CN112029685B

CN112029685B - 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其在混凝土裂缝修复中的应用

Info

Publication number: CN112029685B
Application number: CN202010911233.2A
Authority: CN
Inventors: 徐建妙; 泮佳佳; 郑裕国; 王远山; 程峰; 贾东旭
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN112029685A

Abstract

本发明公开了一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022及其在混凝土裂缝修复中的应用，属于微生物修复技术领域。所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022为本发明自主分离得到具有高脲酶活力的菌株，保藏编号：CCTCC NO:M 2020267。本发明提供的耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022，具有较高脲酶活力与不溶性钙转化能力，其代谢产物可与环境中的钙离子高效结合形成方解石，可有效修复混凝土微裂缝。菌株ZJB20022具有作为生物修复制剂进行混凝土裂缝自修复的潜力和应用前景。

Description

一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其在混凝土裂缝修复中的应用

技术领域

本发明涉及微生物修复技术领域，具体涉及一种高效脲酶矿化菌及其在混凝土裂缝修复中的应用。

背景技术

混凝土因其抗压性能和耐久性能优良而成为应用最广泛的建筑工程材料之一。然而，由于水化过程中温度变化引起的胀缩现象、地基施工质量存在差异导致的稳定性差、钢筋锈蚀、外力撞击、荷载过大等多种不利因素均会使混凝土建筑产生干缩裂缝、温度裂缝、变形裂缝以及接茬缝等。

目前进行裂缝修复的方法包括结构补强法、外观修补法、裂缝灌浆法等，虽在一定程度上能填补裂缝，但通过使用化学材料进行填补，在实施过程中暴露出工艺要求高、操作复杂、成本高昂、破坏混凝土结构和功能等缺点。经过探究，Ramachandran等人提出一种环境友好的自我感知、自我调节、自我修复的裂缝愈合方式，即将用矿化微生物自身的新陈代谢形成碳酸根离子，在环境中存在钙离子的情况下，析出碳酸钙结晶的生物矿化机制去愈合混凝土的微裂缝。

相比于包括氰基丙烯酸酯，环氧基树脂，丙烯酸树脂，硅酸钠，聚氨酯等化学类愈合剂，通过微生物自身代谢活动诱导碳酸钙沉淀使裂缝愈合的生物类愈合剂与混凝土基质具有较好的相容性，加上其独特的原位修复特性促使以微生物的代谢作用产生碳酸钙沉淀从而使裂缝愈合成为更为经济环保的一种智能化方式，混凝土微生物自修复材料成为建筑与生物交叉领域的新兴探究材料。

基于微生物诱导的碳酸钙沉积技术是利用碳酸钙矿化菌产生的脲酶将尿素水解，水解产生的碳酸根与体系中的钙离子形成碳酸钙结晶。目前，脲酶矿化菌在混凝土领域的应用成熟于其他矿化菌(如硫酸盐还原菌)，并取得一定的成果，因此寻找到一株高效脲酶矿化菌对促进混凝土微生物自修复材料的研发并进行工程应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脲酶活力高并能高效利用钙离子的矿化细菌，其代谢产物可与环境中的钙离子高效结合形成方解石，用于修复混凝土微裂缝，为混凝土微生物自修复材料的开发提供新的理论依据和技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明从浙江省杭州市西湖区灵隐古寺山坡上的土样中分离得到具有高脲酶活力的菌株ZJB20022，测得的该菌株的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，ZJB20022与已知菌株Lysinibacillusboronitolerans strain NBRC 103108聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达98.27％，从而确定了ZJB20022在分类上属于耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)，将其命名为耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)ZJB20022。

本发明提供了一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏日期：2020年7月2日，保藏编号：CCTCC NO:M 2020267。

本发明研究表明，耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022菌体不仅脲酶活力高，矿化能力也非常强，不溶性钙转化率达49.4％。

本发明提供了所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022在混凝土裂缝修复中的应用。

所述应用可以为在混凝土制备过程中直接将芽孢混入，当出现裂缝时，芽孢被激活快速萌发成营养体完成对混凝土裂缝的自修复。具体地：将耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022芽孢与包含钙盐和尿素的混合营养液混合得到菌剂，再将菌剂代替混凝土制备过程中的水，拌制后经标准养护得到自修复混凝土。经标准养3天便可实现混凝土0.5mm的微裂缝自修复。

所述菌剂中耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022芽孢的浓度为1×10⁷～1×10⁹cfu/mL，优选的，菌浓为4×10⁷cfu/mL。

所述混合营养液的组分包括：酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素，浓度分别为1～2g/L，2～3g/L，20～21g/L和9.5～10.5g/L。优选的，所述混合营养液中酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素的浓度分别为1.5g/L，2.68g/L，20.8g/L和10g/L。

本发明还提供了一种混凝土裂缝自修复生物制剂，包括所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022。

本发明的有益效果为：

本发明提供的耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022，具有较高脲酶活力与不溶性钙转化能力，其代谢产物可与环境中的钙离子高效结合形成方解石，可有效修复混凝土微裂缝。菌株ZJB20022具有作为生物修复制剂进行混凝土裂缝自修复的潜力和应用前景。

附图说明

图1为实施例2中添加耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022的实验组沉淀物的XRD图。

图2为实施例3中菌株ZJB20022主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中(A)图为修复前的微裂缝，(B)图为修复后的微裂缝。

图3为对比例1中对照菌1主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中(A)图为修复前的微裂缝，(B)图为修复后的微裂缝。

图4为对比例2中对照菌2主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中(A)图为修复前的微裂缝，(B)图为修复后的微裂缝。

图5为对比例3中对照菌3主动修复混凝土微裂缝的结果图，其中(A)图为修复前的微裂缝，(B)图为修复后的微裂缝。

图6为对比例4中对未添加菌的对照组主动修复混凝土微裂缝的结果，其中(A)图为修复前的微裂缝，(B)图为修复后的微裂缝。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中培养基配方如下：

产脲酶菌株筛选培养基成分为：蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，尿素2g/L，葡萄糖0.1g/L，酚红溶液(0.2％)4ml/L，20g/L琼脂，pH值为7。其中，尿素和葡萄糖分别单独配制为溶液灭菌。

种子液培养基成分为：蛋白胨5g、牛肉膏3g、葡萄糖5g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2。

各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌20min。

实施例1

一、高效脲酶矿化菌经富集和筛选纯化分离获得，具体步骤如下：

1)土样处理：取浙江省杭州市西湖区灵隐古寺山坡上的土样1g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和100mL无菌水的锥形瓶中，30℃，200r/min震荡30min后静置10min，去除底部沉淀物，得到土壤悬浮液。将土壤悬浮液置于100℃水中进行沸水浴加热3-5min，得到土壤样品原液。

2)分离培养：在超净台中进行土壤样品原液的梯度稀释，浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，吸取200μL各浓度的菌悬液接种于产脲酶菌株筛选培养基平板上，用封口膜将平板封口后倒置，放于37℃恒温培养箱中培养24h。

3)挑菌纯化：在菌落数合适的平板上，通过观察菌落边缘红色深浅，取边缘红色深的典型菌落在新鲜的种子液固体培养基平板上划线纯化3次。

4)保存：将纯化获得的菌体一份接种至种子液固体斜面培养基中，4℃保存；另一份于30％的甘油中保藏于-80℃；同时另一份进行生理生化和分子生物学鉴定。

经过上述筛选纯化方式共获得29株菌株(先后筛选到，并非一次性筛选获得)。

二、高效脲酶矿化菌的鉴定

1)分子生物学鉴定：用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，细菌通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，

1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR程序：在95℃进行预变性5min；95℃40s，55℃30s，72℃2min，30个循环延伸；72℃10min。产物由擎科生物技术有限公司进行PCR产物测序，将获得的DNA序列，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，选择合适的DNA序列建立系统发育树，确定筛选获得菌株的种属。

2)生理生化鉴定：利用Biolog(GENⅢ)自动鉴定系统测定碳源利用情况以及对化学物质的敏感性，进一步确定微生物的种属。

选择产脲酶菌株筛选固体培养基上菌落边缘最红的单菌落按照上述方式进行菌种鉴定，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，该菌株与已知菌株Lysinibacillus boronitolerans strainNBRC 103108聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达98％，从而确定了ZJB20022在分类上属于耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)。因此对该菌株进行命名并保藏，命名为耐硼赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus boronitolerans ZJB20022，2020年7月2日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2020267，于2020年7月17日检测存活。

3)脲酶活力的测定：将分离得到的单一菌落接种到种子液培养基中，于30℃摇床振荡培养24h，随后取2ml的培养液4℃，12000r/min离心3min，去掉上清得到菌体测定脲酶酶活。

脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法，活力定义：在37℃条件下每产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。以U表示。

同时与步骤一所获得的其余28株脲酶菌中的随机3株菌的脲酶活力进行比较，其酶活如表1所示。

表1

结果表明，本发明筛选出的耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022优于对照菌脲酶活力。

实施例2

菌株ZJB20022高效脲酶的矿化活性

1)菌体的富集

将实施例1中提及的耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022与三株对照菌在种子液固体培养基平板上用接种环划线，37℃倒置培养12小时。用灼烧灭菌的接种环挑平板表面菌落接种于种子液培养液，培养液盛于容积为250ml的锥形瓶中，每瓶培养液体积为50ml，将接种过的锥形瓶置于恒温震荡培养箱中，37℃，150rpm培养12小时，之后进行培养体系扩大培养进行菌体的富集。将这种含有大量菌体的发酵液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后倾倒舍弃上清液，并向菌体沉淀中加去离子水震荡重悬芽孢，再次离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，重复以上操作洗涤菌体8-10次。菌体沉淀置于4℃冰箱保存备用。

2)玻璃反应器的清洗

选择容积为500ml的锥形瓶作为检测不同菌株矿化活性的培养容器，用于检测不同菌株的合成碳酸钙的能力。将玻璃试管置于2％稀盐酸中浸泡过夜，之后依次用自来水、去离子水分别冲洗4次和2次，将玻璃试管置于鼓风式烘干箱中烘干；将烘干后的玻璃试管浸没于95％乙醇中浸泡过夜，后用去离子水冲洗4次；将玻璃试管浸没于双氧水/浓硝酸洗液中浸泡过夜，该洗液为水、30％双氧水、65％浓硝酸以体积比1:1:1混合均匀；将玻璃试管取出，依次用自来水、去离子水分别冲洗4次和2次。用高压蒸汽灭菌锅于121℃灭菌20min，备用。

3)不溶性钙转化反应液的制备

1.2g尿素、2.2g氯化钙和100ml蒸馏水，混合完全溶解，用高压蒸汽灭菌锅于121℃灭菌20min，备用。

4)菌株不溶性钙转化能力的检测

采用灭菌的种子液培养基制备菌体悬浮液，并利用血球计数板检测悬浮液浓度，制备浓度约为1×10⁸个/ml的耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022悬浮液。三株对照菌株悬浮液制备方式同上。上述锥形瓶中，每瓶加入50ml已灭菌的反应液、500μL浓度约为1×10⁸个/ml的菌体悬浮液和转子，同时设置反应液对照组(不含菌体)，4个平行；将玻璃锥形瓶置于恒温水浴锅并设置转速为150rpm，37℃培养9小时。将9小时后的反应液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后倾倒舍弃上清液，并向菌体沉淀中加去离子水震荡沉淀物，再次离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，重复以上操作洗涤沉淀物8-10次。

向沉淀物中加入过量浓度为1M的稀盐酸，稀盐酸与沉淀物中的碳酸钙反应形成可溶性钙离子。静置10分钟，随后继续添加稀盐酸至离心管中，反复颠倒，直至不产生气泡为止。再将离心管中的溶液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后保留上清液弃去沉淀。向上清液中加入稀盐酸体积一半的浓度为1M的碳酸钠溶液，碳酸钠与上清液中的可溶性钙离子反应形成不溶性碳酸钙。静置10分钟，随后继续添加碳酸钠溶液至离心管中，直至不产生沉淀为止。再将离心管中的溶液进行离心，离心转速为8000×g，离心时间为10分钟，离心后弃去上清液。将离心后得到的沉淀物置于鼓风式烘干箱中烘干，对其进行称重，并进行XRD检测其沉淀物成分。

图1所示的XRD图为添加耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022的实验组沉淀物置于XRD检测后并经过软件分析所得，图中所示的衍射峰与PDF卡片比对以后发现，这些衍射峰与碳酸钙物相的衍射峰位置完全吻合。该结果表明，菌体ZJB20022具备将不溶性钙转化的能力且形成的不溶性钙为碳酸钙，这与混凝土基质具有较好的兼容性，利于混凝土微生物自修复材料的制备。如表2所示，反应液对照组无沉淀形成，与对照菌株相比，本发明自主筛选耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022形成的碳酸钙最多，高达0.98g，不溶性钙转化率达49.4％。

表2不同菌株不溶性钙转化能力

实施例3

菌株ZJB20022芽孢主动修复混凝土微裂缝

分别称量离心的菌体芽孢(菌浓为4×10⁷cfu/ml)与混合营养成分混合均匀得到菌剂。按照标准程序，将菌剂代替混凝土试件制备过程中的水，通过自制的裂缝压制法制备含有0.1-0.5mm微裂缝的标准混凝土试件，并用保鲜膜包裹好后静置于30℃、湿度90％的恒温恒湿培养箱中进行养护。利用读数显微镜观察其微裂缝的愈合情况并计算愈合率，利用计时器计算渗透完5ml水需要的时长以体现抗渗水性能。其中所述的营养液成分为：酵母提取物，肌苷，乳酸钙和尿素，浓度分别为1.5g/L，2.68g/L，20.8g/L和10g/L。养护3天后，利用读数显微镜观察微裂缝愈合情况，结果如图2所示。

对比例1

本对比例除了使用的菌株为对照菌1(参见表1)河生莱略特氏菌，其他条件同实施例3，结果如图3所示。

对比例2

本对比例除了使用的菌株为对照菌2(参见表1)烟酸芽孢杆菌，其他条件同实施例3，结果如图4所示。

对比例3

本对比例除了使用的菌株为对照菌3(参见表1)维德芽孢杆菌，其他条件同实施例3，结果如图5所示。

对比例4

本对比例在制备混凝土试件时，不添加脲酶矿化菌，其他条件同实施例3，结果如图6和表3所示。

表3

如表3所示，本发明提出的菌株ZJB20022的自主修复效果较好，可以大大提高混凝土试件的抗渗水能力。

对比例4为无菌添加的对照组，其裂缝仅为0.25mm但未愈合，与实施3和对比例1-3的菌株自主修复0.2mm-0.5mm之间的微裂缝的效能相比，证实脲酶矿化菌具备主动修复混凝土微裂缝的能力。此外，图2-图6显示不同脲酶活力菌株修复裂缝的能力不同，菌株ZJB20022芽孢脲酶活力最高，其主动修复混凝土微裂缝的能力亦最强。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其在混凝土裂缝修复中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> 耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinisbacillus boronitolerans)

<400> 1

caaatcatgc accttcggcg gctggctcca aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac 60

aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat 120

gctgatccgc gattactagc gattccggct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg 180

aactgagaac gactttatcg gattagctcc ctctcgcgag ttggcaaccg tttgtatcgt 240

ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca 300

ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caactaaatg atggcaacta 360

agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420

caaccatgca ccacctgtca ccgttgcccc cgaaggggaa actatatctc tacagtggtc 480

aacgggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 540

accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca 600

ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc 660

actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc 720

gcgcctcagt gtcagttaca gaccagatag tcgccttcgc cactggtgtt cctccaaatc 780

tctacgcatt tcaccgctac acttggaatt ccactatcct cttctgcact caagtctccc 840

agtttccaat gaccctccac ggttgagccg tgggctttca catcagactt aagaaaccac 900

ctgcgcgcgc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg 960

ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct aataaggtac cgtcaaggta cagccagtta 1020

ctactgtact tgttcttccc ttacaacaga gttttacgaa ccgaaatcct tcttcactca 1080

cgcggcgttg ctccatcagg ctttcgccca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg 1140

taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctacg 1200

catcgtcgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg ggcccatcct 1260

atagcgacag ccgaaaccgt ctttcagtgt ttcaccatga ggtgaaacag attattcggt 1320

attagccccg gtttcccgga gttatcccaa actataaggt aggttgccca cgtgttactc 1380

acccgtccgc cgctaacgtc gaaggagcaa gctccttctc tgttcgctcg acttgcatgt 1440

atagcacgct actccc 1456

Claims

1.一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)ZJB20022，其特征在于，该菌株的保藏号为CCTCC NO: M 2020267。

2.如权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)ZJB20022在混凝土裂缝修复中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022芽孢与包含钙盐和尿素的混合营养液混合得到菌剂，再将菌剂代替混凝土制备过程中的水，拌制后经标准养护得到自修复混凝土。

4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌剂中耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022芽孢的浓度为1×10⁷～1×10⁹ cfu/mL。

5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌剂中耐硼赖氨酸芽孢杆菌ZJB20022芽孢的浓度为4×10⁷ cfu/mL。

6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述混合营养液的组分包括：酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素，浓度分别为1~2 g/L，2～3 g/L，20～21 g/L和9.5～10.5 g/L。

7. 一种混凝土裂缝自修复生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)ZJB20022。