
(f)植物免疫刺激蛋白。
6.前述权利要求中任一项的核酸分子，进一步包含第三多核苷酸序列，其编码：
(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其中所述多肽位于所述N端信号肽和与所述N端信号肽异源的多肽之间；
(b)包含选择性标记的多肽；
(c)包含可视化标记的多肽；
(d)包含蛋白质识别/纯化结构域的多肽；或
(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接所述N端信号肽和与所述N端信号肽异源的多肽。
7.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中所述类芽孢杆菌属内生孢子是类芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述类芽孢杆菌属种包括：类芽孢杆菌属种NRRL B-50972、土地类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或皮奥利亚类芽孢杆菌；或
由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16S rRNA基因与类芽孢杆菌属种的16S rRNA基因有至少97、98或99％同一性。
8.前述权利要求中任一项的核酸分子，其可操作地连接至与所述第二多核苷酸序列和类芽孢杆菌属中的至少一个异源的启动子元件。
9.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含：
与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、19、23、25、27或29具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的密码子优化的多核苷酸序列；或其片段，在相同条件下，与相应的未优化序列相比，所述密码子优化的多核苷酸序列或其片段在类芽孢杆菌属内生孢子中以更高的速率或水平表达。
10.一种包含N端信号肽的融合蛋白，所述N端信号肽可操作地连接至与N端信号肽异源的多肽，其中所述N端信号肽包含：
(i)包含至少15、30、45、60、75、90、105或115个残基的多肽；
(ii)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、18、20、21、22、24、26、28、30、31或32的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或
(iii)包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、18、20、21、22、24、26、28、30、31或32的至少15、30、45、60、75、90、105或115个连续氨基酸的片段的多肽；
其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面。
11.权利要求10的融合蛋白，其中所述片段起始于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、18、20、21、22、24、26、28、30、31或32的第一个氨基酸。
12.权利要求10或11的融合蛋白，其中所述多肽序列包含与SEQ ID NO：2、8、20、21、22、28、31或32具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的序列。
13.权利要求10-12中任一项的融合蛋白，其中所述片段包含SEQ ID NO：2、8、31或32的氨基酸1-15或1-30、1-45、1-60、1-75、1-90、1-105或1-115。
14.权利要求10-13中任一项的融合蛋白，其中与所述N端信号肽异源的多肽包括：
(a)植物生长刺激蛋白；
(b)酶；
(c)蛋白质；
(d)与类芽孢杆菌属异源的多肽；
(e)治疗性蛋白质；或
(f)植物免疫刺激蛋白。
15.权利要求10-14中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含：
(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其位于所述N端信号肽和与所述N端信号肽异源的多肽之间；
(b)包含选择性标记的多肽；
(c)包含可视化标记的多肽；
(d)包含至少一种蛋白质识别/纯化结构域的多肽；或
(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接信号肽和与所述N端信号肽异源的多肽。
16.权利要求10-15中任一项的融合蛋白，其中所述类芽孢杆菌属内生孢子是类芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述类芽孢杆菌属种包括：类芽孢杆菌属NRRL B-50972、土地类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或皮奥利亚类芽孢杆菌；或
由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16S rRNA基因与类芽孢杆菌属种的16S rRNA基因有至少97、98或99％同一性。
17.一种包含细菌染色体的重组类芽孢杆菌属细胞，所述细菌染色体包含权利要求1-9中任一项的核酸分子。
18.一种包含权利要求1-9中任一项的核酸分子的载体，其中所述载体包含质粒、人工染色体或病毒载体。
19.权利要求18的载体，进一步包含以下至少一种：
(a)在类芽孢杆菌属细胞中提供稳定维持的复制起点；
(b)在类芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的复制起点；
(c)在类芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的对温度敏感的复制起点；
(d)编码选择性标记的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列；或
(e)编码植物生长刺激蛋白的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列。
20.一种用载体转化的重组类芽孢杆菌属细胞，所述载体包含权利要求1-9中任一项的核酸分子。
21.权利要求20的重组类芽孢杆菌属细胞，其中所述类芽孢杆菌属细胞是类芽孢杆菌属种，其包括：类芽孢杆菌属种NRRL B-50972、土地类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或皮奥利亚类芽孢杆菌；或具有16S rRNA基因的细菌，所述16S rRNA基因与类芽孢杆菌属种的16SrRNA基因有至少97、98或99％同一性。
22.一种在类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面上呈现异源融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)用重组载体转化能够形成孢子的类芽孢杆菌属细胞，所述重组载体包含权利要求1-6中任一项的核酸分子；以及
b)在孢子形成条件下表达由权利要求1-6中任一项的核酸分子编码的融合蛋白，使得所述融合蛋白被靶向至由孢子形成产生的类芽孢杆菌属内生孢子的孢子表面，
其中所述N端信号肽包含：(i)包含至少5、10、15、20、25或30个残基的多肽；
(ii)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或
(iii)SEQ ID NO：2、4、6、8或10的至少5、10、15、20、25或30个连续氨基酸的片段。
23.一种组合物，其包含：
a)一种或多种表达权利要求10-16中任一项的融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属细胞，其中与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及
b)至少一种生物防治剂；任选地，
以协同有效量。
24.用权利要求1-9中任一项的核酸、权利要求10-16中任一项的融合蛋白、权利要求20或21的重组细菌细胞或权利要求23的组合物处理的种子。
25.一种处理植物、种子、植物部位或植物周围土壤以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：
同时或依次施用a)表达权利要求10-16中任一项的融合蛋白的重组产内生孢子的类芽孢杆菌属内生孢子，其中与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及
b)至少一种生物防治剂；任选地，
以协同有效量。
26.一种筛选用重组类芽孢杆菌属内生孢子处理的寄主植物的方法，其包括以下步骤：
a)施用包含经修饰以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白的类芽孢杆菌属内生孢子的组合物至能够被类芽孢杆菌属永久或暂时定殖的种子、幼苗或植物营养体，以产生处理的种子、幼苗或植物营养体；
b)通过检测和任选地测量处理的种子、幼苗或植物营养体的性状、成分或属性来筛选处理的种子、幼苗或植物营养体。
27.权利要求26的方法，其中所述筛选步骤包括以下一个或多个：
a)至少一种包括检测并任选地量化一种或多种化合物的存在、水平、水平变化、活性或定位的体外试验，所述一种或多种化合物包含在由从处理的种子、幼苗或植物营养体获得的细胞或组织样品制备的提取物中；和/或
b)至少一种包括检测和任选地量化处理的种子、幼苗或植物营养体的性状、成分或属性的体内试验。
28.一种筛选在类芽孢杆菌属细胞中表达的农业重要特性的异源蛋白或肽的方法，其包括：
a)修饰类芽孢杆菌属细胞以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白以产生重组类芽孢杆菌属细胞；以及
b)通过检测和任选地量化由重组类芽孢杆菌属细胞产生的化合物的水平或活性来筛选类芽孢杆菌属细胞。
29.一种处理植物、种子、人或动物的方法，其包括：
给予植物、种子、人或动物包含由重组类芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子的组合物；
其中所述重组类芽孢杆菌属细胞表达权利要求10-16中任一项的融合蛋白。
30.权利要求29的方法，其中所述组合物已经被热灭活或灭菌，使得无活力的类芽孢杆菌属细胞保留。
31.一种组合物，其包含根据权利要求10-16中任一项的分离的和/或纯化的融合蛋白。
32.一种将目的蛋白递送至植物、种子或田地的方法，其包括：
将包含重组类芽孢杆菌属内生孢子的组合物施用于植物、种子或田地；
其中所述重组类芽孢杆菌属内生孢子已被修饰以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白。
33.权利要求32的方法，其中所述组合物被施用于田地：
a)在种植前或种植后；
b)在出苗前或出苗后；
c)作为粉末、悬浮液或溶液；和/或
d)其中所述组合物进一步包含一种或多种刺激植物生长或保护植物免受害虫侵害的其他化合物。
34.一种用于鉴定能够将蛋白质靶向至形成内生孢子的细菌的孢子表面的N端信号序列的方法，其包括：
筛选形成内生孢子的细菌的基因组中至少一个开放阅读框，所述开放阅读框编码具有多个胶原样三联体重复的蛋白质，所述胶原样三联体重复具有序列“GLY-X-X”，其中“X”代表任何氨基酸；以及
通过显微镜或实验确定在筛选步骤中鉴定出的至少一种蛋白质定位至形成内生孢子的细菌的孢子表面。
35.权利要求34的方法，其中所述形成内生孢子的细菌包括具有蛋白水解抗性的毛发状结构。
36.权利要求34或35的方法，进一步包括：鉴定来自至少一种在确定步骤中鉴定为定位至孢子表面的蛋白质的假定的N端信号序列，并在形成内生孢子的细菌中表达包含所述假定的N端信号序列与报告基因的融合蛋白。
37.权利要求36的方法，进一步包括：基于融合蛋白在孢子表面上的表达来选择融合蛋白。
38.权利要求37的方法，进一步包括：用目的核苷酸序列替换选择的融合蛋白中的报告基因以产生第二融合蛋白，并在形成内生孢子的细菌中表达所述第二融合蛋白。
39.权利要求34-38中任一项的方法，其中所述细菌是类芽孢杆菌属、绿芽孢杆菌属、短小芽孢杆菌属或赖氨酸芽孢杆菌属的成员。
40.权利要求39的方法，其中所述细菌是类芽孢杆菌属的成员。
41.权利要求34-40中任一项的方法，其中，使用透射电子显微镜或质谱分析法确定定位。
42.一种编码N端信号肽的核酸分子，其中所述信号肽包含：
a)通过权利要求34-41中任一项的方法确定定位至形成内生孢子的细菌的孢子表面的蛋白质的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120个N端残基的连续区段；
b)与通过权利要求34-41中任一项的方法确定定位至形成内生孢子的细菌的孢子表面的蛋白质的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120个N端残基的连续区段具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的序列；
其中当在细菌中表达时，所述区段或序列能够将包含所述区段或序列的融合蛋白靶向至形成内生孢子的细菌的孢子表面。
43.一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：
(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含权利要求42的序列或区段，并且所述N端信号肽能够将融合蛋白靶向至细菌内生孢子的孢子表面。
44.权利要求43的核酸分子，进一步包含上游调控序列，所述上游调控序列在细菌细胞的孢子形成过程中引起融合蛋白的转录。
45.权利要求44的核酸分子，其中所述细菌细胞是类芽孢杆菌属的家族成员。
46.权利要求43-45中任一项的核酸分子，其中所述上游调控序列包含：
(a)SEQ ID NO：11-15中的任一个；
(b)包含SEQ ID NO：11-15中的任一个的至少25、50、100、150个连续核苷酸的片段的序列；
(c)与SEQ ID NO：11-15中的任一个或其25、50、100或150个核苷酸片段相比具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的序列；
其中所述上游调控序列包含在细菌细胞的孢子形成过程中具有转录活性的启动子。
47.一种编码上游调控序列和目的蛋白质的核酸分子，其包含：(a)编码所述上游调控序列的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码所述目的蛋白质的第二多核苷酸序列；
其中所述目的蛋白质与所述上游调控序列是异源的，并且所述上游调控序列在细菌细胞的孢子形成过程中引起所述目的蛋白质的转录。
48.权利要求47的核酸分子，其中所述细菌细胞是类芽孢杆菌属的家族成员。
49.权利要求47或48的核酸分子，其中所述上游调控序列包含：
(a)SEQ ID NO：11-15中的任一个；
(b)包含SEQ ID NO：11-15中的任一个的至少25、50、100或150个连续核苷酸的片段的序列；
(c)与SEQ ID NO：11-15中的任一个或其25、50、100或150个核苷酸片段相比具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的序列；
其中所述上游调节序列包含在细菌细胞的孢子形成过程中具有转录活性的启动子。
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