JP2022507370A - 内生胞子ディスプレイプラットフォーム、製品および方法 - Google Patents

内生胞子ディスプレイプラットフォーム、製品および方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2022507370000001
ブレビバチルス、リシニバチルスまたはビリディバチルス科メンバーによって産生された内生胞子の表面にタンパク質およびペプチドを標的化するために有用なシグナル配列およびこれを用いた方法が提供される。特定のＮ末端標的配列およびその誘導体を用いた、異種分子、例えば、ペプチド、ポリペプチドおよびその他組み換え構築物のブレビバチルス、リシニバチルスまたはビリディバチルス科メンバーのエキソスポリウム上における提示が提供される。
【選択図】図１

Description

関連出願の参照
本申請は、米国暫定特許出願第への優先順位を主張している。６２／７６８，０７７， ６２／７６８，０６３， ２０１８年１１月１５日に申請された６２／７６８，０６３、６２／７６７，９９７であり、各内容全体を参考にしてここに収載している。
技術分野
本願明細書は、目的とする異種分子を植物に送達するなど、様々な用途に有用な製品を提供する。特に、本願明細書は、内生胞子ディスプレイ法および関連する標的配列を記載する。例えば、本願明細書は、異種タンパク質、ペプチド、および他の組換え構築物をブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはビリディバチルス（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ）のエキソスポリウムおよび内生胞子に標的化することや、それを用いる方法など、様々な応用に有用なＮ末端シグナル配列を提供する。このようなＮ末端シグナル配列は、本明細書に開示されているブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス種において発現され、エキソスポリウム表面に局在する興味深い分子を有する内生胞子を生じる融合タンパク質のターゲティングシグナルとして使用され得る。これらの内生胞子は、植物宿主などの宿主に投与され得る。得られたプラットホームは、農業形質（除草剤に対する抵抗性、植物の成長および／または健康の促進、昆虫からの保護、真菌、細菌またはウイルスの植物病原体からの保護など）などの有益な形質について関心のあるタンパク質のハイスループットスクリーニングに適用可能であり、本願明細書は、他の関連製品および方法を提供する。
開示の背景
現代の農業技術は、作物の収量と品質を改善するために、植物の健康と成長を促進または増進する組成物に大きく依存している。このような組成物には、一般的に、有機または無機肥料、栄養素、および適切な植物の成長および発育を促進する他の化学化合物が含まれる。しかし、これらの組成物の多くを長期間または過剰に使用すると、土壌の酸性化や土壌中の栄養バランスの不安定化など、マイナスの副作用が生じる可能性があることは十分に確立されている。さらに、過剰使用は、ヒトの消費のために栽培された作物における有害な最終産物の濃縮をもたらす可能性がある。
現代の農場も、一般的に、病害虫を防除し、商業的に栽培された作物の高収量を保証するために、多種多様な化学物質（例えば、殺虫剤、除草剤、殺菌剤、線虫剤、殺菌剤）の使用に依存している。これらの化学物質の多くは広い活性を示し、高濃度でヒトや動物に有害な可能性がある。さらに、いくつかの化合物はオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）効果を示す。さらに、これらの合成化合物の少なくとも一部は非生分解性である。近年、合成殺虫剤や殺菌剤への曝露量を減らして、あるいは全く曝露させずに飼育・収穫されてきた農産物に対して、消費者からの圧力が高まっている。合成殺虫剤や殺菌剤の使用に伴って生じるさらなる問題は、繰り返しあるいは排他的な使用がしばしば耐性害虫の選択につながることである。通常、耐性害虫は同じ作用様式をもつ他の有効成分に対しても交差耐性である。その結果、害虫防除の組成や化合物は開発が難しく、高価である（例えば、安全性への懸念や耐性の急速な発現のため）。
遺伝子工学的方法はまた、合成化学物質に依存することなく、植物の成長および／または健康を促進するために用いられてきた。例えば、作物は、植物の成長および／または健康に関係する遺伝子を導入または改変するため、および／または天然または合成の害虫駆除剤をコードする遺伝子を導入するために改変することができる。導入遺伝子は、ウイルスベクターを用いて標的植物に導入することができる。近年、植物への組換え蛋白質のデリバリーのために細菌を用いるいくつかの成功が報告されている。しかし、現在までのところ、このような成功は、バチルス科のメンバーに大きく限定されており、より具体的には、最もよく特徴づけられているグラム陽性菌であり、胞子形成研究のための主要な細菌モデルである枯草菌に限定されている。デリバリーおよび発現プラットフォームとしての枯草菌に焦点が当てられているのは、枯草菌ゲノムおよびタンパク質合成および分泌に関係する生物学的経路が十分に理解されているという事実によるものである。しかし、細菌間の遺伝的多様性が高度であるため、枯草菌研究に基づく研究知見は、枯草菌科内外のメンバーに直接移転できないことが多い。例えば、枯草菌の内生胞子は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ科メンバーが産生するエキソスポリウム層を欠いている。
したがって、異種性遺伝物質を送達するある種の方法が知られている一方で、当該技術分野において、そのような遺伝物質のための新たな送達および発現プラットフォームを開発する必要性がある。
開示の実施形態の簡潔な要約
本明細書は、例えば、とりわけ、ブレビバチルス属、リシニバチルス属、またはビリディバチルス属の胞子形成メンバーを用いて環境（例えば、植物、野外）に組換え酵素および関心のある他の分子（例えば、ペプチド、タンパク質）を送達するための新たなプラットフォームを提供することによって、上記で同定されたニーズに対処する方法、組成物および遺伝子構築物を記載する。
一態様では、本明細書は、以下を含む融合タンパク質を発現する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を提供する。（ｉ）植物形質または特性を付与または修飾する少なくとも１つの異種タンパク質またはペプチド（例えば、植物成長刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素、細菌、真菌、または植物栄養源を分解または修飾する酵素；または病原体または害虫から植物を保護する酵素、タンパク質、またはペプチド）；および（ｉｉ）融合タンパク質をそれぞれのブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞のエキソスポリウムに局在させるＮ末端標的配列。この一般的組成は、さらに追加の成分（例えば、植物の成長および／または健康を促進する成分）を含み得る。さらに、本明細書に開示される方法の特定の実施形態は、植物の形質または特性を付与するか、または他の方法で改変する異種タンパク質およびペプチドの効率的なハイスループットスクリーニングを提供する。Ｎ末端シグナルペプチド（または標的配列）、またはこれを含む融合タンパク質が本開示において参照される場合、そのような構築物に適した配列は、構築物を発現する細胞または内生胞子の細菌属に基づいて選択されなければならず、そして属間使用はこの開示によって想定されないことが理解される。言い換えれば、ブレビバチルスに適合するＮ末端標的配列を表１および図１－３に示し、リシニバチルスに適合するＮ末端標的配列を表２およびＦＩＧ４－５に示し、およびビリディバチルスに適合するＮ末端標的配列を表３および図６に示す。これらのそれぞれの細菌属のそれぞれにおいてＮ末端ターゲティング機能性を保持するこれらの配列の変異体および断片も本明細書に開示する。
別の局面において、本開示は、（ａ）（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドに異種のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、融合タンパク質をコードする核酸分子を提供し、ここで、第１のポリヌクレオチド配列は、（ｉ）表１（ブレビバチルスについて）、２（リシニバチルスについて）、または３（ビリディバチルスについて）に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも６０％、７０％、または８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；または（ｉｉ）表１（ブレビバチルスについて）、２（リシニバチルスについて）、または３（ビリディバチルスについて）に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかの少なくとも６０連続ヌクレオチドのフラグメントを含むポリヌクレオチド配列を含み；そしてＮ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内胞子のエキソスポリウムに標的化することができる。
選択された局面において、Ｎ末端シグナルペプチドに異種性のポリペプチドは、（ａ）植物成長または免疫刺激タンパク質の少なくとも１つ； （ｂ）酵素； （ｃ）タンパク質；（ｄ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスと異種のポリペプチド；または（ｅ）治療用タンパク質を含む。選択された局面において、核酸分子は、（ａ）Ｎ－末端シグナルペプチドとＮ－末端シグナルペプチドとの間に位置する１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド、（ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド、（ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド、（ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド、または（ｅ）Ｎ－末端シグナルペプチドとＮ－末端シグナルペプチドと異種性のポリペプチドを連結する柔軟なリンカー要素を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む。
選択された局面において、ブレビバチルス内生胞子は、ブレビバチルス・アグリ（Ｂ． ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・アイジノグルエンシス（Ｂ． ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂ． ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ） ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂ． ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フルミニス（Ｂ． ｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモスス（Ｂ． ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・フルバス（Ｂ． ｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルス・ジンセンギソリ（Ｂ． ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂ． ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂ． ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・レビキイ（Ｂ． ｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂ． ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・マシリエンシス（Ｂ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ニトリフィカンス（Ｂ． ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルス・パナシフミ（Ｂ． ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂ． ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ． ｒｅｕｓｚｅｒｉ）またはブレビバチルス・セルモルバー（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）を含むブレビバチルス種によって形成される内生胞子である。
選択された局面において、リシニバチルス内生胞子は、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、リシニバチルス・ボロニトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｏｎｉｔｏｌｅｒａｎｓ）、シリニバチルス・フシホルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、リシニバチルス・アセトフェノニ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｉ）、リシニバチルス・アルカリフィリス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、リシニバチルス・チュングクカンジ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｕｎｇｋｕｋｊａｎｇｉ）、 リシニバチルス・コンポスティ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、 リシニバチルス・コンタミナンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、リシニバチルス・クレソリボランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｅｓｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、リシニバチルス・マクロイデス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｉｄｅｓ）、リシニバチルス・マンガニカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇａｎｉｃｕｓ）、リシニバチルス・マンギフェリフミ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇｉｆｅｒｉｈｕｍｉ）、リシニバチルス・マシリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・メイエリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｙｅｒｉ）、リシニバチルス・オデッセイ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、リシニバチルス・パキスタネンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｋｉｓｔａｎｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・パルビボロニカピエンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒｖｉｂｏｒｏｎｉｃａｐｉｅｎｓ）、リシニバチルス・シンドリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｎｄｕｒｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・タバシホリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｂａｃｉｆｏｌｉｉ）、リシニバチルス・バリアンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、リシニバチルス・キシラニリティカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）またはリシニバチルス・ハロトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）を含むリシニバチルス種によって形成される内生胞子である。，．
選択された局面において、ビリディバチルス内生胞子はビリディバチルス種によって形成される内生胞子であり、ビリディバチルス・アーヴァイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）、ビリディバチルス・アレノシ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅｎｏｓｉ）、またはビリディバチルス・ネイデイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｉｄｅｉ）を含む。
選択された局面において、核酸分子は、第２のポリヌクレオチド配列およびブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスの少なくとも１つに異種性であるプロモーター要素に機能的に連結される。
選択された局面において、Ｎ末端シグナルペプチドに異種性のポリペプチドは、（ａ）植物成長または免疫刺激タンパク質の少なくとも１つ； （ｂ）酵素；（ｃ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスと異種性のポリペプチド； （ｄ）治療用タンパク質（例えば、抗生物質または抗炎症性タンパク質）；または（ｅ）農業上重要な特性を提供するタンパク質であって、殺虫活性、殺菌活性、植物成長、健康または免疫刺激活性、および／または環境抵抗性の改善を含むが、これらに限定されない。その他の農業的に重要な特性には、作物特性の改善、作物の出現、収量、タンパク質含量、デンプン含量、根系の発達、根のサイズ維持の改善、根のサイズ維持の改善、ストレス耐性の改善（例えば、乾燥、暑熱、塩、ＵＶ、水、寒さに対する）、エチレンの低下（生産および／または受容の阻害）、分げつ増加、草丈の増加、葉身の大きい葉身、枯れの少ない基葉、より強い分げつ枝、緑色、色素含有量、光合成活性、必要とされる投入量の減少（肥料または水など）、必要な種子の減少、より生産的な分げつ枝、より早い開花、より早い穀粒の成熟、より少ない植物の対立（倒伏）、シュートの成長の増加、植物の活力の増強、増加した植物の林分および早期のより良い発芽が含まれる。
選択された態様において、融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性であるポリペプチドとの間に位置する、１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含有するポリペプチド； （ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド（例えば、抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質）； （ｃ）可視化エレメントを含むポリペプチド（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タグ）； （ｄ）少なくとも１つのタンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド（例えば、ＨＩＳタグ）；または（ｅ）シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに異種性であるポリペプチドとを連結する、可撓性リンカーエレメントを含むポリペプチドをさらに含む。
別の局面において、開示は、本明細書に開示される局面のいずれか１つの核酸分子を含む細菌染色体を含む組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を提供する。
代替の局面において、開示は、本明細書に開示される局面のいずれか１つの核酸分子を含むベクターを提供し、ここでベクターはプラスミド、人工染色体、またはウイルスベクターを含む。
選択された局面において、ベクターは、（ａ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞において安定な維持を提供する複製起点；（ｂ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞において選択的に非安定な維持を提供する複製起点；（ｃ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞において選択的に非安定な維持を提供する温度感受性複製起点； （ｄ）発現制御配列に作動可能に連結された選択マーカーをコードするポリヌクレオチド；または（ｅ）発現制御配列に作動可能に連結された植物成長刺激タンパク質をコードするポリヌクレオチド；の少なくとも１つをさらに含む。
別の局面において、開示は、本明細書に開示される局面のいずれか１つの核酸分子を含むベクターで形質転換された組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を提供する。
選択された局面において、ブレビバチルス細胞は、ブレビバチルス・アグリ（Ｂ． ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・アイジノグルエンシス（Ｂ． ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂ． ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ） ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂ． ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フルミニス（Ｂ． ｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモスス（Ｂ． ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・フルバス（Ｂ． ｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルス・ジンセンギソリ（Ｂ． ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂ． ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂ． ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・レビキイ（Ｂ． ｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂ． ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・マシリエンシス（Ｂ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ニトリフィカンス（Ｂ． ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルス・パナシフミ（Ｂ． ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂ． ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ． ｒｅｕｓｚｅｒｉ）またはブレビバチルス・セルモルバー（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）を含む、ブレビバチルス種である。
選択された局面において、リシニバチルス細胞は、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、リシニバチルス・ボロニトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｏｎｉｔｏｌｅｒａｎｓ）、シリニバチルス・フシホルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、リシニバチルス・アセトフェノニ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｉ）、リシニバチルス・アルカリフィリス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、リシニバチルス・チュングクカンジ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｕｎｇｋｕｋｊａｎｇｉ）、 リシニバチルス・コンポスティ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、 リシニバチルス・コンタミナンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、リシニバチルス・クレソリボランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｅｓｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、リシニバチルス・マクロイデス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｉｄｅｓ）、リシニバチルス・マンガニカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇａｎｉｃｕｓ）、リシニバチルス・マンギフェリフミ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇｉｆｅｒｉｈｕｍｉ）、リシニバチルス・マシリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・メイエリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｙｅｒｉ）、リシニバチルス・オデッセイ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、リシニバチルス・パキスタネンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｋｉｓｔａｎｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・パルビボロニカピエンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒｖｉｂｏｒｏｎｉｃａｐｉｅｎｓ）、リシニバチルス・シンドリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｎｄｕｒｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・タバシホリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｂａｃｉｆｏｌｉｉ）、リシニバチルス・バリアンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、リシニバチルス・キシラニリティカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）またはリシニバチルス・ハロトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）を含むリシニバチルス種である。
選択された局面において、ビリディバチルス・アーヴァイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）、ビリディバチルス・アレノシ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅｎｏｓｉ）、またはビリディバチルス・ネイデイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｉｄｅｉ）を含むビリディバチルス種である。
代替の局面において、開示は、以下を含む組成物を提供する：ａ）Ｎ末端シグナルペプチドに異種性のポリペプチドが植物成長または免疫刺激タンパク質を含む、１つ以上の組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、または本明細書に開示されている局面のいずれか１つの融合タンパク質を発現するビリディバチルス細胞；およびｂ）少なくとも１つの生物学的制御剤；場合により相乗的に有効な量。
別の局面において、開示は、本明細書に開示される局面のいずれか１つの核酸、融合タンパク質、細菌細胞または組成物の少なくとも１つで処理された種を提供する。
代替態様では、開示は、植物の成長を増強し、および／または植物の健康を促進するために植物、種子、植物部分、または植物周辺の土壌を処理する方法を提供し、これは、ａ）本明細書に開示されている態様のいずれかの融合タンパク質を発現する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を、Ｎ末端シグナルペプチドに異種性のポリペプチドが植物成長または免疫刺激タンパク質を含む、およびｂ）少なくとも１つの生物学的制御剤、場合によっては相乗的に有効な量で適用する段階を含む。
別の局面において、開示は、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子で処理された宿主植物をスクリーニングする方法を提供し、以下の段階を含む：ａ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を含む組成物を、処理された種子、実生、または栄養植物を生産するために、本明細書に開示されている局面のいずれかに従って融合タンパク質を発現するように改変された種子、実生、またはブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスにより永久的または一時的にコロニー形成され得る栄養植物に適用する； ｂ）処理された種子、実生、または栄養植物の形質、成分または特性を検出し、必要に応じて測定することにより、処理された種子、実生、または栄養植物をスクリーニングする。
選択された局面において、スクリーニング段階は、（ａ）処理された種子、実生、または栄養植物から得られた細胞または組織サンプルから調製された抽出物に含まれる１つ以上の化合物の存在、レベル、レベルの変化、活性、または局在を検出し、任意に定量することを含む少なくとも１つのインビトロアッセイ；および／または（ｂ）処理された種子、実生、または栄養植物の形質、成分、または特性を検出し、任意に定量することを含む少なくとも１つのインビボアッセイの１以上を含む。
別の局面において、開示は、農業的に重要な特性についてブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞で発現される異種タンパク質またはペプチドをスクリーニングする方法を提供し、それは、（ａ）組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を産生するために本明細書に開示される局面に従って融合タンパク質を発現するようにブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を改変すること；および（ｂ）組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞によって産生される化合物のレベルまたは活性を検出および任意に定量することによってブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞をスクリーニングすることを含む。
代替の局面において、開示は、植物、植物種子、ヒト、または動物を治療する方法を提供し、それは：組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞によって産生される内生胞子から単離されるエキソスポリウムを含む組成物を植物、植物種子、植物種子、ヒト、または動物に投与する段階を含み、ここで：組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、開示される局面のいずれか１つの局面の融合タンパク質を発現する。選択された局面において、動物は、ウシのような家畜として飼育された動物を含むことができる。
選択された局面において、組成物は、生存可能なブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞が残らないように、熱不活性化または滅菌されている。
別の局面において、開示は、本明細書に開示される局面のいずれか１つに従って単離および／または精製された融合タンパク質を含む組成物を提供する。
別の局面において、開示は、明細書に開示される局面のいずれかに従って融合タンパク質を発現するように改変されている組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子によって産生される単離および／または精製エキソスポリウムを含む組成物を提供する。
別の局面において、開示は、本明細書に開示される局面のいずれかに従って融合タンパク質を発現するように改変されている組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子によって産生されるエキソスポリウムを含む組成物をする。
選択された態様では、組み換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子によって生成されるエキソスポリウムは、（ａ）エキソスポリウムの基底層と、（ｂ）エキソスポリウムの毛髪様層と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方の混合物と、（ｄ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子から得られる粗エキソスポリウムの画分または抽出物と、（ｅ）同量の粗エキソスポリウムと比較して融合蛋白質の量または濃度が濃縮されたブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子から得られる粗エキソスポリウムの画分または抽出物とを含む。
別の局面において、開示は、植物、種子または野外に目的のタンパク質を送達する方法を提供し、それは：組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子から得られるエキソスポリウムを含む組成物を植物、種子、または野外に施用することを含み、ここで開示されている局面のいずれかに従って、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子が融合タンパク質を発現するように改変されている。
選択された局面において、組成物は、（ａ）植栽前または植栽後； （ｂ）出芽前または出芽後； （ｃ）粉末、懸濁液または溶液として；または（ｄ）組成物がさらに植物成長を刺激する１つ以上の追加化合物を含むように、圃場に施用される。
図１は、開示の例示的な局面に従って、Ｎ末端シグナルペプチドの変異体を有する種々のブレビバチルスタンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列の第一の配列アラインメントを示す。アラインメントの下にコンセンサス配列を示す。
図２は、開示の例示的な局面に従って、Ｎ末端シグナルペプチドの変異体を有する種々のブレビバチルスタンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列の第二の配列アラインメントを示す。アラインメントの下にコンセンサス配列を示す。
図３は、開示の例示的な局面に従って、Ｎ末端シグナルペプチドの変異体を有する種々のブレビバチルスタンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列の第三の配列アラインメントを示す。アラインメントの下にコンセンサス配列を示す。
図４は、開示の例示的な局面に従って、Ｎ－末端シグナルペプチドの変異体を有する種々のリジニバシラスタンパク質のＮ－末端部分のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。コンセンサス配列（配列番号４１）をアラインメントの下に示す。
図５は、開示の別の例示的な局面に従って、Ｎ末端シグナルペプチドの変異体を有する種々のリジニバシラスタンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。アラインメントの下にコンセンサス配列を示す。
図６は、開示の例示的な局面に従って、Ｎ末端シグナルペプチドの変異体を有するビリディバチルス ｓｐ．株（例えば、配列番号： １８１、１８５、１８９、１９３、１９７、２０１、２０５、２０９、２１３、および２１７）において同定された様々なタンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。コンセンサス配列（すなわち、配列番号： １７９）をアラインメントの下に示す。ビリディバチルス ｓｐ．株のいくつかのグループは、同一のＮ末端シグナルペプチドを有する蛋白質を発現した。
本開示による例示的なＮ末端標的配列、具体的には、この図によって示されるように、内生胞子表面に局在化されたｔｄＴｏｍａｔｏ融合蛋白質構築物を発現するビリディバチルス ｓｐ．株ＮＲＬ Ｂ－６７８６５内生胞子の明視野（左）および落射蛍光（右）の顕微鏡写真（倍率１０００倍）を示す。右図のｔｄＴｏｍａｔｏがつくる蛍光は、ｔｄＴｏｍａｔｏの内生胞子表面への正しい局在を示す左図の明視野顕微鏡で観察された胞子の像と一致する。
図７Ｂは、図７Ａに示す内生胞子を形質転換するのに用いたのと同じ例示的Ｎ末端標的配列を発現するブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６５内生胞子のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。野生型のブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６５内生胞子で、観察可能なｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を示さないものを比較のために示す（点線のトレース、開いた領域）。図に示した集団ごとに５０，０００イベントを記録する。
図８Ａは、本開示による例示的なＮ末端標的化配列、特に、この図によって例示されるような内生胞子表面に局在化されるｔｄＴｏｍａｔｏ融合タンパク質構築物を発現するリシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４内生胞子の明視野（左）顕微鏡写真および落射蛍光（右）顕微鏡写真（１０００ｘ倍率）を示す。右図のｔｄＴｏｍａｔｏがつくる蛍光は、ｔｄＴｏｍａｔｏの内生胞子表面への正しい局在を示す左図の明視野顕微鏡で観察された胞子の像と一致する。
図８Ｂは、図８Ａに示す内生胞子を形質転換するのに用いたのと同じ例示的なＮ末端標的配列を発現するリシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４内生胞子のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。野生型リシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４内生胞子で、観察可能なｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を示さないものを比較のために示す（点線トレース、開放領域）。図に示した集団ごとに５０，０００イベントを記録する。
図９Ａは、開示に従った例示的なＮ末端標的配列、特に、この図に示されるような内生胞子表面に局所化されたｔｄＴｏｍａｔｏ融合タンパク質構築物を表現するビリディバチルス ｓｐ． ＮＲＬ－６７８６９の明視野（左）および落射蛍光（右）顕微鏡写真（１０００ｘ倍率）を示す。右図のｔｄＴｏｍａｔｏがつくる蛍光は、ｔｄＴｏｍａｔｏの内生胞子表面への正しい局在を示す左図の明視野顕微鏡で観察された胞子の像と一致する。
図９Ｂは、図９Ａに示す内生胞子を形質転換するのに用いたのと同じ例示的Ｎ末端標的配列を発現するビリディバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６９内生胞子のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。野生型のビリディバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６９内生胞子で、観察可能なｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を示さないものを比較のために示す（点線のトレース、開いた領域）。図に示した母集団ごとに５０，０００イベントを記録する。
詳細な説明
開示は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍへの融合タンパク質を標的化することができる遺伝子構築物、ならびにこれらの構築物を用いて植物などの様々な環境へ異種分子（例えば、ペプチド、タンパク質）を送達する組成物および方法を提供する。例えば、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子で処理した後、処理植物をスクリーニングして、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を介して送達される異種タンパク質に起因する変化を検出することができる。そのような変化には、宿主植物の成長速度または収量の変化；植物の健康の増進（例えば、環境ストレス、病害虫または害虫に対する抵抗性）；および組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を用いた無処理の同じ条件下で生育させた宿主植物と比較した、増強された、改変された、またはその他の別の新しい属性の表示が含まれ得る。異種タンパク質をエキソスポリウムに効率的に標的化する標的配列の使用は、例えば、新しい植物形質または属性を増強、改変、および／または付与することができる有用な異種タンパク質のためのハイスループットスクリーニングのためのプラットフォームも提供する。
ブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス細菌は、エキソスポリウム層を含む内生胞子を産生する。この構造は枯草菌にはない。枯草菌は胞子外被で終わる内生胞子をつくる。標準的な胞子形成過程（枯草菌を用いた研究に基づいて解明された）は、母細胞と前胞子を形成するための栄養細胞の非対称的な細胞分裂を含み、それらは介在する隔壁によって隔てられた２つの異なる区画として発生する。最終的には、隔壁のペプチドグリカンが分解され、前胞子が母細胞に飲み込まれ、細胞内に細胞が形成される。母細胞と前胞子の間の細胞間情報伝達は、各細胞における細胞特異的な遺伝子発現を調整し、その結果、内胞子特異的化合物が産生され、前胞子の周囲に皮層が形成され、被膜が沈着する。
枯草菌、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓ）などの一部のＢａｃｉｌｌｕｓ種では、この被膜が続いて内生胞子の最外層になる。バチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）群の多くの種では、前胞子はさらに、髪の毛のようなナップ層に囲まれた傍結晶性の基底層からなる、緩く合ったバルーン状の外膜によって包まれている。これらの種では、エキソスポリウムは間隙として知られる間質結合領域によって被膜から隔てられている。どちらの場合も、終末被覆層または外膜の形成後、前胞子は最終的な脱水を受け、完全な内生胞子に成熟する。その後、母細胞はプログラムされた細胞死を経て分解され、内生胞子が環境中に放出される。その後、内生胞子は、より好ましい条件または特定の刺激が発芽および栄養状態への復帰を誘発するまで、典型的には休眠状態にとどまるであろう。
胞子と環境の間の最も外側の表面として、外被層（あるいはエキソスポリウム形成種ではエキソスポリウム）は多くの重要な機能を果たしている。特に、この層は環境傷害に対する半透性バリアとして作用し、土壌との相互作用を媒介するため、胞子の生存性の維持および内生胞子の発芽を誘発する条件の感知において重要な役割を果たす。コート層はまた、宿主免疫細胞認識に寄与する細菌の病原性株中の細胞表面分子を含むので、臨床研究の標的でもある。枯草菌の胞子外被上に異種タンパク質を提示する方法は、目的のタンパク質に融合したＣｏｔＣのような枯草菌胞子外被タンパク質を含む融合タンパク質構築物を用いて開発されている。しかし、枯草菌はエキソスポリウムを欠いているため、この種を用いた研究では、ブレビバチルス、リシニバチルス、ビリディバチルスなどの他の細菌属によって産生されるエキソスポリウムに融合タンパク質がどのように標的化されるかについての指針を示すことができない。
対照的に、本開示は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞のエキソスポリウムに融合タンパク質構築物を標的とすることができるものと同じ構成物を含むＮ末端構築物および融合タンパク質を提供する。エキソスポリウムへの融合タンパク質を標的化するために使用されるＮ末端シグナル配列は、そのような配列が選択された細菌属と適合することを条件として、本明細書に開示される配列のいずれかによって表される配列を有するポリペプチドを含むことができる（すなわち、ブレビバチルスについては表１またはＦＩＧ．１～３、リシニバチルスについては表２またはＦＩＧ．４～５、ビリディバチルスについては表３または図６、または対応する細菌属においてエキソスポリウムターゲティング機能性を保持するこれらの配列のいずれかの断片または変異体）。選択された実施態様において、このＮ末端シグナル配列は、同一細菌属においてエキソスポリウム標的化機能性を保持するのに十分な、本明細書に開示された配列のいずれかの断片または変異体を含むことができる。これらおよび他の実施形態を本明細書に記載する。
本開示を通して、用語「含有（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその派生語（例えば、含有（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含有（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）は、「本質的に含有」、「から成る」、またはそれらの該当する派生語と置き換えることができる。
本明細書中で用いる「ブレビバチルス」は、ブレビバチルス属に分類される内生胞子産生細菌を意味する。この用語は、制限されることなく、ブレビバチルス・アグリ（Ｂ． ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・アイジノグルエンシス（Ｂ． ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂ． ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ） ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂ． ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フルミニス（Ｂ． ｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモスス（Ｂ． ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・フルバス（Ｂ． ｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルス・ジンセンギソリ（Ｂ． ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂ． ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂ． ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・レビキイ（Ｂ． ｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂ． ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・マシリエンシス（Ｂ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ニトリフィカンス（Ｂ． ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルス・パナシフミ（Ｂ． ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂ． ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ． ｒｅｕｓｚｅｒｉ）またはブレビバチルス・セルモルバー（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）を含む様々なブレビバチルス科メンバーを含む。
本明細書で使用される「リシニバチルス」は、リシニバチルス属に分類される内胞子生成バクテリアを指す。この用語は、限定されるものではないが、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、リシニバチルス・ボロニトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｏｎｉｔｏｌｅｒａｎｓ）、シリニバチルス・フシホルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、リシニバチルス・アセトフェノニ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｉ）、リシニバチルス・アルカリフィリス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、リシニバチルス・チュングクカンジ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｕｎｇｋｕｋｊａｎｇｉ）、 リシニバチルス・コンポスティ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、 リシニバチルス・コンタミナンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、リシニバチルス・クレソリボランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｅｓｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、リシニバチルス・マクロイデス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｉｄｅｓ）、リシニバチルス・マンガニカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇａｎｉｃｕｓ）、リシニバチルス・マンギフェリフミ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇｉｆｅｒｉｈｕｍｉ）、リシニバチルス・マシリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・メイエリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｙｅｒｉ）、リシニバチルス・オデッセイ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、リシニバチルス・パキスタネンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｋｉｓｔａｎｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・パルビボロニカピエンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒｖｉｂｏｒｏｎｉｃａｐｉｅｎｓ）、リシニバチルス・シンドリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｎｄｕｒｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・タバシホリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｂａｃｉｆｏｌｉｉ）、リシニバチルス・バリアンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、リシニバチルス・キシラニリティカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）またはリシニバチルス・ハロトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）を含む様々なリシニバチルス科メンバーを含む。
ここで使用される「ビリディバチルス」は、ビリディバチルス属に分類される内生胞子産生細菌を示す。この用語は、制限されることなく、ビリディバチルス・アーヴァイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）、ビリディバチルス・アレノシ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅｎｏｓｉ）、またはビリディバチルス・ネイデイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｉｄｅｉ）を含む様々なビリディバチルス科メンバーを含む。
ある局面において、融合タンパク質を発現するために使用されるブレビバチルスメンバーは、ブレビバチルス・ブレビス（以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓとして分類された）、融合タンパク質を発現するために使用されるリシニバチルスメンバーは、リシニバチルス・ スフェリカス （以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓとして分類された）、および融合タンパク質を発現するために使用されるビリディバチルスメンバーは、ビリディバチルス・アーヴァイ （以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉとして分類された）である。これらの細菌種はそれぞれ、土壌から一般的に分離されるグラム陽性、好気性、胞子形成細菌である。
バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、またはバチルス・アーヴェイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）としての細菌の特性評価は、以前は単純な形態学的特徴と限られた数の生化学的検査のみに基づいていた。しかし、最近のゲノミクス研究は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のいくつかのメンバーがＤＮＡレベルで全く異なることを明らかにし、その結果、現在Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ， Ｌ． ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓおよびＶ． ａｒｖｉとして同定された種を含む複数種の分類学的位置の再評価をもたらした。注目すべきことに、この属の１６Ｓ ｒＲＮＡおよび全ゲノム解析はいずれも、もともと分類されていたＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ科ではなくＰｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科のメンバーであることを明らかにしている。以前の研究は、ブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス胞子が外膜層を有することを示している。しかし、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ群のエキソスポリウムとは異なり、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスのエキソスボリウムの組成と構造についてはほとんど知られていない。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスのエキソスポリウムの基本組成または構造に関する知識が全般的に不足していることを考えると、この層の形成時にこれらの属のメンバーのエキソスポリウムにタンパク質が標的となる過程についてはほとんど知られていない。
ある局面において、融合タンパク質を発現するために使用されるブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスメンバーは、ここに開示されている他の例示的なブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスファミリーメンバーのいずれかの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７、９８または９９％の同一性を共有する細菌である。または融合タンパク質を発現するために使用されるブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスメンバーは、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ビリディバチルス・アーヴィ（Ｖ．ａｒｖｉ）またはここに開示される他の例示的ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス科メンバーのいずれかに対する少なくとも７０％のＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション値を有する細菌である。別の例では、融合タンパク質を発現するために使用されるブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスメンバーは、ここに開示されるブレビバチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ビリディバチルス・アーヴィ（Ｖ．ａｒｖｉ）または他の例示的ブレビバチルス科メンバーのものと９５、９６、９７、９８、または９９％の平均ヌクレオチド同一性を有する細菌である。
用語「Ｎ－末端シグナル配列」とは、一般的に、ポリペプチドのアミノ末端またはその近位に位置するポリペプチド配列を意味し、これは、ポリペプチドの細胞内コンパートメントへの局在化、または分泌のために指示する。この用語は、状況に応じて、「Ｎ－末端標的配列」、「標的配列」、「シグナル配列」、および「シグナルペプチド」という用語と互換的に使用され得ることが認識され、理解される。Ｎ末端シグナル配列は、成熟タンパク質のポリペプチド配列の一部として保持されていてもよく、または局在化過程の間もしくは後に選択的に切断されていてもよい。この用語は、特に、ポリペプチドのアミノ末端またはその近位に位置するポリペプチド配列を指すために使用されてよく、これは、ポリペプチドの局在化をブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムに向ける。この文脈において、Ｎ末端シグナル配列の唯一必要とされる機能性は、そのポリペプチドがブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムの一部であるポリペプチドを標的とする能力である。ブレビバチルスに適合するＮ末端標的配列を表１および図１から３に示し、リシニバチルスに適合するＮ末端標的配列を表２および図４および５に示し、ビリディバチルスに適合するＮ末端標的配列を表３および図６に示す。上述のように、Ｎ末端標的配列の属間使用は、本開示により想定されない。
「植物」または「宿主植物」は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスがコロニー形成し得る根圏または葉圏を有する任意の植物、ならびにブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細菌の一過性宿主として働き得る植物を含む。コロニー形成は、開示の特定の局面において好ましいかもしれないが、本明細書に記載された方法および組成物が機能するための要件ではない。
ここで用いられている「生物的制御」とは、第２生物または生物分子の使用による病原体および／または、病害虫および／または、ダニおよび／線虫の制御と定義される。生物学的防除の既知のメカニズムには、根の表面上の空間または栄養分のための競合しない菌類による根腐病を制御する細菌が含まれる。病原体の制御には、抗生物質などの細菌毒素が用いられてきた。毒素は単離され、植物に直接適用されるか、または細菌種がその場で毒素を産生するように投与され得る。生物学的防除を発揮する他の手段としては、標的の植物病原体、昆虫、ダニまたは線虫に対して有効な成分を産生するある種の菌類の適用、または標的の害虫／病原体を攻撃することが挙げられる。「生物学的防除」はまた、植物の健康、成長、活力、ストレス応答または収量に有益な効果を有する微生物を包含してもよい。散布、土壌散布、種子処理などの施用経路がある。
「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して複合体を形成し、その複合体がヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される反応を指す。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、あるいは他のどのような配列特異的な方法によっても起こりうる。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、多本鎖複合体を形成する３本以上の鎖、１本の自己ハイブリダイゼーション鎖、またはこれらの任意の組合せを含むことがある。異なる「ストリンジェンシー」の条件下でハイブリダイゼーション反応を行うことができる。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は１０ｘ ＳＳＣ中約４０℃または等価イオン強度／温度の溶液で行われる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、典型的には、６ｘ ＳＳＣ中で約５０℃で実施され、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般的に、１ｘ ＳＳＣ中で約６０℃で実施される。
本明細書中で用いられる「配列同一性」という用語は、比較のウインドウにわたって、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が同一である程度（すなわち、それぞれヌクレオチドごとまたは残基ごとに）を意味する。配列同一性のパーセンテージは、比較のウインドウ上で２つの最適に並べられた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、ポリヌクレオチド配列について、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）が両方の配列中で起こる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除し、そして結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを生じることによって計算される。同様な計算は、２つの並べられたアミノ酸配列を比較することによって行うことができる。
アミノ酸配列の比較に関しては、配列同一性の測定に加えて、残基の変化が「保存的」置換を構成しているかどうかを比較することも考慮してもよい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンであり、脂肪族－水酸基側鎖を有するアミノ酸群はセリンとスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンとグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アルギニン、ヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインとメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。
Ｎ末端標的配列
開示は、ブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス細菌由来のＮ末端標的配列を提供する。ストレスの多い環境条件下では、ブレビバチルス、リシニバチルス、ビリディバチルス科の細菌は胞子形成を行い、長期間休眠状態を保つことのできる内生胞子を形成する。ブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス内生胞子の最外層は、外膜として知られ、基底層を含み、いくつかの株では、コラーゲン様蛋白質からなる外部付属器官／フィラメント／構造体を含む。
他の属の細菌の外膜に関する既報の研究は、外膜は、炭疽菌（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ）内生胞子において、コラーゲン様糖蛋白質、例えばＢｃｌＡによって主に形成されることを決定している。基底層は現在、多くの異なるタンパク質から構成されていると考えられている。炭疽菌（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ）表面ナップの主要な構成成分であるＢｃｌＡは、そのアミノ末端（Ｎ末端）が基底層に位置し、そのカルボキシ末端（Ｃ末端）が胞子から外側に伸びているエキソスポリウムに付着していることが示されている。ＢｃｌＡおよびＢｃｌＢのＮ末端領域からのある種の配列が、ペプチドまたはタンパク質をバチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）科メンバー内生胞子のエキソスポリウムに標的化するために使用できることが以前に発見された。米国特許公開番号２０１０／０２３３１２４および２０１１／０２８１３１６、ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎら、“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＢｃｌＡ ａｎｄ ＢｃｌＢ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｓｐｏｒｅ Ｓｕｒｆａｃｅ，” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７０（２）：４２１－３４ （２００８）参照。これらの全体は、引用により組み込まれている。
バチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）エキソスポリウムの標的配列に関する利用可能な文献が増えているにもかかわらず、ブレビバチルス、リシニバチルス、ビリディバチルスの相同なＮ末端標的配列を同定した研究は報告されていない。既知のエキソスポリウム標的コラーゲン様反復蛋白質ＢｃｌＡ、ＢｃｌＢまたはＢｅｔＡのバイオインフォマティクス解析では、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスにおける相同なＮ末端標的配列を明らかにすることができず、これらの蛋白質のエキソスポリウム標的配列はバチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）科に高度に特異的であることが示唆される。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスのエキソスポリウムに形成され、局在する蛋白質の特徴が限られていることから、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスのエキソスポリウムに、一般的に、またはこれらの属内の特定の種（例えば、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、またはバチルス・アーヴェイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）に標的蛋白質に必要なＮ末端シグナル配列を容易に推定することはできない。
本発明者らは、入手可能な文献においてこの指針がないにもかかわらず、内在性および融合タンパク質をブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス細胞のエキソスポリウムに向けることができるＮ末端標的配列を同定した。
参照を容易にするために、ここで言及するヌクレオチドおよびポリペプチド配列に対する配列番号を以下の表１に挙げる。
Figure 2022507370000002
Figure 2022507370000003
Figure 2022507370000004
Figure 2022507370000005
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Figure 2022507370000014
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ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスに適合するＮ－末端標的配列を、それぞれ表１、２、および３に示す。これらの配列に加えて、融合タンパク質をブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子に標的化し得る限りにおいて、Ｎ末端標的配列は、ここに記載されるいずれかの配列と少なくとも５０％、５１％、５５％、５５％、５６％、５６％、６５％、６５％、６３％、６６％、６７％、６６％、６７％、６７％、７０％、７２％、７３％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８３％、８４％、８５％、８６％、８９％、８９％、８９％、８９％、８９％、９１％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する変異体を含んていてもよい。いくつかの実施形態において、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５ （リシニバチルスの場合）、または表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示される配列のいずれかから選択される少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の隣接アミノ酸の断片を用いてもよい。この隣接セグメントは、本明細書に開示される配列のいずれかのＮ－末端またはＣ－末端を含み得る（例えば、Ｎ－末端標的配列は、本明細書に開示される任意の配列の最後の２５の隣接アミノ酸を含み得る）。いくつかの局面において、必要とされる唯一の機能性は、配列がブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的化する能力を維持することである。
エキソスポリウムへ融合タンパク質を標的化するために使用されるＮ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されているような配列を有するポリペプチドを含み得る。あるいは、選択された実施態様においては、このＮ－末端シグナル配列は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムへの融合タンパク質およびＮ－末端シグナル配列に異種性の関心分子（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）配列を標的とする、その変異体または断片を含むことができる。選択された実施態様において、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）表２または図４、５ （リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に記載されたいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５５％、５６％、５７％、６０％、６２％、６３％、６４％、６５％、６７％、６７％、６９％、７０％、７１％、７３％、７５％、７６％、７７％、７８％、７８％、８０％、８１％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８６％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。選択された実施態様において、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）表２または図４、５ （リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に記載された同数のアミノ酸から成る連続配列と同一である少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の連続配列を含む。
本明細書中で論じるように、開示のいくつかの局面による融合タンパク質構築物は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とするＮ末端シグナル配列またはその改変体または断片、およびＮ末端シグナル配列と異種であるポリペプチド配列を含む。しかしながら、さらなる局面において、開示された配列のいずれか、ならびに開示された局面のいずれかによる連続的な変異体およびその断片は、他の目的のために使用され得る。本開示が、これらの配列がＮ末端外膜標的配列として機能する側面に焦点を合わせいることをもって、他の機能を排除していると解釈されるべきではない。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかの配列によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）のいずれかの変異体、例えば、これらの表または図上に開示される配列のいずれかに見出される少なくとも１つの隣接するサブ配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかの配列の変異体、例えば、これらの表または図に開示された配列と最小または正確なパーセンテージの同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。選択された実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、上記に定義されるように、断片および変異体（例えば、本明細書に開示された配列の連続したサブ配列、ならびに開示された配列同一性範囲内に入る分岐配列を含むＮ末端シグナル配列）の両方として適格であり得る。
選択された実施態様において、Ｎ－末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５５％、５６％、５７％、５８％、６０％、６２％、６３％、６４％、６５％、６７％、６８％、６９％、７０％、７２％、７３％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８６％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
選択された実施態様において、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるアミノ酸配列の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の連続配列と同一である少なくとも１０、２０または２５アミノ酸の連続配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片、例えば、これら表または図に開示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド中に見出される少なくとも１つの隣接するサブ配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体、例えば、これら表または図に開示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列と最小または正確なパーセンテージの同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。選択された実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、上記に定義されるように、断片および変異体（例えば、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド内に見出される隣接するサブ配列を含み、本明細書に記載の最小配列同一性範囲内にある分岐配列（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が続くＮ末端シグナル配列）の両方として適格であり得る。
選択された実施態様において、Ｎ末端シグナル配列は、本明細書に記載されたいずれかヌクレオチド配列、例えば、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５５％、５６％、６０％、６１％、６５％、６３％、６４％、６６％、６７％、６９％、７０％、７２％、７３％、７５％、７６％、７７％、７８％、７８％、７８％、８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８９％、８９％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
選択された実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかのポリペプチド配列またはその断片をコードするポリヌクレオチドと相同な酢酸プローブと、中等度または高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
選択態様において、Ｎ末端シグナル配列は、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）表２または図４、５ （リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に記載された同一数のヌクレオチドの連続配列と同一である少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの連続配列を含む。
前述の実施態様のような、本開示によって意図される代替Ｎ末端標的配列のいずれに関しても、選択された局面におけるそのような配列の最小必要機能性は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムに対する融合タンパク質を標的とする能力である。
融合タンパク質
開示は、直接的または間接的に、興味のある少なくとも１つの分子（例えば、少なくとも１つの植物成長刺激タンパク質またはペプチドなどの、興味のあるタンパク質またはペプチドのポリペプチド配列）に連結されたＮ－末端標的配列を含む融合タンパク質を提供する。選択された実施形態において、間接的連鎖は介在スペーサー、リンカーまたは調節配列であってもよい。タンパク質またはペプチドは、限定されるわけではないが、ペプチドホルモン、非ホルモンペプチド、植物成長刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素、または細菌、真菌、または植物栄養源を分解または改変する酵素を含むことができる。一般に、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子において発現可能であり、かつ選択されたＮ－末端標的配列に異種性である任意の興味深いタンパク質を使用してもよい。標的配列は、上述の標的配列のいずれでもよい。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、標的配列および病原体から植物を保護する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含むことができる。標的配列は、上述の標的配列のいずれでもよい。
融合タンパク質は、当技術分野で知られている標準的なクローニングおよび分子生物学的方法を用いて作製することができる。例えば、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（例えば、植物成長刺激タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、前記標的配列のいずれかをコードするＤＮＡに連結して、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を形成することができる。融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、任意の適当なベクター、例えばプラスミドベクターにクローン化することができる。このベクターは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を容易に挿入することができる多重クローニング部位を適当に含む。ベクターはまた、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを適当に含んでおり、その結果、ベクターで形質転換、トランスフェクト、またはベクターと交配（ｍａｔｅｄ）させた細菌を容易に同定し、単離することができる。ベクターがプラスミドである場合、プラスミドは適当に複製起点も含む。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適当に、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウム上の融合タンパク質の発現を引き起こすであろう胞子形成プロモーター （例えば、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスファミリーメンバー由来の天然プロモーター） の制御下にある。あるいは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ、例えば、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかのポリヌクレオチド配列を含む配列を、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の染色体ＤＮＡに組み込むことができる。
この融合タンパク質は、標的配列の一部ではない追加のポリペプチド配列、または興味のある結合タンパク質（例えば、植物成長刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を保護するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または植物結合タンパク質もしくはペプチド）を含むこともできる。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質自体、または融合タンパク質を発現する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の胞子の精製を促進するためのタグまたはマーカー（例えば、ポリヒスチジンタグ）もしくは可視化を促進するためのタグまたはマーカー（例えば、ＧＦＰもしくはＹＦＰなどの蛍光タンパク質）を含むことができる。
本明細書に記載されている標的配列を用いたエキソスポリウム上の融合タンパク質の発現は、これらの配列のアミノ末端における二次構造の欠如により増強され、これにより融合タンパク質の天然の折りたたみおよび活性の保持が可能になる。適切な折りたたみは、標的配列と融合パートナータンパク質との間に短いアミノ酸リンカーを含めることによってさらに増強することができる。
したがって、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれも、標的配列と目的とする結合タンパク質（例えば、植物成長刺激タンパク質またはペプチド、病原体から植物を保護するタンパク質またはペプチド、植物におけるストレス抵抗性を増強するタンパク質またはペプチド、または植物結合タンパク質またはペプチド）との間のアミノ酸リンカーを含むことができる。
リンカーは、ポリアラニンリンカーまたはポリグリシンリンカーを含み得る。アラニン残基およびグリシン残基の両方の混合物を含むリンカーも使用することができる。例えば、標的配列が配列番号４を含む場合、融合タンパク質は、以下の構造の１つを有することができる：
リンカーなし：配列番号：４－融合パートナータンパク質
アラニンリンカー：配列番号：４－Ａｎ－融合パートナータンパク質
グリシンリンカー：配列番号：４－Ｇｎ－融合パートナータンパク質
アラニン／グリシン混合リンカー：配列番号：４－（Ａ／Ｇ）ｎ－融合パートナータンパク質
ここで、Ａｎ， Ｇｎ、および（Ａ／Ｇ）ｎは、それぞれ任意の数のアラニン、任意の数のグリシン、または任意の数のアラニンとグリシンの混合である。
たとえば、ｎには、６～１０の整数など、１～２５の任意の整数を指定できる。リンカーがアラニンおよびグリシン残基の混合物を含む場合、グリシンおよびアラニン残基の任意の組み合わせを使用することができる。配列番号：４（ブレビバチルスについて）で表されるＮ－末端標的配列を、例えば上記に示すように使用してもよい。しかしながら、上記例示的な配置、例えば、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかの配列において、本明細書に開示されている他のＮ－末端標的配列（切断型および変異型を含む）のいずれかで置換してもよい。上記構造において、「融合パートナータンパク質」は、目的とする結合タンパク質（例えば、植物成長刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を保護するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス抵抗性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または植物結合タンパク質もしくはペプチド）を表す。
代わりに、または加えて、リンカーはプロテアーゼ認識部位を含み得る。プロテアーゼ認識部位の封入は、目的のタンパク質（例えば、植物成長刺激タンパク質またはペプチド、植物を病原体から保護するタンパク質またはペプチド、植物におけるストレス抵抗性を増強するタンパク質またはペプチド、または植物結合タンパク質またはペプチド）の、プロテアーゼ認識部位を認識するプロテアーゼへの曝露に際して、標的除去を可能にする。
特定の局面において、融合タンパク質は、アセトインレダクターゼ、インドール－３－アセトアミドヒドロラーゼ、アセト乳酸シンテターゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジアセチルレダクターゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、アミノオキシダーゼ、インドール－３－ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン側鎖オキシダーゼ、ニトリルヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、アデノシンリン酸イソペンテニルトランスフェラーゼ、アデノシンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＹＰ７３５Ａ 、５’－リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、ゼアチントランスイソメラーゼ、ゼアチンＯ－グルコシルトランスフェラーゼ、β－ヒドロキシラーゼ、ＣＫシスヒドロキシラーゼ、ＣＫ Ｎ－グルコシルトランスフェラーゼ、２，５－リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ゼアチンレダクターゼ、ヒドロキシルアミンレダクターゼ、２－オキソグルタル酸 ジベレリン２Ｂ／３Ｂヒドロラーゼ、ジベレリン３－オキシダーゼ、ジベレリン２０－オキシダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、β－１，３－グルカナーゼ、β－１，４－グルカナーゼ、β－１，６－グルカナーゼ、アミノシクロプロパン－１－カルボン酸デアミナーゼ、ｎｏｄ因子を産生するのに関与する酵素、または上記のいずれかの組合せ等のなどの植物成長刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含む。
他の局面において、融合タンパク質は、細菌、真菌、または植物の栄養源を分解または修飾する酵素、例えば、セルラーゼ、リグニンオキシダーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼ、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、キシラナーゼ、シデロフォア、または上記の任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、標的配列、エキソスポリウムタンパク質、または融合タンパク質のエキソスポリウムタンパク質断片に天然の胞子形成プロモーターの制御下で発現される。融合タンパク質は、高発現胞子形成プロモーターの制御下で発現され得る。特定の局面において、高発現胞子形成プロモーターは、シグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を含む。選択された局面において、融合タンパク質は、融合タンパク質の標的配列に天然であるプロモーターの制御下で発現され得る。場合によっては、標的配列に天然であるプロモーターは、高発現胞子形成プロモーターとなるであろう。他の場合には、標的配列に天然であるプロモーターは、高発現胞子形成プロモーターではないであろう。後者の場合には、天然プロモーターを高発現胞子形成プロモーターと置き換えるのが有利であろう。高発現胞子形成プロモーターの制御下での融合タンパク質の発現は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウム上での融合タンパク質の発現増加を提供する。高発現胞子形成プロモーターは、１つ以上のシグマ－Ｋ胞子形成特異的プロモーター配列を含むことができる。
上述のように、融合タンパク質は、標的配列および成長刺激タンパク質またはペプチドを含み得る少なくとも１つの異種タンパク質を含み得る。植物成長刺激タンパク質またはペプチドは、とりわけ、ペプチドホルモン、非ホルモンペプチド、植物成長刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素、または細菌、真菌、または植物栄養源を分解または改変する酵素を含み得る。植物成長刺激タンパク質またはペプチドは、植物成長刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含み得る。植物成長刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素は、植物成長を刺激するまたは植物構造を変化させる化合物の生物学的合成経路の任意の段階を触媒する任意の酵素、または植物成長を刺激するまたは植物構造を改変する化合物の不活性または活性の低い誘導体を当該化合物の活性化形態またはより活性の高い形態への改変を触媒する酵素であり得る。代わりに、植物成長刺激化合物は、植物成長ホルモン、例えば、サイトカイニンまたはサイトカイニン誘導体、エチレン、オーキシンまたはオーキシン誘導体、ジベレリン酸またはジベレリン酸誘導体、アブシジン酸またはアブシジン酸誘導体、またはジャスモン酸またはジャスモン酸誘導体を含み得る。
酵素がプロテアーゼまたはペプチダーゼを含む場合、プロテアーゼまたはペプチダーゼは、タンパク質、ペプチド、プロタンパク質、またはプレプロプロタンパク質を切断して生物活性ペプチドを作り出すプロテアーゼまたはペプチダーゼであり得る。生理活性ペプチドは、生物活性を発揮する任意のペプチドであり得る。タンパク質、ペプチド、プロタンパク質、またはプレプロタンパク質を切断して生物活性ペプチドを作り出すプロテアーゼまたはペプチダーゼは、スブチリシン、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼを含むことができる。
植物成長刺激タンパク質はまた、細菌、菌類、または植物栄養源を分解または改変する酵素を含み得る。そのような酵素には、セルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼ、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、キシラナーゼ、およびシデロフォアが含まれる。植物の成長培地に導入したり、植物、種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に施用すると、細菌、菌類、または植物の栄養源を分解または改変する酵素を含む融合タンパク質は、植物の近傍の栄養素の処理を助け、植物による栄養素の取り込みの増強、または植物の近傍の有益な細菌もしくは菌類による取り込みの増強をもたらすことができる。この融合タンパク質は、標的配列および植物を病原体から保護する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含むことができる。タンパク質またはペプチドは、植物免疫応答を刺激するタンパク質またはペプチドを含み得る。例えば、植物免疫応答を刺激するタンパク質またはペプチドは、植物免疫系エンハンサータンパク質またはペプチドを含み得る。植物免疫系エンハンサータンパク質またはペプチドは、植物の免疫系に有益な効果を有する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。代わりに、病原体から植物を保護するタンパク質またはペプチドは、抗細菌活性、抗真菌活性、または抗細菌活性と抗真菌活性の両方を有するタンパク質またはペプチドであり得る。病原体から植物を保護するタンパク質またはペプチドは、殺虫活性、駆虫活性、昆虫または線虫の捕食を抑制するタンパク質またはペプチド、またはそれらの組み合わせでもあり得る。病原体から植物を保護するタンパク質は、酵素を含み得る。適当な酵素としては、プロテアーゼおよびラクトナーゼが挙げられる。プロテアーゼおよびラクトナーゼは、細菌シグナル伝達分子（例えば、細菌ラクトンホモセリンシグナル伝達分子）に特異的であり得る。また、この酵素は、細菌または真菌の細胞成分に特異的な酵素であり得る。
融合タンパク質は、標的配列、および植物におけるストレス抵抗性を増強する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含み得る。例えば、植物においてストレス耐性を増強するタンパク質またはペプチドは、ストレス関連化合物を分解する酵素を含む。ストレス関連化合物には、アミノシクロプロパン－１－カルボン酸（ＡＣＣ）、活性酸素種、一酸化窒素、オキシリピン、およびフェノール類が含まれるが、これらに限定されない。特定の活性酸素種には、ヒドロキシル、過酸化水素、酸素、およびスーパーオキシドが含まれる。ストレス関連化合物を分解する酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、アミノシクロプロパン－１－カルボン酸デアミナーゼ、ペルオキシダーゼ、抗酸化酵素、または抗酸化ペプチドを含み得る。
植物のストレス抵抗性を増強するタンパク質またはペプチドは、環境ストレスから植物を保護するタンパク質またはペプチドを含むこともできる。環境ストレスは、例えば、乾燥、洪水、熱、凍結、塩、重金属、低ｐＨ、高ｐＨ、またはそれらの組合せを含み得る。例えば、環境ストレスから植物を保護するタンパク質またはペプチドは、氷核タンパク質、プロリナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、イソコリスミン酸シンターゼ、イソコリスミン酸ピルビン酸リアーゼ、またはコリンデヒドロゲナーゼを含み得る。
融合タンパク質は、標的配列および少なくとも植物結合タンパク質またはペプチドを含み得る。植物結合タンパク質またはペプチドは、植物の任意の部分（例えば、植物根、または葉、茎、花、または果実などの植物の空中部分）または植物物質に特異的または非特異的に結合し得る任意のタンパク質またはペプチドであり得る。したがって、例えば、植物結合タンパク質またはペプチドは、根結合タンパク質もしくはペプチド、または葉結合タンパク質もしくはペプチドであり得る。
組換えブレビバチルス、リシニバチルス、ビリディバチルスの内生胞子と融合タンパク質を発現する細胞
本明細書に記載される融合タンパク質は、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞（例えば、Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ． ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓまたはＶ． ａｒｖｉ細胞）によって発現され得る。融合タンパク質は、発現のために使用される選択された細菌属と適合性がある、すなわち、融合タンパク質が表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるＮ末端シグナルペプチドまたはこれら配列の断片または変異体であって、対応する細菌属においてエキソスポリウムターゲティング機能性を保持するものを含まなければならないという条件で、上述の融合タンパク質のいずれでもよい。組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、上述の融合タンパク質のいずれか２つ以上を共発現することができる。例えば、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、植物成長刺激タンパク質またはペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質、病原体から植物を保護するタンパク質またはペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質、または植物におけるストレス抵抗性を増強する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドとともに、植物結合タンパク質またはペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質を共発現することができる。
組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス細胞は、ブレビバチルス・アグリ（Ｂ． ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・アイジノグルエンシス（Ｂ． ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂ． ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ） ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂ． ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フルミニス（Ｂ． ｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモスス（Ｂ． ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・フルバス（Ｂ． ｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルス・ジンセンギソリ（Ｂ． ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂ． ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂ． ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・レビキイ（Ｂ． ｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂ． ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・マシリエンシス（Ｂ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ニトリフィカンス（Ｂ． ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルス・パナシフミ（Ｂ． ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂ． ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ． ｒｅｕｓｚｅｒｉ）またはブレビバチルス・セルモルバー（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）等のブレビバチルス細胞を含んでもよい。
組換えエキソスポリウム産生リシニバチルス細胞は、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、リシニバチルス・ボロニトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｏｎｉｔｏｌｅｒａｎｓ）、シリニバチルス・フシホルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、リシニバチルス・アセトフェノニ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｉ）、リシニバチルス・アルカリフィリス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、リシニバチルス・チュングクカンジ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｕｎｇｋｕｋｊａｎｇｉ）、 リシニバチルス・コンポスティ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、 リシニバチルス・コンタミナンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、リシニバチルス・クレソリボランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｅｓｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、リシニバチルス・マクロイデス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｉｄｅｓ）、リシニバチルス・マンガニカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇａｎｉｃｕｓ）、リシニバチルス・マンギフェリフミ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇｉｆｅｒｉｈｕｍｉ）、リシニバチルス・マシリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・メイエリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｙｅｒｉ）、リシニバチルス・オデッセイ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、リシニバチルス・パキスタネンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｋｉｓｔａｎｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・パルビボロニカピエンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒｖｉｂｏｒｏｎｉｃａｐｉｅｎｓ）、リシニバチルス・シンドリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｎｄｕｒｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・タバシホリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｂａｃｉｆｏｌｉｉ）、リシニバチルス・バリアンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、リシニバチルス・キシラニリティカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）またはリシニバチルス・ハロトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）等のリシニバチルス細胞を含んでもよい。
組換えビリディバチルスは、ビリディバチルス・アーヴァイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）、ビリディバチルス・アレノシ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅｎｏｓｉ）、またはビリディバチルス・ネイデイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｉｄｅｉ）等のビリディバチルス科メンバーを含んでもよい。
融合タンパク質を発現している組み換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を作製するために、業界で知られている標準方法（例えば、エレクトロポレーシン、または、該融合タンパク質をコードするベクターで形質転換された細胞との複合化）を用いていずれのブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細菌
を形質転換してもよい。その後、業界で知られている方法によって、細菌をスクリーニングして形質転換された細菌を同定することができる。例えば、上記ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含む場合には、抗生物質耐性について細菌をスクリーニングすることができる。或いは、融合タンパク質をコードするＤＮＡをブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の染色体ＤＮＡに導入することができる。組み換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞はその後、胞子形成を誘導する条件に晒される。胞子形成誘導に適した条件は当業界で知られている。例えば、組み換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、アガープレート上に置き、約３０℃で数日（例えば３日）インキュベートするか、あるいは、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍｕ中に培養することができる。
本明細書に開示されるいずれかの種の不活化株、非毒性株、または遺伝的に操作された株も適当に使用され得る。例えば、Ｂｉｎ毒素を欠くブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスを用いることができる。あるいは、または、これに加えて、融合タンパク質を発現する組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス種の胞子を一旦産生し、それらを不活化して、使用中にさらなる発芽を防ぐこともできる。当技術分野で知られている細菌胞子を不活性化するための任意の方法を使用することができる。適当な方法は、限定されるものではないが、熱処理、ガンマ線照射、Ｘ線照射、ＵＶ－Ａ照射、ＵＶ－Ｂ照射、化学処理（例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、過酸化水素、酢酸、ブリーチ、またはそれらの任意の組合せによる処理）、またはそれらの組合せを含む。代わりに、毒素非産生株または遺伝的または物理的に不活化された株に由来する芽胞を用いることもできる。
本開示による融合タンパク質構築物は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とするＮ末端シグナル配列またはその改変体または断片、およびＮ末端シグナル配列と異種であるポリペプチド配列を含む。選択態様では、Ｎ末端シグナル配列およびＮ末端シグナル配列と異種性であるポリペプチド配列を直接連結する。他の局面では、介在するリンカーまたはスペーサー配列が存在してもよい。さらなる局面において、切断配列または他の調節配列を、２つの領域の間に配置してもよい。Ｎ末端シグナル配列と異種性であるポリペプチド配列は、１つ以上の機能性タンパク質を含み得る。Ｎ末端シグナル配列に異種性であるポリペプチド配列中に複数の機能性タンパク質が含まれる局面において、少なくとも１つのスペーサー、切断配列または他の調節エレメントが、２つ以上の機能性タンパク質の間に位置してもよい。
Ｎ末端シグナル配列に異種性であるポリペプチド配列は、例えば、（ａ）植物成長刺激タンパク質またはペプチド； （ｂ）植物を病原菌から保護するタンパク質またはペプチド； （ｃ）植物のストレス耐性を増強するタンパク質またはペプチド； （ｄ）植物結合タンパク質またはペプチド； （ｅ）植物免疫系エンハンサータンパク質またはペプチド；または、（ｆ）栄養素の取り込みを増強するタンパク質またはペプチドであってもよい。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスで発現させると、これらの融合タンパク質は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウム層を標的とし、タンパク質またはペプチドが胞子の外側に表示されるように物理的に配向される。
これらのブレビバチルス、リシニバチルス、ビリディバチルスエキソスポリウムディスプレイシステムは、ペプチド、酵素、その他のタンパク質を植物（例えば、植物の葉、果実、花、茎、または根）または土壌などの植物成長培地に送達するために用いることができる。この方法で土壌または別の植物成長培地に送達されたペプチド、酵素、およびタンパク質は、長期間にわたって土壌中で存続し、活性を示す。本明細書に記載されている融合タンパク質を発現する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を土壌または植物の根圏に導入することは、多くの異なる土壌条件における植物成長の有益な増強につながる可能性がある。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスエキソスポリウムディスプレイシステムを用いて、これらの酵素を作り出すことにより、植物の一生の最初の数カ月間、および植物の生涯までのより長い期間にわたって、植物および根圏に対して有益な効果を発揮し続けることができる。
単離および／または精製された外生胞子およびその組成物
開示は、本明細書に記載される融合タンパク質構築物、および同構築物を含む組成物を発現するように改変された組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子から得られる単離および／または精製されたエキソスポリウムを提供する。選択された局面において、これらの組成物は、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスエキソスポリウムの基底層または毛様ナップ層のいずれかを含む。他のものでは、組成物は、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスエキソスポリウムの両方の層を含む。選択された局面において、組成物は、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスエキソスポリウム （例えば、特定の溶媒に可溶なエキソスポリウム成分を含む抽出物）の特定の画分または抽出物を含み得る。
他の選択された局面において、エキソスポリウム組成物は、さらに追加の成分（例えば、ここに開示されている植物成長促進化合物、農薬、または他の活性剤のいずれか）を含み得る。さらなる局面において、エキソスポリウム組成物を処理して、組成物中の生育不能なブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞および／または内生胞子を死滅させてもよい。選択された局面において、エキソスポリウム組成は、検出可能な量のブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞および／または内生胞子を含まない。選択された局面において、エキソスポリウム組成物は、より毒性または免疫原性でないエキソスポリウム組成物を産生するために、あるいは、エキソスポリウム組成物で処理されたか暴露され得る植物あるいは動物にとって十分に認容であるように、細菌毒素および／または免疫原性成分のレベルを除去または減少させるために処理される。
選択された局面において、エキソスポリウム組成物は、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子から収集された（例えば、超音波処理を用いる）実質的にインタクトなエキソスポリアを含む。あるいは、組成物は、加工された （例えば、すり上げ、流体中に懸濁される、など） 外生胞子を含み得る。別の局面において、エキソスポリウム組成物を溶媒中に溶解してもよい。いずれの場合も、組成物は、特定のサブコンポーネントまたは化合物が濃縮されるように処理され得る。例えば、エキソスポリウム組成物を処理して、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子から採取された粗エキソスポリウム中の量または組成と比較して、濃縮組成中に存在する組換え融合タンパク質の濃度または量を濃縮することができる。
選択された局面において、エキソスポリウム組成は、本明細書に記載される任意の局面に従って融合タンパク質を含む単離および／または精製されたブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスエキソスポリウムを含む。例えば、融合タンパク質は、本明細書に開示されるＮ末端標的配列、例えば、表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されるいずれかの配列を含む。
本明細書に開示されている融合タンパク質および／またはエキソスポリウム組成物は、目的のタンパク質を植物に送達するために使用され得る。選択された局面において、本明細書に記載される任意の局面による融合タンパク質またはエキソスポリウム組成物は、植物に直接適用され得る（例えば、粉末、懸濁液または溶液として、種子、または圃場に）。選択された局面において、融合タンパク質またはエキソスポリウム組成は、播種前または後、または代替的に、萌芽前または後（例えば、植栽前または植栽後、または出芽前または出芽後）に圃場に施用される。
別の局面において、本明細書に開示されている融合タンパク質および／またはエキソスポリウム組成物は、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を植物、種子、または野外に間接的に施用することによって、植物、種子、および／または野外に送達され得る。これらの局面において、融合タンパク質および／またはエキソスポリウム組成物は、（例えば野外において）組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞によって発現または生成され得、その結果、融合タンパク質が植物、種子、または野外に送達される。
植物成長促進効果および／または他の有益な特性を有する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス細胞
一部のブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細菌は、固有の有益な特性を有することが知られている。たとえば、植物の成長促進効果をもつ株もある。本明細書に記載されている融合タンパク質のいずれも、このような株において発現させることができる。
例えば、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスの植物成長促進株を含み得る。細菌の植物成長促進株は、殺虫性毒素（例えば、Ｂｉｎ毒素）を産生し、殺菌性化合物（例えば、β－１、３－グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組合せ）を産生し、殺線虫性化合物（例えば、Ｃｒｙ毒素）を産生し、殺菌性化合物を産生し、１以上の抗生物質に耐性であり、１以上の自由複製プラスミドを含み、植物根に結合し、植物根にコロニーを形成し、バイオフィルムを形成し、栄養を可溶化し、有機酸を分泌し、またはそれらの任意の組合せを含む細菌の株を含み得る。
生物防除剤
開示によって提供される組成物には、生物学的防除剤がさらに含まれ得る。生物学的防除剤は、特に、細菌、真菌または酵母、原虫、ウイルス、昆虫病原性線虫、接種剤および／またはそれぞれの株の全ての識別特性を有するそれらの突然変異体、および／または昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体に対して活性を示すそれぞれの株によって産生される少なくとも１つの代謝産物を含み得る。開示は、上述の組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子と、本明細書に記載されている特定の生物学的防除剤との組合せ、および／または本明細書に記載されている特定の菌株の突然変異体との組合せを提供する。ここで、突然変異体は、それぞれの菌株のすべての同定特性を有し、および／または昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体に対して活性を示す、または植物の成長を促進する、および／または植物の健康を増進する、それぞれの菌株によって産生される。開示によれば、本明細書に記載されている生物学的防除剤は、活性または休眠のような任意の生理学的状態において使用され、または使用され得る。
本開示による選択された組成
選択された局面において、開示は、（ａ）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスファミリーメンバーのエキソスポリウムに、目的の異種タンパク質を含む融合タンパク質を局在化する標的配列、および（ｂ）本明細書に開示されている少なくとも１つのさらなる異なる特定の生物学的防除剤、および／または相乗的に有効な量で昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体に対して活性を示す、それぞれの株によって産生される全ての同定特性を有する本明細書に開示されている微生物の特定の株の突然変異体、および／またはそれぞれの株によって産生される少なくとも１つの代謝産物を含む融合タンパク質を発現する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を含む組成物を提供する。別の局面において、組成物は、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、殺虫剤および殺菌剤が同一でないように、少なくとも１つの追加の殺菌剤および／または殺虫剤を含む。別の局面において、組成物は、植物および植物部分の全体的な損傷、ならびに昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体によって引き起こされる収穫された果物または野菜の損失を減少させるために使用される。別の局面において、組成物は、全体的な植物の健康を増加させる。
「植物の健康」という用語は、一般に、害虫の防除に結びつかない植物の様々な種類の改良を含む。例えば、出芽、作物収量、タンパク質含量、澱粉含量、より発達した根系、根の成長、改良された根系、根のサイズ維持、改良された根の成長、改善された根のサイズ維持、改善された根の有効性、ストレス耐性（例えば、乾燥、熱、塩、ＵＶ、水、冷）、減少したエチレン（生産および／または受容の阻害）、分げつ増加、草丈の増加、より大きい葉身、より少ない枯死基部の葉、より強い分げつ枝、緑色、色素含有量、光合成活性、必要とされない投入量（肥料または水など）、必要な種子の減少、より生産的な分げつ枝、より早い開花、より早い穀粒の成熟、より少ない植物の対立（倒伏）、シュートの成長の増加、植物の活力の増強、増加した植物の林分および早期のより良い発芽が含まれる。
開示によって提供される組成物をスクリーニングして、同じ環境条件下で栽培される植物を比較することによって、植物の成長、健康、または他の正の属性に対する潜在的な便益を同定することができ、それによって、前記植物の一部は本開示に従って組成物で処理され、前記植物の他の部分は本開示に従って組成物で処理されない。あるいは、前記他の部分は、全く処理されないか、または適当な対照（すなわち、全ての活性成分を含まない適用のような、本開示による組成物を含まない適用）、本明細書に記載される組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を含まない適用、または本明細書に開示されるさらなる特定の生物学的対照剤を含まない適用で処理される。
本開示による組成物は、種皮、土壌ドレンチ、および／または直接溝内および／または葉面スプレーの形態などの任意の所望の方法で適用され、出芽前、出芽後、またはその両方のいずれかに適用され得る。言い換えれば、該組成物は、種子、植物、または収穫された果実および野菜、または植物が成長している土壌、または植物が成長したい土壌（植物の成長場）に施用され得る。
植物および植物部分の全体的な損傷を減らすことは、しばしば、より健全な植物体および／または植物の活力および収量の増加をもたらす。好ましくは、本開示による組成物は、従来のまたはトランスジェニック植物またはその種子を処理するために使用される。
組換えブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルスを用いる方法
構築物及び組成物
本開示はまた、融合タンパク質および本明細書に記載されるさらなる特定の生物学的防除剤の少なくとも１つを発現する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を含む上述の組成物のいずれかを用いて植物成長を刺激するための方法に関する。植物成長を刺激する方法は、以下を含む融合タンパク質を発現する組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を含む組成物を、植物、種子、植物部分に適用することを含む。（１）異種タンパク質（例えば、少なくとも１つの植物成長刺激タンパク質）；および（２）標的配列；ならびに、本明細書に開示する少なくとも１つのさらなる特定の生物学的制御剤および／または相乗的に有効な量で昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体に対して活性を示すそれぞれの株によって産生される全ての同定特性を有する、本明細書に開示する微生物の特定株の突然変異体、および／またはそれぞれの株によって産生される少なくとも１つの代謝産物の突然変異体。
本発明の別の局面において、昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体によって引き起こされる植物および植物部分の全体的な損傷ならびに収穫された果物または野菜の損失を低減するための方法が提供され、これは、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に記載されている少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤を相乗的に有効な量で同時にまたは連続的に適用する工程を含む。
本方法の一実施形態において、組成物は、少なくとも１種の殺菌剤をさらに含む。一態様では、少なくとも１種の殺菌剤は合成殺菌剤である。別の実施形態では、殺虫剤に加えて、または殺菌剤の代わりに少なくとも１つの殺虫剤を含む。ただし、殺虫剤、殺菌剤、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に開示する特定の生物学的防除剤は同一ではない。
本開示の方法は、以下の適用方法、すなわち、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の両方を含み、本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤は、農業的に許容可能な有効期間を有する単一の安定した組成物（いわゆる「単独－製剤」）に処方されてもよく、または使用前または使用時に組み合わせられてもよい（いわゆる「併用－製剤」）。
他に言及されていない場合、「組合せ」という表現は、本明細書に開示されている組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の様々な組合せ、および任意に少なくとも１種の殺菌剤および／または少なくとも１種の殺虫剤を、「槽混合物」などのソロ配合剤から構成されている単一の「準備済みの混合物」形態で、特に、数時間または数日、例えば２時間から７日などの合理的に短期間のうちに、単一の活性成分の組合せで表す。本開示に従った組成物を適用する順序は、本開示の作業に必須ではない。したがって、用語「組合せ」はまた、例えば、組み換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞および本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物的防除剤、および任意選択で少なくとの１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤を植物またはその周囲の生息地もしくは貯蔵空間に同時にまたは連続して施用した後における、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的制御剤、および、任意に、少なくとも１種の殺菌剤および／または殺虫剤の、処理される植物の上またはその中、あるいはその周囲の生息地または貯蔵空間における存在を含む。
組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞と、本明細書に記載されている少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、および任意に少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤が使用されるか、または連続的な方法で使用される場合、植物または植物部分（種子から出芽する種子および植物を含む）、収穫された果実および野菜を、以下の方法に従って処理することが好ましい：第一に、少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤を植物または植物部分に適用し、第二に、ここに記載されているさらなる特定の生物学的防除剤および組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を、同じ植物または植物部分に適用する。このような適用方法により、収穫時の植物上の殺虫剤／殺菌剤の残留物の量は、可能な限り少ない。（作物）生育サイクル内での１回目の施用から２回目の施用までの期間は、変動する可能性があり、達成すべき効果に依存する。例えば、１回目の施用は、昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体の植物または植物部分への寄生を防止するため（特に種子を処理する場合）、または昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体の寄生と闘うため（特に植物および植物部分を処理する場合）、２回目の施用は、昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体の寄生を防止または制御するため、および／または植物生育を促進するために行われる。この状況での制御とは、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を含む組成物、および本明細書に開示する特定の生物学的制御剤は、害虫または植物病原性真菌を完全に駆除することはできないが、許容レベルで寄生を維持することができることを意味する。
本開示はまた、複数の応用による本開示の組成物の殺傷、阻害、予防および／または忌避活性を増強する方法を提供する。いくつかの他の実施形態において、本開示の組成物は、任意の所望の発育段階の間、または任意の所定の害虫圧力下で、約１時間、約５時間、約１０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、約３週間、約１ヵ月以上の間隔で、植物および／または植物部分に２回適用される。さらにいくつかの実施形態において、本開示の組成物は、任意の所望の発育段階中、または任意の所定の害虫圧力下において、約１時間、約５時間、約１０時間、約１０時間、約２４時間、約２時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、約３週間、約１ヵ月以上の間隔で、例えば２回以上、３回、４回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上、植物および植物部分に適用される。各塗布の間隔は、希望すれば変動する可能性がある。当業者は、植物種、植物病害虫種、および他の因子に依存して、間隔の適用時間および長さを決定することができるであろう。
上記の手順に従うことにより、処理された植物、植物部分、および収穫された果物および野菜上の少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤の非常に低いレベルの残留量を達成することができる。
特に明記しない場合、本開示に係る組成の植物または植物部分（種子および種子から出現する植物を含む）の処理は、直接的に、またはそれらの周囲、生息場所または貯蔵場所において、通常の処理方法、例えば浸漬、噴霧、霧状化、霧状化、潅漑、蒸発、粉塵、霧状化、放送、泡立て、塗装、塗装、延伸、散水（ドレンチング）、点滴潅漑を用いて実施される。さらに、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、本明細書に記載されている少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、および、任意に、超低容量法による単独－製剤または複合－製剤として少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤を施用すること、または組成物として、または単独－製剤として土壌中（溝内）に本開示に従って組成物を注入することが可能である。
「処理される植物」という用語は、その根系および物質－例えば土壌または栄養培地－を含む植物のすべての部分を包含し、これらは、それぞれ処理される植物の腐肉またはボルの周りの半径が少なくとも１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ、または処理される植物の根系の周りの少なくとも１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ、である。
組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の量は、少なくとも１種の殺菌剤および／または少なくとも１種の殺虫剤の存在下で、本明細書に記載されている少なくとも１種のさらなる特定の生物学的防除剤と組み合わせて使用または適用され、処理される植物、植物部分、種子、収穫した果物および野菜のサイズまたはタイプと同様に、最終製剤に依存する。通常、開示に従って使用または使用される組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、約１％～約８０％ （ｗ／ｗ）、好ましくは約１％～約６０％ （ｗ／ｗ）、より好ましくは、本明細書に記載される少なくとも１種のさらなる特定の生物学的防除剤、および／または少なくとも１種の殺虫剤との混合製剤の約１０％～約５０％ （ｗ／ｗ）に存在する。
また、任意に少なくとも１種の殺菌剤および／または少なくとも１種の殺虫剤の存在下で、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞と組み合わせて使用または適用される、本明細書に開示されている少なくとも１種のさらなる特定の生物学的防除剤の量は、処理される植物、植物部分、種子、収穫された果実または野菜のサイズまたはタイプと同様に、最終製剤に依存する。通常、本開示に従って使用または適用される、本明細書に記載されるさらなる特定の生物学的防除剤は、組換え体外膜産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および場合により少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤と、約０．１％～約８０％ （ｗ／ｗ）、好ましくは１％～約６０％ （ｗ／ｗ）、より好ましくは約１０％～約５０％ （ｗ／ｗ）で存在する。
組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の適用は、葉面散布、土壌処理、および／または種子処理／包帯として行うことができる。葉面処理として使用される場合、一実施形態では、１エーカー当たり約１／１６～約５ガロンの全ブロスが適用される。土壌処理として使用する場合、１実施形態において、１エーカーあたり約１～約５ガロンの全ブロスが塗布される。種子処理に用いる場合、１エーカー当たり１／３２～約１／４ガロンの全ブロスを施用する。種処理のために、最終用途の定式化は、少なくとも１×１０４、少なくとも１×１０５、少なくとも１×１０６、１×１０７、少なくとも１×１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも１×１０１０コロニー形成単位／グラムを含む。
比は、本明細書に開示されている少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤の量に基づいて、植物または植物部分への開示に従った組合せの前記成分の適用時点、および直前（例えば、４８時間、２４時間、１２時間、６時間、２時間、１時間）の組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の量、または植物または植物部分への開示に従った組合せの前記成分の適用時点で、計算することができる。
組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に開示する少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤の植物または植物部分への適用は、両成分が適用後に植物上または植物中に存在する限り、同時にまたは異なる時間で起こり得る。組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞および本明細書に開示されているさらなる特定の生物学的防除剤が異なる時期に適用され、本明細書に開示されているさらなる特定の生物学的防除剤が組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の前に適用される場合、当業者は、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を適用する時点またはその直前に、当業者が公知の化学分析によって、本明細書に開示されているさらなる特定の生物学的防除剤の植物上または植物内での濃度を決定することができる。同様に、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞を植物に最初に適用する場合、本明細書に開示されているさらなる特定の生物学的防除剤を適用する時点またはその直前に、当該技術分野においても知られている試験を用いて、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞の濃度を測定することができる。
本開示の別の態様では、上記のような組成物で処理された種子が提供される。植物の種子を処理することによる昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体の制御は長い間知られており、継続的改良の対象である。それにもかかわらず、種子の処理には、必ずしも満足な方法で解決できるとは限らない一連の問題が伴う。したがって、種子および発芽植物を保護する方法を開発することが望ましく、その方法は、植物の播種後または出芽後の貯蔵過程における作物保護組成物の追加配送の必要性を除去するか、または少なくとも著しく減少させる。さらに、昆虫、ダニ、線虫及び／又は植物病原体による攻撃から種子及び発芽植物に最良の可能な防御を提供するが、使用される活性成分によって植物自体に損傷を与えないように、使用される活性成分の量を最適化することが望ましい。特に、種子を処理する方法は、作物保護組成物を最小限に使用して種子と発芽植物の最適保護を達成するために、害虫抵抗性または害虫耐性のトランスジェニック植物の固有の殺虫および／または殺線虫特性も考慮すべきである。
従って、本開示は、特に、害虫による攻撃から植物の種子及び発芽を保護するための方法、上記のように定義される組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、又はビリディバチルス細胞、並びに本明細書に開示する特定の微生物の株から選択される少なくとも１つのさらなる生物学的防除剤、及び／又は開示の昆虫、ダニ、線虫及び／又は植物病原体、及び／又は任意に少なくとも１つの殺虫剤に対して活性を示すそれぞれの株によって産生される少なくとも１つの代謝産物を有する。害虫による攻撃から種子および発芽植物を保護するための開示の方法は、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に記載されている少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、および／または少なくとも１つの殺虫剤と同時に種子を処理する方法を包含する。また、種子を組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞および本明細書に開示されている少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、場合によっては少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で異なる時間で処理する方法を包含する。
開示はさらに、種子及び結果として生じる植物を昆虫、ダニ、線虫及び／又は植物病原体から保護する目的で種子を処理する方法を提供する。開示はまた、同時に組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に記載されている少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、および任意に少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で処理された種子に関する。開示は、組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、および任意に少なくとも１つの殺菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で異なる時間で処理された種子に関する。組換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞、および本明細書に開示する少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、および任意には少なくとも１つの殺菌剤、および／または殺虫剤で異なる時間で処理された種子の場合、開示の組成物中の個々の活性成分は、種子上の異なる層に存在してもよい。
さらに、本開示は、その組成物での処理に続いて、種子の粉塵擦過を防止するために、フィルムコーティング処理を施す種子に関する。
本開示の利点の１つは、開示の組成物の特定の全身的特性のために、これらの組成物による種子の処理は、種子自体だけでなく、種子に由来する植物に対しても、昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体からの保護を提供することである。このようにして、播種時やその直後に作物を直接処理する必要はないかもしれない。さらなる利点は、開示の組成を有する種子の処理を通して、処理種子の発芽および出芽が促進される可能性があるという事実に見られる。
開示の組成物は、農業、温室、林業又は園芸において使用される任意の品種の植物の種子を保護するのに適している。より詳細には、問題の種子は、穀類（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オート麦および粟粒）、トウモロコシ、綿、大豆、イネ、ジャガイモ、ひまわり、コーヒー、カノーラ、油性ナタネ、ビート（例えば、サトウダイコンおよび飼料ビート）、ピーナッツ、野菜（例えば、トマト、キュウリ、豆、ブラシカス、タマネギおよびレタス）、果実植物、ローンおよび観賞植物のものである。特に重要なのは、穀類（小麦、大麦、ライ麦、オート麦など）のトウモロコシ、大豆、綿、カノーラ、油料ナタネ、米などの種子である。
本開示の目的のために、開示の組成物は、単独で、または種子に適当な処方で適用される。種子は、その安定性が、処理の過程で損傷が生じないような状態で処理することが好ましい。一般的に言えば、種子は収穫から播種までのどの時点でも処理できる。典型的には、植物から分離され、穂軸、外皮、茎、外皮、毛または果肉を除去した種子が使用される。したがって、例えば、収穫され、洗浄され、１５重量％未満の含水率まで乾燥された種子を使用してもよい。あるいは、乾燥後に、例えば、水で処理され、次いで、再び乾燥された種子を使用することもできる。
種子を処理する場合には、一般的に言って、種子の発芽に悪影響を及ぼさないように、種子に施用する成分及び／又は他の添加物の量が選択されること、及び／又は種子から出てくる植物が損傷を受けないことを保証する必要がある。これは、特に、特定の施用速度で植物毒性作用を示す可能性のある活性成分についての場合である。
開示の組成物は、言い換えれば、さらなる成分を含むことなく、かつ希釈されることなく、直接適用することができる。原則として、種子に適当な製剤の形で適用することが望ましい。種子処理のための適切な製剤および方法は、当業者に知られており、例えば、以下の文書に記載されている：米国特許番号４，２７２，４１７ Ａ； ４，２４５，４３２ Ａ； ４，８０８，４３０ Ａ； ５，８７６，７３９ Ａ； 米国特許出願公開 Ｎｏ． ２００３／０１７６４２８ Ａ１；国際公開ＷＯ ２００２／０８０６７５ Ａ１； ＷＯ ２００２／０２８１８６ Ａ２、各内容は引用により本明細書に組み込まれている。
開示に従って使用することができる組合せは、溶液、エマルジョン、懸濁液、粉末、発泡体、スラリーまたは種子用の他のコーティング組成物、およびＵＬＶ製剤などの通常のシードドレッシング（種子被覆）製剤に変換することができる。これらの製剤は、既知の方法で組成を通常のアジュバント、例えば、通常の増量剤および溶剤または希釈剤、着色剤、湿剤、分散剤、乳化剤、消泡剤、保存剤、二次増粘剤、シール剤、ジベレリン、およびまた水と混合することによって調製される。本発明に従って使用することができるシードドレッシング配合物中に存在することができる着色剤は、そのような目的のために慣用的な全ての着色剤を含む。これに関連して、水に溶けにくい顔料だけでなく、水溶性染料を用いることも可能である。例としては、ローダミンＢ、Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド１１２、およびＣ．Ｉ．ソルベントレッド１という名称で知られている着色剤が挙げられる。
植物種または植物栽培品種によっては、それらの位置および生育条件（土壌、気候、植生期間、飼料）により、本開示に従って組成物を使用または適用することで、超相加的（「相乗的」）効果をもたらす可能性がある。したがって、例えば、開示に従った処理において本発明の組成物を使用または使用することによって、施用率の低下および／または施用範囲の拡大、活性スペクトルの拡大および／または向上した植物生長の増加、高温または低温に対する耐性の増大、干ばつまたは水または土壌塩分に対する耐性の増大、開花成績の向上、収穫の容易さ、成熟の促進、収穫高、果実の大型化、草丈の大型化、緑葉色、早期開花、収穫産物の高い品質および／または高い栄養価、果実内の高い糖濃度、収穫産物のより良好な貯蔵安定性および／または加工性が可能であり、これは実際に予想された効果を上回る可能性がある。
開示に従った治療における本発明の組成物の一定の適用率では、植物においても強化効果を有する可能性がある。望ましくない植物病原性真菌および／または微生物および／またはウイルスによる攻撃に対する植物の防御システムが動員される。植物強化（抵抗性誘導）物質は、本文において、望ましくない植物病原性真菌および／または微生物および／またはウイルスを後に接種すると、処理植物がこれらの植物病原性真菌および／または微生物および／またはウイルスに対してかなりの程度の抵抗性を示すような方法で、植物の防御システムを刺激することができる物質またはそれら物質の組合せを意味すると理解されるべきである。したがって、開示に従った処理において本開示に従った組成物を使用または適用することにより、処理後の一定期間内に前記病原体による攻撃から植物を防御することができる。保護作用が発揮される期間は、一般に、活性化合物で植物を処理した後、１～１０日、好ましくは１～７日に及ぶ。
本明細書に開示される組成物のいずれにも、１つ以上の農薬が含まれ得る。同様に、開示に従って組成物を適用する方法は、さらに、少なくとも１つの農薬を植物生育培地に導入すること、または少なくとも１つの農薬を植物または種子に適用することを含むことができる。
農薬は、肥料（例えば、液体肥料）、微量栄養素材料（ホウ酸、ホウ素フリット、硫酸銅フリット、銅キレート、四ホウ酸ナトリウム十水和物、硫酸鉄、酸化鉄アンモニウム、鉄フリット、硫酸マンガン、酸化マンガン、塩化マンガンフリット、モリブデン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、炭酸亜鉛フリット、リン酸亜鉛、キレート、またはそれらの組み合わせ）、殺虫剤（例えば、有機リン酸塩、カルバメート、ピレスロイド、フタル酸アルキル、ホウ酸、硫黄、芳香族置換尿素、炭化水素エステル、生物学的に基づく殺虫剤、またはそれらの組み合わせ、除草剤（例えば、クロロフェノキシ化合物、ニトロフェノール化合物）， ニトロクレゾール化合物、ジピリジル化合物、アセトアミド、脂肪酸、安息香酸誘導体、アニス酸誘導体、アニス酸誘導体、ベンゾチアジアジノンジオキシド、チオカルバメート、カルバニレート、クロロピリジニル、シクロヘキセノン誘導体、ジニトロトルイジン化合物、イソオキサゾリジン、イソプロピルアミン誘導体、オキサジアゾリノン、ホスフェート、フタレート、ピコリン酸化合物、トリアゾール、ウラシル、エンドタロール、塩素酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせ、殺菌剤（例えば、置換ベンゼン、チオカルバメート、エチレンビスジチオカルバメート）チオフタリダミド、銅化合物、有機水銀化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロヘキサミド、ドジン、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル、チアミメホン、トリホルイン、またはそれらの組み合わせ）、軟体動物駆除剤、植物成長改良剤、細菌接種剤（例えば、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種物、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種物、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種物、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種物、アロリゾビウム（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種物、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種物、クライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属の細菌接種物、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌接種物、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌接種物、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）属の細菌接種物、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌接種物、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌接種物、パエニバシルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌接種物、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属の細菌接種物、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌接種物、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の細菌接種物、バイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌接種物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の細菌接種物、グリコクラディウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）属の細菌接種物、グロムス（Ｇｌｏｍｕｓ）属の細菌接種物、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の細菌接種物、またはそれらの組み合わせ、真菌接種物（例えば、ブロムス（Ｇｌｏｍｅｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、クラロイドグロメラセアエ（Ｃｌａｒｏｉｄｏｇｌｏｍｅｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、ギガスポラ（Ｇｉｇａｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、アカウロスポラ（Ａｃａｕｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、サックロスポラ（Ｓａｃｃｕｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、エントロホスポラ（Ｅｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、パシドスポラ（Ｐａｃｉｄｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、ディバーシスポラ（Ｄｉｖｅｒｓｉｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、パラグロメラ（Ｐａｒａｇｌｏｍｅｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、アーケオスポラ（Ａｒｃｈａｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、ゲオシフォン（Ｇｅｏｓｉｐｈｏｎａｃｅａｅ）科の真菌接種物、アンビスポラ（Ａｍｂｉｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、スクテロスポラ（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、デンティスクルタタ（Ｄｅｎｔｉｓｃｕｌｔａｔａｃｅａｅ）科の真菌接種物、ラコセトラ（Ｒａｃｏｃｅｔｒａｃｅａｅ）科の真菌接種物、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門の真菌接種物、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門の真菌接種物、接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門の真菌接種物）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
肥料は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ポリ硫酸アンモニウム、無水アンモニウム、ポリ硫酸アンモニウム、カルシウム、硝酸アンモニウム、カルシウム、亜硝酸カルシウム、石灰石、カルシウムメソライト、ドロマイト石灰石、水和石灰石、炭酸カルシウム、二アンモニウム、リン酸モノアンモニウム、硝酸マグネシウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、マグネシウム石灰石、尿素、尿素－ホルムアルデヒド、硫黄被覆尿素、イソブチリデンジウレア、Ｋ２ ＳＯ４－（ＭｇＳＯ４）を含むことができる カナイト、エプソム塩、シルヴィナイト、魚粉、魚粕、血粉、リン酸岩、過リン酸塩、スラグ、骨粉、木灰、コウモリグアノ、ピートモス、堆肥、緑砂、綿実粕、カニ粕、魚乳剤， フミン酸、またはその組み合わせ。農薬は、本明細書に記載されるように、任意の殺菌剤、細菌接種剤、または除草剤を含み得る。胞子形成細菌は、単独で、または殺虫剤と組み合わせて、さらに、少なくとも１つの殺菌剤の有効量を含むことができる。
一般に「殺菌剤」とは、菌類の死亡率を上げたり、生育速度を阻害したりする物質であり、「菌類」または「菌類」とは、クロロフィルを欠く多種多様な有核胞子生物を含む。真菌の例には、酵母、カビ、カビ、サビ、およびキノコが含まれる。代表的な殺菌成分には、カプタン、フルジオキソニル、イプロジオン、テブコナゾール、チアベンダゾール、アゾキシストロビン、プロクロラズ、オキサジキシルも含まれる。開示に従った組成物、植物種子、または接種物は、任意の天然または合成殺菌剤、例えば、アルジモルフ、アンプロピルフォスカリウム、アンドプリム、アゾキシル、ベナキシル、ベノダニル、ベンザクリル、ビアラホス、ビフェニル、ビテルタノール、ビテルタノール、ボスカリジン－Ｓ、ブロムコナゾール、ブピリメート、ポリスルフィドカルシウム、カプタゾール、カルベンダジム、カルボン、キノメチオネート、クロルフェナゾール、クロロピクリン、クロゾリナート、クロザコニル、クフラネブ、シプロコナゾール、シプロフラムを含み得る ジクロブトラゾール、ジクロフェン、ジクロロフェン、ジメトロフェン、ジメトモルフィン、ジニコナゾール、ジコナゾール－Ｍ、ジニコナゾール、ジフェニルアミン、ジチアノン、ジデモルフォン、ドデモロン、ドラゾロン、エポキシコナゾール、エチモール、エトリジアゾール、ファモキサドン、フェナパニル、フェンブコナゾール、フェニトロパン、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸フェンチン、フェルバム、フルメタン、フルオロピラム、フルキンコナゾール、フルプリミドール， フルシラゾール、フルトリアフォール、フルトリアフォール、フォセチル－ナトリウム、フラミダゾール、フラメピリド、フラルコナゾール、フルコナゾール、フロナゾール－シス、フロメキサチン、ヘキサクロロベンゼン、ヘキサコナゾール、イマザリル、イミノクタジン、アルベシル酸イミノクタジン、イプロベンホス（ＩＢＰ）、イプロビオン、イソプロチオラン、イソバレジオン、ｋｒｅｓｏｘｉｍ－メチル、銅製剤：水酸化銅、オキシ塩化銅、酸化銅、オキシン－銅およびボルデアックス混合物、マンコゼブ、マネブ、メフェリムゾン メパニピリム、メプロニル、メタゾール、メタロキサム、メトメタロキサム、メトスルファミシン、ミルジオカルバミン酸、ニトロタル－イソプロピル、ヌアラセ、オキサジキシル、カルボキシコリン酸、オキシフェンチイン、パクロブトラゾール、ペンシクロン、ピマリシン、ピペラリン、ポリオキシン、プロベナゾール、プロキミドン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロチオシナゾール、ピリフェノクス ピリメタニル、ピロキロ、ピロキシフロン、キンコナゾール、硫黄剤、テブコナゾール、テクロフタラム、テトラコナゾール、テトラコナゾール、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チオフェン、チオフェン、チオファナート－メチル、チオキシミド、トルクロホス－メチル、トルリルフルアニド、トリアジメホン、トリアジメノール、トリアゾキシド、トリクラミド、トリシクラゾール、トリデモルフィン、トリフルキシストロビン、トリフルミゾール、トリフォルミゾール、トリフォルミゾール、トリフォルミゾール、ウニコナゾール、バリダマイシンＡ、バリダマイシンＡ、ビンクロゾリン、ビニコナゾール、ザリラミド、ジネブ、またはこれらの組合せ。殺菌剤はまた、置換ベンゼン、チオカルバメート、エチレンビスジチオカルバメート、チオフタリダミド、銅化合物、有機水銀化合物、有機スズ化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロヘキサミド、ドジン、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル、チアミメホン、トリホリン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。当業者は、農業目的で使用される他の既知の合成または天然に存在する殺菌剤も、開示に従って組成物、植物種子または接種材料に含めるために選択され得ることを容易に認識するであろう。
組成物、植物種子、または接種物が殺菌剤を含む場合、殺菌剤は葉面殺菌剤であり得る。葉面殺菌剤には、銅、マンコゼブ、ペンチオピラド、トリアゾール、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、テブコナゾール、キシストロビン、ピラクトビン、フルオキサストロビン、ピコキシストロビン、トリフロキシストロビン、イフロキシストロビン、硫黄、ボスカリド、チオファネートメチル、クロロタノニル、ペンチオピラド、ジフェンコナゾール、フルトリアフォール、シプロジニル、フルジアゾン、イプロジナム、ペンフルフェン、シアゾファミド、フルアゾファミド、シモキサニル、ジメトモルフ、ピリメタニル、ゾキサミド、マンジプロパミド、メトリナム、プロパモカルブ、フェナミド、テトラコナゾール、クロロナブ、ヒメキサゾール、トルクロホスおよびフェンブコナゾールが含まれる。当業者であれば、農業目的に使用される他の公知の合成又は自然発生の葉状菌類もまた、開示に従った組成物、植物種又は接種材料に含めるために選択することができることを容易に理解するであろう。
殺虫剤に係る成分、種子及び接種剤は、昆虫の死亡率を増加させる能力又は成長率を阻害する能力を有することを開示する。本明細書中で用いる「昆虫」という用語は、「昆虫」というクラスに属する全ての生物を含む。「成虫前の」昆虫という用語は、例えば、卵、幼虫、若虫を含む、成虫期前の任意の形態の生物を意味する。本明細書中で用いる「殺虫剤」および「殺虫剤」という用語は、「殺線虫剤」および「殺ダニ剤」および「殺ダニ剤」も包含する。「殺線虫剤」および「殺線虫剤」とは、線虫の死亡率を増加させる、または成長速度を阻害する物質の能力を意味する。一般に、「線虫」という用語は、前記生物の卵、幼虫、幼虫および成熟形態を含む。「殺ダニ剤」および「殺ダニ剤」という用語は、アラキダニ綱に属する外部寄生虫の死亡率を増加させる、または成長速度を阻害する物質の能力を意味する。
本開示の一態様によれば、少なくとも１つの殺虫剤は、（１）カルバメート、例えばアラニカルブ、ベンフラカルブ、ブトキシカルボキシム、カルボスルファン、エチオフェンカルブ、イソプロカルブ、メトルカルボキシル、ピリミカルブ、プロポキスル、チオファノクス、トリメタカルブ、ＸＭＣおよびキシリルカルブ；または有機リン酸塩、例えばアセフェート、アザメトホス－エチル、アジンホス－メチル、カドサホス、クロルフェンホス、クロルピリホス、クマホス、シアノホス、デメトン－Ｓ－メチル、ジアジノンを含む ジクロルボス／ＤＤＶＰ、ジメトホス、ジメチルビンホス、ジスルホン酸、フェニトロチオン、フェニトロチオン、ヘプテノホス、イソプロピルＯ－（メトキシアミノチオホスホリル）サリチル酸塩、マラチオン、メカルバム、メビンホス、ナレド、オメトエート、パラチオン－メチル、フェントエート、ホスメット、ホスファミドン、ホキシム、ピリミホス－メチル、プロフェノホス、プロペタムホス、プロチオホス、ピラクロホス、ピリダフェンチオン、キナルホス、スルホテップ、テブピリムホス、 テメホス、テルブホス、テトラクロルビンホス、チオメトン、トリクロルホン（２） 例えば、シクロジエン－有機塩素、例えばクロルデンおよび／またはフェニルピラゾールなどのＧＡＢＡ開口型塩素チャネルアンタゴニスト。（３） ナトリウムチャネルモジュレーター／電位依存性ナトリウムチャネル遮断薬、例えば、ピレトリン、アレトリン、ｄ－シス－アレトリン、ｄ－トランス－アレトリン、ビフェントリン、ビオアレトリン、ビオアレトリン－シクロペンテリン異性体、シハロトリン、ラムダ－シハロトリン、エンベントリン［（ＥＺ）－（ＩＲ）－異性体］、エスフェンプロエート、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フルシトリン、タウ－フルバリネート、ハルフェンプロックス、イミプロトリン、カデトリン、ペルメトリン、フェノトリン［（ｌＲ）－トランス－異性体］、プラレトリン、ピレスリン テフルトリン、テトラメトリン［（１Ｒ）－異性体］、トランスフルトリンまたはＤＤＴまたはメトキシクロル。（４） ニコチン作動性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）アゴニスト、例えば、ネオニコチノイド、例えば、ジノテフラン、ニテンピラム、およびチアメトキサムまたはニコチンまたはスルホキサフロール。（５） ニコチン作動性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のアロステリック活性化因子（例えば、スピノシン（ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ）、例えば、スピネトラム（ｓｐｉｎｅｔｏｒａｍ）およびスピノサド（ｓｐｉｎｏｓａｄ））。（６） 例えば、アバメクチン、安息香酸エマメクチン、レピメクチンおよびミルベメクチンなどのアベルメクチン／ミルベマイシンのような塩素チャンネル活性化剤。（７） 例えば、幼若ホルモン類似体、例えば、ヒドロプレン、キノプレンおよびメトプレンまたはフェノキシカルブまたはピリプロキシフェンのような幼若ホルモン模倣剤。（８） 例えばハロゲン化アルキル、例えば臭化メチルおよび他のハロゲン化アルキル；またはクロロピクリンもしくはフッ化スルフリルもしくはホウラックスもしくはタール催吐剤のような作用機序が未知または非特異的な活性化合物。（９） 選択的摂食阻害薬、例えば、ピメトロジンまたはフロニカミド。（１０） クロフェンテジン、ヘキシチアゾックス、ジフロビダジン、エトキサゾールなどのダニ成長阻害薬。（１１） 例えば、昆虫腸管膜の微生物破壊物質、例えば、バチルス・チューリンゲンシス亜種イスラエレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種アイザワイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ａｉｚａｗａｉ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスターキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｋｕｒｓｔａｋｉ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種テネブリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ） およびＢｔ植物タンパク質： ＣｒｙｌＡｂ、ＣｒｙｌＡｂ、ＣｒｙｌＡｃ、ＣｒｙｌＦａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ、Ｃｒｙ３４／３５Ａｂｌ。（１２） 酸化的リン酸化阻害剤、例えばジアフェンチウロンまたは有機スズ化合物、例えばアゾシクロチン、シヘキサチンおよびフェンブタチンオキシドまたはプロパルガイトまたはテトラジホンのようなＡＴＰ破壊剤。（１３） Ｈプロトン勾配を中断することによって作用する酸化的リン酸化脱カップリング剤、例えば、クロルフェナピル、ＤＮＯＣおよびスルフルラミド。（１４） 例えば、ベンスルタップ、コルタップ塩酸塩、チオシラム、およびチオスルタップ－ナトリウムのようなニコチン作動性アセチルコリン受容体アンタゴニスト。（１５） 例えば、ビストリフルロン、クロルフルアズロン、ジフルベンズロン、フルシクロクスロン、フルフェノクスロン、ヘキサフルムロン、ルフェヌロン、ノバルロン、ノビフルムロン、およびテフルベンズロンなどの０型キチン生合成阻害剤。（１６） キチン生合成阻害薬１型、例えばブプロフェジン。（１７） 例えばシロマジンのような脱皮阻害剤（特に双翅目、すなわち双翅目に対して）。（１８） 例えば、クロマフェノジド、ハロフェノジド、メトキシフェノジドおよびテブフェノジドのようなエクジソン受容体アゴニスト。（１９） オクトパミンエルゴニスト。（２０） 例えばヒドラメチルノンまたはアセキノシルまたはフルアクリピリムのような複合体－Ｉｌｌ電子伝達阻害薬。（２１） 例えばフェナザキン、フェンピロキシメート、ピリミジフェン、ピリダベン、テブフェンピラド及びトルフェンピラド又はロテノン（Ｄｅｒｒｉｓ）等のＭＥＴＩダニ駆除剤群由来の複合Ｉ電子伝達阻害剤。（２２） 電位依存性ナトリウムチャネル拮抗薬、例えばインドキサカルブまたはメタフルミゾン。（２３） アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤。（２４） 例えば、ホスフィン、例えば、リン化アルミニウム、リン化カルシウム、ホスフィンおよびリン化亜鉛またはシアン化物などの複合体－ＩＶ電子伝達阻害剤。（２５） たとえば、シエノピラフェンやシフルメトフェンのような複合ＩＩ型電子伝達阻害薬。（２６） リアノジン受容体エフェクター、例えば、ジアミド、例えば、商品名ＲＹＮＡＸＹＰＹＲ、およびシアントラニリプロールによっても知られるクロランチリプロール、または上記で同定された化合物またはクラスの化合物の１つ以上の組合せ。
農業目的で使用される他の既知の合成または天然の殺虫剤も、開示に従って組成物、植物種子または接種材料に含めるために選択され得ることを、当業者は容易に認識するであろう。
スクリーニング方法
本明細書に開示されている融合タンパク質構築物および組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、開示を通じて議論されているように、新規および／または改変された植物属性を生成する異種タンパク質のハイスループットスクリーニングのためのプラットフォームとして使用され得る。そのような特性には、植物の収量や油分／組成の変化、種子の炭水化物含量／組成の変化、種子油またはタンパク質組成の変化、環境または化学的ストレスに対する耐性の増大（例：寒さまたは暑さ、干ばつ、殺虫剤または除草剤）、老化の遅延、健康増進、草食動物の抵抗性、窒素固定または窒素利用の改善、根の構造または長さの改善、水利用効率の向上、種子の重さの増大、シュートの長さの増大、収量の増大、改変された穀粒量または湿度の含有量、金属耐性、光合成能力の向上、塩分耐性、活力の向上、成熟種子の乾燥および／または新鮮重の増大、植物当たりの成熟種子数の増加、クロロフィル含量の増加、参照植物／種子に対する代謝産物またはメタボロームにおける検出可能な修飾、または転写産物のレベルにおける検出可能な修飾 参照植物／種子に関連したトランスクリプトーム；参照植物に関連したタンパク質またはプロテオームにおける検出可能な変調；および上記のいずれかの形質または属性の組合せなど、商業的に重要な改善が含まれる。さらに、先のリストは、例の非限定的な組み合わせとして意図されている。当業者は、本明細書に開示されているハイスループット送達プラットフォームが、開示の他の場所で議論されている、または他の方法で当技術分野で知られている様々な他の植物形質および属性のスクリーニングに適していることを認識するであろう。
開示に従って融合タンパク質を発現するように改変された組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞によって産生された内生胞子は、インビトロで増殖された植物細胞、宿主植物の種子、実生、または栄養または他の方法で成熟した植物に適用され得る。異種タンパク質は、次に、形質を改変または付与し、またはインビトロで成長した植物細胞、宿主植物種子、実生または成熟植物に帰属し得る。実施態様において、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を用いて種子に接種することができ、得られた新しいまたは改変された形質または属性は直ちに明らかになり得るが、他の実施態様においては、それは宿主植物の発生の後期段階まで明らかにならないことがある。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質を送達するために使用されるブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細菌は、宿主植物種に外因性である。他のものでは、選択されたブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細菌は、宿主植物種にコロニー形成することが知られている内因性内部寄生菌である。宿主植物はここに開示されたいずれの適当な植物でもよい（単子葉植物、双子葉植物、針葉植物など）。
融合タンパク質を送達するために使用される組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細菌は、コーティングもしくはスプレー、または内生胞子を当技術分野で公知の宿主植物に適用する任意の他の方法によって、宿主植物の種子、実生、栄養または他の方法で成熟した植物標本を接種するために使用され得る。液体として、例えば溶液または懸濁液として適用する場合、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を混合するか、または水溶液中に懸濁することができる。適当な液体希釈剤または担体には、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体が含まれる。固体組成物は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を、ピート、小麦、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、珪藻土、フルラー土、低温殺菌土などの適切に分割された固体担体中および上に分散させることによって調製することができる。このような製剤が湿潤性粉末を含む場合、非イオン性、アニオン性、両性、またはカチオン性分散剤および乳化剤などの分散剤を使用することができる。
ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、宿主植物の種子の表面、または栄養植物の葉および茎に直接、または追加の成分を含む組成物の一部として直接適用され得る。追加の成分は、コロニー形成の速度を高める１つ以上の化合物、植物の成長または健康を増進する化合物、農薬もしくは除草剤、または植物の栽培および成長を促進するのに適しているとして本明細書に開示される任意の他の化合物を含み得る。さらに、この組成物は、異なるアミノ酸配列を含む融合タンパク質を発現するように改変された追加のブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を含み得る。例えば、組成物は、第１のブレビバチルス、リシニバチルス、または植物成長促進因子を含む融合タンパク質を発現するビリディバチルス内生胞子、ならびに第２のブレビバチルス、リシニバチルス、または農薬耐性を増強するタンパク質を含む融合タンパク質を発現するビリディバチルス内生胞子を含み得る。
選択態様において、宿主植物の種子上にコーティングされた組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、植物の異なる組織に局在化する栄養状態への種子の発芽時に可能である。例えば、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、根、不定根、精根、根毛、シュート、葉、花、芽、味、分裂組織、花粉、めしべ、卵巣、雄ずい、果実、ストロン、根茎、根粒、塊茎、毛穴、トリコーム、孔辺細胞、包葉、包葉、花弁、がく、枝肉、維管束形成層、師部、および木部を含む、植物中の組織のいずれか１つに局在化することができる。他の実施形態では、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、植物の根および／または根毛に局在化することができる。代替の実施態様において、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、光合成組織、例えば、植物の葉およびシュート；または植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化することができる。
他の実施態様において、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、又はビリディバチルス細胞は、植物の生殖組織（花、花粉、雌ずい、子房、雄ずい、果実）に局在化することができる。さらに別の実施形態では、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、植物の果実または種子組織にコロニー形成する。さらに別の実施形態では、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、植物の表面（例えば、植物の外部または葉圏）に存在するように植物にコロニー形成することができる。さらに他の実施形態において、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞は、植物の実質的に全て、または全ての組織に局在化することが可能である。
宿主植物への適用のために設計された組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を含む組成物は、種子被覆組成、根処理、または葉面散布組成を含み得る。種皮組成物、または根処理、または葉面適用組成物は、殺菌剤、抗菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、栄養素、またはそれらの組み合わせを含み得る。種皮組成物、または根処理、または葉面施用組成物は、農業的に許容される担体、粘着付与剤、微生物安定剤、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。選択された実施態様において、種皮組成、または根の処理、または葉面散布組成物は、限定されるわけではないが、根粒菌細菌調製物を含む第２の細菌を含むことができる。組成物はまた、界面活性剤を含有していてもよい。１つの実施形態において、界面活性剤は０．０１％ ｖ／ｖ～１０％ ｖ／ｖの濃度で存在する。別の実施形態では、界面活性剤は０．１％ ｖ／ｖ～１％ ｖ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、組成物は、微生物安定剤（例えば、安定剤）を含み得る。
接種に際して、処理された宿主植物（例えば、処理された種子、実生、栄養または他の方法で成熟した植物）を、新しいまたは改変された属性または形質の存在についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは治療後のどの時点でも実施可能である。選択された実施形態では、種子を処理してもよく、種子が発芽するか、またはより進行した発生段階に達するまでスクリーニングが行われないことがある。他の実施態様において、種子、実生または栄養植物は処理され、処理された植物が、新しいまたは改変された形質または属性についてスクリーニングされる試料を含み得る収穫された最終産物を生産するまで、スクリーニングが行われないことがある。
スクリーニングの間、処理された宿主植物にどのような利益が与えられるかを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で様々な試験を実施することができる。ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングアッセイには、植物または種子の表現形質または特性を測定する試験（例えば、植物の成長速度または高さを測定するアッセイ；作物の収量；熱、寒さ、または塩分などの環境ストレスに対する抵抗性；生物学的病原体または害虫に対する抵抗性；殺虫剤または除草剤などの化学処理に対する抵抗性）が含まれる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイには、植物抽出物、組織サンプル、細胞サンプルなどの組成または特性を測定するテストが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、インビトロスクリーニングは、処理された宿主植物の細胞または組織中に見出される所与のタンパク質、酵素、遺伝子転写産物、代謝産物または他の化合物の量または活性を精製および測定することを含むことができる。他の実施形態では、スクリーニングは、肉眼によるものであろうと顕微鏡によるものであろうと、処理された宿主植物の細胞または組織の構造の目視検査を含むことができる。
代替の実施態様において、スクリーニングは、処理された宿主植物に向けられたアッセイとは対照的に、本開示に従って融合タンパク質を発現するように改変された組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子または栄養細胞のアッセイを含み得る。これらの実施態様では、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス科メンバー細胞または内生胞子は、複合リン酸塩または複合鉄を遊離する能力（例えば、シデロフォアの分泌を通して）；植物ホルモンの産生；抗菌性、抗真菌性、または殺虫性化合物、または殺線虫性化合物の産生；および／またはＡＣＣデアミナーゼ、アセトイン、ペクチナーゼ、セルラーゼ、またはＲＮアーゼの産生および／または分泌などの１つ以上の活性のインビトロアッセイを受けることができる。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス科メンバー細胞または内生胞子に向けられたスクリーニング方法は、栄養植物よりも、そのような方法が、処理された宿主植物に向けられた方法よりも早く有用な異種タンパク質の検出を可能にするかもしれないという点で、特に有利である。
寄託情報
本発明のブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス株の試料は、ブダペスト条約のもとに、米国農務省農業研究局農業利用研究センター（ＮＲＲＬ）（１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｐｅｏｒｉａ， ＩＬ ６１６０４， 米国）にある農業研究サービス培養コレクションにおいて寄託されている。ブレビバチルスおよびリシニバチルス株ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６５、およびＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４は、いずれも２０１９年１０月１０日に寄託された。２０１９年１０月１７日にビリディバチルス ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６９株が寄託された。
ブレビバチルス株、リシニバチルス株、ビリディバチルス株は、特許および貿易局長により、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． § １．１４および３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１２２の下でそれに権利があると判断された株への本特許出願の期間中に培養へのアクセスが可能になることを保証する条件下で寄託されている。しかし、寄託の利用可能性は、政府の措置により付与された特許権の撤廃において、本発明を実施するための免許を構成するものではないことを理解すべきである。
本開示をさらに例示するために、以下の非限定的な例を提供する。
実施例
実施例１：組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を作製するための一般的プロトコル。
融合構築物を作製するために、１つ以上の異種性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本明細書に開示されているいずれかのＮ末端標的配列のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、例えば表１または図１から３（ブレビバチルスの場合）、表２または図４、５（リシニバチルスの場合）、表３または図６（ビリディバチルスの場合）に開示されたいずれかのアミノ酸配列またはそれぞれの細菌属において発現された場合にエキソスポリウム標的機能性を保持するその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドに融合させることができる。融合構築物は、開示されたＮ－末端標的配列の天然プロモーターの制御下にあり得る。このような構築物は、重複伸長（ＳＯＥ）技術または線状アンプリコンを生じるＧｉｂｓｏｎ集合によりスプライシングを用いて生成され得る。この段階で、プロトコルは、Ｎ末端標的配列をタグ（例えば、ＧＦＰ）のためのインフレームコード配列に融合させるか、またはＮ末端標的配列と異種タンパク質との間にリンカーまたはプロテアーゼ認識配列を挿入するように改変することもできる。任意のタグ、リンカー、および／またはプロテアーゼ認識配列が含まれているかどうかにかかわらず、次いで、正しいアンプリコンを選択して、適当なシャトルベクター（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ／ブレビバチルスについてのｐＨＰ１３）、およびＤＮＡ配列決定によってスクリーニングされた正しいベクター構築物にクローニングしてもよい。このベクター構築物は、形質転換されていないブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞にエレクトロポレーションされ得る。次に、正しい形質転換体を、胞子形成が起こるまで（典型的には２～３日）、適当な胞子形成培地（例えば、シェーファーの胞子形成培地液体培地にて３０℃で一晩培養）で増殖させてもよい。融合構築物を発現する胞子を収穫し、次いで、１つ以上のインビトロスクリーニングアッセイにかけてもよく、宿主植物または種子に直接適用するか、または宿主植物または種子に適用してもよく、その後、１つ以上のインビトロまたはインビボスクリーニングアッセイに供する。
実施例２：植物成長促進化合物の種子、実生、植物、または植物部分への生産に関与する融合タンパク質の送達のための組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用
植物成長促進化合物の生産に関与する酵素は、ここに開示されているブレビバチルス、リシニバチルス、およびビリディバチルス内生胞子送達システムを用いて植物に送達することができる。たとえば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼはアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する。２，３－ブタンジオールは植物成長促進化合物である。この酵素を発現するブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、種子処理または種子被覆として適用するか、または種子、実生、植物、または植物部分の周囲の領域に点滴またはスプレーにより送達することができる。
実施例３：単一のブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子上の１つ以上の融合タンパク質の種子、実生、植物、または植物部分への送達のための組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。
単一の組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を用いて、複数の異種融合タンパク質を提示することができる。これは２つ（あるいはそれ以上）の別々の融合タンパク質を構築することによって達成される。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子表面に提示される各異種タンパク質のコード配列を、その天然プロモーターの制御下でＮ末端標的配列に別々に融合させる。融合タンパク質構築物は、同じプラスミドベクターまたは異なるプラスミドベクターのいずれかにクローン化され、エレクトロポレーションによってブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス細胞に導入され得る。得られたブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、次いで、両異種タンパク質の混合物を胞子表面に発現するであろう。このことは、害虫抵抗性を緩和するために、複数のタンパク質性無脊椎動物毒素を積み重ねるのに特に有用である。
実施例４：組合せにおける複数の組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。それぞれ、種子、実生、植物、または植物部分に１つ以上の異なる融合タンパク質を表示する。
ある場合には、各々１つ以上の（上記のような）異なる異種タンパク質を発現する組合せでの２つ以上のブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の送達が提供される。たとえば、窒素固定酵素を植物の根の周囲に運ぶと、化学窒素肥料の必要性が減る。細菌における窒素固定には、最低でも８～９種類の酵素が必要であり、種によっては２０種類以上の異なる酵素が必要になる場合がある。ここでは、窒素固定経路の異なる酵素成分をそれぞれ発現するブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の組合せの送達が有用であろう。例えば、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、およびＮｉｆＫを異種表示するブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、およびＮｉｆＤを異種表示するビリディバチルス内生胞子と混合して、根の周囲の領域に送達することができる。
実施例５：無脊椎動物の植物害虫を殺す無脊椎動物の毒素を種子、実生、植物、もしくは植物の一部の周囲に送達するための、または種子処理としての組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。
ここに開示するブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子系を用いて、昆虫または線虫を含むがこれらに限定されない無脊椎動物に対して拮抗的なタンパク質性毒素を送達することができる。例えば、殺虫性および殺線虫性のＣｒｙ５ＢおよびＣｒｙ２１Ａを含むＣｒｙ毒素を、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子における発現のためにＮ末端標的配列に融合させることができる。Ｃｒｙ毒素または他の蛋白性無脊椎動物毒素を発現するブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、種子処理または種子被覆として適用するか、無脊椎動物の植物病原体に対する防御のために滴下またはスプレーにより種子、実生、植物、または植物部分の周辺領域に送達することができる。
実施例６：種子、種子、植物、または植物の一部を囲む領域または種子処理としての細菌性植物害虫に向けたペプチド、タンパク質、または酵素の送達のためのブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。
バクテリオシンは細菌によって産生される小さなペプチドで、他の細菌に対して拮抗活性をもつ。バクテリオシンは、大きな非リボソームペプチドシンテターゼによって合成される他の抗菌分子（例えば、バシトラシン）とは対照的にリボソームで合成されるため、バクテリオシンは、ブレビバチルス内生胞子系を用いるデリバリーに特によく適している。１つ以上のバクテリオシンのコード配列を、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子における発現のためのＮ末端標的配列に融合させることができる。バクテリオシンを発現するブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、種子処理または種子被覆として適用されるか、細菌性植物病原体に対する防御のために滴下またはスプレーにより種子、実生、植物、または植物部分の周囲の領域に送達され得る。
実施例７：植物に被害を及ぼす真菌に対して拮抗するペプチド、タンパク質または酵素を、種子、実勢、植物もしくは植物の一部の周囲に送達するための、または種子処理としてのブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。
真菌類の一次細胞壁成分はキチンである。キチナーゼはキチンを分解する酵素であり、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の表面に発現させて、それらの細胞壁を破壊することによって真菌性植物病原体から保護することができる。キチナーゼを発現するブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、種子処理または種子被覆として適用するか、または種子、実生、植物、または植物部分の周囲の領域に滴下またはスプレーにより送達することができる。
実施例８： 細菌、菌類、または植物栄養源を分解または改変する酵素を、種子、実勢、植物もしくは植物の一部の周囲に送達するための、または種子処理としてのブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。
細菌、真菌、または植物の栄養源の分解または改変の原因となる酵素を、組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を用いて植物に送達することができる。例えば、複合多糖類を分解するグリコシドヒドロラーゼは、目的とするこの酵素（または他の酵素）を発現する組換えブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子で植物または種子を処理することにより、有用な根粒菌に利用可能な単純な糖を作るために使用することができる。
実施例９：植物成長促進生物防除剤に由来するゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる植物成長促進生物防除剤に対する応答を評価するためのブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。
今日用いられているバイオコントロール株の多くは、外因性ＤＮＡ取り込みに対して不耐性であるため、研究者は当該株の標的遺伝子改変を生成することができない。この課題のため、これらの生物防除株の植物成長促進効果の作用機序を解明することは信じられないほど困難である。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、バイオコントロール株の根底にある植物成長促進効果に関与する特異的遺伝子を同定するための新規アプローチを提示する。第一に、Ｎ末端標的配列および天然プロモーターを、適当なシャトルベクター（例えば、ブレビバチルスについてはｐＨＰ１３）にクローン化し、その結果、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子上での異種タンパク質発現に適したベクターを生じる。すべてのクローニング段階とプラスミドの増殖は大腸菌で行われる。次に、標的植物成長促進バイオコントロール株から全ｇＤＮＡを抽出する。ｇＤＮＡを（酵素的にまたはソニックにより）断片にせん断し、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子上の異種タンパク質の発現のために上記ベクターにライゲーションして、目的の生物防除株に由来するすべての遺伝物質を含むｇＤＮＡライブラリーを生成する。得られたベクターライブラリーを、エレクトロポレーションによってブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスメンバーに導入し、そして細菌を適切な抗生物質選択剤を含む寒天プレート上に平板培養して、成功した形質転換体を選択する。標的バイオコントロール株のｇＤＮＡの異なる断片をそれぞれ発現する個々の形質転換体について、植物成長促進効果を評価する。これらの作用には、緑化の強化、発芽の改善、植物の活力の増加、根長の増加、根量の増加、草丈の増加、葉面積の増加、または害虫に対する抵抗性が含まれるが、これらに限定されない。上記の植物健康パラメータを調節することが見出されたブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子形質転換体におけるベクターを配列決定し、観察された植物成長促進効果の原因となる生物防除株に由来する遺伝的決定因子を同定することができる。
実施例１０：植物無脊椎動物、細菌、および真菌植物病原体に対して拮抗的な新規毒素または特徴付けられていない毒素を同定するためのブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子の使用。
今日用いられているバイオコントロール株の多くは、外因性ＤＮＡ取り込みに対して不耐性であるため、研究者は当該株の標的遺伝子改変を生成することができない。この課題のため、バイオコントロール株が無脊椎動物、細菌、および真菌の植物病原体に対して毒性を示す作用機序の解明は、信じられないほど困難である。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、バイオコントロール株の根底にある植物防御効果に関与する特異的遺伝子を同定するための新規アプローチを提示する。第一に、Ｎ末端標的配列および天然プロモーターを、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子上での異種タンパク質発現に適したベクターをもたらす適切なシャトルベクター（例えば、ブレビバチルスについてはｐＨＰ１３）中にクローン化する。すべてのクローニング段階とプラスミドの増殖は大腸菌で行われる。次に、標的植物成長促進バイオコントロール株から全ｇＤＮＡを抽出する。ｇＤＮＡを （酵素的にまたはソニックによって）断片にせん断し、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子上の異種タンパク質の発現のために上記ベクターにライゲーションして、目的の生物防除株に由来するすべての遺伝物質を含むｇＤＮＡライブラリーを生成する。得られたベクターライブラリーを、エレクトロポレーションによってブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスメンバーに導入し、そして細菌を適切な抗生物質選択剤を含む寒天プレート上に平板培養して、成功した形質転換体を選択する。対象バイオコントロール株のｇＤＮＡの異なる断片をそれぞれ発現する個々の形質転換体について、無脊椎動物、細菌、および真菌の植物病原体に対するアンタゴニスト活性を評価する。上記の植物病原体に対してアンタゴニストであることがわかっているブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス形質転換体におけるベクターを配列決定し、観察された植物保護作用の原因となるバイオコントロール株に由来する遺伝的決定因子を同定することができる。
実施例１１：植物の健康を改善するための種子、実生、植物、または植物部分への処理としての、ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子由来の精製エキソスポリウムの使用。
生存可能なブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子なしでここに開示されたブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子システムを用いて、植物健康促進タンパク質／酵素を送達する必要があり得る。その目的のために、 （例えば、ここに開示されているＮ末端標的配列を用いて異種タンパク質を生成するように改変された細胞により産生される）ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子由来の外生胞子を、超音波処理を介してブレビバチルス内生胞子から取り出すことができる。取り出した外生胞子はろ過によりさらに精製される。得られた精製エキソスポリウムは、種子処理または種子被覆として適用することができ、または滴下またはスプレーにより種子、実生、植物、または植物部分の周辺領域に送達することができる。
実施例１２：病原体から植物を保護したり、植物の健康を改善する目的で、種子、実生、植物、または植物部分への処理としての生育不能なブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルスの内生胞子の使用。
ここに開示されたブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子送達システムを用いて、生育不能な（死んだ）ブレビバチルス内生胞子とともに、植物健康促進タンパク質／酵素または植物保護タンパク質／酵素を送達する必要があるかもしれない。ブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子を不活化し、十分な熱処理、紫外線、ガンマ線照射、または高圧処理を介して非生存状態にすることができる。得られた生育不能なブレビバチルス、リシニバチルス、またはビリディバチルス内生胞子は、種子処理または種子被覆として適用するか、または種子、実生、植物、または植物部分の周囲の領域に滴下またはスプレーにより送達することができる。
実施例１３：タンデムダイマートマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）を示す組換えブレビバチルス内生胞子を調製するための一般的プロトコル。
バイオインフォマティクス解析により、ブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ‐６７８６５の完全ゲノムにおいてコラーゲン様ＧＸＸ反復を含むＯＲＦを検索した。コラーゲン様反復配列を含むＯＲＦからの配列をまとめ、コラーゲン様反復配列から上流にＮ末端アミノ酸のみを生じるようにトリミングした。この一般的なプロトコルを用いて、表１および図１から３に開示されているＮ末端標的配列を有する内在性ブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６５蛋白質を同定した。例えば、このアプローチを用いて、配列番号３によって表されるＮ－末端標的配列を同定したが、これは、ＣＬＲ反復ドメイン（配列番号： ２２０）の直接上流にあり、配列番号： ２２１によってコードされる天然プロモーターの制御下にあることがわかった。
Figure 2022507370000016
融合構築物を作製するために、ｔｄＴｏｍａｔｏをコードする遺伝子を、開示されたＮ末端標的配列の天然プロモーターの制御下にあるブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６５の開示されたＮ末端標的配列（配列番号３）のアミノ酸をコードするＤＮＡセグメントに遺伝子合成によって融合させ、Ｅ． ｃｏｌｉ／ブレビバチルスシャトルベクター、ｐＡＰ１３にクローン化した。得られたベクター構築物を、Ｈｕａｎｇら（２０１０）（“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ ｂｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ，” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６１：４０１－４０６， ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２８４－０１０－９６２７－０）によって記載されたものと同様のエレクトロポレーションによってブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ‐６７８６５に導入した。次に、正しい形質転換体を、グルコースベースのブロス培地で、胞子形成まで３０℃で増殖させた。次に融合構築物を発現するブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６５胞子を落射蛍光顕微鏡で調べた。ＴｄＴｏｍａｔｏは融合構築物を発現する胞子上に見える（図７Ａ）。ブレビバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６５胞子もフローサイトメトリーによって調べた。融合構築物を発現する胞子は、野生型胞子よりも有意に蛍光性が高い（図７Ｂ）。
実施例１４：タンデムダイマートマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）を表示する組換えリシニバチルス内生胞子を作製するための一般的プロトコル。
バイオインフォマティクス解析により、リシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ‐６７８６４の完全ゲノムについてコラーゲン様ＧＸＸ反復を含むＯＲＦを探索した。コラーゲン様反復配列を含むＯＲＦからの配列をまとめ、コラーゲン様反復配列から上流にＮ末端アミノ酸のみを生じるようにトリミングした。この一般的なプロトコルを用いて、表２および図４、５に開示されているＮ末端標的配列を有する内在性リシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４蛋白質を同定した。例えば、このアプローチを用いて、配列番号４３によって表されるＮ－末端標的配列を同定したが、これは、ＣＬＲ反復ドメイン（配列番号：２２２であり、且つ、配列番号： ２２３によってコードされる天然プロモーターの制御下にある）の直接上流にあることが判明した。
Figure 2022507370000017
融合構築物を作製するために、ｔｄＴｏｍａｔｏをコードする遺伝子を、開示されたＮ末端標的配列の天然プロモーターの制御下にあるリシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４の開示されたＮ末端標的配列（配列番号４３）のアミノ酸をコードするＤＮＡセグメントに遺伝子合成によって融合させ、Ｅ． ｃｏｌｉ／リシニバチルスシャトルベクター、ｐＡＰ１３にクローン化した。得られたベクター構築物を、ＴａｙｌｏｒおよびＢｕｒｋｅ （１９９０）（“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｉｃ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｖｏｌｔａｇｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，” ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ６６：１２５－１２８， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１５７４－６９６８．１９９０．ｔｂ０３９８３．ｘ）によって記載されたものと同様のエレクトロポレーションによってリシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４に導入した。次に、正しい形質転換体を、グルコースベースのブロス培地で、胞子形成まで３０℃で増殖させた。次に融合構築物を発現するリシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４胞子を落射蛍光顕微鏡で調べた。ＴｄＴｏｍａｔｏは融合構築物を発現する胞子上に見える（図８Ａ）。リシニバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６４胞子もフローサイトメトリーによって調べた。融合構築物を発現する胞子は、野生型胞子よりも有意に蛍光性が高い（図８Ｂ）。
実施例１５：タンデム－ダイマートマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）を示す組換えビリディバチルス内生胞子を調製するための一般的プロトコール
実施例１３および１４に記載されたアプローチを用いて、ビリディバチルス中のＮ－末端標的配列を同定した。このアプローチは、ＣＬＲリピートドメイン（配列番号２２４であり、且つ、配列番号２２５によってコードされる天然プロモーターの制御下にある）の直接上流にあることが見出された、配列番号１９７に代表されるＮ－末端標的配列の同定につながった。
Figure 2022507370000018
融合構築物を作製するために、ｔｄＴｏｍａｔｏをコードする遺伝子を、開示されたＮ末端標的配列の天然プロモーターの制御下にあるビリディバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６９の開示されたＮ末端標的配列（配列番号： １９７）のアミノ酸をコードするＤＮＡセグメントに遺伝子合成によって融合させ、Ｅ． ｃｏｌｉ／ビリディバチルスシャトルベクター、ｐＡＰ１３にクローン化した。得られたベクター構築物は、Ｚｈａｎｇら（２０１５）（“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｔｕｒｉｎ Ａ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＺＫ，” Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６：７３３４－７３５１， ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１６０４７３３４）で記載されているのと同様に、ＬＢＳＰ培地を用いたエレクトロポレーション、アンピシリン処理、およびＴＳＭＭＫＫ緩衝液による洗浄により、ビリディバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６９に導入された。次に、正しい形質転換体を、グルコースベースのブロス培地で、胞子形成まで３０℃で増殖させた。次に融合構築物を発現するビリディバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６９胞子を落射蛍光顕微鏡で調べた。ＴｄＴｏｍａｔｏは融合構築物を発現する胞子上に見える（図９Ａ）。ビリディバチルス ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－６７８６９胞子もフローサイトメトリーによって調べた。融合構築物を発現する胞子は、野生型胞子よりも有意に蛍光性が高い（図９Ｂ）。

Claims (108)

  1. 融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該核酸分子は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み、該ポリヌクレオチド配列は、（ｂ）該Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と機能的に連結されており、該第１のポリヌクレオチド配列は、
    （ｉ）配列番号１から３８のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列または表１もしくは図１から３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するか、または
    （ｉｉ）表１または図１から３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０または１５０、２１０、２７０、３３０、３９０または４５０連続ヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチド配列
    を含み、該Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）内生胞子のエキソスポリウムに標的化し得ることを特徴とする、前記核酸分子。
  2. 該断片が、
    （ａ）表１または図１から３に示されるいずれかのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の第１のヌクレオチド、または
    （ｂ）表１または図１から３に示されるいずれかのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の最後のヌクレオチド
    を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 第１のポリヌクレオチド配列が、表１または図１から３に示すいずれかのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 断片が、表１または図１から３に示すいずれか１つのアミノ酸配列のアミノ酸１－５、１－１０、１－１５、１－２０、１－２５、１－３０、１－３５、１－４０または１－４５、１－５０、１－７５、１－１００、１－１２５または１－１５０をコードする、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが、
    （ａ）植物成長刺激タンパク質、
    （ｂ）酵素、
    （ｃ）タンパク質、
    （ｄ）ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に対して異種性であるポリペプチド、
    （ｅ）治療性タンパク質、または
    （ｆ）植物免疫刺激タンパク質
    を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. （ａ）１以上のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド、但し、該ポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性であるポリペプチドの間に位置している、
    （ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド、
    （ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド、
    （ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド、または
    （ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドを連結する柔軟なリンカー要素を含むポリペプチド
    をコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. ブレビバチルス内生胞子が、ブレビバチルス・アグリ（Ｂ． ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・アイジノグルエンシス（Ｂ． ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂ． ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ） ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂ． ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フルミニス（Ｂ． ｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモスス（Ｂ． ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・フルバス（Ｂ． ｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルス・ジンセンギソリ（Ｂ． ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂ． ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂ． ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・レビキイ（Ｂ． ｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂ． ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・マシリエンシス（Ｂ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ニトリフィカンス（Ｂ． ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルス・パナシフミ（Ｂ． ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂ． ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ． ｒｅｕｓｚｅｒｉ）またはブレビバチルス・セルモルバー（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）を含むブレビバチスル種によって形成される内生胞子またはブレビバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌によって形成された内生胞子である、請求項１から６のいずれか一項に記載された核酸分子。
  8. 第２のポリヌクレオチド配列およびブレビバチルスの少なくとも１つに対して異種性であるプロモーター要素と機能的に連結している、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 第１のポリヌクレオチド配列が、表１または図１から３に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含み、該コドン最適化ポリヌクレオチド配列が、ブレビバチルス内生胞子内において、表１または図１から３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列に比較して、同一条件下で、より高率または高レベルで発現している、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸配列。
  10. Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドと連結している該Ｎ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質であって、該Ｎ末端シグナルペプチドが、
    （ａ）配列番号１から６のいずれか１つまたは表１または図１から３に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
    （ｂ）配列番号１から３８のいずれか１つのアミノ酸配列または表１もしくは図１から３に示すアミノ酸配列からの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５または１５０連続アミノ酸の断片を含むポリペプチド
    を含み、Ｎ末端シグナルペプチドが、融合タンパク質をブラビバチルス内生胞子へ標的化することができる、前記融合タンパク質。
  11. 断片が、
    （ａ）配列番号１から３８のいずれか１つまたは表１または図１から３に示すアミノ酸配列の第１のアミノ酸、または
    （ｂ）配列番号１から３８のいずれか１つまたは表１または図１から３に示すアミノ酸配列の最後のアミノ酸
    を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. ポリペプチド配列が、配列番号１から３８のいずれか１つのアミノ酸配列または表１もしくは図１から３に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質。
  13. 断片が、配列番号１から３８のいずれか１つまたは表１または図１から３に示すアミノ酸配列のアミノ酸１－５、１－１０、１－１５、１－２０、１－２５、１－３０、１－３５、１－４０、１－４５、１－５０、１－７５、１－１００、１－１２５または１－１５０を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが、
    （ａ）植物成長刺激タンパク質、
    （ｂ）酵素、
    （ｃ）タンパク質、
    （ｄ）ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に対して異種性であるポリペプチド、
    （ｅ）治療性タンパク質、または
    （ｆ）植物免疫刺激タンパク質
    を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  15. （ａ）１以上のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド、但し、該ポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性であるポリペプチドの間に位置している、
    （ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド、
    （ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド、
    （ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド、または
    （ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドを連結する柔軟なリンカー要素を含むポリペプチド
    をさらに含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. ブレビバチルス内生胞子が、ブレビバチルス・アグリ（Ｂ． ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・アイジノグルエンシス（Ｂ． ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂ． ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ） ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂ． ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フルミニス（Ｂ． ｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモスス（Ｂ． ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・フルバス（Ｂ． ｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルス・ジンセンギソリ（Ｂ． ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂ． ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂ． ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・レビキイ（Ｂ． ｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂ． ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・マシリエンシス（Ｂ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ニトリフィカンス（Ｂ． ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルス・パナシフミ（Ｂ． ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂ． ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ． ｒｅｕｓｚｅｒｉ）またはブレビバチルス・セルモルバー（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）を含むブレビバチルス種によって形成される内生胞子またはブレビバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌によって形成された内生胞子である、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む細菌染色体を含む組み換えブレビバチルス細胞。
  18. 請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターであって、プラスミド、人工染色体またはウイルスベクターを含むベクター。
  19. 以下の少なくとも１つをさらに含む、請求項１８に記載のベクター：
    （ａ）ブレビバチルス細胞において安定した維持を提供する複製起点、
    （ｂ）ブレビバチルス細胞において選択的に不安定な維持を提供する複製起点、
    （ｃ）ブレビバチルス細胞において選択的に不安定な維持を提供する温度感受性複製起点、
    （ｄ）発現制御配列に機能的に連結された、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、または
    （ｅ）発現制御配列に機能的に連結された、植物成長刺激タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  20. 請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターで形質転換された組み換えブレビバチルス細胞。
  21. ブレビバチルス細胞が、ブレビバチルス・アグリ（Ｂ． ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・アイジノグルエンシス（Ｂ． ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂ． ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂ． ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ） ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂ． ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フルミニス（Ｂ． ｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモスス（Ｂ． ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・フルバス（Ｂ． ｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルス・ジンセンギソリ（Ｂ． ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂ． ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂ． ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・レビキイ（Ｂ． ｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂ． ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・マシリエンシス（Ｂ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ニトリフィカンス（Ｂ． ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルス・パナシフミ（Ｂ． ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂ． ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂ． ｒｅｕｓｚｅｒｉ）もしくはブレビバチルス・セルモルバー（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）またはブレビバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌である、請求項２０に記載の組み換えブレビバチルス細胞。
  22. ブレビバチルス内生胞子のエキソスポリウム上に異種融合タンパク質を表示する方法であって、
    （ａ）請求項１から９のいずれか一項に核酸分子を含む組み換えベクターで胞子形成なブレビバチルス細胞を形質転換すること、および
    （ｂ）請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子にコードされる融合タンパク質を、該融合タンパク質が胞子形成によって得られるブレビバチルス内生胞子のエキソスポリウムに標的化されるような胞子形成条件下で発現すること
    を含み、Ｎ末端シグナルペプチドが、
    （ｉ）配列番号１から３８のいずれかによって示されるアミノ酸配列または表１もしくは図１から３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％または８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、
    （ｉｉ）配列番号１から３８のいずれか１つのアミノ酸配列または表１または図１から３に示されるアミノ酸配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５または１５０連続アミノ酸の断片を含むことを特徴とする、前記方法。
  23. （ａ）請求項１０から１６のいずれか一項に記載に融合タンパク質を発現する１以上の組み換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス細胞、および、（ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を任意に相乗的有効量で含む組成物。
  24. 請求項１から９のいずれか一項の核酸、請求項１０から１６のいずれか一項の融合タンパク質、請求項２０または２１の組み換え細菌細胞または請求項２３の組成物で処理した種子。
  25. 植物、種子、植物の部分または植物の周囲の土壌を処理して植物成長を増強し、および／または、植物健康を促進する方法であって、
    （ａ）請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する組み換えエキソスポリウム産生ブレビバチスル内生胞子、但し、Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが植物成長または免疫刺激タンパク質を含んでいる、および
    （ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤
    を任意に相乗有効量で、同時に、または、順次に適用することを含む前記方法。
  26. 組み換えブレビバチルス内生胞子で処理した宿主植物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されたブレビバチルス内生胞子を含む組成物を、ブレビバチルスによって永久的または一時的にコロニー形成されることができる種、実生、または栄養植物に適用して、処理された種、実生または栄養植物を産生する工程、および
    （ｂ）処理された種、実生または栄養植物の特性、成分または属性を検出し、任意に測定することにより、処理された種、実生または栄養植物をスクリーニングする工程
    を含む、前記方法。
  27. スクリーニング工程が以下の１つ以上を含む、請求項２６に記載の方法：
    （ａ）処理された種、実生または栄養植物から得られた細胞または組織サンプルから調製された抽出物に含まれる１以上の化合物の存在、レベル、レベルの変化、活性または局在化を検出し、また、任意に測定することを含む少なくとも１つのインビトロアッセイ、および／または
    （ｂ）処理された種、実生または栄養植物の特性、成分または属性を検出し、また、任意に測定することを含む少なくとも１つのインビボアッセイ。
  28. ブレビバチルス細胞中で発現される異種タンパク質またはペプチドを、農業上重要な特性についてスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するようにブレビバチルス細胞を改変して、組み換えブレビバチルス細胞を産生すること、および
    （ｂ）組み換えブレビバチルス細胞によって産生された化合物のレベルまたは活性を検出し、また、任意に測定することで、ブレビバチルス細胞をスクリーニングすること、
    を含む、前記方法。
  29. 組み換えブレビバチルス細胞によって産生された内生胞子から単離されたエキソスポリウムを含む組成物を植物、種、ヒトまたは動物に投与することを含む、植物、種、ヒトまたは動物を処置する方法であって、該組み換えプレビバチルス細胞が請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する前記方法。
  30. 生存可能なブレビバチルス細胞が残らないように組成物が熱不活化または滅菌されている、請求項２９に記載の方法。
  31. 請求項１０から１６のいずれか一項に記載の単離され、および／または、精製された融合タンパク質を含む組成物。
  32. 請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されている組み換えブレビバチルス内生胞子によって産生された、単離され、および／または、精製されたエキソスポリウムを含む組成物。
  33. 請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されている組み換えブレビバチルス内生胞子によって産生されたエキソスポリウムを含む組成物。
  34. 組み換えブレビバチルス内生胞子によって産生されたエキソスポリウムが、
    （ａ） エキソスポリウムの基底層、
    （ｂ） エキソスポリウムの毛様層、
    （ｃ） ａ）とｂ）の両方の混合物、
    （ｄ） ブレビバチルス内生胞子から得た粗エキソスポリウムの分画または抽出物、および／または
    （ｅ） ブレビバチルス内生胞子から得られた粗エキソスポリウムの画分または抽出物であって、同量の粗エキソスポリウムと比較して、融合タンパク質の量または濃度が豊富であるもの
    を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 目的のタンパク質を植物、種または圃場に送達する方法であって、
    組み換えブレビバチルス内生胞子から得られたエキソスポリウムを含む組成物を植物、種または圃場に適用することを含み、
    該組み換えブレビバチルス内生胞子が、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されていることを特徴とする、前記方法。
  36. 組成物が、
    （ａ） 植栽前後に、
    （ｂ） 出現前後に、
    （ｃ）粉末、懸濁液または溶液として、および／または
    （ｄ） その組成物がさらに、植物の成長を刺激するか、または害虫から植物を保護する１つ以上の追加の化合物を含むことを特徴として、
    圃場に適用される、請求項３５に記載の方法。
  37. 融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該核酸分子は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み、該ポリヌクレオチド配列は、（ｂ）該Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と機能的に連結されており、該第１のポリヌクレオチド配列は、
    （ｉ）配列番号３９または４０のいずれかと、または、配列番号４１から１７７のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列または表１もしくは図１から３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するか、または
    （ｉｉ）配列番号３０または４０由来の、または、配列番号４１から１７７のいずれか１つに示されるか、または、表２または図４、５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列由来の、少なくとも１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０または１３５連続ヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチド配列
    を含み、該Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をリシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）内生胞子のエキソスポリウムに標的化し得ることを特徴とする、前記核酸分子。
  38. 該断片が、
    （ａ）表２または図４、５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の第１のヌクレオチド、または
    （ｂ）表２または図４、５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の最後のヌクレオチド
    を含む、請求項３７に記載の核酸分子。
  39. 第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３９または４０と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、または、表２または図４、５に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項３７または３８に記載の核酸分子。
  40. 断片が、配列番号７または８、または、表２または図１４、５に示すいずれか１つのアミノ酸配列のアミノ酸１－５、１－１０、１－１５、１－２０、１－２５、１－３０、１－３５、１－４０または１－４５をコードする、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  41. 前記Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが、
    （ａ）植物成長刺激タンパク質、
    （ｂ）酵素、
    （ｃ）タンパク質、
    （ｄ）リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に対して異種性であるポリペプチド、
    （ｅ）治療性タンパク質、または
    （ｆ）植物免疫刺激タンパク質
    を含む、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  42. （ａ）１以上のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド、但し、該ポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性であるポリペプチドの間に位置している、
    （ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド、
    （ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド、
    （ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド、または
    （ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドを連結する柔軟なリンカー要素を含むポリペプチド
    をコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  43. リシニバチルス内生胞子が、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、リシニバチルス・ボロニトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｏｎｉｔｏｌｅｒａｎｓ）、シリニバチルス・フシホルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、リシニバチルス・アセトフェノニ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｉ）、リシニバチルス・アルカリフィリス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、リシニバチルス・チュングクカンジ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｕｎｇｋｕｋｊａｎｇｉ）、 リシニバチルス・コンポスティ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、 リシニバチルス・コンタミナンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、リシニバチルス・クレソリボランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｅｓｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、リシニバチルス・マクロイデス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｉｄｅｓ）、リシニバチルス・マンガニカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇａｎｉｃｕｓ）、リシニバチルス・マンギフェリフミ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇｉｆｅｒｉｈｕｍｉ）、リシニバチルス・マシリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・メイエリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｙｅｒｉ）、リシニバチルス・オデッセイ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、リシニバチルス・パキスタネンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｋｉｓｔａｎｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・パルビボロニカピエンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒｖｉｂｏｒｏｎｉｃａｐｉｅｎｓ）、リシニバチルス・シンドリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｎｄｕｒｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・タバシホリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｂａｃｉｆｏｌｉｉ）、リシニバチルス・バリアンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、リシニバチルス・キシラニリティカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）またはリシニバチルス・ハロトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）を含むリシニバチルス種によって形成される内生胞子またはリシニバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌によって形成された内生胞子である、請求項３７から４２のいずれか一項に記載さえた核酸分子。
  44. 第２のポリヌクレオチド配列およびリシニバチルスの少なくとも１つに対して異種性であるプロモーター要素と機能的に連結している、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  45. 第１のポリヌクレオチド配列が、表２または図４、５に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含み、該コドン最適化ポリヌクレオチド配列が、リシニバチルス内生胞子内において、表２または図４、５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列に比較して、同一条件下で、より高率または高レベルで発現している、請求項３７から４４のいずれか一項に記載の核酸配列。
  46. Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドと連結している該Ｎ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質であって、該Ｎ末端シグナルペプチドが、
    （ａ）配列番号４１から１７７のいずれか１つまたは表２または図４、５に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
    （ｂ）配列番号４１から１７７のいずれか１つのアミノ酸配列または表２もしくは図４、５に示すアミノ酸配列からの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５連続アミノ酸の断片を含むポリペプチド
    を含み、Ｎ末端シグナルペプチドが、融合タンパク質をリシニバチルス内生胞子へ標的化することができる、前記融合タンパク質。
  47. 断片が、
    （ａ）配列番号４１から１７７のいずれか１つまたは表２または図４、５に示すアミノ酸配列の第１のアミノ酸、または
    （ｂ）配列番号４１から１７７のいずれか１つまたは表２または図４、５に示すアミノ酸配列の最後のアミノ酸
    を含む、請求項４６に記載の融合タンパク質。
  48. ポリペプチド配列が、配列番号４１から１７７のいずれか１つのアミノ酸配列または表２もしくは図４、５に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４６または４７に記載の融合タンパク質。
  49. 断片が、配列番号４１から１７７のいずれか１つまたは表２または図４、５に示すアミノ酸配列のアミノ酸１－５、１－１０、１－１５、１－２０、１－２５、１－３０、１－３５、１－４または１－４５を含む、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  50. Ｎ末端シグナルペプチペプチドに対して異種性のポリペプチドが、
    （ａ）植物成長刺激タンパク質、
    （ｂ）酵素、
    （ｃ）タンパク質、
    （ｄ）リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に対して異種性であるポリペプチド、
    （ｅ）治療性タンパク質、または
    （ｆ）植物免疫刺激タンパク質
    を含む、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  51. （ａ）１以上のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド、但し、該ポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性であるポリペプチドの間に位置している、
    （ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド、
    （ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド、
    （ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド、または
    （ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドを連結する柔軟なリンカー要素を含むポリペプチド
    をさらに含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  52. リシニバチルス内生胞子が、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、リシニバチルス・ボロニトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｏｎｉｔｏｌｅｒａｎｓ）、シリニバチルス・フシホルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、リシニバチルス・アセトフェノニ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｉ）、リシニバチルス・アルカリフィリス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、リシニバチルス・チュングクカンジ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｕｎｇｋｕｋｊａｎｇｉ）、 リシニバチルス・コンポスティ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、 リシニバチルス・コンタミナンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、リシニバチルス・クレソリボランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｅｓｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、リシニバチルス・マクロイデス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｉｄｅｓ）、リシニバチルス・マンガニカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇａｎｉｃｕｓ）、リシニバチルス・マンギフェリフミ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇｉｆｅｒｉｈｕｍｉ）、リシニバチルス・マシリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・メイエリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｙｅｒｉ）、リシニバチルス・オデッセイ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、リシニバチルス・パキスタネンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｋｉｓｔａｎｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・パルビボロニカピエンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒｖｉｂｏｒｏｎｉｃａｐｉｅｎｓ）、リシニバチルス・シンドリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｎｄｕｒｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・タバシホリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｂａｃｉｆｏｌｉｉ）、リシニバチルス・バリアンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、リシニバチルス・キシラニリティカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）またはリシニバチルス・ハロトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）を含むリシニバチルス種によって形成される内生胞子またはリシニバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌によって形成された内生胞子である、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  53. 請求項３７から４５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む細菌染色体を含む組み換えリシニバチルス細胞。
  54. 請求項３７から４５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターであって、プラスミド、人工染色体またはウイルスベクターを含むベクター。
  55. 以下の少なくとも１つをさらに含む、請求項５４に記載のベクター：
    （ａ）リシニバチルス細胞において安定した維持を提供する複製起点、
    （ｂ）リシニバチルス細胞において選択的に不安定な維持を提供する複製起点、
    （ｃ）リシニバチルス細胞において選択的に不安定な維持を提供する温度感受性複製起点、
    （ｄ）発現制御配列に機能的に連結された、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、または
    （ｅ）発現制御配列に機能的に連結された、植物成長刺激タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  56. 請求項３７から４５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターで形質転換された組み換えリシニバチルス細胞。
  57. リシニバチルス細胞が、リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、リシニバチルス・ボロニトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｏｎｉｔｏｌｅｒａｎｓ）、シリニバチルス・フシホルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、リシニバチルス・アセトフェノニ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｉ）、リシニバチルス・アルカリフィリス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、リシニバチルス・チュングクカンジ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｕｎｇｋｕｋｊａｎｇｉ）、 リシニバチルス・コンポスティ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、 リシニバチルス・コンタミナンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、リシニバチルス・クレソリボランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｅｓｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、リシニバチルス・マクロイデス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｉｄｅｓ）、リシニバチルス・マンガニカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇａｎｉｃｕｓ）、リシニバチルス・マンギフェリフミ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｇｉｆｅｒｉｈｕｍｉ）、リシニバチルス・マシリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・メイエリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｙｅｒｉ）、リシニバチルス・オデッセイ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、リシニバチルス・パキスタネンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｋｉｓｔａｎｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・パルビボロニカピエンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒｖｉｂｏｒｏｎｉｃａｐｉｅｎｓ）、リシニバチルス・シンドリエンシス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｎｄｕｒｉｅｎｓｉｓ）、リシニバチルス・タバシホリ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｂａｃｉｆｏｌｉｉ）、リシニバチルス・バリアンス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、リシニバチルス・キシラニリティカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）もしくはリシニバチルス・ハロトレランス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）またはリシニバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌である、請求項５６に記載の組み換えリシニバチルス細胞。
  58. リシニバチルス内生胞子のエキソスポリウム上に異種融合タンパク質を表示する方法であって、
    （ａ）請求項３７から４５のいずれか一項に核酸分子を含む組み換えベクターで胞子形成なリシニバチルス細胞を形質転換すること、および
    （ｂ）請求項３７から４５のいずれか一項に記載の核酸分子にコードされる融合タンパク質を、該融合タンパク質が胞子形成によって得られるリシニバチルス内生胞子のエキソスポリウムに標的化されるような胞子形成条件下で発現すること
    を含み、Ｎ末端シグナルペプチドが、
    （ｉ）配列番号４１から１７７のいずれかによって示されるアミノ酸配列または表２もしくは図４、５に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％または８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、
    （ｉｉ）配列番号４１から１７７のいずれか１つのアミノ酸配列または表３または図４、５に示されるアミノ酸配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５連続アミノ酸の断片を含むことを特徴とする、前記方法。
  59. （ａ）請求項１０から１６のいずれか一項に記載に融合タンパク質を発現する１以上の組み換えエキソスポリウム産生リシニバチルス細胞、および、（ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を任意に相乗的有効量で含む組成物。
  60. 請求項３７から４５のいずれか一項の核酸、請求項４６から５２のいずれか一項の融合タンパク質、請求項５６または５７の組み換え細菌細胞または請求項５９の組成物で処理した種子。
  61. 植物、種子、植物の部分または植物の周囲の土壌を処理して植物成長を増強し、および／または、植物健康を促進する方法であって、
    （ａ）請求項４６から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する組み換えエキソスポリウム産生リシニバチルス内生胞子、但し、Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが植物成長または免疫刺激タンパク質を含んでいる、および
    （ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤
    を任意に相乗有効量で、同時に、または、順次に適用することを含む前記方法。
  62. 組み換えブリシニバチルス内生胞子で処理した宿主植物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項４６から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されたリシニバチルス内生胞子を含む組成物を、リシニバチルスによって永久的または一時的にコロニー形成されることができる種、実生、または栄養植物に適用して、処理された種、実生または栄養植物を産生する工程、および
    （ｂ）処理された種、実生または栄養植物の特性、成分または属性を検出し、任意に測定することにより、処理された種、実生または栄養植物をスクリーニングする工程
    を含む、前記方法。
  63. スクリーニング工程が以下の１つ以上を含む、請求項６２に記載の方法：
    （ａ）処理された種、実生または栄養植物から得られた細胞または組織サンプルから調製された抽出物に含まれる１以上の化合物の存在、レベル、レベルの変化、活性または局在化を検出し、また、任意に測定することを含む少なくとも１つのインビトロアッセイ、および／または
    （ｂ）処理された種、実生または栄養植物の特性、成分または属性を検出し、また、任意に測定することを含む少なくとも１つのインビボアッセイ。
  64. リシニバチルス細胞中で発現される異種タンパク質またはペプチドを、農業上重要な特性についてスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項４６から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するようにリシニバチルス細胞を改変して、組み換えリシニバチルス細胞を産生すること、および
    （ｂ）組み換えリシニバチルス細胞によって産生された化合物のレベルまたは活性を検出し、また、任意に測定することで、リシニバチルス細胞をスクリーニングすること、
    を含む、前記方法。
  65. 組み換えリシニバチルス細胞によって産生された内生胞子から単離されたエキソスポリウムを含む組成物を植物、種、ヒトまたは動物に投与することを含む、植物、種、ヒトまたは動物を処置する方法であって、該組み換えリシニバチルス細胞が請求項４６から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する前記方法。
  66. 生存可能なリシニバチルス細胞が残らないように組成物が熱不活化または滅菌されている、請求項６５に記載の方法。
  67. 請求項４６から５２のいずれか一項に記載の単離され、および／または、精製された融合タンパク質を含む組成物。
  68. 請求項４６から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されている組み換えリシニバチルス内生胞子によって産生された、単離され、および／または、精製されたエキソスポリウムを含む組成物。
  69. 請求項４６から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されている組み換えリシニバチルス内生胞子によって産生されたエキソスポリウムを含む組成物。
  70. 組み換えリシニバチルス内生胞子によって産生されたエキソスポリウムが、
    （ａ） エキソスポリウムの基底層、
    （ｂ） エキソスポリウムの毛様層、
    （ｃ） ａ）とｂ）の両方の混合物、
    （ｄ） リシニバチルス内生胞子から得た粗エキソスポリウムの分画または抽出物、および／または
    （ｅ） リシニバチルス内生胞子から得られた粗エキソスポリウムの画分または抽出物であって、同量の粗エキソスポリウムと比較して、融合タンパク質の量または濃度が豊富であるもの
    を含む、請求項６９に記載の組成物。
  71. 目的のタンパク質を植物、種または圃場に送達する方法であって、
    組み換えリシニバチルス内生胞子から得られたエキソスポリウムを含む組成物を植物、種または圃場に適用することを含み、
    該組み換えリシニバチルス内生胞子が、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されていることを特徴とする、前記方法。
  72. 組成物が、
    （ａ） 植栽前後に、
    （ｂ） 出現前後に、
    （ｃ）粉末、懸濁液または溶液として、および／または
    （ｄ） その組成物がさらに、植物の成長を刺激するか、または害虫から植物を保護する１つ以上の追加の化合物を含むことを特徴として、
    圃場に適用される、請求項７１に記載の方法。
  73. 融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該核酸分子は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み、該ポリヌクレオチド配列は、（ｂ）該Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と機能的に連結されており、該第１のポリヌクレオチド配列は、
    （ｉ）表３もしくは図６に示されるポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、または
    （ｉｉ）表３または図６に示されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも３０、６０、９０、１２０または１５０連続ヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチド配列
    を含み、該Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をビリディバチルス（Ｖｉｒｉｄｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）内生胞子のエキソスポリウムに標的化し得ることを特徴とする、前記核酸分子。
  74. 該断片が、
    （ａ）表３または図６に示されるいずれかのポリヌクレオチド配列の第１のヌクレオチド、または
    （ｂ）表３または図６に示されるいずれかのポリヌクレオチド配列の最後のヌクレオチド
    を含む、請求項７３に記載の核酸分子。
  75. 第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６または配列番号２１８と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項７３または７４に記載の核酸分子。
  76. 断片が、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７または配列番号２１９のいずれか１つのアミノ酸１－１０、１－２０、１－３０、１－４０または１－５０をコードする、請求項７３から７５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  77. 前記Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが、
    （ａ）植物成長刺激タンパク質、
    （ｂ）酵素、
    （ｃ）タンパク質、
    （ｄ）ビリディバチルス（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に対して異種性であるポリペプチド、
    （ｅ）治療性タンパク質、または
    （ｆ）植物免疫刺激タンパク質
    を含む、請求項７３から７６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  78. （ａ）１以上のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド、但し、該ポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性であるポリペプチドの間に位置している、
    （ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド、
    （ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド、
    （ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド、または
    （ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドを連結する柔軟なリンカー要素を含むポリペプチド
    をコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７３から７７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  79. ビリディバチルス内生胞子が、ビリディバチルス・アーヴァイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）、ビリディバチルス・アレノシ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅｎｏｓｉ）またはビリディバチルス・ネイデイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｉｄｅｉ）を含むビリディバチルス種によって形成される内生胞子またはビリディバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌によって形成された内生胞子である、請求項７３から７８のいずれか一項に記載された核酸分子。
  80. 第２のポリヌクレオチド配列およびビリディバチルスの少なくとも１つに対して異種性であるプロモーター要素と機能的に連結している、請求項７３から７９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  81. 第１のポリヌクレオチド配列が、表３または図６に示すポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含み、該コドン最適化ポリヌクレオチド配列が、ビリディバチルス内生胞子内において、表３または図６に示されるポリヌクレオチド配列に比較して、同一条件下で、より高率または高レベルで発現している、請求項７３から８０のいずれか一項に記載の核酸配列。
  82. Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドと連結している該Ｎ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質であって、該Ｎ末端シグナルペプチドが、
    （ａ）表３または図６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
    （ｂ）表３もしくは図６に示すいずれか１つのアミノ酸配列の少なくとも１０、２０、３０、４０または５０連続アミノ酸の断片を含むポリペプチド
    を含み、Ｎ末端シグナルペプチドが、融合タンパク質をビリディバチルス内生胞子へ標的化することができる、前記融合タンパク質。
  83. 断片が、
    （ａ）表３または図６に示すいずれか１つの配列の第１のアミノ酸、または
    （ｂ）表３または図６に示すいずれか１つのアミノ酸配列の最後のアミノ酸
    を含む、請求項８２に記載の融合タンパク質。
  84. ポリペプチド配列が、表３もしくは図６に示す配列のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８２または８３に記載の融合タンパク質。
  85. 断片が、表３または図６に示すいずれか１つのアミノ酸配列のアミノ酸１－１０、１－２０、１－３０、１－４０または１－５０を含む、請求項８２から８４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  86. 前記Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが、
    （ａ）植物成長刺激タンパク質、
    （ｂ）酵素、
    （ｃ）タンパク質、
    （ｄ）ビリディバチルス（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に対して異種性であるポリペプチド、
    （ｅ）治療性タンパク質、または
    （ｆ）植物免疫刺激タンパク質
    を含む、請求項８２から８５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  87. （ａ）１以上のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド、但し、該ポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性であるポリペプチドの間に位置している、
    （ｂ）選択マーカーを含むポリペプチド、
    （ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド、
    （ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド、または
    （ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドを連結する柔軟なリンカー要素を含むポリペプチド
    をさらに含む、請求項８２から８６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  88. ビリディバチルス内生胞子が、ビリディバチルス・アーヴァイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）、ビリディバチルス・アレノシ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅｎｏｓｉ）またはビリディバチルス・ネイデイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｉｄｅｉ）を含むビリディバチルス種によって形成される内生胞子またはビリディビバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌によって形成された内生胞子である、請求項８２から８７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  89. 請求項７３から８１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む細菌染色体を含む組み換えビリディバチルス細胞。
  90. 請求項７３から８１のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターであって、プラスミド、人工染色体またはウイルスベクターを含むベクター。
  91. 以下の少なくとも１つをさらに含む、請求項９０に記載のベクター：
    （ａ）ビリディバチルス細胞において安定した維持を提供する複製起点、
    （ｂ）ビリディバチルス細胞において選択的に不安定な維持を提供する複製起点、
    （ｃ）ビリディバチルス細胞において選択的に不安定な維持を提供する温度感受性複製起点、
    （ｄ）発現制御配列に機能的に連結された、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、または
    （ｅ）発現制御配列に機能的に連結された、植物成長刺激タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  92. 請求項７３から８１のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターで形質転換された組み換えビリディバチルス細胞。
  93. ビリディバチルス細胞が、ビリディバチルス・アーヴァイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｖｉ）、ビリディバチルス・アレノシ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅｎｏｓｉ）またはビリディバチルス・ネイデイ（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｉｄｅｉ）を含むビリディバチルス種またはビリディバチルス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌である、請求項２０に記載の組み換えブレビバチルス細胞。
  94. ビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウム上に異種融合タンパク質を表示する方法であって、
    （ａ）請求項７３から８１のいずれか一項に核酸分子を含む組み換えベクターで胞子形成なビリディバチルス細胞を形質転換すること、および
    （ｂ）請求項７３から８１のいずれか一項に記載の核酸分子にコードされる融合タンパク質を、該融合タンパク質が胞子形成によって得られるビリディバチルス内生胞子のエキソスポリウムに標的化されるような胞子形成条件下で発現すること
    を含み、Ｎ末端シグナルペプチドが、
    （ｉ）表３もしくは図６に示されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％または８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、
    （ｉｉ）表３または図６に示されるいずれか１つのアミノ酸配列の少なくとも１０、２０、３０、４０または５０連続アミノ酸の断片を含むことを特徴とする、前記方法。
  95. （ａ）請求項８２から８８のいずれか一項に記載に融合タンパク質を発現する１以上の組み換えエキソスポリウム産生ブレビバチルス細胞、および、（ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を任意に相乗的有効量で含む組成物。
  96. 請求項７３から８１のいずれか一項の核酸、請求項８２から８８のいずれか一項の融合タンパク質、請求項９２または９３の組み換え細菌細胞または請求項９５の組成物で処理した種子。
  97. 植物、種子、植物の部分または植物の周囲の土壌を処理して植物成長を増強し、および／または、植物健康を促進する方法であって、
    （ａ）請求項８２から８８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する組み換えエキソスポリウム産生ビリディバチスル内生胞子、但し、Ｎ末端シグナルペプチドに対して異種性のポリペプチドが植物成長または免疫刺激タンパク質を含んでいる、および
    （ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤
    を任意に相乗有効量で、同時に、または、順次に適用することを含む前記方法。
  98. 組み換えビリディバチルス内生胞子で処理した宿主植物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項８２から８８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されたビリディバチルス内生胞子を含む組成物を、ビリディバチルスによって永久的または一時的にコロニー形成されることができる種、実生、または栄養植物に適用して、処理された種、実生または栄養植物を産生する工程、および
    （ｂ）処理された種、実生または栄養植物の特性、成分または属性を検出し、任意に測定することにより、処理された種、実生または栄養植物をスクリーニングする工程
    を含む、前記方法。
  99. スクリーニング工程が以下の１つ以上を含む、請求項９８に記載の方法：
    （ａ）処理された種、実生または栄養植物から得られた細胞または組織サンプルから調製された抽出物に含まれる１以上の化合物の存在、レベル、レベルの変化、活性または局在化を検出し、また、任意に測定することを含む少なくとも１つのインビトロアッセイ、および／または
    （ｂ）処理された種、実生または栄養植物の特性、成分または属性を検出し、また、任意に測定することを含む少なくとも１つのインビボアッセイ。
  100. ビリディバチルス細胞中で発現される異種タンパク質またはペプチドを、農業上重要な特性についてスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１０から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するようにビリディバチルス細胞を改変して、組み換えブレビバチルス細胞を産生すること、および
    （ｂ）組み換えブレビバチルス細胞によって産生された化合物のレベルまたは活性を検出し、また、任意に測定することで、ブレビバチルス細胞をスクリーニングすること、
    を含む、前記方法。
  101. 組み換えビリディビバチルス細胞によって産生された内生胞子から単離されたエキソスポリウムを含む組成物を植物、種、ヒトまたは動物に投与することを含む、植物、種、ヒトまたは動物を処置する方法であって、該組み換えビリディバチルス細胞が請求項８２から８８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する前記方法。
  102. 生存可能なビリディバチルス細胞が残らないように組成物が熱不活化または滅菌されている、請求項１０１に記載の方法。
  103. 請求項８２から８８のいずれか一項に記載の単離され、および／または、精製された融合タンパク質を含む組成物。
  104. 請求項８２から８８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されている組み換えビリディバチルス内生胞子によって産生された、単離され、および／または、精製されたエキソスポリウムを含む組成物。
  105. 請求項８２から８８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されている組み換えビリディバチルス内生胞子によって産生されたエキソスポリウムを含む組成物。
  106. 組み換えビリディバチルス内生胞子によって産生されたエキソスポリウムが、
    （ａ） エキソスポリウムの基底層、
    （ｂ） エキソスポリウムの毛様層、
    （ｃ） ａ）とｂ）の両方の混合物、
    （ｄ） ビリディバチルス内生胞子から得た粗エキソスポリウムの分画または抽出物、および／または
    （ｅ） ビリディバチルス内生胞子から得られた粗エキソスポリウムの画分または抽出物であって、同量の粗エキソスポリウムと比較して、融合タンパク質の量または濃度が豊富であるもの
    を含む、請求項１０５に記載の組成物。
  107. 目的のタンパク質を植物、種または圃場に送達する方法であって、
    組み換えビリディバチルス内生胞子から得られたエキソスポリウムを含む組成物を植物、種または圃場に適用することを含み、
    該組み換えビリディバチルス内生胞子が、請求項８２から８８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されていることを特徴とする、前記方法。
  108. 組成物が、
    （ａ） 植栽前後に、
    （ｂ） 出現前後に、
    （ｃ） 粉末、懸濁液または溶液として、および／または
    （ｄ） その組成物がさらに、植物の成長を刺激するか、または害虫から植物を保護する１つ以上の追加の化合物を含むことを特徴として、
    圃場に適用される、請求項１０７に記載の方法。
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