BR112021008927A2 - plataformas de exibição de endósporo, produtos e métodos - Google Patents

plataformas de exibição de endósporo, produtos e métodos Download PDF

Info

Publication number
BR112021008927A2
BR112021008927A2 BR112021008927-6A BR112021008927A BR112021008927A2 BR 112021008927 A2 BR112021008927 A2 BR 112021008927A2 BR 112021008927 A BR112021008927 A BR 112021008927A BR 112021008927 A2 BR112021008927 A2 BR 112021008927A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
lysinibacillus
viridibacillus
plant
polypeptide
brevibacillus
Prior art date
Application number
BR112021008927-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Benjamin Golomb
Florencia Ficarra
Rauf SALAMZADE
Damian CURTIS
Kyle Tipton
Dilara ALLY
Original Assignee
Bayer Cropscience Lp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Cropscience Lp filed Critical Bayer Cropscience Lp
Publication of BR112021008927A2 publication Critical patent/BR112021008927A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

PLATAFORMAS DE EXIBIÇÃO DE ENDÓSPORO, PRODUTOS E MÉTODOS. A presente invenção refere-se a sequências de sinal úteis para direcionar proteínas e peptídeos até a superfície de endósporos produzidos por membros da família de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus e métodos de utilização dos mesmos. A exibição de moléculas heterólogas, tais como peptídeos, polipeptídeos e outros construtos recombinantes, no exospório de membros da família de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, usando sequências de direcionamento N-terminal específicas e derivados das mesmas, e da mesma forma são providas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLATAFORMAS DE EXIBIÇÃO DE ENDÓSPORO, PRODUTOS E MÉTODOS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade dos Pedidos de Patente provisórios Norte-americanos Nos. 62/768,077; 62/768,063; e 62/767,997, que foram depositados em 15 de novembro de 2018, cujos teores totais são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE
[002] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um arquivo denominado “BCS189008WO_ST25.txt” criado em 13 de novembro de 2019, e com um tamanho de 169 kilobytes, e é depositado de forma concomitante com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII é parte do relatório descritivo e é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[003] A divulgação provê produtos úteis para várias aplicações, tais como liberação de moléculas heterólogas de interesse às plantas. Em particular, a divulgação descreve métodos de exibição de endósporos e sequências de direcionamento associadas. Por exemplo, a divulgação provê sequências de sinal N-terminal úteis para várias aplicações, tais como direcionamento de proteínas heterólogas, peptídeos e outros construtos recombinantes ao exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, assim como endósporos e métodos de utilização dos mesmos. As referidas sequências de sinal N-
terminal podem ser usadas como sinais de direcionamento para proteínas de fusão expressadas em espécies de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus conforme divulgadas no presente documento, resultando em endósporos com uma molécula de interesse localizada na superfície do exospório. Esses endósporos podem ser administrados a um hospedeiro, tal como um hospedeiro de plantas. A plataforma resultante é suscetível ao rastreio de alto rendimento das proteínas de interesse para traços benéficos, tais como traços agrícolas (resistência a herbicidas, promoção do crescimento e/ou saúde da planta, proteção contra insetos, proteção contra fitopatógenos fúngicos, bacterianos ou virais, etc.) A divulgação provê outros produtos relacionados e métodos.
ANTECEDENTES DA DIVULGAÇÃO
[004] Técnicas agrícolas modernas dependem fortemente de composições que promovam ou aumentem a saúde e crescimento das plantas de modo a melhorar o rendimento e qualidade das culturas. As referidas composições geralmente incluem fertilizantes orgânicos ou inorgânicos, nutrientes e outros compostos químicos que promovem o crescimento e desenvolvimento apropriado das plantas. No entanto, sabe-se que o uso a longo prazo ou uso excessivo de muitas dessas composições pode resultar em efeitos colaterais negativos, tais como acidificação do solo ou desestabilização do equilíbrio de nutrientes no solo. Além do mais, o uso excessivo pode resultar no enriquecimento de produtos finais nocivos em culturas crescidas para consumo humano.
[005] As fazendas modernas também se baseiam tipicamente no uso de uma ampla variedade de produtos químicos (por exemplo, inseticidas, herbicidas, bactericidas, nematicidas e fungicidas) para controlar pragas e garantir um alto rendimento de culturas comercialmente crescidas. Muitos destes compostos químicos exibem atividade ampla e podem ser potencialmente prejudiciais aos seres humanos e animais em altas concentrações. Além disso, alguns compostos químicos apresentam efeitos “off-target”. Além disso, pelo menos alguns destes compostos sintéticos são não biodegradáveis. Nos últimos anos, tem havido uma maior pressão de consumidores para produtos agrícolas que foram criados e colhidos com pouca ou nenhuma exposição a inseticidas ou fungicidas sintéticos. Um problema adicional que surge com o uso de inseticidas ou fungicidas sintéticos é que o uso repetido e/ou exclusivo frequentemente leva à seleção de pragas resistentes. Normalmente, as pragas resistentes são também resistentes ao cruzamento contra outros ingredientes ativos que têm o mesmo modo de ação. Como resultado, as composições e compostos de controle de pragas são difíceis e caros de desenvolver (por exemplo, devido a preocupações de segurança e o rápido desenvolvimento de resistência).
[006] Métodos genéticos de engenharia também têm sido usados para promover crescimento e/ou saúde de plantas sem dependência em produtos químicos sintéticos. Por exemplo, as culturas podem ser modificadas para introduzir ou modificar genes relacionados ao crescimento e/ou saúde da planta e/ou introduzir genes que codificam agentes de controlo de pragas naturais ou sintéticos. Os transgenes podem ser introduzidos em uma planta alvo utilizando um vetor viral. Nos últimos anos, tem havido algum sucesso relatado com o uso de bactérias para a distribuição de proteínas recombinantes a plantas. Entretanto, até agora, tal sucesso é grandemente limitado aos membros da família Bacillaceae e mais especificamente, Bacillus subtilis, que é a mais bem caracterizada, bactérias Gram-positivas e o modelo bacteriano primário para pesquisa de esporulação. O foco em B. subtilis como uma plataforma de liberação e expressão é ainda devida ao fato de que o genoma de B. subtilis e as vias biológicas relacionadas à síntese de proteínas e a secreção são bem entendidas. No entanto, devido ao alto grau de diversidade genética entre as bactérias, as descobertas de pesquisa com base em estudos de B. subtilis não são frequentemente transladadas diretamente aos membros dentro e fora da família Bacillaceae. Por exemplo, os endósporos de B. subtilis carecem da camada de exospório que os membros da família de B. cereus produzem.
[007] Consequentemente, embora certos métodos de liberação de materiais genéticos heterólogos sejam conhecidos, existe a necessidade na técnica de desenvolver novas plataformas de liberação e expressão para tais materiais genéticos.
BREVE SUMÁRIO DE MODALIDADES DA DIVULGAÇÃO
[008] A divulgação descreve métodos, composições e construtos genéticos que atendem às necessidades identificadas acima, por exemplo, provendo, entre outras coisas, uma nova plataforma para a liberação de enzimas recombinantes e outras moléculas de interesse (por exemplo, peptídeo, proteína) a um ambiente (por exemplo, planta, campo) usando membros formadores de esporos dos genêros Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[009] Em um aspecto, a divulgação provê células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que produzem exospórios recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo: (i) pelo menos uma proteína ou peptídeo heterólogo que confere ou modifica um traço ou atributo da planta (por exemplo, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante do crescimento da planta, uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal; ou uma enzima, proteína, ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou de uma praga); e (ii) uma sequência de direcionamento N-terminal que localiza a proteína de fusão no exospório das respectivas células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
Esta composição geral pode ainda incluir componentes adicionais (por exemplo, que promovam crescimento e/ou saúde das plantas). Além do mais, modalidades específicas dos métodos divulgados no presente documento proveem um rastreio de alto rendimento eficiente de proteínas heterólogas e peptídeo que conferem ou de alguma forma modificam os traços ou atributos das plantas. Quando se faz referência nesta divulgação aos peptídeos de sinal N-terminal (ou sequências de direcionamento), ou proteínas de fusão compreendendo as mesmas, entende-se que as sequências adequadas por quaisquer dos referidos construtos devem ser selecionadas com base no gênero bacteriano da célula ou endósporo que expressará o construto, e cujo uso intergenérico não seja previsto por esta divulgação. Em outras palavras, as sequências de direcionamento N-terminal compatíveis com Brevibacillus são mostradas na tabela 1 e FIGs. 1-3, as sequências de direcionamento N-terminal compatíveis com Lysinibacillus são mostradas na tabela 2 e FIGs. 4-5, e as sequências de direcionamento N-terminal compatíveis com Viridibacillus são mostradas na tabela 3 e FIG. 6. As variantes e fragmentos dessas sequências que retêm a funcionalidade de direcionamento N-terminal em cada um desses respectivos gêneros bacterianos também são divulgadas no presente documento.
[0010] Em um outro aspecto, a divulgação provê uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão, compreendendo (a) uma primeira sequência de polinucleotídeos codificando um peptídeo de sinal N-terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: (i) uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 60%, 70% ou 80% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências de polinucleotídeos divulgadas nas tabelas 1 (para Brevibacillus), 2 (para Lysinibacillus), ou 3 (para Viridibacillus); ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos compreendendo um fragmento de pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências de polinucleotídeos divulgadas nas tabelas 1 (para Brevibacillus), 2 (para Lysinibacillus), ou 3 (para Viridibacillus); e em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de direcionar a proteína de fusão ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[0011] Em aspectos selecionados, o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) pelo menos uma de uma proteína imunoestimulante ou de crescimento de planta; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo ao Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; ou (e) uma proteína terapêutica. Em aspectos selecionados, a molécula de ácido nucleico ainda compreende uma terceira sequência de polinucleotídeos, codificando: (a) um polipeptídeo compreendendo um ou mais sítios de protease clivagem de protease, em que o polipeptídeo é posicionado entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo compreendendo um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo compreendendo um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
[0012] Em aspectos selecionados, o endósporo de Brevibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Brevibacillus, compreendendo: B. agri, B. aydinogluensis, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. fluminis, B. formosus, B. fulvus, B. ginsengisoli, B. invocatus, B. laterosporus, B. levickii, B. limnophilus, B.
massiliensis, B. nitrificans, B. panacihumi, B. parabrevis, B. reuszeri ou B. thermoruber.
[0013] Em aspectos selecionados, o endósporo de Lysinibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Lysinibacillus, compreendendo: Lysinibacillus sphaericus, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus acetophenoni, Lysinibacillus alkaliphilus, Lysinibacillus chungkukjangi, Lysinibacillus composti, Lysinibacillus contaminans, Lysinibacillus cresolivorans, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus manganicus, Lysinibacillus mangiferihumi, Lysinibacillus massiliensis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus odysseyi, Lysinibacillus pakistanensis, Lysinibacillus parviboronicapiens, Lysinibacillus sinduriensis, Lysinibacillus tabacifolii, Lysinibacillus varians, Lysinibacillus xylanilyticus ou Lysinibacillus halotolerans.
[0014] Em aspectos selecionados, o endósporo de Viridibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Viridibacillus, compreendendo: Viridibacillus arvi, Viridibacillus arenosi ou Viridibacillus neidei.
[0015] Em aspectos selecionados, a molécula de ácido nucleico é operacionalmente ligada a um elemento promotor que é heterólogo a pelo menos uma das segundas sequências de polinucleotídeos e Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[0016] Em aspectos selecionados, o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) pelo menos uma de uma proteína imunoestimulante ou de crescimento de plantas; (b) uma enzima; (c) um polipeptídeo heterólogo ao Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; (d) uma proteína terapêutica (por exemplo, um antibiótico ou proteína anti-inflamatória); ou (e) uma proteína que provê uma propriedade comercialmente significativa, incluída, mas não limitada a: atividade inseticida, atividade fungicida, crescimento de plantas, atividade de saúde ou imunoestimulante e/ou resistência ambiental melhorada. Outras propriedades agricolamente significativas incluem característica melhorada, incluindo: emergência, rendimento da safra, teor de proteína, teor de óleo, teor de amido, sistema de raiz mais desenvolvido, maior crescimento de raiz, manutenção de tamanho de raiz melhorada, eficiência de raiz melhorada, tolerância melhorada ao estresse (por exemplo, contra seca, calor, sal, UV, água, frio), etileno reduzido (produção e/ou inibição de recepção reduzidas), aumento no perfilhamento, aumento na altura da planta, maior lâmina foliar, menos folhas basais mortas, perfilhos mais fortes, coloração mais verde da folha, teor do pigmento, atividade fotossintética, menos insumo necessário (tal como fertilizantes ou água), menor necessidade de sementes, perfilhos mais produtivos, floração mais precoce, maturidade mais precoce do grão, menos dobramento da planta (acamamento), crescimento aumentado de brotos, vigor aumentado da planta, estande de plantas aumentado e germinação precoce e melhor.
[0017] Em aspectos selecionados, a proteína de fusão ainda compreende: (a) um polipeptídeo contendo um ou mais sítios de protease clivagem da protease, posicionados entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável (por exemplo, uma proteína que confere resistência a um antibiótico); (c) um polipeptídeo compreendendo um elemento de visualização (por exemplo, um marcador fluorescente tal como GFP); (d) um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio de reconhecimento/purificação de proteína (por exemplo, um marcador HIS-tag); ou (e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, conectando o peptídeo de sinal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
[0018] Em um aspecto alternativo, a divulgação provê uma célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus recombinante compreendendo um cromossomo bacteriano compreendendo uma molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento.
[0019] Em um aspecto alternativo, a divulgação provê um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento, em que o vetor compreende um plasmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral.
[0020] Em aspectos selecionados, o vector ainda compreendendo pelo menos uma das seguintes: (a) uma origem de replicação que provê manutenção estável em uma célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; (b) uma origem de replicação que provê seletivamente manutenção não estável na célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; (c) uma origem de replicação sensível à temperatura que provê seletivamente manutenção não estável na célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; (d) um polinucleotídeo codificando um marcador de seleção, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; ou (e) um polinucleotídeo codificando uma proteína estimulante do crescimento da planta, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão;
[0021] Em aspectos alternativos, a divulgação provê uma célula recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus transformada com um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento.
[0022] Em aspectos selecionados, a célula de Brevibacillus é uma espécie de Brevibacillus, compreendendo: B. agri, B. aydinogluensis, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. fluminis, B. formosus, B. fulvus, B. ginsengisoli, B. invocatus, B. laterosporus, B. levickii, B. limnophilus, B. massiliensis, B. nitrificans, B. panacihumi, B.
parabrevis, B. reuszeri ou B. thermoruber.
[0023] Em aspectos selecionados, a célula de Lysinibacillus é uma espécie de Lysinibacillus, compreendendo: Lysinibacillus sphaericus, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus acetophenoni, Lysinibacillus alkaliphilus, Lysinibacillus chungkukjangi, Lysinibacillus composti, Lysinibacillus contaminans, Lysinibacillus cresolivorans, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus manganicus, Lysinibacillus mangiferihumi, Lysinibacillus massiliensis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus odysseyi, Lysinibacillus pakistanensis, Lysinibacillus parviboronicapiens, Lysinibacillus sinduriensis, Lysinibacillus tabacifolii, Lysinibacillus varians, Lysinibacillus xylanilyticus ou Lysinibacillus halotolerans.
[0024] Em aspectos selecionados, a célula de Viridibacillus é uma espécie de Viridibacillus, compreendendo: Viridibacillus arvi, Viridibacillus arenosi ou Viridibacillus neidei.
[0025] Em aspectos alternativos, a divulgação provê uma composição compreendendo: a) uma ou mais células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospório que expressam a proteína de fusão de qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína de crescimento da planta ou imunoestimulante; e b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0026] Em aspectos alternativos, a divulgação provê uma semente tratada com pelo menos um dos ácidos nucleicos, proteínas de fusão, células bacterianas ou composições de qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento.
[0027] Em aspectos alternativos, a divulgação provê um método de tratamento de uma planta, semente, uma parte de planta, ou do solo no entorno da planta para aumentar o crescimento da planta e/ou promover a saúde da planta compreendendo a etapa de simultaneamente ou sequencialmente aplicar: a) endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtores de exospórios que expressam a proteína de fusão de qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína de crescimento da planta ou imunoestimulante; e b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[0028] Em aspectos alternativos, a divulgação provê um método de rastreio de uma planta hospedeira tratada com um endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, compreendendo as seguintes etapas: a) aplicação de uma composição compreendendo um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus modificado para expressar uma proteína de fusão de acordo com qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento, a uma semente, uma muda ou uma planta vegetativa capaz de estar permanentemente ou transitoriamente colonizada por um Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, para produzir uma semente tratada, muda ou planta vegetativa; b) rastreio da semente tratada, muda ou planta vegetativa ao se detectar e opcionalmente medir um traço, componente, ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
[0029] Em aspectos selecionados, a etapa de rastreio compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos um ensaio in vitro compreendendo detectar e opcionalmente quantificar a presença, nível, mudança no nível, atividade ou localização de um ou mais compostos contidos em um extrato preparado a partir de uma célula ou amostra de tecido obtidos a partir da semente tratada, muda ou planta vegetativa;
e/ou (b) pelo menos um ensaio in vivo compreendendo detectar e opcionalmente quantificar um traço, componente, ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
[0030] Em aspectos alternativos, a divulgação provê um método de rastreio de proteínas heterólogas ou peptídeos expressados em uma célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para propriedades agricolamente significativas, compreendendo: (a) modificar uma célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para expressar uma proteína de fusão de acordo com os aspectos divulgados no presente documento para produzir uma célula recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; e (b) rastreio da célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus ao detectar e opcionalmente quantificar um nível ou atividade de um composto produzido pela célula recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[0031] Em aspectos alternativos, a divulgação provê um método de tratamento de uma planta, uma semente de planta, um ser humano ou um animal, compreendendo: administrar à planta, semente de planta, ser humano ou animal uma composição compreendendo um exospório isolado a partir de um endósporo produzido por uma célula recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; em que a célula recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus expressa a proteína de fusão de qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento. Em aspectos selecionados, o animal pode incluir animais criados como rebanho para pecuária, tal como gado.
[0032] Em aspectos selecionados, a composição foi inativada termicamente ou esterilizada de forma que nenhuma célula não viável de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus permaneça.
[0033] Em aspectos alternativos, a divulgação provê uma composição compreendendo uma proteína de fusão isolada e/ou purificada de acordo com qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento.
[0034] Em aspectos alternativos, a divulgação provê uma composição compreendendo um exospório isolado e/ou purificado produzido por um endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão de acordo com qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento.
[0035] Em aspectos alternativos, a divulgação provê uma composição compreendendo an exospório produzido por um endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão de acordo com qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento.
[0036] Em aspectos selecionados, o exospório produzido por um endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus compreende: (a) uma camada basal de um exospório; (b) uma camada do tipo cabelo de um exospório; (c) uma mistura de ambos (a) e ( b); (d) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; e/ou (e) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que é enriquecido em uma quantidade ou concentração da proteína de fusão comparado com uma mesma quantidade do exospório bruto.
[0037] Em aspectos alternativos, a divulgação provê um método de liberação de uma proteína de interesse a uma planta, semente ou campo, compreendendo: aplicar uma composição compreendendo um exospório obtido a partir de um endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus a uma planta, semente ou campo; em que o endósoporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus foi modificado para expressar uma proteína de fusão de acordo com qualquer um dos aspectos divulgados no presente documento.
[0038] Em aspectos selecionados, a composição é aplicada a um campo: (a) pré- ou pós-plantio; (b) pré- ou pós-emergência; (c) como um pó, suspensão ou solução; ou (d) em que a composição ainda compreende um ou mais compostos adicionais que estimulam o crescimento da planta.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0039] A FIG. 1 mostra um primeiro alinhamento sequencial das sequências de aminoácido da porção N-terminal de várias proteínas de Brevibacillus que possuem variantes de um peptídeo de sinal N-terminal de acordo com um aspecto exemplificador da divulgação. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.
[0040] A FIG. 2 mostra um segundo alinhamento sequencial das sequências de aminoácido da porção N-terminal de várias proteínas de Brevibacillus que possuem variantes de um peptídeo de sinal N-terminal de acordo com um aspecto exemplificador da divulgação. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.
[0041] A FIG. 3 mostra um terceiro alinhamento sequencial das sequências de aminoácido da porção N-terminal de várias proteínas de Brevibacillus que possuem variantes de um peptídeo de sinal N-terminal de acordo com um aspecto exemplificador da divulgação. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.
[0042] A FIG. 4 mostra um alinhamento sequencial das sequências de aminoácido da porção N-terminal de várias proteínas de Lysinibacillus que possuem variantes de um peptídeo de sinal N- terminal de acordo com um aspecto exemplificador da divulgação. A consensus sequence (SEQ ID NO: 41) é mostrada abaixo do alinhamento.
[0043] A FIG. 5 mostra um alinhamento sequencial das sequências de aminoácido da porção N-terminal de várias proteínas de
Lysinibacillus que possuem variantes de um peptídeo de sinal N- terminal de acordo com um outro aspecto exemplificador da divulgação. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.
[0044] A FIG. 6 mostra um alinhamento sequencial das sequências de aminoácido da porção N-terminal de várias proteínas identificadas em cepas de Viridibacillus sp. (por exemplo, SEQ ID NOs: 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213 e 217) que possuem variantes de um peptídeo de sinal N-terminal de acordo com um aspecto exemplificador da divulgação. Uma sequência consenso (isto é, SEQ ID NO: 179) é mostrada abaixo do alinhamento. Vários grupos de cepas de Viridibacillus sp. expressaram proteínas tendo um peptídeo de sinal N- terminal idêntico.
[0045] A FIG. 7A mostra um micrográfico em campo claro (lado esquerdo) e epifluorescente (lado direito) (1000x de amplificação) de um endósporo de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 expressando uma sequência de direcionamento N-terminal exemplificadora de acordo com a divulgação, especificamente um construto de proteína de fusão tdTomato que está localizado na superfície do endósporo conforme ilustrado por esta figura. A fluorescência produzida por tdTomato no painel direito corresponde com a imagem dos esporos observados com o microscópio de campo claro no painel esquerdo indicando a localização correta do tdTomato na superfície do endósporo.
[0046] A FIG. 7B mostra um histograma de citometria de fluxo de endósporos de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 expressando a mesma sequência de direcionamento N-terminal exemplificadora usada para transformar os endósporos mostrados na FIG. 7A. Os endósporos de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 do tipo selvagem sem nenhuma fluorescência tdTomato observável são mostrados para comparação (traço de linha pontilhada, área aberta). 50,000 eventos são registrados para cada população mostrada na figura.
[0047] A FIG. 8A mostra um micrográfico em campo claro (lado esquerdo) e epifluorescente (lado direito) (1000x de amplificação) de um endósporo de Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 expressando uma sequência de direcionamento N-terminal exemplificadora de acordo com a divulgação, especificamente um construto de proteína de fusão tdTomato o qual está localizado na superfície do endósporo conforme ilustrado por esta figura. A fluorescência produzida por tdTomato no painel direito corresponde com a imagem dos esporos observados com a microscopia de campo claro no painel esquerdo indicando a localização correta do tdTomato na superfície do endósporo.
[0048] A FIG. 8B mostra um histograma de citometria de fluxo de endósporos de Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 expressando a mesma sequência de direcionamento N-terminal exemplificadora usada para transformar os endósporos mostrados na FIG. 8A. Os endósporos de Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 do tipo selvagem com nenhuma fluorescência tdTomato observável são mostrados para comparação (traço de linha pontilhada, área aberta). 50,000 eventos são registrados para cada população mostrada na figura.
[0049] A FIG. 9A mostra um micrográfico em campo claro (lado esquerdo) e epifluorescente (lado direito) (1000x de amplificação) de um endósporo de Viridibacillus sp. NRRL B-67869 expressando uma sequência de direcionamento N-terminal exemplificadora de acordo com a divulgação, especificamente um construto de proteína de fusão tdTomato o qual está localizado na superfície do endósporo conforme ilustrado por esta figura. A fluorescência produzida por tdTomato no painel direito corresponde com a imagem dos esporos observados com a microscopia de campo claro no painel esquerdo indicando a localização correta do tdTomato na superfície do endósporo.
[0050] A FIG. 9B mostra um histograma de citometria de fluxo de endósporos de Viridibacillus sp. NRRL B-67869 expressando a mesma sequência de direcionamento N-terminal exemplificadora usada para transformar os endósporos mostrados na FIG. 9A. Os endósporos de Viridibacillus sp. NRRL B-67869 do tipo selvagem com nenhuma fluorescência tdTomato observável são mostrados para comparação (traço de linha pontilhada, área aberta). 50,000 eventos são registrados para cada população mostrada na figura.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0051] A divulgação provê construtos genéticos capazes de direcionar uma proteína de fusão a um exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, assim como composições e métodos que usam esses construtos para liberar moléculas heterólogas de interesse (por exemplo, peptídeos, proteínas) a vários ambientes, tais como plantas. Por exemplo, ao seguir o tratamento com os endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, as plantas tratadas podem ser rastreadas para detectar mudanças que sejam atribuídas à proteína heteróloga liberada através dos endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. As referidas mudanças podem incluir alterações na taxa de crescimento ou rendimento da planta hospedeira; saúde da planta melhorada (por exemplo, resistência ao estresse ambiental, doença ou pragas); e a exibição de atributos intensificados, modificados ou de outra forma novos, em comparação com as plantas hospedeiras crescidas sob as mesmas condições sem tratamento com os endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. O uso de uma sequência de direcionamento que direciona de forma eficiente a proteína heteróloga ao exospório também provê uma plataforma para rastreio de alto desempenho para proteínas heterólogas úteis que, por exemplo, são capazes de aumentar, modificar, e/ou conferir novos traços ou atributos às plantas.
[0052] As bactérias Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus produzem endósporos que contêm uma camada de exospório. Esta estrutura está ausente em B. subtilis, o qual produz endósporos que terminam em um revestimento de esporo externo. O processo de formação de esporos canônico (elucidado com base em estudos usando B. subtilis) envolve a divisão celular assimétrica de uma célula vegetativa para formar uma célula mãe e um foresporo, que se desenvolvem como dois compartimentos distintos separados por um septo interveniente. Por fim, o peptidoglicano no septo é degradado e o foresporo é engolfado pela célula mãe, formando uma célula dentro de uma célula. A comunicação intercelular entre a célula mãe e o foresporo coordena a expressão genética específica celular em cada célula, resultando na produção de compostos endósporo-específicos, formação de uma camada de córtex em torno do foresporo e a deposição do revestimento.
[0053] Em algumas espécies de Bacillus, por exemplo, B. subtilis, B. licheniformis e B. pumilus, este revestimento irá se tornar a camada mais externa do endósporo. Em muitas espécies do grupo B. cereus, o foresporo é ainda encerrado por um exospório de encaixe frouxo e tipo balão composto por uma camada basal paracristalina circundada por uma camada de raiz semelhante a cabelos. Nessas espécies, o exospório é separado do revestimento por uma região de ligação intersticial conhecida como interespaço. Em qualquer caso, após a formação de uma camada de revestimento terminal ou exospório, o foresporo sofre uma desidratação e maturação finais em um endósporo completo. A célula mãe é subsequentemente degradada através de morte celular programada, resultando em uma liberação do endósporo no ambiente. Tipicamente, o endósporo permanecerá em estado dormente até que mais condições favoráveis ou estímulos particulares desencadeiem a germinação e um retorno ao estado vegetativo.
[0054] Como a superfície mais externa entre o esporo e o ambiente,
a camada de revestimento (ou exospório, em espécies formadoras de exospório) serve a muitas funções cruciais. Em particular, esta camada age como uma barreira semipermeável a insultos ambientais e media as interações com o solo e assim tem um papel importante na manutenção da viabilidade do esporo e na detecção de condições que desencadeiem a germinação do endósporo. A camada de revestimento é também um alvo de pesquisa clínica já que contém moléculas de superfície celular em cepas patogênicas de bactérias que contribuem para o reconhecimento de células imunes do hospedeiro. Os métodos de exibição de proteínas heterólogas no revestimento do esporo de B. subtilis foram desenvolvidos usando construtos de proteína de fusão contendo uma proteína de revestimento de esporos de B. subtilis tal como CotC fundida a uma proteína de interesse. No entanto, B. subtilis carece de um exospório e então estudos usando essa espécie falham ao prover orientação como as proteínas de fusão podem ser direcionadas ao exospório produzido por outros gêneros bacterianos, tais como Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[0055] Em contraste, a divulgação provê construtos N-terminais e proteínas de fusão compreendendo as mesmas que são capazes de direcionar os construtos de proteína de fusão ao exospório de células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. A sequência de sinal N- terminal usada para direcionar a proteína de fusão ao exospório pode compreender um polipeptídeo tendo uma sequência representada por qualquer uma das sequências divulgadas no presente documento, contanto que a referida sequência seja compatível com o gênero bacteriano selecionado (isto é, uma sequência mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3 para Brevibacillus, tabela 2 ou FIGs. 4-5 para Lysinibacillus, tabela 3 ou FIG. 6 para Viridibacillus ou um fragmento ou variante de qualquer uma dessas sequências as quais retêm a funcionalidade de direcionamento ao exospório no gênero bacteriano correspondente).
Em modalidades selecionadas, esta sequência de sinal N-terminal pode compreender um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências divulgadas no presente documento, suficientes para reter a funcionalidade de direcionamento ao exospório no mesmo gênero bacteriano. Essas e outras modalidades são descritas no presente documento.
[0056] Ao longo da divulgação, o termo “compreendem” ou qualquer derivado do mesmo (por exemplo, compreendendo, compreende) pode ser substituído com “consistem essencialmente em”, “consistem em” ou do derivado correspondente aplicável do mesmo.
[0057] Conforme usado no presente documento, “Brevibacillus” refere-se a bactérias que produzem endósporos classificadas no gênero Brevibacillus. Este termo abrange, sem limitação, vários membros da família Brevibacillus incluindo B. agri, B. aydinogluensis, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. fluminis, B. formosus, B. fulvus, B. ginsengisoli, B. invocatus, B. laterosporus, B. levickii, B. limnophilus, B. massiliensis, B. nitrificans, B. panacihumi, B. parabrevis, B. reuszeri ou B. thermoruber.
[0058] Conforme usado no presente documento, “Lysinibacillus” refere-se a bactérias que produzem endósporos classificadas no gênero Lysinibacillus. Este termo abrange, sem limitação, vários membros da família incluindo Lysinibacillus sphaericus, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus acetophenoni, Lysinibacillus alkaliphilus, Lysinibacillus chungkukjangi, Lysinibacillus composti, Lysinibacillus contaminans, Lysinibacillus cresolivorans, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus manganicus, Lysinibacillus mangiferihumi, Lysinibacillus massiliensis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus odysseyi, Lysinibacillus pakistanensis, Lysinibacillus parviboronicapiens, Lysinibacillus sinduriensis, Lysinibacillus tabacifolii, Lysinibacillus varians, Lysinibacillus xylanilyticus e Lysinibacillus halotolerans.
[0059] Conforme usado no presente documento, “Viridibacillus” refere-se a bactérias que produzem endósporos classificadas no gênero Viridibacillus. Este termo abrange, sem limitação, vários membros da família Viridibacillus incluindo Viridibacillus arvi, Viridibacillus arenosi, eViridibacillus neidei.
[0060] Em certos aspectos, o membro Brevibacillus usado para expressar a proteína de fusão é Brevibacillus brevis (anteriormente classificado como Bacillus brevis), o membro Lysinibacillus usado para expressar a proteína de fusão é Lysinibacillus sphaericus (anteriormente classificado como Bacillus sphaericus), e o membro Viridibacillus usado para expressar a proteína de fusão é Viridibacillus arvi (anteriormente classificado como Bacillus arvi). Cada uma dessas espécies bacterianas é uma bactéria formadora de esporos, Gram- positiva, aeróbica comumente isolada dos solos.
[0061] A caracterização de uma bactéria como um Bacillus brevis, Bacillus sphaericus ou Bacillus arvi foi anteriormente baseada somente em características morfológicas simples e um número limitado de testes bioquímicos. No entanto, estudos genômicos recentes revelaram que vários membros do gênero Bacillus são tão distintos no nível do DNA, resultando na reavaliação da posição taxonômica de múltiplas espécies, incluindo a espécie agora identificada como B. brevis, L. sphaericus e V. arvi. Surpreendentemente, ambos o 16S rRNA e a análise completa do genoma deste gênero revelam que ele é um membro da família Planococcaceae em vez da família Bacillaceae, conforme foi originalmente classificado. Os estudos anteriores indicaram que os esporos de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus possuem uma camada de exospório. No entanto, diferente do exospório no grupo B. cereus, comparativamente pouco se sabe acerca da composição e estrutura do exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
Dada a falta geral de conhecimento acerca da composição ou estrutura básica do exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, pouco se sabe acerca do processo pelo qual as proteínas são direcionadas ao exospório de membros desses gêneros durante a formação desta camada.
[0062] Em certos aspectos, o membro de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus usado para expressar a proteína de fusão é uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99 por cento de identidade com um gene 16S rRNA de B. brevis, L. sphaericus, V. arvi ou qualquer outro membro da família Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus exemplificador divulgado no presente documento. Alternativamente, o membro de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus usado para expressar a proteína de fusão é uma bactéria que possui um valor de hibridização de DNA-DNA de pelo menos 70 por cento daquele de B. brevis, L. sphaericus, V. arvi ou qualquer outro dos membros da família Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus exemplificadores divulgados no presente documento. Em um outro caso, o membro de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus usado para expressar a proteína de fusão é uma bactéria que possui uma identidade nucleotídica média de 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento daquele de B. brevis, L. sphaericus, V. arvi ou qualquer outro dos membros da família Brevibacillus exemplificadores divulgados no presente documento.
[0063] O termo “sequência de sinal N-terminal” geralmente refere- se a uma sequência polipeptídica localizada em ou próximo ao amino terminal de um polipeptídeo, o qual direciona a localização do polipeptídeo a um compartimento subcelular ou para secreção. Reconhece-se e se compreende que este termo pode ser usado de forma intercambiável com os termos “sequência de direcionamento N- terminal”, “sequência de direcionamento”, “sequência de sinal” e
“peptídeo de sinal” dependendo do contexto. A sequência de sinal N- terminal pode ser retida como parte da sequência polipeptídica de uma proteína madura ou alternativamente clivada durante ou depois do processo de localização. Este termo pode ser usado para se referir especificamente a uma sequência polipeptídica localizada em ou próximo ao amino terminal de um polipeptídeo, o qual direciona a localização do polipeptídeo ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Neste contexto, a única funcionalidade necessária da sequência de sinal N-terminal é a capacidade de direcionar o polipeptídeo do qual faz parte do exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. As sequências de direcionamento N-terminal compatíveis com Brevibacillus são mostradas na tabela 1 e FIGs. 1-3, as sequências de direcionamento N-terminal compatíveis com Lysinibacillus são mostradas na tabela 2 e FIGs. 4-5, e as sequências de direcionamento N-terminal compatíveis com Viridibacillus são mostradas na tabela 3 e FIG. 6. Conforme observado acima, o uso intergenérico de sequências de direcionamento N-terminal não está previsto por esta divulgação.
[0064] Uma “planta” ou “planta hospedeira” inclui qualquer planta que possui uma rizosfera ou filosfera na qual Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus pode colonizar, assim como plantas que podem servir como hospedeiros transitórios para bactérias de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. A colonização não é um requerimento para os métodos descritos no presente documento e as composições funcionarem, porém ela pode ser preferida em certos aspectos da divulgação.
[0065] Conforme usado no presente documento, “controle biológico” é definido como controle de um patógeno e/ou inseto e/ou acarídeo e/ou um nematoide pelo uso de um segundo organismo ou uma molécula biológica. Os mecanismos conhecidos de controle biológico incluem bactérias que controlam a podridão da raiz ao superar os fungos por espaço ou nutrientes sobre a superfície da raiz. Toxinas bacterianas, tais como antibióticos, têm sido usadas para controlar patógenos. A toxina pode ser isolada e aplicada diretamente à planta ou a espécie bacteriana pode ser administrada de modo que ela produza a toxina in situ. Outros meios de exercer o controle biológico incluem a aplicação de certos fungos que produzem ingredientes ativos contra um fitopatógeno alvo, inseto, ácaro ou nematoide ou atacar a praga/patógeno alvo. O “controle biológico” também pode abranger micro-organismos tendo um efeito benéfico na saúde da planta, crescimento, vigor, resposta ao estresse ou rendimento. As vias de aplicação incluem aplicação por pulverização, aplicação no solo e tratamento de sementes.
[0066] “Hibridização” refere-se a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através da ligação hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo. A ligação hidrogênio pode ocorrer pelo paramento de bases Watson-Crick, ligação Hoogstein ou de qualquer outra forma específica em sequência. O complexo pode compreender dois filamentos formando uma estrutura duplex, três ou mais filamentos formando um complexo multifilamentado, um filamento auto-hibridizante único ou uma combinação destes. As reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de “estringência” diferente. Em geral, uma reação de hibridização de baixa estringência é realizada em cerca de 40°C em 10x SSC ou uma solução de resistência/temperatura iônica equivalente. Uma hibridização de estringência moderada é tipicamente realizada em cerca de 50°C em 6x SSC, e uma reação de hibridização de alta estringência é geralmente realizada em cerca de 60°C em 1x SSC.
[0067] Conforme usado no presente documento, o termo
“identidade sequencial” refere-se ao grau no qual duas sequências de polinucleotídeo ou aminoácido são idênticas (isto é, em uma base de nucleotídeo-a-nucleotídeo ou resíduo-a-resíduo, respectivamente) sobre a janela de comparação. A porcentagem de identidade sequencial é calculada pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G para a sequência de polinucleotídeos) ocorre em ambas as sequências para render o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade sequencial. Um cálculo equivalente pode ser realizado ao se comparar duas sequências alinhadas de aminoácidos.
[0068] Com relação à comparação das sequências de aminoácidos, além da medição da identidade sequencial, uma comparação também pode levar em consideração se as mudanças residuais constituem substituições “conservadoras”. As substituições de aminoácidos conservadoras referem-se à intercambialidade de resíduos tendo similares cadeias laterais. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais hidroxila alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-
glutamina. Sequências de direcionamento N-terminal
[0069] A divulgação provê sequências de direcionamento N- terminal a partir de bactérias de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus. Sob condições ambientais estressantes, as bactérias da família de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus sofrem esporulação e formam endósporos que podem permanecer dormentes por períodos estendidos de tempo. A camada mais externa dos endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus é conhecida como o exospório e compreende uma camada basal, e em algumas cepas, anexos/filamentos/estruturas externas compreendidas de proteína do tipo colágeno.
[0070] Estudos reportados anteriormente no exospório das bactérias a partir de outros gêneros determinaram que o exospório é predominantemente formado por uma glicoproteína do tipo colágeno, por exemplo, BclA, em endósporos de B. anthracis. Entende-se que a camada basal seja compreendida atualmente de várias proteínas diferentes. BclA, o principal constituinte do filamento superficial de B. anthracis, se mostrou estar presa ao exospório com o seu amino- terminal (N-terminus) posicionada na camada basal e é seu carbóxi- terminal (C-terminal) se estendendo para fora do esporo. Verificou-se anteriormente que certas sequências a partir das regiões N-terminal de BclA e BclB poderiam ser usadas para direcionar um peptídeo ou proteína ao exospório de um endósporo do membro da família de B. cereus. Vide Publicação da Patente Norte-americana Nos. 2010/0233124 e 2011/0281316, e Thompson, et al., “Targeting de the BclA and BclB Proteins to the Bacillus anthracis Spore Surface,” Molecular Microbiology, 70(2):421-34 (2008), cuja totalidade de cada uma delas é aqui incorporada a título de referência.
[0071] Apesar o corpo crescente de literatura disponível em relação às sequências de direcionamento do exospório de B. cereus, não existem estudos reportados identificando sequências de direcionamento N-terminal homólogas em Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Uma análise bioinformática das proteínas de repetição do tipo colágeno direcionado ao exospório conhecidas BclA, BclB ou BetA falha para revelar quaisquer sequências de direcionamento N-terminal homólogas em Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, sugerindo que as sequências de direcionamento de exospório dessas proteínas é altamente específica à família de B. cereus. Dada a limitada caracterização das proteínas que se formam e se localizam no exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, não se pode facilmente deduzir as sequências de sinal N-terminal necessárias para direcionar proteínas ao exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus geralmente ou em particular espécies dentro desses gêneros (por exemplo, B. brevis, L. sphaericus ou V. arvi).
[0072] Apesar desta falta de orientação na literatura disponível, os inventores identificaram sequências de direcionamento N-terminal capazes de direcionar proteínas endógenas e de fusão ao exospório das células de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus.
[0073] Para facilidade de referência, as SEQ ID Nos. para as sequências nucleotídicas e polipeptídicas referidas no presente documento são listadas na tabela 1 abaixo. Tabela 1: Sequências de direcionamento N-terminal de Brevibacillus exemplificadoras Identificador da Sequência sequência
MPFSNKIVNGDFETGTLIPWSSXNVAITNLQSHTGFFSALLFGNTA
NSLLFQAVPVTPGDSFEFFLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVAATPV SEQ ID NO: 1
GIGLNXTIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATATQALLIIHKIPSLS TADIVVDDIVLLQTSG
MVRTLSKIEDSTYTTLAPINPIMEVVIYLPFSNKVVNGDFETGTLFP SEQ ID NO: 2 WSFTNVSITNLQSHTGFFSALLFGDTANSLLFQAIPVTPGDSFELFL
SIAKLGNLVSPQVNIALXYLDVATIPVGIGLNLTIPVGHLPDNTANIW
Identificador da Sequência sequência
TTIYETTSVVPATATQALLIINKIPALSTADIVVDDIGILQTSG SEQ ID NO: 3 MLPLIFPPQGCPAIFPGPTLDPPDPPDPP
MMILTIKIFRKERAKINDKRANAFNKKILPLIFPPQGCPAIFPGPTLDP SEQ ID NO: 4
PDPPDPP
MKELHDIKRIWDEVANTDLEEFTRKNPIYMKSSNGISSSSSTFCWT SEQ ID NO: 5
FIR
MKELHDIKRIWDEVANTDLEEFTRKNPIYMKSSNGISSSSSTFCWT SEQ ID NO: 6
FIRGKT MVLALSKIGESTYNASVPINLIMEVVIYLPFSNIVENGNFESGTLFPW
SFTNAAITDLQSHSGFFSALLFGGTANSLLFQTVPVTPGDSFELFLS SEQ ID NO: 7
IAKSGNLISPQVNIVLIYLDAANIPVGIGLNLTIPVGHLPDNTANIWTTI YETTAVVPATAIEALLIISKVPAL-STADVILDDIELLQTSG MKAVIYLPFGNKIVNGNFETGSLVPWNFSNVTINNLQSHTGSFSAL
FFGNTTNSVLYQTVPVTSGEIFEFFLSIGKIGNLPSPQVNIALIYLNA SEQ ID NO: 8
ASTPENIGINIILPVGKLPNNLNNNWSTIYEISSVVPAAATQAMVIIHKI PAPSTADIVVDDIVLVQTGA MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVAISNLQSHTGSYSALLFGNAA
NSFLFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPQVDIALIYLNAASTPISN SEQ ID NO: 9
GMSIILPTGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPAMATHAMVIIHKIPSPST SDIVVDDIVLVQTGA
NKVVNGDFETGTLFPWSFTNVSITNLQSHTGFFSALFFGDTANSLL SEQ ID NO: FQAIPVTPGDSFELFLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVATIPVGIGLNL 10 TIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATATQALLIINKISALSTADIVVD
DIGILQTSG
MFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPEVNIALIYLNVASTPISIGMS SEQ ID NO: IILPIGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPATATHAMVIIHKIPSP- 11
STSDIVVDDIVLVQTGA
MKAVIYLPLGNKIVNGNFETGSLVPWNFSNVAIYNLQSHTGSFSAL SEQ ID NO: FFGNTTNSVLYQTVPVTSGEIFEFFLSIGKIGNLPSPQVNIALIYLNA 12 ASTPENIGINIILPVGKLPNNLNNNWSTIYEISSVVPAAATQAMVIIHKI
PAPSTADIVVDDIVLVQTGA
MPFSNKIVNGDFETGTLIPWSFVNVAITNLQSHTGFFSAQLFGTTA SEQ ID NO: NSLLFQAVPVTPGDSFEFFLSIAKLGNLLSPQVNIALLYLDVAATPV 13 GIGLNITIPIGHLPDNAANIWTTIYETTTVVPATATQALLIINKIPTLTTA
DIVVDDIALLQVSG SEQ ID NO: MFLSIAKSGNVISPQVNIVLIYLDVANIPVGIGLNLTIPVGHLPDNTAN 14 IWTTIYETTSVVPATAIEALLIINKVPALSTADVILDDIGLLQTSG
LLPWSFTNAAITDLQSHSGFFSALLFGGTANSLLFQTVPVTPGDSF SEQ ID NO:
ELFLSIAKSGNLISPQVNIVLIYLDAANIPVGIGLNLTIPVGHLPDNTA 15
NIWTTIYETTAVVPATAIEALLIISKVPALSTADVILDDIELLQTSG MPFSNKIVNGDFETGTLIPWSFTNVAITNLQSHSGFFSARLFGTTV
NSLLFQSVPVTPGDSFEFFLSIAKLGTLLSPQVNIALLYLDVTATPVG SEQ ID NO: IGLNITIPIGHLPDNTANIWTTIYETTTVVPATATQALLIINKIPTLTTADI 16 VVDDIELLQVSG
Identificador da Sequência sequência
MSFINKIVNGDFETGTLIPWSFVNVAINPLQSHTGFFSARLFGNTAN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTPGDSFEFFLSIAKIGNLTSPQVNIVLFYLDALANPISL 17 GLNITIPSGHLPDNVDNNWTTIYETTSAVPATATQALLIINKIPALFTT
ADIVVDDIALLQTGAGV
MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVVISNLQSHTGSYSALLFGNEA SEQ ID NO: NSLMFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPQVNIALIYLNVASTPISI 18 GMSIILPIGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPATATHAMVIIHKIPSPSTS
DIVVDDIVLVQTGA
MPVKNRAVNGDFETGSLVPWNSINVTISNQQSHSGTFSALLFGTS SEQ ID NO: ANSLLFQTVPVITGDSFEFFLSIAKIGNLPSPQVNIAVIYVNATSTPLS 19 IGMSVILPVNHLPNNLNNNWLTIYNTTSVVPVTATQAIIIIHKIPAPST
ADIVVDDIALIQTGG
MPFSNKIVNGNFETGALIPWSSINVAITNLQSHTGFFSARLFGNTTN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTPGDSFEFLLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVTATPVGI 20 GLNFTIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATATQALLIINKIAALSTA
DIVVDDIGILQTSG
MPFSNKIVNGNFETGALIPWSSINVAITNLQSHTGFFSARLFGNTTN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTPGDSFEFLLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVTATPVGI 21 GLNFTIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATAIQALLIIEKVAALTTA
DVVVDDIQLLQTSG MFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPEVNIALIYLNVASTPISIGMS SEQ ID NO:
IILPIGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPATATHAMVIIHKIPSPSTSDIVV 22
DDIVLVQTGA
MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVVISNLQSHTGSYSALLFGNAA SEQ ID NO: NSLMFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPQVNIALIYLNVASTPISI 23 GMSIILPIGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPATATHAMVIIHKIPSPSTS
DIVVDDIVLVQTGA
MPFSNKIVNGNFETGALIPWSSINVAITNLQSHTGFFSARLFGNTTN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTLGDSFEFLLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVTATPVGI 24 GLNFTIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATAIQALLIIEKVAALTTA
DVVVDDIQLLQTSG MVRTLSKIEDSTYTTLAPINPIMEVVIYLPFSNKVVNGDFETGTLFP
WSFTNVSITNLQSHTGFFSALLFGDTANSLLFQAIPVTPGDSFELFL SEQ ID NO: SIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVATIPVGIGLNLTIPVGHLPDNTANIWT 25 TIYETTSVVPATATQALLIINKISALSTADIVVDDIGILQTSG
MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVAISNLQSHTGSYSALLFGNAA
NSFLFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPQVDIALIYLNAASTPISI SEQ ID NO: GMSIILPTGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPAMATHAMVIIHKIPSPST 26 SDIVVDDIVLVQTGA
MVRTLSKIEDSTYTTLAPINPIMEVVIYLPFSNKVVNGDFETGTLFP
WSFTNVSITNLQSHTGFFSAILFGDTANSLLFQAIPVTPGDSFELFL SEQ ID NO: SIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVATIPVGIGLNLTIPVGHLPDNTANIWT 27 TIYETTSVVPANATQALLIINKISALSTADIVVDDIGILQTSG
Identificador da Sequência sequência
GDFETGTLFPWSFTNVSITNLQSHTGFFSAILFGDTANSLLFQAIPV SEQ ID NO: TPGDSFELFLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVATIPVGIGLNLTIPVGH 28 LPDNTANIWTTIYETTSVVPANATQALLIINKISALSTADIVVDDIGILQ
TSG
MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVAISNLQSHTGSYSALLFGNTA SEQ ID NO: NSLMFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSAQVNIALIYLNVASTPISI 29 GMSIILPIGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPAMATHAMVIIHKIPSPSTS
DIVVDDIVLVQTGA
MPFSNKIVNGDFETGTLIPWSSINVAITNLQSHTGFFSARLFGNTAN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTPGDSFEFLLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVTATPVGI 30 GLNLTIPVGHLPDNTADIWTTIYETTSVVPATAIQALLIIEKVPGLTTA
DVVVDDIELLQTSG
MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVAISNLQSHTGSYSALLFGNTA SEQ ID NO: NSLMFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSAQVNIALIYLNVASTPISI 31 GMSIILPIGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPAMATHAMVIIHKIPSPSTS
DIVVDDIVFVQTGA SEQ ID NO: VYLNVVATPIGIGMSTILPIDHLPDNTNKNWTTIYETTSVVPATAIRAL 32 VIIHKIPSPSTADIVVDDIVLLQTGL
MPFSNKIVNGDFETGTLIPWSSINVAITNLQSHTGFFSARLFGNIAN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTPGDSFEFLLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVTATPVGI 33 GLNLTIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATAIQALLIIEKVASLTTA
DVVVDDIELLQTSG
MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVVISNLQSHTGSYSALLFGNAA SEQ ID NO: NSLMFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPQVNIALIYLNVASTPISI 34 GMSIILPIDHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPATATHAMVIIHKIPSPSTS
DIVVDDIVLVQTGA
MPFSNKIVNGDFETGTLIPWSSINVAITNLQSHTGFFSARLFGNIAN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTPGDSFEFLLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVTATPVGI 35 GLNFTIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATAIQALLIIEKVASLTTA
DVVVDDIELLQTSG SEQ ID NO: FELFLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVATIPVGIGLNLTIPVGHLPDNT 36 ANIWTTIYETTSVVPATATQALLIINKIAALSTADIVVDDIGILQTSE
MPFGNKIVNGNFETGSLIPWSSSNVVISNLQSHTGSYSALLFGNAT SEQ ID NO: NSLMFQAVPVTVGDSFEFFLSIAKIGNLPSPQVNIALIYLNVASTPISI 37 GMSIILPIGHLPDNLNNNWSTIYEISSVVPATATHAMVIIHKIPSPSTS
DIVVDDIVLVQTGA
MPFSNKIVNGDFETGTLIPWSSINVAITNLQSHTGFFSARLFGNIAN SEQ ID NO: SLLFQAVPVTPGDSFEFLLSIAKLGNLVSPQVNIALLYLDVTATPVGI 38 GLNFTIPVGHLPDNTANIWTTIYETTSVVPATATQALLIINKIAALSTA
DIVVDDIGILQTSE Tabela 2: Sequências de direcionamento N-terminal de Lysinibacillus exemplificadoras
Identifica- dor da Sequência sequência
ATGCGCTTTAGCTATAGCCGCAACTTTGATAACTTTAAATGCGATA SEQ ID NO:
GCAAATGCAACTATCCGATGAAATATAAATGCAACGAATTTGGCT 39
GCAACGGCTATCCGTATGATCTGAGCGGCATTCAGGATCCGATT ATGCATTTTGGCAACTTTAACCTGGATCGCGTGTGCAGCAAATGC SEQ ID NO:
AACAGCTTTCCGTGCTGCTGCAAAACCGGCCCGATTCCGAGCTG 40
CCCGATTTGGCCGGTGAAACCGACC SEQ ID NO:
MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 41 SEQ ID NO:
MHFGNFNLDRVCSKCNSFPCCCKTGPIPSCPIWPVKPT 42 SEQ ID NO:
MRFSYNRNFDNFKCDAKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYVYGIEDPI 43 SEQ ID NO:
MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 44 SEQ ID NO:
MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPM 45 SEQ ID NO:
MRFSYSRNFDYFKCDSKCNYPMKYKCYEFGCNGYPYDFSGIQDPI 46 SEQ ID NO:
MRFSYSRNSDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 47 SEQ ID NO:
MRFSYSRNFDNFKCDSKSNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 48 SEQ ID NO:
MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFLGIQDPI 49 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLLGIQDPI 50 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPLKFKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 51 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYNLSGIQDPI 52 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPKKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 53 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPLKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 54 SEQ ID NO: MRLSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 55 SEQ ID NO: LRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 56 SEQ ID NO: MRFRYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 57 SEQ ID NO: MRVSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 58
Identifica- dor da Sequência sequência SEQ ID NO: MRFSYSRYFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 59 SEQ ID NO: MRISYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPM 60 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQEPM 61 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDLI 62 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQVPI 63 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKFNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 64 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDYFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 65 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKNKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 66 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSAIQDPI 67 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGFQDPI 68 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGFQDPT 69 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNYKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 70 SEQ ID NO: MRFSYCRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 71 SEQ ID NO: MRFSYSRNLDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDLI 72 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCIGYPYNLSGIQDPI 73 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYAYNLSGIQDPI 74 SEQ ID NO: MRFSYSRNLDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYNLSGIQDPI 75 SEQ ID NO: LRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYNLSGIQDPI 76 SEQ ID NO: MRFSYIRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYNLSGIQDPI 77 SEQ ID NO: MRVSDSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 78 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCYSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGFQDPI 79
Identifica- dor da Sequência sequência SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFWCNGYPYDLSGFQDPI 80 SEQ ID NO: MRFSNSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGFQDPI 81 SEQ ID NO: MRFSYSRNLDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGFQDPI 82 SEQ ID NO: FSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYAYNLSGIQDPI 83 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEYGCNGYAYNLSGIQDPI 84 SEQ ID NO: MRLSYSRNLDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYNLSGIQDPI 85 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYPMKYKCNEFGCNGYPFDFSGFQDPI 86 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKSDTKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYDLSGIQDPI 87 SEQ ID NO: MRFSYNRNFDNFKCDAKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYVYGIQDPI 88 SEQ ID NO: MRFSFNRNFDNFKCDAKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYVYGIEDPI 89 SEQ ID NO: MRFSYNRNFDNFKCDAKCNYPMKYKCNEFGCNGYPYVYGIEDQI 90 SEQ ID NO: MRFSYIRNFDNFKCDAKCNYPLKYKCNEFGCNGYPYVYGIQEPI 91 SEQ ID NO: MRFSYNLNFDNFKCDAKCNYPLKYKCNEFGCNGYPYVYGIQEPI 92 SEQ ID NO: MRFCYYRNFDNFKCDANCYYPMKYKCNEFGCNGYPYVYGIEDPI 93 SEQ ID NO: MRFSYSRNFDNFKCDSKCNYHMKYKCNEFGCNGYPYVLSDIQDPI 94 SEQ ID NO: YSRNFDKIKCDSKCNYHMKYKCNEFGCNGYPYDFSGIQDPI 95 SEQ ID NO: MRFNYNRNNDNFKCDAKCNYPMKFKCNEFGCNGYPYGAYEIQDPV 96 SEQ ID NO: MRFNYNRNNDNFKCDTKCNYPMKFKCNEFGCNGYPYGAYEIQDPV 97 SEQ ID NO: MHFGKFKERVCSKCNTFPCCCSPCPPQSCPIWPVKPT 98 SEQ ID NO: MHFGKFKERVCSKCNTFPCCCSPYPPQSCPIWPVKPT 99 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCHSFPCCCKTGPIPSCPIWPVKPT 100
Identifica- dor da Sequência sequência SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCHSFPCYCKTGPIPSCPIWPVKPT 101 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCHSFPCCCKTGPIPSCPIWPVNPT 102 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCHSFPCCCKAGPIPSCPIWPVKPT 103 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCHSFPCCCKTGPIPNCPIWPVKPT 104 SEQ ID NO: MHYGNFIDRVCSKCHSFPCCCKTGPIPSCPIWPVKPT 105 SEQ ID NO: MHFGNFIVRVCSKCHSFPCCCKTGPIQSCPIWPVKPT 106 SEQ ID NO: MHFGIIIDRVCSKCHSFPCCCKTGPIPSCPIWPVKPT 107 SEQ ID NO: MHFGKFIDRVCTKCHSYPCCCKTGPIPSCPIWPVKPT 108 SEQ ID NO: MHFGKFLDRVCNKCHSFPCCCKTGPIPGCPIWPVKPT 109 SEQ ID NO: MHFGKFLDRVCSKCHSFPCCCKTGPIPGCPIWPVKPT 110 SEQ ID NO: MHFGKFLDRVCSKCNSFPCCCKTGPSPSCPIWPVKPT 111 SEQ ID NO: MNFGKFLDRVCSKCNSFPCCCKTGPSPSCPIWPVKPT 112 SEQ ID NO: MLFGKFLDRVCSKCNSFPCCCKTGPSPSCPIWPVKPT 113 SEQ ID NO: MHFGKFLDRVCSKCNSFPCCCKTGPSPSCPNWPVKPT 114 SEQ ID NO: MHFGNYLKRVCSKCNSFPCCCRTGPIPSCPVWPVKPT 115 SEQ ID NO: MHFGNYLKRVCSKCNYFPCCCRTGPIPSCPVWPVKPT 116 SEQ ID NO: MHFGNYLKRVCSKCNSFPCCCRPGPIPSCPVWPVKPT 117 SEQ ID NO: MHFGNYLKQVCSKCNSFPCCCRTGPIPSCPVWPVKPT 118 SEQ ID NO: MHFGNYLKRVCSKCNSFPCCCRTGPIQSCPVWPVKPT 119 SEQ ID NO: MHFGNYLKQVCNKCNSFPCCCRTGPIPSCPVWPVKPT 120 SEQ ID NO: MHFGNYLKQVCSKCNSFPCCCRNGPIPSCPVWPVKPT 121
Identifica- dor da Sequência sequência SEQ ID NO: MHFGNYLKQVCSKCNSFPCCCRTGPIPSCPIWPVKPT 122 SEQ ID NO: LHFGNYLKQVCSKCNSFPCCCRTGPIPSCPIWPVKPT 123 SEQ ID NO: MLFGNYLKQVCSKCNSFPCCCRTGPIPSCPIWPVKPT 124 SEQ ID NO: MHFGNYLKQVSSKCNSFPCCCRNGPIPSCPVWPVKPT 125 SEQ ID NO: MHFGRFNERVCSKCNTFPCCCNPCAAQSCPIWPVKPT 126 SEQ ID NO: MHFGRFKERVCSKCNTFPCCCNPCAAQSCPIWPVKPT 127 SEQ ID NO: MHFGRFNERVCSKCNSFPCCCNPCAAQSCPIWPVKPT 128 SEQ ID NO: MHFGKFNERVCSKCNTFPCCCNPCAAQSCPIWPVKPS 129 SEQ ID NO: MHFGRFNERVCSKCNTFPCCCCAAQSCPIWPVKPT 130 SEQ ID NO: MHFGKFKDSVCSKCNTFPCCCNPCAAQSCPIWPVKPT 131 SEQ ID NO: MHFGRFNERVCSKCNTFPCCCCAAQSCPIWPVKP 132 SEQ ID NO: MHFGKFKERVCSKCNSFPCCCSPCPPQSCPIWPVKPT 133 SEQ ID NO: MHFGKFKDRVCSKCNTFPCCCSPCPPQSCPIWPVKPT 134 SEQ ID NO: MHFGRFNERVCSKCNTFPCCCSPCDVQSCPIWPVKPT 135 SEQ ID NO: MQFGRFNERVCSKCTTFPCCCSPCDVQSCPIWPVKPT 136 SEQ ID NO: MHFGKFNDRICSKCNTFPCCCNPCAPSCPVWPVKP 137 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCNTFPCCCRGGPVPGCPIWPVKPT 138 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCKTFPCCCRGGPVPGCPIWPVKPT 139 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCNTFPCCCRGGPVPGCPIWPVKPP 140 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCNTFPCCCRGGPVPGCHIWPVKPT 141 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCKTFPCCCRGGPVPCCPIWPVKPT 142
Identifica- dor da Sequência sequência SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCKTIPCCCRGGPVPGCPIWPVKPT 143 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCNTFPCCCKGGPVPGCHIWPVKPT 144 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCKTFPCCCGSGPVPGCPIWPVKPT 145 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCSKCKTSPCCCGSGPVPGCPIWPVKPT 146 SEQ ID NO: MHFGNFIDRVCTKCKIFPRCCRGGPVPGCPIWPVKPT 147 SEQ ID NO: MHFGKFTDRVCSKCNTFPCCCNTCPAPNCPIWPVKP 148 SEQ ID NO: MNFGNFNNRICSKCNTFPCCCIPCAPSCPVWPVKPG 149 SEQ ID NO: MYFGNFLDRICSKCNTFPCCCLSGPILRSPIWPVRPT 150 SEQ ID NO: MHFGNFLDRVCNKCNTFPCCCLSGPIHRSPIWPVPPAKATR 151 SEQ ID NO: MQFGKYNDRICRKCNTFPCCCNPSAPSCPGWPVKP 152 SEQ ID NO: MKFQDFNINKICNNCHSYPCCCHNGPVQRCPVWPVKPT 153 SEQ ID NO: MKFQDFNINKICNNCHSYPCCCHNGPVHRCPVWPVKPT 154 SEQ ID NO: MKFQDFNINKICNNCNSYPCCCHNGPVQRCPVWPVKPT 155 SEQ ID NO: MKFQDFNINKICNNCHSYPCCCHNGPVLRCPVWPVKPT 156 SEQ ID NO: MKFLDFNINKICNNCHSYPCCCHNGPVHRCPVWPVKPT 157 SEQ ID NO: MKFQDFNINKICNNCHSYPCCCHKGPVHRCPVWPVKPT 158 SEQ ID NO: MKFQDFNINKICNICHSYPFCCHNGPVQRCPVWPVKPT 159 SEQ ID NO: MKFQDFNINMICNNCHSYPCCCHNGPVHRCPVWPVKP 160 SEQ ID NO: MKFHDFNLNNICGKCLSHPCCCNNGPAQRCPIWPVKPT 161 SEQ ID NO: MKFHDFNLNNICGKCLSHPCCCNNVPAQRCPIWPVKPT 162 SEQ ID NO: MKFHDFNLNNICGKCLSHPCCCNNGPVQRCPIWPVKPT 163
Identifica- dor da Sequência sequência SEQ ID NO: MDFANFKNRICSRCNSFPCNCKRNFPQNCPIWPVKPT 164 SEQ ID NO: MDFANFKNRICSRCNSFPCNCKRNSPQNCPIWPVKPT 165 SEQ ID NO: MDFANFKNRICSRCNTFPCNCKRNFPQNCPIWPVKPT 166 SEQ ID NO: MDFANFKNRICSRCNSFPCNCKGNFPQNCPIWPVKPT 167 SEQ ID NO: MDFAYFKNRICSRCNSFPCNCKRNFPQNCPIWPVKPT 168 SEQ ID NO: MDFANFKNRICSRCNSFPCNCIRNIPQNCPIWPVKPT 169 SEQ ID NO: MDLANFKNRICSRCNSFPCNCKRNFPQNCPIWPVKPT 170 SEQ ID NO: MDFANFKNRICSRCNSFPCNCKSNYPQNCSIWPVKPT 171 SEQ ID NO: MNFEDYFLNNVCSKCKTFPCACIRIPEHHCCIWPVKPT 172 SEQ ID NO: MNFEDYFLNNVCSKCKTFPCACIRIPGHHCSIWPVKPT 173 SEQ ID NO: MNFEDYFLNNVHVLCKTFPCACIRIPEHHCCIWPVKPT 174 SEQ ID NO: MNFEDYFLNNVCSKCRTFPCGCRRIPEHHSCVWPVKPT 175 SEQ ID NO: MNFEDYFLKNVCSKCRTFPCGCTRIPEQHCCVWPVKPT 176 SEQ ID NO: MNFHDFILNNICKRCNSYPCRCINRPEQNCSIWPVKPT 177 Tabela 3: Sequências de direcionamento N-terminal de Viridibacillus exemplificadoras Identificador da Sequência sequência
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 178 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGA
MDSNKTRCXVCNKYQCSCNHKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH SEQ ID NO: CHNR 179
Identificador da Sequência sequência
ATGGACTCAAATAAAACGAGGTGTCCTATTTGTAATAATTATCAA SEQ ID NO: TGTTCTTGTAACGCTAAAAAAAGAAGGCCTACAAGATGTATTAG 180 ATATTTAGATTATATAGATCAATGTGAACAATGTGAACCTATTTC
TATAATAGATCATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MDSNKTRCPICNNYQCSCNAKKRRPTRCIRYLDYIDQCEQCEPISII 181 DHCHNR
ATGGACTCAAATAAAACGAGGTGTCCTATTTGTAATAATTATCAA TGTTCTTGTAACGCTAAAAAAAGAAGGCCTACAAGATGTATTAG
ATATTTAGATTATATAGATCAATGTGAACAATGTGAACCTATTTC SEQ ID NO: TATAATAGATCATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGACCGACCG 182 GAGCAACTGGTGCAACCGGACCAACTGGAGCAACTGGAGCAAC
AGGACCAACAGGACCAACTGGAGCAACAGGACCTACAGGAGCA ACAGGACCAACAGGTGCAACTGGGGCGACAGGAATCACCGGG CCGACTGGAGCAACGGGAGCAACA MDSNKTRCPICNNYQCSCNAKKRRPTRCIRYLDYIDQCEQCEPISII SEQ ID NO:
DHCHNRGKTGPTGATGATGPTGATGATGPTGPTGATGPTGATGP 183
TGATGATGITGPTGATGAT
ATGGAATCAAATAAAACGAGGTGTATTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 184 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MESNKTRCIVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDHC 185 HNR
ATGGAATCAAATAAAACGAGGTGTATTGTTTGTAATAAATATCAA TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGACCAACAGGACCAACGG SEQ ID NO:
GACCAACCGGAGTGACTGGAGCAACCGGACCAACAGGAGAAA 186
CAGGACCAACGGGAGCAACCGGAGCAACTGGAGCAACAGGAG CAACAGGTCCAATGGGAGTAACTGGCTCGACCGGAGCAACTGG TGTAACGGGAGCAACAGGAGCAACAGGGTCAACCGGAGCAAC AGGTGAAACCGGAGCGACTGGTGAAACCGGA MESNKTRCIVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDHC SEQ ID NO:
HNRGKTGPTGPTGPTGVTGATGPTGETGPTGATGATGATGATGP 187
MGVTGSTGATGVTGATGATGSTGATGETGATGETG ATGTATTCAAATAAAAAGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA
TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA SEQ ID NO: GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT 188 CATTGTCATAATAGA
MYSNKKRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH SEQ ID NO: CHNR 189
Identificador da Sequência sequência
ATGTATTCAAATAAAAAGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGACCAACAGGAGCAACAG GTCATACAGGAACAACCGGAACAACAGGAGAGACTGGACCAAC SEQ ID NO:
AGGAGCAACAGGAGCAACAGGAATAACGGGAGCAACGGGAGA 190
AACAGGAGCAACAGGACCAACGGGAACAACTGGTGTAACCGGA GAAACCGGAGCAACAGGTCCAACTGGAGAAACTGGTGAAACAG GACCAACGGGAGCAACTGGGAACCGGAGCAACAGGAGAAACA GGAACAACTGGAGCAACAGGAAAAACGGGAACAACAGGAGAAA CAGGAGAAACAGGAGCAACAGGAGAAACAGGAAAAACAGG
MYSNKKRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH SEQ ID NO: CHNRGKTGPTGATGHTGTTGTTGETGPTGATGATGITGATGETG 191 ATGPTGTTGVTGETGATGPTGETGETGPTGATGNRSNRRNRNN
WSNRKNGNNRRNRRNRSNRRNRKNR
ATGTATTCAAATAAAAAGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 192 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MYSNKKRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH 193 CHNR
ATGTATTCAAATAAAAAGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA
GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT SEQ ID NO: CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGACCAACAGGAGCAACAG 194 GTCCTACAGGATCAACGGGACCAACAGGAGTGACTGGACCAAC
AGGAGCAACAGGAACAACAGGATCAACAGGAACAACAGGAGCA ACAGGAGCAACAGGAGAAACAGGAGCAACAGGACCAACAGGA CCAACAGGAGAAACAGGAACAACA MYSNKKRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH SEQ ID NO:
CHNRGKTGPTGATGPTGSTGPTGVTGPTGATGTTGSTGTTGATG 195
ATGETGATGPTGPTGETGTT
ATGGATTCAAATAAAAAGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 196 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCGCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MDSNKKRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH 197 CHNR
ATGGATTCAAATAAAAAGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA
TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA SEQ ID NO: GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCGCTTTATATAATAGAT 198 CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGACCAACAGGAGCAACAG
GTCCTACAGGATCAATGGGACCAACCGGAGTGACTGGATCAAC AGGAGCAACCGGACCAACAGGGTCAACCGGAGTAACTGGGGA
Identificador da Sequência sequência
AACAGGATCAACCGGGACAACGGGACCAAGCGGATCAACTGGA CCAACTGGTGCAACAGGGTCAACCGGAGAAACCGGAGCAACA GGGTCAACCGGAGCAACTGGAGAAACAGGTCCAACAGGACCAA CGGGAACAACTGGTGTAACCGGAGAAACCGGAGCAACAGGTC CAACTGGAGCAACTGGAGCAACTGGTGAAACAGGTTCAACAGG ACCAACGGGAGCAACTGGAGAAACTGGTGAAACAGGTTCAACA GGACCAACGGGAGCAACGGGATCGACTGGAGCAACGGGACCA ACGGGAGCAACGGGATCCACTGGAGCAACGGGATCGACTGGA GCAACGGGATCGACTGGAGCAACAGGACCAACAGGAGCAACA GGGTCAACCGGAGAAACAGGACCAACTGGTGAAACAGGTTCAA CGGGAGCAACTGGGTCGACCGGAGCAACAGGTGAAACAGGAC CAACGGGAACAACTGGAGTAACCGGAGAAACCGGAGCAACAG GTCCAACAGGAGCAACTGGAGCAACTGGAGAAACTGGTGAAAC AGGTTCAACAGGACCAACGGGAGCAACTGGAGAAACTGGTGAA ACAGGTTCAACAGGACCAACGGGAGCAACGGGATCGACTGGA GCAACGGGACCAACTGGAGCAACGGGATCGACTGGAGCAACG GGATCGACTGGAGCAACGGGATCGACTGGAGCAACAGGACCA ACAGGAGCAACAGGGTCAACCGGAGAAACAGGACCAACTGGT GAAACAGGTTCAACGGGAGCAACTGGGTCGACCGGAGCAACA GGTGAAACAGGACCAACGGGAGCAACTGGGTCGACCGGAGCA ACTGGTGAAACAGGTGCAACAGGACCAACAGGACCAACGGGAA CAACTGGTGTAACCGGAGCAACAGGTCCAACTGGAGCAACTGG AGAAACAGGACCAACGGGAGCGACTGGAGAAGCAGGACCAAC AGGGTCAACCGGAGCGACTGGACCAACCGGGGCAACGGGAAT CACGGGAGCAACAGGACCAACAGGATCAACTGGTGCAACAGG GTCAACCGGAGAAACTGGATCAACTGGAGAAACCGGACCAACA GGAGCAACTGGTGTAACCGGAGCAACAGGTCCAACTGGAGAAA CAGGTTCAACAGGACCAATGGGAGCAACCGGAGAAACTGGTTC GACCGGATCAACTGGTGTAACGGGAGCAACAGGAGCAACGGG AGAAACCGGAGCAACAGGATCAACGGGAGCAACTGGCACGAC CGGAGCAACAGGAGAAACAGGACCAACAGGACCAACTGGGTC CACCGGAGCAACAGGAGAAACAGGTCCAACAGGACCAACGGG AGCAACTGGAGTAACCGGAGCAACAGGAGCAACGGGAGCAAC TGGAGAAACAGGTTCAACAGGACCAATGGGAGCAACCGGAGAA ACTGGTTCGACCGGATCAACTGGTGTAACGGGAGCAACAGGAG CGACTGGAGTAACAGGAGCAACTGGTGAAACAGGATCAACGGG AGCAACTGGGTCGACCGGAGCAACAGGTGAAACCGGACCAAC AGGTCCAACAGGTCCAACAGGACCAACGGGAACAACTGGTGTA ACCGGAGTAACTGGAGAAACCGGACCAACAGGAGCGACTGGT GAAACAGGTTCAACAGGACCAACGGGAACAACTGGTGTAACCG GAGAAACCGGAGCAACAGGACCAACTGGTGCAACAGGGTCAAC CGGAGAAACCGGAGCAACTGGAGAAACAGGTCGAACAGGACC AACGGGAACAACTGGTGTAACCGGAGAAACCGGAGCAACTGGA GAAACAGGACCAACAGGAGCAACGGGATCGACTGGAGCAACA GGACCAACGGGAGCAACTGGGGCGACCGGAGCAACAGGTGAA ACAGGACCAACGGGAGCGACTGGAGAAACAGGAGCAACGGGA GCAACTGGGTCAACCGGAGCAACAGGTCCAACAGGACCAACG GGAACAACTGGAGTAACCGGAGCAACAGGTCCAACTGGAGCAA CTGGAGAAACAGGACCAACGGGAGCAACTGGAGAAGCAGGAC CAACAGGGTCAACCGGATCGACTGGACCAACCGGGGCAACGG
Identificador da Sequência sequência
GAATCACGGGAGCAACAGGACCAACAGGAGCAACTGGTGCAAC AGGGTCAACCGGAGAAACTGGATCAACTGGAGAAACCGGACCA ACAGGATCAACTGGT MDSNKKRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH CHNRGKTGPTGATGPTGSMGPTGVTGSTGATGPTGSTGVTGET GSTGTTGPSGSTGPTGATGSTGETGATGSTGATGETGPTGPTGT TGVTGETGATGPTGATGATGETGSTGPTGATGETGETGSTGPTG ATGSTGATGPTGATGSTGATGSTGATGSTGATGPTGATGSTGET GPTGETGSTGATGSTGATGETGPTGTTGVTGETGATGPTGATGA TGETGETGSTGPTGATGETGETGSTGPTGATGSTGATGPTGATG STGATGSTGATGSTGATGPTGATGSTGETGPTGETGSTGATGST GATGETGPTGATGSTGATGETGATGPTGPTGTTGVTGATGPTGA SEQ ID NO:
TGETGPTGATGEAGPTGSTGATGPTGATGITGATGPTGSTGATGS 199
TGETGSTGETGPTGATGVTGATGPTGETGSTGPMGATGETGSTG STGVTGATGATGETGATGSTGATGTTGATGETGPTGPTGSTGAT GETGPTGPTGATGVTGATGATGATGETGSTGPMGATGETGSTGS TGVTGATGATGVTGATGETGSTGATGSTGATGETGPTGPTGPTG PTGTTGVTGVTGETGPTGATGETGSTGPTGTTGVTGETGATGPT GATGSTGETGATGETGRTGPTGTTGVTGETGATGETGPTGATGS TGATGPTGATGATGATGETGPTGATGETGATGATGSTGATGPTG PTGTTGVTGATGPTGATGETGPTGATGEAGPTGSTGSTGPTGAT GITGATGPTGATGATGSTGETGSTGETGPTGSTG
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 200 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAAATC
ATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MDSNKTRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIINH 201 CHNR
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAAATC ATTGTCATAATAGAGGTAAAACTGGACCAACTGGACCAACCGGA SEQ ID NO:
TCGACCGGACCAACAGGACCAACTGGTGAAACCGGACCAACTG 202
GAGCAACAGGACCAACAGGAGCTACTGGAGCAACTGGAGCAAC TGGTGCAACTGGAGCAACGGGATCAACTGGAGCAACAGGATCA ACTGGGGCAGCCGGAGTAACTGGTGAAACAGGACTAACAGGGT CAACCGGAGCGACAGGA MDSNKTRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIINH SEQ ID NO:
CHNRGKTGPTGPTGSTGPTGPTGETGPTGATGPTGATGATGATG 203
ATGATGSTGATGSTGAAGVTGETGLTGSTGATG ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA
TGTTCTTGTAATACCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA SEQ ID NO: GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT 204 CATTGTCATAATAGA
Identificador da Sequência sequência SEQ ID NO: MDSNKTRCAVCNKYQCSCNTKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH 205 CHNR
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA TGTTCTTGTAATACCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGACCAACAGGACCAACAG SEQ ID NO: GAGCAACTGGACCAACCGGACCAACTGGAGCAACAGGGGCAA 206 CCGGAGCAACAGGTCCAACAGGATCAACTGGCGCAACAGGAG
CAACTGGACAAACGGGAGCAACTGGAGCAACGGGACCAACAG GAGCAACAGGAGCAACTGGAGAAACAGGAGCAACAGGAGCAA CAGGAGCAACAGGAGCAACAGGACCAACGGGAGCAACTGGAG AAACAGGAGCA MDSNKTRCAVCNKYQCSCNTKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH SEQ ID NO:
CHNRGKTGPTGPTGATGPTGPTGATGATGATGPTGSTGATGATG 207
QTGATGATGPTGATGATGETGATGATGATGATGPTGATGETGA
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 208 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MDSNKTRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH 209 CHNR
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTGCTGTTTGTAATAAATATCAA TGTTCTTGTAACTCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCTCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGACCAACAGGAGCAACAG SEQ ID NO: GTCCAACGGGACCAACCGGAGCAACGGGATCAACTGGTCCAAC 210 AGGATCAACTGGAGCAACTGGAGCAACAGGGTCAACCGGAGC
GACTGGAGAAACAGGACCAACTGGGGTAACGGGAATCACGGG ACCGACTGGTGTAACTGGAGCAACAGGGTTCACAGGACTGACT GGAGCAACTGGAGCGACAGGAAATACAGGTCCAACAGGACCAA CCGGAGCA MDSNKTRCAVCNKYQCSCNSKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH SEQ ID NO:
CHNRGKTGPTGATGPTGPTGATGSTGPTGSTGATGATGSTGATG 211
ETGPTGVTGITGPTGVTGATGFTGLTGATGATGNTGPTGPTGA
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTACTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCATGTAACCACAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 212 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCGCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MDSNKTRCTVCNKYQCSCNHKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH 213 CHNR
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTACTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCATGTAACCACAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 214 GATTTAGATTATATAGATCCATGTGAACCGCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGTCCAACGGGGCCAACCG
Identificador da Sequência sequência
GAGCAACTGGAGCAACAGGTGCAACGGGATCAACTGGGCCGA CAGGAGTAACTGGTGCAAACTCATATACAAAACAAACACTGCCA ACGACGTCAACAGAGAAGAAA MDSNKTRCTVCNKYQCSCNHKKRSPKTVIRDLDYIDPCEPLYIIDH SEQ ID NO:
CHNRGKTGPTGPTGATGATGATGSTGPTGVTGANSYTKQTLPTT 215
STEKK
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTACTGTTTGTAATAAATATCAA SEQ ID NO: TGTTCATGTAACCCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA 216 GATTTAGATTATATAAATCCATGTGAACCGCTTTATATAATAGAT
CATTGTCATAATAGA SEQ ID NO: MDSNKTRCTVCNKYQCSCNPKKRSPKTVIRDLDYINPCEPLYIIDH 217 CHNR
ATGGATTCAAATAAAACGAGGTGTACTGTTTGTAATAAATATCAA TGTTCATGTAACCCCAAAAAAAGAAGTCCTAAAACAGTTATTAGA GATTTAGATTATATAAATCCATGTGAACCGCTTTATATAATAGAT CATTGTCATAATAGAGGTAAAACAGGTCCAACGGGGCCAACCG GAGCAACCGGAGCAACGGGGCCAACCGGACCAACTGGAGCAA CAGGGCCAACCGGAGCGACTGGAGCAACCGGACCAACGGGAT CAACAGGTCCTACAGGATCAACCGGAGCAACAGGACCGACTGG GGCTACAGGAGTAACTGGAGCAACGGGAGCAACTGGAGCAAC GGGAGTAACTGGGGCAACAGGACCAACGGGACCAACAGGGTT AACCGGAGCGACTGGAGCAACAGGAACGACTGGGGCTACAGG AGCAACTGGGGCAACGGGAGTAACTGGAGCAACAGGACCGAC TGGGGCAACGGGAGTAACTGGAGCAACGGGAGTAACTGGGGC AACAGGACCAACTGGAGCAACAGGATCGACTGGAGAAACTGGA
ACAACAGGAGTAACTGGAGCAACGGGAGTAACTGGAGCAACAG SEQ ID NO: GTCCAACCGGGTCAATCGGATCAACGGGAGCAACTGGGGCAA 218 CCGGACCAACTGGAGCAACCGGGGCAACAGGAGCAACCGGAC
CAACGGGAGAAACCGGACCAACCGGACCAACAGGCCCAACGG GAATCACCGGGCCAACCGGAGCAACTGGTTCAGGAGGCGTAAT CCCATTTGCATCAGGAGGCACAGTAACAATAAATTCACTATTAA CTGGGGTACCTAATACCGGAGGTATTATTGCATTTGGCAATAGT ACTACTAGTGTAGGGATTGGTAATGCTACAGTAAATCTTCAAAAT ATTAATAATGAAGCGTTTGTCGTTCCACATGCTGGAGCAATTAC AAATGTTGCTGCATTCTTTAATATTACAGTTGCTCTTAATATAGC TGTTTTAGGTACAGCTACTATTACGGCACAAGTATGGAAATCAC AAAATGCATCATCTAACGTATTTGCACCTTTAGCATCGACTCTTA TAAGCTTTACACCATTAGCTGGTGCCATAGCTGCATTTACTACAT TAAATGGTGCTCTTGCAAATTTAAATGAACCAGTAAATGTTGGA GATCGTTTAATTATGGTATTCTCTGTGGCTACTACAGGGTTAAGT GTAATAACTGCTATTACAGGTACAGCAAGTGCGGGTATTACAAT TAGTTGA
MDSNKTRCTVCNKYQCSCNPKKRSPKTVIRDLDYINPCEPLYIIDH SEQ ID NO: CHNRGKTGPTGPTGATGATGPTGPTGATGPTGATGATGPTGSTG 219 PTGSTGATGPTGATGVTGATGATGATGVTGATGPTGPTGLTGAT
GATGTTGATGATGATGVTGATGPTGATGVTGATGVTGATGPTGA TGSTGETGTTGVTGATGVTGATGPTGSIGSTGATGATGPTGATGA
Identificador da Sequência sequência
TGATGPTGETGPTGPTGPTGITGPTGATGSGGVIPFASGGTVTINS LLTGVPNTGGIIAFGNSTTSVGIGNATVNLQNINNEAFVVPHAGAIT NVAAFFNITVALNIAVLGTATITAQVWKSQNASSNVFAPLASTLISFT PLAGAIAAFTTLNGALANLNEPVNVGDRLIMVFSVATTGLSVITAITG TASAGITIS
[0074] Sequências de direcionamento N-terminal compatíveis com Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus são mostradas na tabela 1, 2 e 3, respectivamente. Além dessas sequências, a sequência de direcionamento N-terminal pode alternativamente compreender uma variante compartilhando pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências divulgadas no presente documento, contanto que a sequência retenha a capacidade de direcionar a proteína de fusão ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Em algumas modalidades, um fragmento de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos contíguos selecionados a partir de qualquer uma das sequências divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus) pode ser usado. Este segmento contíguo pode incluir a extremidade N-terminal ou a extremidade C-terminal de qualquer uma das sequências divulgadas no presente documento (por exemplo, uma sequência de direcionamento N-terminal pode compreender os últimos 25 aminoácidos contíguos de qualquer sequência divulgada no presente documento). Em alguns aspectos, a única funcionalidade necessária é que a sequência mantenha a capacidade de direcionar uma proteína de fusão ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[0075] A sequência de sinal N-terminal usada para direcionar a proteína de fusão ao exospório pode compreender um polipeptídeo tendo uma sequência conforme divulgada na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus). Alternativamente, em modalidades selecionadas, esta sequência de sinal N-terminal pode compreender uma variante ou fragmento do mesmo que direciona a proteína de fusão ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus e sequência heteróloga de uma molécula de interesse (por exemplo, peptídeo ou polipeptídeo) à sequência de sinal N-terminal. Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com a sequência de aminoácido de qualquer uma das sequências divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus). Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N-terminal compreende uma sequência contígua de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos que é idêntica a uma sequência contígua do mesmo número de aminoácidos divulgados na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus).
[0076] Conforme discutido no presente documento, os construtos da proteína de fusão de acordo com vários aspectos da divulgação compreendem uma sequência de sinal N-terminal ou uma variante ou fragmento do mesmo que direciona a proteína de fusão ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus e uma sequência polipeptídica que é heteróloga à sequência de sinal N- terminal. No entanto, em aspectos adicionais, qualquer uma das sequências divulgadas, assim como as variantes sequenciais e fragmentos dos mesmos de acordo com qualquer um dos aspectos divulgados, podem ser usados para outras finalidades. O foco da divulgação em aspectos em que essas sequências funcionam como sequências de direcionamento de exospório N-terminal não deve ser interpretado como uma exclusão de outras funcionalidades.
[0077] Em algumas modalidades, a sequência de sinal N-terminal compreende um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representado por qualquer uma das sequências divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus). Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N-terminal compreende um fragmento de qualquer uma das sequências divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus), por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma subsequência contígua encontrada em qualquer uma das sequências divulgadas nessas tabelas ou figuras. Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N-terminal compreende uma variante de qualquer uma da tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus), por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compartilha um grau mínimo ou exato de identidade percentual com uma sequência divulgada nessas tabelas ou figuras. Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N-terminal pode qualificar tanto como um fragmento e como uma variante, conforme definido acima (por exemplo, uma sequência de sinal N-terminal compreendendo uma subsequência contígua de uma sequência divulgada no presente documento, assim como uma sequência divergente que se inclui dentro de uma faixa sequencial de identidade divulgada).
[0078] Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N- terminal compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com uma sequência de aminoácidos divulgada na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus).
[0079] Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N- terminal compreende uma sequência contígua de pelo menos 10, 20 ou 25 aminoácidos que é idêntica a uma sequência contígua de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de uma sequência de aminoácidos divulgada na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus).
[0080] Em algumas modalidades, a sequência de sinal N-terminal compreende um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma das sequências nucleotídicas divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus). Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N-terminal compreende um fragmento de um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma das sequências nucleotídicas divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus), por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma subsequência contígua encontrada em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleotídica divulgada nessas tabelas ou figuras. Em modalidades alternativas, a sequência de sinal N-terminal compreende uma variante de um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleotídica divulgada na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus), por exemplo, um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compartilha um grau mínimo ou exato de identidade percentual com um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleotídica divulgada nessas tabelas ou figuras. Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N-terminal pode quantificar tanto como um fragmento e como uma variante, conforme definido acima, por exemplo, uma sequência de sinal N-terminal compreendendo uma subsequência contígua encontrada em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos divulgada na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus), seguida por uma sequência divergente que se inclui dentro de uma faixa sequencial de identidade mínima conforme descrita no presente documento.
[0081] Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N- terminal compreende uma sequência nucleotídica tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências nucleotídicas divulgadas no presente documento, por exemplo, quaisquer sequências nucleotídicas divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus).
[0082] Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N- terminal compreende uma sequência nucleotídica que se hibridiza a uma sonda de ácido nucleico complementar a um polinucleotídeo codificando qualquer uma das sequências polipeptídicas divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus) ou um fragmento do mesmo, sob estringência moderada ou alta.
[0083] Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N- terminal compreende uma sequência contígua de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos que é idêntica a uma sequência contígua do mesmo número de nucleotídeos em qualquer uma das sequências nucleotídicas divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus).
[0084] Com relação a qualquer uma das sequências de direcionamento N-terminal alternativas contempladas por esta divulgação, tais como as modalidades anteriormente mencionadas, a mínima funcionalidade necessária das referidas sequências em aspectos selecionados é a capacidade de direcionar uma proteína de fusão ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Proteínas de fusão
[0085] A divulgação provê proteínas de fusão compreendendo uma sequência de direcionamento N-terminal ligada, direta ou indiretamente, a pelo menos uma molécula de interesse (por exemplo, sequência polipeptídica de uma proteína ou peptídeo de interesse, tal como pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação ao crescimento da planta). Em modalidades selecionadas, a ligação indireta pode ser um espaço, ligante ou uma sequência reguladora interveniente. A proteína ou peptídeo pode compreender, porém não se limita a, um hormônio peptídico, um peptídeo não hormonal, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador do crescimento da planta ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutrientes para plantas. Em geral, qualquer proteína de interesse capaz de expressão em um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus e heteróloga à sequência de direcionamento N-terminal selecionada pode ser usada. A sequência de direcionamento pode ser qualquer uma das sequências de direcionamento descritas acima.
[0086] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão podem compreender a sequência de direcionamento e pelo menos uma proteína ou peptídeo que proteja uma planta de um patógeno. A sequência de direcionamento pode ser qualquer uma das sequências de direcionamento descritas acima.
[0087] A proteína de fusão pode ser feita usando métodos de clonagem e biologia molecular padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene codificando uma proteína ou peptídeo (por exemplo, um gene codificando uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta) pode ser amplificado por reação em cadeia polimerase (PCR) e ligado à codificação de DNA para qualquer uma das sequências de direcionamento descritas acima para formar uma molécula de DNA que codifica a proteína de fusão. A molécula de DNA codificando a proteína de fusão pode ser clonada em um vetor adequado, por exemplo um vetor de plasmídeo. O vetor adequadamente compreende um sítio de clonagem múltiplo no qual a molécula de DNA codificando a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém adequadamente um marcador selecionável, tal como um gene de resistência a antibiótico, de forma que as bactérias transformadas, transfectadas ou cruzadas com o vector possam ser prontamente identificadas e isoladas. Onde o vetor é um plasmídeo, o plasmídeo adequadamente também compreende uma origem de replicação. O DNA codificando a proteína de fusão está adequadamente sob o controle de um promotor de esporulação que causará a expressão da proteína de fusão no exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus (por exemplo, um promotor nativo a partir de um membro da família de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus). Alternativamente, a codificação de DNA para a proteína de fusão, por exemplo, uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências de polinucleotídeos divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus) pode estar integrada no DNA cromossômico de uma célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[0088] A proteína de fusão também pode compreender sequências polipeptídicas adicionais que não fazem parte da sequência de direcionamento ou proteína de interesse ligada (por exemplo, a proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta). Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir identificadores ou marcadores para facilitar a purificação (por exemplo, um identificador de poli-histidina) ou visualização (por exemplo, uma proteína fluorescente tal como GFP ou
YFP) da própria proteína de fusão ou dos esporos de células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que produzem exospórios recombinantes expressando a proteína de fusão.
[0089] A expressão de proteínas de fusão no exospório usando as sequências de direcionamento descritas no presente documento é aumentada devido a uma falta de estrutura secundária no amino- terminal dessas sequências, o que permite dobramento nativo das proteínas fundidas e a retenção de atividade. O dobramento apropriado pode ainda ser aumentado pela inclusão de um aminoácido ligante curto entre a sequência de direcionamento e a proteína parceira de fusão.
[0090] Sendo assim, qualquer uma das proteínas de fusão descritas no presente documento pode compreender um aminoácido ligante entre a sequência de direcionamento e a proteína de interesse ligada (por exemplo, a proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta).
[0091] O ligante pode compreender um ligante de polialanina ou um ligante de poliglicina. Um ligante compreendendo uma mistura de ambos os resíduos de alanina e glicina também pode ser usado. Por exemplo, onde a sequência de direcionamento compreende SEQ ID NO: 4, uma proteína de fusão pode ter uma das seguintes estruturas: Sem ligante: SEQ ID NO: 4—Proteína parceira de fusão ligante de alanina: SEQ ID NO: 4—An-Proteína parceira de fusão ligante de glicina: SEQ ID NO: 4—Gn-Proteína parceira de fusão ligante misto de alanina e glicina: SEQ ID NO: 4—(A/G)n-Proteína parceira de fusão onde An, Gn, e (A/G)n são qualquer número de alaninas, qualquer número de glicinas ou qualquer número de uma mistura de alaninas e glicinas, respectivamente.
[0092] Por exemplo, n pode ser qualquer número inteiro entre 1 a 25, tal como um número inteiro entre 6 a 10. Onde o ligante compreende uma mistura de resíduos de alanina e glicina, qualquer combinação de resíduos de glicina e alanina pode ser usada. A sequência de direcionamento N-terminal representada pela SEQ ID NO: 4 (para Brevibacillus) pode ser usada, por exemplo, conforme mostrado acima. No entanto, qualquer uma das outras sequências de direcionamento N- terminal divulgadas no presente documento (incluindo formas truncadas e variantes) pode ser substituída no lugar da SEQ ID NO: 4 nas configurações exemplificadoras acima, por exemplo, qualquer uma das sequências divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus). Nas estruturas mostradas acima, “proteína parceira de fusão” representa a proteína de interesse ligada (por exemplo, uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta).
[0093] Alternativamente ou além disso, o ligante pode compreender um sítio de reconhecimento de protease. A inclusão de um sítio de reconhecimento de protease permite a remoção direcionada, mediante a exposição a uma protease que reconhece o sítio de reconhecimento de protease, da proteína de interesse (por exemplo, uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação à planta).
[0094] Em certos aspectos, a proteína de fusão compreende uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação do crescimento da planta, tal como acetoína redutase, uma indol-3-acetamida hidrolase, um triptofano monooxigenase, um acetolactato sintetase, um α-acetolactato decarboxilase, um piruvato decarboxilase, um diacetil redutase, um butanodiol desidrogenase, uma aminotransferase, um triptofano decarboxilase, uma amina oxidase, um indol-3-piruvato decarboxilase, um indol-3-acetaldeído desidrogenase, uma oxidase de cadeia lateral triptofano, uma nitrila hidrolase, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma adenosina fosfato isopenteniltransferase, uma fosfatase, uma adenosina quinase, uma adenina fosforibosiltransferase, CYP735A, um 5'-ribonucleotídeo fosfoidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma zeatina cis-trans isomerase, uma zeatina O-glucosiltransferase, uma β-glucosidase, uma cis-hidroxilase, uma CK cis-hidroxilase, uma CK N-glucosiltransferase, um 2,5-ribonucleotídeo fosfoidrolase, uma adenosina nucleosidase, uma purina nucleosídeo fosforilase, uma zeatina redutase, uma hidroxilamina redutase, uma 2-oxoglutarato dioxigenase, uma 2B/3B hidrolase giberélica, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20- oxidase, uma quitosanase, uma quitinase, uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4-glucanase, uma β-1,6-glucanase, uma desaminase de ácido aminociclopropano-1-carboxílico, uma enzima envolvida na produção de um fator nod ou qualquer combinação do mencionado acima.
[0095] Em outros aspectos, a proteína de fusão compreende uma enzima que degrada ou modifica uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente da planta, tal como uma celulase, uma lipase, uma lignina oxidase, uma protease, um glicosídeo hidrolase, uma fosfatase, uma nitrogenase, uma nuclease, uma amidase, um nitrato redutase, um nitrito redutase, uma amilase, uma amônia oxidase, uma ligninase, uma glucosidase, uma fosfolipase, uma fitase, uma pectinase, uma glucanase, uma sulfatase, uma urease, uma xilanase, um sideróforo ou qualquer combinação do mencionado acima.
[0096] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é expressada sob o controle de um promotor de esporulação nativo à sequência de direcionamento, proteína de exospório ou fragmento da proteína de exospório da proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão. Em certos aspectos, o promotor de esporulação de alta expressão compreende uma sequência promotora de polimerase específica da esporulação sigma-K. Em aspectos selecionados, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um promotor que é nativo à sequência de direcionamento da proteína de fusão. Em alguns casos, o promotor que é nativo à sequência de direcionamento será um promotor de esporulação de alta expressão. Em outros casos, o promotor que é nativo à sequência de direcionamento não será um promotor de esporulação de alta expressão. Nos últimos casos, pode ser vantajoso substituir o promotor nativo com um promotor de esporulação de alta expressão. A expressão de uma proteína de fusão sob o controle de um promotor de esporulação de alta expressão provê expressão aumentada da proteína de fusão no exospório do endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. O promotor de esporulação de alta expressão pode compreender uma ou mais sequências promotoras específicas de esporulação sigma-K.
[0097] Conforme descrito acima, as proteínas de fusão podem compreender a sequência de direcionamento e pelo menos uma proteína heteróloga que pode compreender uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento. A proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta pode compreender, entre outras coisas, um hormônio peptídico, um peptídeo não hormonal, uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador do crescimento da planta ou uma enzima que degrada ou modifica uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente da planta. A proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta pode compreender uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador do crescimento da planta. A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador do crescimento da planta pode ser qualquer enzima que catalise qualquer etapa em uma via de síntese biológica para um composto que estimule o crescimento da planta ou altere a estrutura da planta ou qualquer enzima que catalise a conversão de um derivado inativo ou menos ativo de um composto que estimule o crescimento da planta ou altere a estrutura da planta em uma forma ativa ou mais ativa do composto. Alternativamente, o composto estimulador do crescimento da planta pode compreender um hormônio de crescimento de planta, por exemplo, uma citoquinina ou um derivado de citoquinina, etileno, uma auxina ou um derivado de auxina, um ácido giberélico ou um derivado de ácido giberélico, ácido abscísico ou um derivado de ácido abscísico ou um ácido jasmônico ou um derivado de ácido jasmônico.
[0098] Onde a enzima compreende uma protease ou peptidase, a protease ou peptidase pode ser uma protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, proproteínas ou preproproteínas para criar um peptídeo bioativo. O peptídeo bioativo pode ser qualquer peptídeo que exerça uma atividade biológica. A protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, proproteínas ou preproproteínas para criar um peptídeo bioativo pode compreender subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, termolisina, papaína, pepsina, tripsina, pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma protease glutâmica, um aspartato protease, um cisteína protease, uma treonina protease ou uma metaloprotease.
[0099] A proteína estimuladora do crescimento da plantatambém pode compreender uma enzima que degrada ou modifica uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutrientes para plantas.
As referidas enzimas incluem celulases, lipases, lignina oxidases, proteases, glicosídeo hidrolases, fosfatases, nitrogenases, nucleases, amidases, nitrato redutases, nitrito redutases, amilases, amônia oxidases, ligninases, glucosidases, fosfolipases, fitases, pectinases, glucanases, sulfatases, ureases, xilanases e sideróforos.
Quando introduzidas em um meio de crescimento de plantas ou aplicadas a uma planta, semente ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, as proteínas de fusão compreendendo enzimas que degradam ou modificam uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutrientes para plantas podem auxiliar no processamento de nutrientes na proximidade da planta e resultar em captação aumentada de nutrientes pela planta ou por bactérias ou fungos benéficos na proximidade da planta.
As proteínas de fusão podem compreender a sequência de direcionamento e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno.
A proteína ou peptídeo pode compreender uma proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune da planta.
Por exemplo, a proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune da planta pode compreender uma proteína ou peptídeo intensificador do sistema imune da planta.
A proteína ou peptídeo intensificador do sistema imune da planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que tenha um efeito benéfico no sistema imune de uma planta.
Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno pode ser uma proteína ou peptídeo que tenha atividade antibacteriana, atividade antifúngica ou ambas atividade antibacteriana e atividade antifúngica.
A proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno também pode ser uma proteína ou peptídeo que tenha atividade inseticida, atividade helminticida, suprima a predação de insetos e vermes ou uma combinação dos mesmos. A proteína que protege uma planta de um patógeno pode compreender uma enzima. As enzimas adequadas incluem proteases e lactonases. As proteases e lactonases podem ser específicas para uma molécula de sinalização bacteriana (por exemplo, uma molécula de sinalização de lactona homosserina bacteriana). A enzima também pode ser uma enzima que seja específica para um componente celular de uma bactéria ou fungo.
[00100] As proteínas de fusão podem compreender a sequência de direcionamento e pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumente a resistência ao estresse em uma planta. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que aumente a resistência ao estresse em uma planta compreende uma enzima que degrada um composto relacionado ao estresse. Compostos relacionados ao estresse incluem, porém não se limitam ao, ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécies oxigênio-reativas, óxido nítrico, oxilipinas e fenólicos. As espécies oxigênio-reativas específicas incluem hidroxila, peróxido de hidrogênio, oxigênio e superóxido. A enzima que degrada um composto relacionado ao estresse pode compreender um superóxido dismutase, uma oxidase, uma catalase, uma desaminase de ácido aminociclopropano-1- carboxílico, uma peroxidase, uma enzima antioxidante ou um peptídeo antioxidante.
[00101] A proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta também pode compreender uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um estresse ambiental. O estresse ambiental pode compreender, por exemplo, seca, alagamento, calor, congelamento, sal, metais pesados, baixo pH, alto pH ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um estresse ambiental pode compreender uma proteína de nucleação de gelo, uma prolinase, uma fenilalanina amônia liase, um isocorismato sintase, um isocorismato piruvato liase ou uma colina desidrogenase.
[00102] As proteínas de fusão podem compreender a sequência de direcionamento e pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação à planta. A proteína ou peptídeo de ligação à planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que seja capaz de especificamente ou não especificamente se ligar a qualquer parte de uma planta (por exemplo, uma raiz de planta ou uma porção aérea de uma planta tal como uma folha, haste, flor ou fruto) ou à matéria da planta. Sendo assim, por exemplo, a proteína ou peptídeo de ligação à planta pode ser uma proteína ou peptídeo de ligação à raiz ou uma proteína ou peptídeo de ligação à folha. Endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus e células que expressam proteínas de fusão
[00103] As proteínas de fusão descritas no presente documento podem ser expressadas por células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes (por exemplo, células de B. brevis, L. sphaericus ou V. arvi). A proteína de fusão pode ser qualquer uma das proteínas de fusão discutida acima, contanto que ela seja compatível com o gênero bacteriano selecionado usado para expressão, isto é, a proteína de fusão deve incluir um peptídeo de sinal N-terminal mostrado na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus) ou um fragmento ou variante de qualquer uma dessas sequências, o qual retém a funcionalidade de direcionamento ao exospório no gênero bacteriano correspondente. As células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem coexpressar duas ou mais das proteínas de fusão discutidas acima. Por exemplo, as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem coexpressar pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação à planta, junto com pelo menos uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta, pelo menos uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumente a resistência ao estresse em uma planta.
[00104] As células de Brevibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem compreender células de Brevibacillus, tais como células de B. agri, B. aydinogluensis, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. fluminis, B. formosus, B. fulvus, B. ginsengisoli, B. invocatus, B. laterosporus, B. levickii, B. limnophilus, B. massiliensis, B. nitrificans, B. panacihumi, B. parabrevis, B. reuszeri ou B. thermoruber.
[00105] As células de Lysinibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem compreender células de Lysinibacillus, tais como células de Lysinibacillus sphaericus, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus acetophenoni, Lysinibacillus alkaliphilus, Lysinibacillus chungkukjangi, Lysinibacillus composti, Lysinibacillus contaminans, Lysinibacillus cresolivorans, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus manganicus, Lysinibacillus mangiferihumi, Lysinibacillus massiliensis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus odysseyi, Lysinibacillus pakistanensis, Lysinibacillus parviboronicapiens, Lysinibacillus sinduriensis, Lysinibacillus tabacifolii, Lysinibacillus varians, Lysinibacillus xylanilyticus ou Lysinibacillus halotolerans.
[00106] As células de Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem compreender células de Viridibacillus, tais como células de Viridibacillus arvi, Viridibacillus arenosi ou Viridibacillus neidei.
[00107] Para gerar as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou
Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes expressando uma proteína de fusão, qualquer bactéria de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus pode ser transformada usando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, por eletroporação ou por conjugação com uma célula que foi transformada com um vetor codificando a proteína de fusão). As bactérias podem ser então rastreadas para identificar transformantes através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, onde o vetor inclui um gene de resistência ao antibiótico, as bactérias podem ser rastreadas quanto à resistência ao antibiótico. Alternativamente, DNA codificando a proteína de fusão pode ser integrado no DNA cromossômico de uma célula de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. As células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem ser então expostas a condições que incluirão esporulação. As condições adequadas para induzir a esporulação são conhecidas na técnica. Por exemplo, as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem ser colocadas em placas de ágar, e incubadas em uma temperatura de cerca de 30°C por vários dias (por exemplo, 3 dias) ou alternativamente cultivadas em meio de esporulação Schaeffer.
[00108] As cepas inativadas, cepas não tóxicas ou cepas geneticamente manipuladas de qualquer uma das espécies divulgadas no presente documento também podem ser adequadamente usadas. Por exemplo, um Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que carece das toxinas Bin pode ser usado. Alternativamente ou além disso, uma vez que os esporos das espécies recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus expressando a proteína de fusão foram gerados, eles podem ser inativados para impedir germinação adicional uma vez em uso. Qualquer método para inativar esporos bacterianos que é conhecido na técnica pode ser usado. Os métodos adequados incluem, sem limitação, tratamento térmico, irradiação gama, irradiação com raios x, irradiação UV-A, irradiação UV-B, tratamento químico (por exemplo, tratamento com gluteraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante ou qualquer combinação dos mesmos) ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, os esporos derivados de cepas não toxigênicas ou cepas geneticamente ou fisicamente inativadas, podem ser usados.
[00109] Os construtos da proteína de fusão de acordo com a presente divulgação compreendem uma sequência de sinal N-terminal ou uma variante ou fragmento do mesmo que direciona a proteína de fusão ao exospório de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus e uma sequência polipeptídica que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal. Em modalidades selecionadas, a sequência de sinal N-terminal e a sequência polipeptídica que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal são diretamente ligadas. Em outros aspectos, uma sequência ligante ou espaçadora interveniente pode estar presente. Em aspectos adicionais, uma sequência de clivagem ou outra sequência reguladora pode estar posicionada entre as duas regiões. A sequência polipeptídica que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal pode compreender uma ou mais proteínas funcionais. Em aspectos onde múltiplas proteínas funcionais estão contidas na sequência polipeptídica que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal, pelo menos uma sequência espaçadora, sequência de clivagem ou outro elemento regulador pode estar localizado entre as duas ou mais proteínas funcionais.
[00110] A sequência polipeptídica que é heteróloga à sequência de sinal N-terminal pode ser, por exemplo: (a) uma proteína ou peptídeo estimulador de crescimento da planta; (b) uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno; (c) uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse de uma planta; (d) uma proteína ou peptídeo de ligação à planta; (e) uma proteína ou peptídeo intensificadora do sistema imune; ou (f) uma proteína ou peptídeo que aumenta a captação de nutrientes. Quando expressadas em Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, essas proteínas de fusão são direcionadas ao exospório do endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus e são fisicamente orientadas de forma que a proteína ou peptídeo seja exibida na parte externa do esporo.
[00111] Esses sistemas de exibição do exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus podem ser usados para liberar peptídeosm enzimas e outras proteínas às plantas (por exemplo, às folhagens, frutas, flores, hastes ou raízes das plantas) ou a um meio de crescimento da planta tal como solo. Os peptídeos, enzimas e proteínas liberados no solo ou um outro meio de crescimento da planta neste modo persistem e exibem atividade no solo por estendidos períodos de tempo. A introdução de células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes expressando as proteínas de fusão descritas no presente documento no solo ou a rizosfera de uma planta pode levar a um melhoramento benéfico do crescimento da planta em muitas diferentes condições de solo. O uso de um sistema de exibição de exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para criar essas enzimas permite que elas continuem a exercer os seus efeitos benéficos na planta e na rizosfera durante os primeiros meses da vida das plantas, e em alguns aspectos durante período mais longo de tempo e incluindo a vida da planta. Exospórios isolados e/ou purificados e composições compreendendo os mesmos
[00112] A divulgação provê exospórios isolados e/ou purificados obtidos a partir de endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que foram modificados para expressar construtos de proteína de fusão conforme descritos no presente documento, e composições compreendendo os mesmos. Em aspectos selecionados, essas composições compreendem tanto a camada basal ou uma camada de filamento do tipo cabelo de um exospório recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Em outras, a composição compreende ambas as camadas de um exospório recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Em aspectos selecionados, a composição pode compreender uma fração ou extrato específico de um exospório recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus (por exemplo, um extrato compreendendo componentes de exospório solúveis em um solvente específico).
[00113] Em outros aspectos selecionados, a composição de exospórios pode ainda compreender componentes adicionais (por exemplo, qualquer um dos compostos promotores de crescimento da planta, pesticidas ou outros agentes ativos divulgados no presente documento). Em aspectos adicionais, as composições de exospórios podem ser tratadas para matar ou tornar células e/ou endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus vegetativos não viáveis na composição. Em aspectos selecionados, a composição de exospório não contém quantidades detectáveis de células e/ou endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Em aspectos selecionados, a composição de exospório é processada para remover ou reduzir o nível de toxinas bacterianas e/ou componentes imunogênicos de modo a produzir uma composição de exospórios que seja menos tóxica ou imunogênica ou de outra forma mais bem tolerada por uma planta ou animal que pode ser tratado com ou exposto à composição de exospório.
[00114] Em aspectos selecionados, a composição de exospório compreende exospórios substancialmente intactos coletados a partir de endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus (por exemplo, usando sonicação). Alternativamente, a composição pode conter exospórios processados (por exemplo, triturados, suspensos em um fluido, etc.) Em aspectos alternativos, a composição de exospórios pode ser dissolvida em um solvente. Em cada caso, a composição pode ser processada de modo que um subcomponente ou composto específico seja enriquecido. Por exemplo, as composições de exospório podem ser processadas para enriquecer uma concentração ou quantidade da proteína de fusão recombinante presente na composição enriquecida comparado com a quantidade ou composição na exospório bruto coletado a partir dos endósporos do exospório recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[00115] Em aspectos selecionados, a composição de exospórios compreende um exospório isolado e/ou purificado de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus contendo uma proteína de fusão de acordo com qualquer um dos aspectos descritos no presente documento. Por exemplo, a proteína de fusão compreende qualquer uma das sequências de direcionamento N-terminal divulgadas no presente documento, por exemplo, qualquer uma das sequências divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus).
[00116] As proteínas de fusão e/ou composições de exospório divulgadas no presente documento podem ser usadas para liberar uma proteína de interesse a uma planta. Em aspectos selecionados, as proteínas de fusão ou composições de exospório de acordo com qualquer aspecto descrito no presente documento podem ser aplicadas diretamente a uma planta (por exemplo, como um pó, suspensão ou solução, a uma semente ou a um campo). Em aspectos selecionados, a proteína de fusão ou composição de exospório é aplicada a um campo na semeadura ou depois da semeadura ou alternativamente antes ou depois da germinação (por exemplo, pré- ou pós-plantio ou pré- ou pós-
emergência).
[00117] Em aspectos alternativos, as proteínas de fusão e/ou composições de exospório divulgadas no presente documento podem ser liberadas a uma planta, semente e/ou campo indiretamente através da aplicação de células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus à planta, semente ou campo. Nesses aspectos, a proteína de fusão e/ou composição de exospório pode ser expressada ou gerada pelas células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus (por exemplo, no campo), resultando na liberação da proteína de fusão à planta, semente ou campo. Células de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes tendo efeitos promotores do crescimento de planta e/ou outros atributos benéficos
[00118] Algumas bactérias de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus são conhecidas por terem inerentes atributos benéficos. Por exemplo, algumas cepas têm efeitos promotores do crescimento das plantas. Qualquer uma das proteínas de fusão descritas no presente documento pode ser expressada nas referidas cepas.
[00119] Por exemplo, as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes podem compreender uma cepa promotora do crescimento das plantas de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. A cepa promotora do crescimento das plantas de bactérias pode compreender uma cepa de bactérias que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Bin), produz um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3- glucanase, uma quitosinase, uma liticase ou uma combinação das mesmas), produz um composto nematocida (por exemplo, uma toxina Cry), produz um composto bacteriocida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos que se replicam livremente, se liga às raízes das plantas, coloniza as raízes das plantas,
forma biopelículas, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos. Agentes de controle biológico
[00120] As composições providas pela divulgação podem ainda incluir agentes de controle biológico. Os agentes de controle biológico podem incluir, em particular, bactérias, fungos ou leveduras, protozoários, vírus, nematoides entomopatogênicos, inoculantes e botânicos e/ou mutantes destes tendo todas as características de identificação da respectiva cepa, e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos. A divulgação provê combinações dos endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus descritos acima com os agentes de controle biológico específicos descritos no presente documento e/ou aos mutantes de cepas específicas de micro-organismos descritos no presente documento, onde os mutantes têm todas as características de identificação da respectiva cepa, e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos ou promove o crescimento da planta e/ou aumenta a saúde da planta. De acordo com a divulgação, os agentes de controle biológico descritos no presente documento podem ser empregados ou usados em qualquer estado fisiológico tal como ativo ou dormente. Composições selecionadas de acordo com a presente divulgação
[00121] Em aspectos selecionados, a divulgação provê composições compreendendo (a) uma célula recombinante produtora de exospório de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que expressa uma proteína de fusão compreendendo: a sequência de direcionamento que localiza a proteína de fusão, a qual compreende uma proteína de interesse heteróloga, ao exospório de um membro da família de
Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus; e (b) pelo menos um agente de controle biológico adicional e diferente divulgado no presente documento e/ou um mutante de uma cepa específica de um micro- organismo divulgado no presente documento tendo todas as características identificadoras da respectiva cepa, e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos em uma quantidade sinergicamente eficaz. Em aspectos alternativos, a composição compreende pelo menos um fungicida adicional e/ou pelo menos um inseticida, com a condição de que as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes, o inseticida e o fungicida não sejam idênticos. Em um outro aspecto, a composição é usada para reduzir o dano completo das plantas e partes das plantas, assim como, perdas em frutas ou vegetais colhidos causadas por insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos. Em um outro aspecto, a composição aumenta a saúde global da planta.
[00122] O termo “saúde da planta” geralmente compreende vários tipos de melhoramentos de plantas que não estão conectados ao controle de pragas. Por exemplo, as propriedades vantajosas que podem ser mencionadas são características de cultura melhoradas incluindo: emergência, rendimento da safra, teor de proteína, teor de óleo, teor de amido, sistema raiz mais desenvolvido, crescimento de raiz melhorado, manutenção de tamanho de raiz melhorada, eficácia de raiz melhorada, tolerância melhorada ao estresse (por exemplo, contra seca, calor, sal, UV, água, frio), etileno reduzido (produção e/ou inibição reduzida da recepção), aumento no perfilhamento, aumento na altura da planta, maior lâmina foliar, menos folhas basais mortas, perfilhos mais fortes, coloração mais verde da folha, teor do pigmento, atividade fotossintética, menos insumo necessário (tal como fertilizantes ou água), menor necessidade de sementes, perfilhos mais produtivos,
floração mais precoce, maturidade mais precoce do grão, menos dobramento da planta (acamamento), crescimento aumentado de brotos, vigor aumentado da planta, estande de plantas aumentado e germinação precoce e melhor.
[00123] As composições providas pela divulgação podem ser rastreadas para identificar benefícios potenciais para o crescimento, saúde da planta ou outros atributos positivos através da comparação das plantas que são desenvolvidas sob as mesmas condições ambientais, pelas quais uma parte das referidas plantas é tratada com uma composição de acordo com a presente divulgação e uma outra parte das referidas plantas não é tratada com uma composição de acordo com a presente divulgação. Em vez disso, a referida outra parte não é tratada ou é tratada com um controle adequado (isto é, uma aplicação sem uma composição de acordo com a divulgação tal como uma aplicação sem todos os ingredientes ativos), uma aplicação sem as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes conforme descrito no presente documento ou uma aplicação sem um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento.
[00124] A composição de acordo com a presente divulgação pode ser aplicada de qualquer modo desejado, tal como na forma de um revestimento de sementes, encharcamento do solo e/ou diretamente nos sulcos e/ou como um pulverizador foliar e aplicada tanto pré- emergência, pós-emergência ou ambas. Em outras palavras, a composição pode ser aplicada na semente, na planta ou nas frutas e vegetais colhidos ou no solo onde a planta está crescendo ou onde se deseja que ela cresça (local de crescimento da planta).
[00125] Reduzir o dano global das plantas e partes de plantas frequentemente resulta em plantas mais saudáveis e/ou em um aumento no vigor e rendimento da planta. Preferivelmente, a composição de acordo com a presente divulgação é usada para tratar plantas convencionais ou transgênicas ou semente das mesmas. Métodos de utilização de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus recombinantes Construtos e composições
[00126] A presente divulgação também se refere aos métodos para estimulação do crescimento da planta usando qualquer uma das composições descritas acima compreendendo células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes que expressam uma proteína de fusão e pelo menos um dos agentes de controle biológico específicos adicionais descritos no presente documento. O método para estimulação do crescimento da planta compreende aplicar a uma planta, uma semente, uma parte da planta, ao local que circunda a planta ou no qual a planta será plantada (por exemplo, solo ou outro meio de crescimento) uma composição compreendendo células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo: (i) uma proteína heteróloga (por exemplo, pelo menos uma proteína de estimulação de crescimento de plantas); e (ii) a sequência de direcionamento; e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento e/ou um mutante de uma cepa específica de um micro-organismo divulgado no presente documento tendo todas as características identificáveis da respectiva cepa, e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[00127] Em um outro aspecto da presente divulgação um método para reduzir o dano global de plantas e partes de plantas assim como as perdas em frutas ou vegetais colhidos causadas por insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos é provido compreendendo a etapa de simultaneamente ou sequencialmente aplicar as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional descritas no presente documento em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[00128] Em uma modalidade do presente método, composição ainda compreende pelo menos um fungicida. Em um aspecto, pelo menos um fungicida é um fungicida sintético. Em uma outra modalidade, a composição compreende pelo menos um inseticida além do fungicida ou no lugar do fungicida, contanto que o inseticida, o fungicida, as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e o agente de controle biológico específico divulgados no presente documento não sejam idênticos.
[00129] O método da presente divulgação inclui os seguintes métodos de aplicação, a saber ambos das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento podem ser formulados em uma composição única, estável com uma meia-vida agricolamente aceitável (assim chamada “formulação solo”) ou sendo combinada antes ou no momento do uso (assim chamada “formulações combinadas”).
[00130] Caso não mencionado de outra forma, a expressão “combinação” significa que várias combinações das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida, em uma formulação solo, em uma forma única “pronta para misturar”, em uma mistura pulverizadora combinada composta de formulações solo, tais como “mistura de tanque”, e especialmente em um uso combinado dos únicos ingredientes ativos quando aplicados de uma forma sequencial, isto é, um depois do outro dentro de um período razoavelmente curto, tal como umas poucas horas ou dias, por exemplo, 2 horas a 7 dias. A ordem de aplicação da composição de acordo com a presente divulgação não é essencial para funcionamento da presente divulgação. Consequentemente, o termo “combinação” também abrange a presença das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou inseticida em ou em uma planta a ser tratada ou sua proximidade, habitat ou espaço de armazenagem, por exemplo, depois de simultaneamente ou consecutivamente aplicar as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida a uma planta ou sua proximidade, habitat ou espaço de armazenagem.
[00131] Se as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida forem empregados ou usados de uma forma sequencial, prefere-se tratar as plantas ou partes de plantas (as quais incluem sementes e plantas que emergem das sementes), frutas e vegetais colhidos de acordo com o método a seguir: primeiro aplicar pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida na planta ou partes das plantas, e em segundo lugar aplicar o agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento e as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes na mesma planta ou partes das plantas. Com esse modo de aplicação, a quantidade de resíduos de inseticidas/fungicidas na planta mediante a colheita é a menor possível. Os períodos de tempo entre a primeira e a segunda aplicação dentro de um ciclo de desenvolvimento da (cultura) pode variar e depende do efeito a ser alcançado. Por exemplo, a primeira aplicação é feita para impedir uma infestação da planta ou partes das plantas com insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos (este é particularmente o caso quando se tratam as sementes) ou para combater uma infestação com insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos (este é particularmente o caso quando se tratam plantas e partes das plantas) e a segunda aplicação é feita para impedir ou controlar a infestação com insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos e/ou para promover o crescimento das plantas. O controle neste contexto significa que a composição compreendendo as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e o agente de controle biológico específico divulgado no presente documento não são capazes de exterminar completamente as pragas ou fungos fitopatogênicos mas são capazes de manter a infestação em um nível aceitável.
[00132] A presente divulgação também provê métodos de aumentar a morte, inibição, atividade preventiva e/ou repelente das composições da presente divulgação através de múltiplas aplicações. Em algumas outras modalidades, as composições da presente divulgação são aplicadas a uma plantas e/ou partes da planta por duas vezes, durante qualquer estágio de desenvolvimento desejado ou sob pressão de pragas predeterminada, em um intervalo de cerca de 1 hora, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 24 horas, cerca de dois dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 1 semana, cerca de 10 dias, cerca de duas semanas, cerca de três semanas, cerca de 1 mês ou mais. Ainda em algumas modalidades, as composições da presente divulgação são aplicadas a uma planta e/ou partes de plantas por mais de duas vezes, por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais, durante qualquer estágio de desenvolvimento desejado ou sob pressão de pragas predeterminada, em um intervalo de cerca de 1 hora, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 24 horas, cerca de dois dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 1 semana, cerca de 10 dias, cerca de duas semanas, cerca de três semanas, cerca de 1 mês ou mais. Os intervalos entre cada aplicação podem variar caso seja desejado. Um versado na técnica será capaz de determinar os tempos de aplicação e a duração do intervalo dependendo das espécies de planta, espécie da praga na planta e outros fatores.
[00133] Ao seguir as etapas mencionadas antes, um nível muito baixo de resíduos de pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida na planta tratada, partes das plantas, e as frutas e vegetais colhidos pode ser alcançado.
[00134] Caso não mencionado de outra forma, o tratamento das plantas ou partes das plantas (o qual inclui sementes e plantas que emergem das sementes), frutas e vegetais colhidos com a composição de acordo com a divulgação é realizado diretamente ou através da ação nas suas proximidades, habitat ou espaço de armazenagem usando métodos de tratamento usuais, por exemplo imersão, pulverização, atomização, irrigação, evaporação, formação de poeira, formação de névoa, difusão, formação de espuma, pintura, espalhamento, irrigação (encharcamento), irrigação por gotejamento. É ainda possível aplicar as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes, pelo menos um agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida como formulação solo ou formulações combinadas através do método de volume ultra baixo ou injetar a composição de acordo com a presente divulgação como uma composição ou como formulações únicas no solo (em sulcos).
[00135] O termo “planta a ser tratada” abrange cada parte de uma planta incluindo o seu sistema de raiz e o material – por exemplo, solo ou meio de nutrição – o qual está em um raio de pelo menos 10 cm, 20 cm, 30 cm em torno do caule ou tronco de uma planta a ser tratada pu que é de pelo menos 10 cm, 20 cm, 30 cm em torno do sistema de raiz da referida planta a ser tratada, respectivamente.
[00136] A quantidade das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes, a qual é usada ou empregada em combinação com pelo menos um agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento, opcionalmente na presença de pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida, depende da formulação final assim como do tamanho ou tipo da planta, partes das plantas, sementes, frutas e vegetais colhidos a serem tratados. Em geral, as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes a serem empregadas ou usadas de acordo com a divulgação estão presentes em cerca de 1% até cerca de 80% (p/p), preferivelmente em cerca de 1% até cerca de 60% (p/p), mais preferivelmente cerca de 10% até cerca de 50% (p/p) de sua formulação solo ou formulação combinada com pelo menos um agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento, e opcionalmente o fungicida e/ou pelo menos um inseticida.
[00137] Também a quantidade de pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento que é usado ou empregado em combinação com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes,
opcionalmente na presença de pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida, depende da formulação final assim como do tamanho ou tipo da planta, partes das plantas, sementes, frutas ou vegetais colhidos a serem tratados. Em geral, o agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento a ser empregado ou usado de acordo com a divulgação está presente em cerca de 0,1% até cerca de 80% (p/p), preferivelmente 1% até cerca de 60% (p/p), mais preferivelmente cerca de 10% até cerca de 50% (p/p) de sua formulação solo ou formulação combinada com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida.
[00138] A aplicação das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes pode ser efetuada como um pulverizador foliar, como um tratamento no solo, e/ou como um tratamento/preparação das sementes. Quando usado como um tratamento foliar, em uma modalidade, cerca de 1/16 até cerca de 5 galões de caldo total são aplicados por hectare. Quando usado como um tratamento no solo, em uma modalidade, cerca de 1 até cerca de 5 galões de caldo total são aplicados por hectare. Quando usado para tratamento das sementes cerca de 1/32 até cerca de 1/4 galões de caldo total são aplicados por hectare acre. Para tratamento das sementes, a formulação de uso final contém pelo menos 1 × 104, pelo menos 1 × 105, pelo menos 1 × 106, 1 × 107, pelo menos 1 × 108, pelo menos 1 × 109, pelo menos 1 × 1010 de unidades formadoras de colônia por grama.
[00139] A razão pode ser calculada com base na quantidade de pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento, no momento de aplicação do referido componente de uma combinação de acordo com a divulgação a uma planta ou parte da planta e a quantidade das células de Brevibacillus,
Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes pouco antes (por exemplo, 48 h, 24 h, 12 h, 6 h, 2 h, 1 h) ou no momento de aplicação do referido componente de uma combinação de acordo com a divulgação a uma planta ou parte da planta.
[00140] A aplicação das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento a uma planta ou uma parte da planta pode acontecer simultaneamente ou em diferentes momentos à medida que ambos os componentes estejam presentes ou na planta depois da(s) aplicação(ões). Em casos onde as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento são aplicados em momentos diferentes e o agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento é aplicado antes das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes, o versado na técnica pode determinar a concentração de agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento em uma planta através da análise química conhecida na técnica, no momento ou pouco antes do momento de aplicação das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes. Similarmente, quando as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes são aplicadas a uma planta primeiro, a concentração das células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes pode ser determinada usando testes que são conhecidos na técnica, no momento ou pouco antes do momento de aplicação do agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento.
[00141] Em um outro aspecto da presente divulgação uma semente tratada com a composição conforme descrita acima é provida. O controle de insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos através do tratamento da semente das plantas é conhecido por um longo período de tempo e é sujeito a melhoramentos contínuos. Não obstante, o tratamento de sementes implica em uma série de problemas que não podem ser sempre resolvidos de uma maneira satisfatória. Assim, é desejável desenvolver métodos para proteger a semente e a planta germinativa que remova a necessidade ou pelo menos significativamente reduza o fornecimento adicional de composições de proteção de safra no decurso do armazenamento, após a semeadura ou após a emergência das plantas. É desejável, além disso, otimizar a quantidade de ingrediente ativo de uma tal forma a prover a proteção melhor possível à semente e a planta germinativa do ataque de insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos, mas sem causar dano à própria planta pelo ingrediente ativo empregado. Em particular, os métodos para tratamento da semente também devem levar em consideração as propriedades inseticidas e/ou nematicidas intrínsecas das plantas transgênicas resistentes às pragas ou tolerantes às pragas, de modo a alcançar proteção ideal da semente e da planta germinativa com um uso mínimo de composições de proteção à cultura.
[00142] A presente divulgação consequentemente também se refere em particular a um método para proteger a semente e plantas germinativas do ataque por pragas, ao tratar a semente com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes conforme definido acima e pelo menos um agente de controle biológico adicional selecionado a partir de micro- organismos específicos divulgados no presente documento e/ou um mutante de uma cepa específica de micro-organismo divulgado no presente documento tendo todas as características identificadoras da respectiva cepa, e/ou pelo menos um metabólito produzido pela respectiva cepa que exibe atividade contra insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou opcionalmente pelo menos um inseticida da divulgação. O método da divulgação para proteger sementes e plantas germinativas do ataque por pragas abrange um método no qual a semente é tratada simultaneamente em uma operação com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida. Ele também abrange um método no qual a semente é tratada em diferentes momentos com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida.
[00143] A divulgação ainda provê métodos de tratamento de sementes para a finalidade de proteção das sementes e da planta resultante contra insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos. A divulgação também se refere à semente a qual foi tratada ao mesmo tempo com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional descrito no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida. A divulgação ainda se refere à semente que foi tratada em diferentes momentos com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida. No caso da semente que foi tratada em diferentes momentos com as células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus produtoras de exospórios recombinantes e pelo menos um agente de controle biológico específico adicional divulgado no presente documento, e opcionalmente pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida, os ingredientes ativos individuais na composição da divulgação podem estar presentes em diferentes camadas na semente.
[00144] Além disso, a divulgação refere-se à semente que, em seguida ao tratamento com a composição da divulgação, é submetida a um processo de revestimento com película de modo a impedir abrasão de poeira da semente.
[00145] Uma das vantagens da presente divulgação é que, devido às propriedades sistêmicas específicas das composições da divulgação, o tratamento da semente com essas composições provê proteção contra insetos, ácaros, nematoides e/ou fitopatógenos não apenas para a própria semente mas também para as plantas que se originam da semente, depois que elas emergiram. Deste modo, pode ser necessário tratar a cultura diretamente no momento da semeadura ou pouco depois dela. Uma vantagem adicional a ser observada no fato de que, através do tratamento da semente com a composição da divulgação, a germinação e a emergência da semente tratada podem ser promovidas.
[00146] As composições da divulgação são adequadas para proteger a semente de qualquer variedade de plantas que é usada na agricultura, em estufas, na silvicultura ou na horticultura. Mais particularmente, a semente em questão é aquela de cereais (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e milhete), milho, algodão, soja, arroz, batatas, girassol, café, tabaco, canola, colza, beterrabas (por exemplo, beterraba açucareira e beterraba forrageira), amendoins, vegetais (por exemplo, tomate, pepino, feijão, brássicas, cebolas e alface), plantas frutíferas, gramados e plantas ornamentais. É particularmente importante o tratamento da semente dos cereais (tal como trigo, cevada, centeio e aveia) milho, soja, algodão, canola, colza e arroz.
[00147] Para as finalidades da presente divulgação, a composição da divulgação é aplicada sozinha ou em uma formulação adequada à semente. A semente é preferivelmente tratada em uma condição na qual a sua estabilidade é tal que nenhum dano ocorra no curso do tratamento. Em termos gerais, a semente pode ser tratada em qualquer momento entre a colheita e a semeadura. Tipicamente, a semente que é usada foi separada da planta e teve espigas, cascos, hastes, cascas, pelo ou polpa removidos. Sendo assim, por exemplo, a semente que pode ser usada foi colhida, limpa e seca até um teor de umidade de menos do que 15% em peso. Alternativamente, a semente que também pode ser usada foi tratada com água, por exemplo, e depois seca novamente.
[00148] Quando se trata a semente, é necessário, em geral, assegurar que a quantidade da composição da divulgação, e/ou de outros aditivos, que é aplicada à semente seja selecionada de forma que a germinação da semente não seja adversamente afetada, e/ou que a planta que emerge a partir da semente não seja danificada. Este é o caso em particular com ingredientes ativos que podem exibir efeitos fitotóxicos em certas taxas de aplicação.
[00149] As composições da divulgação podem ser aplicadas diretamente, em outras palavras sem compreender componentes adicionais e sem ter sido diluída. Como uma regra geral, é preferível aplicar as composições na forma de uma formulação adequada à semente. As formulações e métodos adequados para o tratamento das sementes são conhecidos da pessoa versada na técnica e são descritos em, por exemplo, os documentos a seguir: Patentes Norte-americanas Nos. 4,272,417 A; 4,245,432 A; 4,808,430 A; 5,876,739 A; Publicação de Patente Norte-americana U.S. No. 2003/0176428 A1; WO 2002/080675 A1; WO 2002/028186 A2, cujos conteúdos são incorporados no presente documento a título de referência.
[00150] As combinações que podem ser usadas de acordo com a divulgação podem ser convertidas nas formulações de preparação (cobertura) das sementes costumeiras, tais como soluções, emulsões, suspensões, pós, espumas, pastas ou outras composições de revestimento para sementes, e também formulações ULV. Essas formulações são preparadas de uma forma conhecida, ao se misturar a composição com adjuvantes usuais, tais como, por exemplo, extensores usuais e também solventes ou diluentes, corantes, umectantes, dispersantes, emulsificantes, antiespumantes, conservantes, espessantes secundários, adesivos, giberelinas e também água. Corantes que podem estar presentes nas formulações de cobertura das sementes que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todos os corantes que são usuais para essas finalidades. Neste contexto, é possível usar não apenas pigmentos, que são de baixa solubilidade em água, mas também corantes hidrossolúveis. Os exemplos incluem os corantes conhecidos sob designações Rodamina B, C.I. Pigmento vermelho 112, e solvente vermelho1 C.I.
[00151] Dependendo da espécie ou cultivar da planta, a sua localização e condições de crescimento (solos, clima, período de vegetação, dieta), usando ou empregando a composição de acordo com a presente divulgação, o tratamento de acordo com a divulgação também pode resultar em efeitos (“sinergísticos”) superaditivos. Sendo assim, por exemplo, ao usar ou empregar a composição da invenção no tratamento de acordo com a divulgação, taxas de aplicação e/ou o alargamento do espectro de atividade e/ou um aumento na atividade de crescimento de planta, tolerância aumentada a altas ou baixas temperaturas, tolerância aumentada à seca ou à água ou teor de sal de solo, aumento de desempenho de floração, colheita mais fácil, maturação acelerada, rendimentos de colheita mais altos, frutos maiores, altura de planta maior, cor das folhas mais verde, florescência precoce, qualidade superior e/ou um maior valor nutricional dos produtos colhidos, maior concentração de açúcar dentro das frutas, melhor estabilidade de armazenamento e/ou processabilidade dos produtos colhidos são possíveis, os quais excedem os efeitos que eram de fato esperados.
[00152] Em certas taxas de aplicação da composição da invenção no tratamento de acordo com a divulgação pode também ter um efeito fortalecedor nas plantas. O sistema de defesa da planta contra o ataque por fungos fitopatogênicos indesejados e/ou micro-organismos e/ou vírus é mobilizado. As substâncias de (de indução de resistência) fortalecimento das plantas devem ser entendidas como significado, no presente contexto, aquelas substâncias ou combinações de substâncias que são capazes de estimular o sistema de defesa das plantas de tal forme que, quando subsequentemente inoculadas com fungos fitopatogênicos indesejados e/ou micro-organismos e/ou vírus, as plantas tratadas exibem um grau de resistência substancial a esses fungos fitopatogênicos e/ou micro-organismos e/ou vírus. Sendo assim, ao usar ou empregar a composição de acordo com a presente divulgação no tratamento de acordo com a divulgação, as plantas podem ser protegidas contra o ataque pelos patógenos mencionados acima dentro de um certo período de tempo depois do tratamento. O período de tempo dentro do qual a proteção é efetivada geralmente se estende de 1 a 10 dias, preferivelmente 1 a 7 dias, depois do tratamento das plantas com os compostos ativos.
[00153] Qualquer uma das composições divulgadas no presente documento pode incluir um ou mais agroquímicos. Similarmente, os métodos de aplicação de composições de acordo com a divulgação podem ainda compreender introduzir pelo menos um agroquímico no meio de crescimento da planta ou aplicar pelo menos um agroquímico a plantas ou sementes.
[00154] O agroquímico pode compreender um fertilizante (por exemplo, um fertilizante líquido), um material de fertilizante micronutriente (por exemplo, ácido bórico, um borato, uma frita de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um tetraborato decaidratado de sódio, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, sulfato de amônio de ferro, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibídico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação dos mesmos), um inseticida (por exemplo, um organofosfato, um carbamato, um piretroide, um acaricida, um alquil ftalato, ácido bórico, um borato, um fluoreto, enxofre, uma ureia haloaromática substituída, um éster hidrocarboneto, um inseticida de base biológica ou uma combinação dos mesmos), um herbicida (por exemplo, um composto de clorofenóci, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto dipiridila, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benzamida, um ácido benzoico, um derivado de ácido benzoico, ácido anísico, um derivado de ácido anísico, uma benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinila, um derivado de cicloexenona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, ácido nicotínico, isopropilamina, derivados de isopropilamina, oxadiazolinona, um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, uma uracila, um derivado de ureia, endothall, clorato de sódio, ou uma combinação dos mesmos), um fungicida (por exemplo, um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organoestanho, um composto de cádmio, anilazina, benomila, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxila, tiamimefon, triforina ou uma combinação dos mesmos), um moluscicida, um algicida, uma emenda de crescimento da planta, um inoculante bacteriano (por exemplo, um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella ou uma combinação dos mesmos), um inoculante fúngico (por exemplo, um inoculante fúngico da família Glomeraceae, um inoculante fúngico da família Claroidoglomeraceae, um inoculante fúngico da família Gigasporaceae, um inoculante fúngico da família Acaulosporaceae, um inoculante fúngico da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inoculante fúngico da família
Ambisporaceae, um inoculante fúngico da família Scutellosporaceae, um inoculante fúngico da família Dentiscultataceae, um inoculante fúngico da família Racocetraceae, um inoculante fúngico do filo Basidiomycota, um inoculante fúngico do filo Ascomycota, um inoculante fúngico do filo Zygomycota ou uma combinação dos mesmos) ou uma combinação dos mesmos.
[00155] O fertilizante pode compreender sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfeto de amônio, tiossulfato de amônio, amônia aquosa, amônia anidra, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de cálcio amônio, sulfato de cálcio, magnesita calcinada, calcário calcítico, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, calcário dolomítico, cal hidratada, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, nitrato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de potássio magnésio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, calcário magnesiano, magnésia, ureia, ureia-formaldeídos, nitrato de ureia amônio, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutilideno diureia, K2SO4-(MgSO4)2, cainita, silvinita, kieserita, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, conchas de ostra trituradas, farinha de peixe, bolos de óleo, manco de peixe, farinha de sangue, fosfato de rocha, superfosfatos, escória, farinha de ossos, cinza de madeira, esterco, guano de morcego, turfa, composto, areia verde, farinha da semente de algodão, farinha de penas, farinha de caranguejo, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação dos mesmos. O agroquímico pode compreender qualquer fungicida, inoculante bacteriano ou herbicida, conforme descrito no presente documento. A bactéria formadora de esporos, sozinha ou em combinação com o inseticida, pode ainda compreender uma quantidade eficaz de pelo menos um fungicida.
[00156] Em geral, um “fungicida” é uma substância para aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de fungos.
O termo “fungo” ou “fungos” inclui uma ampla variedade de organismos que carregam esporos nucleados que são desprovidos de clorofila.
Exemplos de fungos incluem leveduras, mofos, míldios, ferrugens e cogumelos.
Os ingredientes fungicidas típicos também incluem captan, fludioxonil, iprodiona, tebuconazol, tiabendazol, azoxstrobina, procloraz e oxadixila.
Selecionar composições, sementes de plantas ou inóculos de acordo com a divulgação pode compreender qualquer fungicida natural ou sintético, tal como: aldimorf, ampropilfos, ampropilfos potássico, andoprim, anilazina, azaconazol, azoxistrobina, benalaxila, benodanila, benomila, benzamacril, benzamacril-isobutila, bialafos, binapacrila, bifenila, bitertanol, blasticidina-S, boscalid, bromuconazol, bupirimato, butiobato, polisulfero de cálcio, capsimicina, captafol, captan, carbendazim, carvon, quinometionato, clobentiazona, clorfenazol, cloroneb, cloropicrina, clorotalonila, clozolinato, clozilacon, cufraneb, cimoxanil, ciproconazol, ciprodinil, ciprofuram, debacarb, diclorofen, diclobutrazol, diclofluanid, diclomezina, dicloran, dietofencarb, dimetirimol, dimetomorf, dimoxistrobina, diniconazol, diniconazol-M, dinocap, difenilamina, dipiritiona, ditalimfos, ditianon, dodemorf, dodina, drazoxolon, edifenfos, epoxiconazol, etaconazol, etirimol, etridiazol, famoxadon, fenapanil, fenarimol, fenbuconazol, fenfuram, fenitropan, fenpiclonil, fenpropidin, fenpropimorf, acetato de fentin, hidróxido de fentin, ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluopiram, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanil, flutriafol, folpet, fosetil-alumínio, fosetil-sódio, ftalida, fuberidazol, furalaxila, furametpir, furcarbonila, furconazol, furconazol-cis, furmeciclox, guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalila, imibenconazol, iminoctadina, albesilato de iminoctadina, triacetato de iminoctadina, iodocarb, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, casugamicina, cresoxim-metila,
preparações de cobre, tais como: hidróxido de cobre, naftenato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, óxido de cobre, oxina-cobre e mistura Bordeaux, mancopper, mancozeb, maneb, meferimzona, mepanipirim, mepronila, metalaxila, metconazola, metassulfocarb, metfuroxam, metiram, metomeclam, metsulfovax, mildiomicina, miclobutanila, miclozolina, dimetilditiocarbamato de níquel, nitrotal- isopropila, nuarimol, ofurace, oxadixila, oxamocarb, ácido oxolínico, oxicarboxim, oxifentiin, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, pencicuron, fosdifen, pimaricin, piperalin, polioxin, polioxorim, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarb, propanosina-sódica, propiconazol, propineb, protiocinazol, pirazofos, pirifenox, pirimetanila, piroquilon, piroxifur, quinconazol, quintozeno (PCNB), enxofre e preparações de enxofre, tebuconazol, tecloftalam, tecnazeno, tetciclasis, tetraconazol, tiabendazol, ticiofen, tifluzamida, tiofanato- metila, tioximid, tolclofos-metila, tolilfluanid, triadimefon, triadimenol, triazbutila, triazóxido, triclamida, triciclazol, tridemorf, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, uniconazol, validamicina A, vinclozolina, viniconazol, zarilamida, zineb, ziramor ou uma combinação dos mesmos. O fungicida também pode compreender um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, um tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organoestanho, um composto de cádmio, anilazina, benomila, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxila, tiamimefon, triforina ou uma combinação dos mesmos. Um versado na técnica prontamente apreciará que outros fungicidas sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos usados para finalidades de agricultura também podem ser selecionados para inclusão em uma composição, semente de planta ou inóculo de acordo com a divulgação.
[00157] Se uma composição, semente de planta ou inóculo compreende um fungicida, o fungicida pode ser um fungicida foliar. Os fungicidas foliares incluem cobre, mancozeb, pentiopirad, triazois, ciproconazol, metconazol, propiconazol, protioconazol, tebuconazol, azoxistrobina, piraclastobina, fluoxastrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, enxofre, boscalid, tiofanato metila, clorotanonila, pentiopirad, difenconazol, flutriafol, ciprodinila, fluzinam, iprodiona, penflufen, ciazofamid, flutolanila, cimoxanila, dimetomorf, pirimetanila, zoxamida, mandipropamid, metrinam, propamocarb, fenamidona, tetraconazol, cloronab, himexazol, tolclofos e fenbuconazol. Um versado na técnica prontamente apreciará que outros fungicidas sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos usados para finalidades agrícolas também podem ser selecionados para inclusão em uma composição, semente de planta ou inóculo de acordo com a divulgação.
[00158] As composições, sementes e inoculantes de acordo com a divulgação compreendendo um inseticida, possuem a capacidade de aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de insetos. Conforme usado no presente documento, o termo “insetos” inclui todos os organismos na classe “Insecta”. O termo insetos “pré-adultos” refere- se a qualquer forma de um organismo antes do estágio adulto, incluindo, por exemplo, ovos, larvas e ninfas. Conforme usado no presente documento, os termos “inseticidas” e “inseticida” também abrangem “nematicidas” e “nematicida” e “acaricidas” e “acaricida”. “Nematicidas” e “nematicida” refere-se à capacidade de uma substância em aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de nematoides. Em geral, o termo “nematoide” compreende ovos, larvas, formas juvenis e maduras do referido organismo. “Acaricidas” e “acaricida” refere-se à capacidade de uma substância em aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de ectoparasitas que pertencem à classe Arachnida, subclasse Acari.
[00159] De acordo com um aspecto da presente divulgação, pelo menos um inseticida compreende: (1) inibidores de acetilcolinesterase
(AChE) tais como, por exemplo, carbamatos, por exemplo alanicarb, bendiocarb, benfuracarb, butocarboxim, butoxicarboxim, carbofuran, carbosulfan, etiofencarb, furatiocarb, isoprocarb, metolcarb, oxamil, pirimicarb, propoxur, tiofanox, triazamato, trimethacarb, XMC e xililcarb; ou organofosfatos, por exemplo acefato, azametifos, azinfos-etila, azinfos-metila, cadusafos, cloretoxifos, clorfenvinfos, clormefos, clorpirifos-metila, coumafos, cianofos, demeton-S-metila, diazinon, diclorvos/DDVP, dicrotofos, dimetoato, dimetilvinfos, disulfoton, EPN, etion, famfur, fenitrotion, fostiazato, heptenofos, imiciafos, isofenfos, isopropil O-(metoxiaminotiofosforil) salicilato, isoxation, malation, mecarbam, metidation, mevinfos, monocrotofos, naled, ometoato, paration-metila, fentoato, forato, fosmet, fosfamidon, foxim, pirimifos - metila, profenofos, propetamfos, protiofos, piraclofos, piridafention, quinalfos, sulfotep, tebupirimfos, temefos, terbufos, tetraclorvinfos, tiometon e triclorfon. (2) antagonistas do canal de cloreto dependentes de GABA, tais como, por exemplo, ciclodieno-organoclorinas, por exemplo clordano e/ou fenilpirazóis. (3) os modelos do canal de sódio/bloqueadores do canal de sódio dependentes de voltagem tais como, por exemplo, piretroides, por exemplo, acrinatrina, alletrina, d-cis- trans alletrina, d-trans alletrina, bifentrina, bioalletrina, isômero de bioalletrin s-ciclopentenila, bioresmetrina, cicloprotrina, cihalotrina, lambda-cihalotrina, gamma-cihalotrina, empentrina [(EZ)-(IR)-isômero], esfenvalerato, etofenprox, fenpropatrina, fenvalerato, flucitrinato, flumetrina, tau-fluvalinato, halfenprox, imiprotrina, kadetrina, permetrina, [(lR)-trans-isômero] de fenotrina, pralletrina, piretrinas (piretrum), resmetina, teflutrina, tetrametrina, [(1R)-isômero)] de tetrametrina e transflutrina ou DDT ou metoxiclor. (4) agonistas do receptor de acetilcolina nicotinérgica (nAChR), tais como, por exemplo, neonicotinoides, por exemplo, dinotefuran, nitenpiram e tiametoxam ou nicotina ou sulfoxaflor. (5) Ativadores alostéricos do receptor de acetilcolina nicotinérgica (nAChR) tais como, por exemplo, espinosinas, por exemplo, espinetoram e espinosad. (6) ativadores do canal de cloro, tais como, por exemplo, avermectinas/milbemicinas, por exemplo abamectina, benzoato de emamectina, lepimectina e milbemectina. (7) mimetizadores dos hormônios juvenis, tais como, por exemplo, análogos do hormônio juvenil, por exemplo, hidropreno, quinopreno e metopreno ou fenoxicarb ou piriproxifen. (8) compostos ativos com mecanismos desconhecidos ou não específicos de ação, tais como, por exemplo, haletos de alquila, por exemplo, brometo de metila e outros haletos de alquila; ou cloropicrina ou fluoreto de sulfurila ou bórax ou tártaro emético. (9) fagoinibidores seletivos, por exemplo pimetrozina ou flonicamida. (10) inibidores do crescimento de ácaros, por exemplo clofentezina, hexitiazox e diflovidazina ou etoxazol. (11) desreguladores microbianos da membrana intestinal dos insetos, por exemplo Bacillus thuringiensis subespécie israelensis, Lysinibacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis subspecies aizawai, Bacillus thuringiensis subespécie kurstaki, Bacillus thuringiensis subespécie tenebrionis, e proteínas da planta Bt: CrylAb, CrylAc, CrylFa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Abl. (12) Inibidores da fosforilação oxidativa, desreguladores de ATP tais como, por exemplo, diafentiuron ou compostos de organoestanho, por exemplo azocclotina, cihexatina e óxido de fenbutatina ou propargita ou tetradifon. (13) desaclopadores da fosforilação oxidativa agindo através da interrupção do gradiente próton H tais como, por exemplo, clorfenapir, DNOC e sulfluramida. (14) antagonistas do receptor de acetilcolina nicotinérgica tais como, por exemplo, bensultap, cloridrato de cartap, tiocilam e tiosultap-sódico. (15) inibidores da biossíntese de quitina, tipo 0, tais como, por exemplo, bistrifluron, clorfluazuron, diflubenzuron, flucicloxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, novaluron, noviflumuron e teflubenzuron. (16) inibidores da biossíntese de quitina, tipo 1, por exemplo buprofezina.
(17) inibidores da muda (em particular para Diptera, isto é, dípteros) tais como, por exemplo, ciromazina. (18) agonistas do receptor de ecdysona tais como, por exemplo, cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida e tebufenozida. (19) agonistas octopaminérgicos. (20) inibidores do transporte de elétrons de complexo-Ill, tais como, por exemplo, hidrametilnona ou acequinocila ou fluacripirim. (21) inibidores do transporte de elétrons de complexo-I, por exemplo a partir do grupo dos acaricidas METI, por exemplo, fenazaquin, fenpiroximato, pirimidifen, piridaben, tebufenpirad e tolfenpirad ou rotenona (Derris). (22) bloqueadores do canal de sódio dependentes de voltagem, por exemplo indoxacarb ou metaflumizona. (23) Inibidores de acetil-CoA carboxilase. (24) inibidores do transporte de elétrons de complexo-IV, tais como, por exemplo, fosfinas, por exemplo, fosfito de alumínio, fosfito de cálcio, fosfito de alumínio, fosfito de cálcio, fosfina e fosfito de zinco ou cianeto de zinco. (25) inibidores do transporte de elétrons de complexo II, tais como, por exemplo, cienopirafen e ciflumetofen. (26) efetivadores do receptor de rianodina, tais como, por exemplo, diamidas, por exemplo, clorantraniliprol, o qual é também conhecido pelo nome comercial RYNAXYPYR™, e ciantraniliprol ou qualquer combinação de um ou mais dos compostos ou classes de compostos identificados acima.
[00160] Um versado na técnica prontamente apreciará que outros inseticidas sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos usados para finalidades agrícolas também podem ser selecionados para inclusão em uma composição, semente de plantas ou inóculo de acordo com a divulgação. Métodos de rastreio
[00161] Os construtos da proteína de fusão e as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus divulgados no presente documento podem ser usados como uma plataforma para rastreio de alto desempenho de proteínas heterólogas que geram novos e/ou modificados atributos de plantas, conforme discutido ao longo da divulgação.
Os referidos atributos podem incluir melhoramentos comercialmente significativos nos rendimentos das plantas e outras características de plantas, tais como: teor/composição de proteína ou óleo alterados na planta, teor/composição de carboidrato alterados na planta; teor/composição de sementes alterados na planta, composição de óleo ou proteína alterados na semente; tolerância aumentada aos estresses ambientais ou químicos (por exemplo, resistência ao frio ou calor, seca, inseticidas ou herbicidas); senescência retardada ou resistência a doenças; melhoramento do crescimento; aumento da saúde; resistência herbívora; melhorada fixação ou utilização do nitrogênio; melhor arquitetura ou comprimento da raiz; melhor eficiência no uso da água; biomassa aumentada; peso aumentado das sementes; comprimento aumentado das hastes; rendimento aumentado; teor de umidade ou massa do grão aumentados; tolerância ao metal; resistência a patógenos ou pragas; melhoramento da capacidade fotossintética; tolerância à salinidade; melhoramento do vigor; peso seco e/ou fresco aumentado das sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta; teor de clorofila aumentado; uma modulação detectável no nível de um metabólito ou no metaboloma relativo a uma planta/semente de referência; uma modulação detectável no nível de um transcrito ou no transcriptoma relativo a uma planta/semente de referência; uma modulação detectável no nível de uma proteína ou no proteoma relativo a uma planta de referência; e combinações de qualquer um dos traços ou atributos acima.
Além do mais, a lista precedente pretende ser um conjunto não limitante de exemplos.
Um versado na técnica apreciará que a plataforma de liberação de alto desempenho divulgada no presente documento é adequada para rastreio de vários outros traços ou atributos de plantas discutidos em algum outro lugar na divulgação ou de alguma outra forma conhecidos na técnica.
[00162] Os endósporos produzidos pelas células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus modificados para expressar uma proteína de fusão de acordo com a divulgação podem ser aplicados a células de plantas desenvolvidas in vitro, uma semente da planta hospedeira, muda ou a uma planta vegetativa ou de outra forma planta adura. A proteína heteróloga pode por sua vez modificar ou conferir um traço ou atributo às células de plantas desenvolvidas in vitro, semente da planta hospedeira, muda ou planta madura. Em modalidades selecionadas, os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que podem ser usados para inocular uma semente e o traço ou atributo novo ou modificado resultante podem ficar imediatamente aparentes, enquanto em outras modalidades eles podem não estar aparentes até um estágio tardio da planta hospedeira.
[00163] Em algumas modalidades, a bactéria de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus usada para liberar a proteína de fusão é exógena a espécies de plantas hospedeiras. Em outras, a bactéria de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus selecionada é um endófito endógeno conhecido por colonizar a espécie de planta hospedeira. A planta hospedeira pode ser qualquer planta adequada divulgada aqui (uma monocotiledônea, dicotiledônea, conífera, etc.)
[00164] A bactéria recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus usada para liberar a proteína de fusão pode ser usada para inocular uma semente da planta hospedeira, muda, espécime de planta vegetativa ou de outra forma espécime de planta madura por meio de um revestimento ou pulverização ou qualquer outro método de aplicação de endósporos a uma planta hospedeira conhecida na técnica. Quando aplicados como um líquido, por exemplo, como uma solução ou suspensão, os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser misturados ou suspensos em soluções aquosas. Os diluentes ou veículos líquidos adequados incluem soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros veículos líquidos. As composições sólidas podem ser preparadas através da dispersão de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus em e um veículo sólido adequadamente dividido, tais como turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra fuller, solo pasteurizado e similar. Quando as referidas formulações compreendem pós umectáveis, agentes dispersantes tais como agentes dispersantes e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos podem ser usados.
[00165] Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser aplicados diretamente na superfície das sementes da planta hospedeira ou nas folhas e caule de uma planta vegetativa diretamente ou como parte de uma composição compreendendo componentes adicionais. Os componentes adicionais podem incluir um ou mais compostos que aumentam a taxa de colonização, compostos que aumentam o crescimento ou saúde da planta, pesticidas ou herbicidas ou qualquer outro composto divulgado no presente documento como adequado para promover o cultivo e crescimento das plantas. Além do mais, a composição pode incluir endósporos adicionais de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que foram modificados para expressar proteínas de fusão compreendendo diferentes sequências de aminoácido. Por exemplo, uma composição pode compreender um primeiro endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que expressa uma proteína de fusão compreendendo um fator de promoção do crescimento da planta assim como um segundo endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que expressa uma proteína de fusão que compreende uma proteína que aumenta a resisência a pesticidas.
[00166] Em modalidades selecionadas, o endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que é revestido na semente de uma planta hospedeira é capaz, mediante a germinação da semente em um estado vegetativo, de localização em um tecido diferente da planta. Por exemplo, as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser capazes de localização em qualquer um dos tecidos na planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, fio da raiz, broto, folha, flor, botão, pendão, meristema, póllen, pistilo, ovários, estame, fruta, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células-guarda, hidatódio, pétala, sépala, gluma, haste, câmbio vascular, floema e xilema. Em outras modalidades, as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser capazes de se localizar na raiz e/ou no fio da raiz da planta. Em modalidades alternativas, as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser capazes de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta; ou nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema.
[00167] Em outras modalidades, as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus são capazes de se localizar nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta) da planta. Em ainda uma outra modalidade, as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus colonizam uma fruta ou tecido da semente da planta. Em ainda uma outra modalidade, as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus são capazes de colonizar a planta de forma que ela esteja presente na superfície da planta (por exemplo, o exterior da planta ou a filosfera da planta). Em ainda outras modalidades, as células recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus são capazes de se localizar em substancialmente todos ou todos, os tecidos da planta.
[00168] As composições compreendendo os endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus designados para aplicação a uma planta hospedeira podem compreender uma composição de revestimento da semente, um tratamento da raiz ou uma composição de aplicação foliar. A composição de revestimento da semente ou o tratamento da raiz ou a composição de aplicação foliar pode compreender um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento da planta, um nutriente ou combinações dos mesmos. A composição de revestimento da semente ou tratamento da raiz ou a composição de aplicação foliar podem ainda compreender um veículo agricolamente aceitável, um adesivo, um estabilizante microbiano ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades selecionadas, a composição de revestimento da semente ou tratamento da raiz ou a composição de aplicação foliar podem conter uma segunda bactéria, incluindo mas não limitado a uma preparação bacteriana rizobiana. As composições também podem conter um tensoativo. Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração dentre 0,01% v/v a 10% v/v. Em uma outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração dentre 0,1% v/v a 1% v/v. Em algumas modalidades, a composição pode incluir um estabilizante microbiano (por exemplo, um estabilizante).
[00169] Mediante a inoculação, uma planta hospedeira tratada (por exemplo, uma semente tratada, muda, planta vegetativa ou de outra forma planta madura) podem ser rastreadas quanto à existência de novos ou modificados atributos ou traços. O rastreio pode ocorrer em qualquer momento em seguida ao tratamento. Em modalidades selecionadas, uma semente pode ser tratada e o rastreio pode não ocorrer até que a semente tenha brotado ou alcançado um estágio mais avançado de desenvolvimento. Em outras modalidades, uma semente, muda ou planta vegetativa podem ser tratadas e o rastreio pode não ocorrer até que a planta tratada tenha produzido um produto final colhido que pode compreender a amostra a ser rastreada para um novo ou modificado traço ou atributo.
[00170] Durante o rastreio, vários testes podem ser realizados tanto in vitro e in vivo para determinar quais benefícios, se algum, são conferidos na planta hospedeira tratada. Os ensaios de rastreio in vivo incluem testes que medem traços ou atributos fenotípicos de uma planta ou semente (por exemplo, ensaios medindo a taxa ou altura de crescimento da planta; rendimento da cultura; resistência a um estresse ambiental tais como calor, frio ou salinidade; resistência a patógenos biológicos ou pragas insetos; resistência aos tratamentos químicos tais como inseticidas ou herbicidas). Os ensaios de rastreio in vitro incluem, porém não se limitam a, testes que medem a composição ou propriedades dos extratos das plantas, amostras de tecidos, amostras de células, e similar. Em algumas modalidades, o rastreio in vitro pode compreender purificar e medir a quantidade ou atividade de uma dada proteína, enzima, transcrito genético, metabólito ou outro composto encontrado nas células ou tecido da planta hospedeira tratada. Em outras modalidades, o rastreio pode compreender inspeção visual da estrutura de células ou tecido da planta hospedeira tratada, seja a olho nu ou através de microscópio.
[00171] Em modalidades alternativas, o rastreio pode compreender ensaios dos endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus ou células vegetativas modificadas para expressar uma proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, conforme oposto aos ensaios direcionados a plantas hospedeiras tratadas. Nessas modalidades, as células do membro da família ou endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser submetidos aos ensaios in vitro de uma ou mais atividades, tais como mas não limitado à capacidade de liberar fosfatos complexados ou ferro complexado (por exemplo, através da secreção de sideróforos); produção de fitohormônios; produção de compostos antibacterianos, antifúngicos ou inseticidas ou nematicidas; produção e/ou secreção de ACC desaminase, acetoína, pectinase, celulase ou RNase. Os métodos de rastreio direcionados às células do membro de família ou endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, em vez de plantas vegetativas, são particularmente vantajosos de forma que os referidos métodos podem permitir a detecção de proteínas heterólogas úteis mais cedo do que os métodos direcionados a plantas hospedeiras tratadas.
INFORMAÇÃO DE DEPÓSITO
[00172] As amostras das cepas de Brevibacillus, Lysinibacillus, and Viridibacillus da invenção foram depositadas com a Agricultural Research Service Culture Collection located at the National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department de Agriculture (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, U.S.A., under the Budapest Treaty. As cepas de Brevibacillus e Lysinibacillus NRRL B-67865 e NRRL B-67864, respectivamente, ambas foram depositadas em 10 de outubro de 2019. A cepa de Viridibacillus NRRL B-67869 foi depositada em 17 de outubro de 2019.
[00173] As cepas de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus foram depositadas sob condições que asseguram que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente a um determinado pelo Comissário de Patentes e marcas a ser intitulado aqui sob 37 C.F.R. § 1.14 e 35 U.S.C. §122. No entanto, deve ser compreendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção em derrogação dos direitos de patente condedidos por ação governamental.
[00174] Os exemplos não limitantes a seguir são providos para adicionalmente ilustrar a presente divulgação.
EXEMPLOS Exemplo 1: Protocolo geral para preparar endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
[00175] Para criar um construto de fusão, um polinucleotídeo codificando uma ou mais proteínas heterólogas pode ser fundido a um polinucleotídeo codificando os aminoácidos de qualquer sequência de direcionamento N-terminal divulgada no presente documento, por exemplo, um polinucleotídeo codificando qualquer uma das sequências de aminoácidos divulgadas na tabela 1 ou FIGs. 1-3 (para Brevibacillus), tabela 2 ou FIGs. 4-5 (para Lysinibacillus), ou tabela 3 ou FIG. 6 (para Viridibacillus) ou um fragmento ou variante do mesmo que retém a funcionalidade de direcionamento de exospório quando expressada no respectivo gênero bacteriano. O construto de fusão pode estar sob o controle do promotor nativo da sequência de direcionamento N-terminal divulgada. Os referidos construtos podem ser gerados usando emendas através da técnica de extensão sobreposta (SOE) ou junção Gibson resultando em um amplicon linear. Neste estágio, o protocolo também pode ser modificado para fundir a sequência de direcionamento N- terminal a uma sequência codificadora em estrutura para um marcador (por exemplo, GFP) ou para inserir um ligante ou sequência de reconhecimento de protease entre a sequência de direcionamento N- terminal e a proteína heteróloga. Independente se o marcador opcional, ligante, e/ou sequência de reconhecimento de protease está incluído, amplicons corretos podem ser então selecionados e clonados em um vetor de transporte adequado (por exemplo, pHP13 para E. coli/Brevibacillus), e os construtos do vetor corretos rastreados por sequenciamento de DNA. Este construto de vetor pode ser eletroporado em células não transformadas de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Os transformantes corretos podem ser desenvolvidos em um meio de esporulação adequado (por exemplo, caldo do meio de esporulação de Schaeffer de um dia para o outro em 30°C) até que a esporulação tenha ocorrido (tipicamente 2 – 3 dias). Os esporos expressando o construto de fusão podem ser colhidos e depois submetidos a um ou mais ensaios de rastreio in vitro, aplicados diretamente a uma planta hospedeira ou semente ou aplicados a uma planta hospedeira ou semente que é depois submetida a um ou mais ensaios de rastreio in vitro ou in vivo. Exemplo 2: Uso de endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para liberação de uma proteína de fusão envolvida na produção de um composto promotor de crescimento da planta a uma semente, muda, planta ou parte da planta.
[00176] As enzimas responsáveis pela produção de comopostos promotores do crescimento de plantas podem ser liberadas às plantas usando os sistemas de liberação de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus e Viridibacillus divulgados no presente documento. Por exemplo, butanodiol desidrogenase converte acetoína em 2,3- butanodiol. 2,3-butanodiol é um composto promotor do crescimento da planta. Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus expressando essa enzima podem ser aplicados como um tratamento de semente ou revestimento de semente ou liberados na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte de planta por gotejamento ou pulverização. Exemplo 3: Uso de endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para liberação de mais do que uma proteína de fusão em um único endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus a uma semente, muda, planta ou parte de planta.
[00177] Um único endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus pode ser usado para exibir mais do que uma proteína de fusão heteróloga. Isto é alcançado pela construção de duas (ou mais) proteínas de fusão separadas. A sequência codificadora para cada proteína heteróloga a ser exibida na superfície do endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus é fundida separadamente a uma sequência de direcionamento N-terminal sob o controle de seus promotores nativos. Os construtos da proteína de fusão podem ser clonados tanto no mesmo vetor plasmídeo ou diferentes vetores plasmídeo e introduzidos em células de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus através de eletroporação. Os endósporos resultantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus irão então expressar uma mistura de ambas as proteínas heterólogas na superfície do esporo. Isto é particularmente útil para acumular múltiplas toxinas invertebradas proteináceas para mitigar a resistência a pragas. Exemplo 4: Uso de mais de um endósporo recombinante de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus em combinação, cada um exibindo uma ou mais diferentes proteínas de fusão a uma semente, muda, planta ou parte de planta.
[00178] Em certos casos, a liberação de mais de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus em combinação, cada um expressando uma ou mais diferentes proteínas heterólogas (conforme descrito acima) é provida. Por exemplo, a liberação de enzimas de fixação de nitrogênio à área que circunda as raízes de uma planta reduz a necessidade por fertilizantes nitrogenados químicos. A fixação de nitrogênio em bactérias pode necessitar, no mínimo, oito ou nove enzimas diferentes e potencialmente além de vinte enzimas diferentes dependendo da espécie. Aqui, a liberação de uma combinação de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus, cada um expressando diferentes componentes enzimáticos da via de fixação de nitrogênio podem ser úteis. Por exemplo, os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que exibem de forma heteróloga NifH, NifD e NifK podem ser combinados em uma mistura com endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que exibem de forma heteróloga NifE, NifN e NifD e liberados na área que circunda as raízes. Exemplo 5: Uso de endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para liberação de uma toxina invertebrada que mata pragas invertebradas nas plantas na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta ou como um tratamento para sementes.
[00179] As toxinas proteináceas antagonísticas em relação aos invertebrados incluindo, mas não limitado, a insetos ou nematoides podem ser liberadas usando sistemas de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus divulgados no presente documento. Por exemplo, as toxinas Cry incluindo mas não limitada a Cry5B e Cry21A as quais são ambas inseticidas e nematicidas podem ser fundidas à sequência de direcionamento N-terminal para expressão em endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus expressando toxinas Cry ou outras toxinas invertebradas proteináceas podem ser aplicados como um tratamento para sementes ou revestimento de sementes ou liberados na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta através de gotejamento ou pulverização para proteção contra patógenos invertebrados das plantas. Exemplo 6: Uso de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para liberação de um peptídeo, proteína ou enzima que é antagonística em relação a pragas bacterianas nas plantas na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta ou como um tratamento para sementes.
[00180] As bacteriocinas são peptídeos pequenos produzidos pelas bactérias com atividade antagonística em relação a outras bactérias.
Devido ao fato das bacteriocinas serem ribossomicamente sintetizadas conforme oposto a outras moléculas antimicrobianas (por exemplo, bacitracina), que são sintetizadas por sintetases peptídicas não ribossômicas grandes, as bacteriocinas são especialmente mais bem adequadas para liberação usando o sistema de endósporo de Brevibacillus. A sequência codificadora para uma ou mais bacteriocinas pode ser fundida à sequência de direcionamento N-terminal para expressão em endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus expressando bacteriocinas podem ser aplicados como um tratamento para sementes ou revestimento de sementes ou liberados na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta através de gotejamento ou pulverização para proteção contra patógenos bacterianos das plantas. Exemplo 7: Uso de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para liberação de um peptídeo, proteína, ou enzima que é antagonística contra pragas fúngicas das plantas na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta ou como um tratamento para sementes.
[00181] O componente primário da parede celular dos fungos é quitina. A quitinase é uma enzima que degrada a quitina e pode ser expressada na superfície dos endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para proteger contra patógenos fúngicos das plantas ao destruir as suas paredes celulares. Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus expressando quitinase podem ser aplicados como um tratamento para sementes ou revestimento de sementes ou liberados na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta através de gotejamento ou pulverização. Exemplo 8: Uso dos endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para liberação de uma enzima que degrada ou modifica uma fonte de nutrientes bacteriana, fúngica ou das plantas na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta ou como um tratamento para sementes.
[00182] As enzimas responsáveis pela degradação ou modificação de uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou de plantas podem ser liberadas nas plantas usando endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Por exemplo, um glicosídeo hidrolase que rompe os polissacarídeos complexos pode ser usado para tornar disponíveis açúcares simples para rizobactérias benéficas através do tratamento de uma planta ou semente com endósporos recombinantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus expressando esta (ou uma outra) enzima de interesse. Exemplo 9: Uso de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para avaliar as respostas aos agentes de biocontrole de promoção do crescimento das plantas através do rastreio de bibliotecas de DNA genômico derivadas de agentes de biocontrole de promoção do crescimento das plantas.
[00183] Muitas das cepas de biocontrole usadas hoje são recalcitrantes à captação de DNA exógeno tornando os pesquisadores incapazes de gerar modificações genéticas direcionadas das referidas cepas. Devido a esta modificação, elucidar o mecanismo de ação dos efeitos promotores do crescimento das plantas dessas cepas de biocontrole é extremamente difícil. Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus apresentam uma nova abordagem para identificar genes específicos responsáveis pelos efeitos promotores de crescimento das plantas subjacentes das cepas de biocontrole. Em primeiro lugar, a sequência de direcionamento N-terminal e promotor nativo são clonados em um vetor de transporte adequado (por exemplo, pHP13 para Brevibacillus), resultando em um vetor adequado para a expressão de proteína heteróloga nos endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
Todas as etapas de clonagem e propagação de plasmídeo são realizadas em E. coli.
A seguir, gDNA total é extraído de uma cepa de biocontrole para promoção do crescimento de plantas alvo.
O gDNA é quebrado em fragmentos (enzimaticamente ou sonicamente) e ligado no vetor descrito acima para expressão de proteínas heterólogas nos endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para gerar uma biblioteca de gDNA compreendida de todo o material genético que se origina da cepa de biocontrole de interesse.
A biblioteca do vetor resultante é introduzida em um membro de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus através de eletroporação e as bactérias são colocadas em placas de ágar contendo um agente de seleção antibiótico apropriado para selecionar transformantes satisfatórios.
Os transformantes individuais, cada um expressando um diferente fragmento do gDNA da cepa de biocontrole alvo, são avaliados para efeitos da promoção do crescimento das plantas.
Esses efeitos podem incluir porém não se limitam a crescimento verde aumentado, germinação aumentada, vigor da planta aumentado, comprimento da raiz aumentado, massa da raiz aumentada, altura da planta aumentada, área da folha aumentada ou resistência a pragas.
Verificou-se que o vetor nos transformantes de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que modula os parâmetros de saúde da planta pode ser sequenciado para identificar os determinantes genéticos que originam da cepa de biocontrole responsável pelos efeitos de promoção do crescimento da planta observados.
Exemplo 10: Uso de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para identificar novas e não caracterizadas toxinas antagonísticas contra patógenos invertebrados, bacterianos e fúngicos das plantas.
[00184] Muitas das cepas de biocontrole em uso hoje são recalcitrantes à captação de DNA exógeno tornando os pesquisadores incapazes de gerar modificações genéticas direcionadas das referidas cepas.
Devido a este desafio, elucidar o mecanismo de ação pelo qual as cepas de biocontrole são tóxicas em relação a patógenos invertebrados, bacterianos e fúngicos das plantas é incrivelmente difícil.
Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus apresentam uma nova abordagem para identificar genes específicos responsáveis pelos efeitos protetores para as plantas de cepas de biocontrole.
Em primeiro lugar, a sequência de direcionamento N- terminal e promotor nativo são clonados em um vetor de transporte adequado (por exemplo, pHP13 para Brevibacillus) resultando em um vetor adequado para a expressão da proteína heteróloga em endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus.
Todas as etapas de clonagem e propagação de plasmídeo são realizadas em E. coli.
A seguir, gDNA total é extraído de uma cepa de biocontrole para promoção do crescimento de plantas alvo.
O gDNA é quebrado em fragmentos (enzimaticamente ou sonicamente) e ligado no vetor descrito acima para expressão de proteínas heterólogas nos endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus para gerar uma biblioteca de gDNA compreendida de todo o material genético que se origina da cepa de biocontrole de interesse.
A biblioteca do vetor resultante é introduzida em um membro de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus através de eletroporação e as bactérias são colocadas em placas de ágar contendo um agente de seleção antibiótico apropriado para selecionar transformantes satisfatórios.
Os transformantes individuais, cada um expressando um diferente fragmento do gDNA da cepa de biocontrole alvo, são avaliados quanto a atividade antagonística em relação a patógenos invertebrados, bacterianos e fúngicos das plantas.
Verificou-se que o vetor nos transformantes de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus que modula os parâmetros de saúde da planta pode ser sequenciado para identificar os determinantes genéticos que originam da cepa de biocontrole responsável pelos efeitos de promoção do crescimento da planta observados. Exemplo 11: Uso de exospórios purificados a partir de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus como um tratamento para uma semente, muda, planta ou parte da planta para melhorar a saúde da planta.
[00185] Pode haver a necessidade de se liberarem proteínas/enzimas promotoras da saúde das plantas usando os sistemas de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus divulgados no presente documento sem endósporos viáveis de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus. Para esta finalidade, o exospório a partir de um endósporo de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus (por exemplo, produzido por uma célula modificada para produzir uma proteína heteróloga usando as sequências de direcionamento N-terminal divulgadas no presente documento) pode ser removido do endósporo de Brevibacillus através de suficiente agitação com sonicação. Os exospórios removidos são então ainda purificados através de filtração. Os exospórios purificados resultantes podem ser aplicados como um tratamento para sementes ou revestimento de sementes ou liberados na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta por gotejamento ou pulverização. Exemplo 12: Uso de endósporos não viáveis de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus como um tratamento para uma semente, muda, planta ou parte da planta com a finalidade de proteger plantas dos patógenos ou melhorar a saúde das plantas.
[00186] Pode haver uma necessidade de liberar proteínas/enzimas promotoras de saúde das plantas ou proteínas/enzimas para proteção das plantas usando os sistemas de liberação de endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus divulgados no presente documento, com endósporos não viáveis (mortos) de Brevibacillus. Os endósporos de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser inativados ou tornados não viáveis através de tratamento térmico suficiente, luz UV, irradiação gamma ou processamento em alta pressão. Os endósporos não viáveis resultantes de Brevibacillus, Lysinibacillus ou Viridibacillus podem ser aplicados como um tratamento para sementes ou revestimento de sementes ou liberados na área que circunda uma semente, muda, planta ou parte da planta por gotejamento ou pulverização. Exemplo 13: Um protocolo geral para preparação de endósporos recombinantes de Brevibacillus exibindo dímero de tomate em tandem (tdTomato).
[00187] O genoma completo de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 foi buscado por ORFs contendo repetições GXX do tipo colágeno através da análise bioinformática. As sequências a partir de ORFs contendo repetições do tipo colágeno foram compiladas e cortadas para render apenas aminoácidos N-terminais a montante das repetições do tipo colágeno. Este protocolo geral foi usado para identificar proteínas endógenas de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 tendo as sequências de direcionamento N-terminal divulgadas na tabela 1 e FIGs. 1-3. Por exemplo, esta abordagem foi usada para identificar a sequência de direcionamento N-terminal representada pela SEQ ID NO: 3, a qual verificou-se estar diretamente a montante de um domínio de repetição CLR (SEQ ID NO: 220) e sob o controle de um promotor nativo codificado pela SEQ ID NO: 221. Tabela 4: CLR e sequências promotoras associadas com uma proteína direcionada ao exospório de Brevibacillus exemplificador
Identificador
SEQUÊNCIA da sequência
GVTGATGATGPTGATGATGATGPTGVTGATGAAGGDTGATGA TGQTGETGVAGATGATGQTGETGVAGATGATGQTGETGVAG ATGATGQTGETGVAGATGATGQTGETGVAGATGATGQTGET
GVAGATGATGQTGETGVAGATGATGQTGETGVAGATGATGQ SEQ ID NO: TGETGVAGATGATGQTGETGKAGATGATGQTGETGVTGATG 220 ATGQTGETGEAGATGAAGQTGETGVTGATGATGQTGETGVA
GATGATGQTGETGVAGATGATGATGQTGETGVVGATGATGQ TGETGVVGATGATGQTGETGVAGATGATGATGQTGETGVAG ATGATGQTGETGVAGATGATGQTGETGVAGATGATGQTGET GVAGATGATGQTGEAGVAGVTGATG
TGAAAAGATGGGGAATTCTCCATCTTTTTTCTTTTGTCTGGA SEQ ID NO: GTGGTGAGATATACGACATACAACGAATGAGCATAACATGAA 221 TAGTTTATAAAATCGCAAAAAATTTTTCGGAAGGAGAGAGCG
AAAATTAACAATAAGCGGGCTAACGCATTCAATAAGAAG
[00188] Para criar construtos de fusão, o gene codificador para tdTomato foi fundido a um segmento de DNA codificando os aminoácidos da sequência de direcionamento N-terminal divulgada (SEQ ID NO: 3) de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 sob o controle do promotor nativo das sequências de direcionamento N-terminal divulgadas pela síntese genética e clonados em um vetor de transporte de E. coli/Brevibacillus, pAP13. O construto do vetor resultante foi introduzido em Brevibacillus sp. NRRL B-67865 através de eletroporação similar àquele descrito por Huang et al. (2010), “Production de an In Vitro-Derived Deletion Mutation de Brevibacillus laterosporus by Constructing a Homology-Driven Integration Vector,” Current Microbiology, 61:401–406, doi:10.1007/s00284-010-9627-0. Os transformantes corretos foram desenvolvidos em um meio de caldo à base de glicose em 30°C até a esporulação. Os esporos de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 expressando o construto de fusão foram então examinados por microscopia epifluorescente. TdTomato é visível em esporos expressando o construto de fusão (FIG. 7A). os esporos de Brevibacillus sp. NRRL B-67865 também foram examinados através de citometria de fluxo. Os esporos expressando o construto de fusão são significativamente mais fluorescentes do que os esporos do tipo selvagem (FIG. 7B). Exemplo 14: um protocolo geral para preparar endósporos de Lysinibacillus recombinantes que exibem dímero de tomate em tandem (tdTomato).
[00189] O genoma completo de Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 foi buscado por ORFs contendo repetições GXX do tipo colágeno através da análise bioinformática. As sequências a partir de ORFs contendo repetições do tipo colágeno foram compiladas e cortadas para render apenas aminoácidos N-terminais a montante das repetições do tipo colágeno. Este protocolo geral foi usado para identificar proteínas endógenas de Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 tendo as sequências de direcionamento N-terminal divulgadas na tabela 2 e FIGs. 4-5. Por exemplo, esta abordagem foi usada para identificar a sequência de direcionamento N-terminal representada pela SEQ ID NO: 43, que verificou-se estar diretamente a montante de um domínio de repetição CLR (SEQ ID NO: 222 e sob o controle de um promotor nativo codificado pela SEQ ID NO: 223. Tabela 5: CLR e sequências promotoras associadas com uma proteína direcionada ao exospório de Lysinibacillus exemplificador Identificad or da SEQUÊNCIA sequência
GVTGATGATGATGAQGPPGAPGPQGVAGAMGPRGEIGPQGVA GATGATGPQGEMGLQGVAGVTGASGPQGEIGPQGVAGVTGAP
GPQGEIGPQGVAGATGVPGPQGEIGPQGVAGETGATGPQGEM SEQ ID NO: GLQGVAGVTGATGPQGEMGPQGVAGVTGATGPQGEIGPQGVA 222 GVTGAPGPQGEIGPQGVAGVTGAPGPQGEMGLQGVAGVTGAT
GPQGIIGATGLRGLAGITGATGERGLAGITGATGVQGVAGSTGAT GSQGITGATGVQGVTGSTGATGSQGITGATGVQGVTGSTGATG SQGITGATGVQGVTGSTGATGSQGITGATGVQGVAGSTGATGS QGITGATGVQGVTGSTGATGARGTTGVTGTTGPSGSGLMEVFL STDQSVGNNDFLGTGNSSASFVRSSIVIPENATIRSLTLNIRDHAL SAGQTASAQIFVSTNCGFTSVATGIIATVTGPNSSTTPNCCAKVIA NYPVSSCTLLSVQVSTTGGAFSNGVSATVLFNTV
TGTTGAAACATATTATTGAGCATTGGGTTTTATATGACCTAATG SEQ ID NO: TTCTTTTTATTTTAAGATACATATTTAAATCATTCTAATATTCTAG 223 GTGCATTAATTATCTCAATAAGTAGACTTTTGAATATGATAAAA
AGGGACAGGAGGTGAAGTCGCA
[00190] Para criar construtos de fusão, o gene codificador para tdTomato foi fundido a um segmento de DNA codificando os aminoácidos da sequência de direcionamento N-terminal divulgada (SEQ ID NO: 43) de Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 sob o controle do promotor nativo das sequências de direcionamento N-terminal divulgadas pela síntese genética e clonadas em um vetor de transporte de E. coli/Lysinibacillus, pAP13. O construto de vetor resultante foi introduzido em Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 por eletroporação similar àquela descrita em Taylor and Burke (1990), “Transformation de an entomopathic strain de Bacillus sphaericus by high voltage electroporation,” FEMS Microbiology Letters, 66:125-128, doi.org/10.1111/j.1574-6968.1990.tb03983.x. Os transformantes corretos foram desenvolvidos em um meio de caldo à base de glicose em 30°C até a esporulação. Os esporos de Lysinibacillus sp. NRRL B- 67864 expressando o construto de fusão foram então examinados por microscopia epifluorescente. TdTomato é visível em esporos expressando o construto de fusão (FIG. 8A). Os esporos de Lysinibacillus sp. NRRL B-67864 também foram examinados por citometria de fluxo. Os esporos expressando o construto de fusão são significativamente mais fluorescentes do que os esporos do tipo selvagem (FIG. 8B). Exemplo 15: Um protocolo geral para preparar endósporos recombinantes de Viridibacillus exibindo dímero de tomate em tandem (tdTomato).
[00191] A abordagem descrita nos Exemplos 13 e 14 foi usada para identificar as sequências de direcionamento N-terminal em Viridibacillus. Esta abordagem leva à identificação da sequência de direcionamento N-terminal representada pela SEQ ID NO: 197, a qual se verificou estar diretamente a montante de um domínio de repetição CLR (SEQ ID NO: 224 e sob o controle de um promotor nativo codificado pela SEQ ID NO: 225). Tabela 6: CLR e sequências promotoras associadas com proteína direcionada ao exospório de Viridibacillus exemplificador Identificador
SEQUÊNCIA da sequência
GKTGPTGATGPTGSMGPTGVTGSTGATGPTGSTGVTGETGST GTTGPSGSTGPTGATGSTGETGATGSTGATGETGPTGPTGTT GVTGETGATGPTGATGATGETGSTGPTGATGETGETGSTGPT GATGSTGATGPTGATGSTGATGSTGATGSTGATGPTGATGST GETGPTGETGSTGATGSTGATGETGPTGTTGVTGETGATGPT GATGATGETGETGSTGPTGATGETGETGSTGPTGATGSTGAT GPTGATGSTGATGSTGATGSTGATGPTGATGSTGETGPTGET GSTGATGSTGATGETGPTGATGSTGATGETGATGPTGPTGTT GVTGATGPTGATGETGPTGATGEAGPTGSTGATGPTGATGIT SEQ ID NO:
GATGPTGSTGATGSTGETGSTGETGPTGATGVTGATGPTGET 224
GSTGPMGATGETGSTGSTGVTGATGATGETGATGSTGATGTT GATGETGPTGPTGSTGATGETGPTGPTGATGVTGATGATGAT GETGSTGPMGATGETGSTGSTGVTGATGATGVTGATGETGST GATGSTGATGETGPTGPTGPTGPTGTTGVTGVTGETGPTGAT GETGSTGPTGTTGVTGETGATGPTGATGSTGETGATGETGRT GPTGTTGVTGETGATGETGPTGATGSTGATGPTGATGATGAT GETGPTGATGETGATGATGSTGATGPTGPTGTTGVTGATGPT GATGETGPTGATGEAGPTGSTGSTGPTGATGITGATGPTGAT GATGSTGETGSTGETGPTGSTG ATATTTTAGAAAGTGAAAAATACAGATAAAAGCCTTTGCTGAT TCATTTTTCTGGATTTATTTAAAAGAACGATTGGAGAGTATTC TTCAGCCGTATCTTTTTTTTGTTGCTAAAAATATTAATAATTTT ACTTGAGGATTTTAATAGATTAAGAAATTTTTAATTCTGATAC SEQ ID NO:
CTATATTGTATTACAGGAATATTTTAGAAATAAGCATATCCCA 225
TTTTCATTTTACAGTTTAATAGCATGCTAGAGAAATACATAAT TATCAGACTACCATGAATGAGATGATTATCCGATTTTTTTCTG TCACATTACAATTGTCCAATATCAATCTATTTCACGAGAATAG TATGTATATGATGGGAGGTGATAATA
[00192] Para criar os construtos de fusão, o gene codificador para tdTomato foi fundido a um segmento de DNA codificando os aminoácidos da sequência de direcionamento N-terminal divulgada (SEQ ID NO: 197) de Viridibacillus sp. NRRL B-67869 sob o controle do promotor nativo das sequências de direcionamento N-terminal divulgadas pela síntese genética e clonadas em um vetor de transporte de E. coli/Viridibacillus, pAP13. O construto do vetor resultante foi introduzido em Viridibacillus sp.
NRRL B-67869 por eletroporação usando meio LBSP, tratamento com ampicilina, e lavagem com tampão TSMMKK similar àquele descrito em Zhang et al. (2015), “Development de an Efficient Electroporation Method for Iturin A-Producing Bacillus subtilis ZK,” International Journal de Molecular Sciences, 16:7334-7351, doi:10.3390/ijms16047334. Os transformantes corretos foram então desenvolvidos em um meio de caldo à base de glicose em 30°C até a esporulação.
Os esporos de Viridibacillus sp.
NRRL B-67869 expressando o construto de fusão foram então examinados por microscopia epifluorescente.
TdTomato é visível em esporos expressando o construto de fusão (FIG. 9A). Os esporos de Viridibacillus sp.
NRRL B-67869 também foram examinados por citometria de fluxo.
Os esporos expressando o construto de fusão são significativamente mais fluorescentes do que os esporos do tipo selvagem (FIG. 9B).

Claims (108)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma primeira sequência polinucleotídica codificando um peptídeo de sinal N-terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência polinucleotídica compreende: (i) uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38, ou mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3; ou (ii) uma sequência polinucleotídica compreendendo um fragmento de pelo menos 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 ou 150, 210, 270, 330, 390 ou 450 nucleotídeos consecutivos de uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3; e em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de direcionar a proteína de fusão a um exospório de um endósporo de Brevibacillus.
2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento inclui: (a) o primeiro nucleotídeo de uma sequência polinucleotídica codificando qualquer sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3; ou (b) o último nucleotídeo de uma sequência polinucleotídica codificando qualquer sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3.
3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com uma sequência polinucleotídica codificando qualquer sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3.
4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o fragmento codifica aminoácidos 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40 ou 1-45, 1-50, 1-75, 1-100, 1-125 ou 1-150 de qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na tabela 1 ou FIGs. 1-3.
5. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora do crescimento das plantas; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Brevibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína estimuladora das plantas.
6. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de ainda compreender uma terceira sequência polinucleotídica, codificando: (a) um polipeptídeo compreendendo um ou mais sítios de protease clivagem de protease, em que o polipeptídeo está posicionado entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo compreendendo um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo compreendendo um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou
(e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, o qual conecta o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
7. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o endósporo de Brevibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Brevibacillus, caracterizada pelo fato de compreender: B. agri, B. aydinogluensis, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. fluminis, B. formosus, B. fulvus, B. ginsengisoli, B. invocatus, B. laterosporus, B. levickii, B. limnophilus, B. massiliensis, B. nitrificans, B. panacihumi, B. parabrevis, B. reuszeri ou B. thermorube; ou um endósporo formado por uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97%, 98% ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie Brevibacillus.
8. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que é operacionalmente ligada a um elemento promotor que é heterólogo a pelo menos uma das segundas sequências polinucleotídicas e Brevibacillus.
9. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência polinucleotídica compreende: uma sequência polinucleotídica códon-otimizada tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3, que é expressada em uma maior taxa ou nível no endósporo de Brevibacillus comparado com a sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3, sob condições idênticas.
10. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo de sinal N-terminal operacionalmente ligado a um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3; ou (b) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125 ou 150 aminoácidos consecutivos a partir da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de direcionar a proteína de fusão a um exospório de um endósporo de Brevibacillus.
11. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o fragmento inclui: (a) o primeiro aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3; ou (b) o último aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3.
12. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a sequência polipeptídica compreende uma sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3.
13. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que o fragmento compreende aminoácidos 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-75, 1-100, 1-125 ou 1-150 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-38 ou de uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3.
14. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora do crescimento das plantas; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Brevibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora das plantas.
15. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão ainda compreende: (a) um polipeptídeo contendo um ou mais sítios de protease clivagem de protease, posicionados entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo compreendendo um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, conectando o peptídeo de sinal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
16. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizada pelo fato de que o endósporo de
Brevibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Brevibacillus, compreendendo: B. agri, B. aydinogluensis, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. fluminis, B. formosus, B. fulvus, B. ginsengisoli, B. invocatus, B. laterosporus, B. levickii, B. limnophilus, B. massiliensis, B. nitrificans, B. panacihumi, B. parabrevis, B. reuszeri ou B. thermorube; ou um endósporo formado por uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97%, 98% ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie de Brevibacillus.
17. Célula recombinante de Brevibacillus caracterizada pelo fato de que compreende um cromossomo bacteriano compreendendo uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
18. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o vetor compreende um plasmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral.
19. Vetor, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um dos seguintes: (a) uma origem de replicação que provê manutenção estável em uma célula de Brevibacillus; (b) uma origem de replicação que provê seletivamente manutenção não estável em uma célula de Brevibacillus; (c) uma origem de replicação sensível à temperatura que provê seletivamente manutenção não estável em uma célula de Brevibacillus; (d) um polinucleotídeo codificando um marcador de seleção, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; ou (e) um polinucleotídeo codificando uma proteína estimuladora do crescimento de plantas, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão.
20. Célula recombinante de Brevibacillus transformada com um vetor caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
21. Célula recombinante de Brevibacillus, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a célula de Brevibacillus é uma espécie de Brevibacillus, compreendendo: B. agri, B. aydinogluensis, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. fluminis, B. formosus, B. fulvus, B. ginsengisoli, B. invocatus, B. laterosporus, B. levickii, B. limnophilus, B. massiliensis, B. nitrificans, B. panacihumi, B. parabrevis, B. reuszeri ou B. thermoruber; ou uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97%, 98% ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie de Brevibacillus.
22. Método de exibição de uma proteína de fusão heteróloga em um exospório de um endósporo de Brevibacillus, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de Brevibacillus capaz de esporulação com um vetor recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e (b) expressar a proteína de fusão codificada pela molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sob condições de esporulação de forma que a proteína de fusão seja direcionada ao exospório do endósporo de Brevibacillus resultante da esporulação, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 70% ou 80% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3; ou (ii) um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125 ou 150 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 1 ou FIGs. 1-3.
23. Composição caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma ou mais células recombinantes de Brevibacillus produtoras de exospório que expressam a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína estimuladora do crescimento das plantas ou imunoestimuladora; e (b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
24. Semente caracterizada pelo fato de que é tratada com o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, a célula bacteriana recombinante, como definida na reivindicação 20 ou 21, ou a composição, como definida na reivindicação 23.
25. Método de tratamento de uma planta, uma semente, uma parte de planta ou o solo que circunda a planta para aumentar o crescimento da planta e/ou promover a saúde da planta caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de simultaneamente ou sequencialmente aplicar: (a) endósporos recombinantes de Brevibacillus produtores de exospórios que expressam a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína de crescimento de plantas ou proteína imunoestimuladora; e (b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
26. Método de rastreio de uma planta hospedeira tratada com um endósporo recombinante de Brevibacillus, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) aplicar uma composição compreendendo um endósporo de Brevibacillus modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, a uma semente, uma muda ou uma planta vegetativa capaz de ser permanentemente ou transitoriamente colonizada por um Brevibacillus, para produzir uma semente tratada, muda ou planta vegetativa; e (b) rastrear a semente tratada, muda ou planta vegetativa através da detecção e opcionalmente medição de um traço, componente ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a etapa de rastreio compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos um ensaio in vitro compreendendo detectar e opcionalmente quantificar a presença, nível, mudança no nível, atividade ou localização de um ou mais compostos contidos em um extrato preparado a partir de uma amostra de célula ou amostra de tecido obtida a partir da semente tratada, muda ou planta vegetativa; e/ou (b) pelo menos um ensaio in vivo compreendendo detectar e opcionalmente quantificar um traço, componente ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
28. Método de rastreio de proteínas ou peptídeos heterólogos expressados em uma célula de Brevibacillus para propriedades agricolamente significativas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) modificar uma célula de Brevibacillus para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, para produzir uma célula recombinante de Brevibacillus; e (b) rastrear a célula de Brevibacillus ao detectar e opcionalmente quantificar um nível ou atividade de um composto produzido pela célula recombinante de Brevibacillus.
29. Método de tratamento de uma planta, uma semente, um ser humano ou um animal, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar à planta, semente, ser humano, ou animal uma composição compreendendo um exospório isolado a partir de um endósporo produzido por uma célula recombinante de Brevibacillus; em que a célula recombinante de Brevibacillus expressa a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a composição foi inativada termicamente ou esterilizada de forma que nenhuma célula viável de Brevibacillus sobreviva.
31. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão isolada e/ou purificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
32. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um exospório isolado e/ou purificado produzido por um endósporo recombinante de Brevibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
33. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um exospório produzido por um endósporo recombinante de Brevibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o exospório produzido por um endósporo recombinante de Brevibacillus compreende: (a) uma camada basal de um exospório; (b) uma camada do tipo cabelo de um exospório; (c) uma mistura de ambos a) e b); (d) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Brevibacillus; e/ou (e) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Brevibacillus que é enriquecido em uma quantidade ou concentração da proteína de fusão comparado com a mesma quantidade do exospório bruto.
35. Método de liberação de uma proteína de interesse a uma planta, semente ou campo, caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar uma composição compreendendo um exospório obtido a partir de um endósporo recombinante de Brevibacillus a uma planta, semente ou campo; em que o endósporo recombinante de Brevibacillus foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada a um campo: (a) pré- ou pós-plantio; (b) pré- ou pós-emergência; (c) como um pó, suspensão ou solução; e/ou
(d) em que a composição ainda compreende um ou mais compostos adicionais que estimulam o crescimento das plantas ou protegem as plantas das pragas.
37. Molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma primeira sequência polinucleotídica codificando um peptídeo de sinal N-terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência polinucleotídica compreende: (i) uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 ou 40, ou com uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs. 41-177 ou mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5; ou (ii) uma sequência polinucleotídica compreendendo um fragmento de pelo menos 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 ou 135 nucleotídeos consecutivos a partir das SEQ ID NOs: 39 ou 40, ou a partir de uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs. 41-177 ou mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5; e em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de direcionar a proteína de fusão a um exospório de um endósporo de Lysinibacillus.
38. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o fragmento inclui: (a) o primeiro nucleotídeo de uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5; ou (b) o último nucleotídeo de uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou
FIGs. 4-5.
39. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com SEQ ID NOs: 39 ou 40, ou uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5.
40. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizada pelo fato de que o fragmento codifica aminoácidos 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40 ou 1-45 de SEQ ID NO: 7 ou 8 ou qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas na tabela 2 ou FIGs. 4-5.
41. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora do crescimento das plantas; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Lysinibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora das plantas.
42. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 41, caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma terceira sequência polinucleotídica, codificando: (a) um polipeptídeo compreendendo um ou mais sítios de protease clivagem de protease, em que o polipeptídeo está posicionado entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo compreendendo um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo compreendendo um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
43. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 42, caracterizada pelo fato de que o endósporo de Lysinibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Lysinibacillus, que compreende: Lysinibacillus sphaericus, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus acetophenoni, Lysinibacillus alkaliphilus, Lysinibacillus chungkukjangi, Lysinibacillus composti, Lysinibacillus contaminans, Lysinibacillus cresolivorans, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus manganicus, Lysinibacillus mangiferihumi, Lysinibacillus massiliensis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus odysseyi, Lysinibacillus pakistanensis, Lysinibacillus parviboronicapiens, Lysinibacillus sinduriensis, Lysinibacillus tabacifolii, Lysinibacillus varians, Lysinibacillus xylanilyticus ou Lysinibacillus halotolerans; ou um endósporo formado por uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie de Lysinibacillus.
44. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 43, caracterizada pelo fato de que é operacionalmente ligada a um elemento promotor que é heterólogo a pelo menos uma das segundas sequências polinucleotídicas e Lysinibacillus.
45. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 44, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência polinucleotídica compreende: uma sequência polinucleotídica códon-otimizada tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% identidade sequencial com uma sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5, que é expressada em uma maior taxa ou nível no endósporo de Lysinibacillus comparado com a sequência polinucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5, sob condições idênticas.
46. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo de sinal N-terminal operacionalmente ligado a um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5; ou (b) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 aminoácidos consecutivos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de direcionar a proteína de fusão a um exospório de um endósporo de Lysinibacillus.
47. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o fragmento inclui: (a) o primeiro aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5; ou (b) o último aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs:
41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5.
48. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que a sequência polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5.
49. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizada pelo fato de que o fragmento compreende aminoácidos 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40 ou 1-45 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5.
50. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora do crescimento das plantas; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Lysinibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora das plantas.
51. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão ainda compreende: (a) um polipeptídeo contendo um ou mais sítios de protease clivagem, posicionados entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável;
(c) um polipeptídeo compreendendo um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, conectando o peptídeo de sinal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
52. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, caracterizada pelo fato de que o endósporo de Lysinibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Lysinibacillus, compreendendo: Lysinibacillus sphaericus, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus acetophenoni, Lysinibacillus alkaliphilus, Lysinibacillus chungkukjangi, Lysinibacillus composti, Lysinibacillus contaminans, Lysinibacillus cresolivorans, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus manganicus, Lysinibacillus mangiferihumi, Lysinibacillus massiliensis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus odysseyi, Lysinibacillus pakistanensis, Lysinibacillus parviboronicapiens, Lysinibacillus sinduriensis, Lysinibacillus tabacifolii, Lysinibacillus varians, Lysinibacillus xylanilyticus, ou Lysinibacillus halotolerans; ou um endósporo formado por uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie de Lysinibacillus.
53. Célula recombinante de Lysinibacillus caracterizada pelo fato de que compreende um cromossomo bacteriano compreendendo a molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 45.
54. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 45, em que o vetor compreende um plasmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral.
55. Vetor, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um dos seguintes: (a) uma origem de replicação que provê manutenção estável em uma célula de Lysinibacillus; (b) uma origem de replicação que provê seletivamente manutenção não estável em uma célula de Lysinibacillus; (c) uma origem de replicação sensível à temperatura que provê seletivamente manutenção não estável em uma célula de Lysinibacillus; (d) um polinucleotídeo codificando um marcador de seleção, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; ou (e) um polinucleotídeo codificando uma proteína estimuladora de crescimento de plantas, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão.
56. Célula recombinante de Lysinibacillus transformada com um vetor caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 45.
57. Célula recombinante de Lysinibacillus, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a célula de Lysinibacillus é uma espécie de Lysinibacillus, compreendendo: Lysinibacillus sphaericus, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus acetophenoni, Lysinibacillus alkaliphilus, Lysinibacillus chungkukjangi, Lysinibacillus composti, Lysinibacillus contaminans, Lysinibacillus cresolivorans, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus manganicus, Lysinibacillus mangiferihumi, Lysinibacillus massiliensis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus odysseyi, Lysinibacillus pakistanensis, Lysinibacillus parviboronicapiens, Lysinibacillus sinduriensis, Lysinibacillus tabacifolii, Lysinibacillus varians, Lysinibacillus xylanilyticus, ou Lysinibacillus halotolerans; ou uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97%, 98% ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie Lysinibacillus.
58. Método de exibição de uma proteína de fusão heteróloga em um exospório de um endósporo de Lysinibacillus, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de Lysinibacillus capaz de esporulação com um vetor recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 45; e (b) expressar a proteína de fusão codificada pela molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 45, sob condições de esporulação de forma que a proteína de fusão seja direcionada ao exospório do endósporo de Lysinibacillus resultante da esporulação, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 70% ou 80% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5; ou (ii) um fragmento de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 aminoácidos consecutivos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-177 ou uma sequência de aminoácidos mostrada na tabela 2 ou FIGs. 4-5.
59. Composição caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma ou mais células recombinantes de Lysinibacillus produtoras de exospórios que expressam a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína estimuladora do crescimento da planta ou proteína imunoestimuladora; e (b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
60. Semente caracterizada pelo fato de que é tratada com o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 45, a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52, a célula bacteriana recombinante, como definida na reivindicação 56 ou 57, ou a composição, como definida na reivindicação 59.
61. Método de tratamento de uma planta, uma semente, uma parte de planta, ou o solo que circunda a planta para aumentar o crescimento da planta e/ou promover a saúde da planta caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de simultaneamente ou sequencialmente aplicar: (a) endósporos recombinantes de Lysinibacillus produtores de exospório que expressam a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a -52, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína estimuladora do crescimento da planta ou proteína imunoestimuladora; e (b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
62. Método de rastreio de uma planta hospedeira tratada com um endósporo recombinante de Lysinibacillus, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) aplicar uma composição compreendendo um endósporo de Lysinibacillus modificado para expressar uma proteína de fusão,
como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52, a uma semente, muda ou uma planta vegetativa capaz de ser permanentemente ou transitoriamente colonizada por um Lysinibacillus, para produzir uma semente tratada, muda ou planta vegetativa; e (b) rastrear a semente tratada, muda ou planta vegetativa ao detectar e opcionalmente medir um traço, componente ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a etapa de rastreio compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos um ensaio in vitro compreendendo detectar e opcionalmente quantificar a presença, nível, mudança no nível, atividade ou localização de um ou mais compostos contidos em um extrato preparado a partir de uma amostra de célula ou tecido obtida da semente tratada, muda ou planta vegetativa; e/ou (b) pelo menos um ensaio in vivo compreendendo detectar e opcionalmente quantificar um traço, componente ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
64. Método de rastreio de proteínas ou peptídeos heterólogos expressados em uma célula de Lysinibacillus para propriedades agricolamente significativas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) modificar uma célula de Lysinibacillus para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52, para produzir uma célula recombinante de Lysinibacillus; e (b) rastrear a célula de Lysinibacillus ao detectar e opcionalmente quantificar um nível ou atividade de um composto produzido pela célula recombinante de Lysinibacillus.
65. Método de tratamento de uma planta, uma semente, um ser humano ou um animal, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar à planta, semente, ser humano ou animal uma composição compreendendo um exospório isolado a partir de um endósporo produzido por uma célula recombinante de Lysinibacillus; em que a célula recombinante de Lysinibacillus expressa uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a composição foi inativada termicamente ou esterilizada de forma que nenhuma célula viável de Lysinibacillus sobreviva.
67. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão isolada e/ou purificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52.
68. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um exospório isolado e/ou purificado produzido por um endósporo recombinante de Lysinibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52.
69. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um exospório produzido por um endósporo recombinante de Lysinibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52.
70. Composição, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que o exospório produzido por um endósporo recombinante de Lysinibacillus compreende: (a) uma camada basal de um exospório; (b) uma camada do tipo cabelo de um exospório; (c) uma mistura de ambos a) e b); (d) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Lysinibacillus; e/ou (e) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Lysinibacillus que é enriquecido em uma quantidade ou concentração da proteína de fusão comparado com a mesma quantidade do exospório bruto.
71. Método de liberação de uma proteína de interesse a uma planta, semente ou campo, caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar uma composição compreendendo um exospório obtido a partir de um endósporo recombinante de Lysinibacillus a uma planta, semente ou campo; em que o endósporo recombinante de Lysinibacillus foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 52.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada a um campo: (a) pré- ou pós-plantio; (b) pré- ou pós-emergência; (c) como um pó, suspensão ou solução; e/ou (d) em que a composição ainda compreende um ou mais compostos adicionais que estimulam o crescimento das plantas ou protegem as plantas das pragas.
73. Molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma primeira sequência polinucleotídica codificando um peptídeo de sinal N-terminal, operacionalmente ligado a (b) uma segunda sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que a primeira sequência polinucleotídica compreende: (i) uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências polinucleotídicas mostradas na tabela 3 ou FIG. 6; ou (ii) uma sequência polinucleotídica compreendendo um fragmento de pelo menos 30, 60, 90, 120 ou 150 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências polinucleotídicas mostradas na tabela 3 ou FIG. 6; e em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de direcionar a proteína de fusão a um exospório de um endósporo de Viridibacillus.
74. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o fragmento incluis: (a) o primeiro nucleotídeo de qualquer uma das sequências polinucleotídicas mostradas na tabela 3 ou FIG. 6; ou (b) o último nucleotídeo de qualquer uma das sequências polinucleotídicas mostradas na tabela 3 ou FIG. 6.
75. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NOs: 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216 ou 218.
76. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 75, caracterizada pelo fato de que o fragmento codifica aminoácidos 1-10, 1-20, 1-30, 1-40 ou 1-50 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217 ou 219.
77. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 76, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora do crescimento das plantas; (b) uma enzima; (c) uma proteína;
(d) um polipeptídeo heterólogo ao Viridibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora das plantas.
78. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 77, caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma terceira sequência polinucleotídica, codificando: (a) um polipeptídeo compreendendo um ou mais sítios de protease clivagem de protease, em que o polipeptídeo é posicionado entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo compreendendo um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo compreendendo um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou (e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, que conecta o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
79. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 78, caracterizada pelo fato de que o endósporo de Viridibacillus é um endósporo formado por uma espécie de Viridibacillus, compreendendo: Viridibacillus arvi, Viridibacillus arenosi ou Viridibacillus neidei; ou um endósporo formado por uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie Viridibacillus.
80. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 79, caracterizada pelo fato de que é operacionalmente ligada a um elemento promotor que é heterólogo a pelo menos uma das segundas sequências polinucleotídicas e Viridibacillus.
81. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 80, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência polinucleotídica compreende: uma sequência polinucleotídica códon-otimizada tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências polinucleotídicas mostradas na tabela 3 ou FIG. 6, que é expressada em uma maior taxa ou nível no endósporo de Viridibacillus comparado com a sequência polinucleotídica mostrada na tabela 3 ou FIG. 6, sob condições idênticas.
82. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo de sinal N-terminal operacionalmente ligado a um polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na tabela 3 ou FIG. 6; ou (b) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos consecutivos de qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas na tabela 3 ou FIG. 6; em que o peptídeo de sinal N-terminal é capaz de direcionar a proteína de fusão a um exospório de um endósporo de Viridibacillus.
83. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de que o fragmento inclui: (a) o primeiro aminoácido de qualquer uma das sequências mostradas na tabela 3 ou FIG. 6; ou (b) o último aminoácido de qualquer uma das sequências mostradas na tabela 3 ou FIG. 6.
84. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 82 ou 83, caracterizada pelo fato de que a sequência polipeptídica compreende uma sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências mostradas na tabela 3 ou FIG. 6.
85. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 84, caracterizada pelo fato de que o fragmento compreende aminoácidos 1-10, 1-20, 1-30, 1-40 ou 1-50 de qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na tabela 3 ou FIG. 6.
86. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 85, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende: (a) uma proteína estimuladora do crescimento das plantas; (b) uma enzima; (c) uma proteína; (d) um polipeptídeo heterólogo a Viridibacillus; (e) uma proteína terapêutica; ou (f) uma proteína imunoestimuladora das plantas.
87. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 86, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão ainda compreende: (a) um polipeptídeo contendo um ou mais sítios de protease clivagem, posicionados entre o peptídeo de sinal N-terminal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal; (b) um polipeptídeo compreendendo um marcador selecionável; (c) um polipeptídeo compreendendo um marcador de visualização; (d) um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio de reconhecimento/purificação de proteína; ou
(e) um polipeptídeo compreendendo um elemento ligante flexível, conectando o peptídeo de sinal e o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal.
88. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 87, caracterizada pelo fato de que o endósporo de Viridibacillus é um endósporo formado por uma espécie Viridibacillus, compreendendo: Viridibacillus arvi, Viridibacillus arenosi, ou Viridibacillus neidei; ou um endósporo formado por uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie Viridibacillus.
89. Célula recombinante de Viridibacillus caracterizada pelo fato de que compreende um cromossomo bacteriano compreendendo uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 73 a 81.
90. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 73 a 81, em que o vetor compreende um plasmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral.
91. Vetor, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um dos seguintes: (a) uma origem de replicação que provê manutenção estável em uma célula de Viridibacillus; (b) uma origem de replicação que provê seletivamente manutenção não estável em uma célula de Viridibacillus; (c) uma origem de replicação sensível à temperatura que provê seletivamente a manutenção não estável em uma célula de Viridibacillus; (d) um polinucleotídeo codificando um marcador de seleção, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão; ou (e) um polinucleotídeo codificando uma proteína estimuladora de crescimento das plantas, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão.
92. Célula recombinante de Viridibacillus transformada com um vetor caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 73 a
81.
93. Célula recombinante de Viridibacillus, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que a célula de Viridibacillus é uma espécie Viridibacillus, compreendendo: Viridibacillus arvi, Viridibacillus arenosi, ou Viridibacillus neidei; ou uma bactéria que possui um gene 16S rRNA que compartilha pelo menos 97, 98 ou 99% de identidade com um gene 16S rRNA de uma espécie Viridibacillus.
94. Método de exibição de uma proteína de fusão heteróloga em um exospório de um endósporo de Viridibacillus, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de Viridibacillus capaz de esporulação com um vetor recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 73 a 81; e (b) expressar a proteína de fusão codificada pela molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 73 a 81, sob condições de esporulação de forma que a proteína de fusão seja direcionada ao exospório do endósporo de Viridibacillus resultante da esporulação, em que o peptídeo de sinal N-terminal compreende: (i) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 70% ou 80% de identidade sequencial com qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na tabela 3 ou FIG. 6; ou (ii) um fragmento de pelo menos 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos consecutivos de qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas na tabela 3 ou FIG. 6.
95. Composição caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma ou mais células recombinantes de Viridibacillus produtoras de exospório que expressam a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína estimuladora do crescimento de plantas ou proteína imunoestimuladora; e (b) pelo menos um agente de controle biológico; opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
96. Semente caracterizada pelo fato de que é tratada com o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 73 a 81, proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88, a célula bacteriana recombinante, como definida na reivindicação 92 ou 93, ou a composição, como definida na reivindicação 95.
97. Método de tratamento de uma planta, uma semente, uma parte de planta, ou o solo que circunda a planta para aumentar o crescimento da planta e/ou promover a saúde da planta caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de simultaneamente ou sequencialmente aplicar: (a) endósporos recombinantes de Viridibacillus produtores de exospório que expressam a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88, em que o polipeptídeo heterólogo ao peptídeo de sinal N-terminal compreende uma proteína estimuladora do crescimento de plantas ou proteína imunoestimuladora; e (b) pelo menos um agente de controle biológico;
opcionalmente, em uma quantidade sinergicamente eficaz.
98. Método de rastreio de uma planta hospedeira tratada com um endósporo recombinante de Viridibacillus, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) aplicar uma composição compreendendo um endósporo de Viridibacillus modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88, a uma semente, muda ou uma planta vegetativa capaz de ser permanentemente ou transitoriamente colonizada por um Viridibacillus, para produzir uma semente tratada, muda ou planta vegetativa; e (b) rastrear a semente tratada, muda ou planta vegetativa ao detectar e opcionalmente medir um traço, componente, ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que a etapa de rastreio compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos um ensaio in vitro compreendendo detectar e opcionalmente quantificar a presença, nível, mudança no nível, atividade ou localização de um ou mais compostos contidos em um extrato preparado a partir de uma amostra de célula ou tecido obtida a partir da semente tratada, muda ou planta vegetativa; e/ou (b) pelo menos um ensaio in vivo compreendendo detectar e opcionalmente quantificar um traço, componente ou atributo da semente tratada, muda ou planta vegetativa.
100. Método de rastreio de proteínas ou peptídeos heterólogos expressados em uma célula de Viridibacillus para propriedades agricolamente significativas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) modificar uma célula de Viridibacillus para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, para produzir uma célula recombinante de Viridibacillus; e (b) rastrear a célula de Viridibacillus ao detectar e opcionalmente quantificar um nível ou atividade de um composto produzido pela célula recombinante de Viridibacillus.
101. Método de tratamento de uma planta, uma semente, um ser humano ou um animal, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar à planta, semente, ser humano ou animal uma composição compreendendo um exospório isolado a partir de um endósporo produzido por uma célula recombinante de Viridibacillus; em que a célula recombinante de Viridibacillus expressa a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que a composição foi inativada termicamente ou esterilizada de forma que nenhuma célula viável de Viridibacillus sobreviva.
103. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão isolada e/ou purificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88.
104. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um exospório isolado e/ou purificado produzido por um endósporo recombinante de Viridibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88.
105. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um exospório produzido por um endósporo recombinante de Viridibacillus, que foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88.
106. Composição, de acordo com a reivindicação 105,
caracterizada pelo fato de que o exospório produzido por um endósporo recombinante de Viridibacillus compreende: (a) uma camada basal de um exospório; (b) uma camada do tipo cabelo de um exospório; (c) uma mistura de ambos a) e b); (d) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Viridibacillus; e/ou (e) uma fração ou extrato de um exospório bruto obtido a partir de um endósporo de Viridibacillus que é enriquecido em uma quantidade ou concentração da proteína de fusão comparado com a mesma quantidade do exospório bruto.
107. Método de liberação de uma proteína de interesse a uma planta, semente ou campo, caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar uma composição compreendendo um exospório obtido a partir de um endósporo recombinante de Viridibacillus a uma planta, semente ou campo; em que o endósporo recombinante de Viridibacillus foi modificado para expressar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 88.
108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada a um campo: (a) pré- ou pós-plantio; (b) pré- ou pós-emergência; (c) como um pó, suspensão ou solução; e/ou (d) em que a composição ainda compreende um ou mais compostos adicionais que estimulam o crescimento das plantas ou protegem as plantas das pragas.
BR112021008927-6A 2018-11-15 2019-11-15 plataformas de exibição de endósporo, produtos e métodos BR112021008927A2 (pt)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862768063P 2018-11-15 2018-11-15
US201862767997P 2018-11-15 2018-11-15
US201862768077P 2018-11-15 2018-11-15
US62/768,063 2018-11-15
US62/768,077 2018-11-15
US62/767,997 2018-11-15
PCT/US2019/061648 WO2020102642A2 (en) 2018-11-15 2019-11-15 Endospore display platforms, products and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021008927A2 true BR112021008927A2 (pt) 2021-08-17

Family

ID=68982426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021008927-6A BR112021008927A2 (pt) 2018-11-15 2019-11-15 plataformas de exibição de endósporo, produtos e métodos

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220002736A1 (pt)
EP (1) EP3879982A2 (pt)
JP (1) JP2022507370A (pt)
KR (1) KR20210091261A (pt)
CN (1) CN113507835A (pt)
AU (1) AU2019381797A1 (pt)
BR (1) BR112021008927A2 (pt)
CA (1) CA3119778A1 (pt)
CL (1) CL2021001251A1 (pt)
MX (1) MX2021005759A (pt)
UY (1) UY38475A (pt)
WO (1) WO2020102642A2 (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029685B (zh) * 2020-09-02 2022-03-25 浙江工业大学 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其在混凝土裂缝修复中的应用
AU2022275552A1 (en) * 2021-05-21 2023-11-30 Ginkgo Bioworks, Inc. Intergeneric endospore display platforms, products and methods
CN116676212B (zh) * 2023-04-27 2024-01-26 四川农业大学 一株Brevibacillus aydinogluensis PMBT001及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4272417A (en) 1979-05-22 1981-06-09 Cargill, Incorporated Stable protective seed coating
US4245432A (en) 1979-07-25 1981-01-20 Eastman Kodak Company Seed coatings
US4808430A (en) 1987-02-27 1989-02-28 Yazaki Corporation Method of applying gel coating to plant seeds
US5876739A (en) 1996-06-13 1999-03-02 Novartis Ag Insecticidal seed coating
US6503904B2 (en) 1998-11-16 2003-01-07 Syngenta Crop Protection, Inc. Pesticidal composition for seed treatment
US6660690B2 (en) 2000-10-06 2003-12-09 Monsanto Technology, L.L.C. Seed treatment with combinations of insecticides
KR20020045400A (ko) * 2000-12-08 2002-06-19 반재구 포자 표면발현 방법
US20020134012A1 (en) 2001-03-21 2002-09-26 Monsanto Technology, L.L.C. Method of controlling the release of agricultural active ingredients from treated plant seeds
US9133251B2 (en) 2008-02-22 2015-09-15 The Curators Of The University Of Missouri Bacillus based delivery system and methods of use
EP2854535A1 (en) * 2012-05-30 2015-04-08 Bayer Cropscience AG Compositions comprising a biological control agent and an insecticide
JP6242877B2 (ja) * 2012-05-30 2017-12-06 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 生物的防除剤及び殺虫剤を含んでいる組成物
US9573980B2 (en) * 2013-03-15 2017-02-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots
CA2935218C (en) * 2013-12-24 2021-01-26 Indigo Ag, Inc. Plants containing beneficial endophytes
RU2017113002A (ru) * 2014-09-17 2018-10-17 Байер Кропсайенс Лп Композиции, содержащие рекомбинантные клетки bacillus и фунгицид
EP3430125A4 (en) * 2016-03-16 2020-03-25 Spogen Biotech Inc. FUSION PROTEINS, RECOMBINANT BACTERIA AND EXOSPORIUM FRAGMENTS FOR USE IN ANIMAL HEALTH AND AQUACULTURE

Also Published As

Publication number Publication date
EP3879982A2 (en) 2021-09-22
UY38475A (es) 2020-06-30
US20220002736A1 (en) 2022-01-06
CA3119778A1 (en) 2020-05-22
WO2020102642A8 (en) 2021-02-25
CL2021001251A1 (es) 2021-11-19
AU2019381797A1 (en) 2021-06-10
CN113507835A (zh) 2021-10-15
WO2020102642A2 (en) 2020-05-22
MX2021005759A (es) 2021-08-11
JP2022507370A (ja) 2022-01-18
WO2020102642A3 (en) 2020-07-30
KR20210091261A (ko) 2021-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11702665B2 (en) Paenibacillus-based endospore display platform, products and methods
WO2016044655A2 (en) Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria
US20220235315A1 (en) Targeting sequences for paenibacillus-based endospore display platform
US20220002736A1 (en) Endospore display platforms, products and methods
AU2022275552A1 (en) Intergeneric endospore display platforms, products and methods

Legal Events

Date Code Title Description
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: GINKGO BIOWORKS, INC. (US)

B154 Notification of filing of divisional application [chapter 15.50 patent gazette]

Free format text: O PEDIDO FOI DIVIDIDO NO BR122023013510-5 PROTOCOLO 870230058656 EM 05/07/2023 16:01.