KR20200083590A - 파에니바실루스 기반 내생포자 디스플레이 플랫폼, 산물 및 방법 - Google Patents

파에니바실루스 기반 내생포자 디스플레이 플랫폼, 산물 및 방법 Download PDF

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대미안 커티스
벤자민 엘. 골롬
딜라라 앨리
플로렌시아 에이. 피카라
라우프 살람자데
비욘 에이. 트래그
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바이엘 크롭사이언스 엘피
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Abstract

단백질 및 펩티드를 파에니바실루스 과 구성원에 의해 생산된 내생포자의 표면에 표적화하는 데 유용한 신호 서열 및 이를 사용하는 방법이 제공된다. 특정한 N-말단 표적화 서열 및 그의 유도체를 사용하여, 파에니바실루스 과 구성원의 포자 표면 상에서의 이종 분자, 예컨대 펩티드, 폴리펩티드 및 다른 재조합 구축물의 디스플레이가 또한 제공된다.

Description

파에니바실루스 기반 내생포자 디스플레이 플랫폼, 산물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 11월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/587,371을 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 사본은 EFS-Web을 통해 2018년 11월 13일에 생성된 "BCS179003WO_ST25.txt"라는 파일명과 80 킬로바이트 크기를 갖는 ASCII 포맷의 서열 목록으로서 전자적으로 제출되고, 본 명세서와 공동으로 출원된다. 이러한 ASCII 포맷의 문서에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로, 내생포자 디스플레이 플랫폼, 관련 디스플레이 방법, 포자 표면 표적화 서열 및 이를 포함하는 융합 단백질 구축물, 재조합 내생포자 조성물, 및 다양한 적용, 예컨대 식물, 종자 또는 필드에 관심 이종 분자를 전달하는 데 유용한 파에니바실루스(Paenibacillus) 및 다른 박테리아 속에서 포자 표면 표적화 서열을 확인하는 방법에 관한 것이다.
현대 농업 기술은 작물의 수확량과 품질을 개선시키기 위해 식물의 건강과 성장을 촉진시키거나 또는 증강시키는 조성물에 크게 의존한다. 이러한 조성물은 일반적으로 유기 또는 무기 비료, 영양소 및 적절한 식물 성장 및 발달을 촉진하는 다른 화학 화합물을 포함한다. 그러나, 이들 조성물 중 다수를 장기간 또는 과다하게 사용하면 부정적인 부작용, 예컨대 토양 산성화 또는 토양 내의 영양소 균형의 불안정화가 초래될 수 있는 것으로 널리 확립되어 있다. 더욱이, 과다 사용은 인간이 소비하기 위해 재배한 작물에서 유해한 최종 산물이 강화될 수 있다.
현대 농장은 또한 전형적으로, 해충을 방제하고 상업적으로 재배된 작물의 높은 수확량을 보장하기 위해 광범위한 화학 물질 (예를 들어, 살곤충제, 제초제, 살균제, 살선충제, 및 살진균제)의 사용에 의존한다. 이러한 화학 화합물 중 다수는 광범위한 활성을 나타내며 고 농도에서 인간 및 동물에게 잠재적으로 해로울 수 있다. 또한 일부 화학 화합물은 표적을 벗어난 효과를 나타낸다. 더욱이, 이들 합성 화합물 중 적어도 일부는 생분해되지 않는다. 최근 수년 간, 합성 살곤충제 또는 살진균제에 대한 노출을 감소시키거나 또는 노출시키지 않고서 재배되고 수확된 농산물에 대한 소비자의 압력이 증가하고 있다. 합성 살곤충제 또는 살진균제의 사용으로 발생하는 추가 문제는 반복되고/되거나 독점적인 사용이 종종 내성 해충의 선택으로 이어진다는 점이다. 정상적으로, 내성 해충은 또한 동일한 작용 방식을 갖는 다른 활성 성분에 대항한 교차 내성을 갖는다. 결과적으로, 해충 방제 조성물 및 화합물은 개발하기 어렵고 비용이 많이 든다 (예를 들어, 안전성 문제 및 빠른 내성 발생에 기인함).
유전 공학 방법은 합성 화학 물질에 의존하지 않고서도 식물 성장 및/또는 건강을 증진시키는 데 사용된다. 예를 들어, 작물은 식물 성장 및/또는 건강과 관련된 유전자를 도입 또는 변형시키고/시키거나 자연 또는 합성 해충 방제제를 코딩하는 유전자를 도입하도록 변형될 수 있다. 트랜스진은 바이러스 벡터를 사용하여 표적 식물 내로 도입될 수 있다. 최근 수년 간, 재조합 단백질을 식물에 전달하기 위해 박테리아를 사용하는 경우에 일부 성공된 것으로 보고되었다. 그러나, 현재까지, 그러한 성공은 대부분 바실라세아에(Bacillaceae) 과의 구성원, 보다 구체적으로 가장 널리 특징 규명된 그램 양성 박테리아이며 포자형성 연구의 주요 박테리아 모델인 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 한정된다. 전달 및 발현 플랫폼으로서의 비. 서브틸리스(B. subtilis)에 주목하는 것은, 단백질 합성 및 분비와 관련된 비. 서브틸리스 게놈 및 생물학적 경로가 널리 이해되고 있다는 사실에 추가로 기인한다. 그러나, 박테리아 간의 유전적 다양성이 높기 때문에, 비. 서브틸리스 연구에 근거한 결과는 종종 바실라세아에 과 내부 및 외부 구성원에게 직접 번역될 수가 없다.
따라서, 이종 유전 물질을 전달하는 특정 방법이 공지되어 있지만, 이러한 유전 물질에 대한 새로운 전달 및 발현 플랫폼을 개발하기 위한 기술이 필요하다.
본 개시내용은, 예를 들어, 특히 파에니바실루스 속의 포자형성 구성원을 사용하여 재조합 효소 및 다른 관심 분자 (예를 들어, 펩티드, 단백질)를 환경 (예를 들어, 식물, 필드)에 전달하기 위한 새로운 플랫폼을 제공함으로써 상기 확인된 요구를 해결하는 방법, 조성물 및 유전적 구축물을 설명한다. 본 개시내용은 또한 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속 내의 포자 표면 표적화 서열을 확인하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 식물 형질 또는 속성을 부여하거나 변형시키는 적어도 하나의 이종 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 관여하는 효소; 박테리아, 진균 또는 식물 영양원을 분해 또는 변형시키는 효소; 살균 또는 미생물 증식 억제 화합물; 또는 병원체 또는 해충으로부터 식물을 보호하는 효소, 단백질 또는 펩티드); 및 (ii) 융합 단백질을 파에니바실루스 세포의 포자 표면에 국재화시키는 N-말단 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 제공한다. 이러한 일반적인 조성물은 부가 성분 (예를 들어, 식물 성장 및/또는 건강을 증진시키는 성분)을 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 본원에 개시된 방법의 특정한 실시양태는 식물 형질 또는 속성을 부여하거나 달리 변형시키는 이종 단백질 및 펩티드의 효율적인 고 처리량 스크리닝을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1, 3, 5, 7 또는 9와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (iii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 상기 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 한다.
또 다른 대안적 측면에서, 본 개시내용은 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 (ii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 상기 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 한다.
일부 측면에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는: (a) 식물 성장 또는 면역 자극 단백질 중 적어도 하나; (b) 효소; (c) 단백질; (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; 또는 (e) 치료 단백질을 포함한다. 선택된 측면에서, 핵산 분자는 (a) 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드 - 폴리펩티드는 N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치함; (b) 선택가능한 마커를 포함하는 폴리펩티드; (c) 시각화 마커를 포함하는 폴리펩티드; (d) 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 하기를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다: 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에(Paenibacillus terrae), 파에니바실루스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 또는 파에니바실루스 페오리아에(Paenibacillus peoriae).
다른 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 하기를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다: 파에니바실루스 아비시(Paenibacillus abyssi), 파에니바실루스 아세티(Paenibacillus aceti), 파에니바실루스 아에스투아리이(Paenibacillus aestuarii), 파에니바실루스 아가렉세덴스(Paenibacillus agarexedens), 파에니바실루스 아가리데보란스(Paenibacillus agaridevorans), 파에니바실루스 알기노리티쿠스(Paenibacillus alginolyticus), 파에니바실루스 알고리폰티콜라(Paenibacillus algorifonticola), 파에니바실루스 알칼리테라에(Paenibacillus alkaliterrae), 파에니바실루스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실루스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실루스 아나에리카누스(Paenibacillus anaericanus), 파에니바실루스 안타르크티쿠스(Paenibacillus antarcticus), 파에니바실루스 아피아리우스(Paenibacillus apiarius), 파에니바실루스 아라키디스(Paenibacillus arachidis), 파에니바실루스 아사멘시스(Paenibacillus assamensis), 파에니바실루스 아조레두센스(Paenibacillus azoreducens), 파에니바실루스 아조토픽산스(Paenibacillus azotofixans), 파에니바실루스 바에크로크다미솔리(Paenibacillus baekrokdamisoli), 파에니바실루스 바르시노넨시스(Paenibacillus barcinonensis), 파에니바실루스 바렌골트지이(Paenibacillus barengoltzii), 파에니바실루스 보레알리스(Paenibacillus borealis), 파에니바실루스 보비스(Paenibacillus bovis), 파에니바실루스 브라실렌시스(Paenibacillus brasilensis), 파에니바실루스 카멜리아에(Paenibacillus camelliae), 파에니바실루스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실루스 카스타네아에(Paenibacillus castaneae), 파에니바실루스 카탈파에(Paenibacillus catalpae), 파에니바실루스 카토르미이(Paenibacillus cathormii), 파에니바실루스 카베르나에(Paenibacillus cavernae), 파에니바실루스 셀룰로시리티쿠스(Paenibacillus cellulosilyticus), 파에니바실루스 셀룰로시트로피쿠스(Paenibacillus cellulositrophicus), 파에니바실루스 카르타리우스(Paenibacillus chartarius), 파에니바실루스 치벤시스(Paenibacillus chibensis), 파에니바실루스 친주엔시스(Paenibacillus chinjuensis), 파에니바실루스 치티노리티쿠스(Paenibacillus chitinolyticus), 파에니바실루스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실루스 청강엔시스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실루스 시네리스(Paenibacillus cineris), 파에니바실루스 시솔로켄시스(Paenibacillus cisolokensis), 파에니바실루스 콘타미난스(Paenibacillus contaminans), 파에니바실루스 쿠키이(Paenibacillus cookii), 파에니바실루스 쿠쿠미스(Paenibacillus cucumis), 파에니바실루스 쿠르드라노리티쿠스(Paenibacillus curdlanolyticus), 파에니바실루스 다에제오넨시스(Paenibacillus daejeonensis), 파에니바실루스 다르위니아누스(Paenibacillus darwinianus), 파에니바실루스 다우시(Paenibacillus dauci), 파에니바실루스 덴드리티포르미스(Paenibacillus dendritiformis), 파에니바실루스 동도넨시스(Paenibacillus dongdonensis), 파에니바실루스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실루스 두루스(Paenibacillus durus), 파에니바실루스 에다피쿠스(Paenibacillus edaphicus), 파에니바실루스 에히멘시스(Paenibacillus ehimensis), 파에니바실루스 엘기이(Paenibacillus elgii), 파에니바실루스 엔도피티쿠스(Paenibacillus endophyticus), 파에니바실루스 에테리(Paenibacillus etheri), 파에니바실루스 파에시스(Paenibacillus faecis), 파에니바실루스 파비스포루스(Paenibacillus favisporus), 파에니바실루스 페라리우스(Paenibacillus ferrarius), 파에니바실루스 필리시스(Paenibacillus filicis), 파에니바실루스 폰티콜라(Paenibacillus fonticola), 파에니바실루스 포르시티아에(Paenibacillus forsythiae), 파에니바실루스 프리고리레시스텐스(Paenibacillus frigoriresistens), 파에니바실루스 간수엔시스(Paenibacillus gansuensis), 파에니바실루스 겔라티니리티쿠스(Paenibacillus gelatinilyticus), 파에니바실루스 진센가르비(Paenibacillus ginsengarvi), 파에니바실루스 진센기후미(Paenibacillus ginsengihumi), 파에니바실루스 진센기솔리(Paenibacillus ginsengisoli), 파에니바실루스 글라시알리스(Paenibacillus glacialis), 파에니바실루스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실루스 글리카니리티쿠스(Paenibacillus glycanilyticus), 파에니바실루스 고르도나에(Paenibacillus gordonae), 파에니바실루스 그라미니스(Paenibacillus graminis), 파에니바실루스 그라니보란스(Paenibacillus granivorans), 파에니바실루스 구앙즈호우엔시스(Paenibacillus guangzhouensis), 또는 파에니바실루스 하레나에(Paenibacillus harenae).
일부 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 하기를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다: 파에니바실루스 헤메로칼리콜라(Paenibacillus hemerocallicola), 파에니바실루스 히스파니쿠스(Paenibacillus hispanicus), 파에니바실루스 호도가엔시스(Paenibacillus hodogayensis), 파에니바실루스 호르데이(Paenibacillus hordei), 파에니바실루스 후미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실루스 후나넨시스(Paenibacillus hunanensis), 파에니바실루스 일리노이센시스(Paenibacillus illinoisensis), 파에니바실루스 자밀라에(Paenibacillus jamilae), 파에니바실루스 질룬리이(Paenibacillus jilunlii), 파에니바실루스 코벤시스(Paenibacillus kobensis), 파에니바실루스 콜레오보란스(Paenibacillus koleovorans), 파에니바실루스 콘시덴시스(Paenibacillus konsidensis), 파에니바실루스 코레엔시스(Paenibacillus koreensis), 파에니바실루스 크립벤시스(Paenibacillus kribbensis), 파에니바실루스 경헤엔시스(Paenibacillus kyungheensis), 파에니바실루스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실루스 라르바에(Paenibacillus larvae), 파에니바실루스 라르바에, 파에니바실루스 라르바에, 파에니바실루스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실루스 렘나에(Paenibacillus lemnae), 파에니바실루스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실루스 렌투스(Paenibacillus lentus), 파에니바실루스 리아오닝엔시스(Paenibacillus liaoningensis), 파에니바실루스 루피니(Paenibacillus lupini), 파에니바실루스 마세란스(Paenibacillus macerans), 파에니바실루스 막쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실루스 막쿠아리엔시스, 파에니바실루스 막쿠아리엔시스, 파에니바실루스 마르칸티오피토룸(Paenibacillus marchantiophytorum), 파에니바실루스 마리니세디미니스(Paenibacillus marinisediminis), 파에니바실루스 마실리엔시스(Paenibacillus massiliensis), 파에니바실루스 메디카기니스(Paenibacillus medicaginis), 파에니바실루스 멘델리이(Paenibacillus mendelii), 파에니바실루스 메탄올리쿠스(Paenibacillus methanolicus), 파에니바실루스 몬타니테라에(Paenibacillus montaniterrae), 파에니바실루스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실루스 무실라기노수스(Paenibacillus mucilaginosus), 파에니바실루스 나넨시스(Paenibacillus nanensis), 파에니바실루스 나프탈레노보란스(Paenibacillus naphthalenovorans), 파에니바실루스 나수티테르미티스(Paenibacillus nasutitermitis), 파에니바실루스 네마토필루스(Paenibacillus nematophilus), 파에니바실루스 니코티아나에(Paenibacillus nicotianae), 파에니바실루스 오세아니세디미니스(Paenibacillus oceanisediminis), 파에니바실루스 오도리페르(Paenibacillus odorifer), 파에니바실루스 오에노테라에(Paenibacillus oenotherae), 파에니바실루스 오리자에(Paenibacillus oryzae), 파에니바실루스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실루스 파나시솔리(Paenibacillus panacisoli), 파에니바실루스 파나시테라에(Paenibacillus panaciterrae), 파에니바실루스 파사데넨시스(Paenibacillus pasadenensis), 파에니바실루스 펙티니리티쿠스(Paenibacillus pectinilyticus), 파에니바실루스 페리안드라에(Paenibacillus periandrae), 또는 파에니바실루스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis).
일부 측면에서, 파에니바실루스 내생포자는 하기를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자이다: 파에니바실루스 필로스파에라에(Paenibacillus phyllosphaerae), 파에니바실루스 피스코미트렐라에(Paenibacillus physcomitrellae), 파에니바실루스 피니(Paenibacillus pini), 파에니바실루스 피니후미(Paenibacillus pinihumi), 파에니바실루스 피네솔리(Paenibacillus pinesoli), 파에니바실루스 포케오넨시스(Paenibacillus pocheonensis ), 파에니바실루스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실루스 포풀리(Paenibacillus populi), 파에니바실루스 프로소피디스(Paenibacillus prosopidis), 파에니바실루스 프로벤센시스(Paenibacillus provencensis), 파에니바실루스 푸에리(Paenibacillus pueri), 파에니바실루스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실루스 풀비파시엔스(Paenibacillus pulvifaciens), 파에니바실루스 푸리스파티이(Paenibacillus purispatii), 파에니바실루스 킹스헨기이(Paenibacillus qingshengii), 파에니바실루스 퀘르쿠스(Paenibacillus quercus), 파에니바실루스 라디시스(Paenibacillus radicis), 파에니바실루스 렐릭티세사미(Paenibacillus relictisesami), 파에니바실루스 레시두이(Paenibacillus residui), 파에니바실루스 리조리자에(Paenibacillus rhizoryzae), 파에니바실루스 리조스파에라에(Paenibacillus rhizosphaerae), 파에니바실루스 리구이(Paenibacillus rigui), 파에니바실루스 리오그란덴시스(Paenibacillus riograndensis), 파에니바실루스 리파에(Paenibacillus ripae), 파에니바실루스 사비나에(Paenibacillus sabinae), 파에니바실루스 사케오넨시스(Paenibacillus sacheonensis), 파에니바실루스 살리니카에니(Paenibacillus salinicaeni), 파에니바실루스 산구이니스(Paenibacillus sanguinis), 파에니바실루스 세디미니스(Paenibacillus sediminis), 파에니바실루스 세게티스(Paenibacillus segetis), 파에니바실루스 셀레니이(Paenibacillus selenii), 파에니바실루스 셀레니티레두센스(Paenibacillus selenitireducens), 파에니바실루스 세네갈렌시스(Paenibacillus senegalensis), 파에니바실루스 셉텐트리오날리스(Paenibacillus septentrionalis), 파에니바실루스 세풀크리(Paenibacillus sepulcri), 파에니바실루스 세니앙엔시스(Paenibacillus shenyangensis), 파에니바실루스 시라카미엔시스(Paenibacillus shirakamiensis), 파에니바실루스 시아멘시스(Paenibacillus siamensis), 파에니바실루스 실라게이(Paenibacillus silagei), 파에니바실루스 시노포도필리(Paenibacillus sinopodophylli), 파에니바실루스 솔라니(Paenibacillus solani), 파에니바실루스 솔리(Paenibacillus soli), 파에니바실루스 손키(Paenibacillus sonchi), 파에니바실루스 소포라에(Paenibacillus sophorae), 파에니바실루스 스푸티(Paenibacillus sputi), 파에니바실루스 스텔리페르(Paenibacillus stellifer), 파에니바실루스 수송엔시스(Paenibacillus susongensis), 파에니바실루스 스웬시스(Paenibacillus swuensis), 파에니바실루스 타이쿤겐시스(Paenibacillus taichungensis), 파에니바실루스 타이와넨시스(Paenibacillus taiwanensis), 파에니바실루스 타리멘시스(Paenibacillus tarimensis), 파에니바실루스 텔루리스(Paenibacillus telluris), 파에니바실루스 테레우스(Paenibacillus terreus), 파에니바실루스 테리게나(Paenibacillus terrigena), 파에니바실루스 타일란덴시스(Paenibacillus thailandensis), 파에니바실루스 써모필루스(Paenibacillus thermophilus), 파에니바실루스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실루스 티안무엔시스(Paenibacillus tianmuensis), 파에니바실루스 티베텐시스(Paenibacillus tibetensis), 파에니바실루스 티모넨시스(Paenibacillus timonensis), 파에니바실루스 툰드라에(Paenibacillus tundrae), 파에니바실루스 투리센시스(Paenibacillus turicensis), 파에니바실루스 티파에(Paenibacillus typhae), 파에니바실루스 울리기니스(Paenibacillus uliginis), 파에니바실루스 우리날리스(Paenibacillus urinalis), 파에니바실루스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실루스 비니(Paenibacillus vini), 파에니바실루스 불네리스(Paenibacillus vulneris), 파에니바실루스 웬시니아에(Paenibacillus wenxiniae), 파에니바실루스 우포넨시스(Paenibacillus wooponensis), 파에니바실루스 우송엔시스(Paenibacillus woosongensis), 파에니바실루스 울루무퀴엔시스(Paenibacillus wulumuqiensis), 파에니바실루스 윈니이(Paenibacillus wynnii), 파에니바실루스 크산티니리티쿠스(Paenibacillus xanthinilyticus), 파에니바실루스 신장엔시스(Paenibacillus xinjiangensis), 파에니바실루스 크실라넥세덴스(Paenibacillus xylanexedens), 파에니바실루스 크실라니리티쿠스(Paenibacillus xylanilyticus), 파에니바실루스 크실라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 파에니바실루스 용기넨시스(Paenibacillus yonginensis), 파에니바실루스 윤나넨시스(Paenibacillus yunnanensis), 파에니바실루스 잔톡실리(Paenibacillus zanthoxyli), 또는 파에니바실루스 제아에(Paenibacillus zeae).
일부 측면에서, 핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 파에니바실루스 중 적어도 하나에 대해 이종인 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된다.
일부 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은: (a) 동일한 조건 하에, 각각의 원래의 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9와 비교해서 파에니바실루스 내생포자에서 더 높은 비율 또는 수준으로 발현되는, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 코돈 최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는: (a) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 또는 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (b) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고; 상기 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 한다.
일부 측면에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는: (a) 식물 성장 또는 면역 자극 단백질 중 적어도 하나; (b) 효소; (c) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; (d) 치료 단백질 (예를 들어, 항생제 또는 항염증 단백질); 또는 (e) 살곤충/곤충 증식 억제 활성, 살균/박테리아 증식 억제 활성, 살진균/진균 증식 억제 활성, 식물 성장, 건강 또는 면역 자극 활성, 및/또는 개선된 비생물적 환경 저항을 포함하나 이에 제한되지는 않는 농업적으로 유의한 특성을 제공하는 단백질을 포함한다. 다른 농업적으로 유의한 특성은 출현, 작물 수확량, 단백질 함량, 오일 함량, 전분 함량, 보다 발달된 뿌리 시스템, 개선된 뿌리 성장, 개선된 뿌리 크기 유지, 개선된 뿌리 유효성, 개선된 스트레스 내성 (예를 들어, 가뭄, 열, 염분, UV, 물, 추위에 대항함), 감소된 에틸렌 (감소된 생산 및/또는 수용 억제), 경작 증가, 식물 높이 상의 증가, 더 큰 잎편, 덜 죽은 근출엽, 더 강한 곁눈, 더 푸르른 잎 색깔, 색소 함량, 광합성 활성, 더 적은 투입 필요 (예컨대 비료 또는 물), 더 적은 종자 필요, 더 생산적인 곁눈, 조기 개화, 조기 곡물 성숙, 더 적은 식물 구절 (로징), 증가된 어린가지 성장, 증강된 식물 활력, 증가된 식물 기립 및 조기 및 더 나은 발아를 포함한 개선된 작물 특징을 포함한다.
일부 측면에서, 융합 단백질은: (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치한, 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 함유하는 폴리펩티드; (b) 선택가능한 마커 (예를 들어, 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질)를 포함하는 폴리펩티드; (c) 시각화 요소 (예를 들어, 형광 태그 예컨대 GFP)를 포함하는 폴리펩티드; (d) 적어도 하나의 단백질 인식/정제 도메인 (예를 들어, His-태그)을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 전술한 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 염색체를 포함하는 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 전술한 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서 벡터는 플라스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 측면에서, 벡터는 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함한다: (a) 파에니바실루스 세포에서 안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (b) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 불안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (c) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 불안정한 유지를 제공하는 온도 감수성 복제 기점; (d) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (e) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 식물 성장 자극 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종이다. 다른 예시적인 측면에서, 파에니바실루스 세포는 본원에 기재된 예시적인 파에니바실루스 종 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에 이종 융합 단백질을 디스플레이하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은: a) 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 포자형성할 수 있는 파에니바실루스 세포를 형질전환시키는 단계; 및 b) 포자형성 조건 하에서 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 코딩된 융합 단백질을 발현시켜, 융합 단백질이 포자형성으로부터 생성된 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 하도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는: (i) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (ii) 서열식별번호: 2로부터의 적어도 5, 10, 15 또는 20개의 연속 아미노산의 단편을 포함한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 a) 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 융합 단백질을 발현하는 하나 이상의 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 - N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함함; 및 b) 적어도 하나의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 측면 중 어느 하나의 핵산, 융합 단백질, 박테리아 세포 또는 조성물 중 적어도 하나로 처리된 종자를 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 a) 본원에 개시된 측면 중 임의의 것의 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 내생포자 - N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함함; 및 b) 적어도 하나의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 성장을 증강시키고/시키거나 식물 건강을 증진시키기 위해 식물, 종자, 식물 부분 또는 식물 주위의 토양을 처리하는 방법을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계: a) 본원에 개시된 측면 중 임의의 것에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을, 파에니바실루스에 의해 영구적으로 또는 일시적으로 콜로니화될 수 있는 종자, 묘목, 또는 생장 식물에 적용하여, 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물을 생산하는 단계; b) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물의 형질, 성분, 또는 속성을 검출하고 임의로 측정함으로써 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리된 숙주 식물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 스크리닝 단계는 하기 중 하나 이상을 포함한다: a) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플로부터 제조된 추출물에 함유된 하나 이상의 화합물의 존재, 수준, 수준 상의 변화, 활성 또는 국재화를 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 하나의 시험관내 검정; 및/또는 b) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물의 형질, 성분, 또는 속성을 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 하나의 생체내 검정.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 a) 본원에 개시된 측면에 따른 융합 단백질을 발현하도록 파에니바실루스 세포를 변형시켜 재조합 파에니바실루스 세포를 생산하는 단계; 및 b) 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 화합물의 수준 또는 활성을 검출하고 임의로 정량화함으로써 파에니바실루스 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 파에니바실루스 세포에서 발현된 이종 단백질 또는 펩티드를 농업적으로 유의한 특성에 대하여 스크리닝하는 방법을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 "Gly-X-X" ("GXX 반복부" 여기서 "X"는 임의의 아미노산을 나타냄)의 다수의 콜라겐-유사 삼중자 반복부를 갖는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 대하여 파에니바실루스 또는 또 다른 관심 내생포자 형성 박테리아의 게놈을 스크리닝하는 단계; 및 단백질이 포자 표면에 국재화되는지를 현미경검사에 의해 또는 실험적으로 결정하는 단계를 포함하는, 내생포자 디스플레이에 적합한 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속 내의 포자 표면 표적화 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 단백질 국재화는 투과 전자 현미경검사 또는 질량 분광측정법을 사용하여 결정된다. 다른 측면에서, 포자 표면에 국재화되는 단백질로부터의 추정 N-말단 표적화 서열이 리포터 유전자와 융합되고, 그 결과로 생긴 융합 단백질이 내생포자 형성 박테리아에서 발현된다. 또한 다른 측면에서, 이로써 생성된 융합 단백질은 이러한 내생포자 형성 박테리아의 표면 상에서의 발현에 대하여 분석된다. 또 다른 측면에서, 이러한 발현이 검출되는 경우에는, 리포터 유전자를 관심 뉴클레오티드 서열로 대체시키고, 그러한 제2 융합 단백질이 내생포자 형성 박테리아에서 발현된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 전술한 방법을 통해 확인된 단백질의 N-말단 표적화 서열을 포함하는 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속으로부터의 포자 표면 표적화 서열을 제공한다. 이러한 N-말단 표적화 서열은 단백질의 첫 번째 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120개 아미노산, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열은 내인성 N-말단 표적화 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 변이체이다. 이들 방법을 사용하여 확인된 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속 내의 포자 표면 표적화 서열은 본원에 기재된 다양한 실시양태 중 임의의 것에 따른 이종 융합 단백질을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
선택된 측면에서, 생존 파에니바실루스 세포가 남아 있지 않도록 조성물을 열-불활성화 또는 멸균시켰다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 측면 중 어느 하나에 따른 단리된 및/또는 정제된 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 개시내용은 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자 또는 필드에 적용하는 단계로, 여기서 재조합 파에니바실루스 내생포자를, 본원에 개시된 측면 중 임의의 것에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형시킨 것을 포함하는, 관심 단백질을 식물, 종자 또는 필드에 전달하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 조성물은: a) 심기 전 또는 후에; b) 출현 전 또는 후에; c) 분말, 현탁액 또는 용액으로서; 또는 d) 조성물이 식물 성장을 자극하는 하나 이상의 부가 화합물을 추가로 포함하는 경우에, 필드에 적용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 적어도 15, 30, 45, 60, 75 또는 90개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29의 적어도 45, 90, 135, 180, 225, 270, 315, 또는 345개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; 상기 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 한다.
한 측면에서, 상기 단편은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29의 첫 번째 뉴클레오티드에서 시작한다. 또 다른 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1, 7, 19, 또는 27과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 단편은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 1-15, 또는 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105, 또는 1-115를 코딩한다.
한 실시양태에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는: (a) 식물 성장 자극 단백질; (b) 효소; (c) 단백질; (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; (e) 치료 단백질; 또는 (f) 식물 면역 자극 단백질을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산은 (a) 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드 - 폴리펩티드는 N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치함; (b) 선택가능한 마커를 포함하는 폴리펩티드; (c) 시각화 마커를 포함하는 폴리펩티드; (d) 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
또한 또 다른 실시양태에서, 파에니바실루스 내생포자는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아에 의해 형성된 내생포자이다.
한 측면에서, 핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 파에니바실루스 중 적어도 하나에 대해 이종인 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된다.
또 다른 측면에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은: 동일한 조건 하에, 상응하는 최적화되지 않은 서열과 비교해서 파에니바실루스 내생포자에서 더 높은 비율 또는 수준으로 발현되는, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 코돈 최적화 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 그의 단편을 포함한다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 펩티드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는: (i) 적어도 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 또는 115개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드; (ii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 또는 32의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 또는 32의 적어도 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 또는 115개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고; 상기 N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 한다.
한 실시양태에서, 상기 단편은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 또는 32의 첫 번째 아미노산에서 시작한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 2, 8, 20, 21, 22, 28, 31, 또는 32와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또한 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 서열식별번호: 2, 8, 31, 또는 32의 아미노산 1-15, 또는 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105, 또는 1-115를 포함한다.
일부 측면에서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는: (a) 식물 성장 자극 단백질; (b) 효소; (c) 단백질; (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드; (e) 치료 단백질; 또는 (f) 식물 면역 자극 단백질을 포함한다.
다른 측면에서, 융합 단백질은: (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치한, 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드; (b) 선택가능한 마커를 포함하는 폴리펩티드; (c) 시각화 마커를 포함하는 폴리펩티드; (d) 적어도 하나의 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 박테리아 염색체를 포함하는 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이며, 여기서 이러한 벡터는 플라스미드, 인공 염색체, 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 한 측면에서, 벡터는 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함한다: (a) 파에니바실루스 세포에서 안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (b) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 불안정한 유지를 제공하는 복제 기점; (c) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 불안정한 유지를 제공하는 온도 감수성 복제 기점; (d) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (e) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 식물 성장 자극 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
또한 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 파에니바실루스 세포를 제공한다. 한 측면에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아이다.
일부 측면에서, 본 발명은 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에 이종 융합 단백질을 디스플레이하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은: a) 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 포자형성할 수 있는 파에니바실루스 세포를 형질전환시키는 단계; 및 b) 포자형성 조건 하에서 본원에 개시된 핵산 분자에 의해 코딩된 융합 단백질을 발현시켜, 융합 단백질이 포자형성으로부터 비롯된 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 하도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는: (i) 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드; (ii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 연속 아미노산의 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 a) 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 하나 이상의 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 - N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함함; 및 b) 적어도 하나의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산, 본원에 개시된 융합 단백질, 본원에 개시된 재조합 박테리아 세포, 또는 본원에 개시된 조성물로 처리된 종자를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 a) 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 내생포자 - N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함함; 및 b) 적어도 하나의 생물학적 방제제를, 임의로 상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 성장을 증강시키고/시키거나 식물 건강을 증진시키기 위해 식물, 종자, 식물 부분 또는 식물 주위의 토양을 처리하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계: a) 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하도록 변형된 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을, 파에니바실루스에 의해 영구적으로 또는 일시적으로 콜로니화될 수 있는 종자, 묘목, 또는 생장 식물에 적용하여, 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물을 생산하는 단계; b) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물의 형질, 성분, 또는 속성을 검출하고 임의로 측정함으로써 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리된 숙주 식물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 스크리닝 단계는 하기 중 하나 이상을 포함한다: a) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플로부터 제조된 추출물에 함유된 하나 이상의 화합물의 존재, 수준, 수준 상의 변화, 활성 또는 국재화를 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 하나의 시험관내 검정; 및/또는 b) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물의 형질, 성분, 또는 속성을 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 하나의 생체내 검정.
한 측면에서, 본 발명은 a) 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하도록 파에니바실루스 세포를 변형시켜 재조합 파에니바실루스 세포를 생산하는 단계; 및 b) 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 화합물의 수준 또는 활성을 검출하고 임의로 정량화함으로써 파에니바실루스 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 파에니바실루스 세포에서 발현된 이종 단백질 또는 펩티드를 농업적으로 유의한 특성에 대하여 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
또한, 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자, 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 파에니바실루스 세포가 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 것인, 식물, 종자, 인간 또는 동물을 처리하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 생존 파에니바실루스 세포가 남아 있지 않도록 조성물을 열-불활성화 또는 멸균시켰다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 단리된 및/또는 정제된 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자 또는 필드에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 파에니바실루스 내생포자는, 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하도록 변형된 것인, 관심 단백질을 식물, 종자 또는 필드에 전달하는 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 조성물은: a) 심기 전 또는 후에; b) 출현 전 또는 후에; c) 분말, 현탁액 또는 용액으로서; 및/또는 d) 조성물이 식물 성장을 자극하거나 또는 해충으로부터 식물을 보호하는 하나 이상의 부가 화합물을 추가로 포함하는 경우에, 필드에 적용된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 서열 "GLY-X-X" (여기서 "X"는 "임의의 아미노산"을 나타냄)을 갖는 다수의 콜라겐-유사 삼중자 반복부를 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 대하여 내생포자 형성 박테리아의 게놈을 스크리닝하는 단계; 및 스크리닝 단계에서 확인된 단백질 중 적어도 하나가 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면에 국재화되는지를 현미경검사에 의해 또는 실험적으로 결정하는 단계를 포함하는, 단백질이 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 하는 N-말단 신호 서열을 확인하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 내생포자 형성 박테리아는 단백질분해적으로 내성인 털 유사 구조를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 포자 표면에 국재화되는 것으로서 결정 단계에서 확인된 적어도 하나의 단백질로부터의 추정 N-말단 신호 서열을 확인하는 단계; 및 내생포자 형성 박테리아에서, 추정 N-말단 신호 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 방법은 포자 표면 상의 융합 단백질의 발현에 근거하여 융합 단백질을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 또한 또 다른 측면에서, 상기 방법은 선택되는 융합 단백질 내의 리포터 유전자를 관심 뉴클레오티드 서열로 대체하여 제2 융합 단백질을 생성시키는 단계; 및 내생포자 형성 박테리아에서 제2 융합 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 박테리아는 파에니바실루스 속, 비리디바실루스(Viridibacillus) 속, 브레비바실루스(Brevibacillus) 속 또는 리시니바실루스(Lysinibacillus) 속의 구성원이다. 한 실시양태에서, 박테리아는 파에니바실루스 속의 구성원이다.
일부 측면에서, 국재화는 투과 전자 현미경검사 또는 질량 분광측정법을 사용하여 결정된다.
다른 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 상기 신호 펩티드는: a) 본원에 개시된 방법에 의해 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면에 국재화되는 것으로 결정된 단백질의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120개의 N-말단 잔기의 연속 절편; b) 본원에 개시된 방법에 의해 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면에 국재화되는 것으로 결정된 단백질의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120개의 N-말단 잔기의 연속 절편과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 절편 또는 서열은 이러한 절편 또는 서열을 포함하는 융합 단백질이 내생포자 형성 박테리아에서 발현될 때 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 한다.
또한 다른 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 서열 또는 절편을 포함하고, N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 박테리아 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 한다.
한 측면에서, 핵산 분자는 박테리아 세포의 포자형성 동안 융합 단백질의 전사를 발생시키는 상류 조절 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 박테리아 세포는 파에니바실루스 과 구성원이다.
일부 실시양태에서, 상류 조절 서열은: (a) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것; (b) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것의 적어도 25, 50, 100, 150개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 서열; (c) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것, 또는 그의 25, 50, 100 또는 150개의 뉴클레오티드 단편과 비교해서 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 여기서 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 전사적으로 활성인 프로모터를 포함한다.
또한 다른 실시양태에서, 본 발명은 관심 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, 상류 조절 서열을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 상류 조절 서열 및 관심 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 여기서 관심 단백질은 상류 조절 서열에 대해 이종이고, 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 관심 단백질의 전사를 발생시킨다. 한 측면에서, 박테리아 세포는 파에니바실루스 과 구성원이다.
또 다른 측면에서, 상류 조절 서열은: (a) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것; (b) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것의 적어도 25, 50, 100, 150개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 서열; (c) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것, 또는 그의 25, 50, 100 또는 150개의 뉴클레오티드 단편과 비교해서 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 여기서 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 전사적으로 활성인 프로모터를 포함한다.
도 1은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자의 투과 전자 현미경 사진을 도시한다. 콜라겐-유사 단백질로 구성된 털 유사 구조가 내생포자 표면으로부터 연장되는 것으로 도시되며, 그러한 구조 중 하나가 화살표로 표시된다.
도 2a는 본 개시내용에 따른 예시적인 N-말단 표적화 서열을 발현하는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자, 구체적으로 본 도면에 의해 도시된 바와 같이 내생포자 표면에 국재화되는 (서열식별번호: 2)-GFP 융합 단백질 구축물의 위상차 (좌측) 및 표면 형광 (우측) 현미경 사진 (1000x 배율)을 도시한다. 우측 패널에서 GFP 단백질에 의해 생산된 형광은 좌측 패널에서 위상차 현미경검사로 관찰된 세포의 영상과 상응하며, 이는 내생포자 표면에 대한 GFP의 정확한 국재화를 나타낸다.
도 2b는 본 개시내용에 따른 예시적인 N-말단 표적화 서열을 발현하는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자, 구체적으로 내생포자 표면 (음영 구역)에 국재화되는 (서열식별번호: 2)-GFP 융합 단백질 구축물의 유동 세포계수법 히스토그램을 도시한다. 관찰 가능한 GFP 형광이 없는 야생형 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내생포자가 비교를 위해 제시된다 (열린, 점선 구역). 본 도면에서 각각의 포자 집단에 대해 10,000개의 이벤트가 제시된다.
도 3은 본 개시내용에 따른 예시적인 포자 표면 표적화 서열인 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 8의 N-말단 부분의 국소 서열 정렬을 도시한다. 컨센서스 서열 (서열식별번호: 32)이 정렬 아래에 제시된다.
본 개시내용은 융합 단백질을 파에니바실루스 포자 표면에 표적화할 수 있는 유전적 구축물뿐만 아니라, 이들 구축물을 사용하여 관심 이종 분자 (예를 들어, 펩티드, 단백질)를 다양한 환경, 예컨대 식물에 전달하는 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리한 후, 처리된 식물을, 파에니바실루스 내생포자를 통해 전달되는 이종 단백질에 기인할 수 있는 변화를 검출하기 위해 스크리닝할 수 있다. 이러한 변화는 숙주 식물의 성장 속도 또는 수확량에 있어서의 변경; 증강된 식물 건강 (예를 들어, 환경 스트레스, 질환 또는 해충에 대한 내성); 및 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리하지 않고 동일한 조건 하에서 성장한 숙주 식물과 비교해서 증강되거나, 변형되거나 또는 달리 새로운 속성의 디스플레이를 포함할 수 있다. 이종 단백질을 포자 표면에 효율적으로 표적화하는 표적화 서열의 사용은 또한, 예를 들어, 새로운 식물 형질 또는 속성을 증강, 변형 및/또는 부여할 수 있는 유용한 이종 단백질에 대한 고 처리량 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공한다.
정규 포자형성 프로세스 (비. 서브틸리스를 사용한 연구에 근거하여 밝혀짐)는 생장 세포의 비대칭 세포 분열을 수반하여 모체 세포와 전포자를 형성하며, 이는 중간 격막에 의해 분리된 2개의 별개의 구획으로서 발생한다. 결국, 격막 내의 펩티도글리칸이 분해되고 모체 세포에 의해 전포자가 포획되어 세포 내에 세포가 형성된다. 모체 세포와 전포자 간의 세포간 소통은 각각의 세포에서의 세포 특이적 유전자 발현을 조정하여, 내생포자 특이적 화합물의 생산, 전포자 주위에 피질 층의 형성 및 코트의 침착을 초래한다.
일부 바실루스(Bacillus) 종, 예를 들어, 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 및 비. 푸밀루스(B. pumilus)에서, 이러한 코트는 내생포자의 가장 바깥층이 될 것이다. 전포자는 최종 탈수 및 완전한 내생포자로의 성숙을 진행한다. 이어서 모체 세포는 프로그램된 세포 사멸을 통해 분해되어, 내생포자가 환경으로 방출되게 한다. 이어서, 내생포자는 전형적으로, 보다 유리한 조건 또는 특정한 자극이 발아를 촉발하고 생장 상태로 복귀할 때까지 휴면 상태로 유지될 것이다.
포자와 환경 사이의 가장 바깥쪽 표면으로서, 코트 층은 많은 중요한 기능을 제공한다. 특히, 이러한 층은 환경적 손상에 대한 반투과성 장벽으로서 작용하고 주위 환경과의 상호 작용을 매개하므로, 포자의 생육력을 유지하고 내생포자의 발아를 촉발시키는 조건을 감지하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 코트 층은 또한 숙주 면역 세포 인식에 기여하는 박테리아의 병원성 균주에 세포 표면 분자를 함유하기 때문에 임상 연구의 대상이다. 비. 서브틸리스의 포자 코트 상에 이종 단백질을 디스플레이하는 방법은 비. 서브틸리스 포자 코트 단백질, 예컨대 관심 단백질과 융합된 CotC를 함유하는 융합 단백질 구축물을 사용하여 개발되었다. 그러나, 파에니바실루스의 포자 표면 단백질은 공지되어 있지 않으므로, 비. 서브틸리스를 이용한 연구는 융합 단백질이 다른 박테리아 속, 예컨대 파에니바실루스의 포자 표면에 어떻게 표적화될 수 있는지에 대한 지침을 제공하지 못한다.
대조적으로, 본 개시내용은 융합 단백질 구축물을 파에니바실루스 세포의 포자 표면에 표적화할 수 있는 N-말단 구축물 및 이를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 융합 단백질을 포자 표면에 표적화하기 위해 사용되는 N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로써 나타낸 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, 선택된 실시양태에서, 이러한 N-말단 신호 서열은 포자 표면 표적화 기능성을 보유하기에 충분한 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단편은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 첫 번째 10, 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가의 대안적 측면은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7 또는 9의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 핵산에 의해 코딩된 N-말단 신호 서열을 포함한다. 이들 및 다른 실시양태가 본원에 기재되어 있다.
본 개시내용 전체에 걸쳐, 용어 "포함하다" 또는 그의 임의의 파생어 (예를 들어, 포함하는)는 "본질적으로 이루어지는", "이루어지는" 또는 그의 적용 가능한 상응하는 파생어로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "파에니바실루스"는 파에니바실루스 속으로 분류된 내생포자 생산 박테리아를 지칭한다. 이러한 용어는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 아비시, 파에니바실루스 아세티, 파에니바실루스 아에스투아리이, 파에니바실루스 아가렉세덴스, 파에니바실루스 아가리데보란스, 파에니바실루스 알기노리티쿠스, 파에니바실루스 알고리폰티콜라, 파에니바실루스 알칼리테라에, 파에니바실루스 알베이, 파에니바실루스 아밀로리티쿠스, 파에니바실루스 아나에리카누스, 파에니바실루스 안타르크티쿠스, 파에니바실루스 아피아리우스, 파에니바실루스 아라키디스, 파에니바실루스 아사멘시스, 파에니바실루스 아조레두센스, 파에니바실루스 아조토픽산스, 파에니바실루스 바에크로크다미솔리, 파에니바실루스 바르시노넨시스, 파에니바실루스 바렌골트지이, 파에니바실루스 보레알리스, 파에니바실루스 보비스, 파에니바실루스 브라실렌시스, 파에니바실루스 카멜리아에, 파에니바실루스 캄피나센시스, 파에니바실루스 카스타네아에, 파에니바실루스 카탈파에, 파에니바실루스 카토르미이, 파에니바실루스 카베르나에, 파에니바실루스 셀룰로시리티쿠스, 파에니바실루스 셀룰로시트로피쿠스, 파에니바실루스 카르타리우스, 파에니바실루스 치벤시스, 파에니바실루스 친주엔시스, 파에니바실루스 치티노리티쿠스, 파에니바실루스 콘드로이티누스, 파에니바실루스 청강엔시스, 파에니바실루스 시네리스, 파에니바실루스 시솔로켄시스, 파에니바실루스 콘타미난스, 파에니바실루스 쿠키이, 파에니바실루스 쿠쿠미스, 파에니바실루스 쿠르드라노리티쿠스, 파에니바실루스 다에제오넨시스, 파에니바실루스 다르위니아누스, 파에니바실루스 다우시, 파에니바실루스 덴드리티포르미스, 파에니바실루스 동도넨시스, 파에니바실루스 두사넨시스, 파에니바실루스 두루스, 파에니바실루스 에다피쿠스, 파에니바실루스 에히멘시스, 파에니바실루스 엘기이, 파에니바실루스 엔도피티쿠스, 파에니바실루스 에테리, 파에니바실루스 파에시스, 파에니바실루스 파비스포루스, 파에니바실루스 페라리우스, 파에니바실루스 필리시스, 파에니바실루스 폰티콜라, 파에니바실루스 포르시티아에, 파에니바실루스 프리고리레시스텐스, 파에니바실루스 간수엔시스, 파에니바실루스 겔라티니리티쿠스, 파에니바실루스 진센가르비, 파에니바실루스 진센기후미, 파에니바실루스 진센기솔리, 파에니바실루스 글라시알리스, 파에니바실루스 글루카노리티쿠스, 파에니바실루스 글리카니리티쿠스, 파에니바실루스 고르도나에, 파에니바실루스 그라미니스, 파에니바실루스 그라니보란스, 파에니바실루스 구앙즈호우엔시스, 파에니바실루스 하레나에, 파에니바실루스 헤메로칼리콜라, 파에니바실루스 히스파니쿠스, 파에니바실루스 호도가엔시스, 파에니바실루스 호르데이, 파에니바실루스 후미쿠스, 파에니바실루스 후나넨시스, 파에니바실루스 일리노이센시스, 파에니바실루스 자밀라에, 파에니바실루스 질룬리이, 파에니바실루스 코벤시스, 파에니바실루스 콜레오보란스, 파에니바실루스 콘시덴시스, 파에니바실루스 코레엔시스, 파에니바실루스 크립벤시스, 파에니바실루스 경헤엔시스, 파에니바실루스 락티스, 파에니바실루스 라르바에, 파에니바실루스 라르바에, 파에니바실루스 라르바에, 파에니바실루스 라우투스, 파에니바실루스 렘나에, 파에니바실루스 렌티모르부스, 파에니바실루스 렌투스, 파에니바실루스 리아오닝엔시스, 파에니바실루스 루피니, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 막쿠아리엔시스, 파에니바실루스 막쿠아리엔시스, 파에니바실루스 막쿠아리엔시스, 파에니바실루스 마르칸티오피토룸, 파에니바실루스 마리니세디미니스, 파에니바실루스 마실리엔시스, 파에니바실루스 메디카기니스, 파에니바실루스 멘델리이, 파에니바실루스 메탄올리쿠스, 파에니바실루스 몬타니테라에, 파에니바실루스 모토부엔시스, 파에니바실루스 무실라기노수스, 파에니바실루스 나넨시스, 파에니바실루스 나프탈레노보란스, 파에니바실루스 나수티테르미티스, 파에니바실루스 네마토필루스, 파에니바실루스 니코티아나에, 파에니바실루스 오세아니세디미니스, 파에니바실루스 오도리페르, 파에니바실루스 오에노테라에, 파에니바실루스 오리자에, 파에니바실루스 파불리, 파에니바실루스 파나시솔리, 파에니바실루스 파나시테라에, 파에니바실루스 파사데넨시스, 파에니바실루스 펙티니리티쿠스, 파에니바실루스 페오리아에, 파에니바실루스 페리안드라에, 파에니바실루스 포에니시스, 파에니바실루스 필로스파에라에, 파에니바실루스 피스코미트렐라에, 파에니바실루스 피니, 파에니바실루스 피니후미, 파에니바실루스 피네솔리, 파에니바실루스 포케오넨시스, 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 포필리아에, 파에니바실루스 포풀리, 파에니바실루스 프로소피디스, 파에니바실루스 프로벤센시스, 파에니바실루스 푸에리, 파에니바실루스 풀데운겐시스, 파에니바실루스 풀비파시엔스, 파에니바실루스 푸리스파티이, 파에니바실루스 킹스헨기이, 파에니바실루스 퀘르쿠스, 파에니바실루스 라디시스, 파에니바실루스 렐릭티세사미, 파에니바실루스 레시두이, 파에니바실루스 리조리자에, 파에니바실루스 리조스파에라에, 파에니바실루스 리구이, 파에니바실루스 리오그란덴시스, 파에니바실루스 리파에, 파에니바실루스 사비나에, 파에니바실루스 사케오넨시스, 파에니바실루스 살리니카에니, 파에니바실루스 산구이니스, 파에니바실루스 세디미니스, 파에니바실루스 세게티스, 파에니바실루스 셀레니이, 파에니바실루스 셀레니티레두센스, 파에니바실루스 세네갈렌시스, 파에니바실루스 셉텐트리오날리스, 파에니바실루스 세풀크리, 파에니바실루스 세니앙엔시스, 파에니바실루스 시라카미엔시스, 파에니바실루스 시아멘시스, 파에니바실루스 실라게이, 파에니바실루스 시노포도필리, 파에니바실루스 솔라니, 파에니바실루스 솔리, 파에니바실루스 손키, 파에니바실루스 소포라에, 파에니바실루스 스푸티, 파에니바실루스 스텔리페르, 파에니바실루스 수송엔시스, 파에니바실루스 스웬시스, 파에니바실루스 타이쿤겐시스, 파에니바실루스 타이와넨시스, 파에니바실루스 타리멘시스, 파에니바실루스 텔루리스, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 테레우스, 파에니바실루스 테리게나, 파에니바실루스 타일란덴시스, 파에니바실루스 써모필루스, 파에니바실루스 티아미노리티쿠스, 파에니바실루스 티안무엔시스, 파에니바실루스 티베텐시스, 파에니바실루스 티모넨시스, 파에니바실루스 툰드라에, 파에니바실루스 투리센시스, 파에니바실루스 티파에, 파에니바실루스 울리기니스, 파에니바실루스 우리날리스, 파에니바실루스 발리두스, 파에니바실루스 비니, 파에니바실루스 불네리스, 파에니바실루스 웬시니아에, 파에니바실루스 우포넨시스, 파에니바실루스 우송엔시스, 파에니바실루스 울루무퀴엔시스, 파에니바실루스 윈니이, 파에니바실루스 크산티니리티쿠스, 파에니바실루스 신장엔시스, 파에니바실루스 크실라넥세덴스, 파에니바실루스 크실라니리티쿠스, 파에니바실루스 크실라니솔벤스, 파에니바실루스 용기넨시스, 파에니바실루스 윤나넨시스, 파에니바실루스 잔톡실리, 및 파에니바실루스 제아에를 포함한 다양한 파에니바실루스 과 구성원을 제한 없이 포괄한다.
특정 측면에서, 융합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 파에니바실루스 구성원은 토양으로부터 단리된 그램 양성, 호기성, 및 포자형성 박테리아인 파에니바실루스 종 NRRL B-50972이다. 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 샘플은 2014년 8월 28일에 부다페스트 조약 하에, 미국 농무부의 국립 농업 이용 연구 센터, 농업 연구 서비스 (NRRL)에 위치한 농업 연구 서비스 컬처 컬렉션 (미국 일리노이주 61604 피오리아 노스 유니버서티 스트리트 1815)에 기탁되었다. 파에니바실루스 포자의 기본 조성 또는 구조에 관한 일반적인 지식이 부족하다는 것을 감안할 때, 이러한 층을 형성하는 동안 단백질이 포자 표면을 표적으로 하는 프로세스에 관해서는 거의 공지되어 있지 않다.
특정 측면에서, 융합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 파에니바실루스 구성원은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 또는 본원에 개시된 다른 예시적인 파에니바실루스 과 구성원 중 임의의 것의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99 퍼센트 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아이다. 또 다른 한편으론, 융합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 파에니바실루스 구성원은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 또는 본원에 개시된 다른 예시적인 파에니바실루스 과 구성원 중 임의의 것과 적어도 70 퍼센트의 DNA-DNA 혼성화 값을 보유하는 박테리아이다. 또 다른 경우에, 융합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 파에니바실루스 구성원은 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 또는 본원에 개시된 다른 예시적인 파에니바실루스 과 구성원 중 임의의 것과 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트의 평균 뉴클레오티드 동일성을 보유하는 박테리아이다.
용어 "N-말단 신호 서열"은 일반적으로, 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치하거나 또는 그에 근접하여 위치한 폴리펩티드 서열을 지칭하며, 이는 폴리펩티드가 세포하 구획으로 국재화되거나 또는 분비를 위해 지시한다. 이러한 용어는 문맥에 따라 용어 "N-말단 표적화 서열", "표적화 서열", "신호 서열" 및 "신호 펩티드"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 인식하고 이해한다. N-말단 신호 서열은 성숙 단백질의 폴리펩티드 서열의 일부로서 보유되거나 또는 또 다른 한편으론 국재화 프로세스 동안 또는 후에 절단될 수 있다. 이러한 용어는 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치하거나 또는 그에 근접하여 위치한 폴리펩티드 서열을 구체적으로 지칭하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 폴리펩티드가 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면으로 국재화되는 것을 지시한다. 이러한 맥락에서, N-말단 신호 서열에 요구되는 유일한 기능성은, 그것이 일부인 폴리펩티드가 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있는 능력이다.
"식물" 또는 "숙주 식물"은 파에니바실루스가 콜로니화할 수 있는 근권(rhizosphere) 또는 엽권(phyllosphere)을 보유한 임의의 식물뿐만 아니라 파에니바실루스 박테리아에 대한 일시적인 숙주로서 제공될 수 있는 식물을 포함한다. 콜로니화가 본 개시내용의 특정 측면에서 바람직할 수 있긴 하지만, 본원에 기재된 방법 및 조성물이 기능하기 위한 요구 사항이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 방제"는 제2 유기체 또는 생물학적 분자의 사용에 의한 병원체 및/또는 곤충 및/또는 진드기 및/또는 선충의 방제로서 정의된다. 생물학적 방제의 공지된 메커니즘은 뿌리 표면 상의 공간 또는 영양소에 대해 진균보다 우세함으로써 뿌리 썩음병을 방제하는 박테리아를 포함한다. 박테리아 독소, 예컨대 항생제가 병원체를 방제하는 데 사용되었다. 독소는 단리되어 식물에 직접적으로 적용될 수 있거나, 또는 박테리아 종을 투여하여 독소를 계내 생산할 수 있다. 생물학적 방제를 수행하는 다른 수단은 표적 식물 병원체, 곤충, 좀진드기 또는 선충에 대항하여 활성인 성분을 생산하거나, 또는 표적 해충/병원체를 공격하는 특정 진균의 적용을 포함한다. "생물학적 방제"는 또한 식물 건강, 성장, 활력, 스트레스 반응 또는 수확량에 대한 유리한 효과를 갖는 미생물을 포괄할 수 있다. 적용 경로는 분무 적용, 토양 적용 및 종자 처리를 포함한다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 간의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성, 훅스틴(Hoogstein) 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 이중 나선 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다수 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자기 혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 상이한 "엄격성" 조건 하에 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 정도의 엄격성 혼성화 반응은 10x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액에서 약 40℃ 하에 수행된다. 중간 정도의 엄격성 혼성화는 전형적으로 6x SSC에서 약 50℃ 하에 수행되고, 높은 정도의 엄격성 혼성화 반응은 일반적으로 1x SSC에서 약 60℃ 하에 수행된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 비교 윈도에 걸쳐 동일한 (즉, 각각 뉴클레오티드별 기준 또는 잔기별 기준) 정도를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율은 비교 윈도에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 A, T, C, G)가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하며, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도 내의 총 위치 수 (즉, 윈도 크기)로 나눈 다음, 그 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 2개의 정렬된 아미노산 서열을 비교함으로써 동등한 계산을 수행할 수 있다.
아미노산 서열의 비교와 관련하여, 서열 동일성의 측정에 더하여, 비교는 또한, 잔기 변화가 "보존적" 치환을 구성하는지의 여부를 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환 가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다.
N-말단 표적화 서열
본 개시내용은 파에니바실루스 박테리아로부터의 N-말단 표적화 서열을 제공한다. 스트레스가 많은 환경 조건에서, 파에니바실루스 과 박테리아는 포자형성을 거치며 장기간 휴면 상태를 유지할 수 있는 내생포자를 형성한다. 본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 파에니바실루스 내생포자의 가장 바깥쪽 층은 포자 표면으로서 공지되어 있으며 단백질 층을 포함한다. 바실루스 포자 표면 표적화 서열에 관한 이용 가능한 문헌이 증가함에도 불구하고, 파에니바실루스에서 상동 N-말단 표적화 서열을 확인하는 연구는 보고되지 않았다. 공지된 포자 표면 표적화된 단백질 CotC, BclA, BclB 또는 BetA의 생물 정보학 분석은 파에니바실루스에서 임의의 상동 N-말단 표적화 서열을 밝혀내지 못하는데, 이는 이들 단백질의 포자 표면 표적화 서열이 파에니바실루스 속에 보존되어 있지 않다는 것을 시사한다. 파에니바실루스의 포자 표면에 형성되고 국재화되는 단백질의 제한된 특징 규명을 고려해 볼 때, 단백질을 일반적으로 파에니바실루스에서 또는 이러한 속 내의 특정한 종 (예를 들어, 파에니바실루스 종 NRRL B-50972)에서의 포자 표면에 표적화하는 데 필요한 N-말단 신호 서열을 쉽게 추론할 수 없다.
이용 가능한 문헌에는 이러한 지침이 부족함에도 불구하고, 본 발명자들은 내인성 및 융합 단백질이 파에니바실루스 세포의 포자 표면으로 향할 수 있게 하는 N-말단 표적화 서열을 확인하였다.
용이한 참조를 위해, 본원에 언급된 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열에 대한 서열식별번호가 하기 표 1에 열거되어 있다.
<표 1>
예시적인 파에니바실루스 N-말단 표적화 서열 (즉, 서열식별번호: 1-10 및 18) 및 상류 조절 서열 (즉, 서열식별번호: 11-15).
Figure pct00001
Figure pct00002
<표 2>
부가의 예시적인 파에니바실루스 N-말단 표적화 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
표 1에 열거된 예시적인 N-말단 표적화 서열 (즉, 서열식별번호: 1-10 및 18) 및 표 2에 열거된 예시적인 N-말단 표적화 서열 (즉, 서열식별번호: 19-30) 외에도, 추가 실시양태에서, 전술한 서열 중 임의의 것과 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 변이체 서열이 사용될 수 있는데, 단 이러한 서열은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 능력을 보유해야 한다. 일부 실시양태에서, 표 1에 열거된 폴리펩티드 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속 아미노산의 단편이 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 요구되는 유일한 기능성은 상기 서열이 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 능력을 유지한다는 것이다.
일부 실시양태에서, 이러한 N-말단 신호 서열, 또는 그의 변이체 또는 단편은 융합 단백질을, 상기 연결된 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 관심 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 포함하는 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 표 1 상에 열거된 개별 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 표 1 상에 열거된 개별 폴리펩티드 서열 중 임의의 것의 동일한 아미노산 수의 연속 서열과 동일한 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 아미노산의 적어도 하나의 연속 서열을 포함한다.
본원에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 몇 가지 측면에 따른 융합 단백질 구축물은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 N-말단 신호 서열 또는 그의 변이체 또는 단편, 및 이러한 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 그러나, 추가 측면에서, 개시된 서열 중 임의의 것뿐만 아니라 개시된 측면 중 임의의 것에 따른 그의 순차적 변이체 및 단편이 다른 목적으로 사용될 수 있다. 이들 서열이 N-말단 포자 표면 표적화 서열로서 기능하는 측면에 대해 본 개시내용이 초점을 맞추는 것이, 다른 기능성의 포기로서 해석되지 않아야 한다.
일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로써 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10 중 하나에서 발견된 적어도 하나의 연속 하위 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)을 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로써 나타낸 서열과 최소 또는 정확한 정도의 동일성 백분율을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)를 포함한다. 선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 상기 정의된 바와 같이, 단편 및 변이체 둘 다로서 규정될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10에서 발견된 연속 하위 서열에 이어서 개시된 서열 동일성 범위 내에 속하는 발산 서열을 포함하는 N-말단 신호 서열).
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로써 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10으로써 나타낸 아미노산 서열의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 아미노산의 연속 서열과 동일한 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25개의 아미노산의 연속 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 발견된 적어도 하나의 연속 하위 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)을 포함한다. 대안적 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 서열 중 임의의 것으로써 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 최소 또는 정확한 정도의 동일성 백분율을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)를 포함한다. 선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 상기 정의된 바와 같이, 단편 및 변이체 둘 다로서 규정될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 발견된 연속 하위 서열에 이어서 최소 서열 동일성 범위 내에 속하는 발산 서열을 포함하는 N-말단 신호 서열).
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 중간 정도 또는 높은 정도의 엄격성 하에 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9에 상보적인 핵산 프로브와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 또는 9로써 나타낸 뉴클레오티드 서열 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 연속 서열과 동일한 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드의 연속 서열을 포함한다.
본 개시내용에 의해 고려되는 대안적 N-말단 표적화 서열 중 임의의 것, 예컨대 전술한 실시양태와 관련하여, 선택된 측면에서 이러한 서열의 최소 요구 기능성은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화할 수 있는 능력이다.
포자형성 관련 조절 서열
본 개시내용은 포자형성 동안 본 개시내용에 따른 융합 단백질 및 다른 구축물을 발현시키는 데 사용될 수 있는 다수의 상류 조절 서열을 제공한다 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15). 본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 이들 상류 조절 서열은 관심 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면으로 향하게 하는 N-말단 표적화 서열을 갖는 융합 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 이들 상류 조절 서열 (또는 그의 단편 또는 변이체)은 또한 관심 단백질이 N-말단 표적화 서열을 포함하는지의 여부에 관계없이 포자형성 동안 임의의 관심 이종 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 관심 단백질의 전사는 본원에 기재된 상류 조절 서열 중 임의의 것 (예를 들어, 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것, 또는 그의 단편 또는 변이체)에 존재하는 프로모터에 의해 제어된다. 일부 측면에서, DNA 구축물은 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 본원에 기재된 조절 서열 중 임의의 것 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것), 또는 그의 단편 또는 변이체의 하류에 관심 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15의 임의의 연속 25, 50, 100, 150 또는 200개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 변이체는 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것 (또는 그의 단편)과 비교해서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 관심 단백질을 코딩하는 DNA 및 임의의 상류 조절 서열(들)은 파에니바실루스 또는 다른 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질
본 개시내용은 적어도 하나의 관심 분자 (예를 들어, 관심 단백질 또는 펩티드, 예컨대 적어도 하나의 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드의 폴리펩티드 서열)에 직접 또는 간접적으로 연결된 N-말단 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 선택된 실시양태에서, 간접 결합은 개재 스페이서, 링커 또는 조절 서열일 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 펩티드 호르몬, 비-호르몬 펩티드, 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 관여하는 효소, 또는 박테리아, 진균, 또는 식물 영양원을 분해 또는 변형시키는 효소를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 파에니바실루스 내생포자에서 발현될 수 있고 선택된 N-말단 표적화 서열에 대해 이종인 임의의 관심 단백질이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 파에니바실루스 속의 박테리아에서 발현되는 단백질이다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 융합 단백질이 발현될 파에니바실루스 내생포자와 동일한 종의 박테리아로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 융합 단백질이 내생포자 상에서 발현될 파에니바실루스 균주로부터 단리된다. 표적화 서열은 상기 기재된 표적화 서열 중 임의의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표적화 서열 및 병원체로부터 식물을 보호하는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 표적화 서열은 상기 기재된 표적화 서열 중 임의의 것일 수 있다.
융합 단백질은 관련 기술 분야에 공지된 표준 클로닝 및 분자 생물학 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자)는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭될 수 있고 전술한 표적화 서열 중 임의의 것을 코딩하는 DNA에 라이게이션되어, 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 형성할 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 적합하게, 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자가 쉽게 삽입될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함한다. 벡터는 또한 적합하게, 선택가능한 마커, 예컨대 항생제 내성 유전자를 함유하여, 이러한 벡터로 형질전환되거나, 형질 감염되거나 또는 상기 벡터와 교배된 박테리아를 쉽게 확인 및 단리할 수 있다. 벡터가 플라스미드인 경우, 플라스미드는 적합하게 또한 복제 기점을 포함한다. 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 적합하게, 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에서 융합 단백질의 발현을 발생시킬 포자형성 프로모터 (예를 들어, 파에니바실루스 과 구성원으로부터의 천연 프로모터)의 제어 하에 있다. 일부 측면에서, 융합 단백질의 전사는 본원에 기재된 상류 조절 서열 중 임의의 것 (예를 들어, 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것, 또는 그의 단편 또는 변이체)에 존재하는 프로모터에 의해 제어된다. 일부 측면에서, DNA 구축물은 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 본원에 기재된 조절 서열 중 임의의 것 (예를 들어, 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것), 또는 그의 단편 또는 변이체의 하류에 본 개시내용에 따른 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15의 임의의 연속 50, 100, 150 또는 200개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 변이체는 포자형성 동안 전사적으로 활성을 유지하는, 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것 (또는 그의 단편)과 비교해서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 상류 조절 서열(들)을 수반하는 융합 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9 중 임의의 것, 또는 그의 변이체 또는 단편의 서열)을 코딩하는 DNA가, 파에니바실루스 또는 다른 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질은 또한 표적화 서열의 일부가 아닌 부가의 폴리펩티드 서열, 또는 연결된 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 융합 단백질 자체 또는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포의 포자의 정제 (예를 들어, 폴리히스티딘 태그) 또는 시각화 (예를 들어, 형광 단백질, 예컨대 GFP 또는 YFP)를 용이하게 하기 위해 태그 또는 마커를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 표적화 서열을 사용하는 포자 표면 상에서의 융합 단백질의 발현은 이들 서열의 아미노-말단에서의 2차 구조의 결여로 인해 증강되며, 이는 융합된 단백질의 천연 폴딩 및 활성 유지를 허용한다. 표적화 서열과 융합 파트너 단백질 사이에 짧은 아미노산 링커를 포함시킴으로써 적절한 폴딩이 추가로 증강될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것은 표적화 서열과 연결된 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드) 사이에 아미노산 링커를 포함할 수 있다.
링커는 폴리알라닌 링커 또는 폴리글리신 링커를 포함할 수 있다. 알라닌 잔기와 글리신 잔기 둘 다의 혼합물을 포함하는 링커가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적화 서열이 서열식별번호: 2를 포함하는 경우, 융합 단백질은 하기 구조 중 하나를 가질 수 있다:
링커 없음: 서열식별번호: 2-융합 파트너 단백질
알라닌 링커: 서열식별번호: 2-An-융합 파트너 단백질
글리신 링커: 서열식별번호: 2-Gn-융합 파트너 단백질
혼합된 알라닌 및 글리신 링커: 서열식별번호: 2-(A/G)n-융합 파트너 단백질
여기서 An, Gn, 및 (A/G)n은 각각 임의의 수의 알라닌, 임의의 수의 글리신, 또는 임의의 수의 알라닌과 글리신의 혼합물이다.
예를 들어, n은 1 내지 25의 임의의 정수, 예컨대 6 내지 10의 정수일 수 있다. 링커가 알라닌과 글리신 잔기의 혼합물을 포함하는 경우, 글리신과 알라닌 잔기의 임의의 조합이 사용될 수 있다. N-말단 표적화 서열은 상기 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 2로써 나타낸다. 그러나, 본원에 개시된 다른 N-말단 표적화 서열 중 임의의 것이, 상기 예시적인 구성에서 서열식별번호: 2 (예를 들어, 서열식별번호: 4, 6, 8 또는 10 또는 그의 단편 또는 변이체) 대신에 치환될 수 있다. 상기 나타낸 구조에서, "융합 파트너 단백질"은 연결된 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드)을 나타낸다.
또 다른 한편으론, 또는 또한, 링커는 프로테아제 인식 부위를 포함할 수 있다. 프로테아제 인식 부위의 포함은 프로테아제 인식 부위를 인식하는 프로테아제에 노출되었을 때, 관심 단백질 (예를 들어, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드, 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드, 식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 식물 결합 단백질 또는 펩티드)의 표적화된 제거를 허용한다.
특정 측면에서, 융합 단백질은 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 관여하는 효소, 예컨대 아세토인 리덕타제, 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제, 트립토판 모노옥시게나제, 아세토락테이트 신테타제, α-아세토락테이트 데카르복실라제, 피루베이트 데카르복실라제, 디아세틸 리덕타제, 부탄디올 데히드로게나제, 아미노트랜스퍼라제, 트립토판 데카르복실라제, 아민 옥시다제, 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제, 인돌-3-아세트알데히드 데히드로게나제, 트립토판 측쇄 옥시다제, 니트릴 히드롤라제, 니트릴라제, 펩티다제, 프로테아제, 아데노신 포스페이트 이소펜테닐트랜스퍼라제, 포스파타제, 아데노신 키나제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제, CYP735A, 5'-리보뉴클레오티드 포스포히드롤라제, 아데노신 뉴클레오시다제, 제아틴 시스-트랜스 이소머라제, 제아틴 O-글루코실트랜스퍼라제, β-글루코시다제, 시스-히드록실라제, CK 시스-히드록실라제, CK N-글루코실트랜스퍼라제, 2,5-리보뉴클레오티드 포스포히드롤라제, 아데노신 뉴클레오시다제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 제아틴 리덕타제, 히드록실아민 리덕타제, 2-옥소글루타레이트 디옥시게나제, 지베렐릭 2B/3B 히드롤라제, 지베렐린 3-옥시다제, 지베렐린 20-옥시다제, 키토사나제, 키티나제, β-1,3-글루카나제, β-1,4-글루카나제, β-1,6-글루카나제, 아미노시클로프로판-1-카르복실산 데아미나제, nod 인자 생산에 관여하는 효소, 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다.
다른 측면에서, 융합 단백질은 박테리아, 진균 또는 식물 영양원을 분해 또는 변형시키는 효소, 예컨대 셀룰라제, 리파제, 리그닌 옥시다제, 프로테아제, 글리코시드 히드롤라제, 포스파타제, 니트로게나제, 뉴클레아제, 아미다제, 니트레이트 리덕타제, 니트라이트 리덕타제, 아밀라제, 암모니아 옥시다제, 리그니나제, 글루코시다제, 포스포리파제, 피타제, 펙티나제, 글루카나제, 술파타제, 우레아제, 크실라나제, 시드로포어(siderophore), 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표적화 서열, 포자 표면 단백질, 또는 융합 단백질의 포자 표면 단백질 단편에 고유한 포자형성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 융합 단백질은 고 발현 포자형성 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 특정 측면에서, 고 발현 포자형성 프로모터는 시그마-K 포자형성 특이적 폴리머라제 프로모터 서열을 포함한다. 선택된 측면에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 표적화 서열에 고유한 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 일부 경우에, 표적화 서열에 고유한 프로모터는 고 발현 포자형성 프로모터일 것이다. 다른 경우에, 표적화 서열에 고유한 프로모터는 고 발현 포자형성 프로모터가 아닐 것이다. 후자의 경우에, 천연 프로모터를 고 발현 포자형성 프로모터로 대체하는 것이 유리할 수 있다. 고 발현 포자형성 프로모터의 제어 하에 융합 단백질의 발현은 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에서의 융합 단백질의 증가된 발현을 제공한다. 고 발현 포자형성 프로모터는 하나 이상의 시그마-K 포자형성 특이적 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합 단백질은 표적화 서열 및 성장 자극 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있는 적어도 하나의 이종 단백질을 포함할 수 있다. 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드는 특히, 펩티드 호르몬, 비-호르몬 펩티드, 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 관여하는 효소, 또는 박테리아, 진균 또는 식물 영양원를 분해 또는 변형시키는 효소를 포함할 수 있다. 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드는 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 관여하는 효소를 포함할 수 있다. 식물 성장 자극 화합물의 생산 또는 활성화에 관여하는 효소는 식물 성장을 자극하거나 또는 식물 구조를 변경시키는 화합물에 대한 생물학적 합성 경로의 임의의 단계를 촉매하는 임의의 효소, 또는 식물 성장을 자극하거나 또는 식물 구조를 변경시키는 화합물의 불활성 또는 덜 활성인 유도체를, 상기 화합물의 활성 또는 보다 활성인 형태로 전환시키는 것을 촉매하는 임의의 효소일 수 있다. 또 다른 한편으론, 식물 성장 자극 화합물은 식물 성장 호르몬, 예를 들어, 시토키닌 또는 시토키닌 유도체, 에틸렌, 옥신 또는 옥신 유도체, 지베렐린산 또는 지베렐린산 유도체, 아브시스산 또는 아브시스산 유도체, 또는 자스몬산 또는 자스몬산 유도체를 포함할 수 있다.
효소가 프로테아제 또는 펩티다제를 포함하는 경우, 이러한 프로테아제 또는 펩티다제는 단백질, 펩티드, 프로단백질 또는 프리프로단백질을 절단하여 생체 활성 펩티드를 생성하는 프로테아제 또는 펩티다제일 수 있다. 생체 활성 펩티드는 생물학적 활성을 발휘하는 임의의 펩티드일 수 있다. 단백질, 펩티드, 프로단백질 또는 프리프로단백질을 절단하여 생체 활성 펩티드를 생성하는 프로테아제 또는 펩티다제는 서브틸리신, 산 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 프로테이나제, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제, 써모리신, 파파인, 펩신, 트립신, 프로나제, 카르복실라제, 세린 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제 또는 메탈로프로테아제를 포함할 수 있다.
식물 성장 자극 단백질은 또한 박테리아, 진균 또는 식물 영양원을 분해 또는 변형시키는 효소를 포함할 수 있다. 이러한 효소는 셀룰라제, 리파제, 리그닌 옥시다제, 프로테아제, 글리코시드 히드롤라제, 포스파타제, 니트로게나제, 뉴클레아제, 아미다제, 니트레이트 리덕타제, 니트라이트 리덕타제, 아밀라제, 암모니아 옥시다제, 리그니나제, 글루코시다제, 포스포리파제, 피타제, 펙티나제, 글루카나제, 술파타제, 우레아제, 크실라나제, 및 시드로포어를 포함한다. 식물 성장 배지 내로 도입되거나 또는 식물, 종자, 또는 식물 또는 식물 종자 주위의 구역에 적용될 때, 박테리아, 진균 또는 식물 영양원을 분해 또는 변형시키는 효소를 포함하는 융합 단백질은 식물 근처에서 영양소의 프로세싱을 도울 수 있고, 식물에 의한 또는 식물 근처에서 유익한 박테리아 또는 진균에 의한 영양소의 흡수를 증강시킨다. 융합 단백질은 표적화 서열 및 병원체로부터 식물을 보호하는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 단백질 또는 펩티드는 식물 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 펩티드는 식물 면역계 인핸서 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 식물 면역계 인핸서 단백질 또는 펩티드는 식물의 면역계에 유리한 효과를 갖는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 또 다른 한편으론, 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드는 항박테리아 활성, 항진균 활성, 또는 항박테리아 활성과 항진균 활성 둘 다를 갖는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드는 또한, 살곤충 활성, 구충 활성을 갖거나, 곤충 또는 벌레 포식을 억제하거나, 또는 그의 조합을 갖는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질은 효소를 포함할 수 있다. 적합한 효소는 프로테아제 및 락토나제를 포함한다. 프로테아제 및 락토나제는 박테리아 신호전달 분자 (예를 들어, 박테리아 락톤 호모세린 신호전달 분자)에 특이적일 수 있다. 효소는 또한 박테리아 또는 진균의 세포성 성분에 특이적인 효소일 수 있다.
융합 단백질은 표적화 서열 및 식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 단백질 또는 펩티드는 스트레스 관련 화합물을 분해하는 효소를 포함한다. 스트레스 관련 화합물은 아미노시클로프로판-1-카르복실산 (ACC), 반응성 산소 종, 산화 질소, 옥시리핀 및 페놀계를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특이적 반응성 산소 종은 히드록실, 과산화수소, 산소 및 슈퍼옥시드를 포함한다. 스트레스 관련 화합물을 분해하는 효소는 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 옥시다제, 카탈라제, 아미노시클로프로판-1-카르복실산 데아미나제, 퍼옥시다제, 항산화 효소 또는 항산화 펩티드를 포함할 수 있다.
식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 단백질 또는 펩티드는 또한, 환경 스트레스로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 환경 스트레스는, 예를 들어, 가뭄, 홍수, 열, 동결, 염분, 중금속, 낮은 pH, 높은 pH 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 환경 스트레스로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드는 얼음 핵생성 단백질, 프롤리나제, 페닐알라닌 암모니아 리아제, 이소코리스메이트 신타제, 이소코리스메이트 피루베이트 리아제, 또는 콜린 데히드로게나제를 포함할 수 있다.
융합 단백질은 표적화 서열 및 적어도 식물 결합 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 식물 결합 단백질 또는 펩티드는 식물의 임의의 부분 (예를 들어, 식물 뿌리 또는 식물의 공중 부분, 예컨대 잎, 줄기, 꽃, 또는 열매) 또는 식물 물질과 특이적으로 또는 비특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 식물 결합 단백질 또는 펩티드는 뿌리 결합 단백질 또는 펩티드, 또는 잎 결합 단백질 또는 펩티드일 수 있다.
융합 단백질을 발현하는 재조합 파에니바실루스 내생포자 및 세포
본원에 기재된 융합 단백질은 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 [예를 들어, 피. 테라에(P. terrae)]에 의해 발현될 수 있다. 융합 단백질은 상기 논의된 융합 단백질 중 임의의 것일 수 있다. 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포는 상기 논의된 융합 단백질 중 임의의 것의 둘 이상을 공동 발현할 수 있다. 예를 들어, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포는 식물 결합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 적어도 하나의 융합 단백질을, 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드를 포함하는 적어도 하나의 융합 단백질, 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드를 포함하는 적어도 하나의 융합 단백질, 또는 식물에서의 스트레스 내성을 증강시키는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드와 함께 공동 발현할 수 있다.
재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스 세포, 예컨대 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 또는 파에니바실루스 페오리아에 세포를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 내생포자 생산 파에니바실루스 세포는 본원에 기재된 예시적인 파에니바실루스 종 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 생성하기 위해, 임의의 파에니바실루스 박테리아를 관련 기술 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 (예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 이용한 전기 천공에 의함) 형질전환시킬 수 있다. 이어서, 상기 박테리아를 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 스크리닝하여 형질전환체를 확인할 수 있다. 예를 들어, 벡터가 항생제 내성 유전자를 포함하는 경우, 상기 박테리아는 항생제 내성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 또 다른 한편으론, 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 파에니바실루스 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 이어서 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포는 포자형성을 유도하는 조건에 노출될 수 있다. 포자형성을 유도하는 데 적합한 조건은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 약 30℃의 온도에서 수 일 (예를 들어, 3일) 동안 인큐베이션하거나 또는 또 다른 한편으론, 쉐퍼(Schaeffer) 포자형성 배지에서 배양할 수 있다.
상기 종 중 임의의 것의 불활성화된 균주, 무독성 균주, 또는 유전적으로 조작된 균주가 또한 적합하게 사용될 수 있다. 또 다른 한편으론 또는 또한, 일단 융합 단백질을 발현하는 재조합 파에니바실루스 과 포자가 생성되면, 이들은 사용 중 한번 더 발아되는 것을 방지하기 위해 불활성화될 수 있다. 관련 기술 분야에 공지된 박테리아 포자를 불활성화시키는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은 열 처리, 감마선 조사, x-선 조사, UV-A 조사, UV-B 조사, 화학적 처리 (예를 들어, 글루테르알데히드, 포름알데히드, 과산화수소, 아세트산, 표백제, 또는 그의 임의의 조합으로의 처리), 또는 그의 조합을 포함하나, 제한되지 않는다. 또 다른 한편으론, 비-독소발생 균주, 또는 유전적으로 또는 물리적으로 불활성화된 균주로부터 유래된 포자가 사용될 수 있다.
본 개시내용에 따른 융합 단백질 구축물은 융합 단백질을 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면에 표적화하는 N-말단 신호 서열 또는 그의 변이체 또는 단편, 및 이러한 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 선택된 실시양태에서, N-말단 신호 서열과, 이러한 N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열은 직접적으로 연결된다. 다른 측면에서, 개재 링커 또는 스페이서 서열이 존재할 수 있다. 추가 측면에서, 절단 서열 또는 다른 조절 서열이 두 영역 사이에 위치될 수 있다. N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 기능성 단백질을 포함할 수 있다. N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열에 다수의 기능성 단백질이 함유되는 측면에서, 적어도 하나의 스페이서, 절단 서열 또는 다른 조절 요소가 둘 이상의 기능성 단백질 사이에 위치할 수 있다.
N-말단 신호 서열에 대해 이종인 폴리펩티드 서열은, 예를 들어: (a) 식물 성장 자극 단백질 또는 펩티드; (b) 병원체로부터 식물을 보호하는 단백질 또는 펩티드; (c) 식물의 스트레스 내성을 증강시키는 단백질 또는 펩티드; (d) 식물 결합 단백질 또는 펩티드; (e) 식물 면역계 인핸서 단백질 또는 펩티드; 또는 (f) 영양소 흡수를 증강시키는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 파에니바실루스에서 발현될 때, 이들 융합 단백질은 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 하고, 상기 단백질 또는 펩티드가 포자의 외부에 디스플레이되도록 물리적으로 배향된다.
이러한 파에니바실루스 포자 표면 디스플레이 시스템은 펩티드, 효소 및 다른 단백질을 식물 (예를 들어, 식물 잎, 열매, 꽃, 줄기 또는 뿌리) 또는 식물 성장 배지, 예컨대 토양에 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 토양 또는 또 다른 식물 성장 배지에 전달되는 펩티드, 효소 및 단백질은 장기간 지속되며 토양에서 활성을 나타낸다. 본원에 기재된 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 토양 또는 식물의 근권 내로 도입하면, 많은 상이한 토양 조건에서 식물 성장의 유리한 증강이 초래될 수 있다. 이들 효소를 생성하기 위해 파에니바실루스 포자 표면 디스플레이 시스템을 사용하면, 식물 생애의 첫 번째 몇 달 동안, 및 일부 측면에서 식물의 수명을 포함하여 그때가지 보다 장기간에 걸쳐 식물 및 근권에 대한 유익한 효과를 지속적으로 발휘할 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 또는 본원에 기재된 임의의 측면에 따라 이러한 세포에 의해 생산된 내생포자를 포함하는 조성물이 식물에 (예를 들어, 분말, 현탁액 또는 용액으로서, 종자 또는 필드에) 직접적으로 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 조성물은 시딩 전 또는 후에, 또는 또 다른 한편으론 발아 전 또는 후에 (예를 들어, 심기 전 또는 후에, 또는 출현 전 또는 후에) 필드에 적용된다.
대안적 측면에서, 본원에 개시된 융합 단백질 및/또는 조성물은 재조합 파에니바실루스 세포 또는 포자를 식물, 종자 또는 필드에 적용함으로써 식물, 종자 및/또는 필드에 간접적으로 전달될 수 있다. 이들 측면에서, 융합 단백질은 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 (예를 들어, 필드에서) 발현 또는 생성되어, 융합 단백질을 식물, 종자 또는 필드에 전달할 수 있다.
식물 성장 촉진 효과 및/또는 다른 유익한 속성을 갖는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포
일부 파에니바실루스 박테리아는 고유의 유익한 속성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 균주는 식물 성장 촉진 또는 살곤충 (예를 들어, 모기 살충) 효과를 갖는다. 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것이 이러한 균주에서 발현될 수 있다.
예를 들어, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포는 파에니바실루스의 식물 성장 촉진 균주를 포함할 수 있다. 박테리아의 식물 성장 촉진 균주는 살곤충 독소 (예를 들어, Bin 독소)를 생산하거나, 살진균 화합물 (예를 들어, β-1,3-글루카나제, 키토시나제, 리티카제, 또는 그의 조합)을 생산하거나, 살선충 화합물 (예를 들어, Cry 독소)을 생산하거나, 살균 화합물을 생산하거나, 하나 이상의 항생제에 내성이거나, 하나 이상의 자유롭게 복제되는 플라스미드를 포함하거나, 식물 뿌리와 결합하거나, 식물 뿌리에 콜로니화하거나, 생물막을 형성하거나, 영양소를 가용화하거나, 유기산을 분비하거나, 또는 그의 임의의 조합을 나타내는 박테리아 균주를 포함할 수 있다.
생물학적 방제제
본 개시내용에 의해 제공되는 조성물은 생물학적 방제제를 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 방제제는 특히, 박테리아, 진균 또는 효모, 원생 동물, 바이러스, 곤충병원성 선충, 접종물 및 식물학, 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징 및/또는 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 대항하여 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 하나의 대사 산물을 갖는 그들의 돌연변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 전술한 재조합 파에니바실루스 내생포자와, 본원에 기재된 특정한 생물학적 방제제 및/또는 본원에 기재된 미생물의 특이적 균주의 돌연변이체의 조합을 제공하며, 여기서 돌연변이체는 각각의 균주의 모든 식별 특징, 및/또는 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 대항하여 활성을 나타내거나 또는 식물 성장을 촉진시키고/시키거나 식물 건강을 증강시키는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 하나의 대사 산물을 갖는다. 본 개시내용에 따르면, 본원에 기재된 생물학적 방제제는 임의의 생리학적 상태, 예컨대 활성 또는 휴면으로 이용되거나 사용될 수 있다.
예시적인 조성물
선택된 측면에서, 본 개시내용은 a) 관심 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 파에니바실루스 과 구성원의 포자 표면에 국재화시키는 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포; 및 b) 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 및 상이한 특정한 생물학적 방제제, 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징 및/또는 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 대항하여 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 하나의 대사 산물을 갖는 본원에 개시된 미생물의 특이적 균주의 돌연변이체를, 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물을 제공한다. 대안적 측면에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 부가의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제를 포함하며, 단 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포, 살곤충제 및 살진균제는 동일하지 않다. 또 다른 측면에서, 조성물은 식물 및 식물 부분의 전반적인 손상뿐만 아니라 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 의해 유발된 수확된 열매 또는 채소에 있어서의 손실을 감소시키기 위해 사용된다. 또 다른 측면에서, 상기 조성물은 전반적인 식물 건강을 증가시킨다.
용어 "식물 건강"은 일반적으로, 해충 방제와 관련이 없는 다양한 종류의 식물 개량을 포함한다. 예를 들어, 언급될 수 있는 유리한 특성은 출현, 작물 수확량, 단백질 함량, 오일 함량, 전분 함량, 보다 발달된 뿌리 시스템, 개선된 뿌리 성장, 개선된 뿌리 크기 유지, 개선된 뿌리 유효성, 개선된 스트레스 내성 (예를 들어, 가뭄, 열, 염분, UV, 물, 추위에 대항함), 감소된 에틸렌 (감소된 생산 및/또는 수용 억제), 경작 증가, 식물 높이 상의 증가, 더 큰 잎편, 덜 죽은 근출엽, 더 강한 곁눈, 더 푸르른 잎 색깔, 색소 함량, 광합성 활성, 더 적은 투입 필요 (예컨대 비료 또는 물), 더 적은 종자 필요, 더 생산적인 곁눈, 조기 개화, 조기 곡물 성숙, 더 적은 식물 구절 (로징), 증가된 어린가지 성장, 증강된 식물 활력, 증가된 식물 기립 및 조기 및 더 나은 발아를 포함한 개선된 작물 특징이다.
본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 동일한 환경 조건 하에서 재배된 식물을 비교함으로써 식물 성장, 건강 또는 다른 긍정적인 속성에 대한 잠재적 이익을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있으며, 이로써 상기 식물의 일부가 본 개시내용에 따른 조성물로 처리되고 상기 식물의 또 다른 부분은 본 개시내용에 따른 조성물로 처리되지 않는다. 대신에, 상기 다른 부분은 전혀 처리되지 않거나 또는 적합한 대조군 (즉, 본 개시내용에 따른 조성물을 사용하지 않은 적용, 예컨대 모든 활성 성분을 수반하지 않은 적용), 본원에 기재된 바와 같은 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 수반하지 않은 적용, 또는 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제를 수반하지 않은 적용으로 처리된다.
본 개시내용에 따른 조성물은 임의의 원하는 방식으로, 예컨대 종자 코팅, 토양 관주 및/또는 직접 고랑내 및/또는 엽상 분무의 형태로 적용될 수 있고, 출현 전, 출현 후, 또는 둘 다 중 어느 하나에 적용될 수 있다. 다시 말해서, 상기 조성물은 종자, 식물 또는 수확된 열매 및 채소에 적용되거나 또는 식물이 자라고 있거나 또는 성장하기를 원하는 토양 (식물의 성장 위치)에 적용될 수 있다.
식물 및 식물 부분의 전반적인 손상을 감소시키면, 종종 식물이 더 건강해지고/지거나 식물 활력과 수확량이 증가한다. 바람직하게, 본 개시내용에 따른 조성물은 통상적인 또는 트랜스제닉 식물 또는 그의 종자를 처리하기 위해 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 동물 건강 또는 이러한 동물의 일반적인 전반적 신체 상태를 개선시킨다. 건강 증강의 표시는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 동물에서 질환 상태의 완화 또는 반전; 동물의 특이적 부분의 체중 증가 또는 전반적 체중 증가를 포함할 수 있는 체중 증가; 장내 미생물의 유지; 사료 활용 효율 상의 증가; 사망 위험 감소; 질환 저항력 증가; 이환율의 감소; 면역 반응의 증가; 설사 발생 감소, 생산성 증가; 및/또는 병원체 유출의 감소. 본 개시내용은 또한 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 포함하는 상기 기재된 조성물의 임의의 것의 치료량 또는 유효량을 동물에게 투여함으로써 동물 건강을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 이러한 융합 단백질은 사료의 소화를 돕는 효소, 예컨대 아밀라제, 글루카나제, 글루코아밀라제, 셀룰라제, 크실라나제, 글루카나제 및 펙티나제, 또는 면역 조정제, 예컨대 항체를 포함한다. 조성물의 유효량은 이러한 조성물을 투여받지 않았지만 본 발명의 조성물을 투여받은 동물과 동일한 식이 (사료 및 다른 화합물 포함)를 투여받은 동물과 비교해서 동물의 건강을 증강시키는 데 유효한 양이다. 용어 "치료량"은 동물에서 질환 상태를 완화 또는 역전시키기에 충분한 양을 지칭한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 배지, 예컨대 토양, 지하수, 퇴적물 또는 지표수로부터 오염물 또는 오염체를 제거한다. 본 개시내용은 또한 포자 표면 상에 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 포함하는 상기 기재된 조성물 중 임의의 것의 유효량을 배지에 적용함으로써 이러한 배지, 예컨대 토양, 지하수, 퇴적물 또는 지표수로부터 오염물 또는 오염체를 제거하는 방법에 관한 것이다.
재조합 파에니바실루스 구축물 및 조성물을 사용하는 방법
본 개시내용은 또한, 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제를 포함하는 상기 기재된 조성물 중 임의의 것을 사용하여 식물 성장을 자극하는 방법에 관한 것이다. 식물 성장을 자극하는 방법은 식물, 종자, 식물 부분, 식물 주위의 장소에 또는 식물이 심어질 곳 (예를 들어, 토양 또는 다른 성장 배지)에, (i) 이종 단백질 (예를 들어, 적어도 하나의 식물 성장 자극 단백질); 및 (ii) 표적화 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포; 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징 및/또는 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 대항하여 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 하나의 대사 산물을 갖는 본원에 개시된 미생물의 특이적 균주의 돌연변이체를, 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물을 적용하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제를, 상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 및 식물 부분의 전반적인 손상뿐만 아니라 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 의해 유발된 수확된 열매 또는 채소에 있어서의 손실을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 살진균제를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 적어도 하나의 살진균제는 합성 살진균제이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 살진균제에 더하여 또는 살진균제를 대신하여 적어도 하나의 살곤충제를 포함하며, 단 본원에 개시된 살곤충제, 살진균제, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 특정한 생물학적 방제제는 동일하지 않다.
본 개시내용의 방법은 하기 적용 방법, 즉 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제 둘 다를, 농업적으로 허용되는 저장 수명을 갖는 단일의 안정한 조성물로 제형화하거나 (소위 "단독 제형"), 또는 사용 전 또는 사용 시점에 조합되는 (소위 "조합 제형") 적용 방법을 포함한다.
달리 언급되지 않으면, "조합"이라는 표현은 단독 제형에서, 단일 "미리 혼합된 것" 형태에서, 단독 제형으로부터 구성된 조합 분무 혼합물, 예컨대 "탱크-믹스"에서, 및 특히 순차적인 방식으로, 즉 하나를 투여한 후 다른 하나를 합리적으로 짧은 기간 내에, 예컨대 수 시간 또는 수 일, 예를 들어 2시간 내지 7일에 적용될 때 단일 활성 성분의 조합 사용에서, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제의 다양한 조합을 나타낸다. 본 개시내용에 따른 조성물의 적용 순서는 본 개시내용을 작동시키는데 필수적이지 않다. 따라서, 용어 "조합"은 또한, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 살곤충제가, 예를 들어, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제를 식물 또는 그의 주위 환경, 서식지 또는 저장 공간에 동시에 또는 연속적으로 적용한 후, 처리할 식물 또는 그의 주위 환경, 서식지 또는 저장 공간 상에 또는 내에 존재하는 것을 포괄한다.
재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제가 순차적 방식으로 이용 또는 사용되는 경우에는, 식물 또는 식물 부분 (종자 및 종자로부터 출현되는 식물을 포함한다), 수확된 열매 및 채소를 하기 방법에 따라 처리하는 것이 바람직하다: 첫째, 식물 또는 식물 부분에 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제를 적용하고, 둘째 본원에 기재된 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 동일한 식물 또는 식물 부분에 적용한다. 이러한 적용 방식에 의해, 수확 시 식물 상의 살곤충제/살진균제의 잔류량은 가능한 한 낮다. (작물) 성장 주기 내에서 제1 적용과 제2 적용 사이의 기간은 다양할 수 있고 달성되는 효과에 의존할 수 있다. 예를 들어, 제1 적용은 식물 또는 식물 부분에 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체가 침습하는 것을 방지하기 위해 수행되거나 (이것은 종자를 처리하는 경우에 특히 그렇다), 또는 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체로의 침습과 싸우기 위해 수행되고 (이것은 식물 및 식물 부분을 처리하는 경우에 특히 그렇다), 제2 적용은 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체로의 침습을 방지 또는 방제하고/하거나 식물 성장을 촉진시키기 위해 수행된다. 이러한 맥락에서 방제는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 특정한 생물학적 방제제를 포함하는 조성물이 해충 또는 식물 병원성 진균을 완전히 박멸할 수는 없지만 침습을 허용 가능한 수준으로 유지할 수 있다는 것을 의미한다.
본 개시내용은 또한, 다수의 적용에 의해 본 개시내용의 조성물의 사멸, 억제, 예방적 및/또는 반발 활성을 증강시키는 방법을 제공한다. 일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 1시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 1주, 약 10일, 약 2주, 약 3주, 약 1개월 또는 그 초과의 간격으로, 임의의 원하는 발생 단계 동안 또는 임의의 미리 결정된 해충 압력 하에서 식물 및/또는 식물 부분에 2회 적용된다. 또한 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 1시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 1주, 약 10일, 약 2주, 약 3주, 약 1개월 또는 그 초과의 간격으로, 임의의 원하는 발생 단계 동안 또는 임의의 미리 결정된 해충 압력 하에서 식물 및/또는 식물 부분에 2회 초과, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과로 적용된다. 원하는 경우, 각각의 적용 간의 간격이 다양할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 식물 종, 식물 해충 종 및 다른 요인에 따라 적용 시간 및 간격의 길이를 결정할 수 있을 것이다.
전술한 단계를 수행함으로써, 처리된 식물, 식물 부분 및 수확된 열매 및 채소 상에 매우 낮은 수준의 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제 잔류물이 존재할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용에 따른 조성물로 식물 또는 식물 부분 (종자 및 종자로부터 출현되는 식물을 포함한다), 수확된 열매 및 채소를 처리하는 것은 직접적으로 수행되거나 또는 통상적인 처리 방법, 예를 들어 침지, 분무, 분사, 관개, 증발, 더스팅, 김서림, 방송, 발포, 페인팅, 확산, 관수 (흠뻑 젖음), 점적 관개를 사용하여 그들의 주위 환경, 서식지 또는 저장 공간 상에서의 작용에 의해 수행된다. 더욱이 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포, 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제를 초 저용량 방법에 의해 단독 제형 또는 조합 제형으로서 적용하거나, 또는 본 개시내용에 따른 조성물을 조성물로서 또는 단독 제형으로서 토양 (고랑내) 내로 주사하는 것이 가능하다.
용어 "처리될 식물"은 뿌리 시스템을 포함한 식물의 모든 부분, 및 처리될 식물의 줄기 또는 나무 줄기 둘에에 적어도 10 cm, 20 cm, 30 cm의 반경 내에 있거나 또는 처리될 상기 식물의 뿌리 시스템 둘레에 적어도 10 cm, 20 cm, 30 cm에 있는 물질 (예를 들어, 토양 또는 영양 배지)을 각각 포괄한다.
임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제의 존재하에, 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제와 조합하여 사용 또는 이용되는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포의 양은 최종 제형뿐만 아니라 처리될 식물, 식물 부분, 종자, 수확된 열매 및 채소의 크기 또는 유형에 의존한다. 통상적으로, 본 개시내용에 따라 이용 또는 사용될 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포는 그의 단독 제형 또는 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제와의 조합 제형의 약 1% 내지 약 80% (w/w), 바람직하게 약 1% 내지 약 60% (w/w), 보다 바람직하게 약 10% 내지 약 50% (w/w)로 존재한다.
또한, 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제의 존재 하에, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포와 조합하여 사용 또는 이용되는 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제의 양은 최종 제형뿐만 아니라 처리될 식물, 식물 부분, 종자, 수확된 열매 및 채소의 크기 또는 유형에 의존한다. 통상적으로, 본 개시내용에 따라 이용 또는 사용될 본원에 기재된 추가의 특정한 생물학적 방제제는 그의 단독 제형 또는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제와의 조합 제형의 약 0.1% 내지 약 80% (w/w), 바람직하게 1% 내지 약 60% (w/w), 보다 바람직하게 약 10% 내지 약 50% (w/w)로 존재한다.
재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포의 적용은 엽상 분무, 토양 처리, 및/또는 종자 처리/드레싱으로서 수행될 수 있다. 엽상 처리로서 사용될 때, 한 실시양태에서, 에이커 당 전체 브로스의 약 1/16 내지 약 5 갤런이 적용된다. 토양 처리로서 사용될 때, 한 실시양태에서, 에이커 당 전체 브로스의 약 1 내지 약 5 갤런이 적용된다. 종자 처리를 위해 사용될 때, 에이커 당 전체 브로스의 약 1/32 내지 약 1/4 갤런이 적용된다. 종자 처리를 위해, 최종 용도 제형은 적어도 1 x 104, 적어도 1 x 105, 적어도 1 x 106, 1 x 107, 적어도 1 x 108, 적어도 1 x 109, 적어도 1 x 1010 콜로니화 단위/그램을 함유한다.
비율은 본 개시내용에 따른 상기 조합 성분을 식물 또는 식물 부분에 적용하는 시점에서의 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제의 양, 및 본 개시내용에 따른 상기 조합 성분을 식물 또는 식물 부분에 적용하기 직전 (예를 들어, 48 h, 24 h, 12 h, 6 h, 2 h, 1 h) 또는 적용하는 시점에서의 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포의 양에 근거하여 계산될 수 있다.
재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제를 식물 또는 식물 부분에 적용하는 것은 동시에 또는 상이한 시간에 일어날 수 있는데, 단 두 성분이 적용(들) 후에 식물 상에 또는 식물 내에 존재해야 한다. 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포와 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제가 상이한 시점에 적용되고, 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제가 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 적용 이전에 적용되는 경우, 통상의 기술자는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 적용하는 시점 또는 적용하는 시점 직전에, 관련 기술 분야에 공지된 화학적 분석에 의해 식물 상에/내에 존재하는 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제의 농도를 결정할 수 있다. 그 반대로, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포를 식물에 먼저 적용하는 경우, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포의 농도는 본원에 개시된 추가의 특정한 생물학적 방제제를 적용하는 시점 또는 적용하는 시점 직전에, 관련 기술 분야에 또한 공지되어 있는 시험을 사용하여 결정될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 바와 같은 조성물로 처리된 종자가 제공된다. 식물의 종자를 처리함으로써 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체를 방제하는 것이 오랫동안 공지되어 왔으며, 이는 지속적인 개선의 대상이다. 그럼에도 불구하고, 종자 처리는 항상 만족스러운 방식으로 해결될 수 없는 일련의 문제를 수반한다. 따라서, 저장 과정에서, 파종 후 또는 식물의 출현 후, 작물 보호 조성물의 부가의 전달 필요성을 없애거나 또는 부가의 전달을 적어도 상당히 감소시키는, 종자 및 발아 식물을 보호하기 위한 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 더욱이, 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 의한 공격으로부터 종자 및 발아 식물에 대한 최선의 보호를 제공하지만, 이용된 활성 성분에 의해 식물 자체에 손상을 입히지 않는 방식으로 이용되는 활성 성분의 양을 최적화하는 것이 바람직하다. 특히, 종자를 처리하는 방법은 또한, 작물 보호 조성물을 최소한으로 사용하면서 종자 및 발아 식물의 최적 보호를 달성하기 위해, 해충 저항성 또는 해충 내성 트랜스제닉 식물의 고유 살곤충 및/또는 살선충 특성을 고려해야 한다.
따라서 본 개시내용은 또한 특히, 종자를 상기 정의된 바와 같은 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포; 및 본원에 개시된 특정한 미생물 및/또는 각각의 균주의 모든 식별 특징 및/또는 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체에 대항하여 활성을 나타내는 각각의 균주에 의해 생산된 적어도 하나의 대사 산물을 갖는 본원에 개시된 미생물의 특이적 균주의 돌연변이체로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 생물학적 방제제; 및 임의로 본 개시내용의 적어도 하나의 살진균제 및/또는 임의로 적어도 하나의 살곤충제로 처리함으로써, 해충에 의한 공격으로부터 종자 및 발아 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 종자 및 발아 식물을 해충에 의한 공격으로부터 보호하기 위한 본 개시내용의 방법은 종자를 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제로 동시에 한 번의 조작으로 처리하는 방법을 포괄한다. 이는 또한, 종자를 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제로 상이한 시점에 처리하는 방법을 포괄한다.
본 개시내용은 추가로, 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체로부터 종자 및 그로써 생성된 식물을 보호할 목적으로 종자를 처리하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 기재된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제로 동시에 처리시킨 종자에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로, 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제로 상이한 시간에 처리시킨 종자에 관한 것이다. 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 및 본원에 개시된 적어도 하나의 추가의 특정한 생물학적 방제제, 및 임의로 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살곤충제로 상이한 시간에 처리시킨 종자의 경우, 본 개시내용의 조성물 중의 개별 활성 성분은 종자 상의 상이한 층에 존재할 수 있다.
더욱이, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물로 처리한 후, 종자의 먼지 마모를 방지하기 위해 필름 코팅 공정을 거친 종자에 관한 것이다.
본 개시내용의 장점 중 하나는, 본 개시내용의 조성물의 특정한 전신 특성으로 인해, 이들 조성물로 종자를 처리하는 것이, 종자 자체에 대해서 뿐만 아니라 종자가 출현한 후에 이러한 종자로부터 유래되는 식물에 대해서도 곤충, 좀진드기, 선충 및/또는 식물 병원체로부터의 보호를 제공한다는 것이다. 이러한 방식으로, 파종 시 또는 그 직후에 작물을 직접적으로 처리할 필요가 없을 수 있다. 본 개시내용의 조성물로 종자를 처리함으로써, 이와 같이 처리된 종자의 발아 및 출현이 촉진될 수 있다는 사실에서 추가의 이점을 볼 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 농업, 온실, 임업 또는 원예에서 사용되는 임의의 다양한 식물의 종자를 보호하는 데 적합하다. 보다 특히, 해당 종자는 곡물 (예를 들어, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 기장), 옥수수, 면화, 대두, 쌀, 감자, 해바라기, 커피, 담배, 카놀라, 평지씨, 사탕무 (예를 들어, 사탕무 및 사료용 비트), 땅콩, 채소 (예를 들어, 토마토, 오이, 콩, 브라시카, 양파 및 상추), 열매 식물, 잔디 및 관상용 식물의 것이다. 곡물 (예컨대 밀, 보리, 호밀 및 귀리), 옥수수, 대두, 면화, 카놀라, 평지씨 및 쌀의 종자를 처리하는 것이 특히 중요하다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본 개시내용의 조성물은 종자에 단독으로 적용되거나 또는 적합한 제형으로 적용된다. 종자는 처리 과정에서 손상이 발생하지 않도록 안정성이 양호한 상태에서 처리되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 종자는 수확과 파종 사이의 임의의 시점에서 처리될 수 있다. 전형적으로, 식물로부터 분리되어 있으며 속대, 깍지, 줄기, 겉껍질, 털 또는 펄프가 제거된 종자가 사용된다. 따라서, 예를 들어, 15 중량% 미만의 수분 함량으로 수확, 세정 및 건조시킨 종자가 사용될 수 있다. 또 다른 한편으론, 건조 후, 예를 들어, 물로 처리한 다음 다시 건조시킨 종자가 사용될 수도 있다.
종자를 처리할 때, 일반적으로 말해서, 본 개시내용의 조성물 및/또는 다른 부가제가 종자에 적용되는 양은, 종자의 발아에 불리한 영향을 미치지 않도록 선택되어야 하고/하거나, 종자로부터 출현되는 식물은 손상되지 않아야 하는 것이 필요하다. 이는 특정 적용률에서 식물 독성 효과를 나타낼 수 있는 활성 성분의 경우에 특히 그렇다.
본 개시내용의 조성물은 직접적으로, 다시 말해서 추가의 성분을 포함하지 않고 희석되지 않으면서 적용될 수 있다. 일반적으로, 조성물을 적합한 제형 형태로 종자에 적용하는 것이 바람직하다. 종자 처리를 위한 적합한 제형 및 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 4,272,417 A; 4,245,432 A; 4,808,430 A; 5,876,739 A; 미국 특허 공개 번호 2003/0176428 A1; WO 2002/080675 A1; WO 2002/028186 A2 (각각의 내용이 본원에 참조로 포함된다).
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 조합은 통상적인 종자 드레싱 제형, 예컨대 용액, 에멀션, 현탁액, 분말, 발포체, 슬러리 또는 종자용 다른 코팅 조성물, 및 또한 ULV 제형으로 전환될 수 있다. 이들 제형은 조성물을 통상적인 아주반트, 예컨대 예를 들어, 통상적인 증량제 및 또한 용매 또는 희석제, 착색제, 습윤제, 분산제, 유화제, 소포제, 보존제, 2차 증점제, 스티커, 지베렐린 및 또한 물과 혼합함으로써, 공지된 방식으로 제조된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 종자 드레싱 제형에 존재할 수 있는 착색제는 이러한 목적에 통상적인 모든 착색제를 포함한다. 이러한 맥락에서, 수중 용해도가 낮은 색소뿐만 아니라 수용성 염료도 사용하는 것이 가능하다. 그 예는 명칭 로다민 B, C.I. 피그먼트 레드 112 및 C.I. 솔벤트 레드 1 하에 공지된 착색제를 포함한다.
식물 종 또는 식물 재배종, 그의 위치 및 성장 조건 (토양, 기후, 생장 기간, 식이)에 따라, 본 개시내용에 따른 조성물을 사용하거나 이용하여, 본 개시내용에 따른 처리는 또한 상가적 ("상승작용적") 효과를 초래할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 개시내용에 따른 처리에 본 발명의 조성물을 사용하거나 이용함으로써, 감소된 적용률 및/또는 활성 스펙트럼의 확대 및/또는 더 우수한 식물 성장 활성 상의 증가, 고온 또는 저온에 대한 내성 증가, 가뭄 또는 물 또는 토양 염분에 대한 증가된 내성, 증가된 개화 성능, 더 용이한 수확, 촉진된 성숙, 더 높은 수확 수율, 더 큰 열매, 더 큰 식물 높이, 더 푸르른 잎 색깔, 조기 개화, 수확 산물의 더 높은 품질 및/또는 더 높은 영양가, 열매 내의 더 높은 당 농도, 수확 산물의 더 우수한 저장 안정성 및/또는 가공성이 가능하며, 이는 실제적으로 예측되는 효과를 초과한다.
본 개시내용에 따른 처리에서 본 발명의 조성물의 특정 적용률에서 또한, 식물에 강화 효과를 줄 수 있다. 원치 않는 식물 병원성 진균 및/또는 미생물 및/또는 바이러스에 의한 공격에 대항한 식물의 방어 시스템이 동원된다. 식물 강화 (저항 유도) 물질은 본 발명의 맥락에서, 원치 않는 식물 병원성 진균 및/또는 미생물 및/또는 바이러스로 후속 접종될 때, 처리된 식물이 이들 식물 병원성 진균 및/또는 미생물 및/또는 바이러스에 대해 상당한 정도의 내성을 나타내는 방식으로 식물의 방어 시스템을 자극할 수 있는 물질 또는 물질의 조합을 의미하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 처리에서 본 개시내용에 따른 조성물을 사용하거나 이용함으로써, 식물은 처리 후 특정 기간 내에 상기 언급된 병원체에 의한 공격에 대항하여 보호될 수 있다. 보호가 이루어지는 기간은 일반적으로, 식물을 활성 화합물로 처리한 후 1 내지 10일, 바람직하게는 1 내지 7일 연장된다.
본원에 개시된 조성물 중 임의의 것은 하나 이상의 농약을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 개시내용에 따른 조성물을 적용하는 방법은 식물 성장 배지에 적어도 하나의 농약을 도입하거나 또는 식물 또는 종자에 적어도 하나의 농약을 적용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
농약은 비료 (예를 들어, 액체 비료), 미량 영양소 비료 재료 (예를 들어, 붕산, 붕산염, 붕소 프릿, 황산구리, 구리 프릿, 구리 킬레이트, 소듐 테트라보레이트 데카히드레이트, 황산철, 산화철, 황산철 암모늄, 철 프릿, 철 킬레이트, 황산 망가니즈, 산화 망가니즈, 망가니즈 킬레이트, 염화 망가니즈, 망가니즈 프릿, 몰리브덴산 나트륨, 몰리브덴산, 황산 아연, 산화 아연, 탄산 아연, 아연 프릿, 인산 아연, 아연 킬레이트 또는 그의 조합), 살곤충제 (예를 들어, 유기 인산염, 카르바메이트, 피레트로이드, 살비제, 알킬 프탈레이트, 붕산, 붕산염, 플루오라이드, 황, 할로방향족 치환 우레아, 탄화수소 에스테르, 생물학적 기반 살곤충제 또는 그의 조합), 제초제 (예를 들어, 클로로페녹시 화합물, 니트로페놀 화합물, 니트로크레졸 화합물, 디피리딜 화합물, 아세트아미드, 지방족 산, 아닐리드, 벤즈아미드, 벤조산, 벤조산 유도체, 아니스산, 아니스산 유도체, 벤조니트릴, 벤조티아디아지논 디옥시드, 티오카르바메이트, 카르바메이트, 카르바닐레이트, 클로로피리디닐, 시클로헥세논 유도체, 디니트로아미노벤젠 유도체, 플루오로디니트로톨루이딘 화합물, 이속사졸리디논, 니코틴산, 이소프로필아민, 이소프로필아민 유도체, 옥사디아졸리논, 인산염, 프탈레이트, 피콜린산 화합물, 트리아진, 트리아졸, 우라실, 우레아 유도체, 엔도탈, 염소산 나트륨 또는 그의 조합), 살진균제 (예를 들어, 치환된 벤젠, 티오카르바메이트, 에틸렌 비스 디티오카르바메이트, 티오프탈리드아미드, 구리 화합물, 유기 수은 화합물, 유기 주석 화합물, 카드뮴 화합물, 아닐라진, 베노밀, 시클로헥사미드, 도딘, 에트리디아졸, 이프로디온, 메트락실, 티아미메폰, 트리포린 또는 그의 조합), 연체동물 구충제, 살조제, 식물 성장 수정제, 박테리아 접종물 (예를 들어, 리조비움(Rhizobium) 속의 박테리아 접종물, 브라디리조비움(Bradyrhizobium) 속의 박테리아 접종물, 메소리조비움(Mesorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 아조리조비움(Azorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 알로리조비움(Allorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 시노리조비움(Sinorhizobium) 속의 박테리아 접종물, 클루이베라(Kluyvera) 속의 박테리아 접종물, 아조토박터(Azotobacter) 속의 박테리아 접종물, 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 박테리아 접종물, 아조스피릴리움(Azospirillium) 속의 박테리아 접종물, 바실루스 속의 박테리아 접종물, 스트렙토미세스(Streptomyces) 속의 박테리아 접종물, 파에니바실루스 속의 박테리아 접종물, 파라코쿠스(Paracoccus) 속의 박테리아 접종물, 엔테로박터(Enterobacter) 속의 박테리아 접종물, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속의 박테리아 접종물, 미코박테리움(Mycobacterium) 속의 박테리아 접종물, 트리코데르마(Trichoderma) 속의 박테리아 접종물, 글리오클라디움(Gliocladium) 속의 박테리아 접종물, 글로쿠스(Glomus) 속의 박테리아 접종물, 클렙시엘라(Klebsiella) 속의 박테리아 접종물, 또는 그의 조합), 진균 접종물 (예를 들어, 글로메라세아에(Glomeraceae) 과의 진균 접종물, 클라로이도글로메라세아에(Claroidoglomeraceae) 과의 진균 접종물, 기가스포라세아에(Gigasporaceae) 과의 진균 접종물, 아카울로스포라세아에(Acaulosporaceae) 과의 진균 접종물, 사쿨로스포라세아에(Sacculosporaceae) 과의 진균 접종물, 엔트로포스포라세아에(Entrophosporaceae) 과의 진균 접종물, 파시드스포라세아에(Pacidsporaceae) 과의 진균 접종물, 디베르시스포라세아에(Diversisporaceae) 과의 진균 접종물, 파라글로메라세아에(Paraglomeraceae) 과의 진균 접종물, 아르카에오스포라세아에(Archaeosporaceae) 과의 진균 접종물, 지오시포나세아에(Geosiphonaceae) 과의 진균 접종물, 암비스포라세아에(Ambisporaceae) 과의 진균 접종물, 스쿠텔로스포라세아에(Scutellosporaceae) 과의 진균 접종물, 덴티스쿨타타세아에(Dentiscultataceae) 과의 진균 접종물, 라코세트라세아에(Racocetraceae) 과의 진균 접종물, 바시디오미코타(Basidiomycota) 문의 진균 접종물, 아스코미코타(Ascomycota) 문의 진균 접종물, 지고미코타(Zygomycota) 문의 진균 접종물, 또는 그의 조합), 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
비료는 황산암모늄, 질산암모늄, 황산암모늄 니트레이트, 염화암모늄, 중황산암모늄, 암모늄 폴리술피드, 티오황산암모늄, 수성 암모니아, 무수 암모니아, 폴리인산암모늄, 황산알루미늄, 질산칼슘, 칼슘 질산암모늄, 황산칼슘, 석회화된 마그네사이트, 방해석질 석회석, 산화칼슘, 질산칼슘, 백운 석회석, 수화 석회, 탄산칼슘, 디암모늄 포스페이트, 모노암모늄 포스페이트, 질산마그네슘, 황산마그네슘, 질산칼륨, 염화칼륨, 칼륨 황산마그네슘, 황산칼륨, 질산나트륨, 마그네시아질 석회석, 마그네시아, 우레아, 우레아-포름알데히드, 우레아 질산암모늄, 황-코팅된 우레아, 중합체-코팅된 우레아, 이소부틸리덴 디우레아, K2SO4-(MgSO4)2, 카이나이트, 실비나이트, 키저라이트, 엡섬 염, 원소상 황, 이회토, 굴 껍질, 어분, 오일 케이크, 어비, 혈분, 인광석, 과인산염, 슬래그, 골분, 목재 회분, 거름, 박쥐 구아노, 초탄, 퇴비, 녹색 사암, 목화씨 가루, 우모분, 크랩 밀, 어류 에멀젼, 흄산, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 농약은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 살진균제, 박테리아 접종물, 또는 제초제를 포함할 수 있다. 포자형성 박테리아는 단독으로 또는 살곤충제와 조합하여, 적어도 하나의 살진균제의 유효량을 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, "살진균제"는 진균의 사망률을 증가시키거나 또는 그의 성장 속도를 억제하는 물질이다. 용어 "진균들" 또는 "진균"은 클로로필이 없는 광범위한 유핵 포자 보유 유기체를 포함한다. 진균의 예는 효모, 곰팡이, 흰곰팡이, 러스트, 및 버섯을 포함한다. 전형적인 살진균 성분은 또한, 캅탄, 플루디옥소닐, 이프로디온, 테부코나졸, 티아벤다졸, 아족시스트로빈, 프로클로라즈, 및 옥사딕실을 포함한다. 본 개시내용에 따른 선택 조성물, 식물 종자, 또는 접종물은 임의의 자연 또는 합성 살진균제, 예컨대: 알디모르프, 암프로필포스, 암프로필포스 포타슘, 안도프림, 아닐라진, 아자코나졸, 아족시스트로빈, 베날락실, 베노다닐, 베노밀, 벤자마크릴, 벤자마크릴-이소부틸, 비알라포스, 비나파크릴, 비페닐, 비테르타놀, 블라스티시딘-S, 보스칼리드, 브로무코나졸, 부피리메이트, 부티오베이트, 칼슘 폴리술피드, 캅시마이신, 캅타폴, 캅탄, 카르벤다짐, 카르본, 퀴노메티오네이트, 클로벤티아존, 클로르페나졸, 클로로넵, 클로로피크린, 클로로탈로닐, 클로졸리네이트, 클로질라콘, 쿠프라넵, 시목사닐, 시프로코나졸, 시프로디닐, 시프로푸람, 데바카르브, 디클로로펜, 디클로부트라졸, 디클로플루아니드, 디클로메진, 디클로란, 디에토펜카르브, 디메티리몰, 디메토모르프, 디목시스트로빈, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 디노캅, 디페닐아민, 디피리티온, 디탈림포스, 디티아논, 도데모르프, 도딘, 드라족솔론, 에디펜포스, 에폭시코나졸, 에타코나졸, 에티리몰, 에트리디아졸, 파목사돈, 페나파닐, 페나리몰, 펜부코나졸, 펜푸람, 페니트로판, 펜피클로닐, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜틴 아세테이트, 펜틴 히드록시드, 페르밤, 페림존, 플루아지남, 플루메토베르, 플루오피람, 플루오로마이드, 플루퀸코나졸, 플루르프리미돌, 플루실라졸, 플루술파미드, 플루톨라닐, 플루트리아폴, 폴펫, 포세틸-알루미늄, 포세틸-소듐, 프탈리드, 푸베리다졸, 푸랄락실, 푸라메트피르, 푸르카르보닐, 푸르코나졸, 푸르코나졸-시스, 푸르메시클록스, 구아자틴, 헥사클로로벤젠, 헥사코나졸, 히멕사졸, 이마잘릴, 이미벤코나졸, 이미녹타딘, 이미녹타딘 알베실레이트, 이미녹타딘 트리아세테이트, 아이오도카르브, 이프로벤포스 (IBP), 이프로디온, 이루마마이신, 이소프로티올란, 이소발레디온, 카수가마이신, 크레속심-메틸, 구리 제제, 예컨대: 수산화구리, 나프텐산구리, 옥시염화구리, 황산구리, 산화구리, 옥신-구리 및 보르도 혼합물, 만코퍼, 만코제브, 마네브, 메페림존, 메파니피림, 메프로닐, 메탈락실, 메트코나졸, 메타술포카르브, 메트푸록삼, 메티람, 메토메클람, 메트술포박스, 밀디오마이신, 미클로부타닐, 미클로졸린, 니켈 디메틸디티오카르바메이트, 니트로탈-이소프로필, 누아리몰, 오푸레이스, 옥사딕실, 옥사모카르브, 옥솔린산, 옥시카르복심, 옥시펜티인, 파클로부트라졸, 페푸라조에이트, 펜코나졸, 펜시쿠론, 포스디펜, 피마리신, 피페랄린, 폴리옥신, 폴리옥소림, 프로베나졸, 프로클로라즈, 프로시미돈, 프로파모카르브, 프로파노신-소듐, 프로피코나졸, 프로피넵, 프로티오시나졸, 피라조포스, 피리페녹스, 피리메타닐, 피로퀼론, 피록시푸르, 퀸코나졸, 퀸토젠 (PCNB), 황 및 황 제제, 테부코나졸, 테클로프탈람, 테크나젠, 테트시클라시스, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티시오펜, 티플루자미드, 티오파네이트-메틸, 티옥시미드, 톨클로포스-메틸, 톨릴플루아니드, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리아즈부틸, 트리아족시드, 트리클라미드, 트리시클라졸, 트리데모르프, 트리플록시스트로빈, 트리플루미졸, 트리포린, 유니코나졸, 발리다마이신 A, 빈클로졸린, 비니코나졸, 자릴아미드, 지넵, 지라모르, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 살진균제는 또한, 치환된 벤젠, 티오카르바메이트, 에틸렌 비스 디티오카르바메이트, 티오프탈리드아미드, 구리 화합물, 유기 수은 화합물, 유기 주석 화합물, 카드뮴 화합물, 아닐라진, 베노밀, 시클로헥사미드, 도딘, 에트리디아졸, 이프로디온, 메트락실, 티아미메폰, 트리포린, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 농업용으로 사용되는 다른 공지된 합성 또는 자연적으로 발생하는 살진균제가 또한, 본 개시내용에 따른 조성물, 식물 종자 또는 접종물에 포함되기 위해 선택될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
조성물, 식물 종자, 또는 접종물이 살진균제를 포함하는 경우, 이러한 살진균제는 엽상 살진균제일 수 있다. 엽상 살진균제는 구리, 만코제브, 펜티오피라드, 트리아졸, 시프로코나졸, 메트코나졸, 프로피코나졸, 프로티오코나졸, 테부코나졸, 아족시스트로빈, 피라클라스토빈, 플루옥사스트로빈, 피콕시스트로빈, 트리플록시스트로빈, 황, 보스칼리드, 티오파네이트 메틸, 클로로타노닐, 펜티오피라드, 디펜코나졸, 플루트리아폴, 시프로디닐, 플루지남, 이프로디온, 펜플루펜, 시아조파미드, 플루톨라닐, 시목사닐, 디메토모르프, 피리메타닐, 족사미드, 만디프로파미드, 메트리남, 프로파모카르브, 페나미돈, 테트라코나졸, 클로로납, 히멕사졸, 톨클로포스, 및 펜부코나졸을 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 농업용으로 사용되는 다른 공지된 합성 또는 자연적으로 발생하는 엽상 살진균제가 또한, 본 개시내용에 따른 조성물, 식물 종자 또는 접종물에 포함되기 위해 선택될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
살곤충제를 포함하는 본 개시내용에 따른 조성물, 종자 및 접종물은 곤충의 사망률을 증가시키거나 또는 성장 속도를 억제할 수 있는 능력을 보유한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "곤충"은 "인섹타(Insecta)" 강의 모든 유기체를 포함한다. 용어 "성체기 이전" 곤충은, 예를 들어, 알, 유충 및 님프를 포함하여, 성체기 이전의 임의의 형태의 유기체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "살곤충제" 및 "살곤충"은 또한 "살선충제" 및 "살선충" 및 "살비제" 및 "살비"를 포괄한다. "살선충제" 및 "살선충"은 선충의 사망률을 증가시키거나 또는 성장 속도를 억제할 수 있는 물질의 능력을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "선충"은 알, 유충, 미성숙 및 성숙한 형태의 상기 유기체를 포함한다. "살비제" 및 "살비"는 아라크니다(Arachnida) 강, 아카리(Acari) 아강에 속하는 체외 기생충의 사망률을 증가시키거나 또는 성장 속도를 억제할 수 있는 물질의 능력을 지칭한다.
본 개시내용의 한 측면에 따라, 적어도 하나의 살곤충제는 하기를 포함한다:
(1) 아세틸콜린에스테라제 (AChE) 억제제, 예컨대, 예를 들어, 카르바메이트, 예를 들어 알라니카르브, 벤디오카르브, 벤푸라카르브, 부토카르복심, 부톡시카르복심, 카르보푸란, 카르보술판, 에티오펜카르브, 푸라티오카르브, 이소프로카르브, 메톨카르브, 옥사밀, 피리미카르브, 프로폭수르, 티오파녹스, 트리아자메이트, 트리메타카르브, XMC 및 크실릴카르브; 또는 유기 인산염, 예를 들어 아세페이트, 아자메티포스, 아진포스-에틸, 아진포스-메틸, 카두사포스, 클로르에톡시포스, 클로르펜빈포스, 클로르메포스, 클로르피리포스-메틸, 코우마포스, 시아노포스, 데메톤-S-메틸, 디아지논, 디클로르보스/DDVP, 디크로토포스, 디메토에이트, 디메틸빈포스, 디술포톤, EPN, 에티온, 팜푸르, 페니트로티온, 포스티아제이트, 헵테노포스, 이미시아포스, 이소펜포스, 이소프로필 O-(메톡시아미노티오포스포릴) 살리실레이트, 이속사티온, 말라티온, 메카르밤, 메티다티온, 메빈포스, 모노크로토포스, 날레드, 오메토에이트, 파라티온-메틸, 펜토에이트, 포레이트, 포스메트, 포스파미돈, 폭심, 피리미포스-메틸, 프로페노포스, 프로페탐포스, 프로티오포스, 피라클로포스, 피리다펜티온, 퀴날포스, 술포텝, 테부피림포스, 테메포스, 테르부포스, 테트라클로르빈포스, 티오메톤, 및 트리클로폰; (2) GABA 게이트 클로라이드 채널 길항제, 예컨대, 예를 들어, 시클로디엔-유기 염소, 예를 들어 클로르단 및/또는 페닐피라졸; (3) 나트륨 채널 조정제/전압 게이트 나트륨 채널 차단제, 예컨대, 예를 들어, 피레트로이드, 예를 들어, 아크리나트린, 알레트린, d-시스-트랜스 알레트린, d-트랜스 알레트린, 비펜트린, 비오알레트린, 비오알레트린 s-시클로펜테닐 이성질체, 비오레스메트린, 시클로프로트린, 시할로트린, 람다-시할로트린, 감마-시할로트린, 엠펜트린 [(EZ)-(IR)-이성질체], 에스펜발레레이트, 에토펜프록스, 펜프로파트린, 펜발레레이트, 플루시트리네이트, 플루메트린, 타우-플루발리네이트, 할펜프록스, 이미프로트린, 카데트린, 페르메트린, 페노트린 [(1R)-트랜스-이성질체], 프랄레트린, 피레트린 (피레트룸), 레스메트린, 테플루트린, 테트라메트린, 테트라메트린 [(1R)-이성질체)], 및 트랜스플루트린 또는 DDT 또는 메톡시클로르; (4) 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR) 효능제, 예컨대, 예를 들어, 네오니코티노이드, 예를 들어, 디노테푸란, 니텐피람, 및 티아메톡삼 또는 니코틴 또는 술폭사플로르; (5) 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 알로스테릭 활성화제, 예컨대, 예를 들어, 스피노신, 예를 들어, 스피네토람 및 스피노사드; (6) 클로라이드 채널 활성화제, 예컨대, 예를 들어, 아베르멕틴/밀베미신, 예를 들어 아바멕틴, 에마멕틴 벤조에이트, 레피멕틴 및 밀베멕틴; (7) 미성숙 호르몬 모방제, 예컨대, 예를 들어, 미성숙 호르몬 유사체, 예를 들어, 히드로프렌, 키노프렌 및 메토프렌 또는 페녹시카르브 또는 피리프록시펜; (8) 공지되지 않거나 비-특이적 작용 메커니즘을 갖는 활성 화합물, 예컨대, 예를 들어, 알킬 할라이드, 예를 들어, 메틸 브로마이드 및 다른 알킬 할라이드; 또는 클로로피크린 또는 술푸릴 플루오라이드 또는 보락스 또는 타르타르 구토제; (9) 선택적 섭식 기피제, 예를 들어 피메트로진 또는 플로니카미드; (10) 좀진드기 성장 억제제, 예를 들어 클로펜테진, 헥시티아족스 및 디플로비다진 또는 에톡사졸; (11) 곤충 장 막의 미생물 파괴자, 예를 들어 바실루스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 아종 이스라엘렌시스(israelensis), 리시니바실루스 스파에리쿠스(Lysinibacillus sphaericus), 바실루스 투링기엔시스 아종 아이자와이(aizawai), 바실루스 투링기엔시스 아종 쿠르스타키(kurstaki), 바실루스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스(tenebrionis), 및 Bt 식물 단백질: CrylAb, CrylAc, CrylFa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Abl; (12) 산화적 인산화 억제제, ATP 파괴자, 예컨대, 예를 들어, 디아펜티우론 또는 유기 주석 화합물, 예를 들어 아조시클로틴, 시헥사틴 및 펜부타틴 옥사이드 또는 프로파르가이트 또는 테트라디폰; (13) H 양성자 구배를 방해함으로써 작용하는 산화적 인산화 분리제, 예컨대, 예를 들어, 클로르페나피르, DNOC 및 술플루라미드; (14) 니코틴성 아세틸콜린 수용체 길항제, 예컨대, 예를 들어, 벤술탑, 카르탑 히드로클로라이드, 티오시람, 및 티오술탑-소듐; (15) 키틴 생합성 억제제, 유형 0, 예컨대, 예를 들어, 비스트리플루론, 클로르플루아주론, 디플루벤주론, 플루시클록수론, 플루페녹수론, 헥사플루무론, 루페누론, 노발루론, 노비플루무론, 및 테플루벤주론; (16) 키틴 생합성 억제제, 유형 1, 예를 들어 부프로페진; (17) 탈피 억제제 (특히 디프테라(Diptera)의 경우, 즉 디프테란), 예컨대, 예를 들어, 시로마진; (18) 엑디손(Ecdysone) 수용체 효능제, 예컨대, 예를 들어, 크로마페노지드, 할로페노지드, 메톡시페노지드 및 테부페노지드; (19) 옥토파민성 효능제; (20) 복합체-III 전자 수송 억제제, 예컨대, 예를 들어, 히드라메틸논 또는 아세퀴노실 또는 플루아크리피림; (21) 예를 들어, METI 살비제 군으로부터의 복합체-I 전자 수송 억제제, 예를 들어, 페나자퀸, 펜피록시메이트, 피리미디펜, 피리다벤, 테부펜피라드 및 톨펜피라드 또는 로테논 (데리스); (22) 전압 게이트 나트륨 채널 차단제, 예를 들어 인독사카르브 또는 메타플루미존; (23) 아세틸-CoA 카르복실라제의 억제제; (24) 복합체-IV 전자 수송 억제제, 예컨대, 예를 들어, 포스핀, 예를 들어, 알루미늄 포스피드, 칼슘 포스피드, 포스핀 및 아연 포스피드 또는 시아니드; (25) 복합체 II 전자 수송 억제제, 예컨대, 예를 들어, 시에노피라펜 및 시플루메토펜; (26) 리아노딘 수용체 이펙터, 예컨대, 예를 들어, 디아미드, 예를 들어, 상표명 RYNAXYPYR™으로써 공지되기도 하는 클로란트라닐리프롤, 및 시안트라닐리프롤, 또는 상기 확인된 화합물 또는 화합물의 클래스 중 하나 이상의 임의의 조합.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 농업용으로 사용되는 다른 공지된 합성 또는 자연적으로 발생하는 살곤충제가 또한, 본 개시내용에 따른 조성물, 식물 종자 또는 접종물에 포함되기 위해 선택될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
본원에 기재된 내생포자 디스플레이 플랫폼을 사용하는 스크리닝 방법
본원에 개시된 융합 단백질 구축물 및 재조합 파에니바실루스 세포는 본 개시내용 전반에 걸쳐 논의된 바와 같이, 신규 및/또는 변형된 식물 속성을 생성하는 이종 단백질의 고 처리량 스크리닝을 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 이러한 속성은 식물 수확량에 있어서 상업적으로 중요한 개선 및 다른 식물 특징, 예컨대: 변경된 식물 단백질 또는 오일 함량/조성, 변경된 식물 탄수화물 함량/조성; 변경된 종자 탄수화물 함량/조성, 변경된 종자 오일 또는 단백질 조성; 환경 또는 화학적 스트레스에 대한 증가된 내성 (예를 들어, 추위 또는 열, 가뭄, 살곤충제 또는 제초제에 대한 내성); 지연된 노화 또는 질환 저항; 성장 개선, 건강 증진; 초식 동물 내성; 개선된 질소 고정 또는 질소 활용; 개선된 뿌리 구조 또는 길이; 개선된 물 사용 효율; 증가된 바이오매스; 증가된 종자 중량; 증가된 어린가지 증가; 증가된 수확량; 변형된 알맹이 질량 또는 수분 함량; 금속 내성; 병원체 또는 해충 저항성; 광합성 능력 개선; 내염성; 활력 개선; 성숙한 종자의 증가된 건조 및/또는 신선한 중량, 식물 당 성숙한 종자의 증가된 수; 증가된 엽록소 함량; 참조 식물/종자와 비교한 대사 산물 수준 또는 대사체에서의 검출 가능한 조정; 참조 식물/종자와 비교한 전사체 수준 또는 전사체에서의 검출 가능한 조정; 참조 식물과 비교한 단백질 수준 또는 프로테옴에서의 검출 가능한 조정; 및 상기 형질 또는 속성 중 임의의 것의 조합을 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 목록은 비-제한적 예의 세트로서 의도된다. 통상의 기술자는 본원에 개시된 고 처리량 전달 플랫폼이 본 개시내용의 다른 곳에서 논의되거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지된 다양한 다른 식물 형질 및 속성을 스크리닝하는 데 적합하다는 것을 인지할 것이다.
본 개시내용에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 내생포자는 시험관 내에서 성장한 식물 세포, 숙주 식물 종자, 묘목, 또는 생장 또는 달리 성숙한 식물에 적용될 수 있다. 이종 단백질은 차례로, 시험관 내에서 성장한 식물 세포, 숙주 식물 종자, 묘목 또는 성숙한 식물에 형질 또는 속성을 부여하거나 또는 이를 변형시킬 수 있다. 선택된 실시양태에서, 파에니바실루스 내생포자는 종자를 접종하는 데 사용될 수 있고, 이로써 생성된 새로운 또는 변형된 형질 또는 속성은 즉시 명백할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서는 숙주 식물의 발달의 후기 단계까지 명백하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 전달하기 위해 사용되는 파에니바실루스 박테리아는 숙주 식물 종에 대해 외인성이다. 다른 한편으로, 선택된 파에니바실루스 박테리아는 숙주 식물 종을 콜로니화하는 것으로 공지된 내인성 체내 기생 식물이다. 숙주 식물은 본원에 개시된 임의의 적합한 식물 (외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 침엽수 등)일 수 있다.
융합 단백질을 전달하기 위해 사용되는 재조합 파에니바실루스 박테리아는 숙주 식물 종자, 묘목, 생장 또는 달리 성숙한 식물 표본을 코팅 또는 분무를 통해 접종하거나, 또는 관련 기술 분야에 공지된 숙주 식물에 내생포자를 적용하는 임의의 다른 방법을 통해 접종하는 데 사용될 수 있다. 액체로서, 예를 들어, 용액 또는 현탁액으로서 적용될 때, 파에니바실루스 내생포자는 수용액에 혼합되거나 현탁될 수 있다. 적합한 액체 희석제 또는 담체는 수용액, 페트로리움 증류액 또는 다른 액체 담체를 포함한다. 고형 조성물은 적절하게 분할된 고형 담체, 예컨대 토탄, 밀, 밀기울, 질석, 점토, 활석, 벤토나이트, 규조토, 풀러 토, 저온 살균된 토양 등 내에 및 상에 파에니바실루스 내생포자를 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 제형이 습윤성 분말을 포함하는 경우, 분산제, 예컨대 비이온성, 음이온성, 양쪽성 또는 양이온성 분산제 및 유화제가 사용될 수 있다.
파에니바실루스 내생포자는 숙주 식물 종자의 표면에 또는 생장 식물의 잎과 줄기에 직접적으로 또는 부가의 성분을 포함하는 조성물의 일부로서 직접적으로 적용될 수 있다. 부가의 성분은 콜로니화 속도를 증강시키는 하나 이상의 화합물, 식물 성장 또는 건강을 증강시키는 화합물, 살충제 또는 제초제, 또는 식물의 재배 및 성장을 촉진시키기에 적합한 것으로서 본원에 개시된 임의의 다른 화합물을 포함 할 수 있다. 더욱이, 조성물은 상이한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 변형시킨 부가의 파에니바실루스 내생포자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 식물 성장 촉진 인자를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 제1의 파에니바실루스 내생포자뿐만 아니라 살충제 내성을 증강시키는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 제2의 파에니바실루스 내생포자를 포함할 수 있다.
선택된 실시양태에서, 숙주 식물의 종자 상에 코팅되는 재조합 파에니바실루스 내생포자는 종자의 생장 상태로의 발아 시, 식물의 상이한 조직에 국재화될 수 있다. 예를 들어, 재조합 파에니바실루스 세포는 뿌리, 막뿌리, 씨뿌리, 뿌리 털, 어린가지, 잎, 꽃, 싹, 꽃술, 분열 조직, 꽃가루, 암술, 난소, 수술, 열매, 가는줄기, 뿌리 줄기, 결절, 괴경, 트리콤, 공변 세포, 배수 조직, 꽃잎, 꽃받침, 영(glume), 꽃대, 관다발 부름켜, 체관부 및 목질부를 포함한, 식물 내의 조직 중 어느 하나에 국재화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 뿌리 및/또는 뿌리 털에 국재화될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 광합성 조직, 예를 들어, 식물의 잎 및 어린가지; 또는 식물의 관다발 조직, 예를 들어, 목질부 및 체관부에 국재화될 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 생식 조직 (꽃, 꽃가루, 암술, 난소, 수술, 열매)에 국재화될 수 있다. 또한 또 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 열매 또는 종자 조직에 콜로니화한다. 또한 또 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 표면 (예를 들어, 식물 외부 또는 식물의 엽권)에 존재하도록 식물에 콜로니화할 수 있다. 또한 다른 실시양태에서, 재조합 파에니바실루스 세포는 식물의 실질적으로 모든, 또는 모든 조직에 국재화될 수 있다.
숙주 식물에 적용하기 위해 설계된 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물은 종자 코팅 조성물, 뿌리 처리 또는 엽상 적용 조성물을 포함할 수 있다. 종자 코팅 조성물, 또는 뿌리 처리, 또는 엽상 적용 조성물은 살진균제, 항균제, 제초제, 살선충제, 살곤충제, 식물 성장 조절제, 영양소 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 종자 코팅 조성물, 또는 뿌리 처리, 또는 엽상 적용 조성물은 농업적으로 허용되는 담체, 점착 부여제, 미생물 안정화제 또는 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 선택된 실시양태에서, 종자 코팅 조성물, 또는 뿌리 처리, 또는 엽상 적용 조성물은 리조비움 박테리아 제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 제2 박테리아를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 계면 활성제를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 계면 활성제는 0.01% v/v 내지 10% v/v의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 계면 활성제는 0.1% v/v 내지 1% v/v의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 미생물 안정화제 (예를 들어, 안정화제)를 포함할 수 있다.
접종 시, 처리된 숙주 식물 (예를 들어, 처리된 종자, 묘목, 생장 또는 달리 성숙한 식물)은 신규 또는 변형된 속성 또는 형질의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 처리 후 임의의 시점에 수행될 수 있다. 선택된 실시양태에서, 종자는 처리될 수 있고, 종자가 발아되거나 또는 보다 발달된 발생 단계에 도달할 때까지 스크리닝이 수행되지 않을 수 있다. 다른 실시양태에서, 종자, 묘목 또는 생장 식물은 처리될 수 있고, 이와 같이 처리된 식물이 새로운 또는 변형된 형질 또는 속성에 대해 스크리닝될 샘플을 포함할 수 있는 수확된 최종 산물을 생산할 때까지 스크리닝이 수행되지 않을 수 있다.
스크리닝 동안, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 다양한 시험이 수행되어, 처리된 숙주 식물에 어떤 이점 (존재하는 경우)이 부여되는지를 결정할 수 있다. 생체내 스크리닝 검정은 식물 또는 종자의 표현형 형질 또는 속성을 측정하는 시험 (예를 들어, 식물 성장 속도 또는 높이; 작물 수확량; 환경 스트레스, 예컨대 열, 추위 또는 염도에 대한 내성; 생물학적 병원체 또는 곤충 해충에 대한 내성; 화학적 처리, 예컨대 살곤충제 또는 제초제에 대한 내성을 측정하는 검정)을 포함한다. 시험관내 스크리닝 검정은 식물 추출물, 조직 샘플, 세포 샘플 등의 조성 또는 특성을 측정하는 시험을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 시험관내 스크리닝은 처리된 숙주 식물의 세포 또는 조직에서 발견되는 주어진 단백질, 효소, 유전자 전사체, 대사 산물 또는 다른 화합물의 양 또는 활성의 정제 및 측정을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 스크리닝은 육안에 의해서든 아니면 현미경검사를 통해서든지 간에, 처리된 숙주 식물의 세포 또는 조직의 구조의 육안 검사를 포함할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 스크리닝은 처리된 숙주 식물에 대한 검정과 달리, 본 개시내용에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 재조합 파에니바실루스 내생포자 또는 생장 세포의 검정을 포함할 수 있다. 이들 실시양태에서, 파에니바실루스 과 구성원 세포 또는 내생포자는, 예컨대 복합 인산염 또는 복합 철을 방출시킬 수 있는 능력 (예를 들어, 시드로포어의 분비를 통해); 식물 호르몬의 생산; 항균, 항진균 또는 살곤충 또는 살선충 화합물의 생산; ACC 데아미나제, 아세토인, 펙티나제, 셀룰라제 또는 RNase의 생산 및/또는 분비이나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 활성에 대한 시험관내 검정을 수행할 수 있다. 생장 식물이 아닌 파에니바실루스 과 구성원 세포 또는 내생포자에 대한 스크리닝 방법은, 이러한 방법이 처리된 숙주 식물에 대한 방법보다 더 신속하게 유용한 이종 단백질을 검출할 수 있다는 점에서 특히 유리하다.
포자 표면 표적화 서열을 확인하는 방법
본 개시내용은 파에니바실루스에서 확인된 여러 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 개시하며, 이는 본원에 기재된 바와 같이 이종 단백질에 대한 포자 표면 디스플레이 플랫폼의 일부로서 유용하다. 그러나, 본 개시내용은 이들 특정한 서열, 그의 단편 및 변이체로 제한되지 않는다. 본 개시내용에 따른 스크리닝 방법은 내생포자 디스플레이 플랫폼의 일부로서 또는 다른 목적으로 유사하게 유용할 수 있는 부가의 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 확인하기 위해 파에니바실루스 및 다른 내생포자 형성 박테리아 속에 광범위하게 사용될 수 있다. 한 실시양태에서에서, 본 발명에 유용한 내생포자 형성 박테리아는 도 1에 도시된 바와 같이, 단백질분해적으로 저항성인 털 유사 구조를 갖는다. 예를 들어, 본원에 개시된 스크리닝 방법은 리시니바실루스, 비리디바실루스, 및 브레비바실루스의 내생포자 형성 구성원에서 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
일부 예시적인 측면에서, 이러한 서열은 "글리신--임의의 잔기--임의의 잔기"의 다수의 콜라겐-유사 삼중자 아미노산 반복부 ("GXX 반복부")를 갖는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 ("ORF")에 대하여 파에니바실루스 또는 또 다른 관심 내생포자 형성 박테리아의 게놈을 스크리닝하고; 상기 단백질이 포자 표면에 국재화되는지를 현미경검사에 의해 또는 실험적으로 결정함으로써 확인될 수 있다. 이들 GXX 반복부는 폴리펩티드 서열의 인접한 영역 또는 별도의 영역일 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 서열은 특정한 수의 인접한 또는 전체 GXX 반복부 (예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 GXX 반복부)에 대하여 스크리닝될 수 있다. 일부 측면에서, 단백질 국재화는 시각적으로 (예를 들어, 투과 전자 현미경검사를 사용함) 또는 실험적으로 (예를 들어, 질량 분광측정법을 사용함) 결정된다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열을 확인하는 방법은 파에니바실루스 또는 다른 박테리아 세포에서 추정 N-말단 표적화 서열 및 리포터 (예를 들어, GFP)를 포함하는 융합 단백질을 발현시킴으로써 추정 N-말단 표적화 서열을 시험하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 전술한 스크리닝 공정을 통해 확인된 단백질의 N-말단 부분을 포함하는, 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속 (예를 들어, 리시니바실루스, 비리디바실루스, 및 브레비바실루스)로부터의 포자 표면 표적화 서열을 제공한다. 이러한 표적화 서열의 N-말단 표적화 서열은 내인성 서열의 첫 번째 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 아미노산, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열은 내인성 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 변이체, 또는 그의 단편이다. 이들 방법에 따라 확인된 파에니바실루스 및 다른 박테리아 속에서의 포자 표면 표적화 서열은 본원에 기재된 다양한 실시양태 중 임의의 것에 따른 이종 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
하기 비-제한적 예는 본 개시내용을 추가로 예시하기 위해 제공된다.
실시예
실시예 1: 내생포자 디스플레이에 적합한 콜라겐-유사 포자 표면 단백질을 확인하기 위한 일반적인 프로토콜
파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 완전한 게놈을 콜라겐-유사 GXX 반복부를 함유하는 ORF에 대해 검색하였다. 이어서 콜라겐-유사 포자 표면 단백질을 투과 전자 현미경검사에 의해 가시화하였다 (도 1). 콜라겐-유사 포자 표면 단백질의 존재는 또한 질량 분광측정법에 의해 실험적으로 확증되었다. 간략하게, 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 포자를 트립신으로 소화시켜 표면 단백질을 제거하였다. 포자를 원심 분리에 의해 제거하고 상청액을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 콜라겐-유사 포자 표면 단백질의 존재를 검증하였다. 이러한 일반적인 프로토콜은 서열식별번호: 1-10으로써 확인된 N-말단 표적화 서열을 갖는 내인성 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 단백질을 확인하기 위해 사용되었다. 동일한 방법을 사용하여 비리디바실루스, 리시니바실루스 또는 브레비바실루스로부터의 포자 표면 단백질 및 상응하는 N-말단 표적화 서열을 확인할 수 있다.
실시예 2: 녹색 형광 단백질 (GFP)을 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜.
융합 구축물을 생성하기 위해, GFP를 코딩하는 유전자를, 유전자 합성에 의해 상기 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 상기 개시된 N-말단 표적화 서열의 아미노산 (서열식별번호: 1)을 코딩하는 DNA 절편과 융합시키고, 이. 콜라이(E. coli)/파에니바실루스 셔틀 벡터인 pAP13 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 벡터 구축물을 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 내로 도입하였다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성될 때까지 30℃에서 쉐퍼의 포자형성 배지 브로스에서 성장시켰다. 이어서, 융합 구축물을 발현하는 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 포자를 표면 형광 현미경검사에 의해 검사하였다. GFP는 융합 구축물을 발현하는 포자에서 볼 수 있다 (도 2a). 파에니바실루스 종 NRRL B-50972 포자를 또한 유동 세포계수법에 의해 검사하였다. 융합 구축물을 발현하는 포자는 야생형 포자보다 훨씬 더 형광성이다 (도 2b).
실시예 3: 임의의 관심 단백질을 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜.
파에니바실루스 세포 (예를 들어, 파에니바실루스 종 NRRL B-50972)는 본 개시내용에 따른 N-말단 포자 표면 표적화 서열을 갖는 융합 구축물을 생산하기 위해 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 배양, 형질전환 및 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 질량 분광측정법 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 생화학적 또는 시각적 수단에 의해 진행될 수 있다 (예를 들어, 관심 단백질은 GFP 또는 또 다른 선택/스크리닝 태그로 태그부착될 수 있다). 융합 구축물을 생성하는 데 사용되는 N-말단 표적화 서열은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 또는 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30 중 임의의 것의 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, N-말단 표적화 서열은 폴리펩티드를 포자 표면에 표적화할 수 있는, 서열식별번호: 2 및 8의 쌍을 이룬 정렬에서 동일한 잔기에 상응하는 하나 이상의 잔기를 갖는 서열을 포함할 수 있다 (도 3). 유사하게, 도 3과 같이 제공된 서열식별번호: 2 및 8의 쌍을 이룬 정렬에서 동일한/보존된 잔기에 상응하는 하나 이상의 잔기를 갖는 서열을 포함하는 N-말단 표적화 서열이 사용될 수 있다.
예를 들어, N-말단 표적화 서열은 M-X-V-X-S-T-G-P-I-X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X-X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V-L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T-L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X (서열식별번호: 31) (여기서, "X"는 임의의 아미노산을 나타냄)를 포함하거나, 또는 그의 임의의 연속 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개의 잔기 절편을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, N-말단 표적화 서열은 M-X-V-X-S-T-G-P-I-X-N-X-X-V-X-G-X-R-P-T-X-X-V-T-V-K-I-D-N-R-D-X-V-N-S-S-X-V-L-I-X-G-F-X-L-N-G-X-R-T-L-Y-V-X-X-X-X-X-V-X-X-N-X-V-I-T-X-X-X-X-A-X-X-X-X-F-E-F-V-F-T-T-X-X-X-X-E-N-E-X-Q-X-S-V-W-G-K-X-X-X-G-Q-L-V-X-A-H-R-X-V-S-X-E-L-L-V-X-X-X-X (서열식별번호: 32) (여기서, "X"는 임의의 아미노산을 나타냄)를 포함하거나, 또는 그의 임의의 연속 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120개의 잔기 절편을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 선택된 N-말단 표적화 서열은 이들 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 공유할 수 있고 융합 구축물을 포자 표면에 표적화할 수 있다.
실시예 4: 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분에 식물 성장 촉진 화합물의 생산에 관여하는 융합 단백질을 전달하는 방법.
식물 성장 촉진 화합물의 생산에 책임이 있는 효소는 본원에 개시된 파에니바실루스 내생포자 전달 시스템을 사용하여 식물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 부탄디올 데히드로게나제는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환시킨다. 2,3-부탄디올은 식물 성장 촉진 화합물이다. 이러한 효소를 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에 점적 또는 분무에 의해 전달될 수 있다.
실시예 5: 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자, 묘목, 식물, 또는 식물 부분에 단일 파에니바실루스 내생포자 상의 다수의 융합 단백질을 전달하는 방법.
단일 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 2개 이상의 이종 융합 단백질을 디스플레이할 수 있다. 이것은 2개 이상의 별도의 융합 단백질을 구축함으로써 달성된다. 파에니바실루스 내생포자 표면 상에 디스플레이될 각각의 이종 단백질에 대한 코딩 서열은 그의 천연 프로모터의 제어 하에 N-말단 표적화 서열과 별도로 융합된다. 융합 단백질 구축물은 동일한 플라스미드 벡터 또는 상이한 플라스미드 벡터 내로 클로닝될 수 있고 전기 천공에 의해 파에니바실루스 구성원 내로 도입될 수 있다. 이로써 생성된 파에니바실루스 내생포자는 포자 표면 상에 두 이종 단백질의 혼합물을 발현할 것이다. 이것은 해충 저항성을 완화시키기 위해 다수의 단백질성 무척추 동물 독소를 적층시키는 데 특히 유용하다.
실시예 6: 각각 하나 이상의 상이한 융합 단백질을 디스플레이하는, 다수의 재조합 파에니바실루스 내생포자의 조합을 사용하여 종자, 묘목, 식물, 또는 식물 부분에 하나 이상의 상이한 융합 단백질을 제공하는 방법.
특정 경우에, 하나 이상의 상이한 이종 단백질 (상기 기재된 바와 같음)을 각각 발현하는 둘 이상의 파에니바실루스 내생포자를 조합하여 전달하는 것이 제공된다. 예를 들어, 식물의 뿌리 주위의 구역에 질소 고정 효소를 전달하는 것은, 화학적 질소 비료의 필요성을 감소시킨다. 박테리아에서의 질소 고정을 위해서는, 종에 따라 최소 8개 또는 9개의 상이한 효소와 잠재적으로 20개 이상의 상이한 효소가 필요할 수 있다. 여기서, 질소 고정 경로의 상이한 효소 성분을 각각 발현하는 파에니바실루스 내생포자의 조합의 전달이 유용할 수 있다. 예를 들어, NifH, NifD 및 NifK를 이종적으로 디스플레이하는 파에니바실루스 내생포자는 NifE, NifN, 및 NifD를 이종적으로 디스플레이하는 파에니바실루스 내생포자와의 혼합물로 조합되어 뿌리 주위의 구역에 전달될 수 있다.
실시예 7: 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에, 무척추 동물성 식물 해충을 사멸시키는 무척추 동물 독소를 전달하는 방법.
곤충 또는 선충을 포함하나 이에 제한되지는 않는 무척추 동물에 대해 길항성인 단백질성 독소는 파에니바실루스 내생포자 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 둘 다 살곤충 및 살선충인 Cry5B 및 Cry21A를 포함하나 이에 제한되지는 않는 Cry 독소는 파에니바실루스 내생포자에서의 발현을 위해 N-말단 표적화 서열과 융합될 수 있다. Cry 독소 또는 다른 단백질성 무척추 동물 독소를 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나, 또는 무척추 동물 식물성 병원체에 대항한 보호를 위해 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에 전달될 수 있다.
실시예 8: 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에, 박테리아성 식물 해충을 향해 길항성인 펩티드, 단백질 또는 효소를 전달하는 방법.
박테리오신은 다른 박테리아에 대한 길항 활성을 갖는 박테리아에 의해 생산된 작은 펩티드이다. 박테리오신은 큰 비-리보솜 펩티드 신테타제에 의해 합성되는 다른 항미생물 분자 (예를 들어, 바시트라신)와 달리 리보솜에 의해 합성된다는 사실로 인해, 박테리오신은 파에니바실루스 내생포자 시스템을 사용하여 전달하기에 특히 적합하다. 하나 이상의 박테리오신에 대한 코딩 서열은 파에니바실루스 내생포자에서의 발현을 위해 N-말단 표적화 서열과 융합될 수 있다. 박테리오신을 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나 또는 박테리아성 식물 병원균에 대항한 보호를 위해 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에 전달될 수 있다.
실시예 9: 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에, 진균성 식물 해충을 향해 길항성인 펩티드, 단백질 또는 효소를 전달하는 방법.
진균의 1차 세포벽 성분은 키틴이다. 키티나제는 키틴을 분해하는 효소이며, 자신의 세포벽을 파괴함으로써 진균성 식물 병원체에 대항하여 보호하기 위해 파에니바실루스 내생포자의 표면 상에 발현될 수 있다. 키티나제를 발현하는 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에 점적 또는 분무에 의해 전달될 수 있다.
실시예 10: 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 종자 처리로서 또는 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에, 박테리아, 진균 또는 식물 영양원을 분해 또는 변형시키는 효소를 전달하는 방법.
박테리아, 진균 또는 식물 영양원의 분해 또는 변형에 책임이 있는 효소는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 복합 폴리사카라이드를 분해하는 글리코시드 히드롤라제를 사용하여, 이러한 (또는 또 다른) 관심 효소를 발현하는 재조합 파에니바실루스 내생포자로 식물 또는 종자를 처리함으로써 유익한 리조박테리아를 위한 이용 가능한 단순 당을 만들 수 있다.
실시예 11: 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물 성장 촉진 생물 방제제로부터 유래된 게놈 DNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 식물 성장 촉진 생물 방제제에 대한 반응을 평가하는 방법.
오늘날 사용되고 있는 많은 생물 방제 균주는 외인성 DNA 흡수에 대해 다루기 힘드므로, 연구자들은 상기 균주의 표적화된 유전적 변형을 생성할 수 없게 된다. 이러한 문제로 인해, 이들 생물 방제 균주의 식물 성장 촉진 효과의 작용 메커니즘을 밝히는 것은 믿을 수 없을 정도로 어려운 일이다. 파에니바실루스 내생포자는 생물 방제 균주의 근원적인 식물 성장 촉진 효과에 책임이 있는 특이적 유전자를 확인하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. 먼저, N-말단 표적화 서열 및 천연 프로모터를 적합한 이. 콜라이/바실루스 셔틀 벡터 (예를 들어, pHP13) 내로 클로닝하면, 파에니바실루스 내생포자 상에서의 이종 단백질 발현에 적합한 벡터가 초래된다. 모든 클로닝 단계 및 플라스미드 번식은 이. 콜라이에서 수행된다. 다음으로, 전체 gDNA는 표적 식물 성장 촉진 생물 방제 균주로부터 추출된다. gDNA는 (효소적으로 또는 음파적으로) 단편으로 전단되고, 파에니바실루스 내생포자 상에서의 이종 단백질의 발현을 위해 상기 기재된 벡터에 라이게이션되어 관심 생물 방제 균주로부터 유래되는 모든 유전 물질로 구성된 gDNA 라이브러리를 생성한다. 이로써 생성되는 벡터 라이브러리를 전기 천공에 의해 파에니바실루스 구성원 내로 도입하고, 박테리아를 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 선택하기 위해 적절한 항생제 선택 작용제를 함유하는 한천 플레이트 상으로 플레이팅한다. 표적 생물 방제 균주의 gDNA의 상이한 단편을 각각 발현하는 개별 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 식물 성장 촉진 효과에 대해 평가한다. 이들 효과는 증강된 녹지 향상, 개선된 발아, 증가된 식물 활력, 증가된 뿌리 길이, 증가된 뿌리 질량, 증가된 식물 높이, 증가된 잎 면적 또는 해충 저항성을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 언급된 식물 건강 파라미터를 조정하는 것으로 밝혀진 파에니바실루스 내생포자 형질전환체 내의 벡터는, 관찰된 식물 성장 촉진 효과에 책임이 있는 생물 방제 균주로부터 유래되는 유전적 결정 인자를 확인하기 위해 서열 분석될 수 있다.
실시예 12: 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 무척추 동물성, 박테리아성, 및 진균성 식물 병원체에 대항하여 길항적인 새로운 또는 특징 규명되지 않은 독소를 확인하는 방법.
오늘날 사용되고 있는 많은 생물 방제 균주는 외인성 DNA 흡수에 대해 다루기 힘드므로, 연구자들은 상기 균주의 표적화된 유전적 변형을 생성할 수 없게 된다. 이러한 문제로 인해, 생물 방제 균주가 무척추 동물성, 박테리아성, 및 진균성 식물 병원체에 대해 독성인 작용 메커니즘을 밝히는 것은 믿을 수 없을 정도로 어려운 일이다. 파에니바실루스 내생포자는 생물 방제 균주의 근원적인 식물 보호 효과에 책임이 있는 특이적 유전자를 확인하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. 먼저, N-말단 표적화 서열 및 천연 프로모터를 적합한 이. 콜라이/바실루스 셔틀 벡터 (예를 들어, pHP13) 내로 클로닝하면, 파에니바실루스 내생포자 상에서의 이종 단백질 발현에 적합한 벡터가 초래된다. 모든 클로닝 단계 및 플라스미드 번식은 이. 콜라이에서 수행된다. 다음으로, 전체 gDNA는 표적 식물 성장 촉진 생물 방제 균주로부터 추출된다. gDNA는 (효소적으로 또는 음파적으로) 단편으로 전단되고, 파에니바실루스 내생포자 상에서의 이종 단백질의 발현을 위해 상기 기재된 벡터에 라이게이션되어 관심 생물 방제 균주로부터 유래되는 모든 유전 물질로 구성된 gDNA 라이브러리를 생성한다. 이로써 생성되는 벡터 라이브러리를 전기 천공에 의해 파에니바실루스 구성원 내로 도입하고, 박테리아를 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 선택하기 위해 적절한 항생제 선택 작용제를 함유하는 한천 플레이트 상으로 플레이팅한다. 표적 생물 방제 균주의 gDNA의 상이한 단편을 각각 발현하는 개별 파에니바실루스 내생포자 형질전환체를 무척추 동물성, 박테리아성, 및 진균성 식물 병원체에 대한 길항 활성에 대해 평가한다. 상기 식물 병원체에 대해 길항적인 것으로 밝혀진 파에니바실루스 내생포자 형질전환체 내의 벡터는, 관찰된 식물 보호 효과에 책임이 있는 생물 방제 균주로부터 유래되는 유전적 결정 인자를 확인하기 위해 서열 분석될 수 있다.
실시예 13: 병원체로부터 식물을 보호하거나 또는 생육 불가능한 파에니바실루스 내생포자를 사용하여 식물 건강을 개선하기 위해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분을 처리하는 방법.
생육 불가능한 (죽은) 파에니바실루스 내생포자를 수반한 파에니바실루스 내생포자 전달 시스템을 사용하여 식물 건강 증진 단백질/효소 또는 식물 보호 단백질/효소를 전달할 필요가 있을 수 있다. 파에니바실루스 내생포자는 충분한 열 처리, UV 광, 감마선 조사 또는 고압 프로세싱을 통해 불활성화되고 생육 불가능하게 될 수 있다. 이로써 생성되는 생육 불가능한 파에니바실루스 내생포자는 종자 처리 또는 종자 코팅으로서 적용되거나 또는 점적 또는 분무에 의해 종자, 묘목, 식물 또는 식물 부분 주위의 구역에 전달될 수 있다.
실시예 14. 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli )로부터 베타-갈락토시다제 (Β-Gal)를 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜.
융합 구축물을 생성하기 위해, β-gal을 코딩하는 유전자를, 유전자 합성에 의해 상기 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 상기 개시된 N-말단 표적화 서열의 아미노산 (서열식별번호: 1)을 코딩하는 DNA 절편과 융합시키고, 문헌 [Patrick, JE and Kearns, DB. 2008. MinJ (YvjD) is a Topological Determinant of Cell Division in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 70: 1166-1179]에 기재된 pMiniMad 벡터로부터 유래된 이. 콜라이/파에니바실루스 셔틀 벡터 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 벡터 구축물을 문헌 [Kim and Timmusk (2013), "A Simplified Method for Gene Knockout and Direct Screening of Recombinant Clones for Application in Paenibacillus polymyxa," PLoSONE, 8(6): e68092, doi: doi:10.1371/journal.pone.0068092]에 기재된 것과 유사한 전기 천공에 의해 파에니바실루스 폴리믹사 균주 (균주 1) 내로 도입하였다. 표적화 서열을 수반하지 않는 셔틀 벡터를 함유하는 대조군이 또한 제조되었다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성될 때까지 30℃에서 쉐퍼의 포자형성 배지 브로스에서 성장시켰다. 이로써 생성된 배양물을 원심 분리하여 포자로부터 상청액을 분리시켰다. 이어서, 융합 구축물을 발현하거나 또는 비어 있는 셔틀 벡터만을 함유하고 상응하는 상청액을 함유하는 파에니바실루스 폴리믹사 포자를 시험관내 검정에 의해 조사하였다. β-gal은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토-피라노시드 (X-Gal)의 가수분해에 근거한 융합 구축물을 발현하는 포자 상에서 기능적이다. 결과가 하기 표 3에 제시되어 있다.
<표 3>
상청액 및 포자의 베타-갈락토시다제 활성.
Figure pct00010
aX-gal 가수분해는 무색의 경우 (-)로서 스코어링되거나, 또는 β-갈락토시다제에 의한 X-gal의 가수분해를 나타내는 청색의 경우 (+)로서 스코어링되었다.
실시예 15: 바실루스 투링기엔시스로부터의 생장 살곤충 단백질 3 (Vip3) (서열식별번호: 17)을 디스플레이하는 재조합 파에니바실루스 내생포자를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜.
융합 구축물을 생성하기 위해, vip3을 코딩하는 유전자 (서열식별번호: 16)를, 실시예 14에 기재된 이. 콜라이/파에니바실루스 셔틀 벡터로의 깁슨(Gibson) 어셈블리에 의해 파에니바실루스 종 NRRL B-50972의 상기 개시된 N-말단 표적화 서열의 아미노산 (서열식별번호: 1)을 코딩하는 DNA 절편과 융합시켰다. 상기 융합물의 발현은 상기 개시된 N-말단 표적화 서열의 천연 프로모터의 제어 하에 있다. 이로써 생성된 벡터 구축물을 상기 기재된 바와 같이 전기 천공에 의해 파에니바실루스 폴리믹사 균주 (균주 1) 내로 도입하였다. 이어서, 정확한 형질전환체를 포자형성될 때까지 30℃에서 쉐퍼의 포자형성 배지 브로스에서 성장시켰다.
실시예 16: 스포도프테라 엑시구아( Spodoptera exigua )에 대항하여 Vip3을 발현하는 파에니바실루스 폴리믹사 균주의 활성.
실시예 15로부터 Vip3을 발현하는 파에니바실루스 폴리믹사 균주의 살곤충 활성을 스포도프테라 엑시구아 [파밤나방(beet armyworm)]에 대항하여 평가하였다. 비어 있는 벡터 대조군 및 활성 카고 (서열식별번호: 2-Vip3)를 포함한 각각의 파에니바실루스 폴리믹사 균주의 살곤충 활성을 시험하기 위해 96-웰 플레이트 검정을 수행하였다. 균주의 포자는 포자형성될 때까지 쉐퍼의 포자형성 배지 브로스에서 균주를 성장시키고 이로써 생성되는 전체 브로스 배양물을 원심 분리하여 포자를 상청액으로부터 분리시킴으로써 생산되었다. 이어서, 균주로부터의 포자 샘플을, 문헌 [Marrone et al., (1985), "Improvements in Laboratory Rearing of the Southern Corn Rootworm, Diabrotica undecimpuncta howardi Barber (Coleoptera: Chrysomelidae), on an Artificial Diet and Corn," J. Econ. Entomol., 78: 290-293]에 기재된 것과 유사한 한천 기질을 함유하는 96-웰 마이크로 플레이트에 적용하였다. 이어서 포자 샘플을 물에 희석하고 플레이트에 100%, 33%, 11%, 3.7%, 및 1.2%의 농도로 적용하였다.
상기 처리로 인해 건조된 후, 스포도프테라 엑시구아 (파밤나방)로부터의 약 20개의 알을 각각의 웰에 부가하였다. 며칠 후, 살곤충 활성은 처리된 유충의 성장 억제 점수 및 사망률 점수를 평가함으로써 결정되었다. 곤충 성장 억제 점수는 하기 척도에 따라 평가되었다: 1 = 심하게 성장 억제됨; 2 = 고도로 성장 억제됨, 최소한의 성장; 3 = 미처리 대조군보다 약간 더 작음; 4 = 미처리 대조군과 동일한 크기. 곤충 사망률 점수는 하기 척도에 근거한다: 4 = 0-25% 사망률, 3 = 26-50% 사망률, 2 = 51-79% 사망률, 1 = 80-100% 사망률.
표적화된 Vip3 (즉, 서열식별번호: 2-Vip3)을 발현하는 11% 파에니바실루스 포자로 처리된 스포도프테라 엑시구아 유충은, 비어 있는 벡터를 발현하는 동일한 농도의 파에니바실루스 포자로 처리된 것보다 2배 더 큰 성장 억제를 경험하였다 (표 4 참조). 유사하게, 표적화된 Vip3을 발현하는 11% 파에니바실루스 포자로 처리된 유충은 비어 있는 벡터를 발현하는 동일한 농도의 파에니바실루스 포자로 처리된 것보다 1.5배 더 큰 사망률을 경험하였다 (표 5 참조).
<표 4>
처리된 스포도프테라 엑시구아 (파밤나방)의 성장 억제 평가
Figure pct00011
<표 5>
처리된 스포도프테라 엑시구아 (파밤나방)의 사망률 평가
Figure pct00012
달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
개시된 발명은 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 물질로 제한되지 않는 것으로 이해되는데, 이는 이들이 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정한 실시양태만을 설명하기 위한 목적이며 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구 범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience LP <120> PAENIBACILLUS-BASED ENDOSPORE DISPLAY PLATFORM, PRODUCTS AND METHODS <130> BCS179003 WO <150> US 62/587,371 <151> 2017-11-16 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. NRRL B-50972 <400> 1 atggtagtat tatctactgg acctattgca aacgatcctg ttctaggagt cagacccacc 60 caactggtca cagtaaaaat agataaccga gattctgtaa attcttctat cgttttgatc 120 gagggtttta ttttaaacgg tagcagaaca ttatatgtac aacaattagt ggtagtggga 180 ccaaatgcgg ttataacgag gaatttcttt gcaaatgtag acgcatttga attcgttttt 240 accactagcg gaccagcaga gaatgaaact caaatttctg tttggggtaa agatgcattg 300 gggcaattag tacctgccca tcggttagta tctgacgaac ttttaggaac cgatcga 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. 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ctaaagttaa aaaagacggt 600 tctcctgctg atattttaga tgaattaact gaattaactg aacttgctaa atctgtaact 660 aaaaacgatg ttgacggttt cgaattctac cttaacactt tccacgatgt aatggtaggc 720 aacaaccttt tcggtcgctc tgctcttaaa actgctagtg aattaatcac taaagaaaac 780 gttaaaactt ctggtagcga agtaggtaac gtttacaatt tcttaatcgt actaacagct 840 cttcaagcac aagcattcct tactcttact acttgccgta aattacttgg tttagctgat 900 attgattaca cttctatcat gaacgaacat cttaacaaag aaaaagaaga attccgtgtt 960 aatatccttc cgacattatc taacactttt tctaacccaa attacgctaa ggttaaaggt 1020 agcgatgaag atgcaaaaat gatcgtagaa gctaaaccag gtcacgcatt aatcggtttc 1080 gagatctcaa acgacagcat cacagtttta aaagtttatg aagctaaact taaacaaaac 1140 taccaagtag ataaagacag cctgtctgaa gttatctacg gtgacatgga taaattatta 1200 tgtccagatc aaagtgaaca aatctactac actaataaca tcgtattccc aaacgaatat 1260 gtaatcacta aaatcgattt cacaaagaaa atgaaaactc ttcgttacga ggtaactgct 1320 aacttttacg attcatctac tggtgaaatt gatcttaaca agaaaaaagt tgaatcttct 1380 gaagctgaat accgtacatt atctgctaac gatgatggtg tttatatgcc tttaggtgta 1440 atttctgaaa cattcttaac tcctatcaac ggtttcggtc ttcaagctga tgaaaactct 1500 cgcttaatca ctttaacatg caaatcttac cttcgcgaac ttttattagc tacagattta 1560 tctaacaaag aaactaaact tattgttcct ccatctggat tcattagcaa tatcgttgag 1620 aacggtagca ttgaagaaga taaccttgaa ccttggaaag ctaacaacaa aaacgcatac 1680 gttgatcata caggtggtgt taacggtaca aaagctcttt acgtacacaa agatggtggt 1740 attagccaat tcatcggcga caaattaaag ccaaaaactg aatacgttat ccaatacact 1800 gtaaaaggta aaccatcaat tcatttaaaa gatgaaaata ctggttacat tcattacgaa 1860 gacactaaca acaaccttga agattaccaa acaatcaaca aacgttttac aacaggaact 1920 gacttaaaag gtgtttactt aattttaaaa tctcaaaacg gtgacgaggc atggggcgac 1980 aacttcatca ttctagaaat ttctccttct gaaaaattac tttctcctga attaatcaat 2040 actaacaact ggacttctac aggttctact aacatttctg gaaacacttt aacactttac 2100 caaggtggtc gtggtatctt aaaacaaaac ttacaattag attcattctc tacataccgt 2160 gtttatttct ctgtatctgg tgacgctaac gtacgtatcc gtaactctcg tgaagtatta 2220 tttgaaaaac gttacatgtc aggagctaaa gatgtatctg aaatgttcac 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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa 50 55 60 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (54)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (83)..(86) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (92)..(92) <223> Xaa can be any naturally occurring amino 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100 105 110 Glu Leu Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120

Claims (49)

  1. N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은:
    (i) 적어도 15, 30, 45, 60, 75 또는 90개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (ii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29의 적어도 45, 90, 135, 180, 225, 270, 315, 또는 345개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열
    을 포함하고; N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 파에니바실루스(Paenibacillus) 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 하는 것인
    핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 단편이 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29의 첫 번째 뉴클레오티드에서 시작하는 것인 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이, 서열식별번호: 1, 7, 19, 또는 27과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단편이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 1-15, 또는 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105, 또는 1-115를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가:
    (a) 식물 성장 자극 단백질;
    (b) 효소;
    (c) 단백질;
    (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드;
    (e) 치료 단백질; 또는
    (f) 식물 면역 자극 단백질
    을 포함하는 것인 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드 - 폴리펩티드는 N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치함;
    (b) 선택가능한 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 시각화 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (d) 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (e) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드
    를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 파에니바실루스 내생포자가 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에(Paenibacillus terrae), 파에니바실루스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 또는 파에니바실루스 페오리아에(Paenibacillus peoriae)를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자; 또는
    파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아에 의해 형성된 내생포자
    인 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 파에니바실루스 중 적어도 하나에 대해 이종인 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이:
    동일한 조건 하에, 상응하는 최적화되지 않은 서열과 비교해서 파에니바실루스 내생포자에서 더 높은 비율 또는 수준으로 발현되는, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 19, 23, 25, 27, 또는 29와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 코돈 최적화 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 그의 단편
    을 포함하는 것인 핵산 분자.
  10. N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 펩티드를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는:
    (i) 적어도 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 또는 115개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 또는 32의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 또는 32의 적어도 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 또는 115개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드
    를 포함하고; N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 하는 것인
    융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 단편이 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 또는 32의 첫 번째 아미노산에서 시작하는 것인 융합 단백질.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 서열식별번호: 2, 8, 20, 21, 22, 28, 31, 또는 32와 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단편이 서열식별번호: 2, 8, 31, 또는 32의 아미노산 1-15, 또는 1-30, 1-45, 1-60, 1-75, 1-90, 1-105, 또는 1-115를 포함하는 것인 융합 단백질.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드가:
    (a) 식물 성장 자극 단백질;
    (b) 효소;
    (c) 단백질;
    (d) 파에니바실루스에 대해 이종인 폴리펩티드;
    (e) 치료 단백질; 또는
    (f) 식물 면역 자극 단백질
    을 포함하는 것인 융합 단백질.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) N-말단 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드 사이에 위치한, 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 함유하는 폴리펩티드;
    (b) 선택가능한 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 시각화 마커를 포함하는 폴리펩티드;
    (d) 적어도 하나의 단백질 인식/정제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (e) 신호 펩티드와 N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 연결하는 가요성 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드
    를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 파에니바실루스 내생포자가 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종에 의해 형성된 내생포자; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아에 의해 형성된 내생포자인 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 염색체를 포함하는 재조합 파에니바실루스 세포.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터이며, 여기서 벡터는 플라스미드, 인공 염색체, 또는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 벡터:
    (a) 파에니바실루스 세포에서 안정한 유지를 제공하는 복제 기점;
    (b) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 불안정한 유지를 제공하는 복제 기점;
    (c) 파에니바실루스 세포에서 선택적으로 불안정한 유지를 제공하는 온도 감수성 복제 기점;
    (d) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (e) 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 식물 성장 자극 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 파에니바실루스 세포.
  21. 제20항에 있어서, 파에니바실루스 세포가 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 테라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 또는 파에니바실루스 페오리아에를 포함하는 파에니바실루스 종; 또는 파에니바실루스 종의 16S rRNA 유전자와 적어도 97, 98 또는 99% 동일성을 공유하는 16S rRNA 유전자를 보유하는 박테리아인 재조합 파에니바실루스 세포.
  22. a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 포자형성할 수 있는 파에니바실루스 세포를 형질전환시키는 단계; 및
    b) 포자형성 조건 하에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 융합 단백질을 발현시켜, 융합 단백질이 포자형성으로부터 생성된 파에니바실루스 내생포자의 포자 표면을 표적으로 하도록 하는 단계
    를 포함하며, 여기서 N-말단 신호 펩티드는: (i) 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드; (ii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 2, 4, 6, 8 또는 10의 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 것인,
    파에니바실루스 내생포자의 포자 표면 상에 이종 융합 단백질을 디스플레이하는 방법.
  23. a) 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 하나 이상의 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 세포 - N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함함; 및
    b) 적어도 하나의 생물학적 방제제
    를, 임의로 상승작용적 유효량으로 포함하는 조성물.
  24. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제20항 또는 제21항의 재조합 박테리아 세포, 또는 제23항의 조성물로 처리된 종자.
  25. a) 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 재조합 내생포자 생산 파에니바실루스 내생포자 - N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드는 식물 성장 또는 면역 자극 단백질을 포함함; 및
    b) 적어도 하나의 생물학적 방제제
    를, 임의로 상승작용적 유효량으로 동시에 또는 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 식물 성장을 증강시키고/시키거나 식물 건강을 증진시키기 위해 식물, 종자, 식물 부분 또는 식물 주위의 토양을 처리하는 방법.
  26. a) 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을, 파에니바실루스에 의해 영구적으로 또는 일시적으로 콜로니화될 수 있는 종자, 묘목, 또는 생장 식물에 적용하여, 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물을 생산하는 단계;
    b) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물의 형질, 성분, 또는 속성을 검출하고 임의로 측정함으로써 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물을 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 재조합 파에니바실루스 내생포자로 처리된 숙주 식물을 스크리닝하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 스크리닝 단계가 하기:
    a) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플로부터 제조된 추출물에 함유된 하나 이상의 화합물의 존재, 수준, 수준 상의 변화, 활성 또는 국재화를 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 하나의 시험관내 검정; 및/또는
    b) 처리된 종자, 묘목, 또는 생장 식물의 형질, 성분, 또는 속성을 검출하고 임의로 정량화하는 것을 포함하는 적어도 하나의 생체내 검정
    중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  28. a) 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하도록 파에니바실루스 세포를 변형시켜 재조합 파에니바실루스 세포를 생산하는 단계; 및
    b) 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 화합물의 수준 또는 활성을 검출하고 임의로 정량화함으로써 파에니바실루스 세포를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 파에니바실루스 세포에서 발현된 이종 단백질 또는 펩티드를 농업적으로 유의한 특성에 대하여 스크리닝하는 방법.
  29. 재조합 파에니바실루스 세포에 의해 생산된 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자, 인간 또는 동물에게 투여하는 단계
    를 포함하며; 여기서 재조합 파에니바실루스 세포가 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 것인, 식물, 종자, 인간 또는 동물을 처리하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 생존 파에니바실루스 세포가 남아 있지 않도록 조성물이 열-불활성화 또는 멸균된 것인 방법.
  31. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단리된 및/또는 정제된 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  32. 재조합 파에니바실루스 내생포자를 포함하는 조성물을 식물, 종자 또는 필드에 적용하는 단계
    를 포함하며; 여기서 재조합 파에니바실루스 내생포자는, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하도록 변형된 것인, 관심 단백질을 식물, 종자 또는 필드에 전달하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 조성물이:
    a) 심기 전 또는 후에;
    b) 출현 전 또는 후에;
    c) 분말, 현탁액 또는 용액으로서; 및/또는
    d) 조성물이 식물 성장을 자극하거나 또는 해충으로부터 식물을 보호하는 하나 이상의 부가 화합물을 추가로 포함하는 경우에,
    필드에 적용되는 것인 방법.
  34. 서열 "GLY-X-X" (여기서 "X"는 "임의의 아미노산"을 나타냄)을 갖는 다수의 콜라겐-유사 삼중자 반복부를 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 대하여 내생포자 형성 박테리아의 게놈을 스크리닝하는 단계; 및
    스크리닝 단계에서 확인된 단백질 중 적어도 하나가 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면에 국재화되는지를 현미경검사에 의해 또는 실험적으로 결정하는 단계
    를 포함하는, 단백질이 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 하는 N-말단 신호 서열을 확인하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 내생포자 형성 박테리아가, 단백질분해적으로 내성인 털 유사 구조를 포함하는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 포자 표면에 국재화되는 것으로서 결정 단계에서 확인된 적어도 하나의 단백질로부터의 추정 N-말단 신호 서열을 확인하는 단계; 및 내생포자 형성 박테리아에서, 추정 N-말단 신호 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 포자 표면 상에서의 융합 단백질의 발현에 근거하여 융합 단백질을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 선택되는 융합 단백질 내의 리포터 유전자를, 관심 뉴클레오티드 서열로 대체하여 제2 융합 단백질을 생성시키는 단계; 및 내생포자 형성 박테리아에서 제2 융합 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 파에니바실루스 속, 비리디바실루스(Viridibacillus) 속, 브레비바실루스(Brevibacillus) 속 또는 리시니바실루스(Lysinibacillus) 속의 구성원인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 박테리아가 파에니바실루스 속의 구성원인 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 국재화가 투과 전자 현미경검사 또는 질량 분광측정법을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  42. N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 신호 펩티드는:
    a) 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 의해 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면에 국재화되는 것으로 결정된 단백질의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120개의 N-말단 잔기의 연속 절편;
    b) 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 의해 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면에 국재화되는 것으로 결정된 단백질의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120개의 N-말단 잔기의 연속 절편과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열
    을 포함하고; 절편 또는 서열은 절편 또는 서열을 포함하는 융합 단백질이 내생포자 형성 박테리아에서 발현될 때 내생포자 형성 박테리아의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 하는 것인 핵산 분자.
  43. N-말단 신호 펩티드에 대해 이종인 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, N-말단 신호 펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 제42항의 서열 또는 절편을 포함하고, N-말단 신호 펩티드는 융합 단백질이 박테리아 내생포자의 포자 표면을 표적으로 할 수 있게 하는 것인 핵산 분자.
  44. 제43항에 있어서, 박테리아 세포의 포자형성 동안 융합 단백질의 전사를 발생시키는 상류 조절 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  45. 제44항에 있어서, 박테리아 세포가 파에니바실루스 과 구성원인 핵산 분자.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상류 조절 서열이:
    (a) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것;
    (b) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것의 적어도 25, 50, 100, 150개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 서열;
    (c) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것, 또는 그의 25, 50, 100 또는 150개의 뉴클레오티드 단편과 비교해서 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열
    을 포함하며; 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 전사적으로 활성인 프로모터를 포함하는 것인 핵산 분자.
  47. 관심 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (b)에 작동가능하게 연결된, 상류 조절 서열을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (a)을 포함하는, 상류 조절 서열 및 관심 단백질을 코딩하는 핵산 분자이며;
    여기서 관심 단백질은 상류 조절 서열에 대해 이종이고, 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 관심 단백질의 전사를 발생시키는 것인 핵산 분자.
  48. 제47항에 있어서, 박테리아 세포가 파에니바실루스 과 구성원인 핵산 분자.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상류 조절 서열이:
    (a) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것;
    (b) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것의 적어도 25, 50, 100, 150개의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는 서열;
    (c) 서열식별번호: 11-15 중 임의의 것, 또는 그의 25, 50, 100 또는 150개의 뉴클레오티드 단편과 비교해서 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 서열
    을 포함하며; 상류 조절 서열은 박테리아 세포의 포자형성 동안 전사적으로 활성인 프로모터를 포함하는 것인 핵산 분자.
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