CN113507835A - 内生孢子展示平台、产品和方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了可用于将蛋白和肽靶向至由短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的家族成员产生的内生孢子的表面的信号序列以及使用其的方法。并且同样地提供了使用特定的N端靶向序列及其衍生物在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的家族成员的孢子外壁上展示异源分子，例如肽、多肽和其他重组构建体。

Description

内生孢子展示平台、产品和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月15日提交的美国临时专利申请号62/768,077、62/768,063和62/767,997的优先权，每篇申请的全部内容通过引用的方式纳入本文。

引用电子提交的序列表

通过EFS-Web将序列表的正式副本作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，该文件名称为“BCS189008WO_ST25”，创建于2019年11月13日，大小为169千字节，并与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文档中的序列表是本说明书的一部分，并且该序列表通过引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开内容提供了可用于多种应用的产品，例如将目的异源分子递送至植物。特别地，本公开内容记载了内生孢子展示方法和相关的靶向序列。例如，本公开内容提供了可用于多种应用的N端信号序列，例如将异源蛋白、肽和其他重组构建体靶向至短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)或绿芽孢杆菌属(Viridibacillus)的孢子外壁，以及内生孢子和使用其的方法。这样的N端信号序列可以用作用于本文所公开的短芽孢杆菌属种、赖氨酸芽孢杆菌属种或绿芽孢杆菌属种中表达的融合蛋白的靶向信号，产生具有位于孢子外壁上的目的分子的内生孢子。可以将这些内生孢子施用于宿主，例如植物宿主。所得平台适合高通量筛选目的蛋白的有益性状(例如农业性状(对除草剂的抗性、促进植物的生长和/或健康、保护免遭昆虫侵害、保护免遭真菌、细菌或病毒性植物病原体的侵害等)。本公开内容提供其他相关产品和方法。

背景技术

现代农业技术在很大程度上依赖于促进或增强植物健康和生长的组合物，以提高作物的产量和质量。这样的组合物通常包括有机或无机肥料、营养物质和其他促进植物正常生长和发育的化合物。然而，已经充分确定的是，许多这样的组合物的长期或过度使用可能导致负面副作用，例如土壤酸化或土壤中养分平衡的不稳定。而且，过度使用可能导致有害的终产物在为供人类消费而种植的作物中富集。

现代农场通常还依赖于使用多种化学物质(例如，杀虫剂、除草剂、杀菌剂、杀线虫剂和杀真菌剂)来防治害虫，并确保商业化种植作物的高产量。许多这样的化合物表现出广泛的活性，并且在高浓度下可能对人类和动物有害。另外，某些化合物表现出脱靶效应。此外，这些合成化合物中的至少一些是不可生物降解的。近年来，存在着来自消费者的对在减少暴露或不暴露于合成杀虫剂或杀真菌剂的情况下种植和收获的农产品越来越大的压力。使用合成杀虫剂或杀真菌剂引起的另一个问题是，重复和/或专一地使用往往导致选择出抗性害虫。通常，抗性害虫对具有相同作用模式的其他活性成分也具有交叉抗性。因此，害虫防治组合物和化合物的开发困难且昂贵(例如，由于安全考虑和抗性的迅速发展)。

基因工程方法也已经被用于促进植物生长和/或健康，而不依赖合成化学物质。例如，可以修饰作物以引入或修饰与植物生长和/或健康有关的基因，和/或引入编码天然或合成害虫防治剂的基因。可以使用病毒载体将转基因引入目标植物。近年来，报道称使用细菌将重组蛋白递送至植物取得了部分成功。然而，迄今为止，这种成功在很大程度上局限于芽孢杆菌科(Bacillaceae)的家族成员，更具体地说，局限于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，枯草芽孢杆菌是被最充分表征的革兰氏阳性细菌，并且是孢子形成研究的主要细菌模型。枯草芽孢杆菌作为递送和表达平台的关注进一步归因于以下事实：人们已经充分了解了枯草芽孢杆菌的基因组和与蛋白合成和分泌相关的生物学途径。但是，由于细菌之间的高度遗传多样性，基于枯草芽孢杆菌研究的研究结果通常无法直接转换到芽孢杆菌科的家族内部和外部成员。例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)内生孢子缺少蜡样芽孢杆菌(B.cereus)家族成员产生的孢子外壁层。

因此，尽管已知某些递送异源遗传物质的方法，但是在本领域中需要开发用于此类遗传物质的新的递送和表达平台。

发明内容

本公开内容描述了解决上述需要的方法、组合物和遗传构建体，例如，通过提供一种使用短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的孢子形成成员将重组酶和其他目的分子(例如，肽或蛋白)递送至环境(例如，植物或田地)的新平台等。

在一方面，本公开内容提供了表达融合蛋白的重组的产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，所述融合蛋白包含：(i)赋予或修饰植物性状或属性的至少一种异源蛋白或肽(例如，植物生长刺激化合物的产生或活化中所涉及的酶；或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶；或保护植物免受病原体或害虫侵害的酶、蛋白或肽)；以及(ii)将融合蛋白定位至各自的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的N端靶向序列。该一般性组合物可进一步包含其他组分(例如，促进植物生长和/或健康的组分)。此外，本文公开的方法的具体实施方案提供了赋予或以其他方式修饰植物性状或属性的异源蛋白和肽的高效高通量筛选。当在本公开内容中提及N端信号肽(或靶向序列)或包含其的融合蛋白时，应理解，必须基于表达构建体的细胞或内生孢子的细菌属来选择用于任何此类构建体的适合序列，并且本公开内容未设想属间使用。换言之，与短芽孢杆菌属相容的N端靶向序列示于表1和图1-3中，与赖氨酸芽孢杆菌属相容的N端靶向序列示于表2和图4-5中，且与绿芽孢杆菌属相容的N端靶向序列示于表3和图6中。本文还公开了在这些各自细菌属的每一个中保留N端靶向功能的这些序列的变体和片段。

在另一方面，本公开内容提供了一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含：(i)与表1(对于短芽孢杆菌属)、表2(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何多核苷酸序列具有至少60％、70％或80％序列同一性的多核苷酸序列；或(ii)包含表1(对于短芽孢杆菌属)、表2(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何多核苷酸序列的至少60个连续核苷酸的片段的多核苷酸序列；其中所述N端信号肽能够将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁。

在所选择的方面，与所述N端信号肽异源的多肽包含：(a)植物生长或免疫刺激蛋白中的至少一种；(b)酶；(c)蛋白；(d)与短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属异源的多肽；或(e)治疗性蛋白。在所选择的方面，所述核酸分子还包含第三多核苷酸序列，其编码：(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其中所述多肽位于N端信号肽和与N端信号肽异源的多肽之间；(b)包含选择性标记物的多肽；(c)包含可视化标记物的多肽；(d)包含蛋白识别/纯化结构域的多肽；或(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接N端信号肽和与该N端信号肽异源的多肽。

在所选择的方面，短芽孢杆菌属内生孢子是由短芽孢杆菌属种形成的内生孢子，其包括：土壤短芽孢杆菌(B.agri)、艾登短芽孢杆菌(B.aydinogluensis)、波茨坦短芽孢杆菌(B.borstelensis)、简短短芽孢杆菌(B.brevis)、中孢短芽孢杆菌(B.centrosporus)、桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)、溪河短芽孢杆菌(B.fluminis)、美丽短芽孢杆菌(B.formosus)、黄褐色短芽孢杆菌(B.fulvus)、人参短芽孢杆菌(B.ginsengisoli)、污染短芽孢杆菌(B.invocatus)、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、利氏短芽胞杆菌(B.levickii)、喜湖短芽孢杆菌(B.limnophilus)、马赛短芽孢杆菌(B.massiliensis)、硝化短芽孢杆菌(B.nitrificans)、人参土壤短芽胞杆菌(B.panacihumi)、副短短芽孢杆菌(B.parabrevis)、罗伊兹短芽抱杆菌(B.reuszeri)或热红短芽抱杆菌(B.thermoruber)。

在所选择的方面，赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子是由赖氨酸芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述赖氨酸芽孢杆菌属种包括：球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)、耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusacetophenoni)、嗜碱赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus alkaliphilus)、清国酱赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus chungkukjangi)、堆肥赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacilluscomposti)、污染赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus contaminans)、Lysinibacilluscresolivorans、长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)、锰矿土赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus manganicus)、芒果赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus mangiferihumi)、马赛赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus massiliensis)、迈氏赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus meyeri)、奥德赛赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus odysseyi)、巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus pakistanensis)、低硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus parviboronicapiens)、新斗里赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillussinduriensis)、烟草赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus tabacifolii)、变形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus varians)、解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)或耐盐赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus halotolerans)。

在所选择的方面，绿芽孢杆菌属内生孢子是由绿芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述绿芽孢杆菌属种包括：田地绿芽孢杆菌(Viridibacillus arvi)、沙地绿芽孢杆菌(ridibacillus arenos)或雷氏绿芽孢杆菌(Viridibacillus neidei)。

在所选择的方面，核酸分子可操作地连接至与第二多核苷酸序列以及短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属中的至少一个异源的启动子元件。

在所选择的方面，与N端信号肽异源的多肽包括：(a)植物生长或免疫刺激蛋白中的至少一种；(b)酶；(c)与短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属异源的多肽；(d)治疗性蛋白(例如，抗生素或抗炎蛋白)；或(e)提供农业上重要特性的蛋白，该农业上重要特性包括但不限于：杀虫活性，杀真菌活性，植物生长、健康或免疫刺激活性，和/或改善环境的抵性。其他农业上重要特性包括改善的作物特征，其包括：出苗(emergence)、作物产量、蛋白含量、油含量、淀粉含量、更发达的根系、改善的根部生长、改善的根部尺寸维持、改善的根部效率、改善的胁迫耐受性(例如，耐干旱、热、盐、紫外线、水、寒冷)、乙烯减少(减少产生和/或抑制接收)、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、更少的死基生叶、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、色素含量、光合活性、需要更少的输入(例如，肥料或水)、需要更少的种子、更高产的分蘖产量、开花更早、谷粒成熟更早、植物倒逆(倒伏)减少、枝条生长增加、植物活力增强、植物直立性增加以及早且更好的萌发。

在所选择的方面，所述融合蛋白还包含：(a)含有一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，该多肽位于N端信号肽和与N端信号肽异源的多肽之间；(b)包含选择性标记物的多肽(例如，赋予抗生素抗性的蛋白)；(c)包含可视化元件(例如荧光标签，如绿色荧光蛋白(GFP))的多肽；(d)包含至少一种蛋白识别/纯化结构域(例如，HIS标签)的多肽；或(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接信号肽和与N端信号肽异源的多肽。

在可选的方面，本公开内容提供了一种包含细菌染色体的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，所述细菌染色体包含本文公开的任一方面中的核酸分子。

在可选的方面，本公开内容提供了一种包含本文公开的任一方面的核酸分子的载体，其中所述载体包含质粒、人工染色体或病毒载体。

在所选择的方面，所述载体进一步包含以下中的至少一种：(a)在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞中提供稳定维持的复制起点；(b)在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的复制起点；(c)在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的对温度敏感的复制起点；(d)编码选择标记物的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列；或(e)编码植物生长刺激蛋白的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列。

在可选的方面，本公开内容提供了一种用载体转化的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，所述载体包含本文公开的任一方面的核酸分子。

在所选择的方面，短芽孢杆菌属细胞为短芽孢杆菌属种，其包括：土壤短芽孢杆菌、艾登短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、简短短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、桥石短芽孢杆菌、溪河短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、黄褐色短芽孢杆菌、人参短芽孢杆菌、污染短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、利氏短芽胞杆菌、喜湖短芽孢杆菌、马赛短芽孢杆菌、硝化短芽孢杆菌、人参土壤短芽胞杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊兹短芽抱杆菌或热红短芽抱杆菌。

在所选择的方面，赖氨酸芽孢杆菌属细胞为赖氨酸芽孢杆菌属种，其包括：球形赖氨酸芽孢杆菌、耐硼赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌、嗜碱赖氨酸芽孢杆菌、清国酱赖氨酸芽孢杆菌、堆肥赖氨酸芽孢杆菌、污染赖氨酸芽孢杆菌、Lysinibacillus cresolivorans、长赖氨酸芽孢杆菌、锰矿土赖氨酸芽孢杆菌、芒果赖氨酸芽孢杆菌、马赛赖氨酸芽孢杆菌、迈氏赖氨酸芽孢杆菌、奥德赛赖氨酸芽孢杆菌、巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌、低硼赖氨酸芽孢杆菌、新斗里赖氨酸芽胞杆菌、烟草赖氨酸芽胞杆菌、变形赖氨酸芽胞杆菌、解木糖赖氨酸芽孢杆菌或耐盐赖氨酸芽孢杆菌。

在所选择的方面，绿芽孢杆菌属细胞为绿芽孢杆菌属种，其包括：田地绿芽孢杆菌、沙地绿芽孢杆菌或雷氏绿芽孢杆菌。

在可选的方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含：a)一种或多种表达本文公开的任一方面的融合蛋白的重组的产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，其中与N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及b)至少一种生物防治剂；任选地，以协同有效量。

在可选的方面，本公开内容提供了用本文公开的任一方面的核酸、融合蛋白、细菌细胞或组合物中的至少一种经处理的种子。

在可选的方面，本公开内容提供了一种处理植物、种子、植物部分或植物周围土壤以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：同时或依次施用：a)表达本文公开的任一方面的融合蛋白的重组的产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子，其中与N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及b)至少一种生物防治剂；任选地，以协同有效量。

在可选的方面，本公开内容提供了一种筛选用重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子处理的宿主植物的方法，其包括以下步骤：a)将包含经修饰以表达根据本文公开的任一方面的融合蛋白的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的组合物施用至能够被短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属永久或暂时定殖的种子、幼苗或营养繁殖苗(vegetative plant)，以产生经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗；b)通过检测和任选地测量经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性来筛选经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗。

在所选择的方面，筛选步骤包括以下一个或多个：(a)至少一种体外测定，包括检测并任选地定量一种或多种化合物的存在、水平、水平变化、活性或定位，该一种或多种化合物被包含在由从经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗获得的细胞或组织样品制备的提取物中；和/或(b)至少一种包括检测和任选地定量经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性的体内(in vivo)测定。

在可选的方面，本公开内容提供了一种筛选在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞中表达的异源蛋白或肽的农业上重要特性得方法，其包括：(a)修饰短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞以表达根据本文公开的方面的融合蛋白以产生重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞；以及(b)通过检测和任选地定量由重组的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞产生的化合物的水平或活性来筛选短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞。

在可选的方面，本公开内容提供了一种处理植物、植物种子、人或动物的方法，其包括：向植物、植物种子、人或动物给予包含从由重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子中分离出孢子外壁的组合物；其中所述重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞表达本文公开的任一方面的的融合蛋白。在所选择的方面，所述动物可以包括作为家畜饲养的动物，例如牛。

在所选择的方面，所述组合物已经被热灭活或灭菌，使得保留无活力的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞。

在可选的方面，本公开内容提供一种组合物，其包含根据本文公开的任一方面的分离的和/或纯化的融合蛋白。

在可选的方面，本公开内容提供了一种包含分离的和/或纯化的由重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子(其已被修饰以表达根据本文公开的任一方面的融合蛋白)产生的孢子外壁的组合物。

在可选的方面，本公开内容提供了一种包含由重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子(其已被修饰以表达根据本文公开的任一方面的融合蛋白)产生的孢子外壁的组合物。

在所选择的方面，由重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁包括：(a)孢子外壁的基底层；(b)孢子外壁的毛状层(hair-likelayer)；(c)(a)和(b)的混合物；(d)从短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子中获得的粗制孢子外壁的部分或提取物；和/或(e)从短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子获得的粗制孢子外壁的部分或提取物，与相同量的粗制孢子外壁相比，其富含一定量或浓度的所述融合蛋白(a fraction or extract of a crudeexosporium obtained from a Brevibacillus,Lysinibacillus,or Viridibacillusendospore that is enriched in an amount or concentration of the fusionprotein compared to a same amount of the crude exosporium)。

在可选的方面，本公开内容提供了一种将目的蛋白递送至植物、种子或田地的方法，其包括：将包含从重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子中获得的孢子外壁的组合物施用于植物、种子或田地；其中所述重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子已被修饰以表达根据本文公开的任一方面的融合蛋白。

在所选择的方面，将所述组合物施用于田地：(a)种植前或种植后；(b)出苗前或出苗后；(c)作为粉末，悬液或溶液形式；或(d)其中所述组合物还包含一种或多种刺激植物生长的额外化合物。

附图说明

图1示出了根据本公开内容的示例性方面的具有N端信号肽的变体的多种短芽孢杆菌属蛋白的N端部分的氨基酸序列的第一序列比对。比对下方示出共有序列。

图2示出了根据本公开内容的示例性方面的具有N端信号肽的变体的多种短芽孢杆菌属蛋白的N端部分的氨基酸序列的第二序列比对。比对下方示出共有序列。

图3示出了根据本公开内容的示例性方面的具有N端信号肽的变体的多种短芽孢杆菌属蛋白的N端部分的氨基酸序列的第三序列比对。比对下方示出共有序列。

图4示出了根据本公开内容的示例性方面的具有N端信号肽的变体的多种赖氨酸芽孢杆菌属蛋白的N端部分的氨基酸序列的序列比对。比对下方示出共有序列(SEQ ID NO:41)。

图5示出了根据本公开内容的另一个示例性方面的具有N端信号肽的变体的多种赖氨酸芽孢杆菌属蛋白的N端部分的氨基酸序列的序列比对。比对下方示出共有序列。

图6示出了在根据本公开内容的示例性方面的具有N端信号肽的变体的绿芽孢杆菌属种菌株中鉴定的多种蛋白的N端部分的氨基酸序列的序列比对(例如，SEQ ID NO:181、185、189、193、197、201、205、209、213和217)。比对下方示出共有序列(即，SEQ ID NO:179)。几组赖氨酸芽孢杆菌属种菌株表达的具有相同N端信号肽的蛋白。

图7A示出了根据本公开内容的短芽孢杆菌属种NRRL B-67865内生孢子的明视场(左)和落射荧光(右)显微照片(放大1000倍)。所述NRRL B-67865内生孢子表达示例性N端靶向序列，特别是tdTomato融合蛋白构建体，其定位至内生孢子表面，如本图所示。右图中由tdTomato产生的荧光与左图中使用明视场显微术观察到的孢子图像相对应，表明tdTomato正确定位至内生孢子表面。

图7B示出了短芽孢杆菌属种NRRL B-67865内生孢子的流式细胞术直方图。所述NRRL B-67865内生孢子表达与用于转化图7A所示出的内生孢子的示例性N端靶向序列相同的示例性N端靶向序列。示出了无可观测到的tdTomato荧光的野生型短杆菌属种NRRL B-67865内生孢子，用于比较(虚线，空心区域)。对此图上示出的每个群体，记录50,000个事件。

图8A示出了根据本公开内容的赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864内生孢子的明视场(左)和落射荧光(右)显微照片(放大1000倍)。所述NRRL B-67864内生孢子表达示例性N端靶向序列，特别是tdTomato融合蛋白构建体，其定位至内生孢子表面，如本图所示。右图中由tdTomato产生的荧光与左图中使用明视场显微术观察到的孢子图像相对应，表明tdTomato正确定位至内生孢子表面。

图8B示出了赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864内生孢子的流式细胞术直方图。所述NRRL B-67864内生孢子表达与用于转化图8A所示出的内生孢子的示例性N端靶向序列相同的示例性N端靶向序列。示出了无可观察到的tdTomato荧光的野生型赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864内生孢子，用于比较(虚线，空心区域)。对此图上示出的每个群体，记录50,000个事件。

图9A示出了根据本公开内容的绿芽孢杆菌属种NRRL B-67869内生孢子的明视场(左)和落射荧光(右)显微照片(放大1000倍)。所述NRRL B-67869内生孢子表达了示例性N端靶向序列，特别是tdTomato融合蛋白构建体，其定位至内生孢子表面，如本图所示。右图中由tdTomato产生的荧光与左图中使用明视场显微术观察到的孢子图像相对应，表明tdTomato正确定位至内生孢子表面。

图9B示出了绿芽孢杆菌属种NRRL B-67869内生孢子的流式细胞术直方图。所述NRRL B-67869内生孢子表达与用于转化图9A所示出的内生孢子的示例性N端靶向序列相同的示例性N端靶向序列。示出了无可观察到的tdTomato荧光的野生型绿芽孢杆菌属种NRRLB-67869内生孢子，用于比较(虚线，空心区域)。对此图上示出的每个群体，记录50,000个事件。

具体实施方式

本公开内容提供了能够将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属孢子外壁的遗传构建体，以及组合物和使用这些构建体将目的异源分子(例如，肽、蛋白)递送至各种环境(例如，植物)的方法。例如，在用重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子处理之后，可筛选处理的植物，以检测归因于由短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子递送的异源蛋白的变化。这些变化可能包括：宿主植物的生长速率或产量发生变化；增强的植物健康(例如，对环境胁迫、病害或害虫的抵抗)；以及与没有使用重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子处理的相同条件下生长的宿主植物相比，呈现出增强的、修饰的或其他新属性。有效地将异源蛋白靶向至孢子外壁的靶向序列的使用还提供了用于高通量筛选有用异源蛋白的平台，例如，所述有用异源蛋白能够增强、修饰和/或赋予新的植物性状或属性。

短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细菌产生含有孢子外壁层的内生孢子。该结构不存在于枯草芽孢杆菌中，所述枯草芽孢杆菌产生终止于外孢子壳(coat)的内生孢子。典型的孢子形成过程(基于使用枯草芽孢杆菌的研究阐明)涉及营养细胞的不对称细胞分裂以形成母细胞和前孢子，其发展为由中间隔膜隔开的两个不同的隔室。最终，隔膜中的肽聚糖被降解，并且前孢子被母细胞吞没，在细胞内形成细胞。母细胞和前孢子之间的细胞间通讯协调了每个细胞中细胞特异性基因的表达，从而导致了内生孢子特异性化合物的产生、前孢子周围皮层(cortex layer)的形成以及壳的沉积。

在某些芽孢杆菌属种中，例如，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短芽孢杆菌(B.pumilus)，该壳将继续成为内生孢子的最外层。在蜡样芽孢杆菌组的许多种中，前孢子进一步被松散贴合(loose-fitting)的球状的孢子外壁包围，所述孢子外壁由被毛状绒毛层(nap layer)围绕的类结晶的基底层组成。在这些种中，孢子外壁与壳被称为间隙(interspace)的间隙连接区域分开。无论哪种情况，在形成最终壳层或孢子外壁后，前孢子经过最后的脱水并成熟变成完整的内生孢子。随后，母细胞通过程序性细胞死亡而降解，导致内生孢子释放到环境中。然后，内生孢子通常将保持休眠状态，直到更有利的条件或特定刺激触发萌发并回到营养状态。

作为孢子与环境之间的最外层表面，壳层(coat layer)(或在形成孢子外壁的种中的孢子外壁)起到许多关键作用。特别地，该层充当环境侵害的半渗透屏障，并调节与土壤的相互作用，因此在维持孢子的活力和感测触发内生孢子萌发的条件中起着重要的作用。壳层还是临床研究的目标，因为它包含有助于宿主免疫细胞识别的细菌致病菌株的细胞表面分子。在枯草芽孢杆菌的孢子壳上展示异源蛋白的方法已经被开发，该方法使用了包含将枯草芽孢杆菌孢子壳蛋白(spore coat protein)(例如CotC)融合到目的蛋白的融合蛋白构建体。但是，枯草芽孢杆菌缺乏孢子外壁，因此使用该菌种进行的研究未能针对如何将融合蛋白靶向至由其他细菌属(例如，短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属)的产生的孢子外壁提供指导。

相反，本公开内容提供了能够将融合蛋白构建体靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的N端构建体和包含其的融合蛋白。用于将融合蛋白靶向至孢子外壁的N端信号序列可包含具有由本文公开的任何序列所表示的序列的多肽，只要该序列与所选细菌属相容(例如，在针对短芽孢杆菌的表1或图1-3、针对赖氨酸芽孢杆菌的表2或图4-5、针对绿芽孢杆菌的表3或图6中所示出的序列，或在相应的细菌属中保留孢子外壁靶向功能的任何这些序列的片段或变体)。在选择的实施方案中，该N-末端信号序列可包含本文公开的任何序列的片段或变体，其足以在相同细菌属中保留孢子外壁靶向功能。这些和其他实施方案记载于本文中。

本公开内容通篇中，术语“包含(comprise)”或其任何派生词(例如，包含(comprising、comprises))可以用“基本上由……组成”、“由……组成”或其适用的相应派生词替换。

如本文所用，“短芽孢杆菌属”指分类为短芽孢杆菌属的产内生孢子的细菌。该术语包括但不限于各种短芽孢杆菌属家族成员，其包括土壤短芽孢杆菌、艾登短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、简短短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、桥石短芽孢杆菌、溪河短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、黄褐色短芽孢杆菌、人参短芽孢杆菌、污染短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、利氏短芽胞杆菌、喜湖短芽孢杆菌、马赛短芽孢杆菌、硝化短芽孢杆菌、人参土壤短芽胞杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊兹短芽抱杆菌或热红短芽抱杆菌。

如本文所用，“赖氨酸芽孢杆菌属”指分类为赖氨酸芽孢杆菌属的产内生孢子的细菌。该术语包括但不限于各种赖氨酸芽孢杆菌属家族成员，其包括球形赖氨酸芽孢杆菌、耐硼赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌、嗜碱赖氨酸芽孢杆菌、清国酱赖氨酸芽孢杆菌、堆肥赖氨酸芽孢杆菌、污染赖氨酸芽孢杆菌、Lysinibacilluscresolivorans、长赖氨酸芽孢杆菌、锰矿土赖氨酸芽孢杆菌、芒果赖氨酸芽孢杆菌、马赛赖氨酸芽孢杆菌、迈氏赖氨酸芽孢杆菌、奥德赛赖氨酸芽孢杆菌、巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌、低硼赖氨酸芽孢杆菌、新斗里赖氨酸芽胞杆菌、烟草赖氨酸芽胞杆菌、变形赖氨酸芽胞杆菌、解木糖赖氨酸芽孢杆菌和耐盐赖氨酸芽孢杆菌。

如本文所用，“绿芽孢杆菌属”指分类为绿芽孢杆菌属的产内生孢子的细菌。该术语包括但不限于各种绿芽孢杆菌属家族成员，其包括田地绿芽孢杆菌、沙地绿芽孢杆菌和雷氏绿芽孢杆菌。

在某些方面，用于表达所述融合蛋白的短芽孢杆菌属成员为简短短芽孢杆菌(以前分类为短芽孢杆菌(Bacillus brevis))，用于表达所述融合蛋白的赖氨酸芽孢杆菌属成员为球形赖氨酸芽孢杆菌(以前分类为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))，以及用于表达所述融合蛋白的绿芽孢杆菌属为田地绿芽孢杆菌(以前分类为田地芽孢杆菌(Bacillus arvi))。这些细菌种类中的每一种都是通常从土壤中分离出的革兰氏阳性、需氧和形成孢子的细菌。

以前，仅基于简单的形态学特征和有限次数的生化测试，就将细菌鉴定为短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌或田地芽孢杆菌。然而，最近的基因组学研究已经表明，芽孢杆菌属的几个成员在DNA水平上是非常不同的，导致重新评估了多个种的分类学位置，包括现在鉴定为简短短芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌和田地绿芽孢杆菌的种。引人注目的是该属的16SrRNA和全基因组分析表明其为动球菌科(Planococcaceae)家族的成员，而不是其最初分类为的芽孢杆菌科(Bacillaceae)家族的成员。以前的研究表明，短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属具有孢子外壁层。但是，与蜡样芽孢杆菌组中的孢子外壁不同，对短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的孢子外壁的组成和结构所知较少。鉴于普遍缺乏关于短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属孢子外壁的基本组成或结构的知识，对该层形成过程中将蛋白靶向至这些属的成员的孢子外壁的过程所知甚少。

在某些方面，用于表达融合蛋白的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的成员是具有16S rRNA基因的细菌，该16S rRNA基因与简短短芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、田地绿芽孢杆菌或本文公开的任何其他示例性短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的家族成员的16S rRNA基因共享至少97％、98％或99％的同一性。或者，用于表达融合蛋白的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的成员是这样的细菌，即其具有的DNA-DNA杂交值为简短短芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、田地绿芽孢杆菌或本文公开的任何其他示例性短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的家族成员的DNA-DNA杂交值的至少70％。在另一种情况下，用于表达融合蛋白的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的成员是这样的细菌，即其具有的平均核苷酸同一性为简短短芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、田地绿芽孢杆菌或本文公开的任何其他示例性短芽孢杆菌属的家族成员的平均核苷酸同一性的95％、96％、97％、98％或99％。

术语“N端信号序列”通常指位于多肽的氨基末端处或附近的多肽序列，其引导多肽定位至亚细胞隔室或用于分泌。应了解并理解，根据上下文，该术语可以与术语“N端靶向序列(N-terminal targeting sequence)”、“靶向序列(targeting sequence)”、“信号序列(signal sequence)”和“信号肽(signal peptide)”可互换使用。N端信号序列可以作为成熟蛋白的多肽序列的一部分保留，或者在定位过程中或之后进行切割。该术语可用于特别指位于多肽的氨基末端处或附近的多肽序列，其引导多肽定位至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁。在这种情况下，N端信号序列的唯一需要的功能是将多肽(N端信号序列是该多肽的一部分)靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁的能力。与短芽孢杆菌属相容的N端靶向序列示于表1和图1-3中。与赖氨酸芽孢杆菌属相容的N-末端靶向序列示于表2和图4-5中。与绿芽孢杆菌相容的N端靶向序列示于表3和图6中。如上所述，本公开内容并未设想N端靶向序列的属间使用。

“植物”或“宿主植物”包括具有短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属可定殖的根际或叶际的任何植物，以及可用作短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细菌的临时宿主的植物。定殖不是本文所述的方法和组合物起作用的必要条件，尽管在本公开内容的某些方面可能是优选的。

如本文所用，“生物防治”定义为通过使用第二生物体或生物分子防治病原体和/或昆虫和/或螨和/或线虫。已知的生物防治机制包括通过与真菌竞争根部表面空间或营养而胜出来控制根腐病的细菌。细菌毒素，例如抗生素，已被用于控制病原体。可以分离毒素并将其直接施用于植物，或者可以施用细菌种使其原位(in situ)产生毒素。进行生物防治的其他手段包括施用某些真菌，其产生针对目标植物病原体、昆虫、螨虫或线虫的活性成分或攻击目标害虫/病原体。“生物防治”还可以包括对植物健康、生长、活力、胁迫应答或产量具有有益作用的微生物。施用途径包括喷雾施用、土壤施用和种子处理。

“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残基的碱基间的氢键合稳定。氢键合可通过Watson-Crick碱基配对，Hoogstein结合或以任何其他序列特异的方式出现。所述复合物可包括形成双链结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，可自杂交的单链或它们的任何组合。杂交反应可以在不同的“严格”条件下进行。通常，低严格杂交反应在约40℃下在10x SSC中或等同的离子强度/温度的溶液中进行。中严格杂交通常是在6x SSC中约50℃下进行，以及高严格杂交反应通常是在1x SSC中在约60℃下进行。

如本文所用，术语“序列同一性”是指在比较窗口中两个多核苷酸或氨基酸序列相同的程度(即分别基于核苷酸-核苷酸或残基-残基)。通过以下步骤来计算序列同一性百分比：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中相同核酸碱基(例如，多核苷酸序列的A、T、C、G)出现的位置的数量，以产生匹配的位置数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，然后将结果乘以100得出序列同一性的百分比。可以通过比较两个比对的氨基酸序列来进行等效计算。

关于氨基酸序列的比较，除了测量序列同一性外，比较还可以考虑残基变化是否构成“保守”置换。保守氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺基的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

N端靶向序列

本公开内容提供了来自短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属细菌的N端靶向序列。在胁迫的环境条件下，短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属的家族细菌经历孢子形成并形成可以长时间保持休眠的内生孢子。短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属内生孢子的最外层被称为孢子外壁，并包含基底层，且在一些菌株中，包含由胶原蛋白样蛋白组成的外部附丝(appendage)/细丝/结构。

先前报道的关于来自其他属的细菌的孢子外壁的研究已经确定，孢子外壁主要由炭疽杆菌(B.anthracis)内生孢子中的胶原蛋白样糖蛋白(例如BclA)形成。目前认为基底层由许多不同的蛋白组成。BclA(炭疽杆菌表面绒毛的主要组分)已被证明附着在孢子外壁上，其氨基末端(N末端)位于基底层，且其羧基末端(C末端)从孢子向外延伸。先前已经发现，来自BclA和BclB的N端区域的某些序列可以用于将肽或蛋白靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员内生孢子的孢子外壁。参见美国专利公开号2010/0233124和2011/0281316，以及Thompson et al.,“Targeting of the BclA and BclB Proteins to the Bacillusanthracis Spore Surface,”Molecular Microbiology,70(2):421-34(2008)，每一篇的全部内容均通过引用的方式纳入本文。

尽管有关蜡样芽孢杆菌孢子外壁靶向序列的可利用文献量越来越多，但尚无已报道的鉴定短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属中的同源N端靶向序列的研究。对已知的靶向孢子外壁的胶原蛋白样重复蛋白BclA、BclB或BetA的生物信息学分析未能揭示出短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属中的任何同源N端靶向序列，这表明这些蛋白的孢子外壁靶向序列对蜡样芽孢杆菌家族是高度特异的。鉴于形成和定位至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的孢子外壁的蛋白的有限表征，人们无法轻易地推断出短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属总体或这些属内具体种(例如，简短短芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌或田地绿芽孢杆菌)中将蛋白靶向到孢子外壁所必需的N端信号序列。

尽管在现有文献中缺乏指导，但是本发明人已经鉴定了能够将内源性和融合蛋白引导至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的N端靶向序列。

为了便于参考，本文中提及的核苷酸和多肽序列的SEQ ID NO列于下表1中。

与短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属相容的N端靶向序列分别示出于表1、2和3中。除了这些序列，N端靶向序列可以可选地包含与本文公开的任何序列共享至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的变体，只要该序列保留将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的能力。在一些实施方案中，可以使用选自在表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续氨基酸的片段。该连续区段可以包括本文公开的任何序列的N端或C端(例如，N端靶向序列可以包含本文公开的任何序列的最后25个连续氨基酸)。在一些方面，唯一需要的功能是该序列保持将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁的能力。

用于将融合蛋白靶向至孢子外壁的N端信号序列可包含具有在表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的序列的多肽。或者，在选择的实施方案中，该N端信号序列可包含其变体或片段以及与N端信号序列异源的目的分子(例如肽或多肽)序列，所述变体或片段将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁。在选择的实施方案中，N端信号序列包含具有与在表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何序列的氨基酸序列至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在选择的实施方案中，N端信号序列包含至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的连续序列，其与表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的相同数量氨基酸的连续序列相同。

如本文所讨论，根据本公开内容的几个方面的融合蛋白构建体包含将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁的N端信号序列，或其变体或片段，以及与N端信号序列异源的多肽序列。然而，在其他方面，根据任何公开的方面的任何公开的序列及其顺序变体和片段可用于其他目的。本公开内容的重点关注其中这些序列用作N端孢子外壁靶向序列的方面，不应被解释为对其他功能的放弃。

在一些实施方案中，N端信号序列包含具有表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何序列所表示的氨基酸序列的多肽。在可选的实施方案中，N端信号序列包含表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何序列的片段(例如，具有包含在公开于这些表和图中的任何序列中发现的至少一个连续子序列的氨基酸序列的多肽)。在可选的实施方案中，N端信号序列包含表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中任一个的变体(例如，具有与在这些表或图中公开的序列共享最小或准确程度的百分比同一性的氨基酸序列的多肽)。在选择的实施方案中，如上所述，作为片段和作为变体的N端信号序列都是合格的(例如，包含本文公开的序列的连续子序列，以及落入所公开的序列同一性范围内的差异序列的N端信号序列)。

在选择的实施方案中，N端信号序列包含与表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的氨基酸序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在选择的实施方案中，N端信号序列包含至少10、20或25个氨基酸的连续序列，其与表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的氨基酸序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的连续序列相同。

在一些实施方案中，N端信号序列包含具有由表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽。在可选的实施方案中，N端信号序列包含具有由表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽的片段(例如具有包含由在这些表或图中公开的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽中发现的至少一个连续子序列的氨基酸序列的多肽)。在可选的实施方案中，N端信号序列包含多肽的变体，该多肽具有由表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何核苷酸序列编码的氨基酸序列(例如，具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与具有由这些表和图中公开的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽共享最小或准确程度的百分比同一性的)。在选择的实施方案中，如上所述，作为片段和作为变体的N端信号序列都是合格的(例如，包含在具有表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的氨基酸序列的多肽中发现的连续子序列，随后是差异序列(其落入本文公开的最小序列同一性范围内)的N端信号序列)。

在选择的实施方案中，N端信号序列包含与本文公开的任何核苷酸序列(例如，在表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何核苷酸序列)具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在选择的实施方案中，N端信号序列包含在中严格或高严格下与互补于编码表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何多肽序列的多核苷酸或其片段的核酸探针杂交的核苷酸序列。

在选择的实施方案中，N端信号序列包含至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的连续序列，其与表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何核苷酸序列中相同数量核苷酸的连续序列相同。

关于本公开内容考虑的任何可选的N端靶向序列，例如上述实施方案，在所选择的方面，此类序列的最少的需要的功能是将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁的能力。

融合蛋白

本公开内容提供了融合蛋白，其包含直接或间接连接至至少一个目的分子(例如，目的蛋白或肽的多肽序列，例如至少一种植物生长刺激蛋白或肽)的N端靶向序列。在选择的实施方案中，间接连接可以是插入间隔子、接头或调控序列。蛋白或肽可包括但不限于，肽激素、非激素肽、产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶、或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。通常，可使用能够在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子中表达并且与所选择的N端靶向序列异源的任何目的蛋白。靶向序列可以是上述的任何靶向序列。

在一些实施方案中，融合蛋白可包含靶向序列和至少一种保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽。靶向序列可以是上述的任何靶向序列。

融合蛋白可使用本领域已知的标准克隆和分子生物学方法制得。例如，可以通过聚合酶链反应(PCR)来扩增编码蛋白或肽的基因(例如，编码植物生长刺激蛋白或肽的基因)，并且连接至编码上述任何靶向序列的DNA，以形成编码融合蛋白的DNA分子。编码融合蛋白的DNA分子可被克隆到任何合适的载体(例如质粒载体)中。载体适当地包含多个克隆位点，编码融合蛋白的DNA分子可容易地插入其中。载体还适当地包含选择性标记，例如抗生素抗性基因，从而可容易地鉴定和分离用载体转化、转染或与载体配对的细菌。当载体是质粒时，质粒还适当地包含复制起点。编码融合蛋白的DNA适当地在孢子形成启动子的控制下，该启动子将引起融合蛋白在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁上表达(例如，来自短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属家族成员的天然启动子)。或者，可以将编码融合蛋白的DNA(例如，包含表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何多核苷酸序列的序列)整合到短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的染色体DNA中。

融合蛋白还可包含其他多肽序列，该多肽序列不是靶向序列或连接的目的蛋白(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽)的一部分。例如，融合蛋白可包括标签或标记，以促进融合蛋白本身或表达融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的孢子的纯化(例如，多组氨酸标签)或可视化(例如，荧光蛋白(如GFP或YFP))。

使用本文所述的靶向序列增强了融合蛋白在孢子外壁上的表达，这是由于在这些序列的氨基端缺乏二级结构，这允许融合蛋白的天然折叠和活性的保持。适当的折叠可通过在靶向序列和融合伴侣蛋白之间包含短氨基酸接头来进一步增强。

因此，本文所述的任何融合蛋白可在靶向序列和连接的目的蛋白(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽)之间包含氨基酸接头。

接头可包括聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。还可使用包含丙氨酸残基与甘氨酸残基的混合物的接头。例如，当靶向序列包含SEQ ID NO:4时，融合蛋白可具有以下结构中的一种：

无接头： SEQ ID NO:4—融合伴侣蛋白

丙氨酸接头： SEQ ID NO:4—A_n-融合伴侣蛋白

甘氨酸接头： SEQ ID NO:4—G_n-融合伴侣蛋白

丙氨酸和甘氨酸混合接头： SEQ ID NO:4—(A/G)_n-融合伴侣蛋白

其中A_n、G_n和(A/G)_n分别是任意数量的丙氨酸、任意数量的甘氨酸或任意数量的丙氨酸和甘氨酸的混合物。

例如，n可以是1至25之间的任何整数，例如6至10之间的整数。当接头包含丙氨酸残基与甘氨酸残基的混合物时，可使用甘氨酸与丙氨酸残基的任何组合。如上所述，可以使用由SEQ ID NO:4(对于短芽孢杆菌属)所表示的N端靶向序列。然而，在以上示例性配置中，本文公开的任何其他N端靶向序列(包括截短形式和变体形式)可以代替SEQ ID NO:4(例如，表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何序列)。在上面显示的结构中，“融合伴侣蛋白”表示连接的目的蛋白(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽)。

可选地或另外地，接头可包含蛋白酶识别位点。包含蛋白酶识别位点使得能够在暴露于识别该蛋白酶识别位点的蛋白酶时靶向移除目的蛋白(例如，植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽)。

在某些方面，融合蛋白包含产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，例如乙缩醛还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、双乙酰基还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、腺苷磷酸异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5'-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-葡糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CK N-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶，氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶或参与产生结瘤因子(nod factor)的酶或以上的任意组合。

在其他方面，融合蛋白包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶，例如纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶、铁载体，或以上的任何组合。

在一些实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然孢子形成启动子的控制下表达。融合蛋白可在高表达孢子形成启动子的控制下表达。在某些方面，高表达孢子形成启动子包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列。在所选择的方面，融合蛋白可以在融合蛋白的靶向序列的天然启动子的控制下表达。在某些情况下，靶向序列的天然启动子会是高表达孢子形成启动子。在其他情况下，靶向序列的天然启动子不会是高表达孢子形成启动子。在后一种情况下，用高表达孢子形成启动子代替天然启动子可能是有利的。融合蛋白在高表达孢子形成启动子的控制下的表达使融合蛋白在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁上的表达增加。高表达孢子形成启动子可包含一个或多个σ-K孢子形成特异性启动子序列。

如上所述，融合蛋白可包含靶向序列和至少一种异源蛋白，该异源蛋白可包含生长刺激蛋白或肽。所述植物生长刺激蛋白或肽可包括肽激素、非激素肽、产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶、或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶，等。所述植物生长刺激蛋白或肽可包括产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶。产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶可以是在刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中催化任何步骤的任何酶，或将刺激植物生长或改变植物结构的化合物的无活性或活性较小的衍生物催化转化为化合物的活性或更大活性形式的任何酶。可选地，该植物生长刺激化合物可包括植物生长激素，例如细胞分裂素或细胞分裂素衍生物、乙烯、植物生长素或植物生长素衍生物、赤霉素或赤霉素衍生物、脱落酸或脱落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。

当所述酶包括蛋白酶或肽酶时，所述蛋白酶或肽酶可以是裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。生物活性肽可以是发挥生物活性的任何肽。裂解蛋白、肽，前蛋白或前蛋白原以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。

植物生长刺激蛋白还可包括降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶。这样的酶包括纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶和铁载体。当被引入植物生长介质中或施用于植物、种子或植物或植物种子周围的区域时，包含降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶的融合蛋白可有助于加工植物附近的养分并增强植物或植物附近的有益细菌或真菌对营养的摄取。融合蛋白可包含靶向序列和保护植物免受病原体侵害的至少一种蛋白或肽。所述蛋白或肽可包括刺激植物免疫应答的蛋白或肽。例如，刺激植物免疫应答的蛋白或肽可包括植物免疫系统增强蛋白或肽。所述植物免疫系统增强蛋白或肽可以是对植物免疫系统具有有益作用的任何蛋白或肽。或者，保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可以是具有抗菌活性、抗真菌活性或同时具有抗菌和抗真菌活性的蛋白或肽。保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽也可以是具有杀虫活性、杀蠕虫活性，抑制昆虫或蠕虫的捕食，或其组合的蛋白或肽。保护植物免受病原体侵害的蛋白可包括酶。适合的酶包括蛋白酶和内酯酶。所述蛋白酶和内酯酶可特异性针对细菌信号转导分子(例如细菌内酯高丝氨酸信号分子)。所述酶还可以是特异性针对细菌或真菌的细胞组分的酶。

融合蛋白可包含靶向序列和至少一种提高植物胁迫抗性的蛋白或肽。例如，提高植物胁迫抗性的蛋白或肽包括降解胁迫相关化合物的酶。胁迫相关化合物包括但不限于，氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、活性氧种类、一氧化氮、氧脂素和酚类物质。具体的活性氧种类包括羟基、过氧化氢、氧和超氧化物。降解胁迫相关化合物的酶可包括超氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、过氧化物酶、抗氧化剂酶或抗氧化剂肽。

提高植物胁迫抗性的蛋白或肽还可包括保护植物免受环境胁迫的蛋白或肽。所述环境胁迫可包括，例如干旱、洪水、高温、冰冻、盐、重金属、低pH、高pH或其组合。例如，保护植物免受环境胁迫的蛋白或肽可包括冰成核蛋白、脯氨酰肽酶、苯丙氨酸解氨酶、异分支酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶或胆碱脱氢酶。

融合蛋白可包括靶向序列和至少一种植物结合蛋白或肽。所述植物结合蛋白或肽可以是能够特异性或非特异性结合至植物的任何部分(例如，植物的根部或植物的地上部分，如叶、茎、花或果实)或植物物质的任何蛋白或肽。因此，例如，植物结合蛋白或肽可以是根结合蛋白或肽、或叶结合蛋白或肽。

表达融合蛋白的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子和细胞

本文所述的融合蛋白可以通过重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞(例如，简短短芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌或田地绿芽孢杆菌细胞)表达。融合蛋白可以为上文讨论的任何融合蛋白，只要它与用于表达的所选细菌属相容(例如，融合蛋白必须包含表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中所示出的N端信号肽，或在相应的细菌属中保留靶向孢子外壁的功能的任一这些序列的片段或变体)。重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞可共表达上文讨论的任何融合蛋白中的两种或多种。例如，重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞可共表达至少一种包含植物结合蛋白或肽的融合蛋白、与至少一种包含植物生长刺激蛋白或肽的融合蛋白、至少一种融合蛋白包含保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽的融合蛋白、或至少一种提高植物胁迫抗性的蛋白或肽。

重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属细胞可以包括短芽孢杆菌属细胞，例如土壤短芽孢杆菌、艾登短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、简短短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、桥石短芽孢杆菌、溪河短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、黄褐色短芽孢杆菌、人参短芽孢杆菌、污染短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、利氏短芽胞杆菌、喜湖短芽孢杆菌、马赛短芽孢杆菌、硝化短芽孢杆菌、人参土壤短芽胞杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊兹短芽抱杆菌或热红短芽抱杆菌细胞。

重组产孢子外壁的赖氨酸芽孢杆菌属细胞可以包括赖氨酸芽孢杆菌属细胞，例如球形赖氨酸芽孢杆菌、耐硼赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌、嗜碱赖氨酸芽孢杆菌、清国酱赖氨酸芽孢杆菌、堆肥赖氨酸芽孢杆菌、污染赖氨酸芽孢杆菌、Lysinibacillus cresolivorans、长赖氨酸芽孢杆菌、锰矿土赖氨酸芽孢杆菌、芒果赖氨酸芽孢杆菌、马赛赖氨酸芽孢杆菌、迈氏赖氨酸芽孢杆菌、奥德赛赖氨酸芽孢杆菌、巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌、低硼赖氨酸芽孢杆菌、新斗里赖氨酸芽胞杆菌、烟草赖氨酸芽胞杆菌、变形赖氨酸芽胞杆菌、解木糖赖氨酸芽孢杆菌或耐盐赖氨酸芽孢杆菌细胞。

重组产孢子外壁的绿芽孢杆菌属细胞可以包括绿芽孢杆菌属细胞，例如田地绿芽孢杆菌、沙地绿芽孢杆菌或雷氏绿芽孢杆菌细胞。

为了产生表达融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，可使用本领域已知的标准方法(例如，通过电穿孔或与已经用编码融合蛋白的载体转化的细胞接合)来转化任何短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的细菌。然后，可通过本领域已知的任何方法筛选细菌以鉴定转化体。例如，当载体包括抗生素抗性基因时，可就抗生素抗性对细菌进行筛选。或者，可将编码融合蛋白的DNA整合到短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的染色体DNA中。然后，可将重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞暴露于将诱发孢子形成的条件中。用于诱发孢子形成的适合的条件是本领域已知的。例如，可将重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞铺于琼脂板上，并且在约30℃的温度下孵育若干天(例如3天)，或者在Schaeffer孢子形成培养基中培养。

还可适当地使用本文公开的任何种的失活菌株、无毒菌株或遗传操作的菌株。例如，可以使用缺乏Bin毒素的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属。可选地或另外地，一旦表达融合蛋白的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属种的孢子已经产生，便可使它们失活以防止一旦使用时的进一步萌发。可使用本领域中已知的使细菌孢子失活的任何方法。合适的方法包括但不限于，热处理、γ辐射、x射线辐射、UV-A辐射、UV-B辐射、化学处理(例如，用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂或其任何组合处理)或其组合。或者，可使用源自非产毒菌株或遗传上或物理上失活菌株的孢子。

根据本公开内容的融合蛋白构建体包含将融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁的N端信号序列，或其变体或片段，以及与N端信号序列异源的多肽序列。在选择的实施方案中，N端信号序列和与N端信号序列异源的多肽序列直接连接。在其他方面，可存在中间的接头或间隔基序列。在其他方面，切割序列或其他调控序列可位于两个区域之间。与N端信号序列异源的多肽序列可包含一个或多个功能蛋白。在多肽序列中包含多种与N端信号序列异源的功能蛋白的方面，至少一个间隔基、切割序列或其他调控元件可位于两种或多种功能蛋白之间。

与N端信号序列异源的多肽序列可以是，例如：(a)植物生长刺激蛋白或肽；(b)保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；(c)提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽；(d)植物结合蛋白或肽；(e)植物免疫系统增强蛋白或肽；或(f)提高营养摄取的蛋白或肽。当在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属中表达时，这些融合蛋白被靶向至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁层，并且被物理定向以使得蛋白或肽展示在孢子的外部。

这些短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属孢子外壁展示系统可用于将肽、酶和其他蛋白递送至植物(例如，至植物的叶子、果实，花、茎或根)或植物生长介质例如土壤。以这种方式递送至土壤或另一种植物生长介质中的肽、酶和蛋白在土壤中存留且长期表现出活性。将本文所述的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞引入土壤或植物的根际中，使得在许多不同的土壤条件下有益增强植物生长。使用短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属孢子外壁展示系统以产生这些酶使得它们在植物生命的最初几个月中，以及在一些方面，在长达且包括植物生命期的较长时期内，持续对植物和根际产生它们的有益作用。

分离和/或纯化的孢子外壁和包含其的组合物

本公开内容提供了分离的和/或纯化的获得自已被修饰以表达如本文所述的融合蛋白构建体的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁，和包含其的组合物。在所选择的方面，这些组合物包含重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属孢子外壁的基底层或毛状绒毛层。在其他方面，所述组合物包含重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的孢子外壁的两层。在所选择的方面，所述组合物可以包含重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属孢子外壁的特定级分或提取物(例如，包含可溶于特定溶剂中的孢子外壁组分的提取物)。

在其他选择方面，孢子外壁组合物可进一步包含额外的组分(例如，本文公开的任何植物生长促进化合物、农药或其他活性剂)。在额外的方面，可以处理孢子外壁组合物以杀死组合物中的营养性短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞和/或内生孢子或使其失去活力。在所选择的方面，所述孢子外壁组合物不包含可检测量的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞和/或内生孢子。在所选择的方面，处理所述孢子外壁组合物以去除或降低细菌毒素和/或免疫原性组分的水平，以产生具有更低的毒性或免疫原性的，或被可用孢子外壁组合物处理或暴露于孢子外壁组合物的植物或动物更好耐受的孢子外壁组合物。

在所选择的方面，孢子外壁组合物包含从重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子收集的基本上完整的孢子外壁(例如，使用超声)。或者，所述组合物可以包含经处理的孢子外壁(例如，磨碎、悬浮在流体中等)。在可选的方面，所述孢子外壁组合物可以溶于溶剂中。在每种情况下，可以对组合物进行处理，使得富集特定的亚组分或化合物。例如，与从重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子收集的粗制孢子外壁中的量或组成相比，可以处理孢子外壁组合物以富集在富集的组合物中存在的重组融合蛋白的浓度或量。

在所选择的方面，孢子外壁组合物包含分离和/或纯化的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属孢子外壁，其包含根据本文所述的任何方面的融合蛋白。例如，所述融合蛋白包含本文公开的任何N端靶向序列(例如，表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何序列)。

本文公开的融合蛋白和/或孢子外壁组合物可用于将目的蛋白递送至植物。在所选择的方面，根据本文所述的任何方面的融合蛋白或孢子外壁组合物可以直接施用于植物(例如，以粉末、悬液或溶液的形式，施用于种子或田地)。在所选择的方面，将融合蛋白或孢子外壁组合物在播种之前或之后，或可选地在萌芽之前或之后(例如，种植前或种植后，或出苗前或出苗后)施用于田地。

在可选的方面，通过将重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞施用于植物、种子或田地，可将本文公开的融合蛋白和/或孢子外壁组合物间接递送至植物、种子和/或田地。在这些方面，融合蛋白和/或孢子外壁组合物可以由重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞表达或产生(例如，在田间)，使融合蛋白递送至植物、种子或田间。

具有植物生长促进作用和/或其他有益属性的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属细胞

已知某些短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细菌具有固有的有益属性。例如，某些菌株具有促进植物生长的作用。本文所述的任何融合蛋白均可在此类菌株中表达。

例如，重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞可包括促进植物生长的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的菌株。促进植物生长的细菌菌株可包括产生杀虫毒素(例如，Bin毒素)、产生杀真菌化合物(例如β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合)，产生杀线虫化合物(例如，Cry毒素)、产生杀细菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一个或多个自主复制的质粒、结合至植物根部、定殖于植物根部、形成生物膜、溶解营养、分泌有机酸或其任何组合的细菌的菌株。

生物防治剂

本公开内容提供的组合物可进一步包含生物防治剂。生物防治剂可特别地包括细菌、真菌或酵母、原生动物、病毒、昆虫致病性线虫、接种体和植物，和/或具有各菌株全部识别特征的它们的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。本公开内容提供了上述重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子与本文所述的特定生物防治剂的组合，和/或与本文所述的微生物的特定菌株的突变体的组合，其中该突变体具有各自菌株的所有识别特征，和/或与由各自菌株产生的表现出对昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性或促进植物生长和/或增强植物健康的至少一种代谢物的组合。根据本公开内容，本文所述的生物防治剂可在任何生理状态例如活化状态或休眠状态下采用或使用。

根据当前公开内容的所选择的组合物

在所选择的方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含协同有效量的：(a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，该融合蛋白包含：将包含异源目的蛋白的融合蛋白定位至短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属家族成员的孢子外壁的靶向序列；以及(b)至少一种本文公开的另外的且不同的特定生物防治剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的突变体(其具有各自菌株的所有识别特征)，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。在可选的方面，所述组合物包含至少一种另外的杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，条件是重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞、杀虫剂和杀真菌剂不相同。在另一方面，组合物用于降低由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部分的整体损害以及采收的果实或蔬菜的损失。在另一方面，所述组合物提高了整体植物健康。

术语“植物健康”通常包括与害虫防治无关的多种植物改善。例如，可以提及的有利特性是改善的作物特征，其包括：出苗、作物产量、蛋白含量、油含量、淀粉含量、更发达的根系、改善的根部生长、改善的根部尺寸维持、改善的根部效率、改善的胁迫耐受性(例如，耐干旱、热、盐、紫外线、水、寒冷)、乙烯减少(减少产生和/或抑制接收)、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、更少的死基生叶、更强壮的分蘖、更绿的叶片颜色、色素含量、光合活性、需要更少的输入(例如，肥料或水)、需要更少的种子、更高产的分蘖产量、开花更早、谷粒成熟更早、植物倒逆(倒伏)减少、枝条生长加快、植物活力增强、植物直立性增加以及早且更好的萌发。

通过比较在相同环境条件下生长的植物，可筛选本公开内容提供的组合物以鉴定对植物生长、健康或其他有益属性的潜在作用，其中所述植物的一部分用根据本公开内容的组合物处理，以及所述植物的另一部分未用根据本公开内容的组合物处理。相反，所述其他部分完全不经处理，或用合适的对照处理(即没有施用根据本公开内容的组合物，例如没有施用所有活性成分，没有施用如本文所述的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，或没有施用本文公开的其他特定生物防治剂)。

根据本公开内容的组合物可以任何所需方式施用，例如以种子包衣、土壤浸液和/或直接施用于犁沟中、和/或以叶面喷雾的形式，并且在出苗前、出苗后或出苗前后都施用。换言之，所述组合物可被施用于种子、植物或采收的果实和蔬菜，或植物正生长于其中或需要在其中生长的土壤(植物的生长地点)。

降低植物和植物部分的整体损害通常得到更健康的植物和/或使植物活力和产量提高。优选地，根据本公开内容的组合物用于处理传统或转基因植物或其种子。

使用重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属构建体及组合物的方法

本公开内容还涉及使用上述任何组合物刺激植物生长的方法，该组合物包含表达融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞以及至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂。刺激植物生长的方法包括：将组合物施用于植物、种子、植物部分、植物周围的地点或植物将在其中生长的地点(例如，土壤或其他生长介质)，所述组合物包括协同有效量的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，该融合蛋白包含：(i)异源蛋白(例如，至少一种植物生长刺激蛋白)；和(ii)靶向序列；和至少一种本文公开的另外的特定生物防治剂和/或本文公开的微生物的特定菌株的突变体(其具有各自菌株的所有识别特征)，和/或由各自菌株产生的表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物。

在本公开内容的另一方面，提供了一种降低由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部分的整体损害以及降低采收的果实或蔬菜的损失的方法，其包括同时或依次地施用协同有效量的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞以及至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂的步骤。

在本方法的一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种杀真菌剂。在一方面，所述至少一种杀真菌剂是合成杀真菌剂。在另一个实施方案中，所述组合物除了杀真菌剂外还包含至少一种杀虫剂或包含至少一种杀虫剂以替代杀真菌剂，条件是杀虫剂、杀真菌剂、重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞及本文公开的特定生物防治剂不相同。

本公开内容的方法包括以下施用方法，即可将重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞及至少一种本文公开的其他特定生物防治剂两者配制成具有农业上可接受的保质期的单一、稳定的组合物(所谓的“独配制剂”)，或在使用之前或使用时进行组合(所谓的“组合制剂”)。

如果没有另外提及，表述“组合”代表重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文公开的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的各种组合，以独配制剂形式、单一“预混”形式、以由独配制剂组成的组合喷雾混合物(例如“桶混”)形式，以及特别是以依次的方式(即在合理的短时期，例如几个小时或几天，例如2小时至7天内相继地)施用时，单一活性成分的组合使用。施用根据本公开内容的组合物的顺序不是实施本公开内容必需的。因此，术语“组合”还涵盖例如在同时或连续地向植物、其周围环境、生境或者储存空间施用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文公开的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂之后，所述重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文公开的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或杀虫剂存在于在待处理的植物或其周围环境、生境或者储存空间之上或之中。

如果以依次的方式利用或使用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，则优选按照以下方法处理植物或植物部分(包括种子和由种子出苗的植物)、采收的果实和蔬菜：首先，将至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂施用于植物或植物部分；其次，将本文所述的其他的特定生物防治剂与重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞施用于同一植物或植物部分。通过这种施用方式，采收时植物上杀虫剂/杀真菌剂的残留量尽可能地低。在(作物)生长周期内的第一次施用和第二次施用之间的时间段可以改变并且取决于所要达到的效果。例如，进行第一次施用以防止植物或植物部分被昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体侵害(特别是在处理种子的情况下)，或对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵害(特别是在处理植物和植物部分的情况下)；进行第二次施用以防止或防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵害和/或促进植物生长。在本文中，防治意指包含重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与本文公开的特定生物防治剂的组合物并不能够完全消灭害虫或植物病原性真菌，但是能够使侵害保持在可接受的水平上。

本公开内容还提供了通过多重施用而增强本公开内容的组合物的杀死、抑制、预防和/或抵抗活性的方法。在一些其他的实施方案中，在任何需要的发育阶段中或在任何预定的害虫压力下，以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间的间隔，将本公开内容的组合物施用于植物和/或植物部分两次。在一些实施方案中，在任何需要的发育阶段中或在任何预定的害虫压力下，以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间的间隔，将本公开内容的组合物施用于植物和/或植物部分多于两次(例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次)。如果需要，各施用之间的间隔可不同。本领域技术人员将能够根据植物种类、植物害虫种类和其他因素决定施用的次数和间隔长度。

通过按照前述步骤，可以实现在处理的植物、植物部分和采收的果实和蔬菜上至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的非常低水平的残留。

如果没有另外提及，用根据本公开内容的组合物对植物或植物部分(包括种子和由种子出苗的植物)、采收的果实和蔬菜的处理直接进行或通过作用于其周围环境、生境或储存空间，该处理使用常规的处理方法(例如浸渍、喷雾、雾化、灌溉、蒸发、撒粉、弥雾(fogging)、撒播、发泡、涂抹(painting)、涂布(spreading-on)、浇水(浸湿)、滴灌)。还可以独配制剂或组合制剂的形式以超低容量法施用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞、至少一种本文公开的其他的特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，或将根据本公开内容的组合物以组合物或独配制剂的形式注入到土壤中(犁沟中)。

术语“待处理的植物”涵盖植物的每个部分，包括其根系和分别在待处理的植物的主茎或树干周围至少10cm、20cm、30cm的半径内或在所述待处理植物的根系周围至少10cm、20cm、30cm的物质(例如土壤或营养培养基)。

任选地在至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂组合使用或利用的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部分、种子、采收的果实或蔬菜的大小或种类。通常，根据本公开内容待利用或使用的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞在其独配制剂或与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂和任选地杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂中以约1％至约80％(w/w)、优选约1％至约60％(w/w)、更优选约10％至约50％(w/w)存在。

同样，任选在至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞组合使用或利用的至少一种本文公开的其他特定生物防治剂的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部分、种子、采收的果实或蔬菜的大小或种类。通常，根据本公开内容的待施用或使用的本文所述的其他的特定生物防治剂在其独配制剂或与重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞，和任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂中以约1％至约80％(w/w)、优选1％至约60％(w/w)、更优选约10％至约50％(w/w)存在。

重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的施用可以作为叶面喷雾、土壤处理，和/或种子处理/拌种来进行。当用作叶面处理时，在一实施方案中，每英亩施用约1/16至约5加仑的全培养液。当用作土壤处理时，在一实施方案中，每英亩施用约1至约5加仑的全培养液。当用于种子处理时，每英亩施用约1/32至约1/4加仑的全培养液。对于种子处理，最终使用制剂包含至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰个菌落形成单位/克。

该比例可基于如下进行计算：在将根据本公开内容的组合的所述组分施用于植物或植物部分的时间点时的至少一种本文公开的其他特定生物防治剂的量，以及在将本公开内容的组合的所述组分施用于植物或植物部分之前不久(例如，48h、24h、12h、6h、2h、1h)或该时间点时的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的量。

可将重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文公开的其他特定生物防治剂同时或在不同时间施用于植物或植物部分，只要在施用后两种组分存在于植物上或植物内即可。在其中重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与本文公开的其他特定生物防治剂在不同时间施用，且本文公开的其他特定生物防治剂在重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞之前施用的情况下，技术人员可通过本领域已知的化学分析测定在施用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的时间点或该时间点之前不久，本文公开的其他特定生物防治剂在植物上/内的浓度。类似地，当首先将重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞施用于植物时，可使用本领域已知的测试在施用本文公开的其他特定生物防治剂的时间点或该时间点之前不久测定重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞的浓度。

在本公开内容的另一方面，提供了用如上所述的组合物处理的种子。通过处理植物的种子来防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体是长期已知的并且是持续改进的主题。然而，种子的处理带来了一系列问题，它们无法总是以令人满意的方式解决的。因此，需要开发出用于保护种子和发芽植物的方法，该方法不需要在植物储过程中、播种后或出苗后额外递送作物保护组合物或至少显著减少这种需要。此外，需要以这样的方式来优化施用的活性成分的量，即为种子和发芽植物提供最可能的保护，使其免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的攻击，但所施用的活性成分不会造成损害植物本身。特别地，处理种子的方法还应当考虑抵抗害虫或耐受害虫的转基因植物固有的杀虫和/或杀线虫特性，以实现用最少量的作物保护组合物获得对种子和发芽植物的最佳保护。

因此，本发明还特别涉及通过用如上定义的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种选自本文公开的特定微生物的其他生物防治剂，和/或具有各自菌株的所有识别特征的本文公开的微生物的特定菌株的突变体，和/或由各自菌株产生的表现出抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的至少一种代谢物，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或任选地本公开内容的至少一种杀虫剂处理种子来保护种子和发芽植物免受害虫攻击的方法。本公开内容用于保护种子和发芽植物免受害虫攻击的方法涵盖了这样一种方法，其中用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，在一次操作中同时处理种子。其还涵盖这样一种方法，其中用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文所述的其他的特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理种子。

本公开内容还提供了处理种子的方法，目的是保护种子和所得植物免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵害。本公开内容还涉及一种种子，将其同时用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂处理。本公开内容进一步涉及已经用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理的种子。在已经用重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞与至少一种本文所述的其他特定生物防治剂，以及任选地至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理的种子的情况中，本公开内容的组合物中的各个活性成分可存在于种子的不同层中。

此外，本发明涉及种子，其在用本公开内容的组合物处理后进行薄膜包衣过程以防止灰尘磨损种子。

本公开内容的优势之一是，由于本公开内容的组合物特有的系统性特性，用这些组合物对种子的处理不仅为种子本身还为来源自种子的植物(在其出苗后)提供保护以抵御昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。如此一来，可不必在播种时或其后不久直接处理作物。可以看到另一优势在于以下事实：通过用本公开内容的组合物处理种子，可促进经处理的种子的萌发和出苗。

本公开内容的组合物适合于保护用于农业、温室、林业或园艺中的任何植物品种的种子。更具体地说，所研究的种子是谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦和黍)、玉米、棉花、大豆、稻、马铃薯、向日葵、咖啡豆、烟草、加拿大油菜、油菜、甜菜(例如，糖用甜菜和饲料用甜菜)、花生、蔬菜(例如，番茄、黄瓜、豆、十字花科蔬菜、洋葱和莴苣)、果实植物、草坪和观赏植物的种子。特别重要的是处理谷物(例如小麦、大麦、黑麦和燕麦)、玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、油菜和稻的种子。

为本公开内容的目的，将本公开内容的组合物单独或以合适的制剂施用于种子。优选地在这样的状态下处理种子：即种子的稳定性使得在处理过程中不发生损伤。一般而言，可在采收和播种之间的任何时间点处理种子。通常，使用已经从植物中分离并且已经去除穗轴、外壳、茎、荚、毛或果肉的种子。因此，例如，可使用已采收、净化并干燥至水分含量小于15重量％的种子。或者，例如，还可使用干燥后已用水处理，然后再次干燥的种子。

一般而言，在处理种子时，必须确保选择施用于种子的本公开内容的组合物和/或其他添加剂的量，以使得种子的萌发不会受到不利影响，和/或从种子中出苗的植物没有受到损伤。特别是对在一定施用率下可表现出植物毒性作用的活性成分来说，情况就是如此。

本公开的组合物可直接施用，换句话说，不包含其他组分并且无需稀释。通常，优选将组合物以合适制剂的形式施用于种子。合适的制剂和用于种子处理的方法是技术人员已知的，并且记载于例如以下文献中：美国专利号4,272,417 A；4,245,432 A；4,808,430A；5,876,739 A；美国专利公开号2003/0176428 A1；WO 2002/080675 A1；WO 2002/028186A2，每一篇的内容均通过引用的方式纳入本文。

可根据本公开内容使用的组合可转化为常规的拌种制剂，例如溶液剂、乳剂、悬剂，粉剂、泡沫剂、浆液剂或其他用于种子的包衣组合物，以及ULV制剂。这些制剂以已知方式通过将组合物与常规佐剂混合而制备，该佐剂为，例如，常规填充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、湿润剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、粘着剂、赤霉素和还有水。可存在于可根据本发明使用的拌种剂中的着色剂包括常规用于此目的的所有着色剂。在本文中，不仅可使用低水溶性的颜料，还可使用水溶性染料。实例包括已知的命名为罗丹明B(Rhodamin B)、C.I.颜料红112和C.I.溶剂红1的着色剂。

根据植物种或植物栽培种，其位置和生长条件(土壤、气候、植物生长期、营养)，使用或采用根据本公开内容的组合物，根据本公开内容的处理还可能导致超加性的(“协同”)效应。因此，例如，通过在根据本公开内容的处理中使用或采用本发明的组合物，可取得超出实际预期的效果：施用率降低和/或活性谱的拓宽和/或提高活性，使植物更好地生长、提高对高温或低温的耐受性、提高对干旱或对水或土壤含盐量的耐受性、提高开花性能、使采收更容易、加速成熟、采收产量更高、果实更大、植株更高、叶色更绿、开花更早、采收产品的品质和/或营养价值更高、果实中糖的浓度更高、采收产品的储存稳定性和/或加工性更好。

在根据本公开内容的处理中，本发明的组合物在某些施用率下，也可在植物中具有强化作用。调动植物的防御系统以抵抗不需要的植物病原真菌和/或微生物和/或病毒的攻击。在本文中，植物强化(抗性诱导)物质应理解为是指能够以这样一种方式刺激植物防御系统的那些物质或物质的组合：即当随后接种不需要的植物病原真菌和/或微生物和/或病毒时，处理的植物对这些植物病原性真菌和/或微生物和/或病毒表现出很大程度的抗性。因此，通过在根据本公开内容的处理中使用或采用根据本公开内容的组合物，可保护植物在处理后的一定时期内抵御上述病原体的侵害。在用活性化合物处理植物后，实现保护作用的时间段通常持续1-10天，优选1-7天。

本文公开的任何组合物可包含一种或多种农业化学品。类似地，施用根据本公开内容的组合物的方法可进一步包括将至少一种农业化学品引入植物生长介质或将至少一种农业化学品施用于植物或种子。

农业化学品可包含肥料(例如液体肥料)、微量元素肥料材料(例如硼酸、硼酸盐、硼熔块、硫酸铜、铜熔块、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁熔块、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰熔块、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、锌熔块、磷酸锌，锌螯合物或其组合)、杀虫剂(例如有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯(pyrethroid)、杀螨剂、邻苯二甲酸烷基酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫磺、卤代芳香族取代的尿素、烃酯、生物基杀虫剂或其组合)，除草剂(例如，氯苯氧基化合物、硝基酚化合物、硝基甲酚化合物、联吡啶化合物、乙酰胺、脂肪酸、苯胺、苯甲酰胺、苯甲酸、苯甲酸衍生物、茴香酸、茴香酸衍生物、苄腈、苯并噻二嗪酮二氧化物(benzothiadiazinone dioxide)、硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、氯吡啶、环己烯酮衍生物、二硝基苯胺衍生物、氟二硝基甲苯胺化合物(fluorodinitrotoluidine compound)、异噁唑酮(isoxazolidinone)、烟酸、异丙胺、异丙胺衍生物、噁二唑啉酮(oxadiazolinone)、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、吡啶甲酸化合物、三嗪、三唑、尿嘧啶、尿素衍生物、草多索(endothall)、氯酸钠或其组合)、杀真菌剂(例如，取代的苯、硫代氨基甲酸酯、亚乙基双二硫代氨基甲酸酯(ethylene bis dithiocarbamate)、硫代邻苯二甲酰胺(thiophthalidamide)、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、敌菌灵(anilazine)、苯菌灵(benomyl)、放线菌酮(cyclohexamide)、多果定(dodine)、氯唑灵(etridiazole)、异菌脲(iprodione)、甲霜灵(metalaxyl)、thiamimefon、嗪氨灵(triforine)或其组合)、杀软体动物剂、杀藻剂、植物生长改良剂、细菌接种剂(例如，根瘤菌属(Rhizobium)的细菌接种剂、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的细菌接种剂、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)的细菌接种剂、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)的细菌接种剂、异根瘤菌属(Allorhizobium)的细菌接种剂、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的细菌接种剂、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)的细菌接种剂、固氮菌属(Azotobacter)的细菌接种剂、假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌接种剂、固氮螺菌属(Azospirillium)的细菌接种剂、芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌接种剂，链霉菌属(Streptomyces)的细菌接种剂、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌接种剂、副球菌属(Paracoccus)的细菌接种剂、肠杆菌属(Enterobacter)的细菌接种剂、产碱杆菌属(Alcaligenes)的细菌接种剂、分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌接种剂、木霉属(Trichoderma)的细菌接种剂、粘帚霉属(Gliocladium)的细菌接种剂、球囊霉属(Glomus)的细菌接种剂、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌接种剂或其组合)、真菌接种剂(例如，球囊霉科(Glomeraceae)的真菌接种剂、近明球囊霉科(Claroidoglomeraceae)的真菌接种剂，巨孢囊霉科(Gigasporaceae)家族的真菌接种剂、无梗囊霉科(Acaulosporaceae)家族的真菌接种剂、葡萄球菌科(Sacculosporace)家族的真菌接种剂、Entrophosporaceae家族的真菌接种剂、Pacidsporaceae家族的真菌接种剂、多样孢囊霉科(Diversisporaceae)的真菌接种剂、类球囊霉科(Paraglomeraceae)的真菌接种剂、原囊霉科(Archaeosporaceae)的真菌接种剂、地管囊霉科(Geogesisiphonae)的真菌接种剂、双型囊霉科(Ambisporaceae)的接种剂、Scutellosporaceae科的真菌接种剂、Dentiscultataceae科的真菌接种剂、Racocetraceae科的真菌接种剂、担子菌(Basidiomycota)门的真菌接种剂、子囊菌门(Ascomcom)的真菌接种剂、接合菌门(Zygomycota)的真菌接种剂或其组合)，或它们的组合。

肥料可包含硫酸铵、硝酸铵、硫硝酸铵(ammonium sulfate nitrate)、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸铵钙、硫酸钙、煅烧菱镁矿、钙质石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石灰石(dolomitic limestone)、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸氢二铵、磷酸一铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸钾镁、硫酸钾、硝酸钠、镁质石灰石(magnesian limestone)、氧化镁、脲、脲醛、硝酸铵脲、硫包衣尿素(sulfur-coated urea)、聚合物包衣尿素、异丁叉二脲(isobutylidene diurea)、K₂SO₄-(MgSO₄)₂、钾盐镁矾、钾石盐、硫酸镁石、泻盐(Epsom salts)、元素硫、泥灰(marl)、磨碎的牡蛎壳(ground oyster shells)、鱼粉、油饼、鱼肥(fish manure)、血粉、磷酸石、过磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、肥料(manure)、蝙蝠粪、泥炭藓(peat moss)、堆肥、湿砂(green sand)、棉籽粉、羽毛粉、蟹粉、鱼乳化剂、腐殖酸或其组合。如本文所述，农业化学品可包含任何杀真菌剂、细菌接种剂或除草剂。形成孢子的细菌(单独或与杀虫剂组合)可进一步包含有效量的至少一种杀真菌剂。

通常，“杀真菌剂”是提高真菌死亡率或抑制其生长速率的物质。术语“真菌(fungus)”或“真菌(fungi)”包括多种不含叶绿素的有核产孢子的生物体。真菌的实例包括酵母、霉菌(molds)、霉(mildews)、锈菌类(rusts)和蕈类(mushrooms)。典型的杀真菌成分还包括克菌丹(captan)、咯菌腈(fludioxonil)、异菌脲(iprodione)、戊唑醇(tebuconazole)、噻苯咪唑(thiabendazole)、嘧菌酯(azoxystrobin)、咪鲜胺(prochloraz)和噁霜灵(oxadixyl)。根据本公开内容选择的组合物、植物种子或接种物可包含任何天然或合成的杀真菌剂，例如：艾敌吗啉(aldimorph)、氨丙磷酸(ampropylfos)、氨丙磷酸钾(ampropylfos potassium)、胺扑灭(andoprim)、敌菌灵(anilazine)、戊环唑(azaconazole)、腈嘧菌酯(azoxystrobin)、苯霜灵(benalaxyl)、麦锈灵(benodanil)、苯菌灵(benomyl)、苄烯酸(benzamacril)、异丁基苄烯酸(benzamacryl-isobutyl)、双丙氨酰膦(bialaphos)、乐杀螨(binapacryl)、联苯(biphenyl)、联苯三唑醇(bitertanol)、灭瘟素(blasticidin-S)、啶酰菌胺(boscalid)、糠菌唑(bromuconazole)、磺嘧菌灵(bupirimate)、丁硫啶(buthiobate)、多硫化钙(calcium polysulphide)、卡巴西霉素(capsimycin)、敌菌丹(captafol)、克菌丹(captan)、多菌灵(carbendazim)、香芹酮(carvon)、灭螨锰(quinomethionate)、灭瘟唑(chlobenthiazone)、苯咪唑菌(chlorfenazole)、地茂散(chloroneb)、三氯硝基甲烷(chloropicrin)、百菌清(chlorothalonil)、乙菌利(chlozolinate)、clozylacon、硫杂灵(cufraneb)、霜菌脲(cymoxanil)、环唑醇(cyproconazole)、嘧菌环胺(cyprodinil)、酯菌胺(cyprofuram)、双乙氧咪唑威(debacarb)、双氯酚(dichlorophen)、苄氯三唑醇(diclobutrazole)、diclofluanid、哒菌清(diclomezine)、氯硝胺(dicloran)、乙霉威(diethofencarb)、恶咪唑(dimethirimol)、烯酰吗啉(dimethomorph)、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯唑醇(diniconazole)、烯唑醇-M(diniconazole-M)、敌螨普(dinocap)、二苯胺(diphenylamine)、双吡硫翁(dipyrithione)、灭菌磷(ditalimfos)、二噻农(dithianon)、吗菌灵(dodemorph)、多果定(dodine)、敌菌酮(drazoxolon)、克瘟散(edifenphos)、氧唑菌(epoxiconazole)、乙环唑(etaconazole)、乙菌定(ethirimol)、氯唑灵(etridiazole)、噁唑酮菌(famoxadon)、菌拿灵(fenapanil)、异嘧菌醇(fenarimol)、腈苯唑(fenbuconazole)、呋菌胺(fenfuram)、种衣酯(fenitropan)、拌种咯(fenpiclonil)、苯锈啶(fenpropidin)、丁苯吗啉(fenpropimorph)、三苯基乙酸锡(fentin acetate)、毒菌锡(fentin hydroxide)、福美铁(ferbam)、嘧菌腙(ferimzone)、氟啶胺(fluazinam)、氟联苯菌(flumetover)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟菌安(fluoromide)、喹唑菌酮(fluquinconazole)、呋嘧醇(flurprimidol)、氟硅唑(flusilazole)、磺菌胺(flusulfamide)、氟酰胺(flutolanil)、粉唑醇(flutriafol)、灭菌丹(folpet)、乙膦铝(fosetyl-aluminium)、三乙膦酸钠(fosetyl-sodium)、四氟苯酞(fthalide)、麦穗宁(fuberidazole)、呋氨丙灵(furalaxyl)、呋吡唑灵(furametpyr)、灭菌安(furcarbonil)、呋菌唑(furconazole)、呋醚唑(furconazole-cis)、拌种胺(furmecyclox)、双胍盐(guazatine)、六氯苯(hexachlorobenzene)、己唑醇(hexaconazole)、土菌消(hymexazole)、烯菌灵(imazalil)、酰胺唑(imibenconazole)、双胍辛胺(iminoctadine)、双胍辛对十二烷基苯磺酸盐(iminoctadine albesilate)、双胍辛胺醋酸盐(iminoctadinetriacetate)、依杜卡(iodocarb)、异稻瘟净(iprobenfos(IBP))、异丙定(iprodione)、人间霉素(irumamycin)、稻瘟灵(isoprothiolane)、氯苯咪菌酮(isovaledione)、春雷霉素(kasugamycin)、亚胺菌(kresoxim-methyl)、铜制剂例如氢氧化铜、环烷酸铜、氯氧化铜、硫酸铜、氧化铜、喹啉铜(oxine-copper)和波尔多液(Bordeaux mixture)、锰铜混剂(mancopper)、代森锰锌(mancozeb)、代森锰(maneb)、meferimzone、嘧菌胺(mepanipyrim)、丙氧灭锈胺(mepronil)、甲霜灵(metalaxyl)、环戊唑菌(metconazole)、磺菌威(methasulfocarb)、甲呋菌胺(methfuroxam)、代森联(metiram)、苯吡洛菌(metomeclam)、噻菌胺(metsulfovax)、米多霉素(mildiomycin)、腈菌唑(myclobutanil)、甲菌利(myclozolin)、福美镍(nickel dimethyldithiocarbamate)、异丙消(nitrothal-isopropyl)、氟苯嘧啶醇(nuarimol)、甲呋酰胺(ofurace)、噁霜灵(oxadixyl)、奥克斯莫卡宾(oxamocarb)、喹菌酮(oxolinic acid)、氧化萎锈灵(oxycarboxim)、oxyfenthiin、多效唑(paclobutrazole)、稻瘟酯(pefurazoate)、戊菌唑(penconazole)、戊菌隆(pencycuron)、双氯苯磷(phosdiphen)、多马霉素(pimaricin)、粉病灵(piperalin)、多抗霉素(polyoxin)、polyoxorim、噻菌灵(probenazole)、丙氯灵(prochloraz)、杀菌利(procymidone)、百维灵(propamocarb)、propanosine-sodium、丙环唑(propiconazole)、丙森锌(propineb)、丙环唑(prothiocinazole)、定菌磷(pyrazophos)、啶斑肟(pyrifenox)、二甲嘧菌胺(pyrimethanil)、咯喹酮(pyroquilon)、氟吡呋醚(pyroxyfur)、唑喹菌酮(quinconazole)、五氯硝基苯(quintozene(PCNB))、硫和硫制剂、戊唑醇(tebuconazole)、叶枯酞(tecloftalam)、四氯硝基苯(tecnazene)、调环烯(tetcyclasis)、氟醚唑(tetraconazole)、涕必灵(thiabendazole)、噻菌腈(thicyofen)、溴氟唑菌(thifluzamide)、甲基托布津(thiophanate-methyl)、硫氰苯甲酰胺(tioxymid)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、对甲抑菌灵(tolylfluanid)、三唑酮(triadimefon)、唑菌醇(triadimenol)、丁三唑(triazbutil)、唑菌嗪(triazoxide)、杨菌胺(trichlamide)、三环唑(tricyclazole)、克啉菌(tridemorph)、肟菌酯(trifloxystrobin)、氟菌唑(triflumizole)、嗪氨灵(triforine)、烯效唑(uniconazole)、有效霉素A(validamycinA)、烯菌酮(vinclozolin)、烯霜苄唑(viniconazole)、氯菌胺(zarilamide)、代森锌(zineb)、福美锌(ziramor)或其组合。杀真菌剂还包含取代苯、硫代氨基甲酸酯、亚乙基双二硫代氨基甲酸酯(ethylene bis dithiocarbamate)、硫代邻苯二甲酰胺(thiophthalidamide)、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、敌菌灵(anilazine)、苯菌灵(benomyl)、放线菌酮(cyclohexamide)、多果定(dodine)、氯唑灵(etridiazole)、异菌脲(iprodione)、甲霜灵(metalaxyl)、thiamimefon、嗪氨灵(triforine)或其组合。本领域普通技术人员将容易理解，还可选择用于农业目的的其他已知的合成或天然存在的杀真菌剂以包含在根据本公开内容的组合物、植物种子或接种物中。

如果组合物、植物种子或接种物包含杀真菌剂，则该杀真菌剂可以是叶杀菌剂。叶杀菌剂包括铜、代森锰锌(mancozeb)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、三唑(triazoles)、环唑醇(cyproconazole)、环戊唑菌(metconazole)、丙环唑(propiconazole)、丙硫菌唑(prothioconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、嘧菌酯(azoxystrobin)、pyraclastobin、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、嘧氧菌酯(picoxystrobin)、肟菌酯(trifloxystrobin)、硫、啶酰菌胺(boscalid)、甲基托布津(thiophanate-methyl)、百菌清(chlorothanonil)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、恶醚唑(difenconazole)、粉唑醇(flutriafol)、嘧菌环胺(cyprodinil)、氟啶胺(fluazinam)、异菌脲(iprodione)、氟唑菌苯胺(penflufen)、氰霜唑(cyazofamid)、氟酰胺(flutolanil)、霜菌脲(cymoxanil)、烯酰吗啉(dimethomorph)、二甲嘧菌胺(pyrimethanil)、苯酰菌胺(zoxamide)、双炔酰菌胺(mandipropamid)、metrinam、百维灵(propamocarb)、咪唑菌酮(fenamidone)、氟醚唑(tetraconazole)、地茂散(chloronab)、恶霉灵(hymexazol)、立枯磷(tolclofos)和腈苯唑(fenbuconazole)。本领域普通技术人员将容易理解，还可选择用于农业目的的其他已知的合成或天然存在的杀真菌剂以包含在根据本公开内容的组合物、植物种子或接种物中。

根据本公开内容的包含杀虫剂的组合物、种子和接种剂具有提高昆虫死亡率或抑制其生长速率的能力。如本文所用，术语“昆虫(insects)”包括“昆虫纲(Insecta)”中的所有生物体。术语“成年前(pre-adult)”昆虫是指成年阶段之前的任何形式的生物体，包括例如卵、幼虫和若虫。如本文所用，术语“杀虫剂(insecticide)”和“杀虫剂的(insecticidal)”还包含“杀线虫剂(nematicide)”和“杀线虫剂的(nematicidal)”以及“杀螨剂(acaricide)”和“杀螨剂的(acaricidal)”。“杀线虫剂(nematicide)”和“杀线虫剂的(nematicidal)”是指物质提高线虫死亡率或抑制其生长速率的能力。通常，术语“线虫(nematode)”包括所述生物体的卵、幼虫、幼体(juvenile)和成熟形式。“杀螨剂(acaricide)”和“杀螨剂的(acaricidal)”是指物质提高属于“蛛形纲(Arachnida)”的蜱螨亚纲(Acari)的外寄生虫死亡率或抑制其生长速率的能力。

根据本公开内容的一方面，至少一种杀虫剂包括：(1)乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，例如氨基甲酸酯类(carbamates)，如棉铃威(alanycarb)、恶虫威(bendiocarb)、丙硫克百威(benfuracarb)、丁酮威(butocarboxim)、丁酮砜威(butoxycarboxim)、克百威(carbofuran)、丁硫克百威(carbosulfan)、乙硫苯威(ethiofencarb)、呋线威(furathiocarb)、异丙威(isoprocarb)、速灭威(metolcarb)、杀线威(oxamyl)、抗蚜威(pirimicarb)、残杀威(propoxur)、久效威(thiofanox)、唑蚜威(triazamate)、混杀威(trimethacarb)、灭除威(XMC)和灭杀威(xylylcarb)；或有机磷酸酯类(organophosphates)，如乙酰甲胺磷(acephate)、甲基吡恶磷(azamethiphos)、乙基谷硫磷(azinphos-ethyl)、谷硫磷(azinphos-methyl)、硫线磷(cadusafos)、氯氧磷(chlorethoxyfos)、毒虫畏(chlorfenvinphos)、氯甲硫磷(chlormephos)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、蝇毒磷(coumaphos)、杀螟腈(cyanophos)、甲基内吸磷(demeton-S-methyl)、二嗪农(diazinon)、敌敌畏(dichlorvos)/DDVP、百治磷(dicrotophos)、乐果(dimethoate)、甲基毒虫畏(dimethylvinphos)、乙拌磷(disulfoton)、苯硫磷(EPN)、乙硫磷(ethion)、伐灭磷(famphur)、杀螟硫磷(fenitrothion)、噻唑酮磷(fosthiazate)、庚烯磷(heptenophos)、imicyafos、异柳磷(isofenphos)、O-(甲氧基氨基硫代磷酰基)水杨酸异丙酯(isopropyl O-(methoxyaminothiophosphoryl)salicylate)、噁唑磷(isoxathion)、马拉硫磷(malathion)、灭蚜磷(mecarbam)、杀扑磷(methidathion)、速灭磷(mevinphos)、久效磷(monocrotophos)、二溴磷(naled)、氧化乐果(omethoate)、甲基对硫磷(parathion-methyl)、稻丰散(phenthoate)、甲拌磷(phorate)、亚胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、辛硫磷(phoxim)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、丙溴磷(profenofos)、胺丙畏(propetamphos)、丙硫磷(prothiofos)、吡唑硫磷(pyraclofos)、哒嗪硫磷(pyridaphenthion)、喹噁磷(quinalphos)、治螟磷(sulfotep)、丁基嘧啶磷(tebupirimfos)、双硫磷(temephos)、特丁硫磷(terbufos)、杀虫畏(tetrachlorvinphos)、甲基乙拌磷(thiometon)和敌百虫(triclorfon)。(2)GABA门控氯化物通道拮抗剂，例如环二烯有机氯类(cyclodiene-organochlorines)，如氯丹(chlordane)和/或苯基吡唑类(phenylpyrazoles)。(3)钠通道调节剂/电压门控钠通道阻断剂，例如拟除虫菊酯类(pyrethroids)，如氟丙菊酯(acrinathrin)、烯丙菊酯(allethrin)、d-顺-反烯丙菊酯(d-cis-trans allethrin)、d-反烯丙菊酯(d-trans allethrin)、联苯菊酯(bifenthrin)、生物烯丙菊酯(bioallethrin)、生物烯丙菊酯S-环戊烯基异构体(bioallethrin s-cyclopentenyl isomer)、生物苄呋菊酯(bioresmethrin)、乙氰菊酯(cycloprothrin)、氟氯氰菊酯(cyhalothrin)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-cyhalothrin)、烯炔菊酯[(EZ)-(IR)异构体](empenthrin[(EZ)-(IR)-isomer])、高氰戊菊酯(esfenvalerate)、醚菊酯(etofenprox)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)、氟氰戊菊酯(flucythrinate)、氟氯苯菊酯(flumethrin)、τ-氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、苄螨醚(halfenprox)、咪炔菊酯(imiprothrin)、噻恩菊酯(kadethrin)、氯菊酯(permethrin)、苯醚菊酯[(1R)-反式异构体]、炔丙菊酯(prallethrin)、除虫菊素(pyrethrins)(除虫菊(pyrethrum))、苄呋菊酯(resmethrin)、七氟菊酯(tefluthrin)、胺菊酯(tetramethrin)、胺菊酯[(1R)-异构体](tetramethrin[(1R)-isomer])和四氟菊酯(transfluthrin)，或滴滴涕(DDT)或甲氧滴滴涕(methoxychlor)。(4)烟碱能乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂，例如新烟碱类(neonicotinoids)，如呋虫胺(dinotefuran)、烯啶虫胺(nitenpyram)和噻虫嗪(thiamethoxam)，或烟碱(nicotine)，或氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)。(5)烟碱能乙酰胆碱受体(nAChR)变构活化剂，例如多杀霉素类(spinosyns)，例如乙基多杀菌素(spinetoram)和多杀菌素(spinosad)。(6)氯化物通道活化剂，例如齐墩螨素类(avermectins)/米尔倍霉素类(milbemycins)，如阿维菌素(abamectin)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectinbenzoate)、雷皮菌素(lepimectin)和弥拜菌素(milbemectin)。(7)保幼激素模拟物，例如保幼激素类似物，例如烯虫乙酯(hydroprene)、烯虫炔酯(kinoprene)和烯虫酯(methoprene)，或苯氧威(fenoxycarb)，或吡丙醚(pyriproxyfen)。(8)具有未知的或未明确的作用机理的活性化合物，例如烷基卤化物(alkyl halides)，如溴甲烷(methylbromide)和其他烷基卤化物；或氯化苦(chloropicrine)，或硫酰氟(sulphurylfluoride)，或硼砂(borax)，或酒石酸氧锑钾(tartar emetic)。(9)选择性拒食剂，例如吡蚜酮(pymetrozine)或氟啶虫酰胺(flonicamid)。(10)螨虫生长抑制剂，例如四螨嗪(clofentezine)、噻螨酮(hexythiazox)和氟螨嗪(diflovidazin)，或乙螨唑(etoxazole)。(11)昆虫肠膜的微生物干扰剂，例如苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis subspecies israelensis)、球形芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subspecies aizawai)、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki)、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis)，和Bt植物蛋白：Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa、Cry2Ab、mCry3A、Cry3Ab、Cry3Bb、Cry34/35Ab1。(12)氧化磷酸化抑制剂，ATP干扰剂，例如丁醚脲(diafenthiuron)或有机锡化合物类(organotin compounds)，例如三唑锡(azocyclotin)、三环锡(cyhexatin)和苯丁锡(fenbutatin oxide)，或炔螨特(propargite)，或三氯杀螨醇(tetradifon)。(13)通过中断H质子梯度起作用的氧化磷酸化解偶联剂，例如虫螨腈(chlorfenapyr)、4,6-二硝基邻甲酚(DNOC)和氟虫胺(sulfluramid)。(14)烟碱能乙酰胆碱受体拮抗剂，例如杀虫磺(bensultap)、杀螟丹盐酸盐(cartap hydrochloride)、杀虫环(thiocylam)和杀虫双(thiosultap-sodium)。(15)几丁质生物合成抑制剂，0型，例如双三氟虫脲(bistrifluron)、氟啶脲(chlorfluazuron)、除虫脲(diflubenzuron)、氟环脲(flucycloxuron)、氟虫脲(flufenoxuron)、氟铃脲(hexaflumuron)、虱螨脲(lufenuron)、氟酰脲(novaluron)、多氟脲(noviflumuron)和氟苯脲(teflubenzuron)。(16)几丁质生物合成抑制剂，1型，例如噻嗪酮(buprofezin)。(17)蜕皮干扰剂(特别是对于双翅目(Diptera)，即双翅类昆虫)，例如，灭蝇胺(cyromazine)。(18)蜕皮激素受体激动剂，例如环虫酰肼(chromafenozide)、氯虫酰肼(halofenozide)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)和虫酰肼(tebufenozide)。(19)章鱼胺能激动剂。(20)复合物III电子转移抑制剂，例如氟蚁腙(hydramethylnone)，或灭螨醌(acequinocyl)，或嘧螨酯(fluacrypyrim)。(21)复合物I电子转移抑制剂，例如来自METI杀螨剂组，如喹螨醚(fenazaquin)、唑螨酯(fenpyroximate)、嘧螨醚(pyrimidifen)、哒螨灵(pyridaben)、吡螨胺(tebufenpyrad)和唑虫酰胺(tolfenpyrad)，或鱼藤酮(rotenone)(鱼藤属(Derris))。(22)电压门控钠通道阻断剂，例如茚虫威(indoxacarb)，或氰氟虫腙(metaflumizone)。(23)乙酰辅酶A羧化酶抑制剂。(24)复合物IV电子转移抑制剂，例如膦类，如磷化铝、磷化钙、膦、和磷化锌，或氰化物。(25)复合物II电子转移抑制剂，例如苯腈吡螨酯(cyenopyrafen)和丁氟螨酯(cyflumetofen)。(26)兰诺定(Ryanodine)受体效应物，例如，二酰胺类，如氯虫酰胺(chlorantraniliprole)，也以商品名RYNAXYPYR^TM而已知，和氰虫酰胺(cyantraniliprole)；或上述限定的一种或多种化合物或化合物类别的任何组合。

本领域普通技术人员将容易理解，还可选择用于农业目的的其他已知的合成或天然存在的杀虫剂以包含在根据本公开内容的组合物、植物种子或接种物中。

筛选方法

如本公开内容通篇中所讨论的，本文公开的融合蛋白构建体和重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞可用作用于高通量筛选产生新的和/或改良的植物属性的异源蛋白的平台。这样的属性可包括在商业上显著提高植物产量和其他植物特性，例如：植物蛋白或油含量/组成改变、植物碳水化合物含量/组成改变；植物碳水化合物含量/组成改变、种子碳水化合物含量/组成改变、种子油或蛋白组成改变；对环境或化学胁迫的耐受性增强(例如，抵抗寒冷或高温、干旱、杀虫剂或除草剂)；延迟衰老或抗病性；促进生长、增强健康；食草动物抗性；改善固氮作用或氮利用；改善根构型(root architecture)或长度；提高水利用效率；生物量增加；种子重量增加；芽长增加；产量提高；改良籽粒质量或水分含量；耐受金属；病原体或害虫抗性；提高光合能力；耐盐；活力增强；提高成熟种子的干重和/或鲜重、增加单株成熟种子的数量；提高叶绿素含量；相对于参照植物/种子的代谢物或代谢组水平的可检测调节；相对于参照植物/种子的转录产物水平或转录组水平的可检测调节；相对于参照植物的蛋白或蛋白组水平的可检测调节；以及上述任何性状或属性的组合。此外，前述列表旨在作为非限制性实例集合。本领域普通技术人员将理解，本文公开的高通量递送平台适用于筛选本公开内容中其他地方讨论的或本领域已知的各种其他植物性状和属性。

经修饰以表达根据本公开内容的融合蛋白的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子可施用于体外生长的植物细胞、宿主植物种子、幼苗，或营养体，或其他成熟植物。异源蛋白可继而修饰或赋予体外生长的植物细胞、宿主植物种子、幼苗或成熟植物性状或属性。在选择的实施方案中，短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞内生孢子可用于接种种子，并且得到的新的或改良的性状或属性可能会立即明显，而在其他实施方案中，它可能直到宿主植物发育的后期才变得明显。

在一些实施方案中，用于递送融合蛋白的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细菌对于宿主植物物种是外源的。在其他情况下，所选择的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细菌是已知定殖在宿主植物种中的内源内生菌。宿主植物可以是本文公开的任何合适的植物(单子叶植物、双子叶植物、松柏植物等)。

通过包衣或喷雾的方式，或本领域已知的将内生孢子施用于宿主植物的任何其他方法，用于递送融合蛋白的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细菌可用于接种宿主植物的种子、幼苗、营养体或其他成熟植物标本。当以液体，例如以溶液或悬液施用时，短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可混合或悬浮在水溶液中。合适的液体稀释剂或载体包括水溶液、石油馏出物或其他液体载体。固体组合物可通过将短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子分散在适当分开(appropriately divided)的固体载体(例如泥炭、小麦、麸皮、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土(fuller's earth)，巴氏消毒的土壤等)中和之上而制备。当此类制剂包含可湿性粉剂时，可使用分散剂(例如非离子、阴离子、两性或阳离子分散剂)和乳化剂。

短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可直接施用于宿主植物种子的表面或直接施用于营养繁殖苗的叶和茎，或作为包含其他组分的组合物的一部分。所述其他组分可包括一种或多种提高定殖率的化合物、增强植物生长或健康的化合物、农药或除草剂、或本文公开的适用于促进植物栽培和生长的任何其他化合物。此外，所述组合物可包含额外的已经被修饰以表达包含不同氨基酸序列的融合蛋白的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子。例如，组合物可包含表达包含植物生长促进因子的融合蛋白的第一短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子，以及表达包含增强农药抗性的蛋白的融合蛋白的第二短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子。

在选择的实施方案中，包被在宿主植物的种子上的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子能够在种子萌发成营养状态时定位至植物的不同组织。例如，重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞能够定位至植物中的任何组织，包括：根、不定根、种子根、根毛、芽(shoot)、叶、花、蓓蕾(bud)、穗(tassel)、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐枝、地下茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、排水器、花瓣、萼片、颖片、叶轴、维管束形成层、韧皮部和木质部。在其他实施方案中，重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞可能能够定位至植物的根和/或根毛。在可选的实施方案中，重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞可能能够定位至光合组织，例如植物的叶和芽；或定位至植物的维管组织，例如在木质部和韧皮部中。

在其他实施方案中，重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞能够定位至植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实)。在另一实施方案中，重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞定殖在植物的果实或种子组织中。在另一实施方案中，重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞能够定殖在植物上，以使其存在于植物的表面(例如植物的外部或植物的叶际)。在其他实施方案中，重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞能够定位至植物的基本上全部或全部组织。

包含设计用于施用于宿主植物的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的组合物可包含种子包衣组合物、根部处理剂、或叶面施用组合物。种子包衣组合物、或根部处理剂、或叶面施用组合物可包含杀真菌剂、抗菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀虫剂、植物生长调节剂、营养物或其组合。种子包衣组合物、或根部处理剂、或叶面施用组合物可进一步包含农业上可接受的载体、增粘剂、微生物稳定剂或其组合。在选择的实施方案中，种子包衣组合物、或根部处理剂、或叶面施用组合物可包含第二细菌，包括但不限于根瘤菌细菌制剂。所述组合物还可包含表面活性剂。在一实施方案中，表面活性剂的存在浓度为0.01％v/v至10％v/v。在另一实施方案中，表面活性剂的存在浓度为0.1％v/v至1％v/v。在一些实施方案中，组合物可包括微生物稳定剂(例如稳定剂)。

接种后，可筛选处理的宿主植物(例如，经处理的种子、幼苗、营养体或其他成熟植物)是否存在新的或改良的性状或属性。筛选可在处理后的任何时间点进行。在选择的实施方案中，可处理种子并且直到种子发芽或达到更高级的发育阶段才进行筛选。在其他实施方案中，可处理种子、幼苗或营养繁殖苗并且直到处理的植物已经产生收获的终产物时才进行筛选，该终产物可包含将要筛选的新的或改良的性状或属性的样品。

在筛选期间，可在体外和体内都进行各种测试以确定所处理的宿主植物被赋予了什么益处(如果有的话)。体内筛选测定包括测量植物或种子的表型性状或属性的测试(例如，测量植物生长速率或高度、作物产量、环境胁迫(如高温、寒冷或盐)抗性、生物病原体或昆虫害虫抗性、化学处理(例如杀虫剂或除草剂)抗性的测定)。体外筛选测定包括但不限于，测量植物提取物、组织样品、细胞样品等的组成或特性的测试。在一些实施方案中，体外筛选可包括纯化和测量在处理的宿主植物的细胞或组织中发现的给定蛋白、酶、基因转录物、代谢物或其他化合物的量或活性。在其他实施方案中，筛选可包括通过肉眼或通过显微镜目测检查处理的宿主植物的细胞或组织的结构。

在可选的实施方案中，筛选可包括对经修饰以表达根据本公开内容的融合蛋白的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子或营养细胞的测定，与针对经处理的宿主植物的测定相反。在这些实施方案中，可对短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的家族成员细胞或内生孢子进行一种或多种活性的体外测定，例如但不限于，释放复合磷酸盐或复合铁的能力(例如，通过铁载体的分泌)；产生植物激素；产生抗细菌、抗真菌、或杀虫、或杀线虫化合物；产生和/或分泌ACC脱氨酶、乙偶姻(acetoin)、果胶酶、纤维素酶或RNA酶。针对短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的家族成员细胞或内生孢子而不是营养繁殖苗的筛选方法是特别有利的，因为这种方法可能允许比针对处理的宿主植物的方法更快地检测有用的异源蛋白。

保藏信息

本发明的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属菌株的样品根据布达佩斯条约保藏在农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection，NRRL)，其位于美国伊利诺伊州，皮奥里亚市，北部大学街1815号，美国农业部农业研究局，农业应用研究国家中心，邮编61604。短芽孢杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属菌株NRRL B-67865和NRRL B-67864分别均保藏于2019年10月10日。绿芽孢杆菌属菌株NRRL B-67869保藏于2019年10月17日。

短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属菌株保藏在这样的条件下，即确保在本专利申请的在审期间，由专利和商标专员根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122确定的有资格的人员能够获得培养物。然而，应当理解，可获得保藏物不构成许可在损害依政府行为授予的专利权的情况下实施本发明。

提供以下非限制性实施例用于进一步举例说明本公开内容。

实施例

实施例1：用于制备重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的通用方案

为了产生融合构建体，可以将编码一种或多种异源蛋白的多核苷酸与编码本文公开的任何N端靶向序列的氨基酸的多核苷酸融合，例如，编码表1或图1-3(对于短芽孢杆菌属)、表2或图4-5(对于赖氨酸芽孢杆菌属)或表3或图6(对于绿芽孢杆菌属)中公开的任何氨基酸序列的多核苷酸，或当在各自的细菌属中表达时，其保留孢子外壁靶向功能的片段或变体。所述融合构建体可以在所公开的N端靶向序列的天然启动子的控制下。可以使用通过重叠延伸(SOE)技术进行剪接或产生线性扩增子的Gibson组装来产生此类构建体。在此阶段，还可以修改方案，以将N端靶向序列与标签(例如GFP)的框内编码序列融合，或在N端靶向序列和异源蛋白之间插入接头或蛋白酶识别序列。无论是否包括可选的标签、接头和/或蛋白酶识别序列，都可以选择正确的扩增子并将其克隆至合适的穿梭载体(例如，用于大肠杆菌/短芽孢杆菌属的pHP13)中，并通过DNA测序筛选正确的载体构建体。可以将该载体构建体电穿孔至未转化的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞中。然后，可以在适合的孢子形成培养基中培养(例如，在30℃下于Schaeffer孢子形成培养基肉汤中过夜)正确的转化子(transformant)，直到孢子形成发生(通常为2-3天)。可以收获表达融合构建体的孢子，然后进行一种或多种体外筛选测定，直接施用于宿主植物或种子，或施用于随后接受一种或多种体外或体内筛选测定的宿主植物或种子。

实施例2：重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于将在促进植物生长的化合物的产生中涉及的融合蛋白递送至种子、幼苗、植物或植物部分的用途

可使用本文公开的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子递送系统将负责产生促进植物生长的化合物的酶递送至植物。例如，丁二醇脱氢酶将乙偶姻转化为2,3-丁二醇。2,3-丁二醇是一种促进植物生长的化合物。表达该酶的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域。

实施例3：重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于将在单个短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子上的一种以上融合蛋白递送至种子、幼苗、植物或植物部分的用途

单个重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可用于展示一种以上的异源融合蛋白。这是通过构建两个(或多个)单独的融合蛋白来实现的。将要展示在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子表面上的每种异源蛋白的编码序列分别与在其天然启动子控制下的N端靶向序列融合。融合蛋白构建体可克隆到同一质粒载体或不同的质粒载体中，并且通过电穿孔引入到短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属细胞中。然后所得到的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子在孢子表面上表达两种异源蛋白的混合物。这对于堆叠多种蛋白无脊椎动物毒素以减轻害虫抗性特别有用。

实施例4：组合使用一种以上重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子，各自向种子、幼苗、植物或植物部分展示一种或多种不同的融合蛋白

在某些情况下，提供一种以上的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的组合的递送，各个短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子都表达一种或多种不同的异源蛋白(如上所述)。例如，递送固氮酶至植物根部周围的区域减少了对化学氮肥的需求。细菌中的固氮作用可能至少需要八或九种不同的酶，并且根据物种的不同可能需要多达二十种不同的酶。本文中，各自表达固氮途径中的不同酶组分的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的组合的递送可能是有用的。例如，异源展示NifH、NifD和NifK的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可与异源展示NifE、NifN和NifD的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子以混合物组合，并递送到根周围的区域。

实施例5：重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于将杀死无脊椎动物植物害虫的无脊椎动物毒素递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域或作为种子处理剂的用途

拮抗无脊椎动物(包括但不限于昆虫或线虫)的蛋白毒素可使用本文公开的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子系统递送。例如，同时杀虫性的和杀线虫性的Cry毒素(包括但不限于Cry5B和Cry21A)可与N末端靶向序列融合，以在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子中表达。表达Cry毒素或其他蛋白无脊椎动物毒素的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域，以保护其免受无脊椎动物植物病原体侵害。

实施例6：短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于将拮抗细菌植物害虫的肽、蛋白或酶递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域或作为种子处理剂的用途

细菌素是由细菌产生的对其他细菌有拮抗活性的小肽。细菌素是通过核糖体合成的，不同于通过大的非核糖体肽合成酶合成的其他抗菌分子(例如杆菌肽)，基于该事实，细菌素特别适合于使用短芽孢杆菌属内生孢子系统递送。可将一种或多种细菌素的编码序列与N端靶向序列融合，以在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子中表达。表达细菌素的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域，以保护其免受细菌植物病原体侵害。

实施例7：短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于将拮抗真菌植物害虫的肽、蛋白或酶递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域或作为种子处理剂的用途

真菌的主要细胞壁组分是几丁质。几丁质酶是一种降解几丁质的酶，并且可在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的表面上表达，以通过破坏真菌的细胞壁来保护其免受真菌植物病原体侵害。表达几丁质酶的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域。

实施例8：短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于将降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域或作为种子处理剂的用途

可使用重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子将负责细菌、真菌或植物营养源的降解或修饰的酶递送至植物。例如，分解复合多糖的糖苷水解酶可用于通过用表达这种(或另一种)目的酶的重组短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子处理植物或种子而使有益的根际细菌获得单糖。

实施例9：短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于通过筛选源自促进植物生长的生物防治剂的基因组DNA文库评估对促进植物生长的生物防治剂的应答的用途

目前使用的许多生物防治菌株难以进行外源DNA吸收(recalcitrant)，致使研究人员无法产生所述菌株的靶向遗传修饰。由于这个挑战，阐明这些生物防治菌株的植物生长促进效果的作用机理是非常困难的。短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子提供了一种用于鉴定负责生物防治菌株的潜在植物生长促进效果的特定基因的新方法。首先，将N端靶向序列和天然启动子克隆到合适的穿梭载体(例如，用于短芽孢杆菌属的pHP13)中，得到适用于短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子上的异源蛋白表达的载体。所有克隆步骤和质粒增殖均在大肠杆菌中进行。接下来，从目标促进植物生长的生物防治菌株中提取总gDNA。将gDNA剪切成片段(酶促法或超声法)，并连接到上述载体中，以在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子上表达异源蛋白以产生由源自目的生物防治菌株的所有遗传物质组成的gDNA文库。将所得到的载体文库通过电穿孔引入到短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的成员中，并且将细菌铺于含有合适抗生素选择剂的琼脂平板上，以选择成功的转化子。评估了每个均表达目标生物防治菌株的gDNA的不同片段的各个转化子的植物生长促进作用。这些作用可包括但不限于，增强的绿化、改善的萌发、增加的植物活力、增加的根长度、增加的根质量、增加的植物高度、增加叶片面积或对害虫的抗性。可对发现能调节上述植物健康参数的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子转化子中的载体进行测序，以鉴定源自负责所观察到的植物生长促进作用的生物防治菌株的遗传决定子。

实施例10：短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子用于鉴定拮抗植物无脊椎动物、细菌和真菌植物病原体的新的或未表征的毒素的用途

目前使用的许多生物防治菌株难以进行外源DNA吸收，致使研究人员无法产生所述菌株的靶向遗传修饰。由于这个挑战，阐明这些生物防治菌株对无脊椎动物、细菌和真菌植物病原体有毒的作用机理是非常困难的。短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子提供了一种用于鉴定负责生物防治菌株的潜在植物保护作用的特定基因的新方法。首先，将N端靶向序列和天然启动子克隆到合适的穿梭载体(例如，用于短芽孢杆菌属的pHP13)中，得到适用于短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子上的异源蛋白表达的载体。所有克隆步骤和质粒繁殖均在大肠杆菌中进行。接下来，从目标促进植物生长的生物防治菌株中提取总gDNA。将gDNA剪切成片段(酶促法或超声法)，并连接到上述载体中，以在短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子上表达异源蛋白以产生由源自目的生物防治菌株的所有遗传物质组成的gDNA文库。将所得到的载体文库通过电穿孔引入到短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属的成员中，并且将细菌铺于含有合适抗生素选择剂的琼脂平板上，以选择成功的转化子。评估了每个均表达目标生物防治菌株的gDNA的不同片段的各个转化子对无脊椎动物、细菌和真菌植物病原体的拮抗活性。可对发现能拮抗上述植物病原体的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子转化子中的载体进行测序，以鉴定源自负责所观察到的植物保护作用的生物防治菌株的遗传决定子。

实施例11：来自短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的纯化的孢子外壁作为对种子、幼苗、植物或植物部分的治疗剂以改善植物健康的用途

可能需要使用不含有活力的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的本文公开的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子系统来递送促进植物健康的蛋白/酶。为此，可以通过超声的充分搅动将来自短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁(例如，由使用本文公开的N端靶向序列修饰以产生异源蛋白的细胞所产生)从短芽孢杆菌属内生孢子中剥离。然后，将剥离的孢子外壁通过过滤进行进一步纯化。所得纯化的孢子外壁可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域。

实施例12：无活力的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子作为对种子、幼苗、植物或植物部分的处理剂用于保护植物免受病原体侵害或改善植物健康的目的的用途

可能需要用含无活力的(死的)短芽孢杆菌属内生孢子的本文公开的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子递送系统来递送促进植物健康的蛋白/酶或植物保护蛋白/酶。短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可通过充分的热处理、UV线、γ辐射或高压处理灭活并使其失去活力。所得到的无活力的短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属或绿芽孢杆菌属内生孢子可作为种子处理剂或种子包衣施用，或通过滴灌或喷雾递送至种子、幼苗、植物或植物部分周围的区域。

实施例13：用于制备展示串联二聚体Tomato(tdTomato)的重组短芽孢杆菌属内生孢子的通用方案

通过生物信息学分析，检索短芽孢杆菌属种NRRL B-67865的完整基因组中含有胶原样GXX重复的ORF。编译并修整来自包含有胶原样重复的ORF的序列，以仅产生胶原样重复序列上游的N端氨基酸。该通用方案用于鉴定具有表1和图1-3中公开的N端靶向序列的内源短芽孢杆菌属种NRRL B-67865蛋白。例如，该方法用于鉴定由SEQ ID NO:3所表示的N端靶向序列，其被发现直接位于CLR重复结构域(SEQ ID NO:220)的上游，并且在由SEQ ID NO:221编码的天然启动子的控制下。

表4：与示例性短芽孢杆菌属孢子外壁靶向蛋白相关的CLR和启动子序列

为了产生融合构建体，通过基因合成将编码tdTomato的基因与编码所公开的短芽孢杆菌属种NRRL B-67865的N端靶向序列(SEQ ID NO:3)的氨基酸的DNA区段(在所公开的N端靶向序列的天然启动子的控制下)融合，并克隆到大肠杆菌/短芽孢杆菌属穿梭载体pAP13中。通过与Huang et al.(2010),“Production of an In Vitro-Derived DeletionMutation of Brevibacillus laterosporus by Constructing a Homology-DrivenIntegration Vector,”Current Microbiology,61:401–406,doi:10.1007/s00284-010-9627-0中所述的电穿孔法相似的电穿孔法，将所得到的载体构建体引入短芽孢杆菌属种NRRL B-67865中。然后将正确的转化子在基于葡萄糖的肉汤培养基中于30℃下生长，直至形成孢子。然后，通过落射荧光显微镜检查表达融合构建体的短芽孢杆菌属种NRRL B-67865孢子。TdTomato在表达融合构建体的孢子上可见(图7A)。还通过流式细胞术检查了短芽孢杆菌属种NRRL B-67865孢子。表达融合构建体的孢子比野生型孢子具有明显更高的荧光性(图7B)。

实施例14：用于制备展示串联二聚体Tomato(tdTomato)的重组赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子的通用方案

通过生物信息学分析，检索赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864的完整基因组中含有胶原样GXX重复的ORF。编译并修整来自包含有胶原样重复的ORF的序列，以仅产生胶原样重复序列上游的N端氨基酸。该通用方案用于鉴定具有表2和图4-5中公开的N端靶向序列的内源赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864蛋白。例如，该方法用于鉴定由SEQ ID NO:43所表示的N端靶向序列，其被发现直接位于CLR重复结构域(SEQ ID NO:222)的上游，并且在由SEQ ID NO:223编码的天然启动子的控制下。

表5：与示例性赖氨酸芽孢杆菌属孢子外壁靶向蛋白相关的CLR和启动子序列

为了产生融合构建体，通过基因合成将编码tdTomato的基因与编码所公开的赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864的N端靶向序列(SEQ ID NO:43)的氨基酸的DNA区段(在所公开的N端靶向序列的天然启动子的控制下)融合，并克隆到大肠杆菌/赖氨酸芽孢杆菌属穿梭载体pAP13中。通过与Taylor and Burke(1990),“Transformation of an entomopathicstrain of Bacillus sphaericus by high voltage electroporation,”FEMSMicrobiology Letters,66:125-128,doi.org/10.1111/j.1574-6968.1990.tb03983.x中所述的电穿孔法相似的电穿孔法，将所得到的载体构建体引入赖氨酸芽孢杆菌属种NRRLB-67864中。然后将正确的转化子在基于葡萄糖的肉汤培养基中于30℃下生长，直至形成孢子。然后，通过落射荧光显微镜检查表达融合构建体的赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864孢子。TdTomato在表达融合构建体的孢子上可见(图8A)。还通过流式细胞术检查了赖氨酸芽孢杆菌属种NRRL B-67864孢子。表达融合构建体的孢子比野生型孢子具有明显更高的荧光性(图8B)。

实施例15：用于制备展示串联二聚体Tomato(tdTomato)的重组绿芽孢杆菌属内生孢子的通用方案

实施例13和14中所述的方法用于鉴定绿芽孢杆菌属中的N端靶向序列。该方法导致鉴定出由SEQ ID NO:197所表示的N端靶向序列，其被发现直接位于CLR重复结构域(SEQID NO:224)的上游，并且在由SEQ ID NO:225编码的天然启动子的控制下。

表6：与示例性绿芽孢杆菌属孢子外壁靶向蛋白相关的CLR和启动子序列

为了产生融合构建体，通过基因合成将编码tdTomato的基因与编码所公开的绿芽孢杆菌属种NRRL B-67869的N端靶向序列(SEQ ID NO:197)的氨基酸的DNA区段(在公开的N端靶向序列的天然启动子的控制下)融合，并克隆到大肠杆菌/绿芽孢杆菌属穿梭载体pAP13中。通过与Zhang et al.(2015),“Development of an Efficient ElectroporationMethod for Iturin A-Producing Bacillus subtilis ZK,”International Journal ofMolecular Sciences,16:7334-7351,doi:10.3390/ijms16047334所述的电穿孔法相似的电穿孔法(使用LBSP培养基、氨苄青霉素处理以及用TSMMKK缓冲液洗涤)，将所得到的载体构建体引入绿芽孢杆菌属种NRRL B-67869中。然后将正确的转化子在基于葡萄糖的肉汤培养基中于30℃下生长，直至形成孢子。然后，通过落射荧光显微镜检查表达融合构建体的绿芽孢杆菌属种NRRL B-67869孢子。TdTomato在表达融合构建体的孢子上可见(图9A)。还通过流式细胞术检查了绿芽孢杆菌属种NRRL B-67869孢子。表达融合构建体的孢子比野生型孢子具有明显更高的荧光性(图9B)。

序列表

<110> Bayer CropScience LP

<120> 内生孢子展示平台、产品和方法

<130> BCS189008 WO

<150> 62/768,077

<151> 2018-11-15

<150> 62/768,063

<151> 2018-11-15

<150> 62/767,997

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<212> PRT

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<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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<213> 人工序列

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 25

Met Val Arg Thr Leu Ser Lys Ile Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Thr Leu

1 5 10 15

Ala Pro Ile Asn Pro Ile Met Glu Val Val Ile Tyr Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Asn Lys Val Val Asn Gly Asp Phe Glu Thr Gly Thr Leu Phe Pro Trp

35 40 45

Ser Phe Thr Asn Val Ser Ile Thr Asn Leu Gln Ser His Thr Gly Phe

50 55 60

Phe Ser Ala Leu Leu Phe Gly Asp Thr Ala Asn Ser Leu Leu Phe Gln

65 70 75 80

Ala Ile Pro Val Thr Pro Gly Asp Ser Phe Glu Leu Phe Leu Ser Ile

85 90 95

Ala Lys Leu Gly Asn Leu Val Ser Pro Gln Val Asn Ile Ala Leu Leu

100 105 110

Tyr Leu Asp Val Ala Thr Ile Pro Val Gly Ile Gly Leu Asn Leu Thr

115 120 125

Ile Pro Val Gly His Leu Pro Asp Asn Thr Ala Asn Ile Trp Thr Thr

130 135 140

Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro Ala Thr Ala Thr Gln Ala Leu

145 150 155 160

Leu Ile Ile Asn Lys Ile Ser Ala Leu Ser Thr Ala Asp Ile Val Val

165 170 175

Asp Asp Ile Gly Ile Leu Gln Thr Ser Gly

180 185

<210> 26

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 26

Met Pro Phe Gly Asn Lys Ile Val Asn Gly Asn Phe Glu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ser Asn Val Ala Ile Ser Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Ser Tyr Ser Ala Leu Leu Phe Gly Asn Ala Ala Asn Ser

35 40 45

Phe Leu Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Val Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Phe Leu Ser Ile Ala Lys Ile Gly Asn Leu Pro Ser Pro Gln Val Asp

65 70 75 80

Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Asn Ala Ala Ser Thr Pro Ile Ser Ile Gly

85 90 95

Met Ser Ile Ile Leu Pro Thr Gly His Leu Pro Asp Asn Leu Asn Asn

100 105 110

Asn Trp Ser Thr Ile Tyr Glu Ile Ser Ser Val Val Pro Ala Met Ala

115 120 125

Thr His Ala Met Val Ile Ile His Lys Ile Pro Ser Pro Ser Thr Ser

130 135 140

Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Val Leu Val Gln Thr Gly Ala

145 150 155

<210> 27

<211> 186

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 27

Met Val Arg Thr Leu Ser Lys Ile Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Thr Leu

1 5 10 15

Ala Pro Ile Asn Pro Ile Met Glu Val Val Ile Tyr Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Asn Lys Val Val Asn Gly Asp Phe Glu Thr Gly Thr Leu Phe Pro Trp

35 40 45

Ser Phe Thr Asn Val Ser Ile Thr Asn Leu Gln Ser His Thr Gly Phe

50 55 60

Phe Ser Ala Ile Leu Phe Gly Asp Thr Ala Asn Ser Leu Leu Phe Gln

65 70 75 80

Ala Ile Pro Val Thr Pro Gly Asp Ser Phe Glu Leu Phe Leu Ser Ile

85 90 95

Ala Lys Leu Gly Asn Leu Val Ser Pro Gln Val Asn Ile Ala Leu Leu

100 105 110

Tyr Leu Asp Val Ala Thr Ile Pro Val Gly Ile Gly Leu Asn Leu Thr

115 120 125

Ile Pro Val Gly His Leu Pro Asp Asn Thr Ala Asn Ile Trp Thr Thr

130 135 140

Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro Ala Asn Ala Thr Gln Ala Leu

145 150 155 160

Leu Ile Ile Asn Lys Ile Ser Ala Leu Ser Thr Ala Asp Ile Val Val

165 170 175

Asp Asp Ile Gly Ile Leu Gln Thr Ser Gly

180 185

<210> 28

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 28

Gly Asp Phe Glu Thr Gly Thr Leu Phe Pro Trp Ser Phe Thr Asn Val

1 5 10 15

Ser Ile Thr Asn Leu Gln Ser His Thr Gly Phe Phe Ser Ala Ile Leu

20 25 30

Phe Gly Asp Thr Ala Asn Ser Leu Leu Phe Gln Ala Ile Pro Val Thr

35 40 45

Pro Gly Asp Ser Phe Glu Leu Phe Leu Ser Ile Ala Lys Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Val Ser Pro Gln Val Asn Ile Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Val Ala

65 70 75 80

Thr Ile Pro Val Gly Ile Gly Leu Asn Leu Thr Ile Pro Val Gly His

85 90 95

Leu Pro Asp Asn Thr Ala Asn Ile Trp Thr Thr Ile Tyr Glu Thr Thr

100 105 110

Ser Val Val Pro Ala Asn Ala Thr Gln Ala Leu Leu Ile Ile Asn Lys

115 120 125

Ile Ser Ala Leu Ser Thr Ala Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Gly Ile

130 135 140

Leu Gln Thr Ser Gly

145

<210> 29

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 29

Met Pro Phe Gly Asn Lys Ile Val Asn Gly Asn Phe Glu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ser Asn Val Ala Ile Ser Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Ser Tyr Ser Ala Leu Leu Phe Gly Asn Thr Ala Asn Ser

35 40 45

Leu Met Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Val Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Phe Leu Ser Ile Ala Lys Ile Gly Asn Leu Pro Ser Ala Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Asn Val Ala Ser Thr Pro Ile Ser Ile Gly

85 90 95

Met Ser Ile Ile Leu Pro Ile Gly His Leu Pro Asp Asn Leu Asn Asn

100 105 110

Asn Trp Ser Thr Ile Tyr Glu Ile Ser Ser Val Val Pro Ala Met Ala

115 120 125

Thr His Ala Met Val Ile Ile His Lys Ile Pro Ser Pro Ser Thr Ser

130 135 140

Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Val Leu Val Gln Thr Gly Ala

145 150 155

<210> 30

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 30

Met Pro Phe Ser Asn Lys Ile Val Asn Gly Asp Phe Glu Thr Gly Thr

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ile Asn Val Ala Ile Thr Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Phe Phe Ser Ala Arg Leu Phe Gly Asn Thr Ala Asn Ser

35 40 45

Leu Leu Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Pro Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Leu Leu Ser Ile Ala Lys Leu Gly Asn Leu Val Ser Pro Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Val Thr Ala Thr Pro Val Gly Ile Gly

85 90 95

Leu Asn Leu Thr Ile Pro Val Gly His Leu Pro Asp Asn Thr Ala Asp

100 105 110

Ile Trp Thr Thr Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro Ala Thr Ala

115 120 125

Ile Gln Ala Leu Leu Ile Ile Glu Lys Val Pro Gly Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Asp Val Val Val Asp Asp Ile Glu Leu Leu Gln Thr Ser Gly

145 150 155

<210> 31

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 31

Met Pro Phe Gly Asn Lys Ile Val Asn Gly Asn Phe Glu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ser Asn Val Ala Ile Ser Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Ser Tyr Ser Ala Leu Leu Phe Gly Asn Thr Ala Asn Ser

35 40 45

Leu Met Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Val Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Phe Leu Ser Ile Ala Lys Ile Gly Asn Leu Pro Ser Ala Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Asn Val Ala Ser Thr Pro Ile Ser Ile Gly

85 90 95

Met Ser Ile Ile Leu Pro Ile Gly His Leu Pro Asp Asn Leu Asn Asn

100 105 110

Asn Trp Ser Thr Ile Tyr Glu Ile Ser Ser Val Val Pro Ala Met Ala

115 120 125

Thr His Ala Met Val Ile Ile His Lys Ile Pro Ser Pro Ser Thr Ser

130 135 140

Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Val Phe Val Gln Thr Gly Ala

145 150 155

<210> 32

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 32

Val Tyr Leu Asn Val Val Ala Thr Pro Ile Gly Ile Gly Met Ser Thr

1 5 10 15

Ile Leu Pro Ile Asp His Leu Pro Asp Asn Thr Asn Lys Asn Trp Thr

20 25 30

Thr Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro Ala Thr Ala Ile Arg Ala

35 40 45

Leu Val Ile Ile His Lys Ile Pro Ser Pro Ser Thr Ala Asp Ile Val

50 55 60

Val Asp Asp Ile Val Leu Leu Gln Thr Gly Leu

65 70 75

<210> 33

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 33

Met Pro Phe Ser Asn Lys Ile Val Asn Gly Asp Phe Glu Thr Gly Thr

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ile Asn Val Ala Ile Thr Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Phe Phe Ser Ala Arg Leu Phe Gly Asn Ile Ala Asn Ser

35 40 45

Leu Leu Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Pro Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Leu Leu Ser Ile Ala Lys Leu Gly Asn Leu Val Ser Pro Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Val Thr Ala Thr Pro Val Gly Ile Gly

85 90 95

Leu Asn Leu Thr Ile Pro Val Gly His Leu Pro Asp Asn Thr Ala Asn

100 105 110

Ile Trp Thr Thr Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro Ala Thr Ala

115 120 125

Ile Gln Ala Leu Leu Ile Ile Glu Lys Val Ala Ser Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Asp Val Val Val Asp Asp Ile Glu Leu Leu Gln Thr Ser Gly

145 150 155

<210> 34

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 34

Met Pro Phe Gly Asn Lys Ile Val Asn Gly Asn Phe Glu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ser Asn Val Val Ile Ser Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Ser Tyr Ser Ala Leu Leu Phe Gly Asn Ala Ala Asn Ser

35 40 45

Leu Met Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Val Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Phe Leu Ser Ile Ala Lys Ile Gly Asn Leu Pro Ser Pro Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Asn Val Ala Ser Thr Pro Ile Ser Ile Gly

85 90 95

Met Ser Ile Ile Leu Pro Ile Asp His Leu Pro Asp Asn Leu Asn Asn

100 105 110

Asn Trp Ser Thr Ile Tyr Glu Ile Ser Ser Val Val Pro Ala Thr Ala

115 120 125

Thr His Ala Met Val Ile Ile His Lys Ile Pro Ser Pro Ser Thr Ser

130 135 140

Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Val Leu Val Gln Thr Gly Ala

145 150 155

<210> 35

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 35

Met Pro Phe Ser Asn Lys Ile Val Asn Gly Asp Phe Glu Thr Gly Thr

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ile Asn Val Ala Ile Thr Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Phe Phe Ser Ala Arg Leu Phe Gly Asn Ile Ala Asn Ser

35 40 45

Leu Leu Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Pro Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Leu Leu Ser Ile Ala Lys Leu Gly Asn Leu Val Ser Pro Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Val Thr Ala Thr Pro Val Gly Ile Gly

85 90 95

Leu Asn Phe Thr Ile Pro Val Gly His Leu Pro Asp Asn Thr Ala Asn

100 105 110

Ile Trp Thr Thr Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro Ala Thr Ala

115 120 125

Ile Gln Ala Leu Leu Ile Ile Glu Lys Val Ala Ser Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Asp Val Val Val Asp Asp Ile Glu Leu Leu Gln Thr Ser Gly

145 150 155

<210> 36

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 36

Phe Glu Leu Phe Leu Ser Ile Ala Lys Leu Gly Asn Leu Val Ser Pro

1 5 10 15

Gln Val Asn Ile Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Val Ala Thr Ile Pro Val

20 25 30

Gly Ile Gly Leu Asn Leu Thr Ile Pro Val Gly His Leu Pro Asp Asn

35 40 45

Thr Ala Asn Ile Trp Thr Thr Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro

50 55 60

Ala Thr Ala Thr Gln Ala Leu Leu Ile Ile Asn Lys Ile Ala Ala Leu

65 70 75 80

Ser Thr Ala Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Gly Ile Leu Gln Thr Ser

85 90 95

Glu

<210> 37

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 37

Met Pro Phe Gly Asn Lys Ile Val Asn Gly Asn Phe Glu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ser Asn Val Val Ile Ser Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Ser Tyr Ser Ala Leu Leu Phe Gly Asn Ala Thr Asn Ser

35 40 45

Leu Met Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Val Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Phe Leu Ser Ile Ala Lys Ile Gly Asn Leu Pro Ser Pro Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Asn Val Ala Ser Thr Pro Ile Ser Ile Gly

85 90 95

Met Ser Ile Ile Leu Pro Ile Gly His Leu Pro Asp Asn Leu Asn Asn

100 105 110

Asn Trp Ser Thr Ile Tyr Glu Ile Ser Ser Val Val Pro Ala Thr Ala

115 120 125

Thr His Ala Met Val Ile Ile His Lys Ile Pro Ser Pro Ser Thr Ser

130 135 140

Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Val Leu Val Gln Thr Gly Ala

145 150 155

<210> 38

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 38

Met Pro Phe Ser Asn Lys Ile Val Asn Gly Asp Phe Glu Thr Gly Thr

1 5 10 15

Leu Ile Pro Trp Ser Ser Ile Asn Val Ala Ile Thr Asn Leu Gln Ser

20 25 30

His Thr Gly Phe Phe Ser Ala Arg Leu Phe Gly Asn Ile Ala Asn Ser

35 40 45

Leu Leu Phe Gln Ala Val Pro Val Thr Pro Gly Asp Ser Phe Glu Phe

50 55 60

Leu Leu Ser Ile Ala Lys Leu Gly Asn Leu Val Ser Pro Gln Val Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Val Thr Ala Thr Pro Val Gly Ile Gly

85 90 95

Leu Asn Phe Thr Ile Pro Val Gly His Leu Pro Asp Asn Thr Ala Asn

100 105 110

Ile Trp Thr Thr Ile Tyr Glu Thr Thr Ser Val Val Pro Ala Thr Ala

115 120 125

Thr Gln Ala Leu Leu Ile Ile Asn Lys Ile Ala Ala Leu Ser Thr Ala

130 135 140

Asp Ile Val Val Asp Asp Ile Gly Ile Leu Gln Thr Ser Glu

145 150 155

<210> 39

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 39

atgcgcttta gctatagccg caactttgat aactttaaat gcgatagcaa atgcaactat 60

ccgatgaaat ataaatgcaa cgaatttggc tgcaacggct atccgtatga tctgagcggc 120

attcaggatc cgatt 135

<210> 40

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 40

atgcattttg gcaactttaa cctggatcgc gtgtgcagca aatgcaacag ctttccgtgc 60

tgctgcaaaa ccggcccgat tccgagctgc ccgatttggc cggtgaaacc gacc 114

<210> 41

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 41

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 42

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 42

Met His Phe Gly Asn Phe Asn Leu Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn

1 5 10 15

Ser Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 43

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 43

Met Arg Phe Ser Tyr Asn Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Tyr Gly Ile Glu Asp Pro Ile

35 40

<210> 44

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 44

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 45

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 45

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Met

35 40 45

<210> 46

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 46

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Tyr Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Tyr Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 47

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 47

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Ser Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 48

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 48

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Ser Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 49

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 49

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Leu Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 50

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 50

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Leu Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 51

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 51

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Leu Lys Phe Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 52

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 52

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 53

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 53

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Lys Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 54

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 54

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Leu Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 55

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 55

Met Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 56

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 56

Leu Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 57

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 57

Met Arg Phe Arg Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 58

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 58

Met Arg Val Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 59

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 59

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Tyr Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 60

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 60

Met Arg Ile Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Met

35 40 45

<210> 61

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 61

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Glu Pro Met

35 40 45

<210> 62

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 62

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Leu Ile

35 40 45

<210> 63

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 63

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Val Pro Ile

35 40 45

<210> 64

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 64

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Phe Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 65

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 65

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Tyr Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 66

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 66

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Asn Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 67

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 67

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Ala Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 68

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 68

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Phe Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 69

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 69

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Phe Gln Asp Pro Thr

35 40 45

<210> 70

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 70

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Tyr Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 71

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 71

Met Arg Phe Ser Tyr Cys Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 72

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 72

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Leu Ile

35 40 45

<210> 73

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 73

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Ile

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 74

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 74

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Ala Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 75

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 75

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 76

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 76

Leu Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 77

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 77

Met Arg Phe Ser Tyr Ile Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 78

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 78

Met Arg Val Ser Asp Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 79

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 79

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Tyr Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Phe Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 80

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 80

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Trp Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Phe Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 81

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 81

Met Arg Phe Ser Asn Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Phe Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 82

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 82

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Phe Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 83

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 83

Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser Lys Cys

1 5 10 15

Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn Gly Tyr

20 25 30

Ala Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40

<210> 84

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 84

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Tyr Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Ala Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 85

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 85

Met Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asn Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 86

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 86

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Phe Asp Phe Ser Gly Phe Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 87

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 87

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Ser Asp Thr

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Asp Leu Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 88

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 88

Met Arg Phe Ser Tyr Asn Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Tyr Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40

<210> 89

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 89

Met Arg Phe Ser Phe Asn Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Tyr Gly Ile Glu Asp Pro Ile

35 40

<210> 90

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 90

Met Arg Phe Ser Tyr Asn Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Tyr Gly Ile Glu Asp Gln Ile

35 40

<210> 91

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 91

Met Arg Phe Ser Tyr Ile Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Leu Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Tyr Gly Ile Gln Glu Pro Ile

35 40

<210> 92

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 92

Met Arg Phe Ser Tyr Asn Leu Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Leu Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Tyr Gly Ile Gln Glu Pro Ile

35 40

<210> 93

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 93

Met Arg Phe Cys Tyr Tyr Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Asn Cys Tyr Tyr Pro Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Tyr Gly Ile Glu Asp Pro Ile

35 40

<210> 94

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 94

Met Arg Phe Ser Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr His Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Val Leu Ser Asp Ile Gln Asp Pro Ile

35 40 45

<210> 95

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 95

Tyr Ser Arg Asn Phe Asp Lys Ile Lys Cys Asp Ser Lys Cys Asn Tyr

1 5 10 15

His Met Lys Tyr Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn Gly Tyr Pro Tyr

20 25 30

Asp Phe Ser Gly Ile Gln Asp Pro Ile

35 40

<210> 96

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 96

Met Arg Phe Asn Tyr Asn Arg Asn Asn Asp Asn Phe Lys Cys Asp Ala

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Phe Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Gly Ala Tyr Glu Ile Gln Asp Pro Val

35 40 45

<210> 97

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 97

Met Arg Phe Asn Tyr Asn Arg Asn Asn Asp Asn Phe Lys Cys Asp Thr

1 5 10 15

Lys Cys Asn Tyr Pro Met Lys Phe Lys Cys Asn Glu Phe Gly Cys Asn

20 25 30

Gly Tyr Pro Tyr Gly Ala Tyr Glu Ile Gln Asp Pro Val

35 40 45

<210> 98

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 98

Met His Phe Gly Lys Phe Lys Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Ser Pro Cys Pro Pro Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 99

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 99

Met His Phe Gly Lys Phe Lys Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Ser Pro Tyr Pro Pro Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 100

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 100

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 101

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 101

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Tyr Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 102

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 102

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Asn Pro Thr

35

<210> 103

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 103

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Ala Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 104

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 104

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 105

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 105

Met His Tyr Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 106

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 106

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Val Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 107

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 107

Met His Phe Gly Ile Ile Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 108

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 108

Met His Phe Gly Lys Phe Ile Asp Arg Val Cys Thr Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Tyr Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 109

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 109

Met His Phe Gly Lys Phe Leu Asp Arg Val Cys Asn Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 110

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 110

Met His Phe Gly Lys Phe Leu Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ile Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 111

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 111

Met His Phe Gly Lys Phe Leu Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ser Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 112

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 112

Met Asn Phe Gly Lys Phe Leu Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ser Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 113

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 113

Met Leu Phe Gly Lys Phe Leu Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ser Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 114

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 114

Met His Phe Gly Lys Phe Leu Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Thr Gly Pro Ser Pro Ser Cys Pro Asn Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 115

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 115

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 116

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 116

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Tyr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 117

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 117

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Pro Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 118

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 118

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Gln Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 119

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 119

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Gln Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 120

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 120

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Gln Val Cys Asn Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 121

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 121

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Gln Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Asn Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 122

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 122

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Gln Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 123

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 123

Leu His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Gln Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 124

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 124

Met Leu Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Gln Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Thr Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 125

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 125

Met His Phe Gly Asn Tyr Leu Lys Gln Val Ser Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Asn Gly Pro Ile Pro Ser Cys Pro Val Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 126

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 126

Met His Phe Gly Arg Phe Asn Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Pro Cys Ala Ala Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 127

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 127

Met His Phe Gly Arg Phe Lys Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Pro Cys Ala Ala Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 128

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 128

Met His Phe Gly Arg Phe Asn Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Pro Cys Ala Ala Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 129

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 129

Met His Phe Gly Lys Phe Asn Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Pro Cys Ala Ala Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Ser

35

<210> 130

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 130

Met His Phe Gly Arg Phe Asn Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gln Ser Cys Pro Ile Trp Pro Val

20 25 30

Lys Pro Thr

35

<210> 131

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 131

Met His Phe Gly Lys Phe Lys Asp Ser Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Pro Cys Ala Ala Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 132

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 132

Met His Phe Gly Arg Phe Asn Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gln Ser Cys Pro Ile Trp Pro Val

20 25 30

Lys Pro

<210> 133

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 133

Met His Phe Gly Lys Phe Lys Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Ser Pro Cys Pro Pro Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 134

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 134

Met His Phe Gly Lys Phe Lys Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Ser Pro Cys Pro Pro Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 135

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 135

Met His Phe Gly Arg Phe Asn Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Ser Pro Cys Asp Val Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 136

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 136

Met Gln Phe Gly Arg Phe Asn Glu Arg Val Cys Ser Lys Cys Thr Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Ser Pro Cys Asp Val Gln Ser Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 137

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 137

Met His Phe Gly Lys Phe Asn Asp Arg Ile Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Pro Cys Ala Pro Ser Cys Pro Val Trp Pro

20 25 30

Val Lys Pro

35

<210> 138

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 138

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Gly Gly Pro Val Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 139

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 139

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Lys Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Gly Gly Pro Val Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 140

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 140

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Gly Gly Pro Val Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Pro

35

<210> 141

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 141

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Gly Gly Pro Val Pro Gly Cys His Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 142

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 142

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Lys Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Arg Gly Gly Pro Val Pro Cys Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 143

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 143

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Lys Thr

1 5 10 15

Ile Pro Cys Cys Cys Arg Gly Gly Pro Val Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 144

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 144

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Lys Gly Gly Pro Val Pro Gly Cys His Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 145

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 145

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Lys Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Gly Ser Gly Pro Val Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 146

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 146

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Lys Thr

1 5 10 15

Ser Pro Cys Cys Cys Gly Ser Gly Pro Val Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 147

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 147

Met His Phe Gly Asn Phe Ile Asp Arg Val Cys Thr Lys Cys Lys Ile

1 5 10 15

Phe Pro Arg Cys Cys Arg Gly Gly Pro Val Pro Gly Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 148

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 148

Met His Phe Gly Lys Phe Thr Asp Arg Val Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Thr Cys Pro Ala Pro Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro

35

<210> 149

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 149

Met Asn Phe Gly Asn Phe Asn Asn Arg Ile Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Ile Pro Cys Ala Pro Ser Cys Pro Val Trp Pro

20 25 30

Val Lys Pro Gly

35

<210> 150

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 150

Met Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Asp Arg Ile Cys Ser Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Leu Ser Gly Pro Ile Leu Arg Ser Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Arg Pro Thr

35

<210> 151

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 151

Met His Phe Gly Asn Phe Leu Asp Arg Val Cys Asn Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Leu Ser Gly Pro Ile His Arg Ser Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Pro Pro Ala Lys Ala Thr Arg

35 40

<210> 152

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 152

Met Gln Phe Gly Lys Tyr Asn Asp Arg Ile Cys Arg Lys Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Cys Cys Asn Pro Ser Ala Pro Ser Cys Pro Gly Trp Pro

20 25 30

Val Lys Pro

35

<210> 153

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 153

Met Lys Phe Gln Asp Phe Asn Ile Asn Lys Ile Cys Asn Asn Cys His

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Cys Cys His Asn Gly Pro Val Gln Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 154

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 154

Met Lys Phe Gln Asp Phe Asn Ile Asn Lys Ile Cys Asn Asn Cys His

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Cys Cys His Asn Gly Pro Val His Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 155

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 155

Met Lys Phe Gln Asp Phe Asn Ile Asn Lys Ile Cys Asn Asn Cys Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Cys Cys His Asn Gly Pro Val Gln Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 156

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 156

Met Lys Phe Gln Asp Phe Asn Ile Asn Lys Ile Cys Asn Asn Cys His

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Cys Cys His Asn Gly Pro Val Leu Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 157

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 157

Met Lys Phe Leu Asp Phe Asn Ile Asn Lys Ile Cys Asn Asn Cys His

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Cys Cys His Asn Gly Pro Val His Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 158

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 158

Met Lys Phe Gln Asp Phe Asn Ile Asn Lys Ile Cys Asn Asn Cys His

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Cys Cys His Lys Gly Pro Val His Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 159

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 159

Met Lys Phe Gln Asp Phe Asn Ile Asn Lys Ile Cys Asn Ile Cys His

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Phe Cys Cys His Asn Gly Pro Val Gln Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 160

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 160

Met Lys Phe Gln Asp Phe Asn Ile Asn Met Ile Cys Asn Asn Cys His

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Cys Cys His Asn Gly Pro Val His Arg Cys Pro Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro

35

<210> 161

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 161

Met Lys Phe His Asp Phe Asn Leu Asn Asn Ile Cys Gly Lys Cys Leu

1 5 10 15

Ser His Pro Cys Cys Cys Asn Asn Gly Pro Ala Gln Arg Cys Pro Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 162

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 162

Met Lys Phe His Asp Phe Asn Leu Asn Asn Ile Cys Gly Lys Cys Leu

1 5 10 15

Ser His Pro Cys Cys Cys Asn Asn Val Pro Ala Gln Arg Cys Pro Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 163

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 163

Met Lys Phe His Asp Phe Asn Leu Asn Asn Ile Cys Gly Lys Cys Leu

1 5 10 15

Ser His Pro Cys Cys Cys Asn Asn Gly Pro Val Gln Arg Cys Pro Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 164

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 164

Met Asp Phe Ala Asn Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Lys Arg Asn Phe Pro Gln Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 165

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 165

Met Asp Phe Ala Asn Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Lys Arg Asn Ser Pro Gln Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 166

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 166

Met Asp Phe Ala Asn Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Thr

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Lys Arg Asn Phe Pro Gln Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 167

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 167

Met Asp Phe Ala Asn Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Lys Gly Asn Phe Pro Gln Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 168

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 168

Met Asp Phe Ala Tyr Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Lys Arg Asn Phe Pro Gln Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 169

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 169

Met Asp Phe Ala Asn Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Ile Arg Asn Ile Pro Gln Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 170

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 170

Met Asp Leu Ala Asn Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Lys Arg Asn Phe Pro Gln Asn Cys Pro Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 171

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 171

Met Asp Phe Ala Asn Phe Lys Asn Arg Ile Cys Ser Arg Cys Asn Ser

1 5 10 15

Phe Pro Cys Asn Cys Lys Ser Asn Tyr Pro Gln Asn Cys Ser Ile Trp

20 25 30

Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 172

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 172

Met Asn Phe Glu Asp Tyr Phe Leu Asn Asn Val Cys Ser Lys Cys Lys

1 5 10 15

Thr Phe Pro Cys Ala Cys Ile Arg Ile Pro Glu His His Cys Cys Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 173

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 173

Met Asn Phe Glu Asp Tyr Phe Leu Asn Asn Val Cys Ser Lys Cys Lys

1 5 10 15

Thr Phe Pro Cys Ala Cys Ile Arg Ile Pro Gly His His Cys Ser Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 174

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 174

Met Asn Phe Glu Asp Tyr Phe Leu Asn Asn Val His Val Leu Cys Lys

1 5 10 15

Thr Phe Pro Cys Ala Cys Ile Arg Ile Pro Glu His His Cys Cys Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 175

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 175

Met Asn Phe Glu Asp Tyr Phe Leu Asn Asn Val Cys Ser Lys Cys Arg

1 5 10 15

Thr Phe Pro Cys Gly Cys Arg Arg Ile Pro Glu His His Ser Cys Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 176

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 176

Met Asn Phe Glu Asp Tyr Phe Leu Lys Asn Val Cys Ser Lys Cys Arg

1 5 10 15

Thr Phe Pro Cys Gly Cys Thr Arg Ile Pro Glu Gln His Cys Cys Val

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 177

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 177

Met Asn Phe His Asp Phe Ile Leu Asn Asn Ile Cys Lys Arg Cys Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Cys Arg Cys Ile Asn Arg Pro Glu Gln Asn Cys Ser Ile

20 25 30

Trp Pro Val Lys Pro Thr

35

<210> 178

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 178

atggattcaa ataaaacgag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 179

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 179

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Xaa Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn His Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 180

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 180

atggactcaa ataaaacgag gtgtcctatt tgtaataatt atcaatgttc ttgtaacgct 60

aaaaaaagaa ggcctacaag atgtattaga tatttagatt atatagatca atgtgaacaa 120

tgtgaaccta tttctataat agatcattgt cataataga 159

<210> 181

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 181

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Pro Ile Cys Asn Asn Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ala Lys Lys Arg Arg Pro Thr Arg Cys Ile Arg Tyr Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Gln Cys Glu Gln Cys Glu Pro Ile Ser Ile Ile Asp

35 40 45

His Cys His Asn Arg

50

<210> 182

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 182

atggactcaa ataaaacgag gtgtcctatt tgtaataatt atcaatgttc ttgtaacgct 60

aaaaaaagaa ggcctacaag atgtattaga tatttagatt atatagatca atgtgaacaa 120

tgtgaaccta tttctataat agatcattgt cataatagag gtaaaacagg accgaccgga 180

gcaactggtg caaccggacc aactggagca actggagcaa caggaccaac aggaccaact 240

ggagcaacag gacctacagg agcaacagga ccaacaggtg caactggggc gacaggaatc 300

accgggccga ctggagcaac gggagcaaca 330

<210> 183

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 183

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Pro Ile Cys Asn Asn Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ala Lys Lys Arg Arg Pro Thr Arg Cys Ile Arg Tyr Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Gln Cys Glu Gln Cys Glu Pro Ile Ser Ile Ile Asp

35 40 45

His Cys His Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly

85 90 95

Ala Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

100 105 110

<210> 184

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 184

atggaatcaa ataaaacgag gtgtattgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 185

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 185

Met Glu Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ile Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 186

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 186

atggaatcaa ataaaacgag gtgtattgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gaccaacagg accaacggga 180

ccaaccggag tgactggagc aaccggacca acaggagaaa caggaccaac gggagcaacc 240

ggagcaactg gagcaacagg agcaacaggt ccaatgggag taactggctc gaccggagca 300

actggtgtaa cgggagcaac aggagcaaca gggtcaaccg gagcaacagg tgaaaccgga 360

gcgactggtg aaaccgga 378

<210> 187

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 187

Met Glu Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ile Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Val

50 55 60

Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Met Gly Val Thr Gly

85 90 95

Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser

100 105 110

Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

115 120 125

<210> 188

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 188

atgtattcaa ataaaaagag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 189

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 189

Met Tyr Ser Asn Lys Lys Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 190

<211> 474

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 190

atgtattcaa ataaaaagag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gaccaacagg agcaacaggt 180

catacaggaa caaccggaac aacaggagag actggaccaa caggagcaac aggagcaaca 240

ggaataacgg gagcaacggg agaaacagga gcaacaggac caacgggaac aactggtgta 300

accggagaaa ccggagcaac aggtccaact ggagaaactg gtgaaacagg accaacggga 360

gcaactggga accggagcaa caggagaaac aggaacaact ggagcaacag gaaaaacggg 420

aacaacagga gaaacaggag aaacaggagc aacaggagaa acaggaaaaa cagg 474

<210> 191

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 191

Met Tyr Ser Asn Lys Lys Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly His Thr Gly Thr

50 55 60

Thr Gly Thr Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly

85 90 95

Thr Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Glu

100 105 110

Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn Arg Ser Asn Arg

115 120 125

Arg Asn Arg Asn Asn Trp Ser Asn Arg Lys Asn Gly Asn Asn Arg Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Asn Arg Ser Asn Arg Arg Asn Arg Lys Asn Arg

145 150 155

<210> 192

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 192

atgtattcaa ataaaaagag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 193

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 193

Met Tyr Ser Asn Lys Lys Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 194

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 194

atgtattcaa ataaaaagag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gaccaacagg agcaacaggt 180

cctacaggat caacgggacc aacaggagtg actggaccaa caggagcaac aggaacaaca 240

ggatcaacag gaacaacagg agcaacagga gcaacaggag aaacaggagc aacaggacca 300

acaggaccaa caggagaaac aggaacaaca 330

<210> 195

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 195

Met Tyr Ser Asn Lys Lys Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ser

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr

65 70 75 80

Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

85 90 95

Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Thr Thr

100 105 110

<210> 196

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 196

atggattcaa ataaaaagag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaaccg 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 197

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 197

Met Asp Ser Asn Lys Lys Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 198

<211> 2484

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 198

atggattcaa ataaaaagag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaaccg 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gaccaacagg agcaacaggt 180

cctacaggat caatgggacc aaccggagtg actggatcaa caggagcaac cggaccaaca 240

gggtcaaccg gagtaactgg ggaaacagga tcaaccggga caacgggacc aagcggatca 300

actggaccaa ctggtgcaac agggtcaacc ggagaaaccg gagcaacagg gtcaaccgga 360

gcaactggag aaacaggtcc aacaggacca acgggaacaa ctggtgtaac cggagaaacc 420

ggagcaacag gtccaactgg agcaactgga gcaactggtg aaacaggttc aacaggacca 480

acgggagcaa ctggagaaac tggtgaaaca ggttcaacag gaccaacggg agcaacggga 540

tcgactggag caacgggacc aacgggagca acgggatcca ctggagcaac gggatcgact 600

ggagcaacgg gatcgactgg agcaacagga ccaacaggag caacagggtc aaccggagaa 660

acaggaccaa ctggtgaaac aggttcaacg ggagcaactg ggtcgaccgg agcaacaggt 720

gaaacaggac caacgggaac aactggagta accggagaaa ccggagcaac aggtccaaca 780

ggagcaactg gagcaactgg agaaactggt gaaacaggtt caacaggacc aacgggagca 840

actggagaaa ctggtgaaac aggttcaaca ggaccaacgg gagcaacggg atcgactgga 900

gcaacgggac caactggagc aacgggatcg actggagcaa cgggatcgac tggagcaacg 960

ggatcgactg gagcaacagg accaacagga gcaacagggt caaccggaga aacaggacca 1020

actggtgaaa caggttcaac gggagcaact gggtcgaccg gagcaacagg tgaaacagga 1080

ccaacgggag caactgggtc gaccggagca actggtgaaa caggtgcaac aggaccaaca 1140

ggaccaacgg gaacaactgg tgtaaccgga gcaacaggtc caactggagc aactggagaa 1200

acaggaccaa cgggagcgac tggagaagca ggaccaacag ggtcaaccgg agcgactgga 1260

ccaaccgggg caacgggaat cacgggagca acaggaccaa caggatcaac tggtgcaaca 1320

gggtcaaccg gagaaactgg atcaactgga gaaaccggac caacaggagc aactggtgta 1380

accggagcaa caggtccaac tggagaaaca ggttcaacag gaccaatggg agcaaccgga 1440

gaaactggtt cgaccggatc aactggtgta acgggagcaa caggagcaac gggagaaacc 1500

ggagcaacag gatcaacggg agcaactggc acgaccggag caacaggaga aacaggacca 1560

acaggaccaa ctgggtccac cggagcaaca ggagaaacag gtccaacagg accaacggga 1620

gcaactggag taaccggagc aacaggagca acgggagcaa ctggagaaac aggttcaaca 1680

ggaccaatgg gagcaaccgg agaaactggt tcgaccggat caactggtgt aacgggagca 1740

acaggagcga ctggagtaac aggagcaact ggtgaaacag gatcaacggg agcaactggg 1800

tcgaccggag caacaggtga aaccggacca acaggtccaa caggtccaac aggaccaacg 1860

ggaacaactg gtgtaaccgg agtaactgga gaaaccggac caacaggagc gactggtgaa 1920

acaggttcaa caggaccaac gggaacaact ggtgtaaccg gagaaaccgg agcaacagga 1980

ccaactggtg caacagggtc aaccggagaa accggagcaa ctggagaaac aggtcgaaca 2040

ggaccaacgg gaacaactgg tgtaaccgga gaaaccggag caactggaga aacaggacca 2100

acaggagcaa cgggatcgac tggagcaaca ggaccaacgg gagcaactgg ggcgaccgga 2160

gcaacaggtg aaacaggacc aacgggagcg actggagaaa caggagcaac gggagcaact 2220

gggtcaaccg gagcaacagg tccaacagga ccaacgggaa caactggagt aaccggagca 2280

acaggtccaa ctggagcaac tggagaaaca ggaccaacgg gagcaactgg agaagcagga 2340

ccaacagggt caaccggatc gactggacca accggggcaa cgggaatcac gggagcaaca 2400

ggaccaacag gagcaactgg tgcaacaggg tcaaccggag aaactggatc aactggagaa 2460

accggaccaa caggatcaac tggt 2484

<210> 199

<211> 828

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 199

Met Asp Ser Asn Lys Lys Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ser

50 55 60

Met Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr

65 70 75 80

Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly

85 90 95

Pro Ser Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu

100 105 110

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr

115 120 125

Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Pro

145 150 155 160

Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr

165 170 175

Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly

180 185 190

Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala

195 200 205

Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr

210 215 220

Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly

225 230 235 240

Glu Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala

245 250 255

Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Glu Thr

260 265 270

Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Glu Thr Gly

275 280 285

Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro

290 295 300

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr

305 310 315 320

Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly

325 330 335

Glu Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser

340 345 350

Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr

355 360 365

Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly

370 375 380

Thr Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu

385 390 395 400

Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Ala Gly Pro Thr Gly Ser Thr

405 410 415

Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly

420 425 430

Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ser

435 440 445

Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr

450 455 460

Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Pro Met Gly Ala Thr Gly

465 470 475 480

Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala

485 490 495

Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr

500 505 510

Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly

515 520 525

Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val

530 535 540

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr

545 550 555 560

Gly Pro Met Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly

565 570 575

Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu

580 585 590

Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr

595 600 605

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly

610 615 620

Val Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu

625 630 635 640

Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr

645 650 655

Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly

660 665 670

Ala Thr Gly Glu Thr Gly Arg Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val

675 680 685

Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr

690 695 700

Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

705 710 715 720

Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala

725 730 735

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr

740 745 750

Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly

755 760 765

Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Ala Gly Pro Thr Gly Ser

770 775 780

Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr

785 790 795 800

Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly

805 810 815

Ser Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly

820 825

<210> 200

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 200

atggattcaa ataaaacgag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa taaatcattg tcataataga 150

<210> 201

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 201

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asn His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 202

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 202

atggattcaa ataaaacgag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa taaatcattg tcataataga ggtaaaactg gaccaactgg accaaccgga 180

tcgaccggac caacaggacc aactggtgaa accggaccaa ctggagcaac aggaccaaca 240

ggagctactg gagcaactgg agcaactggt gcaactggag caacgggatc aactggagca 300

acaggatcaa ctggggcagc cggagtaact ggtgaaacag gactaacagg gtcaaccgga 360

gcgacagga 369

<210> 203

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 203

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asn His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

85 90 95

Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Ala Gly Val Thr Gly Glu

100 105 110

Thr Gly Leu Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly

115 120

<210> 204

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 204

atggattcaa ataaaacgag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaatacc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 205

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 205

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Thr Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 206

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 206

atggattcaa ataaaacgag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaatacc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gaccaacagg accaacagga 180

gcaactggac caaccggacc aactggagca acaggggcaa ccggagcaac aggtccaaca 240

ggatcaactg gcgcaacagg agcaactgga caaacgggag caactggagc aacgggacca 300

acaggagcaa caggagcaac tggagaaaca ggagcaacag gagcaacagg agcaacagga 360

gcaacaggac caacgggagc aactggagaa acaggagca 399

<210> 207

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 207

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Thr Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr

65 70 75 80

Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Ala Thr Gly

85 90 95

Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala

100 105 110

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr

115 120 125

Gly Glu Thr Gly Ala

130

<210> 208

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 208

atggattcaa ataaaacgag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 209

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 209

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 210

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 210

atggattcaa ataaaacgag gtgtgctgtt tgtaataaat atcaatgttc ttgtaactcc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaacct 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gaccaacagg agcaacaggt 180

ccaacgggac caaccggagc aacgggatca actggtccaa caggatcaac tggagcaact 240

ggagcaacag ggtcaaccgg agcgactgga gaaacaggac caactggggt aacgggaatc 300

acgggaccga ctggtgtaac tggagcaaca gggttcacag gactgactgg agcaactgga 360

gcgacaggaa atacaggtcc aacaggacca accggagca 399

<210> 211

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 211

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Ala Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Ser Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly

85 90 95

Val Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Phe

100 105 110

Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr

115 120 125

Gly Pro Thr Gly Ala

130

<210> 212

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 212

atggattcaa ataaaacgag gtgtactgtt tgtaataaat atcaatgttc atgtaaccac 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaaccg 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 213

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 213

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Thr Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn His Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 214

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 214

atggattcaa ataaaacgag gtgtactgtt tgtaataaat atcaatgttc atgtaaccac 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atatagatcc atgtgaaccg 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gtccaacggg gccaaccgga 180

gcaactggag caacaggtgc aacgggatca actgggccga caggagtaac tggtgcaaac 240

tcatatacaa aacaaacact gccaacgacg tcaacagaga agaaa 285

<210> 215

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 215

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Thr Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn His Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asp Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala

50 55 60

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ser Tyr Thr Lys Gln Thr Leu Pro Thr Thr Ser Thr Glu Lys Lys

85 90 95

<210> 216

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 216

atggattcaa ataaaacgag gtgtactgtt tgtaataaat atcaatgttc atgtaacccc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atataaatcc atgtgaaccg 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga 150

<210> 217

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 217

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Thr Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Pro Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asn Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg

50

<210> 218

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 218

atggattcaa ataaaacgag gtgtactgtt tgtaataaat atcaatgttc atgtaacccc 60

aaaaaaagaa gtcctaaaac agttattaga gatttagatt atataaatcc atgtgaaccg 120

ctttatataa tagatcattg tcataataga ggtaaaacag gtccaacggg gccaaccgga 180

gcaaccggag caacggggcc aaccggacca actggagcaa cagggccaac cggagcgact 240

ggagcaaccg gaccaacggg atcaacaggt cctacaggat caaccggagc aacaggaccg 300

actggggcta caggagtaac tggagcaacg ggagcaactg gagcaacggg agtaactggg 360

gcaacaggac caacgggacc aacagggtta accggagcga ctggagcaac aggaacgact 420

ggggctacag gagcaactgg ggcaacggga gtaactggag caacaggacc gactggggca 480

acgggagtaa ctggagcaac gggagtaact ggggcaacag gaccaactgg agcaacagga 540

tcgactggag aaactggaac aacaggagta actggagcaa cgggagtaac tggagcaaca 600

ggtccaaccg ggtcaatcgg atcaacggga gcaactgggg caaccggacc aactggagca 660

accggggcaa caggagcaac cggaccaacg ggagaaaccg gaccaaccgg accaacaggc 720

ccaacgggaa tcaccgggcc aaccggagca actggttcag gaggcgtaat cccatttgca 780

tcaggaggca cagtaacaat aaattcacta ttaactgggg tacctaatac cggaggtatt 840

attgcatttg gcaatagtac tactagtgta gggattggta atgctacagt aaatcttcaa 900

aatattaata atgaagcgtt tgtcgttcca catgctggag caattacaaa tgttgctgca 960

ttctttaata ttacagttgc tcttaatata gctgttttag gtacagctac tattacggca 1020

caagtatgga aatcacaaaa tgcatcatct aacgtatttg cacctttagc atcgactctt 1080

ataagcttta caccattagc tggtgccata gctgcattta ctacattaaa tggtgctctt 1140

gcaaatttaa atgaaccagt aaatgttgga gatcgtttaa ttatggtatt ctctgtggct 1200

actacagggt taagtgtaat aactgctatt acaggtacag caagtgcggg tattacaatt 1260

agttga 1266

<210> 219

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 219

Met Asp Ser Asn Lys Thr Arg Cys Thr Val Cys Asn Lys Tyr Gln Cys

1 5 10 15

Ser Cys Asn Pro Lys Lys Arg Ser Pro Lys Thr Val Ile Arg Asp Leu

20 25 30

Asp Tyr Ile Asn Pro Cys Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Asp His Cys His

35 40 45

Asn Arg Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly

85 90 95

Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala

100 105 110

Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr

115 120 125

Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala

145 150 155 160

Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr

165 170 175

Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly

180 185 190

Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ser Ile Gly Ser

195 200 205

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

210 215 220

Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly

225 230 235 240

Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gly Gly Val

245 250 255

Ile Pro Phe Ala Ser Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Ser Leu Leu Thr

260 265 270

Gly Val Pro Asn Thr Gly Gly Ile Ile Ala Phe Gly Asn Ser Thr Thr

275 280 285

Ser Val Gly Ile Gly Asn Ala Thr Val Asn Leu Gln Asn Ile Asn Asn

290 295 300

Glu Ala Phe Val Val Pro His Ala Gly Ala Ile Thr Asn Val Ala Ala

305 310 315 320

Phe Phe Asn Ile Thr Val Ala Leu Asn Ile Ala Val Leu Gly Thr Ala

325 330 335

Thr Ile Thr Ala Gln Val Trp Lys Ser Gln Asn Ala Ser Ser Asn Val

340 345 350

Phe Ala Pro Leu Ala Ser Thr Leu Ile Ser Phe Thr Pro Leu Ala Gly

355 360 365

Ala Ile Ala Ala Phe Thr Thr Leu Asn Gly Ala Leu Ala Asn Leu Asn

370 375 380

Glu Pro Val Asn Val Gly Asp Arg Leu Ile Met Val Phe Ser Val Ala

385 390 395 400

Thr Thr Gly Leu Ser Val Ile Thr Ala Ile Thr Gly Thr Ala Ser Ala

405 410 415

Gly Ile Thr Ile Ser

420

<210> 220

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 220

Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu

35 40 45

Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr

50 55 60

Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly

65 70 75 80

Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val

85 90 95

Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala

100 105 110

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly

115 120 125

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala

130 135 140

Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr

145 150 155 160

Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly

165 170 175

Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Lys Ala Gly Ala Thr Gly Ala

180 185 190

Thr Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

195 200 205

Gly Gln Thr Gly Glu Thr Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly

210 215 220

Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln

225 230 235 240

Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr

245 250 255

Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

260 265 270

Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln

275 280 285

Thr Gly Glu Thr Gly Val Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr

290 295 300

Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

305 310 315 320

Gln Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln

325 330 335

Thr Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr

340 345 350

Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly

355 360 365

Glu Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Thr Gly Glu

370 375 380

Ala Gly Val Ala Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly

385 390 395

<210> 221

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 221

tgaaaagatg gggaattctc catctttttt cttttgtctg gagtggtgag atatacgaca 60

tacaacgaat gagcataaca tgaatagttt ataaaatcgc aaaaaatttt tcggaaggag 120

agagcgaaaa ttaacaataa gcgggctaac gcattcaata agaag 165

<210> 222

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 222

Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Val Ala Gly Ala Met Gly Pro

20 25 30

Arg Gly Glu Ile Gly Pro Gln Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr

35 40 45

Gly Pro Gln Gly Glu Met Gly Leu Gln Gly Val Ala Gly Val Thr Gly

50 55 60

Ala Ser Gly Pro Gln Gly Glu Ile Gly Pro Gln Gly Val Ala Gly Val

65 70 75 80

Thr Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Glu Ile Gly Pro Gln Gly Val Ala

85 90 95

Gly Ala Thr Gly Val Pro Gly Pro Gln Gly Glu Ile Gly Pro Gln Gly

100 105 110

Val Ala Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Glu Met Gly Leu

115 120 125

Gln Gly Val Ala Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Glu Met

130 135 140

Gly Pro Gln Gly Val Ala Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly

145 150 155 160

Glu Ile Gly Pro Gln Gly Val Ala Gly Val Thr Gly Ala Pro Gly Pro

165 170 175

Gln Gly Glu Ile Gly Pro Gln Gly Val Ala Gly Val Thr Gly Ala Pro

180 185 190

Gly Pro Gln Gly Glu Met Gly Leu Gln Gly Val Ala Gly Val Thr Gly

195 200 205

Ala Thr Gly Pro Gln Gly Ile Ile Gly Ala Thr Gly Leu Arg Gly Leu

210 215 220

Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly Ile Thr

225 230 235 240

Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Val Ala Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly

245 250 255

Ser Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Val Thr Gly Ser

260 265 270

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln

275 280 285

Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Ile Thr Gly

290 295 300

Ala Thr Gly Val Gln Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser

305 310 315 320

Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Val Ala Gly Ser Thr

325 330 335

Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly

340 345 350

Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Thr Thr Gly Val

355 360 365

Thr Gly Thr Thr Gly Pro Ser Gly Ser Gly Leu Met Glu Val Phe Leu

370 375 380

Ser Thr Asp Gln Ser Val Gly Asn Asn Asp Phe Leu Gly Thr Gly Asn

385 390 395 400

Ser Ser Ala Ser Phe Val Arg Ser Ser Ile Val Ile Pro Glu Asn Ala

405 410 415

Thr Ile Arg Ser Leu Thr Leu Asn Ile Arg Asp His Ala Leu Ser Ala

420 425 430

Gly Gln Thr Ala Ser Ala Gln Ile Phe Val Ser Thr Asn Cys Gly Phe

435 440 445

Thr Ser Val Ala Thr Gly Ile Ile Ala Thr Val Thr Gly Pro Asn Ser

450 455 460

Ser Thr Thr Pro Asn Cys Cys Ala Lys Val Ile Ala Asn Tyr Pro Val

465 470 475 480

Ser Ser Cys Thr Leu Leu Ser Val Gln Val Ser Thr Thr Gly Gly Ala

485 490 495

Phe Ser Asn Gly Val Ser Ala Thr Val Leu Phe Asn Thr Val

500 505 510

<210> 223

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 223

tgttgaaaca tattattgag cattgggttt tatatgacct aatgttcttt ttattttaag 60

atacatattt aaatcattct aatattctag gtgcattaat tatctcaata agtagacttt 120

tgaatatgat aaaaagggac aggaggtgaa gtcgca 156

<210> 224

<211> 778

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端信号序列

<400> 224

Gly Lys Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ser Met Gly

1 5 10 15

Pro Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ser

20 25 30

Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Pro Ser

35 40 45

Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly

50 55 60

Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Pro

65 70 75 80

Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr

85 90 95

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly

100 105 110

Ala Thr Gly Glu Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ala

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr

130 135 140

Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly

145 150 155 160

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Glu

165 170 175

Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr

180 185 190

Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly

195 200 205

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Glu Thr Gly Ser

210 215 220

Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr

225 230 235 240

Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly

245 250 255

Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser

260 265 270

Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr

275 280 285

Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly

290 295 300

Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala

305 310 315 320

Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr

325 330 335

Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

340 345 350

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Ala Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala

355 360 365

Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr

370 375 380

Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly

385 390 395 400

Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro

405 410 415

Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Pro Met Gly Ala Thr Gly Glu Thr

420 425 430

Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

435 440 445

Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala

450 455 460

Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr

465 470 475 480

Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly

485 490 495

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Pro

500 505 510

Met Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr

515 520 525

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

530 535 540

Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro

545 550 555 560

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr

565 570 575

Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

580 585 590

Ser Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala

595 600 605

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610 615 620

Gly Glu Thr Gly Arg Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly

625 630 635 640

Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ser

645 650 655

Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

660 665 670

Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly

675 680 685

Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Thr

690 695 700

Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr

705 710 715 720

Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Ala Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly

725 730 735

Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Pro

740 745 750

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr

755 760 765

Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly

770 775

<210> 225

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 225

atattttaga aagtgaaaaa tacagataaa agcctttgct gattcatttt tctggattta 60

tttaaaagaa cgattggaga gtattcttca gccgtatctt ttttttgttg ctaaaaatat 120

taataatttt acttgaggat tttaatagat taagaaattt ttaattctga tacctatatt 180

gtattacagg aatattttag aaataagcat atcccatttt cattttacag tttaatagca 240

tgctagagaa atacataatt atcagactac catgaatgag atgattatcc gatttttttc 300

tgtcacatta caattgtcca atatcaatct atttcacgag aatagtatgt atatgatggg 360

aggtgataat a 371

PCT/RO/134表

Claims (108)

1.一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含：

(i)与编码由SEQ ID NO:1-38中任一个所表示的氨基酸序列，或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的多肽核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列；或

(ii)包含编码表1和图1-3中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少15、30、45、60、75、90、105、120或150、210、270、330、390或450个连续核苷酸的片段的多核苷酸序列；且

其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属(Brevibacillus)内生孢子的孢子外壁。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述片段包含：

(a)编码表1或图1-3中所示出的任何氨基酸序列的多核苷酸序列的第一个核苷酸；或

(b)编码表1或图1-3中所示出的任何氨基酸序列的多核苷酸序列的最后一个核苷酸。

3.权利要求1或2的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含与编码表1或图1-3中所示出的任何氨基酸序列的多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列。

4.权利要求1-3中任一项的核酸分子，其中所述片段编码表1或图1-3中所示出的任一氨基酸序列的氨基酸1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40或1-45、1-50、1-75、1-100、1-125或1-150。

5.权利要求1-4中任一项的核酸分子，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括：

(a)植物生长刺激蛋白；

(b)酶；

(c)蛋白；

(d)与短芽孢杆菌属异源的多肽；

(e)治疗性蛋白；或

(f)植物免疫刺激蛋白。

6.权利要求1-5中任一项的核酸分子，进一步包含第三多核苷酸序列，其编码：

(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其中所述多肽位于所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽之间；

(b)包含选择性标记物的多肽；

(c)包含可视化标记物的多肽；

(d)包含蛋白识别/纯化结构域的多肽；或

(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽。

7.权利要求1-6中任一项的核酸分子，所述短芽孢杆菌属内生孢子是由短芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述短芽孢杆菌属种包括：土壤短芽孢杆菌(B.agri)、艾登短芽孢杆菌(B.aydinogluensis)、波茨坦短芽孢杆菌(B.borstelensis)、简短短芽孢杆菌(B.brevis)、中孢短芽孢杆菌(B.centrosporus)、桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)、溪河短芽孢杆菌(B.fluminis)、美丽短芽孢杆菌(B.formosus)、黄褐色短芽孢杆菌(B.fulvus)、人参短芽孢杆菌(B.ginsengisoli)、污染短芽孢杆菌(B.invocatus)、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、利氏短芽胞杆菌(B.levickii)、喜湖短芽孢杆菌(B.limnophilus)、马赛短芽孢杆菌(B.massiliensis)、硝化短芽孢杆菌(B.nitrificans)、人参土壤短芽胞杆菌(B.panacihumi)、副短短芽孢杆菌(B.parabrevis)、罗伊兹短芽抱杆菌(B.reuszeri)或热红短芽抱杆菌(B.thermoruber)；或由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16SrRNA基因与短芽孢杆菌属种的16S rRNA基因共享至少97％、98％或99％同一性。

8.权利要求1-7中任一项的核酸分子，其可操作地连接至与所述第二多核苷酸序列和短芽孢杆菌属中的至少一个异源的启动子元件。

9.权利要求1-8中任一项的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含：

与编码表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的密码子优化的多核苷酸序列，在相同条件下，与编码表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列相比，所述密码子优化的多核苷酸序列在短芽孢杆菌属内生孢子中以更高的速率或水平表达。

10.一种包含N端信号肽的融合蛋白，所述N端信号肽可操作地连接至与N端信号肽异源的多肽，其中所述N端信号肽包含：

(a)包含与SEQ ID NO:1-6中的任一项或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或

(b)包含来自SEQ ID NO:1-38中任一个的氨基酸序列或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125或150个连续氨基酸的片段的多肽；

其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至短芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁。

11.权利要求10的融合蛋白，其中所述片段包含：

(a)SEQ ID NO:1-38中任一个的或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的第一个氨基酸；或

(b)SEQ ID NO:1-38中任一个的或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的最后一个氨基酸。

12.权利要求10或11的融合蛋白，其中所述多肽序列包含与SEQ ID NO:1-38中任一个的氨基酸序列或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列具有60％、70％、80％或90％的序列同一性的序列。

13.权利要求10至12中任一项的融合蛋白，其中所述片段包含SEQ ID NO:1-38中任一个的或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的氨基酸1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-75、1-100、1-125或1-150。

14.权利要求10至13中任一项的融合蛋白，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包含：

(a)植物生长刺激蛋白；

(b)酶；

(c)蛋白；

(d)与短芽孢杆菌属异源的多肽；

(e)治疗性蛋白；或

(f)植物免疫刺激蛋白。

15.权利要求10至14中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含：

(a)含有一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，该多肽位于N端信号肽和与N端信号肽异源的多肽之间；

(b)包含选择性标记物的多肽；

(c)包含可视化标记物的多肽；

(d)包含至少一种蛋白识别/纯化结构域的多肽；或

(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接信号肽和与N端信号肽异源的多肽。

16.权利要求10至15中任一项的融合蛋白，其中所述短芽孢杆菌属内生孢子是由短芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述短芽孢杆菌属种包括：土壤短芽孢杆菌、艾登短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、简短短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、桥石短芽孢杆菌、溪河短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、黄褐色短芽孢杆菌、人参短芽孢杆菌、污染短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、利氏短芽胞杆菌、喜湖短芽孢杆菌、马赛短芽孢杆菌、硝化短芽孢杆菌、人参土壤短芽胞杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊兹短芽抱杆菌或热红短芽抱杆菌；或由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16S rRNA基因与短芽孢杆菌属种的16S rRNA基因共享至少97％、98％或99％同一性。

17.一种包含细菌染色体的重组短芽孢杆菌属细胞，所述细菌染色体包含权利要求1-9中任一项的核酸分子。

18.一种包含权利要求1-9中任一项的核酸分子的载体，其中所述载体包含质粒、人工染色体或病毒载体。

19.权利要求18的载体，进一步包含以下中的至少一种：

(a)在短芽孢杆菌属细胞中提供稳定维持的复制起点；

(b)在短芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的复制起点；

(c)在短芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的对温度敏感的复制起点；

(d)编码选择性标记物的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列；或

(e)编码植物生长刺激蛋白的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列。

20.一种用载体转化的重组短芽孢杆菌属细胞，所述载体包含权利要求1-9中任一项的核酸分子。

21.权利要求20的重组短芽孢杆菌属细胞，其中所述短芽孢杆菌属细胞为短芽孢杆菌属种，其包括：土壤短芽孢杆菌、艾登短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、简短短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、桥石短芽孢杆菌、溪河短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、黄褐色短芽孢杆菌、人参短芽孢杆菌、污染短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、利氏短芽胞杆菌、喜湖短芽孢杆菌、马赛短芽孢杆菌、硝化短芽孢杆菌、人参土壤短芽胞杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊兹短芽抱杆菌或热红短芽抱杆菌；或具有16S rRNA基因的细菌，所述16S rRNA基因与短芽孢杆菌属种的16S rRNA基因共享至少97％、98％或99％同一性。

22.一种在短芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁上展示异源融合蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用重组载体转化能够形成孢子的短芽孢杆菌属细胞，所述重组载体包含权利要求1-9中任一项的核酸分子；以及

(b)在孢子形成条件下表达由权利要求1-9中任一项的核酸分子编码的融合蛋白，使得所述融合蛋白被靶向至由孢子形成产生的短芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁，

其中所述N端信号肽包含：(i)包含与SEQ ID NO:1-38中任一个的氨基酸序列或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列具有至少60％、70％或80％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(ii)SEQ ID NO:1-38中任一个的氨基酸序列或者表1或图1-3中所示出的氨基酸序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125或150个连续氨基酸的片段。

23.一种组合物，其包含：

(a)一种或多种表达权利要求10-16中任一项的融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属细胞，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及

(b)至少一种生物防治剂；任选地，

以协同有效量。

24.用权利要求1-9中任一项的核酸、权利要求10-16中任一项的融合蛋白、权利要求20或21的重组细菌细胞或权利要求23的组合物处理的种子。

25.一种处理植物、种子、植物部分或植物周围土壤以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：

同时或依次施用：

(a)表达权利要求10-16中任一项的融合蛋白的重组产孢子外壁的短芽孢杆菌属内生孢子，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及

(b)至少一种生物防治剂；任选地，

以协同有效量。

26.一种筛选用重组短芽孢杆菌属内生孢子处理的宿主植物的方法，其包括以下步骤：

(a)将包含经修饰以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白的短芽孢杆菌属内生孢子的组合物施用至能够被短芽孢杆菌属永久或暂时定殖的种子、幼苗或营养繁殖苗，以产生经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗；以及

(b)通过检测和任选地测量所述经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性来筛选经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗。

27.权利要求26的方法，其中所述筛选步骤包括以下一个或多个：

(a)至少一种体外测定，包括检测并任选地定量提取物中包含的一种或多种化合物的存在、水平、水平变化、活性或定位，所述提取物是由从经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗获得的细胞或组织样品制备的；和/或

(b)至少一种体内测定，包括检测和任选地定量所述经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性。

28.一种筛选在短芽孢杆菌属细胞中表达的异源蛋白或肽的农业上重要特性的方法，其包括：

(a)修饰短芽孢杆菌属细胞以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白以产生重组短芽孢杆菌属细胞；以及

(b)通过检测和任选地定量由重组短芽孢杆菌属细胞产生的化合物的水平或活性来筛选短芽孢杆菌属细胞。

29.一种处理植物、种子、人或动物的方法，其包括：

给予所述植物、种子、人或动物一种包含从由重组短芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子中分离的孢子外壁的组合物；

其中所述重组短芽孢杆菌属细胞表达权利要求10-16中任一项的融合蛋白。

30.权利要求29的方法，其中所述组合物已经被热灭活或灭菌，使得保留无活力的短芽孢杆菌属细胞。

31.一种组合物，其包含根据权利要求10-16中任一项的分离的和/或纯化的融合蛋白。

32.一种组合物，其包含分离的和/或纯化的由重组短芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁，其已被修饰以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白。

33.一种组合物，其包含由重组短芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁，其已被修饰以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白。

34.权利要求33的组合物，其中所述由重组短芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁包含：

(a)孢子外壁的基底层；

(b)孢子外壁的毛状层；

(c)a)和b)的混合物

(d)从短芽孢杆菌属内生孢子获得的粗制孢子外壁的级分和提取物；和/或

(e)从短芽孢杆菌属内生孢子获得的粗制孢子外壁的级分和提取物，与相同量的粗制孢子外壁相比，其富含一定量或浓度的所述融合蛋白。

35.一种将目的蛋白递送至植物、种子或田地的方法，其包括：

将包含从重组短芽孢杆菌属内生孢子获得的孢子外壁的组合物施用于植物、种子或田地；

其中所述重组短芽孢杆菌属内生孢子已被修饰以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白。

36.权利要求35的方法，其中所述组合物被施用于田地：

(a)在种植前或种植后；

(b)在出苗前或出苗后；

(c)作为粉末、悬液或溶液形式；和/或

(d)其中所述组合物进一步包含一种或多种刺激植物生长或保护植物免受害虫侵害的额外化合物。

37.一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含：

(i)与SEQ ID NO:39或40中任一个，或与编码SEQ ID NO:41-177中任一个所表示的氨基酸序列或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列；或

(ii)包含来自SEQ ID NO:39或40，或来自编码SEQ ID NO:41-177中任一个所表示的氨基酸序列或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少15、30、45、60、75、90、105、120或135个连续核苷酸的片段；且

其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)内生孢子的孢子外壁。

38.权利要求37的核酸分子，其中所述片段包含：

(a)编码表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列的第一个核苷酸；或

(b)编码表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列的最后一个核苷酸。

39.权利要求37或38的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:39或40，或者编码表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列。

40.权利要求37-39中任一项的核酸分子，其中所述片段编码SEQ ID NO:7或8，或者表2或图4-5中所示出的任一氨基酸序列的氨基酸1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40或1-45。

41.权利要求37-40中任一项的核酸分子，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括：

(a)植物生长刺激蛋白；

(b)酶；

(c)蛋白；

(d)与赖氨酸芽孢杆菌属异源的多肽；

(e)治疗性蛋白；或

(f)植物免疫刺激蛋白。

42.权利要求37-41中任一项的核酸分子，进一步包含第三多核苷酸序列，其编码：

(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其中所述多肽位于所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽之间；

(b)包含选择性标记物的多肽；

(c)包含可视化标记物的多肽；

(d)包含蛋白识别/纯化结构域的多肽；或

(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽。

43.权利要求37-42中任一项的核酸分子，所述赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子是由赖氨酸芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述赖氨酸芽孢杆菌属种包括：球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus acetophenoni)、嗜碱赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusalkaliphilus)、清国酱赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus chungkukjangi)、堆肥赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus composti)、污染赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacilluscontaminans)、Lysinibacillus cresolivorans、长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)、锰矿土赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus manganicus)、芒果赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus mangiferihumi)、马赛赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmassiliensis)、迈氏赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus meyeri)、奥德赛赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus odysseyi)、巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacilluspakistanensis)、低硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus parviboronicapiens)、新斗里赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus sinduriensis)、烟草赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillustabacifolii)、变形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus varians)、解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)或耐盐赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillushalotolerans)；或

由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16S rRNA基因与赖氨酸芽孢杆菌属种的16S rRNA基因共享至少97％、98％或99％同一性。

44.权利要求37-43中任一项的核酸分子，其可操作地连接至与所述第二多核苷酸序列和赖氨酸芽孢杆菌属中的至少一个异源的启动子元件。

45.权利要求37-44中任一项的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含：

与编码表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的密码子优化的多核苷酸序列，在相同条件下，与编码表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的多核苷酸序列相比，所述密码子优化的多核苷酸序列在赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子中以更高的速率或水平表达。

46.一种包含N端信号肽的融合蛋白，所述N端信号肽可操作地连接至与N端信号肽异源的多肽，其中所述N端信号肽包含：

(a)包含与SEQ ID NO:41-177中任一个的氨基酸序列或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或

(b)包含SEQ ID NO:41-177中任一个的或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、或45个连续氨基酸的片段的多肽；

其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁。

47.权利要求46的融合蛋白，其中所述片段包含：

(a)SEQ ID NO:41-177中任一个的或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的第一个氨基酸；或

(b)SEQ ID NO:41-177中任一个的或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的最后一个氨基酸。

48.权利要求46或47的融合蛋白，其中所述多肽序列包含与SEQ ID NO:41-177中的任一项或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列具有60％、70％、80％或90％的序列同一性的氨基酸序列。

49.权利要求46至48中任一项的融合蛋白，其中所述片段包含SEQ ID NO:1-38中任一个或表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的氨基酸1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40或1-45。

50.权利要求46至49中任一项的融合蛋白，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包含：

(a)植物生长刺激蛋白；

(b)酶；

(c)蛋白；

(d)与赖氨酸芽孢杆菌属异源的多肽；

(e)治疗性蛋白；或

(f)植物免疫刺激蛋白。

51.权利要求46至50中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含：

(a)含有一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，该多肽位于所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽之间；

(b)包含选择性标记物的多肽；

(c)包含可视化标记物的多肽；

(d)包含至少一种蛋白识别/纯化结构域的多肽；或

(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接所述信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽。

52.权利要求46至51中任一项的融合蛋白，其中所述赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子是由赖氨酸芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述赖氨酸芽孢杆菌属种包括：球形赖氨酸芽孢杆菌、耐硼赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌、嗜碱赖氨酸芽孢杆菌、清国酱赖氨酸芽孢杆菌、堆肥赖氨酸芽孢杆菌、污染赖氨酸芽孢杆菌、Lysinibacillus cresolivorans、长赖氨酸芽孢杆菌、锰矿土赖氨酸芽孢杆菌、芒果赖氨酸芽孢杆菌、马赛赖氨酸芽孢杆菌、迈氏赖氨酸芽孢杆菌、奥德赛赖氨酸芽孢杆菌、巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌、低硼赖氨酸芽孢杆菌、新斗里赖氨酸芽胞杆菌、烟草赖氨酸芽胞杆菌、变形赖氨酸芽胞杆菌、解木糖赖氨酸芽孢杆菌或耐盐赖氨酸芽孢杆菌；或

由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16S rRNA基因与赖氨酸芽孢杆菌属种的16S rRNA基因共享至少97％、98％或99％同一性。

53.一种包含细菌染色体的重组赖氨酸芽孢杆菌属细胞，所述细菌染色体包含权利要求37-45中任一项的核酸分子。

54.一种包含权利要求37-45中任一项的核酸分子的载体，其中所述载体包含质粒、人工染色体或病毒载体。

55.权利要求54的载体，进一步包含以下中的至少一种：

(a)在赖氨酸芽孢杆菌属细胞中提供稳定维持的复制起点；

(b)在赖氨酸芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的复制起点；

(c)在赖氨酸芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的对温度敏感的复制起点；

(d)编码选择性标记物的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列；或

(e)编码植物生长刺激蛋白的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列。

56.一种用载体转化的重组赖氨酸芽孢杆菌属细胞，所述载体包含权利要求37-45中任一项的核酸分子。

57.权利要求56的重组赖氨酸芽孢杆菌属细胞，其中所述赖氨酸芽孢杆菌属细胞为赖氨酸芽孢杆菌属种，其包括：球形赖氨酸芽孢杆菌、耐硼赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌、嗜碱赖氨酸芽孢杆菌、清国酱赖氨酸芽孢杆菌、堆肥赖氨酸芽孢杆菌、污染赖氨酸芽孢杆菌、Lysinibacillus cresolivorans、长赖氨酸芽孢杆菌、锰矿土赖氨酸芽孢杆菌、芒果赖氨酸芽孢杆菌、马赛赖氨酸芽孢杆菌、迈氏赖氨酸芽孢杆菌、奥德赛赖氨酸芽孢杆菌、巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌、低硼赖氨酸芽孢杆菌、新斗里赖氨酸芽胞杆菌、烟草赖氨酸芽胞杆菌、变形赖氨酸芽胞杆菌、解木糖赖氨酸芽孢杆菌或耐盐赖氨酸芽孢杆菌；或具有16S rRNA基因的细菌，所述16S rRNA基因与赖氨酸芽孢杆菌属种的16S rRNA基因共享至少97％、98％或99％同一性。

58.一种在赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁上展示异源融合蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用重组载体转化能够形成孢子的赖氨酸芽孢杆菌属细胞，所述重组载体包含权利要求37-45中任一项的核酸分子；以及

(b)在孢子形成条件下表达由权利要求37-45中任一项的核酸分子编码的融合蛋白，使得所述融合蛋白被靶向至由孢子形成产生的赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁，

其中所述N端信号肽包含：(i)包含与SEQ ID NO:41-177中任一个的氨基酸序列或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列具有至少60％、70％或80％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(ii)SEQ ID NO:41-177中任一个的或者表2或图4-5中所示出的氨基酸序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40或45个连续氨基酸的片段。

59.一种组合物，其包含：

(a)一种或多种表达权利要求46-52中任一项的融合蛋白的重组产孢子外壁的赖氨酸芽孢杆菌属细胞，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及

(b)至少一种生物防治剂；任选地，

以协同有效量。

60.用权利要求37-45中任一项的核酸、权利要求46-52中任一项的融合蛋白、权利要求56或57的重组细菌细胞或权利要求59的组合物处理的种子。

61.一种处理植物、种子、植物部分或植物周围土壤以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：

同时或依次施用：

(a)表达权利要求46-52中任一项的融合蛋白的重组产孢子外壁的赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及

(b)至少一种生物防治剂；任选地，

以协同有效量。

62.一种筛选用重组赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子处理的宿主植物的方法，其包括以下步骤：

(a)将包含经修饰以表达根据权利要求46-52中任一项的融合蛋白的赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子的组合物施用至能够被赖氨酸芽孢杆菌属永久或暂时定殖的种子、幼苗或营养繁殖苗，以产生经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗；以及

(b)通过检测和任选地测量经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性来筛选经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗。

63.权利要求62的方法，其中所述筛选步骤包括以下一个或多个：

(a)至少一种体外测定，包括检测并任选地定量提取物中包含的一种或多种化合物的存在、水平、水平变化、活性或定位，所述提取物是由从经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗获得的细胞或组织样品制备的；和/或

(b)至少一种体内测定，包括检测和任选地定量经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性。

64.一种筛选在赖氨酸芽孢杆菌属细胞中表达的异源蛋白或肽的农业上重要特性的方法，其包括：

(a)修饰赖氨酸芽孢杆菌属细胞以表达根据权利要求46-52中任一项的融合蛋白以产生重组赖氨酸芽孢杆菌属细胞；以及

(b)通过检测和任选地定量由重组赖氨酸芽孢杆菌属细胞产生的化合物的水平或活性来筛选赖氨酸芽孢杆菌属细胞。

65.一种处理植物、种子、人或动物的方法，其包括：

给予所述植物、种子、人或动物一种包含从由重组赖氨酸芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子中分离的孢子外壁的组合物；

其中所述重组赖氨酸芽孢杆菌属细胞表达权利要求46-52中任一项的融合蛋白。

66.权利要求65的方法，其中所述组合物已经被热灭活或灭菌，使得保留无活力的赖氨酸芽孢杆菌属细胞。

67.一种组合物，其包含根据权利要求46-52中任一项的分离的和/或纯化的融合蛋白。

68.一种组合物，其包含分离的和/或纯化的由重组赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁，其已被修饰以表达根据权利要求46-52中任一项的融合蛋白。

69.一种组合物，其包含由重组赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁，其已被修饰以表达根据权利要求46-52中任一项的融合蛋白。

70.权利要求69的组合物，其中所述由重组赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子产生的所述孢子外壁包含：

(a)孢子外壁的基底层；

(b)孢子外壁的毛状层；

(c)a)和b)的混合物

(d)从赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子获得的粗制孢子外壁的级分和提取物；和/或

(e)从赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子获得的粗制孢子外壁的级分和提取物，与相同量的粗制孢子外壁相比，其富含一定量或浓度的所述融合蛋白。

71.一种将目的蛋白递送至植物、种子或田地的方法，其包括：

将包含从重组赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子获得的孢子外壁的组合物施用于植物、种子或田地；

其中所述重组赖氨酸芽孢杆菌属内生孢子已被修饰以表达根据权利要求46-52中任一项的融合蛋白。

72.权利要求71的方法，其中所述组合物被施用于田地：

(a)在种植前或种植后；

(b)在出苗前或出苗后；

(c)作为粉末、悬液或溶液形式；和/或

(d)其中所述组合物进一步包含一种或多种刺激植物生长或保护植物免受害虫侵害的额外化合物。

73.一种编码融合蛋白的核酸分子，其包含：(a)编码N端信号肽的第一多核苷酸序列，其可操作地连接至(b)编码与所述N端信号肽异源的多肽的第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列包含：

(i)与表3或图6中所示出的任一多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列；或

(ii)包含表3或图6中所示出的任一多核苷酸序列的至少30、60、90、120或150个连续核苷酸的片段的多核苷酸序列；且

其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至绿芽孢杆菌属(Viridibacillus)内生孢子的孢子外壁。

74.权利要求73的核酸分子，其中所述片段包含：

(a)表3或图6中所示出的任一多核苷酸序列的第一个核苷酸；或

(b)表3或图6中所示出的任一多核苷酸序列的最后一个核苷酸。

75.权利要求73或74的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216或218中任一个具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的多核苷酸序列。

76.权利要求73-75中任一项的核酸分子，其中所述片段编码SEQ ID NO:179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217或219中任一个的氨基酸1-10、1-20、1-30、1-40或1-50。

77.权利要求73-76中任一项的核酸分子，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括：

(a)植物生长刺激蛋白；

(b)酶；

(c)蛋白；

(d)与绿芽孢杆菌属异源的多肽；

(e)治疗性蛋白；或

(f)植物免疫刺激蛋白。

78.权利要求73-77中任一项的核酸分子，进一步包含第三多核苷酸序列，其编码：

(a)包含一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，其中所述多肽位于所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽之间；

(b)包含选择性标记物的多肽；

(c)包含可视化标记物的多肽；

(d)包含蛋白识别/纯化结构域的多肽；或

(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽。

79.权利要求73-78中任一项的核酸分子，其中所述绿芽孢杆菌属内生孢子是由绿芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述绿芽孢杆菌属种包括：田地绿芽孢杆菌(Viridibacillusarvi)、沙地绿芽孢杆菌(Viridibacillus arenosi)或雷氏绿芽孢杆菌(Viridibacillusneidei)；或

由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16S rRNA基因与绿芽孢杆菌属种的16S rRNA基因有至少97％、98％或99％同一性。

80.权利要求73-79中任一项的核酸分子，其可操作地连接至与所述第二多核苷酸序列和绿芽孢杆菌属中的至少一个异源的启动子元件。

81.权利要求73-80中任一项的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含：

与表3或图6中所示出的任一多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的密码子优化的多核苷酸序列，在相同条件下，与表3或图6中所示出的多核苷酸序列相比，所述密码子优化的多核苷酸序列在绿芽孢杆菌属内生孢子中以更高的速率或水平表达。

82.一种包含N端信号肽的融合蛋白，所述N端信号肽可操作地连接至与N端信号肽异源的多肽，其中所述N端信号肽包含：

(a)包含与表3或图6中所示出的任一氨基酸序列具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或

(b)包含表3或图6中所示出的任一氨基酸序列的至少10、20、30、40或50个连续氨基酸的片段的多肽；

其中所述N端信号肽能够将所述融合蛋白靶向至绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁。

83.权利要求82的融合蛋白，其中所述片段包含：

(a)表3或图6中所示出的任一序列的第一个氨基酸；或

(b)表3或图6中所示出的任一序列的最后一个氨基酸。

84.权利要求82或83的融合蛋白，其中所述多肽序列包含与表3或图6中所示出的任一氨基酸序列具有60％、70％、80％或90％的序列同一性的序列。

85.权利要求82至84中任一项的融合蛋白，其中所述片段包含表3或图6中所示出的任一氨基酸序列的氨基酸1-10、1-20、1-30、1-40或1-50。

86.权利要求82至85中任一项的融合蛋白，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包含：

(a)植物生长刺激蛋白；

(b)酶；

(c)蛋白；

(d)与绿芽孢杆菌属异源的多肽；

(e)治疗性蛋白；或

(f)植物免疫刺激蛋白。

87.权利要求82至86中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含：

(a)含有一个或多个蛋白酶切割位点的多肽，该多肽位于所述N端信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽之间；

(b)包含选择性标记物的多肽；

(c)包含可视化标记物的多肽；

(d)包含至少一种蛋白识别/纯化结构域的多肽；或

(e)包含柔性接头元件的多肽，其连接所述信号肽和所述与所述N端信号肽异源的多肽。

88.权利要求82至87中任一项的融合蛋白，其中所述绿芽孢杆菌属内生孢子是由绿芽孢杆菌属种形成的内生孢子，所述绿芽孢杆菌属种包括：田地绿芽孢杆菌、沙地绿芽孢杆菌或雷氏绿芽孢杆菌；或由具有16S rRNA基因的细菌形成的内生孢子，所述16S rRNA基因与绿芽孢杆菌属种的16S rRNA基因有至少97％、98％或99％同一性。

89.一种包含细菌染色体的重组绿芽孢杆菌属细胞，所述细菌染色体包含权利要求73-81中任一项的核酸分子。

90.一种包含权利要求73-81中任一项的核酸分子的载体，其中所述载体包含质粒、人工染色体或病毒载体。

91.权利要求90的载体，进一步包含以下中的至少一种：

(a)在绿芽孢杆菌属细胞中提供稳定维持的复制起点；

(b)在绿芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的复制起点；

(c)在绿芽孢杆菌属细胞中选择性提供非稳定维持的对温度敏感的复制起点；

(d)编码选择性标记物的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列；或

(e)编码植物生长刺激蛋白的多核苷酸，其可操作地连接至表达控制序列。

92.一种用载体转化的重组绿芽孢杆菌属细胞，所述载体包含权利要求73-81中任一项的核酸分子。

93.权利要求92的重组绿芽孢杆菌属细胞，其中所述绿芽孢杆菌属细胞为绿芽孢杆菌属种，其包括：田地绿芽孢杆菌、沙地绿芽孢杆菌或雷氏绿芽孢杆菌；或具有16S rRNA基因的细菌，所述16S rRNA基因与绿芽孢杆菌属种的16S rRNA基因有至少97％、98％或99％同一性。

94.一种在绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁上展示异源融合蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用重组载体转化能够形成孢子的绿芽孢杆菌属细胞，所述重组载体包含权利要求73-81中任一项的核酸分子；以及

(b)在孢子形成条件下表达由权利要求73-81中任一项的核酸分子编码的融合蛋白，使得所述融合蛋白被靶向至由孢子形成产生的绿芽孢杆菌属内生孢子的孢子外壁，

其中所述N端信号肽包含：(i)包含与表3或图6中所示出的任一氨基酸序列具有至少60％、70％或80％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(ii)表3或图6中所示出的任一氨基酸序列的至少10、20、30、40或50个连续氨基酸的片段。

95.一种组合物，其包含：

(a)一种或多种表达权利要求82-88中任一项的融合蛋白的重组产孢子外壁的绿芽孢杆菌属细胞，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及

(b)至少一种生物防治剂；任选地，

以协同有效量。

96.用权利要求73-81中任一项的核酸、权利要求82-88中任一项的融合蛋白、权利要求92或93的重组细菌细胞或权利要求95的组合物处理的种子。

97.一种处理植物、种子、植物部分或植物周围土壤以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括以下步骤：

同时或依次施用：

(a)表达权利要求82-88中任一项的融合蛋白的重组产孢子外壁的绿芽孢杆菌属内生孢子，其中所述与所述N端信号肽异源的多肽包括植物生长或免疫刺激蛋白；以及

(b)至少一种生物防治剂；任选地，

以协同有效量。

98.一种筛选用重组绿芽孢杆菌属内生孢子处理的宿主植物的方法，其包括以下步骤：

(a)将包含经修饰以表达根据权利要求82-88中任一项的融合蛋白的绿芽孢杆菌属内生孢子的组合物施用至能够被绿芽孢杆菌属永久或暂时定殖的种子、幼苗或营养繁殖苗，以产生经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗；以及

(b)通过检测和任选地测量经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性来筛选经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗。

99.权利要求98的方法，其中所述筛选步骤包括以下一个或多个：

(a)至少一种体外测定，包括检测并任选地定量提取物中包含的一种或多种化合物的存在、水平、水平变化、活性或定位，所述提取物是由从经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗获得的细胞或组织样品制备的；和/或

(b)至少一种体内测定，包括检测和任选地定量经处理的种子、幼苗或营养繁殖苗的性状、组分或属性。

100.一种筛选在绿芽孢杆菌属细胞中表达的异源蛋白或肽的农业上重要特性的方法，其包括：

(a)修饰绿芽孢杆菌属细胞以表达根据权利要求10-16中任一项的融合蛋白以产生重组绿芽孢杆菌属细胞；以及

(b)通过检测和任选地定量由重组绿芽孢杆菌属细胞产生的化合物的水平或活性来筛选绿芽孢杆菌属细胞。

101.一种处理植物、种子、人或动物的方法，其包括：

给予所述植物、种子、人或动物一种包含从由重组绿芽孢杆菌属细胞产生的内生孢子中分离的孢子外壁的组合物；

其中所述重组绿芽孢杆菌属细胞表达权利要求82-88中任一项的融合蛋白。

102.权利要求101的方法，其中所述组合物已经被热灭活或灭菌，使得保留无活力的绿芽孢杆菌属细胞。

103.一种组合物，其包含根据权利要求82-88中任一项的分离的和/或纯化的融合蛋白。

104.一种组合物，其包含分离的和/或纯化的由重组绿芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁，其已被修饰以表达根据权利要求82-88中任一项的融合蛋白。

105.一种组合物，其包含由重组绿芽孢杆菌属内生孢子产生的孢子外壁，其已被修饰以表达根据权利要求82-88中任一项的融合蛋白。

106.权利要求105的组合物，其中由重组绿芽孢杆菌属内生孢子产生的所述孢子外壁包含：

(a)孢子外壁的基底层；

(b)孢子外壁的毛状层；

(c)a)和b)的混合物

(d)从绿芽孢杆菌属内生孢子获得的粗制孢子外壁的级分和提取物；和/或

(e)从绿芽孢杆菌属内生孢子获得的粗制孢子外壁的级分和提取物，与相同量的粗制孢子外壁相比，其富含一定量或浓度的所述融合蛋白。

107.一种将目的蛋白递送至植物、种子或田地的方法，其包括：

将包含从重组绿芽孢杆菌属内生孢子获得的孢子外壁的组合物施用于植物、种子或田地；

其中所述重组绿芽孢杆菌属内生孢子已被修饰以表达根据权利要求82-88中任一项的融合蛋白。

108.权利要求107的方法，其中所述组合物被施用于田地：

(a)在种植前或种植后；

(b)在出苗前或出苗后；

(c)作为粉末、悬液或溶液形式；和/或

(d)其中所述组合物进一步包含一种或多种刺激植物生长或保护植物免受害虫侵害的额外化合物。

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