BR122021017060B1 - Composição e método para tratamento de uma planta para controlar uma doença - Google Patents

Composição e método para tratamento de uma planta para controlar uma doença Download PDF

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Jeremy BEAU
Daniel M. Joo
Patrick Schwientek
Colleen S. Taylor
Bjorn A. Traag
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Abstract

A presente invenção se refere a uma composição que compreende uma cultura biologicamente pura de uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidina sintetase variante que carece de um domínio de adenilação funcional no terceiro módulo. A presente invenção também fornece uma composição que compreende uma cultura biologicamente pura de uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. ou um extrato livre de célula dos mesmos que compreende pelo menos uma Paeniserina e pelo menos uma Paeniprolixina. Também são fornecidos compostos isolados e métodos de tratamento de uma planta para controlar uma doença de planta com as composições e compostos revelados.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido de Paten te Provisório N° US 62/138,765, depositado em 26 de março de 2015, e Pedido de Patente Provisório N° US 62/232,205, depositado em 24 de setembro de 2015, cujos conteúdos são ambos incorporados no presente documento a título de referência em suas totalidades.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ENVIADA ELETRO-NICAMENTE
[0002] A cópia oficial da listagem de sequência é enviada eletroni camente através da EFS-Web como uma listagem de sequência em formato ASCII com um arquivo com o nome de "BCS159002WO_ST25.txt" criado em segunda-feira, 21 de março de 2016, e que tem um tamanho de 68 quilobytes, e é depositada concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequência contida nesse documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA TÉCNICA
[0003] A presente invenção se refere ao campo de cepas bacteria- nas e sua capacidade de controlar doenças de planta. Em particular, a presente invenção é direcionada a uma cepa de Paenibacillus sp. com um nível relativamente alto de atividade antifúngica de espectro amplo. ANTECEDENTES
[0004] Os fungicidas possuem uma infinidade de usos, que incluem para proteção de cultivo; como conservantes de alimento, ração e cosméticos; e como agentes terapêuticos tanto para aplicações humanas quanto para aplicações veterinárias. A redução de produtividade de cultu- ra, doenças transmitidas por alimentados e infecções fúngicas tanto de humanos quanto de animais são um problema tanto em países desenvolvidos quanto em países em desenvolvimento.
[0005] Os inseticidas ou fungicidas sintéticos são, muitas vezes, não específicos e, portanto, atuam em organismos diferentes dos organismos endereçados, incluindo outros organismos benéficos de ocorrência natural. Por causa de sua natureza química, os mesmos também podem tóxicos e não biodegradáveis. Os consumidores por todo o mundo estão cada vez mais conscientes sobre os problemas potenciais ambientais e de saúde associados aos resíduos de produtos químicos, particularmente, em produtos alimentícios. Isso tem resultado em pressão crescente do consumidor para reduzir o uso ou pelo menos a quantidade de pesticidas químicos (isto é, sintéticos). Dessa forma, há uma necessidade de gerenciar os requisitos da cadeia alimentícia enquanto ainda se permite o controle de peste eficaz.
[0006] Um problema adicional que surge com o uso de inseticidas ou fungicidas sintéticos é que a aplicação repetida e exclusiva de um inseticida ou fungicidas leva muitas vezes à seleção de microorganismos patogênicos resistentes. Normalmente, tais cepas também possuem resistência cruzada a outros ingredientes ativos que têm o mesmo modo de ação. Um controle eficaz dos patógenos com os ditos compostos ativos não é mais, então, possível. Entretanto, os ingredientes ativos que têm novos mecanismos de ação são difíceis e dispendiosos de desenvolver.
[0007] O risco de desenvolvimento de resistência em populações de patógeno bem como questões de saúde humana e ambientais têm promovido interesse na identificação de alternativas para inseticidas e fungicidas sintéticos para gerenciamento de doenças de planta. O uso de agentes de controle biológico é uma alternativa.
[0008] Os peptídeos não ribossômicos, como as fusaricidinas, são bem reconhecidos por suas propriedades antimicrobianas e têm sido usados no campo de proteção de cultivo. Por causa de seu modo de ação, os mesmos também possuem usos potenciais em biofarmacêu- tica e outras aplicações de biotecnologia. As fusaricidinas podem ser isoladas de Paenibacillus sp. e têm uma estrutura em anel composta de 6 resíduos de aminoácido além de ácido 15-guanidino-3- hidroxipentadecanoico. As fusaricidinas isoladas de Paenibacillus polymyxa incluem LI-F03, LI- F04, LI-F05, LI-F07 e LI-F08 (Kurusu K, Ohba K, Arai T e Fukushima K., J. Antibiotics, 40:1506-1514, 1987) e as fusaricidinas adicionais A, B, C e D foram relatadas (Kajimura Y e Kaneda M., J. Antibiotics, 49:129-135, 1996; Kajimura Y e Kaneda M., J. Antibiotics, 50:220-228, 1997).
[0009] Certas fusaricidinas são conhecidas por terem atividade germicida contra fungos patogênicos de planta como Fusarium oxys- porum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae e Penicillium thomii. Algumas fusaricidinas também têm atividade germicida contra bactérias Gram-positivas que incluem Staphylococcus aureus (Kajimura Y e Ka- neda M., J. Antibiotics, 49:129-135, 1996; Kajimura Y e Kaneda M., J. Antibiotics, 50:220-228, 1997). Além disso, verificou-se que as fusari- cidinas específicas têm atividade antifúngica contra Leptosphaeria ma- culans que ocasiona podridão de raiz preta de canola (Beatty PH e Jensen SE., Can. J. Microbiol., 48:159-169, 2002). Há uma necessidade por caracterizar adicionalmente os compostos de fusaricidina e identificar cepas de Paenibacillus sp. que produzem essas fusaricidi- nas que fornecem um espectro amplo de atividade antifúngica em taxas de aplicação relativamente baixas.
[00010] As fusaricidinas e outros metabólitos fúngicos podem ser obtidas através da fermentação de Paenibacillus sp. Entretanto, muitas cepas de Paenibacillus sp. também produzem antibióticos conhecidos como polimixinas. As polimixinas são seletivamente tóxicas para bacté- rias Gram-negativas e podem ter um efeito neurotóxico ou nefrotóxico quando dadas a pacientes humanos. O problema global de avançar a resistência antimicrobiana e a toxicidade relativa das polimixinas requer uso e administração cuidadosos desses antibióticos. Por essa razão, é altamente desejável que uma cepa de Paenibacillus sp. desenvolvida para uso em agricultura expresse níveis relativamente altos das fusari- cidinas e nenhuma polimixina detectável. Tal cepa imporia pouco ou nenhum risco aos profissionais e consumidores. Além disso, há uma necessidade de identificar cepas de Paenibacillus sp. que exibem um espectro amplo de atividade. Os aprimoramentos na eficácia de fungicidas existentes, especialmente aqueles que não são suscetíveis ao desenvolvimento de resistência fúngica, são altamente desejáveis.
SUMÁRIO
[00011] A presente invenção é direcionada a uma composição que compreende uma cultura biologicamente pura de uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidina sintetase variante que carece de um domínio de adenilação funcional no terceiro módulo (FusA-A3), em que a carência de um FusA-A3 funcional inibe a síntese de fusaricidinas com uma tirosina ou uma fenilalanina no resíduo de aminoácido (3) em comparação com a síntese de fusaricidi- nas por uma cepa de Paenibacillus sp. que compreende uma fusarici- dina sintetase do tipo selvagem. Em certos aspectos, a fusaricidina sintetase variante compreende uma deleção em FusA-A3 de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez resíduos de aminoácido que determinam a especificidade de substrato. Em outros aspectos, os resíduos de aminoácido são selecionados do grupo que consiste em Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330, Cys331, Lys517 e combinações dos mesmos.
[00012] Em uma modalidade, os resíduos de aminoácido estão situados em posições 3203, 3204, 3207, 3246, 3267, 3269, 3290, 3298, 3299 e/ou 3486 de SEQ ID N°: 11. Em uma outra modalidade, a fusa- ricidina sintetase variante compreende uma deleção em FusA-A3 de Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330 e Cys331. Em algumas modalidades, a fusaricidina sintetase variante compreende SEQ ID N°: 10.
[00013] A presente invenção também fornece uma composição que compreende uma cultura biologicamente pura de uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. ou um extrato livre de célula dos mesmos que compreende pelo menos uma Paeniserina e pelo menos uma Paeniprolixina.
[00014] Em certos aspectos, a pelo menos uma Paeniserina é selecionada do grupo que consiste em Paeniserina A1, Paeniserina A2, Paeniserina A3, Paeniserina A4, Paeniserina B1, Paeniserina B2, Pa- eniserina B3, Paeniserina B4, Paeniserina C1, Paeniserina C2 e Pae- niserina C3.
[00015] Em outros aspectos, a pelo menos uma Paeniprolixina é selecionada do grupo que consiste em Paeniprolixina A1, Paeniprolixina A2, Paeniprolixina B1, Paeniprolixina B2, Paeniprolixina C1, Paeniprolixi- na D1, Paeniprolixina E1, Paeniprolixina E2, Paeniprolixina F1, Paenipro- lixina F2, Paeniprolixina G1 e Paeniprolixina G2.
[00016] Em certas modalidades, a composição compreende fusari- cidina A, LiF08a, Paeniserina A1, Paeniserina B1, Paeniprolixina A2 e Paeniprolixina B2.
[00017] Em algumas modalidades, a composição não compreende LiF03a, LiF03b, LiF03c, LiF03d, LiF07a, LiF07b, LiF07c e/ou LiF07d. Em outras modalidades, a composição compreende Paeniserina A1, Paeniserina B1, Paeniprolixina A2 e Paeniprolixina B2 em uma quantidade sinergicamente eficaz.
[00018] Em certos aspectos, a presente invenção é direcionada a uma composição em que a cepa de Paenibacillus sp. é cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp., cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida das mesmas. A composição pode compreender um produto de fermentação da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., da cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. ou de uma cepa mutante fungicida das mesmas.
[00019] Em algumas modalidades, a cepa mutante fungicida tem uma sequência genômica com mais que cerca de 90% de identidade de sequência com NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Em outras modalidades, a cepa mutante fungicida tem atividade fungicida e/ou níveis de uma Fusaricidina, Paeniserina e/ou Paeniprolixina que são comparáveis ou melhores que os de NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Ainda em outras modalidades, o produto de fermentação não compreende uma polimixina.
[00020] Em alguns aspectos, o produto de fermentação é uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser um concentrado de suspensão ou uma dispersão de óleo. Em uma modalidade, a composição compreende pelo menos cerca de 1 x 104 UFC da cepa/mL da formulação líquida. Em uma outra modalidade, a composição compreende cerca de 1 % a cerca de 25% de sólidos de fermentações.
[00021] Em outros aspectos, a presente invenção se refere a uma composição que compreende: a) pelo menos uma fusaricidina; e b) pelo menos uma Paeniserina ou pelo menos uma Paeniprolixina em uma quantidade sinergicamente eficaz. Em uma modalidade, a Paeni- serina é pelo menos uma dentre Paeniserina A1, Paeniserina A2, Pa- eniserina A3, Paeniserina A4, Paeniserina B1, Paeniserina B2, Paeni- serina B3, Paeniserina B4, Paeniserina C1, Paeniserina C2 e Paenise- rina C3. Em uma outra modalidade, a Paeniprolixina é pelo menos uma dentre Paeniprolixina A1, Paeniprolixina A2, Paeniprolixina B1, Paeniprolixina B2, Paeniprolixina C1, Paeniprolixina D1, Paeniprolixina E1, Paeniprolixina E2, Paeniprolixina F1, Paeniprolixina F2, Paenipro- lixina G1 e Paeniprolixina G2.
[00022] Em particular, em uma modalidade, a razão sinérgica da pelo menos uma fusaricidina e da pelo menos uma Paeniserina ou pelo menos uma Paeniprolixina se situa na faixa de 1:1000 a 1000:1, de preferência, na faixa de 1:500 a 500:1, com mais preferência, na faixa de 1:250 a 250:1. Em uma outra modalidade, a razão de peso sinérgi- ca da pelo menos uma fusaricidina e da pelo menos uma Paeniserina ou de pelo menos uma Paeniprolixina está na faixa de 1:100 a 100:1, de preferência, na faixa de 1:100 a 10:1 ou ainda na faixa de 1:50 a 25:1. Em um aspecto, a fusaricidina é Fusaricidina A. Em um outro aspecto, a Paeniserina é Paeniserina A1. Ainda em um outro aspecto, a Paeniprolixina é Paeniprolixina C1.
[00023] Em outros aspectos, a presente invenção se refere a um composto isolado que tem a Estrutura (I):
Figure img0001
em que R1 e R2 são, cada um, independentemente -CH(CH3)2 ou -CH(CH3)CH2CH3; R3 é -CH2C(O)NH2 ou -(CH2)2C(O)NH2; e n é um número inteiro entre 13 e 20; que inclui sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isômeros ópti-cos, isômeros geométricos, enantiômeros, diastereômeros, análogos ací- clicos e misturas dos mesmos.
[00024] Em algumas modalidades, R3 é -CH2C(O)NH2. Em outras modalidades, R3 é -(CH2)2C(O)NH2. Em um aspecto, R1 é -CH(CH3)2. Em um outro aspecto, R1 é -CH(CH3)CH2CH3. Em um aspecto, R2 é -CH(CH3)2. Ainda em um outro aspecto, R2 é -CH(CH3)CH2CH3.
[00025] Ainda em outros aspectos, a presente invenção se refere a um composto isolado que tem a Estrutura (II):
Figure img0002
em que R1 é -CH2OH ou -CH(OH)CH3; R2 é -CH2C(O)NH2 ou -(CH2)2C(O)NH2; e R3 é H ou CH3; com a condição de que se R1 for -CH2OH e R2 for -CH2C(O)NH2, então, R3 é H; que inclui sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isômeros ópticos, isômeros geométricos, enantiômeros, diastereômeros, análogos acíclicos e misturas dos mesmos.
[00026] Em algumas modalidades, R3 é CH3. Em outras modalidades, R3 é H. Em um aspecto, R1 é -CH2OH. Em um outro aspecto, R1 é -CH(OH)CH3. Em um aspecto, R2 é -CH2C(O)NH2. Ainda em um outro aspecto, R2 é -(CH2)2C(O)NH2.
[00027] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a uma composição que compreende um composto isolado revelado no presente documento e um carreador agricolamente aceitável.
[00028] Em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a uma solução que compreende um composto da Estrutura (I) em que a concentração do composto é pelo menos 0,001 mg/mL, pelo menos 0,01 mg/mL ou pelo menos 0,1 mg/mL. Em uma outra modalidade, a presente invenção é direcionada a uma solução que compreende um composto da Estrutura (II) em que a concentração do composto é pelo menos 0,001 mg/mL, pelo menos 0,01 mg/mL ou pelo menos 0,1 mg/mL. Em certos aspectos, as soluções reveladas compreendem adicionalmente um carreador agricolamente aceitável.
[00029] Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a um método de tratamento de uma planta para controlar uma doença, em que o método compreende aplicar uma quantidade eficaz de uma composição revelada no presente documento à planta, a uma parte da planta e/ou a um local da planta. Em certos aspectos, a composição é um produto de fermentação da cepa NRRL B-50972 de Pa- enibacillus sp., cepa NRRL B-67129 dePaenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida das mesmas. Em outros aspectos, o método compreende aplicar a composição a partes foliares da planta. Ainda em outros aspectos, a composição é aplicada a cerca de 1 x 1010 a cerca de 1 x io12 unidades formadoras de colônia (UFC) de cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp., cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida das mesmas por hectare. Em uma modalidade, a composição é aplicada a cerca de 0,5 kg a cerca de 5 kg de sólidos de fermentação por hectare.
[00030] Em alguns aspectos, a doença de planta é ocasionada por um fungo. Em outros aspectos, a doença de planta é míldio ou uma doença de ferrugem. Em uma modalidade, o míldio é míldio pulverulento ou míldio suave. Em uma outra modalidade, a doença de ferrugem é selecionada do grupo que consiste em ferrugem de folhas de trigo, ferrugem de folhas de cevada, ferrugem de folhas de centeio, ferrugem de folhas marrom, ferrugem da coroa e ferrugem de tronco.
[00031] Em algumas modalidades, o fungo é selecionado do grupo que consiste em Alternaria alternata, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodo- rum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infes- tans, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucume- ris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus e Pucci- nia triticina.
[00032] Em outras modalidades, a doença de planta é ocasionada por bactérias. Em um aspecto, as bactérias são selecionadas do grupo que consiste em Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae e Erwinia carotovora.
[00033] A presente invenção também se refere ao uso das composições reveladas para controlar um organismo fitopatogênico em plantas úteis. Em certos aspectos, o organismo fitopatogênico é selecionado do grupo que consiste em Alternaria alternata, Alternaria solani, Bo- trytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Tha- natephorus cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces ap- pendiculatus e Puccinia triticina. Em outros aspectos, o organismo fito- patogênico é selecionado do grupo que consiste em Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae e Erwinia carotovora.
[00034] Ainda em outros aspectos, as plantas úteis são selecionadas do grupo que consiste em maçãs, bananas, frutas cítricas, kiwi, melões, pêssegos, peras, abacaxi, pomóidea, romã, repolho, couve-flor, pepinos, abóboras, tomates, batatas, trigo, arroz e feijões-soja.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00035] A FIGURA 1 apresenta atividade fungicida em planta de caldos integrais de cepas de Paenibacillus sp. contra Requeima-do- Tomateiro (PHYTIN), Podridão Cinzenta (BOTRCI) e Ferrugem de Folhas de Trigo (PUCCRT).
[00036] A FIGURA 2 apresenta a atividade antifúngica in vitro de extratos de fusaricidina dos caldos integrais de cepas de Paenibacillus sp. contra Alternaria alternata (ALTEAL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Fusarium culmorum (FUSACU), Phaeosphaeria nodorum (LEPTNO), Zymoseptoria tritici (SEPPTR), Phytophthora cryptogea (PHYTCR), Phytophthora infestans (PHYTIN), Pythium ultimum (PYTHUL), Mag- naporthe oryzae (PYRIOR), Thanatephorus cucumeris (RHIZSO), Usti- lago segetum var. avenae (USTIAV) e Uromyces appendiculatus (UROMAP).
[00037] A FIGURA 3 mostra a abertura da estrutura de anel em LiF04a (também conhecida como fusaricidina A) para produzir o análogo acíclico, LiF04c. Os análogos acíclicos de cada uma das fusarici- dinas e dos compostos similares à fusaricidina ocorrem de uma maneira similar.
[00038] A FIGURA 4A apresenta um diagrama que esboça a estrutura das fusaricidinas conhecidas com aminoácidos conservados nas posições (1), (4) e (6) identificados e aminoácidos que variam indicados como AA (aminoácido). A cauda do ácido 15-guanidino-3- hidroxipentadecanoico (GHPD) forma uma ligação de amida com o N- terminal da L-treonina na posição (1). O C-terminal de D-alanina na posição (6) forma uma ligação de éster com o grupo hidroxila de L- treonina na posição (1) indicada com as setas apontando para um "O". A FIGURA 4B mostra um cromatograma de HPLC/MS TOF de um extrato celular de Paenibacillus sp. no qual as fusaricidinas conhecidas são identificadas. A FIGURA 4C apresenta as fusaricidinas conhecidas detectáveis em um extrato celular da cepa NRRL B-50972 de Paeni- bacillus sp. e/ou cepas derivadas das mesmas.
[00039] A FIGURA 5A apresenta um diagrama que esboça a estrutura das Paeniserinas. Essa classe de compostos é similar às fusarici- dinas exceto pelo fato de que uma ou ambas as treoninas conservadas nas posições (1) e (4) são substituídas por uma serina. A FIGURA 5B mostra um cromatograma TOF de HPLC/MS de um extrato celular da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e/ou de cepas derivadas das mesmas nas quais as Paeniserinas são identificadas. A FIGURA 5C apresenta as Paeniserinas detectáveis em um extrato celular da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e/ou cepas derivadas das mesmas. Os valores m/z e os tempos de retenção (RT) são mostrados para todos os compostos detectados.
[00040] A FIGURA 6A apresenta a estrutura química de Paeniseri- na A1 derivada do espectro de TOF Triplo de UPLC/MS mostrado na FIGURA 6B.
[00041] A FIGURA 7A apresenta a estrutura química de Paeniseri- na B1 derivada do espectro de TOF Triplo de UPLC/MS mostrado na FIGURA 7B.
[00042] A FIGURA 8A apresenta um diagrama que esboça a estrutura das Paeniprolixinas. Essa classe de compostos é similar às fusa- ricidinas exceto pelo fato de que o comprimento da cauda de GHPD é estendido a partir de -(CH2)i2- para -(CH2)i4- ou -(CH2)i6-. A FIGURA 8B mostra um cromatograma TOF de HPLC/MS de um extrato celular da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e/ou de cepas derivadas das mesmas nas quais as Paeniprolixinas são identificadas. A FIGURA 8C apresenta as Paeniprolixinas detectáveis em um extrato celular da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e/ou de cepas derivadas das mesmas. Os valores m/z e os tempos de retenção (RT) são mostrados para todos os compostos detectados.
[00043] A FIGURA 9A apresenta a estrutura química de Paeniproli- xina C1 derivada do espectro de TOF Triplo de UPLC/MS mostrado na FIGURA 9B.
[00044] A FIGURA 10A apresenta a estrutura química de Paenipro- lixina D1 derivada do espectro de TOF Triplo de UPLC/MS mostrado na FIGURA 10B.
[00045] A FIGURA 11 apresenta um ensaio de difusão de disco de antibiótico de Kirby-Bauer com fusaricidinas A e B ("AB"), Paeniserinas A1 e B1 ("868"), Paeniprolixinas A2 e B2 ("938") ou uma combinação de 868 e 938 aplicadas a uma superfície de esporos de Colletotrichum lage- narium (COLLLA) em uma placa ágar. O diâmetro de cada disco com sua zona de inibição de crescimento fúngico é indicado em milímetros.
[00046] A FIGURA 12A mostra a estrutura química de fusaricidina A e uma apresentação simplificada dessa estrutura. As FIGURAS 12B-12E apresentam apresentações simplificadas de combinações de fusaricidinas, Paeniserinas e/ou Paeniprolixinas produzidas pela NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepas derivadas das mesmas. As combinações como essas podem produzir um efeito antifúngico sinér- gico e são responsáveis pela eficácia relativamente alta e pela atividade antifúngica de espectro amplo observada com cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepas derivadas das mesmas.
[00047] A FIGURA 13 apresenta um alinhamento de múltiplas sequências de um segmento da fusaricidina sintetase FusA expressada pelas seguintes cepas de Paenibacillus: Paenibacillus peoriae A (SEQ ID N°: 1); Paenibacillus polymyxa A (SEQ ID N°: 2); Paenibacillus polymyxa PKB1 (GenBank ABQ96384.2; SEQ ID N°: 3); Paenibacillus polymyxa E681 (GenBank ADM67985.1; SEQ ID N°: 4); Paenibacillus polymyxa B (SEQ ID N°: 5); Paenibacillus polymyxa SQR (GenBank AHM63812.1; SEQ ID N°: 6); Paenibacillus polymyxa C (SEQ ID N°: 7); Paenibacillus polymyxa M1 (GenBank CCC83015.1; SEQ ID N°: 8); Paenibacillus polymyxa SC2 (GenBank ACA09733.2; SEQ ID N°: 9); cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 10); e cepa A de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 11). Os resíduos de aminoácido que determinam a especificidade de substrato são identificados com um destaque preto (consulte também Tabela 1). Esses resíduos de aminoácido estão situados nas posições 3203, 3204, 3207, 3246, 3267, 3269, 3290, 3298, 3299 e 3486 de SEQ ID N°s: 1-5 e 11 e nas posições 3204, 3205, 3208, 3247, 3268, 3270, 3291,3299, 3300 e 3487 de SEQ ID N°s: 6-9.
[00048] A FIGURA 14 apresenta o agrupamento gênico de fusarici- dina em cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepa A de Paeni- bacillus sp. ("Cepa A"). As setas representam genes individuais dentro do agrupamento (isto é, fusG é representado pela seta "G", fusF é representado pela seta "F", etc.). A seta maior representa a o gene de fusaricidina sintetase fusA com as seguintes abreviações e símbolos: A = domínio de adenilação (reconhecimento e ativação de substrato); C = domínio de condensação (formação de ligação de peptídeo); E = domínio de epimerização (racemização de substrato); TE = domínio de tioesterase (liberação de produto); oval sem uma letra = domínio de tiolação (T) (proteína de carreador de peptídeo). O gene fusA tem seis módulos responsáveis pela incorporação dos aminoácidos indicados nas caixas acima ou abaixo de cada agrupamento gênico. A Cepa A tem um agrupamento gênico de fusaricidina típico enquanto que o agrupamento gênico de fusaricidina de cepa NRRL B-50972 de Paeni- bacillus sp. é carente de um domínio A funcional no módulo 3. Como um resultado, as fusaricidinas produzidas pela cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. carecem de tirosina e fenilalanina na posição (3) e incorporam apenas valina ou isoleucina.
[00049] A FIGURA 15 apresenta um alinhamento de sequência do gene spoOA em cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 12) e cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 13).
[00050] A FIGURA 16 apresenta um alinhamento de sequência de ortólogos de Spo0A de bactérias formadoras de endósporo que indicam que a alteração de nucleotídeo na sequência de codificação de cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. resulta em uma única substituição de aminoácido em uma região conservada. As sequências de ortólogos de SpoOA alinhados são: SpoOA de Paenibacillus terrae (SEQ ID N°: 14), SpoOA de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 15), SpoOA de cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 16), SpoOA de Paenibacillus polymyxa (SEQ ID N°: 17), SpoOA de Bacillus subtilis (SEQ ID N°: 18), SpoOA de Bacillus cereus (SEQ ID N°: 19) e SpoOA de Clostridium pasteurianum (SEQ ID N°: 2O).
[00051] A FIGURA 17 apresenta as Concentrações Inibitórias Mínimas para valores de 8O% (MIC8O) de várias fusaricidinas, Paeniseri- nas e Paeniprolixinas com os patógenos fúngicos Alternaria solani (ALTESO) e Colletotrichum lagenarium (COLLLA).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00052] A presente invenção fornece a cepa NRRL B-5O972 de Pa- enibacillus sp. ou um mutante fungicida (cepa) derivadas das mesmas. Verificou-se que a cepa NRRL B-5O972 de Paenibacillus sp. tem um espectro amplo de atividade contra fitopatógenos.
[00053] Os microorganismos e as cepas particulares descritos no presente documento, salvo se especificamente observado de outro modo, são todos separados da natureza e crescidos sob condições artificiais como em culturas de frasco de agitação ou através de processo de fabricação de grande escala, como em biorreatores para maximizar produção de metabólito bioativa, por exemplo. O crescimento sob tais condições leva à "domesticação" da cepa. Em geral, tal cepa "domesticada" difere de suas contrapartes encontradas na natureza devido ao fato de que é cultivada como uma população homogênea que não é submetida a pressões de seleção encontradas no ambiente natural, mas de preferência, a pressões de seleção artificial.
[00054] Como usado no presente documento, o termo "isolado" se refere a um composto que foi enriquecido ou concentrado em um caldo integral ou produto de fermentação ou é parcial ou substancialmente purificado a partir de um caldo integral ou produto de fermentação.
[00055] Em uma modalidade, uma cepa mutante da cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp. é fornecida. O termo "mutante" se refere a uma variante genética derivada da cepa NRRL B-50972 de Paenibaci- llus sp.. Em uma modalidade, o mutante tem uma ou mais ou todas as características de identificação (funcionais) da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.. Em um caso particular, o mutante ou um produto de fermentação do mesmo controla (como uma característica funcional de identificação) fungos, Oomicetos e/ou bactérias pelo menos bem como a cepa NRRL B-50972 parental de Paenibacillus sp. Tais mutantes podem ser variantes genéticas que têm uma sequência genômica que tem mais que cerca de 85%, mais que cerca de 90%, mais que cerca de 95%, mais que cerca de 98% ou mais que cerca de 99% de identidade de sequência com a cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Os mutantes podem ser obtidos pelo tratamento de células de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. com produtos químicos ou irradiação ou pela seleção de mutantes espontâneos de uma população de células de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (como mutantes resistentes a antibiótico ou resistente a fago) ou por outros meios bem conhecidos pelos versados na técnica.
[00056] A cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e os mutantes da mesma têm atividade contra uma ampla faixa de patógenos de plan ta. Em um aspecto, a cepa tem atividade contra fungos, como antracno- se de pepino, míldio pulverulento de pepino, ferrugem de folhas de trigo, míldio pulverulento de cevada e Botrytis; os oomicetos, como requeima- do-tomateiro, míldio suave de pepino e míldio suave de Brassica; e/ou bactérias, como Pseudomonas, Xanthomonas e Erwinia.
[00057] Em certos aspectos, a cepa de Paenibacillus sp. compreende uma sequência de DNA que exibe pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 96% de identidade de sequência, pelo menos 97% de identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade de sequência ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID N°: 10.
[00058] Em certos aspectos, a presente invenção é direcionada a um produto de fermentação que compreende uma cepa de Paenibaci- llus sp., em que a cepa de Paenibacillus sp. produz fusaricidinas, Pae- niserinas e/ou Paeniprolixinas. As fusaricidinas são uma família de de- psipeptídeos com uma cauda de ácido 15-guanidino-3- hidroxipentadecanoico (GHPD), bem como suas contrapartes lineares. As características conservadas específicas de fusaricidinas são essa cauda de GHPD, bem como três dos seis aminoácidos na sequência: (1) Treonina, (4) Treonina e (6) Alanina.
[00059] Originalmente descobertas, mas não caracterizadas por Nakajima et al. (J. Antibiot. 1972, 25, 243-247) em meados da década de 70, as fusaricidinas foram descritas por Kurusu et al. (J. Antibiot., 1987, 40, 1506-1514) no fim da década de 80. As mesmas foram adicionalmente estudadas por Kajimura et al. (J. Antibiot., 1996, 49, 129135; J. Antibiot., 1997 50, 220-228), Kuroda et al. (Heterocycles, 2000, 53, 1533-1549; J. Mass Spectrom., 2001, 36, 30-37), e Beatty et al. (Can. J. Microbiol., 2002, 48, 159-169) nos meados da década de 90 até o início do ano 2000. Durante esse período de investigação pesa- da, esses compostos foram renomeados várias vezes dependendo do autor (a Fusaricidina A é também conhecida como LiF04a, Gatavalina ou ainda KT-6291A). Apesar de haver muitas publicações sobre o tópico, os compostos de seleção do mesmo grupo de 24 fusaricidinas conhecidas são descritos em cada vez.
[00060] Após um período ocioso sobre o tópico, Vater et al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2015, 26, 1130-1141) descreveu a elucidação estrutural de fusaricidinas por espectrometria de massa e descreveu vários análogos da família. Vater et al. identificou uma nova classe de compostos similares à fusaricidina com sete aminoácidos (isto é, uma extra- alanina conectada ao resíduo de treonina (4) na sequência de peptí- deos). Como usado no presente documento, o termo "análogo acíclico" se refere ao composto que corresponde à fusaricidina ou composto similar à fusaricidina (por exemplo, uma Paeniserina ou Paeniprolixina), mas carece da ligação de éster, resultando em uma estrutura linear.
[00061] As cadeias de aminoácido de fusaricidinas são ligadas juntas e modificadas por uma peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS). A NRPS multidomínio consiste em até 15.000 aminoácidos e é, portanto, considerada dentre as proteínas mais longas na natureza (Schwarzer et al., (2003) Nonribosomal Peptides: From Genes to Products. Nat. Prod. Rep. 20, 275-287). A incorporação de NRPS não é limitada aos 21 ami- noácidos padrão traduzidos pelo ribossoma, e essa promiscuidade contribui para as ótimas diversidade estrutural e atividade biológica de peptí- deos não ribossômicos (Li e Jensen, (2008). Nonribosomal biosynthesis of fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 involves direct activation of a d-amino acid. Chem. Biol. 15, 118-127).
[00062] Em E68 de P. polymyxa, o agrupamento gênico biossintético de fusaricidina (fusGFEDCBA) foi caracterizado, e a sequência de codificação de NRPS, a maior sequência de codificação de DNA (CDS) no agrupamento, foi observada como codificando um peptídeo de seis mó- dulos (Choi et al., Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681. Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 89-95; Li e Jensen, Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681. Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 89-95; Li et al., (2013). Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 9479-9489). O agrupamento biossintético inclui outra CDS responsável pela biossíntese da porção química de lipídeo, mas não contém genes transportadores (Li e Jensen, (2008). Nonri- bosomal Biosynthesis of Fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a d-amino acid. Chem. Biol. 15, 118-127). Em P. polymyxa, um promotor para o operon fus foi identificado e mostrado como ligado por um repressor transcricional (AbrB), cujos estudos anteriores implicaram em um regulador de esporulação; isso é de interesse, uma vez que a fusaricidina foi observada como sendo sintetizada durante a esporulação, coordenando assim o metabolismo secundário do micróbio com seu ciclo de vida (Li et al., (2013). Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 9479-9489).
[00063] A diversidade alélica é tipicamente considerada como responsável pela produção de diversidade química. Entretanto, um recurso interessante do agrupamento fus é que uma diversidade de fusaricidinas, diferentes em seus aminoácidos incorporados (Tyr, Val, Ile, allo-Ile, Phe), pode ser produzida por um único alelo de fusA; o mecanismo subjacente é que o domínio A de NRPS, responsável pelo reconhecimento de ami- noácidos, relaxou a especificidade de substrato (Han et al., (2012). Site- Directed Modification of the Adenylation Domain of the Fusaricidin Nonri- bosomal Peptide Synthetase for Enhanced Production of Fusaricidin Ana logs. Biotechnol. Lett.34, 1327-1334; Mousa et al., (2015) Biodiversity of Genes Encoding Anti-Microbial Traits within Plant Associated Microbes, Front Plant Sci. 2015; 6: 231).
[00064] A estrutura do domínio A, que é responsável pelo reconhecimento e pela ativação de substrato no gene fusA, foi determinada a partir de GrsA com o uso de cristalografia de raio X, e os 10 resíduos de ami- noácido que determinam a especificidade de substrato foram identificados (Asp235, Ala236, Trp239, Thr278, Ile299, Ala301, Ala322, Ile330, Cys331 e Lys517) (Challis et al., (2000) Predictive, Structure-Based Model of Amino Acid Recognition by Nonribosomal Peptide Synthetase Adenylation Domains. Chem Biol 7:211-224; Stachelhaus et al., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases. Chem Biol 6:493-505). Esses 10 resíduos de assinatura podem ser classificados em três subgrupos com base em sua função dentro do sítio de ligação de substrato. Asp235 e Lys517 interagiram com as extremidades carboxila e amino do substrato, respectivamente, e a análise de sequências revelou que sua posição no domínio A de NRPSs foi invariante. Ala236, Ala301 e Ile330 são moderadamente variáveis dentro dos domínios A específicos para os substratos de ami- noácido que têm cadeia lateral alifática. Trp239, Thr278, Ile299, Ala322 e Cys331 são posições altamente variáveis e são considerados importantes na discriminação e na seleção de diferentes substratos (Challis et al., (2000) Predictive, Structure-Based Model of Amino Acid Recognition by Nonribosomal Peptide Synthetase Adenylation Domains. Chem Biol 7:211-224; Stachelhaus et al., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases. Chem Biol 6:493-505). Ile299 foi a posição mais variável de todos dentro da sequência que confere especificidade de substrato (Stachelhaus et al., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonri- bosomal Peptide Synthetases. Chem Biol 6:493-505).
[00065] Os 10 resíduos de aminoácido que determinam a especificidade de substrato na fusaricidina sintetase são mostrados na Tabela 1. Os domínios de adenilação (domínios A) para cada um dos seis módulos na sintetase são conhecidos como FusA-A1 para o primeiro módulo, FusA-A2 para o segundo módulo, FusA-A3 para o terceiro módulo, etc. Esses 10 resíduos de aminoácido são também identificados no alinhamento de múltiplas sequências de FusA a partir de várias cepas de Paenibacillus sp. apresentadas na FIGURA 13.
Figure img0003
[00066] Em certos aspectos, a cepa fungicida de Paenibacillus sp. expressa uma fusaricidina sintetase variante que compreende uma deleção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou todos os dez resíduos de ami- noácido que determinam a especificidade de substrato em FusA-A3. Em outros aspectos, a cepa fungicida de Paenibacillus sp. expressa uma fusaricidina sintetase com uma deleção em FusA-A3 de pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330, Cys331, Lys517 e combinações dos mesmos.
[00067] As deleções em FusA-A3 reveladas no presente documento afetam a capacidade de a fusaricidina sintetase incorporar aminoácidos específicos na posição de aminoácido (3) do anel de peptídeo na fusari- cidina ou composto similar à fusaricidina. Por exemplo, a cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp. compreende deleções em FusA-A3 e não pode produzir compostos de fusaricidina com um aminoácido de tirosina ou aminoácido de fenilalanina na posição de aminoácido (3). Sem se ater à qualquer teoria, pode ser que as deleções em FusA-A3 desloquem o me-tabolismo na direção oposta à biossíntese das fusaricidinas clássicas e em direção à biossíntese de compostos similares à fusaricidina como as Paeniserinas e as Paeniprolixinas.
[00068] Em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a uma composição que compreende uma cultura biologicamente pura de uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidi- na sintetase variante que carece de um domínio de adenilação funcional no terceiro módulo (FusA-A3), que compreende adicionalmente pelo menos uma Paeniserina e pelo menos uma Paeniprolixina. Em certos aspectos, a pelo menos uma Paeniserina e a pelo menos uma Paeniprolixi- na são isoladas ou enriquecidas na composição.
[00069] Em algumas modalidades, o composto isolado ou Paenipro- lixina é
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[00070] Em algumas modalidades, o composto isolado ou Paenise- rina é
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[00071] Em outros aspectos, a presente invenção se refere a um método de identificação de uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. e/ou de produção de um produto de fermentação correspondente. O método compreende sequenciar FusA-A3 na cepa de Paenibacillus sp. para caracterizar uma fusaricidina sintetase variante e avaliar a atividade fungicida da cepa de Paenibacillus sp. Em certos aspectos, o FusA-A3 é sequenciado com o uso de iniciadores com base em uma ou mais sequências mostradas na FIGURA 13 (isto é, SEQ ID N°s: 111). Em algumas modalidades, a triagem é precedida pelo crescimento das células e pela seleção das células com uma ou mais das seguintes características: níveis diminuídos ou não detectáveis de fusaricidi- nas com uma tirosina ou uma fenilalanina em resíduo de aminoácido (3) (por exemplo, LiF03a, LiF03b, LiF03c, LiF03d, LiF07a, LiF07b, LiF07c e/ou LiF07d) em comparação com fusaricidinas quantificadas em uma cepa de referência de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidina sintetase do tipo selvagem (isto é, que expressa uma Fu- sA-A3 funcional); e/ou níveis aumentados de uma Paeniserina (por exemplo, Paeniserina A1 e/ou Paeniserina B1) e/ou uma Paeniprolixi- na em comparação com aqueles quantificados em uma cepa de referência de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidina sintetase do tipo selvagem (isto é, que expressa uma FusA-A3 funcional).
[00072] Em um aspecto, a presente invenção abrange um método para produzir um produto de fermentação com atividade antifúngica de espectro amplo, em que o método compreende cultivar uma cepa de Paenibacillus sp. com uma fusaricidina sintetase variante para esporu- lação.
[00073] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a um método de identificação de uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. com atividade antifúngica de espectro amplo, em que o método compreende: a) sequenciar FusA-A3 na cepa de Paenibacillus sp. para caracterizar uma fusaricidina sintetase variante; b) avaliar a atividade fungicida da cepa de Paenibacillus sp. com a fusaricidina sintetase variante; e c) selecionar a cepa fungicida de Paenibacillus sp. como tendo atividade antifúngica de espectro amplo se a cepa de Paenibacillus sp. compreender a fusaricidina sintetase variante e demonstrar atividade fungicida aumentada em comparação com uma cepa de referência de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidina sintetase do tipo sel-vagem. O método pode compreender adicionalmente quantificar uma Paeniserina e/ou Paeniprolixina produzida pela cepa de Paenibacillus sp. e selecionar a cepa de Paenibacillus sp. como tendo atividade antifúngi- ca de espectro amplo se a cepa de Paenibacillus sp. produzir níveis au-mentados da Paeniserina e/ou Paeniprolixina em comparação com a ce-pa de referência de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidina sintetase do tipo selvagem. Em um outro aspecto, o método compreende adicionalmente cultivar a cepa fungicida de Paenibacillus sp. para produ-zir um produto de fermentação fungicida.
[00074] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a um método de produção de uma fermentação antifúngica que compreende uma cepa fungicida de Paenibacillus sp. com atividade antifúngi- ca de espectro amplo, em que o método compreende: a) sequenciar FusA-A3 na cepa de Paenibacillus sp. para caracterizar uma fusaricidina sintetase variante; b) avaliar a atividade fungicida da cepa de Paenibacillus sp. com a fusaricidina sintetase variante; c) selecionar a cepa fungicida de Paenibacillus sp. como tendo atividade antifúngica de espectro amplo se a cepa de Paenibaci- llus sp. compreender a fusaricidina sintetase variante e demonstrar atividade fungicida aumentada em comparação com uma cepa de refe-rência de Paenibacillus sp. que compreende uma fusaricidina sintetase do tipo selvagem; e d) cultivar a cepa fungicida de Paenibacillus sp. para pro- duzir um produto de fermentação fungicida.
[00075] Em algumas modalidades, a fusaricidina sintetase variante compreende uma deleção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou todos os dez resíduos de aminoácido que determinam a especificidade de substrato em FusA-A3. Em outros aspectos, a fusaricidina sintetase variante compreende uma deleção em FusA-A3 de pelo menos um resíduo de aminoá- cido selecionado do grupo que consiste em Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330, Cys331, Lys517 e combinações dos mesmos.
[00076] A presente invenção também abrange métodos de tratamento de uma planta para controlar doenças de planta ao administrar a uma planta ou uma parte de planta, como uma folha, tronco, flores, fruta, raiz ou semente ou ao aplicar a um local no qual a planta ou partes de planta crescem, como solo, a cepa NRRL B-50972 de Paeniba- cillus sp. ou mutantes da mesma, ou preparações livres de célula da mesma ou metabólitos da mesma.
[00077] Em um método de acordo com a invenção, uma composição que contém cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou um mutante fungicida da mesma pode ser aplicada a qualquer planta ou qualquer parte de qualquer planta crescida em qualquer tipo de meios usados para crescer plantas (por exemplo, solo, vermiculita, papelão picado e água) ou aplicada a plantas ou às partes de plantas crescidas no ar, como orquídeas ou samambaias. A composição pode, por exemplo, ser aplicada por aspersão, atomização, vaporização, espalhamento, salpi- camento, molhagem, esguicho, polvilhamento, despejamento ou fumi-gação. Como já indicado acima, a aplicação pode ser executada em qualquer local desejado onde a planta de interesse é posicionada, como ambientes agrícolas, horticulturais, florestais, de plantação, orquidários, viveiros, cultivos organicamente desenvolvidos, gramados e ambientes urbanos.
[00078] As composições da presente invenção podem ser obtidas pelo cultivo da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou um mutante fungicida (cepa) derivado da mesma de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica, que incluem uso dos meios e outros métodos descritos nos exemplos abaixo. Os processos convencionais de cultura microbiana de grande escala incluem fermentação submersa, fermentação em estado sólido ou cultura de superfície líquida. No ca-minho do fim da fermentação, conforme os nutrientes são esgotados, as células começam a transição da fase de crescimento para fase de esporulação, de modo que o produto final de fermentação seja am-plamente esporos, metabólitos e meio de fermentação residual. A es- porulação é parte do ciclo de vida natural de Paenibacillus e é, em geral, iniciada pela célula em resposta à limitação de nutriente. A fermentação é configurada para obter níveis altos de unidades formadoras de colônia e para promover a esporulação. As células bacterianas, esporos e metabólitos em meios de cultura resultantes da fermentação podem ser usadas diretamente ou concentradas por métodos industriais convencionais, como centrifugação, filtração de fluxo tangencial, filtração em profundidade e evaporação.
[00079] As composições da presente invenção incluem produtos de fermentação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação con-centrado é lavado, por exemplo, através de um processo de diafiltra- ção, para remover caldo de fermentação e metabólitos residuais. O termo "concentrado de caldo", como usado no presente documento, se refere a caldo integral (caldo de fermentação) que foi concentrado por métodos industriais convencionais, como descrito acima, mas permanece em forma líquida. O termo "sólido de fermentação", como usado no presente documento, se refere ao material sólido que permanece após o caldo de fermentação ser seco. O termo "produto de fermenta-ção", como usado no presente documento, se refere a caldo integral, concentrado de caldo e/ou sólidos de fermentação. As composições da presente invenção incluem produtos de fermentação.
[00080] O caldo de fermentação ou concentrado de caldo pode ser seco com ou sem a adição de carreadores que usam processos ou métodos de secagem convencionais como secagem por aspersão, secagem por congelamento, secagem em bandeja, secagem em leito fluidificado, secagem em tambor ou evaporação.
[00081] Os produtos secos resultantes podem ser adicionalmente processados, como por moagem ou granulação, para alcançar um ta-manho de partícula ou formato físico específico. Os carreadores, des-critos abaixo, podem também ser adicionados após a secagem.
[00082] As preparações livres de célula de caldo de fermentação das cepas da presente invenção podem ser obtidas por qualquer meio conhecido na técnica, como extração, centrifugação e/ou filtração de caldo de fermentação. Os elementos versados na técnica apreciarão que as denominadas preparações livres de célula podem não ser desprovidas de células, mas, de preferência, são amplamente livres de célula ou essencialmente livres de célula, dependendo da técnica usada (por exemplo, velocidade de centrifugação) para remover as células. A preparação livre de célula resultante pode ser seca e/ou formulada com componentes que auxiliam em sua aplicação a plantas ou a meios de crescimento de planta. Os métodos de concentração e as técnicas de secagem descritos acima para caldo de fermentação são também aplicáveis a preparações livres de célula.
[00083] Em uma modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 104 unidades formadoras de colônia (UFC) do micro-organismo (por exemplo, cepa NRRL B-50972 de Paenibaci- llus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mesma)/mL de caldo. Em uma outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 105 unidades formadoras de colônia (UFC) do micro-organismo (por exemplo, cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mesma)/mL de caldo. Em uma outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 106 UFC do micro-organismo (por exemplo, cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mes- ma)/mL de caldo. Ainda em uma outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 107 UFC do microorganismo (por exemplo, cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mesma)/mL de caldo. Em uma outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 108 UFC do micro-organismo (por exemplo, cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mes- ma)/mL de caldo. Em uma outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 109 UFC do microorganismo (por exemplo, cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mesma)/mL de caldo. Em uma outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 1010 UFC do micro-organismo (por exemplo, cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mes- ma)/mL de caldo. Em uma outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 1011 UFC do micro-organismo (por exemplo, cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou uma cepa mutante fungicida da mesma)/mL de caldo.
[00084] As composições inventivas podem ser usadas como tal ou, dependendo de suas propriedades físicas e/ou químicas particulares, na forma de suas formulações ou formas de uso preparadas a partir das mesmas, como aerossóis, suspensões em cápsula, concentrados de nebulização a frio, concentrados de nebulização a quente, grânulos encapsulados, grânulos finos, concentrados fluxíveis para o tratamento de semente, soluções prontas para uso, pós polvilháveis, concentrados emulsificáveis, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo, macrogrânulos, microgrânulos, pós dispersíveis em óleo, concentrados fluxíveis miscíveis em óleo, líquidos miscíveis em óleo, gás (sob pressão), produto de geração de gás, espumas, pastas, semente re-vestida com pesticida, concentrados de suspensão, dispersão de óleo, concentrados de suspoemulsão, concentrados solúveis, suspensões, pós molháveis, pós solúveis, poeiras e grânulos, grânulos ou tabletes dispersíveis em água e solúveis em água, pós solúveis em água e dis- persíveis em água para o tratamento de semente, pós molháveis, pro-dutos naturais e substâncias sintéticas impregnadas com ingrediente ativo, e também microencapsulações em substâncias poliméricas e em materiais de revestimento para semente, e também formulações de nebulização a quente e de nebulização a frio de ULV.
[00085] Em algumas modalidades, as composições inventivas são formulações líquidas. Os exemplos não limitantes de formulações lí-quidas incluem concentrações de suspensão e dispersões de óleo. Em outras modalidades, as composições inventivas são formulações sólidas. Os exemplos não limitantes de formulações líquidas incluem pós secos por congelamento e pós secos por aspersão.
[00086] As composições da presente invenção podem incluir inertes de formulação adicionados às composições que compreendem células, preparações livres de célula ou metabólitos para aprimorar a eficácia, a estabilidade e a utilidade e/ou para facilitar o processamento, a embalagem e a aplicação de uso final. Tais inertes e ingredientes de formulação podem incluir carreadores, agentes de estabilização, nutri-entes ou agentes de modificação de propriedade física, que podem ser adicionados individualmente ou em combinação. Em algumas modali-dades, os carreadores podem incluir materiais líquidos como água, óleo, e outros solventes orgânicos ou inorgânicos e materiais sólidos como minerais, polímeros, ou complexos poliméricos derivados biolo-gicamente ou por síntese química. Em algumas modalidades, o carre- ador é um aglutinante ou adesivo que facilita a aderência da composição a uma parte de planta, como uma semente ou raiz. Consulte, por exemplo, Taylor, A.G., et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments", Annu. Rev. Phytopathol. 28: 321-339 (1990). Os agentes de estabilização podem incluir agentes antiformação de torta, agentes antioxidação, dessecantes, protetores ou conservantes. Os nutrientes podem incluir fontes de carbono, nitrogênio e fósforo como açúcares, polissacarídeos, óleo, proteínas, aminoácidos, ácidos gra- xos e fosfatos. Os modificadores de propriedade física podem incluir agentes avolumadores, agentes de molhagem, espessantes, modificadores de pH, modificadores de reologia, dispersantes, adjuvantes, ten- soativos, agentes anticongelamento ou corantes. Em algumas modalidades, a composição que compreende células, preparação livre de célula resultante ou metabólitos produzidos por fermentação podem ser usados diretamente com ou sem água como o diluente sem qualquer outra preparação de formulação. Em algumas modalidades, os inertes de formulação são adicionados após a concentração de caldo de fermentação e durante e/ou após a secagem.
[00087] Todas plantas e partes de planta podem ser tratadas de acordo com a invenção. No presente contexto, entende-se por plantas todas as plantas e populações de planta, como plantas selvagens ou plantas de cultivo desejadas e indesejadas (que incluem plantas de cultivo de ocorrência natural). As plantas de cultivo podem ser plantas que podem ser obtidas por métodos tradicionais de reprodução e otimização ou por métodos biotecnológicos e recombinantes, ou combinações desses métodos, que incluem as plantas transgênicas e que incluem as variedades de planta com capacidade ou não de serem protegidas pelos Direitos de Reprodutores de Planta. Entende-se por partes de planta todas as partes e órgãos aéreos e subterrâneos das plantas, como broto, folha, flor e raiz, em cujos exemplos que podem ser mencionados estão folhas, pontas, caules, troncos, flores, corpos frutíferos, frutas e sementes, e também raízes, tubérculos e rizomas. As partes de planta também incluem material de cultivo e material de propagação generativa ou vegetativa, por exemplo, aparas, tubérculos, rizomas, mudas e sementes.
[00088] Como já mencionado acima, todas as plantas e suas partes podem ser tratadas de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferencial, as espécies de planta e variedades de planta, e suas partes, que crescem de forma selvagem ou que são obtidas por métodos de reprodução biológica convencionais como hibridização ou fusão de protoplasto são tratadas. Em uma modalidade preferencial adicional, as plantas transgênicas e variedades de planta que foram obtidas por métodos recombinantes, se apropriado em combinação com métodos tradicionais (organismos geneticamente modificados), e suas partes são tratadas. O termo "partes" ou "partes de plantas" ou "partes de planta" foi explicado acima no presente documento. As plantas das variedades de planta que estão, em cada caso, comercialmente disponíveis ou em uso são especialmente tratadas, de preferência, de acordo com a invenção. Entende-se por variedades de planta plantas com tratos inovadores que foram reproduzidos por reprodução tradicional, por mutagênese ou por técnicas de DNA recombinante. As mesmas podem assumir a forma de variedades, raças, biotipos e genótipos.
[00089] O tratamento das plantas e das partes de planta com as composições de acordo com a invenção é executado diretamente ou pela atuação no ambiente, habitat ou espaço de armazenamento com o uso de métodos de tratamento comuns, por exemplo, por imersão, aspersão, atomização, névoa, evaporação, salpicamento, nebulização, espalhamento, formação de espuma, pintura, espalhamento, injeção, encharcamento, irrigação por gotejamento e, no caso de material de propagação, em particular, no caso de semente, adicionalmente pelo método de tratamento de semente, método de tratamento de semente seca, método de tratamento de pasta aquosa, por encrustação, por revestimento com um ou mais revestimentos e similares. Adicional-mente, é possível aplicar as substâncias ativas pelo método de volume ultrabaixo ou injetar a preparação de substância ativa ou a própria substância ativa no solo.
[00090] Um tratamento direto preferencial das plantas é o tratamento de aplicação em folha, isto é, as composições de acordo com a invenção são aplicadas à folha, sendo possível que a frequência de tratamento e a taxa de aplicação sejam correspondidas à pressão de infecção do patógeno em questão.
[00091] No caso de compostos sistemicamente ativos, as composições de acordo com a invenção alcançam as plantas através do sistema de raiz. Nesse caso, o tratamento das plantas é efetuado ao permitir que as composições de acordo com a invenção atuem no ambiente da planta. Isso pode ser feito, por exemplo, por encharcamento, incorporando no solo ou na solução de nutriente, isto é, o local da planta (por exemplo, o solo ou sistemas hidropônicos) é impregnado com uma forma líquida das composições de acordo com a invenção, ou por aplicação em solo, isto é, as composições de acordo com a invenção são incorporadas no local das plantas em forma sólida (por exemplo, na forma de grânulos). No caso de culturas de arroz com casca, isso também pode ser feito pela medição das composições de acordo com a invenção em um campo de arroz com casca inundado em uma forma de uso sólida (por exemplo, na forma de grânulos).
[00092] As plantas preferenciais são aquelas do grupo das plantas úteis, ornamentais, relvas, em geral árvores usadas que são empre- gadas como ornamentais nos setores públicos e domésticos, e árvores florestais. As árvores florestais compreendem árvores para a produção de lenha, celulose, papel e produtos feitas a partir de partes das árvores.
[00093] O termo "plantas úteis", como usado no presente contexto, se refere a plantas de cultivo que são empregadas como plantas para obter artigos alimentícios, artigos de ração, combustíveis ou para propósitos industriais.
[00094] As plantas úteis que podem ser tratadas e/ou aprimoradas com as composições e métodos da presente invenção incluem, por exemplo, os seguintes tipos de plantas: relva, vinhas, cereais, por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias, arroz, milho e painço/sorgo; beterraba, por exemplo, beterraba sacarina e beterraba for-rageira; frutas, por exemplo, pomóidea, drupa e frutos macios, por exemplo, maçãs, peras, ameixas, pêssegos, amêndoas, cerejas e ba-gas, por exemplo, morangos, framboesas, amoras; legumes, por exemplo, feijões, lentilhas, ervilhas e feijões- soja; cultivos oleaginosos, por exemplo, semente oleaginosa de colza, mostarda, papoulas, azeitonas, girassóis, coco, plantas de óleo de rícino, cacau e amendoins; abóboras, por exemplo, abóbora-moranga/abóbora, pepinos e melões; plantas de fibra, por exemplo, algodão, linho, cânhamo e juta; frutas cítricas, por exemplo, laranjas, limões, pomelo e tan-gerinas; vegetais, por exemplo, espinafre, alface, aspargos, espé- cies de repolho, cenouras, cebolas, tomates, batatas e pimentões; Lauraceae, por exemplo, abacate, canela, cânfora ou ainda plantas como tabaco, nozes, café, berinjela, cana-de-açúcar, chá, pi-menta, videiras, lúpulo, bananas, plantas de látex e ornamentais, por exemplo, flores, arbustos, árvores decíduas e árvores coníferas. Essa enumeração não é limitante.
[00095] As seguintes plantas são consideradas como cultivos de endereço particularmente adequados para aplicação de composições e métodos da presente invenção: algodão, berinjela, relva, pomóidea, drupa, frutos macios, milho, trigo, cevada, pepino, tabaco, vinhas, arroz, cereais, pera, feijões, feijões-soja, semente oleaginosa de colza, tomate, pimentão, melões, repolho, batata e maçã.
[00096] Os exemplos de árvores que podem ser aprimoradas de acordo com o método de acordo com a invenção são: Abies sp., Eucalyptus sp., Picea sp., Pinus sp., Aesculus sp., Platanus sp., Tilia sp., Acer sp., Tsuga sp., Fraxinus sp., Sorbus sp., Betula sp., Crataegus sp., Ulmus sp., Quercus sp., Fagus sp., Salix sp., Populus sp.
[00097] As árvores preferenciais que podem ser aprimoradas de acordo com o método de acordo com a invenção são: da espécie de árvore Aesculus: A. hippocastanum, A. pariflora, A. carnea; da espécie de árvore Platanus: P. aceriflora, P. occidentalis, P. racemosa; da espécie de árvore Picea: P. abies; da espécie de árvore Pinus: P. radiata, P. ponderosa, P. contorta, P. sylvestre, P. elliot- tii, P. montecola, P. albicaulis, P. resinosa, P. palustris, P. taeda, P. flexilis, P. jeffregi, P. baksiana, P. strobus; da espécie de árvore Eu-calyptus: E. grandis, E. globulus, E. camadentis, E. nitens, E. obliqua, E. regnans, E. pilularus.
[00098] As árvores especialmente preferenciais que podem ser aprimoradas de acordo com o método de acordo com a invenção são: da espécie de árvore Pinus: P. radiata, P. ponderosa, P. contorta, P. sylvestre, P. stro- bus; da espécie de árvore Eucalyptus: E. grandis, E. globulus, E. ca- madentis.
[00099] As árvores muito particularmente preferenciais que podem ser aprimoradas de acordo com o método de acordo com a invenção são: castanha-da-índia, Platanaceae, tília, bordo.
[000100] A presente invenção também pode ser aplicada a quaisquer gramíneas, que incluem gramíneas de clima frio e gramíneas de clima quente. Os exemplos de gramíneas de clima frio são poáceas (Poa spp.), como Poa pratensis L. (Kentucky bluegrass), Poa trivialis L. (rough bluegrass), Poa compressa L. (Canada bluegrass), Poa annua L. (annual bluegrass), Poa glaucantha Gaudin (upland bluegrass), Poa nemoralis L. (wood bluegrass) e Poa bulbosa L. (bulbous bluegrass); Agrostis spp. (bentgrasses) como Agrostis palustris Huds. (creeping bentgrass), Agrostis tenuis Sibth. (colonial bentgrass), Agrostis canina L. (velvet bentgrass), Agrostis spp. (South German mixed bentgrass) que inclui Agrostis tenuis Sibth., Agrostis canina L., e Agrostis palustris Huds., e Agrostis alba L. (redtop); festucas (Festuca spp.), como Festuca rubra L. spp. rubra (red fescue), (estuca rubra L. (creeping fescue), Festuca rubra commu- tata Gaud. (chewings fescue), Festuca ovina L. (sheep fescue), Festuca longifolia Thuill. (hard fescue), Festucu capillata Lam. (hair fescue), Fes- tuca arundinacea Schreb. (tall fescue) e Festuca elanor L. (meadow fescue); azevéns (Lolium spp.), como Lolium multiflorum Lam. (annual ryegrass), Lolium perenne L. (perennial ryegrass) e Lolium multiflo- rum Lam. (Italian ryegrass); e rebentos de trigo (Agropyron spp.), como Agropyron crista- tum (L.) Gaertn. (fairway wheatgrass), Agropyron desertorum (Fisch.) Schult. (crested wheatgrass) e Agropyron smithii Rydb. (western whe-atgrass).
[000101] Os exemplos de gramíneas de clima frio adicionais são Ammophila breviligulata Fern. (benchgrass), Bromus inermis Leyss. (smooth bromegrass), amentilhos como erva-dos-prados (Phleum pra- tense L.), amentilho arenoso (Phleum subulatum L.), dátilo (Dactylis glomerata L.), Puccinellia distans (L.) Parl. (weeping alkaligrass) e Cy- nosurus cristatus L. (crested dog’s-tail).
[000102] Os exemplos de gramíneas de clima quente são grama- bermudas (Cynodon spp. L. C. Rich), grama zoysia (Zoysia spp. Willd.), grama-santo-agostinho (Stenotaphrum secundatum Walt Kunt- ze), grama centípede (Eremochloa ophiuroides Munro Hack.), grama carpete (Axonopus affinis Chase), grama Bahia (Paspalum notatum Flugge), grama Kikuyu (Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov.), grama búfalo (Buchloe dactyloids (Nutt.) Engelm.), grama azul (Boute- loua gracilis (H.B.K.) Lag. ex Griffiths), Paspalum vaginatum Swartz (seashore paspalum) e Bouteloua curtipendula Michx. Torr. (sideoats grama). As gramíneas de clima frio são em geral preferenciais para o uso de acordo com a invenção. As especialmente preferenciais são poácea, benchgrass e redtop, festucas e azevéns. Agrostis é especi-almente preferencial.
[000103] As composições inventivas têm atividade microbicida potente e podem ser usadas para controlar micro-organismos indesejados, como fungos e bactérias, em proteção de cultivo e na proteção de materiais.
[000104] A invenção também se refere a um método para controlar micro-organismos indesejados, caracterizado pelo fato de que as composições inventivas são aplicadas aos fungos fitopatogênicos, bactérias fitopatogênicas e/ou ao seu habitat.
[000105] Os fungicidas podem ser usados em proteção de cultivo para controle de fungos fitopatogênicos. Os mesmos são caracterizados por uma eficácia excelente contra um amplo espectro de fungos fitopatogênicos, incluindo patógenos presentes no solo, que são em particular membros das classes Plasmodiophoromycetes, Peronospo- romycetes (sinônimo Oomycetes), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes e Deuteromycetes (sinônimo Fungi im- perfecti). Alguns fungicidas são sistemicamente ativos e podem ser usados em proteção de planta como fungicida foliar, de peliculização de semente ou de solo. Adicionalmente, os mesmos são adequados para combater fungos, que, dentre outros, infestam madeira ou raízes da planta.
[000106] Os bactericidas podem ser usados na proteção de cultivo para controle de Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteria- ceae, Corynebacteriaceae e Streptomycetaceae.
[000107] Os exemplos não limitantes de patógenos de doenças fúngicas que podem ser tratadas de acordo com a invenção incluem: doenças ocasionadas por patógenos de míldio pulverulento, por exemplo, espécie Blumeria, por exemplo, Blumeria graminis; espécie Podosphaera, por exemplo, Podosphaera leucotricha; espécie Sphaerotheca, por exemplo, Sphaerotheca fuliginea; espécie Uncinula, por exemplo, Uncinula necator; doenças ocasionadas por patógenos de doença de ferrugem, por exemplo, espécie Gymnosporangium, por exemplo, Gymnosporangium sabinae; espécie Hemileia, por exemplo, Hemileia vastatrix; espécie Phakopsora, por exemplo, Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae; espécie Puccinia, por exemplo, Puccinia re-condite, P. triticina, P. graminis ou P. striiformis; espécie Uromyces, por exemplo, Uromyces appendiculatus; doenças ocasionadas por patógenos do grupo dos Oomice- tos, por exemplo, espécie Albugo, por exemplo, Algubo candida; espécie Bremia, por exemplo, Bremia lactucae; espécie Peronospora, por exemplo, Peronospora pisi ou P. brassicae; espécie Phytophthora, por exemplo, Phytophthora infestans; espécie Plasmopara, por exemplo, Plasmopara viticola; espécie Pseudoperonospora, por exemplo, Pseu- doperonospora humuli ou Pseudoperonospora cubensis; espécie Pythium, por exemplo, Pythium ultimum; doenças de mancha foliar e doenças de murcha foliar oca-sionadas, por exemplo, por espécies Alternaria, por exemplo, Alternaria solani; espécie Cercospora, por exemplo, Cercospora beticola; es-pécie Cladiosporium, por exemplo, Cladiosporium cucumerinum; espécie Cochliobolus, por exemplo, Cochliobolus sativus (forma conídio: Drechslera, sinônimo: Helminthosporium), Cochliobolus miyabeanus; espécie Colletotrichum, por exemplo, Colletotrichum lindemuthanium; espécie Cycloconium, por exemplo, Cycloconium oleaginum; espécie Dia- porthe, por exemplo, Diaporthe citri; espécie Elsinoe, por exemplo, Elsinoe fawcettii; espécie Gloeosporium, por exemplo, Gloeosporium laeticolor; espécie Glomerella, por exemplo, Glomerella cingulata; espécie Guignardia, por exemplo, Guignardia bidwelli; espécie Leptosphaeria, por exemplo, Leptosphaeria macu- lans, Leptosphaeria nodorum; espécie Magnaporthe, por exemplo, Magnaporthe grisea; espécie Marssonia, por exemplo, Marssonia coronaria; espécie Microdochium, por exemplo, Microdochium nivale; espécie Mycosphaerella, por exemplo, Mycosphaerella graminicola, M. arachidicola e M. fijiensis; espécie Phaeosphaeria, por exemplo, Phaeosphaeria nodo- rum; espécie Pyrenophora, por exemplo, Pyrenophora teres, Pyre- nophora tritici repentis; espécie Ramularia, por exemplo, Ramularia collo-cygni, Ramularia areola; espécie Rhynchosporium, por exemplo, Rhynchosporium secalis; espécie Septoria, por exemplo, Septoria apii, Septoria lycopersii; espécie Typhula, por exemplo, Typhula incarnata; espécie Venturia, por exemplo, Venturia inaequalis; doenças de raiz e tronco ocasionadas, por exemplo, por espécie Corticium, por exemplo, Corticium graminearum; espécie Fu-sarium, por exemplo, Fusarium oxysporum; espécie Gaeumannomyces, por exemplo, Gaeumanno- myces graminis; espécie Rhizoctonia, como, por exemplo, Rhizoctonia solani; doenças de Sarocladium ocasionadas, por exemplo, por Sarocladium oryzae; doenças de Sclerotium ocasionadas, por exemplo, por Scle-rotium oryzae; espécie Tapesia, por exemplo, Tapesia acuformis; espécie Thielaviopsis, por exemplo, Thielaviopsis basicola; doenças de espiga e panícula (que incluem espigas de milho) ocasionadas, por exemplo, por espécie Alternaria, por exemplo, Alternaria spp.; espécie Aspergillus, por exemplo, Aspergillus flavus; espécie Cladosporium, por exemplo, Cladosporium cladosporioides; espécie Claviceps, por exemplo, Claviceps purpurea; espécie Fusarium, por exemplo, Fusarium culmorum; espécie Gibberella, por exemplo, Gibberella zeae; espécie Monographella, por exemplo, Monographella nivalis; espécie Septoria, por exemplo, Septoria nodorum; doenças ocasionadas por fungos de fuligem, por exemplo, espécie Sphacelotheca, por exemplo, Sphacelotheca reiliana; espécie Tilletia, por exemplo, Tilletia caries, T. controversa; espécie Urocystis, por exemplo, Urocystis occulta; espécie Ustilago, por exemplo, Ustilago nuda, U. nuda tritici; podridão de fruta ocasionada, por exemplo, por espécie Aspergillus, por exemplo, Aspergillus flavus; espécie Botrytis, por exemplo, Botrytis cinerea; espécie Penicillium, por exemplo, Penicillium expansum e P. purpurogenum; espécie Sclerotinia, por exemplo, Sclerotinia sclerotiorum; espécie Verticilium, por exemplo, Verticilium alboatrum; doenças de semente e presentes no solo de queda, mofo, murcha, podridão e necrose ocasionadas, por exemplo, por espécie Alternaria, ocasionadas, por exemplo, por Alternaria brassicicola; espécie Aphanomyces, ocasionada, por exemplo, por Aphanomyces euteiches; espécie Ascochyta, ocasionada, por exemplo, por Asco- chyta lentis; espécie Aspergillus, ocasionada, por exemplo, por Aspergillus flavus; espécie Cladosporium, ocasionada, por exemplo, por Cla- dosporium herbarum; espécie Cochliobolus, ocasionada, por exemplo, por Co- chliobolus sativus; (Forma de conídios: Drechslera, Bipolaris sinônimo: Helminthosporium); espécie Colletotrichum, ocasionada, por exemplo, por Colletotrichum coccodes; espécie Fusarium, ocasionada, por exemplo, por Fusarium culmorum; espécie Gibberella, ocasionada, por exemplo, por Gibberel- la zeae; espécie Macrophomina, ocasionada, por exemplo, por Ma- crophomina phaseolina; espécie Monographella, ocasionada, por exemplo, por Mo- nographella nivalis; espécie Penicillium, ocasionada, por exemplo, por Penicil- lium expansum; espécie Phoma, ocasionada, por exemplo, por Phoma lingam; espécie Phomopsis, ocasionada, por exemplo, por Phomopsis sojae; espécie Phytophthora, ocasionada, por exemplo, por Phytophthora cactorum; espécie Pyrenophora, ocasionada, por exemplo, por Pyre- nophora graminea; espécie Pyricularia, ocasionada, por exemplo, por Pyricula- ria oryzae; espécie Pythium, ocasionada, por exemplo, por Pythium ul- timum; espécie Rhizoctonia, ocasionada, por exemplo, por Rhizoc- tonia solani; espécie Rhizopus, ocasionada, por exemplo, por Rhizopus oryzae; espécie Sclerotium, ocasionada, por exemplo, por Sclerotium rolfsii; espécie Septoria, ocasionada, por exemplo, por Septoria nodorum; espécie Typhula, ocasionada, por exemplo, por Typhula in- carnata; espécie Verticillium, ocasionada, por exemplo, por Verticil- lium dahliae; cânceres, galhas e vassoura-de-bruxa ocasionadas, por exemplo, por espécie Nectria, por exemplo, Nectria galligena; doenças de murchidão ocasionadas, por exemplo, por es-pécie Monilinia, por exemplo, Monilinia laxa; doenças de bolha da folha ou doenças de ondulção da folha ocasionadas, por exemplo, por espécie Exobasidium, por exemplo, Exobasidium vexans; espécie Taphrina, por exemplo, Taphrina deformans; doenças de declínio de plantas de madeira ocasionadas, por exemplo, por doença Esca, ocasionada, por exemplo, por Phae- moniella clamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterranea; superbrotamento de Eutypa, causada, por exemplo, por Eu- typa lata; doenças de Ganoderma causadas, por exemplo, por Gano- derma boninense; doenças de Rigidoporus causadas, por exemplo, por Rigidoporus lignosus; doenças de flores e sementes ocasionadas, por exemplo, por espécie Botrytis, por exemplo, Botrytis cinerea; doenças de tubérculos de planta ocasionadas, por exemplo, por espécie Rhizoctonia, por exemplo, Rhizoctonia solani; espécie Helminthosporium, por exemplo, Helminthosporium solani; raiz deformada ocasionada, por exemplo, por espécie Plasmodiophora, por exemplo, Plamodiophora brássicae; doenças ocasionadas patógenos bacterianos, por exemplo, espécie Xanthomonas, por exemplo, Xanthomonas campestris pv. ory- zae; espécie Pseudomonas, por exemplo, Pseudomonas syrin- gae pv. lachrymans; espécie Erwinia, por exemplo, Erwinia amylovora.
[000108] As seguintes doenças de soja podem ser controladas com preferência: doenças fúngicas em folhas, troncos, vagens e sementes ocasionadas, por exemplo, por mancha de folha de Alternaria (Alternaria spec. atrans tenuissima), Anthracnose (Colletotrichum gloeosporoides dematium var. truncata), mancha marrom (Septoria glicinas), mancha e praga de folha de cercospora (Cercospora kikuchii), praga de folha de choanephora (Choanephora infundibulifera trispora (sinônimo)), mancha de folha de dactuliophora (Dactuliophora glicinas), míldio (Peronospora manshurica), praga de drechslera (Drechslera glycini), mancha-olho-de- rã de folha (Cercospora sojina), mancha de folha de leptosphaerulina (Leptosphaerulina trifolii), mancha de folha de phyllostica (Phyllosticta sojaecola), praga de vagem e tronco (Phomopsis sojae), oídio (Micros- phaera diffusa), mancha de folha de pyrenochaeta (Pyrenochaeta glici- nas), praga aérea, de folhagem e de manta de rhizoctonia (Rhizoctonia solani), ferrugem (Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae), sarna (Sphaceloma glicinas), praga de folha de stemphylium (Stemphylium bo- tryosa), mancha de alvo (Corynespora cassiicola).
[000109] Doenças fúngicas em raízes e a base de tronco ocasionadas, por exemplo, por podridão preta de raiz (Calonectria crotalariae), podridão cinzenta (Macrophomina phaseolina), praga ou murchidão de fusarium, podridão de raiz e podridão de vagem e colar (Fusarium oxysporum, Fusarium orthoceras, Fusarium semitectum, Fusarium equiseti), podridão de raiz de mycoleptodiscus (Mycoleptodiscus ter- restris), neocosmospora (Neocosmospora vasinfecta), praga de tronco e vagem (Diaporthe phaseolora), cancro de tronco (Diaporthe phaseo- lorum var. caulivora), podridão de phytophthora (Phytophthora megas- perma), podridão de tronco marrom (Phialophora gregata), podridão de pythium (Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, Pythium de- baryanum, Pythium myriotylum, Pythium ultima), podridão de raiz, queda de tronco e podridão de plântulas de (Rhizoctonia solani), queda de tronco de sclerotinia (Sclerotinia sclerotiora), praga meridional de sclerotinia (Sclerotinia rolfsii), podridão de raiz de thielaviopsis (Thi- elaviopsis basicola).
[000110] As composições inventivas fungicidas podem ser usadas para controle de cura ou protetor/preventivo de fungos fitopatogênicos. Portanto, a invenção também se refere a métodos curativos e protetores para controlar fungos fitopatogênicos pelo uso das composições inventivas, que são aplicadas à semente, à planta ou a partes da planta, à fruta ou ao solo no qual as plantas crescem.
[000111] O fato de que as composições são bem toleradas por plantas nas concentrações requeridas para controlar as doenças de planta permite o tratamento de partes de plantas acima do solo, de estoque e sementes de propagação, e do solo.
[000112] De acordo com a invenção, todas as plantas e partes de planta podem ser tratadas incluindo cultivares e variedades de planta (se protegíveis ou não por variedade de planta ou direitos de reprodutor de planta). Cultivares e variedades de planta podem ser plantas obtidas por métodos convencionais de propagação e melhoramento que podem ser auxiliados ou suplementados por um ou mais métodos biotecnológicos, como o uso de haploides duplos, fusão de protoplas- to, mutagênese aleatória e dirigida, marcadores moleculares ou genéticos ou por métodos de bioengenharia e engenharia genética.
[000113] Em certos aspectos, as composições da presente invenção são aplicadas a cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1014 unidades formadoras de colônia (UFC) de cepa fungicida NRRL B-50972 de Paeniba- cillus sp. ou cepa mutante fungicida da mesma por hectare. Em outros aspectos, as composições da presente invenção são aplicadas a cerca de 1 x 109 a cerca de 1 x 1013 unidades formadoras de colônia (UFC) de cepa fungicida NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou cepa mutante fungicida da mesma por hectare. Ainda em outros aspectos, as composições da presente invenção são aplicadas a cerca de 1 x 1010 a cerca de 1 x 1012 unidades formadoras de colônia (UFC) de cepa fungicida NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. ou cepa mutante fungicida da mesma por hectare.
[000114] Em algumas modalidades, as composições da presente in-venção são aplicadas a cerca de 0,1 kg a cerca de 10 kg de sólidos de fermentação por hectare. Em outras modalidades, as composições da presente invenção são aplicadas a cerca de 0,25 kg a cerca de 7,5 kg de sólidos de fermentação por hectare. Ainda em outras modalidades, as composições da presente invenção são aplicadas a cerca de 0,5 kg a cerca de 5 kg de sólidos de fermentação por hectare. As composições da presente invenção também podem ser aplicadas a cerca de 1 kg ou cerca de 2 kg de sólidos de fermentação por hectare.
[000115] As composições inventivas, quando são bem toleradas por plantas, têm toxicidade homotérmica favorável e são bem toleradas pelo ambiente, são adequadas para proteger plantas e órgãos da planta, para acentuação de produtividades de colheita, para aprimorar a qualidade do material colhido. As mesmas podem, de preferência, ser usadas como composições de proteção de cultivo. As mesmas são ativas contra espécies normalmente sensíveis e resistentes e contra todos ou alguns estágios de desenvolvimento.
[000116] As plantas que podem ser tratadas de acordo com a invenção incluem as seguintes plantas de cultivo principais: milho, soja, alfafa, algodão, girassol, sementes oleosas de Brassica, como Brassica napus (por exemplo, canola, semente de colza), Brassica rapa, B. jun- cea (por exemplo, (campo) mostarda) e Brassica carinata, Arecaceae sp. (por exemplo, palma, coco), arroz, trigo, batata-doce, cana de açú-car, aveias, centeio, cevada, painço e sorgo, triticale, linho, nozes, uvas e videira e várias frutas e vegetais de várias taxonômicos botânicos, por exemplo, Rosaceae sp. (por exemplo, pomóideas como maçãs e peras, mas também drupas como damascos, cerejas, amêndoas, ameixas e pêssegos, e frutas de bagas como morangos, framboesas, groselha negra e vermelha e groselha espinhosa), Ribesioidae sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp. (por exemplo, oliveira), Actinidaceae sp., Lauraceae sp. (por exemplo, abacate, canela, cânfora), Musaceae sp. (por exemplo, bananeiras e plantações de banana), Rubiaceae sp. (por exemplo, café), Theaceae sp. (por exemplo, chá), Sterculiceae sp., Rutaceae sp. (por exemplo, limões, laranjas, mandarinas e pomelo); Solanaceae sp. (por exemplo, tomates, batatas, pimentas, pimen- ta-da-guiné, berinjelas, tabaco), Liliaceae sp., Compositae sp. (por exemplo, alface, alcachofras e chicória - incluindo raiz de chicória, en- dívia ou chicória comum), Umbelliferae sp. (por exemplo, cenouras, salsa, aipo e aipo-rábano), Cucurbitaceae sp. (por exemplo, pepinos - incluindo picles, abóboras, melancias, cabaças e melões), Alliaceae sp. (por exemplo, alhos-porós e cebolas), Cruciferae sp. (por exemplo, repolho branco, repolho roxo, brócolis, couve-flor, couve-de-Bruxelas, pak-choi, couve-rábano, rabanetes, rábano silvestre, agrião e repolho chinês), Leguminosae sp. (por exemplo, amendoins, ervilhas, lentilhas e feijões - por exemplo, feijões comuns e feijões grandes), Cheno- podiaceae sp.(por exemplo, acelga, beterraba forrageira, espinafre, raiz da beterraba), Linacae sp. (por exemplo, cânhamo), Cannabeacea sp. (por exemplo, cannabis), Malvaceae sp. (por exemplo, quiabo, cacau), Papaveraceae (por exemplo, papoula), Asparagaceae (por exemplo, aspargos); As plantas úteis e ornamental plantas nos jardins e floretas incluindo relva, gramado, grama e Stevia rebaudiana; e, em cada caso, os tipos geneticamente modificados dessas plantas.
[000117] Em certos aspectos, o produto de fermentação compreende adicionalmente um ingrediente de formulação. O ingrediente de formu-lação pode ser um agente de molhagem, extensor, solvente, promotor de espontaneidade, emulsificante, dispersante, protetor contra geada, espessante e/ou um adjuvante. Em uma modalidade, o ingrediente de formulação é um agente de molhagem. Em outros aspectos, o produto de fermentação é um pó seco por congelamento ou um pó seco por aspersão.
[000118] As composições da presente invenção podem incluir ingredi-entes de formulação adicionados às composições da presente invenção para aprimorar a recuperação, a eficácia ou as propriedades físicas e/ou auxiliar no processamento, embalagem e administração. Tais ingredien-tes de formulação podem ser adicionados individualmente ou em combi-nação.
[000119] Os ingredientes de formulação podem ser adicionados às composições que compreendem células, preparações livres de célula, compostos isolados e/ou metabólitos para aprimorar a eficácia, a estabi-lidade e as propriedades físicas, utilidade e/ou para facilitar o processa-mento, a embalagem e a aplicação de uso final. Tais ingredientes de formulação podem incluir carreadores agricolamente aceitáveis, inertes, agentes de estabilização, conservantes, nutrientes ou agentes de modifi-cação de propriedade física, que podem ser adicionados individualmente ou em combinação. Em algumas modalidades, os carreadores podem incluir materiais líquidos como água, óleo, e outros solventes orgânicos ou inorgânicos e materiais sólidos como minerais, polímeros, ou comple-xos poliméricos derivados biologicamente ou por síntese química. Em algumas modalidades, o ingrediente de formulação é um aglutinante, ad-juvante ou adesivo que facilita a aderência da composição a uma parte de planta, como folhas, sementes ou raízes. Consulte, por exemplo, Tay lor, A.G., et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treat-ments," Annu. Rev. Phytopathol., 28: 321-339 (1990). Os agentes de es-tabilização podem incluir agentes antiformação de torta, agentes antioxi- dação, agentes antiassentamento, agentes antiformação de espuma, dessecantes, protetores ou conservantes. Os nutrientes podem incluir fontes de carbono, nitrogênio e fósforo como açúcares, polissacarídeos, óleo, proteínas, aminoácidos, ácidos graxos e fosfatos. Os modificadores de propriedade física podem incluir agentes avolumadores, agentes de molhagem, espessantes, modificadores de pH, modificadores de reolo- gia, dispersantes, adjuvantes, tensoativos, formadores de filme, hidrótro- pos, reforçadores, agentes anticongelamento ou corantes. Em algumas modalidades, a composição que compreende células, preparação livre de célula resultante e/ou metabólitos produzidos por fermentação podem ser usados diretamente com ou sem água como o diluente sem qualquer outra preparação de formulação. Em uma modalidade particular, um agente de molhagem, ou um dispersante, é adicionado a um sólido de fermentação, como um pó seco por congelamento ou seco por aspersão. Um agente de molhagem aumenta as propriedades de espalhamento e penetração, ou um dispersante aumenta a capacidade de dispersão e a solubilidade do ingrediente ativo (uma vez diluído) quando é aplicado às superfícies. Os agentes de molhagem exemplificadores são conhecidos pelos elementos versados na técnica e incluem sulfossuccinatos e deri-vados, como MULTIWETTM MO-70R (Croda Inc., Edison, NJ, EUA); siloxanos como BREAK-THRU® (Evonik, Alemanha); compostos não iô- nicos, como ATLOXTM 4894 (Croda Inc., Edison, NJ, EUA); alquil poligli- cosídeos, como TERWET® 3001 (Huntsman International LLC, The Wo-odlands, Texas, EUA); etoxilato de álcool C12-C14, como TERGITOL® 15-S-15 (The Dow Chemical Company, Midland, Michigan, EUA); ésteres de fosfato, como RHODAFAC® BG-510 (Rhodia, Inc.); e carboxilatos de éter alquílico, como EMULSOGENTM LS (Clariant Corporation, North Ca rolina, EUA).
INFORMAÇÕES DE DEPÓSITO
[000120] Uma amostra de uma cepa de Paenibacillus sp. da invenção foi depositada junto à Coleção de Cultura de Serviço de Pesquisa Agrícola situada no Centro Nacional para Pesquisa de Utilização Agrícola, Serviço de Pesquisa Agrícola, Departamento de Agricultura dos EUA (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, EUA, de acordo com o Tratado de Budapeste em 28 de agosto de 2014, e à mesma foi atribuído o seguinte número de acesso: NRRL B-50972.
[000121] Uma amostra da cepa de Paenibacillus sp. derivada da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. que demonstra uma morfologia de colônia estável foi depositada junto à Coleção de Cultura de Serviço de Pesquisa Agrícola situada no Centro Nacional para Pesquisa de Utilização Agrícola, Serviço de Pesquisa Agrícola, Departamento de Agricultura dos EUA (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, EUA, de acordo com o Tratado de Budapeste em 1 de setembro de 2015, e à mesma foi atribuído o seguinte número de acesso: NRRL B-67129.
[000122] As cepas de Paenibacillus sp. foram depositadas sob as condições que asseguram que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente para um elemento de-terminado pelo Diretor de Patentes e Marcas a ser intitulado a isso de acordo com 37 C.F.R. § 1.14 e 35 U.S.C. §122. Entretanto, deve ficar entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção em derrogação dos direitos de patente concedidos por ação governamental.
[000123] Os seguintes exemplos são dados puramente propósitos ilustrativos e não limitantes da presente invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1. Seleção de NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.
[000124] Os genomas de várias cepas de Paenibacillus sp. foram sequenciados. Os dados genômicos foram analisados para identificar as cepas com o agrupamento gênico de biossíntese de fusaricidina, mas sem o agrupamento gênico de polimixina sintetase. O agrupamento gênico responsável pela biossíntese de fusaricidina (fusA) foi identificado e caracterizado anteriormente como tendo o agrupamento gênico de polimixina sintetase. Consulte, por exemplo, Li et al., "Nonribosomal Biosynthesis of Fusaricidins by Paenibacillus poly- myxa PKB1 Involves Direct Activation of a D-Amino Acid", Chemistry & Biology, 15:118-127 (2008); Li et al., "Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21", Applied Microbiol Bio- technol, 97:9479-9489 (2013); e Choi et al., "Identification of a Polymyxin Synthetase Gene Cluster of Paenibacillus polymyxa and Heterologous Expression of the Gene in Bacillus subtilis", Journal of Bacteriology, 191(10):3350-3358 (2009).
[000125] As cepas identificadas com essa análise foram adicionalmente avaliadas para confirmar a produção de fusaricidina. Brevemente, cada cepa foi cultivada em um meio à base de soja e a fração lipofí- lica do caldo integral foi extraída. O extrato de caldo integral foi analisado através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e a presença de fusaricidina A foi identificada com base no perfil de HPLC gerado com uma amostra padrão que contém fusaricidina A.
Exemplo 2. Atividade Antifúngica em planta de Caldos Integrais de Cepas de Paenibacillus sp.
[000126] As cepas de Paenibacillus sp. selecionadas que incluem a cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. foram crescidas em um meio à base de soja para produzir culturas de caldo integral. A água destilada foi adicionada a cada um dos caldos integrais para produzir uma diluição final de 10%.
[000127] Os caldos integrais diluídos foram aplicados às folhas de plantas jovens que foram subsequentemente expostas a um inóculo fún-gico de requeima-do-tomateiro (PHYTIN), podridão cinzenta (BOTRCI) ou ferrugem de folhas de trigo (PUCCRT). Um controle não tratado foi incluído para propósitos de comparação em casa ensaio. Vários dias após a exposição aos inóculos fúngicos, cada planta foi classificada em relação ao controle de porcentagem do patógeno relativo às plantas de controle não tratado. Cada tratamento foi avaliado com três réplicas e o controle médio de porcentagem com cada caldo integral da cepa de Pa- enibacillus sp. mostrado na FIGURA 1.
[000128] Dentre as 23 cepas testadas em relação à atividade anti- fúngica contra PHYTIN, BOTRCI e PUCCRT, a cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. foi uma das poucas cepas que teve um nível rela-tivamente alto de atividade contra todos os três patógenos fúngicos.
Exemplo 3. Eficácia Biológica In Vitro do Extrato fusaricidina de Cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.
[000129] As culturas de caldo integral de várias cepas de Paenibaci- llus sp., que incluem NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., foram preparadas com o uso de um meio à base de soja. As frações lipofílicas que contêm fusaricidinas foram extraídas dos caldos integrais. Três frações separadas que contêm várias fusaricidinas e metabólitos fúngicos foram produzidas a partir do extrato do caldo integral da primeira cepa de Paenibacillus sp. (isto é, Fração 1, Fração 2, e Fração 3). O extrato da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. não foi adicionalmente separado.
[000130] As frações que contêm fusaricidina de cada cepa foram tes-tadas contra os doze patógenos fúngicos a seguir: Alternaria alternata (ALTEAL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Fusarium culmorum (FUSACU), Phaeosphaeria nodorum (LEPTNO), Zymoseptoria tritici (SEPPTR), Phytophthora cryptogea (PHYTCR), Phytophthora infestans (PHYTIN), Pythium ultimum (PYTHUL), Magnaporthe oryzae (PYRIOR), Thana- tephorus cucumeris (RHIZSO), Ustilago segetum var. avenae (USTI- AV) e Uromyces appendiculatus (UROMAP). A inibição de crescimento de célula fúngica pelas diferentes frações foi avaliada em um meio à base de soja e em comparação ao crescimento de controles não tratados. Foram testadas oito doses de cada fração variando de 0,005 ppm a 100 ppm. As doses eficazes que produzem 50% de inibição (ED50) e 80% de inibição (ED80) são relatadas na tabela na FIGURA 2.
[000131] A fração que contém fusaricidina de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. exibiu um espectro amplo de atividade antifúngica através dos doze ensaios que foram observados com as frações da outra cepa de Paenibacillus sp. A fração de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. também demonstrou uma atividade muito maior nos ensaios que aquela observada com as frações da outra cepa de Pae- nibacillus sp. (consulte a FIGURA 2).
Exemplo 4. Teste Preventivo In Vivo em Tomates Infectados com Phytophthora
[000132] Nesse ensaio de estufa de patógeno de planta, o produto de fermentação de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. foi testado em comparação a três outras cepas de Paenibacillus sp. que demonstraram atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem. Para produzir uma preparação adequada dos compostos, uma parte em peso do pó seco por aspersão de caldo integral de cada cepa cultivada em um meio à base de soja foi misturada com água e 0,1 parte em peso do emulsificador (alquilaril poliglicol éter) e, subsequentemente, diluída com água para a concentração desejada.
[000133] Para o teste em relação à atividade preventiva, as plantas jovens foram aspergidas com a preparação de composto na taxa clas-sificada de aplicação. Após o revestimento por aspersão ter secado, as plantas foram inoculadas com uma suspensão aquosa de esporos de Phytophthora infestans. As plantas foram, então, colocadas em uma cabine de incubação a aproximadamente 20°C e uma umidade atmosférica relativa de 100%.
[000134] O teste foi avaliado 3 dias após a inoculação. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença é observada. Tabela 2: Teste Preventivo In Vivo em Phytophthora (tomates)
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Exemplo 5. Teste Preventivo In Vivo em Videiras Infectadas com Plasmopara
[000135] Nesse ensaio de estufa de patógeno de planta, o produto de fermentação de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. foi testado em comparação a três outras cepas de Paenibacillus sp. que demonstraram atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem. Para produzir uma preparação adequada dos compostos, uma parte em peso do pó seco por aspersão preparado como descrito no Exemplo 5 foi misturada com água e 0,1 parte em peso do emulsificador (alquilaril poliglicol éter) e, subsequentemente, diluída com água para a concentração desejada.
[000136] Para o teste em relação à atividade preventiva, as plantas jovens foram aspergidas com a preparação de composto na taxa clas-sificada de aplicação. Após o revestimento por aspersão ter secado, as plantas foram inoculadas com uma suspensão aquosa de esporos de Plasmopara viticola e, então, permaneceram por 1 dia em uma cabine de incubação a aproximadamente 20°C e uma umidade atmosférica relativa de 100%. As plantas foram subsequentemente colocadas por 4 dias em uma estufa a aproximadamente 21°C e uma umidade atmosférica relativa de aproximadamente 90%. As plantas foram, en- tão, misturadas e colocadas por 1 dia em uma cabine de incubação.
[000137] O teste foi avaliado 6 dias após a inoculação. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença é observada. Tabela 3: Teste Preventivo In Vivo em Plasmopara (videiras)
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Exemplo 6. Teste Preventivo In Vivo em Feijões Infectados com Uromyces
[000138] Nesse ensaio de estufa de patógeno de planta, o produto de fermentação de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. foi testado em comparação a três outras cepas de Paenibacillus sp. que demonstraram atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem. Para produzir uma preparação adequada dos compostos, 1 parte em peso do pó seco por aspersão preparado como descrito no Exemplo 5 foi misturada com água e 0,1 parte em peso do emulsificador (alquilaril poliglicol éter) e, subsequentemente, diluída com água para a concentração desejada.
[000139] Para o teste em relação à atividade preventiva, as plantas jovens foram aspergidas com a preparação de composto na taxa clas-sificada de aplicação. Após o revestimento por aspersão ter secado, as plantas foram inoculadas com uma suspensão aquosa de esporos do agente causador de ferrugem de feijão (Uromyces appendiculatus) e, então, permaneceram por 1 dia em uma cabine de incubação a aproximadamente 20°C e uma umidade atmosférica relativa de 100%.
[000140] As plantas foram, então, colocadas em uma estufa a apro-ximadamente 21°C e uma umidade atmosférica relativa de aproxima-damente 90%.
[000141] O teste foi avaliado 10 dias após a inoculação. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença é observada. Tabela 4: Teste Preventivo In Vivo em Uromyces (Feijões)
Figure img0013
Exemplo 7. Comparação de Cepas de Paenibacillus em um Ensaio de Campo de Zucchini Infectado com Míldio Pulverulento (Sphae- rotheca fuliginea)
[000142] Dois ensaios de campo com zucchini, artificialmente inoculado com Sphaerotheca fuliginea, foram conduzidos. Cinco tratamentos com pó seco por aspersão de caldo integral de cada cepa de Pae- nibacillus sp. cultivada em um meio à base de soja foram ressuspen- sos em água em um volume de aplicação de 1000 l/ha e aplicados às plantas entre 15 de julho e 8 de agosto em um estágio de crescimento de BBCH59 a BBCH72 em um intervalo de 4 a 8 dias como destacado na Tabela 6. O percentual de controle de doença mostrado na Tabela 5 é o resultado da última avaliação feita 10 dias após a aplicação final, feita pela observação visual de sintomas de doença. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença foi observada.
Figure img0014
Figure img0015
[000143] Os resultados na Tabela 4 mostram claramente que a atividade observada de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. é superior em comparação a outras cepas testadas nesse ensaio de campo, que demonstrou atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem.
Exemplo 8. Comparação de Cepas de Paenibacillus em um Ensaio de Campo de Videira Infectado com Míldio Pulverulento (Uncinula Necator)
[000144] Dois ensaios de campo com videira, naturalmente infectada com Uncinula necator, foram conduzidos. Seis tratamentos com os pós secos por aspersão descritos no Exemplo 8 foram ressus- pensos em água em um volume de aplicação de 1000 l/ha e aplicados às plantas entre 3 de junho e 1 de julho em um estágio de crescimento de BBCH57 a BBCH75 em um intervalo de 5 a 7 dias como destacado na Tabela 8. O percentual de controle de doença mostrado na Tabela 7 é o resultado da última avaliação feita 15 dias após a aplicação final, feita pela observação visual de sintomas de doença. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado enquanto uma eficácia de 100% significa que ne- nhuma doença foi observada.
Figure img0016
[000145] Os resultados na Tabela 7 mostram claramente que a atividade observada de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. é superior em comparação a outras cepas testadas nesse ensaio de campo, que demonstrou atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem.
Exemplo 9. Comparação de Cepas de Paenibacillus em um Ensaio de Campo de Tomate Infectado com Pinta Preta (Alternaria solani)
[000146] Dois ensaios de campo com tomateiros, artificialmente inocu-lados com Alternaria solani, foram conduzidos. Três tratamentos com os pós secos por aspersão descritos no Exemplo 8 foram ressuspensos em água em um volume de aplicação de 1000 l/ha e aplicados às plantas entre 26 de junho e 10 de julho em um estágio de crescimento de BBCH51 a BBCH59 em um intervalo de 6 a 8 dias como destacado na Tabela 10. O percentual de controle de doença mostrado na Tabela 9 é o resultado da última avaliação feita 8 dias após a aplicação final, feita pela observação visual de sintomas de doença. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença foi observada.
Figure img0017
[000147] Os resultados na Tabela 9 mostram claramente que a ativi- dade observada de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. é superior em comparação a outras cepas testadas nesse ensaio de campo, que demonstrou atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem.
Exemplo 10. Comparação de Cepas de Paenibacillus em um Ensaio de Campo de Batata Infectado com Pinta Preta (Alternaria solani)
[000148] Um ensaio de campo com pés de batata, artificialmente inoculados com Alternaria solani, foi conduzido. Cinco tratamentos com os pós secos por aspersão descritos no Exemplo 8 foram ressus- pensos em água em um volume de aplicação de 500 l/ha e aplicados às plantas entre 26 de junho e 19 de julho em um estágio de crescimento de BBCH37 a BBCH55 em um intervalo de 4 a 8 dias como destacado na Tabela 12. O percentual de controle de doença mostrado na Tabela 11 é o resultado da última avaliação feita 6 dias após a aplicação final, feita pela observação visual de sintomas de doença. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tra-tado enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença foi observada.
Figure img0018
[000149] Os resultados na Tabela 11 mostram claramente que a ati- vidade observada de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. é superior em comparação a outras cepas testadas nesse ensaio de campo, que demonstrou atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem.
Exemplo 11. Comparação de Cepas de Paenibacillus em um Ensaio de Campo de Batata Infectado com Pinta Preta (Alternaria solani)
[000150] Um ensaio de campo com pés de batata, artificialmente inoculados com Alternaria solani, foi conduzido. Três tratamentos com os pós secos por aspersão descritos no Exemplo 8 foram ressuspen- sos em água em um volume de aplicação de 500 L/ha e aplicados nas plantas entre 24 de julho e 5 de agosto em um estágio de crescimento de BBCH37 a BBCH51 em um intervalo de 6 dias como destacado na Tabela 14. O percentual de controle de doença mostrado na Tabela 13 é o resultado da última avaliação feita 6 dias após a aplicação final, feita pela observação visual de sintomas de doença. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença foi observada.
Figure img0019
[000151] Os resultados na Tabela 13 mostram claramente que a ati- vidade observada de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. é superior em comparação a outras cepas testadas nesse ensaio de campo, que demonstrou atividade antifúngica relativamente alta nos ensaios anteriores de triagem.
Exemplo 12. Identificação de Variação de fusA em Cepa NRRL B- 50972 de Paenibacillus sp.
[000152] Para caracterizar adicionalmente a cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., a sequência genômica do gene fusA que codifica a fusaricidina sintetase FusA foi determinada com métodos de sequen- ciamento padrão, e a sequência de aminoácidos relacionada foi identi-ficada. A sequência de aminoácidos de FusA expresso pela cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. foi comparada àquela de várias outras cepas de Paenibacillus que incluem aquelas descritas nas seguintes publicações: Li S., et al., (2014). "Complete Genome Sequence of Pae- nibacillus polymyxa SQR-21, a Plant Growth-Promoting Rhizobacte- rium with Antifungal Activity and Rhizosphere Colonization Ability", Genome Announc, 2(2):HASH(0x743db288); Niu B., et al., (2011). "The Genome of the Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Paenibacillus polymyxa M-1 Contains Nine Sites Dedicated to Nonribosomal Synthesis of Lipopeptides and Polyketides", J. Bacteriol. 193(20):5862-3; Ma M., et al., (2011) "Complete Genome Sequence of Pae- nibacillus polymyxa SC2, A Strain of Plant Growth-Promoting Rhizo- bacterium with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity", J. Bacteriol. 193(1):311-2; e Li e Jensen, (2008). Nonribosomal Biosynthesis of Fusari- cidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a d-amino Acid. Chem. Biol. 15, 118-127.
[000153] O alinhamento mostrado na FIGURA 13 revelou significativas deleções na fusaricidina sintetase FusA variante expressada por NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Uma primeira deleção se estende da posição 3009 para posição 3037 da sequência correspondente na cepa A de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 11). Uma segunda deleção se estende da posição 3047 para posição 3317 da sequência correspondente na cepa A de Paenibacillus sp. (SEQ ID N°: 11). Ambas as dele- ções se enquadram no domínio A do terceiro módulo da fusaricidina sintetase FusA (isto é, FusA-A3).
[000154] Como explicado acima, cada um dos domínios A contém dez resíduos de aminoácido conservados responsáveis pelo reconhecimento e ativação do substrato (consulte a Tabela 1). Esses resíduos de aminoácido conservados são destacados no alinhamento mostrado na FIGURA 13. As deleções identificadas na fusaricidina sintetase FusA variante expressada pela cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. removem todos, com exceção do último resíduo de aminoácido con- servado (isto é, Lys517 localizado na posição 3486 de SEQ ID N°: 11).
[000155] Essas duas deleções na fusaricidina sintetase FusA variante Estão presentes nas cepas derivadas da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. que inclui a cepa variante com uma morfologia de colônia estável designada no presente documento como cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. As cepas mutantes aleatórias derivadas de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. manterão geralmente as deleções no FusA-A3 variante visto que a reversão para o FusA-A3 do tipo selvagem é extremamente improvável devido à natureza extensiva das deleções.
Exemplo 13. Comparação de Produção de Fusaricidina ne Cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e Cepa A de Paenibacillus sp.
[000156] Para determinar o efeito do FusA-A3 variante, um painel de fusaricidinas e Paeniserinas foi quantificado em cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (que expressa o FusA-A3 variante) e cepa A de Paenibacillus sp. (que expressa o FusA-A3 do tipo selvagem) com o uso do método descrito no Exemplo 14. A identidade de cada composto foi determinada por sua massa e tempo de retenção únicos. As intensidades relativas de sinal de cada pico no espectro são apresentadas na Tabela 15. A quantificação absoluta não foi possível na ausência de padrões purificados. No entanto, quantidades similares de cada extrato celular foram injetadas e as quantidades relativas dos compostos podem ser estimadas a partir das intensidades de sinal resultantes. Tabela 15
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[000157] Na fusaricidina sintetase FusA do tipo selvagem, FusA-A3 é responsável pela incorporação de L-Tyr, L-Phe, L-Val, L-Ile ou L-allo- Ile no composto de fusaricidina na posição de aminoácido (3) (consulte a Tabela 1). O FusA-A3 variante na cepa NRRL B-50972 de Paeniba- cillus sp. resultou em um extrato sem qualquer fusaricidina C, fusarici- dina D, LiF07a ou LiF07b detectável. Tanto a fusaricidina C quanto a fusaricidina D têm uma tirosina na posição de aminoácido (3) enquanto tanto LiF07a quanto LiF07b têm uma fenilalanina na posição de ami- noácido (3). Esses dados experimentais demonstraram que a variação genética em FusA-A3 expressada pela cepa NRRL B-50972 de Paeni- bacillus sp. inibe a biossíntese de fusaricidinas com uma tirosina ou uma fenilalanina na posição de aminoácido (3) (consulte a FIGURA 14).
[000158] Desse modo, cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepas mutantes derivadas de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. não têm capacidade para produzir quantidades detectáveis de fusaricidinas ou compostos similares à fusaricidina com uma tirosina ou fenilalanina na posição de aminoácido (3) (por exemplo, fusaricidi- nas C e D ou LiF07a e LiF07b). A análise do FusA-A3 variante na cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. indica que essa cepa e seus mutantes são geneticamente incapazes de produzir fusaricidinas ou análogos de fusaricidina com anéis de peptídeo que compreendem um aminoácido de tirosina ou aminoácido de fenilalanina na posição de aminoácido (3).
[000159] Dentre as duas Paeniserinas analisadas, apenas uma foi detectada na cepa A de Paenibacillus sp., e sua intensidade de sinal foi menor que metade da intensidade de sinal correspondente observada com o extrato de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Sem se ater à qualquer teoria, parece que um ou mais dos primeiros nove aminoáci- dos conservados em FusA-A3 (isto é, Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330, e Cys331) são responsáveis pela reconhecimento e ativação de tirosina e fenilalanina na posição (3) nos compostos de fusaricidina. Ademais, o FusA-A3 variante expressado pela cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. pode deslocar os inter-mediários metabólicos na direção contrária da produção de certas fusa- ricidinas para biossíntese de uma faixa mais ampla de compostos simi-lares à fusaricidina (por exemplo, as Paeniserinas).
Exemplo 14. Comparação de Bioatividade da Cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e Cepa A de Paenibacillus sp.
[000160] A cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (que expressa o FusA-A3 variante) e a cepa A de Paenibacillus sp. (que expressa o FusA-A3 do tipo selvagem) foram cultivadas em um meio à base de soja para produzir caldos integrais. Os caldos integrais foram diluídos em uma mistura de água e solvente orgânico para concentrações de 10%, 5%, 2,5% e 1,25%. Os caldos integrais diluídos foram aplicados às plantas jovens que foram subsequentemente expostas a um inóculo de Puccinia triticina (PUCCRT), Botrytis cinerea (BOTRCI) ou Phytophthora infestans (PHYTIN). Vários dias após a exposição ao inóculo de patógeno de planta, cada planta foi classificada em relação ao controle de porcentagem do patógeno relativo às plantas de controle não tratado. Cada tratamento foi avaliado com três réplicas e o controle médio de porcentagem relatado (consulte as Tabelas 16-18).
[000161] Em cada um dos ensaios, a cepa NRRL B-50972 de Pae- nibacillus sp. demonstrou controle superior através da cepa A de Paenibacillus sp. Esses dados experimentais sugeriram que a fusa- ricidina sintetase variante e as alterações resultantes no biossíntese de fusaricidinas e compostos similares à fusaricidina resultaram no controle aumentado de patógenos de planta com NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Tabela 16. Controle de Puccinia triticina (PUCCRT) alcançado com cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepa A de Paenibacillus sp. em taxas de diluição de 10%, 5%, 2,5% e 1,25%.
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Tabela 17. Controle de Botrytis cinerea (BOTRCI) alcançado com cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepa A de Paenibacillus sp. em taxas de diluição de 10%, 5%, 2,5% e 1,25%.
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Tabela 18. Controle de Phytophthora infestans (PHYTIN) alcançado com cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepa A de Paenibaci- llus sp. em taxas de diluição de 10%, 5%, 2,5% e 1,25%.
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Exemplo 15. Identificação de fusaricidinas no extrato celular de Paenibacillus sp.
[000162] A cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e/ou cepas de-rivadas da mesma foram crescidas em um meio à base de soja até que as mesmas alcançassem a fase estacionária no momento em que a cultura de caldo integral foi colhida e extraída com solvente orgânico para produzir um extrato celular.
[000163] Um método cromatográfico com uso de cromatografia líquida de alto desempenho/espectrometria de massa por tempo de voo (HPLC/MS TOF) foi desenvolvido para separar muitas moléculas similares à fusaricidina do extrato celular: Coluna: YMCTM Básico 4,6 x 250 mm, 5μm; Água (0,1% de FA) e Acetonitrila (0,1% de ácido fórmico (FA)); Gradiente (% B): 0-9 minutos 28-30%; 9-14 minutos 30-33%; 1434 minutos 33-50%; Lavagem.
[000164] Um cromatograma do extrato celular no qual as fusaricidi- nas conhecidas são identificadas é mostrado na FIGURA 4B. A estrutura geral das fusaricidinas é apresentada na FIGURA 4A. Cada fusa- ricidina cíclica tem um análogo acíclico correspondente.
[000165] Todas as fusaricidinas detectáveis no extrato celular foram identificadas com base em seus valores de m/z e tempos de retenção (consulte a FIGURA 4C). Interessantemente, as fusaricidinas C e D e outras fusaricidinas em que o aminoácido na posição (3) é uma tirosi- na ou uma fenilalanina não foram detectáveis no extrato celular.
Exemplo 16. Caracterização de Paeniserinas no Extrato Celular de Paenibacillus sp.
[000166] Para identificar outros compostos no extrato celular de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e/ou cepas derivadas dos mesmos, um método cromatográfico com o uso de cromatografia líquida de ultra eficiência/espectrometria de massa por tempo triplo de voo (UPLC/MS TRIPLE TOF) foi desenvolvido para fragmentar muitas moléculas similares à fusaricidina: Coluna: ZORBAXTM Eclipse Plus, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm; Água (0,1% de FA) e acetonitrila (0,1% de FA); Gradiente (% B): 0-5 minutos 10-95%; Lavagem.
[000167] Com esse método, o requerente caracterizou uma nova família de Paeniserina de fusaricidinas examinando-se os padrões de fragmentação de massa obtidos a partir de um espectrômetro de massa por AB SCIEX TRIPLE TOF® bem como comparando-se o espectro com a literatura publicada. O requerente nomeou essa nova família como Paeniserinas. Os padrões representativos de fragmentação por UPLC/MS TRIPLE TOF e as estruturas químicas correspondentes para Paeniserina A1 e Paeniserina B1 são mostrados nas FIGURAS 5 e 6, respectivamente. Uma análise similar foi realizada para cada uma das Paeniserinas detectadas no extrato celular.
[000168] As Paeniserinas foram nomeadas tal como devido ao desvio importante da estrutura principal de fusaricidina com uma ou mais substituições de serina (consulte a FIGURA 5A). Historicamente, para ser considerada como uma fusaricidina, a sequência de peptídeos continha três aminoácidos conservados: (1) treonina, (4) treonina e (6) alanina. No entanto, as Paeniserinas mostram novas substituições com um dentre ou tanto o resíduo de treonina (1) quanto o resíduo de treonina (4) substituídos por uma serina. Ambos os aminoácidos nas posições (2) e (3) são valina nas Paeniserinas que o requerente caracterizou. Um cromatograma no qual os picos que correspondem às Pa- eniserinas são identificados é mostrado na FIGURA 5B.
[000169] O requerente também caracterizou essa família de compostos similares à fusaricidina substituídos por serina no extrato celular com base em seus valores de m/z e tempos de retenção (consulte a FIGURA 5C). Embora a Paeniserina C4 não seja detectável, é aceitável esperar que a mesma seja produzida com base nas estruturas das fusaricidinas anteriormente caracterizadas. Como com as fusaricidi- nas, cada Paeniserina cíclica tem um análogo acíclico correspondente.
[000170] É importante notar que embora as Paeniserinas caracterizadas pelo requerente tenham sido um aminoácido de valina nos resíduos (2) e (3), provavelmente existem compostos com variações nessas posições. Essas variações potenciais seriam similares aos análogos de fusaricidina/LiF com aminoácidos como isoleucina, fenilalanina e tirosina como os resíduos (2) e (3). Além disso, embora a cauda de GHPD seja descrita acima, é provável que exista compostos com variações nos comprimentos da cauda similares à família de Paeniprolixi- na (consulte o Exemplo 17).
Exemplo 17. Caracterização de Paeniprolixinas no Extrato Celular de Paenibacillus sp.
[000171] O extrato celular de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e/ou cepas derivadas do mesmo foi analisado adicionalmente com o mé-todo cromatográfico descrito no Exemplo 14. Uma nova família de fusari- cidinas foi caracterizada examinando-se os padrões de fragmentação de massa obtidos a partir de um espectrômetro de massa por AB SCIEX TRIPLE TOF® bem como comparando-se o espectro com literatura publi-cada. O requerente nomeou essa nova família como Paeniprolixinas. Os padrões representativos de fragmentação por UPLC/MS TRIPLE TOF e as estruturas químicas correspondentes para Paeniprolixina C1 e Paeni- prolixina D1 são mostrados nas FIGURAS 8 e 9, respectivamente. Uma análise similar foi realizada para cada uma das Paeniprolixinas detecta-das no extrato celular.
[000172] As Paeniprolixinas foram nomeadas da palavra latina prolix (que significa longo) devido a um outro desvio importante da estrutura principal de fusaricidina na cauda alifática, a saber, as Paeniprolixinas têm uma cauda mais longa que as fusaricidinas. Historicamente, tem-se observado que apenas as fusaricidinas têm cauda de GHPD específica. Isso foi comprovado como consistente até mesmo na publicação mais recente sobre a matéria (isto é, Vater et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2015, 26, 1130-1141) em que os autores reivindicam, "This finding [GHPD tail strictly conserved] é in contrast to many other lipopeptides reported in literature, where the fatty acid part é a major target of structural variation [such as in] the surfactins, iturins, and fengycins". O requerente identificou uma família de compostos similares à fusaricidina com cadeia mais longa (isto é, ácido 17-guanidino-3-hidroxiheptadecanóico ou GHPD + 2CH2 e ácido 19- guanidino-3-hidroxinonadecanóico ou GHPD + 4CH2) (consulte a FIGURA 8A) no extrato celular de NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.. Diferente das Paeniserinas, as Paeniprolixinas mantêm os resíduos de aminoácido conservados de L-treonina na posição (1) e D-allo-treonina na posição (4).
[000173] É importante notar que, embora as Paeniprolixinas que o requerente caracterizou tenham aminoácidos de valina ou isoleucina nos resíduos (2) e (3), provavelmente existem compostos com variações nessas posições. Essas variações potenciais seriam similares aos análogos de fusaricidina/LiF como outras combinações de valina, isoleucina ou outros aminoácidos como fenilalanina e tirosina como os resíduos de (2) e (3). Além disso, é provável que exista combinações híbridas com as Paeniserinas descritas acima que têm comprimentos de cauda mais longa.
[000174] Um cromatograma no qual os picos que correspondem às Paeniprolixinas são identificados é mostrado na FIGURA 8B. Essa fa-mília de compostos similares à fusaricidina com caudas mais longas também foi caracterizada com base nos seus valores de m/z e tempos de retenção (consulte a FIGURA 8C). Embora as Paeniprolixinas C2 e D2 não sejam detectáveis, é aceitável esperar que as mesmas sejam produzidas com base nas estruturas das fusaricidinas anteriormente caracterizadas. Como com as fusaricidinas, cada Paeniprolixina cíclica tem um análogo acíclico correspondente.
Exemplo 18. Perfis de Bioatividade Antifúngica das Paeniserinas, Paeniprolixinas e outras fusaricidinas
[000175] As amostras mostradas na Tabela 19 foram isoladas das células de Paenibacillus sp. O caldo de fermentação integral foi centri-fugado para remover o sobrenadante. O conglomerado obtido foi, então, extraído em metanol. O extrato resultante foi fracionado com o uso da cromatografia líquida de pressão média em fase reversa. As frações foram, então, adicionalmente purificadas com o uso de cromato- grafia líquida de pressão alta preparatória em fase reversa.
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[000176] O ensaio antifúngico de p aca com 96 cavidades in vitro uti- liza o reagente PRESTOBLUE® de viabilidade de célula à base de re- sazurina como um indicador para o crescimento fúngico. A partir dos esporos fúngicos, o ensaio mede a potência de uma amostra inibir a germinação de esporos fúngicos e/ou o crescimento das células fúngi-cas. O ensaio foi preparado com três doenças fúngicas relevantes para a agricultura: Alternaria solani (ALTESO), Colletotrichum lagenarium (COLLLA) e Botrytis cinerea (BOTRCI).
[000177] Todas as amostras destacadas na Tabela 19 provaram ser ativas contra as doenças fúngicas agricolamente relevantes (consulte a Concentração Inibitória Mínima para 80% (MIC80) valores dados em uni-dades de partes por milhão (ppm) para cada amostra na Tabela 20). In-teressantemente, certos compostos parecem ter atividade variável contra doenças específicas. Por exemplo, enquanto os análogos de asparagina na Amostra 3 parecem ser importantes no controle de ALTESO, as con- trapartes de glutamina do mesmo tipo de composto na Amostra 4 esta-vam mais envolvidas no controle de COLLLA. Os análogos com cauda mais longa na Amostra 6 foram os inibidores mais potentes de COLLLA. Isso sugere que, enquanto todos são ativos em seu próprio papel, uma combinação dessas químicas é importante para a potência e espectro finais de controle de doença do produto final.
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Exemplo 19. Perfis de Bioatividade Antibacteriana das Paeniseri- nas, Paeniprolixinas e outras Fusaricidinas
[000178] O ensaio antibacteriano de placa com 96 cavidades in vitro utiliza absorbância como um indicador para o crescimento bacteriano. O ensaio mede a potência de uma amostra inibir o crescimento bacte- riano comparando-se a absorbância das cavidades não tratadas com as cavidades de amostra. A última diluição/concentração que inibe o crescimento da bactéria é denominada MIC (concentração inibitória mínima) e esse valor pode ser usado para comparar a eficácia de dife-rentes amostras. O ensaio foi avaliado com três doenças bacterianas relevantes para a agricultura: Xanthomonas campestris (XANTAV), Pseudomonas syringae (PSDMTM) e Erwinia carotovora (ERWICA).
[000179] As amostras destacadas na Tabela 19 foram aplicadas nos ensaios antibacterianos para determinar os valores de MIC80 com cada patógeno bacteriano. Os resultados dos ensaios são apresentados na Tabela 21. As amostras 1-5 provaram ser ativas contra as doenças bacterianas agriculturalmente relevantes. Interessantemente, certos compostos parecem ter atividade variável contra doenças específicas. Por exemplo, as Paeniserinas complementam bem a Fusaricidina A, pois são capazes de controlar PSDMTM, uma fraqueza de Fusaricidi- na A. Por outro lado, a Fusaricidina A constitui a fraqueza no controle de ERWICA observada com as Paeniserinas. Como com os ensaios fúngicos, isso sugere que, embora todos estejam ativos em seu próprio papel, uma combinação dessas químicas é importante para a potência e espectro finais de controle de doença do produto final.
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*NDR: nenhum resultado detectável (isto é, nenhuma inibição de cres-cimento bacteriano nas concentrações mais altas testadas) **a amostra foi insolúvel nos meios microbianos e não foi possível testá-la.
Exemplo 20. Indicação de Sinergia com Ensaio de Difusão de Disco de Antibiótico de Kirby-Bauer
[000180] Para obter uma avaliação inicial de sinergia entre as várias classes de compostos similares à fusaricidina, um bioensaio foi realizado com o uso do patógeno de planta COLLLA. O bioensaio foi o ensaio de difusão de disco de antibiótico de Kirby-Bauer clássico em ágar (Bauer, A. W., et al., 1966 Am. J. Clin. Pathol. 36:493-496). Bre-vemente, os discos estéreis virgens carregados com quantidades simi-lares das várias amostrar foram colocados em uma placa de Petri ino-culada com um gramado de esporos de COLLLA. A placa de Petri foi incubada e a atividade foi registrada como o tamanho do diâmetro da zona de inibição exibido em torno de cada disco. Os resultados são ilustrados na FIGURA 11.
[000181] Os resultados desse ensaio preliminar sugerem que um efeito sinérgico resulta quando certas Paeniserinas e Paeniprolixinas são aplicadas juntas. As Paeniserinas A1 e B1 ("868") ou as Paenipro- lixinas A2 e B2 ("938") aplicadas separadamente mostram zonas relativamente pequenas de inibição nesse ensaio. Entretanto, sua combinação ("868/938") mostra a zona maior e mais livre de inibição excedendo os resultados obtidos com aplicação de 868, 938 ou fusaricidi- nas A e B ("AB"). Cerca de 0,1 mg do total de material foi aplicado a cada disco estéril para as amostras AB, 868 e 938. O disco que contém tanto a amostra 868 quanto a amostra 938 conteve cerca de 0,05 mg de cada amostra de modo que a quantidade total de material no disco 868/938 foi cerca de 0,1 mg.
[000182] Uma limitação desse ensaio é a exigência de que os compostos de fusaricidina precisam difundir através do ágar para inibir o crescimento fúngico. Essa indicação inicial de um efeito sinérgico será adicionalmente avaliada utilizando ensaios antifúngicos in vitro em meios líquidos.
Exemplo 21. Ensaios Antifúngicos In vitro para Demonstrar Sinergia de Combinações de Fusaricidina
[000183] Além das combinações de fusaricidinas destacadas no Exemplo 17, os ensaios antifúngicos in vitro em meios líquidos serão realizados para demonstrar a sinergia proposta resultante da aplicação de combinações de fusaricidinas e/ou compostos similares à fusarici- dina mostrados na FIGURA 12. Cada um dos grupos mostrado na FI-GURA 12 será avaliado individualmente para primeiramente analisar características estruturais e, então, em combinações para abordar a sinergia. Tanto misturas binárias quanto ternárias serão avaliadas.
[000184] Embora os compostos individuais possam exibir fraqueza a respeito da atividade fungicida, as combinações terão uma atividade que excede uma simples adição de atividades.
[000185] Um efeito sinérgico dos fungicidas está sempre presente quando a atividade fungicida das combinações de composto ativo excede o total das atividades dos compostos ativos quando aplicadas individualmente.
[000186] A atividade esperada para uma determinada combinação de dois ou três compostos ativos pode ser calculada da seguinte forma (consulte Colby, S.R., "Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations, Weeds 1967, 15, 20-22): Se X for a eficácia quando o composto ativo A for aplicado em uma taxa de aplicação de m ppm (ou g/ha), Y for a eficácia quando o composto ativo B for aplicado em uma taxa de aplicação de n ppm (ou g/ha), Z for a eficácia quando o composto ativo B é aplicado a uma taxa de aplicação de r ppm (ou g/ha), E1 for a eficácia quando os compostos ativos A e B forem aplicados em taxas de aplicação de m e n ppm (ou g/ha), respectiva-mente E2 for a eficácia quando os compostos ativos A, B e C forem aplicados em taxas de aplicação de m, n e r ppm (ou g/ha), res-pectivamente então, para uma mistura binária:
Figure img0028
e para uma mistura ternária:
Figure img0029
o grau de eficácia expressado em % é denotado. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença é observada.
[000187] Se a atividade fungicida real exceder o valor calculado, então, a atividade da combinação é superaditiva, isto é, existe um efeito sinérgico. Nesse caso, a eficácia que foi de fato observada precisa ser maior que o valor para a eficácia esperada (E) calculada a partir da fórmula mencionada acima.
[000188] Uma maneira adicional de demonstrar um efeito sinérgico é o método de Tammes (consulte "Isoboles, A Graphic Representation of Synergism in Pesticides", em Neth. J. Plant Path., 1964, 70, 73-80).
Exemplo 22. Seleção de Cepa Variante de Cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.
[000189] Sob condições laboratoriais padrão, a cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. produz múltiplas morfologias de colônia em meio de ágar sólido. Diversas colônias morfologicamente distintas foram identifi-cadas e armazenadas como estoques de glicerol a -80°C. As culturas de meio líquido foram inoculadas com o uso de estoques derivados dos dife-rentes fenótipos de colônia, e após vários ciclos de crescimento em meio líquido, reinoculadas sobre meio de ágar sólido. A partir daqui, um isola-do foi identificado como tendo um fenótipo de colônia estável sob as condições testadas, enquanto ainda é capaz de produzir esporos termor- resistentes e química de fusaricidina. Um isolado com uma morfologia de colônia estável é desejável para aprimoramento de cepa adicional (con-sulte o Exemplo 23). Esse isolado foi depositado junto ao NRRL em 1 de setembro de 2015, e ao mesmo foi atribuído o seguinte número de aces-so: NRRL B-67129.
Exemplo 23. Mutagênese Aleatória para Gerar Mutantes de Paeni- bacillus sp. Aprimorados Mutagênese Química
[000190] A fim de criar um agrupamento de isolados geneticamente diversos de cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp., uma cultura crescida em líquido da cepa foi peletizada por centrifugação, e ressus- pensas em tampão contendo 1-metil-3-nitro-1-nitroguanidina (NTG) em uma concentração final de 400 μg/mL. Como uma referência, uma se-gunda amostra sem NTG foi preparada. As amostras foram incubadas por uma hora a 30°C e 220 rpm. Após uma hora, as amostras foram peletizadas por centrifugação, lavadas com tampão que não contém NTG e, por fim, ressuspensas no mesmo volume de tampão fresco. As alíquotas da cultura não diluída foram congeladas como estoques de glicerol a -80°C. As amostras foram diluídas e colocadas em placas de ágar para determinar as unidades formadoras de colônia, e uma por-centagem de extermínio foi determinada como uma referência para o grau de mutações por genoma. Os isolados aprimorados selecionados a partir de um primeiro ciclo de triagem foram submetidos a um ou mais ciclos subsequentes de tratamento de NTG como descrito acima e triados para aprimoramentos adicionais na produção de fusaricidina. A produção de fusaricidina foi determinada pelas quantidades relativas de vários compostos que incluem fusaricidina A (também conhecida como LiF04a ou "Fus A"); LiF08a; Paeniserinas A1 e B1 (também conhecidas como "M868" ou "868"); e Paeniprolixinas A2 e B2 (também conhecidas como "M938" ou "938"). Caracterização de Isolado e Triagem de Alta Produtividade
[000191] As amostras tratadas com NTG foram diluídas e colocadas em placas de ágar para obter colônias únicas. As colônias únicas foram inoculadas em blocos de cavidade profunda com 96 cavidades que con-têm meio de semente, as quais foram incubadas com agitação por 2 dias a 30°C. A partir daqui, novos blocos de cavidade profunda com 96 cavi- dades que contêm um meio de produção à base de soja foram inoculados e incubados com agitação por 5 dias a 30°C. Após 5 dias, os estoques de glicerol foram preparados a partir de cada amostra em uma cavidade individual e armazenados a -80°C, e uma amostra foi submetida à análise química dos quatro biomarcadores de fusaricidina identificados acima. Nessa triagem primária, os isolados individuais foram considerados como acertos se seu "valor total de fusaricidina" (isto é, a soma dos quatro biomarcadores de fusaricidina analisados em relação à média dos valores do tipo selvagem) foi maior que a média dos valores de tipo sel-vagem mais 3x o desvio padrão dos valores do tipo selvagem. 8 réplicas de cada isolado selecionadas com base nesse critério foram crescidas e analisadas como descrito acima. Os superprodutores de fusaricidina con-firmados foram a seguir aumentados em volumes de 50 ml em frascos de agitação de 250 ml, e caracterizados para esporulação, produção de fu- saricidina e bioatividade. Os isolados priorizados adicionalmente aumen-tados em biorreatores e novamente caracterizados para esporulação, viscosidade, produção de fusaricidina e bioatividade. Várias cepas mu- tantes foram obtidas a partir do segundo ciclo de tratamento e triagem de NTG e verificadas como sendo superiores à produção de biomarcador de fusaricidina e bioatividade.
Exemplo 24. Caracterização de Sensibilidade de Antibiótico de Cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.
[000192] A cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. foi inoculada em meio sólido de ágar de sLB e meio de ágar de sLB suplementado com antibióticos em concentrações típicas. As placas de ágar foram incubadas a 30°C, e o crescimento foi avaliado após 24, 48 e 72 horas. A sensibilidade de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. para cada um dos antibióticos testado é mostrada na Tabela 22. Tabela 22. Sensibilidade de Antibiótico de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.
Figure img0030
Exemplo 25. Caracterização de spo0A na Cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e Cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp.
[000193] Os genomas de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. foram sequenciados. Uma comparação das duas sequências de genomas identificou uma diferença característica no gene spo0A nas duas cepas. Como mostrado no alinhamento de sequência na Figura 15, cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. diferem em um nucleotídeo para a extremidade 3' do gene spo0A. Uma única diferença de nucleotídeo foi identificada e é indicada por uma seta vermelha abaixo da sequência na Figura 15. Os números de nucleotí- deo relativos ao primeiro nucleotídeo do gene spo0A são indicados acima das sequências.
[000194] Um alinhamento de ortólogos de Spo0A das bactérias forma-doras de endósporo indicou que a alteração de nucleotídeo na sequência de codificação de cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. resultou em uma única substituição de aminoácido em uma região conservada (con-sulte a Figura 16). As sequências de aminoácidos de Spo0A de Paeni- bacillus terrae (NCBI Sequência de Referência: WP_044647644.1), Pae- nibacillus polymyxa SQR-21 (GenBank: AHM66630.1), Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (NCBI Sequência de Referência: NP_390302.1), Bacillus cereus E33L (GenBank: AJI26924.1), e Clostridium pasteuria- num DSM 525 (GenBank: AAA18883.1) foram alinhadas com as se-quências de aminoácidos de Spo0A da cepa NRRL B-50972 de Paeni- bacillus sp. e cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp.. Uma seta na Fi-gura 16 indica uma única substituição de aminoácido em Spo0A da cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp.
Exemplo 26. Estudos de Relação de Atividade de Estrutura com Fusaricidinas, Paeniserinas e Paeniprolixinas
[000195] A relação de atividade de estrutura de várias fusaricidinas purificadas, Paeniserinas e Paeniprolixinas foi investigada com o uso do ensaio in vitro descrito no Exemplo 16. Em um primeiro experimento, os pares mais comuns de fusaricidinas foram comparados. Uma variação nessas fusaricidinas ocorre na posição de aminoácido (5) do anel/cadeia com asparagina ou glutamina. Nesse estudo, a Fusaricidi- na A foi comparada à Fusaricidina B, e LiF08a foi comparada à LiF08b contra o patógeno de planta Alternaria solani (ALTESO). Em ambos os casos, o análogo de asparagina foi mais doze vezes mais potente que sua contraparte de glutamina (consulte a FIGURA 17).
[000196] Em um outro experimento, formas cíclicas versus formas acíclicas de fusaricidinas foram comparadas. Não é evidente se as formas acíclicas de fusaricidinas são um produto de degradação ou precursor do composto final; no entanto, as mesmas são onipresentes no caldo de fermentação de cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. e um contaminante comum das fusaricidinas purificadas a partir desse caldo de fermentação. A atividade antifúngica de fusaricidina A foi comparada a uma mistura de LiF04c e LiF04d (análogos acícli- cos de fusaricidina A e B) no ensaio in vitro com o ALTESO de pató- geno de planta. Há um impacto significativo do anel de peptídeo que abre na ligação de éster. Os análogos acíclicos foram inativos nas concentrações mais altas testadas (consulte a FIGURA 17). Isso é importante em relação à informação estrutural e para demonstrar que esses compostos que constituem tipicamente as impurezas nas fusa- ricidinas de outro modo purificadas provavelmente não contribuem com a atividade antifúngica.
[000197] As substituições de aminoácido nas posições de aminoáci- do (2) e (3) do anel/cadeia também foram investigadas. Os análogos Fusaricidina A, LiF05a, LiF06a e LiF08a diferem nessas posições com quaisquer combinações de valina ou isoleucina. Os mesmos foram testados no ensaio in vitro com o ALTESO de patógeno de planta. Os dois análogos mais potentes foram Fusaricidina A (valina/valina) e LiF08a (isoleucina/isoleucina). Os outros dois análogos, que compre-endem uma mistura de valina/isoleucina, foram mais que três vezes menos potentes (consulte a FIGURA 17).
[000198] As diferenças na atividade antifúngica com as novas Paeni- serinas também foram investigadas. Mais uma vez testadas contra ALTESO, as diferenças nas posições de aminoácido (1) e (4) do anel/cadeia foram avaliadas. As fusaricidinas clássicas são restringidas à treonina naquelas posições enquanto as Paeniserinas podem alternar entre treonina e serina. As Paeniserinas demonstraram atividade antifúngica similar à fusaricidina A nesse ensaio (consulte a FIGURA 17).
[000199] A atividade antifúngica das Paeniprolixinas (isto é, análogos com diferentes comprimentos de cadeia lateral) também foi investigada com ensaios in vitro contra os patógenos fúngicos ALTESO e Colle- totrichum lagenarium (COLLLA). A fusaricidina clássica compreende uma cadeia lateral de ácido 15-guanidino-3-hidroxipentadecanóico. As Paeniprolixinas foram mostradas tendo 2 de 4 grupos metileno adicionais na cadeia. O comprimento de cadeia lateral demonstrou um efeito pronunciado na bioatividade e exibiu diferenças com patógenos fúngicos distintos. Contra ALTESO, o comprimento não alterado de GHPD foi o mais potente, diminuindo com cada grupo metileno adicional. Contra COLLLA, o comprimento mais potente foi GHPD + 2CH2 (consulte a FIGURA 17).
Exemplo 27. Atividade Antifúngica Sinérgica com Misturas de fu- saricidina A com Paeniserina A1 ou Paeniprolixina C1
[000200] O ensaio de placa com 96 cavidades in vitro antifúngico com o reagente PRESTOBLUE® de viabilidade de célula à base de resazurina (consulte o Exemplo 18) foi usado para avaliar a atividade antifúngica de fusaricidinas, Paeniserinas e Paeniprolixinas sozinhas e em combinações de duas maneiras. A atividade antifúngica foi calculada em relação aos valores de controle não tratado com a seguinte equação: Eficácia = (100- Crescimento Relativo de Controle Não Tratado) Uma eficácia de 100% não indicou nenhum crescimento fúngico em comparação ao controle não tratado, e uma eficácia de 0% não indicou nenhuma inibição de crescimento fúngico em comparação ao controle não tratado.
[000201] As Tabelas 23 e 24 mostram claramente que a atividade observada das combinações de composto ativo de acordo com a in-venção foi maior que a atividade calculada, isto é, um efeito sinérgico estava presente. Tabela 23: Atividade Antifúngica contra Alternaria solani de Fusa- ricidina A sozinha, Paeniserina A1 sozinha e fusaricidina A + Pae- niserina A1
Figure img0031
* encontrado = atividade encontrada ** calc. = atividade calculada com o uso da fórmula de Colby Tabela 24: Atividade Antifúngica contra Alternaria solani de Fusa- ricidina A sozinha, Paeniprolixina sozinha e fusaricidina A + Pae- niprolixina C1
Figure img0032
* encontrado= atividade encontrada ** calc. = atividade calculada com o uso da fórmula de Colby
[000202] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos do presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica a que esta invenção pertence. Todas as publicações, patentes e publicações de patente citadas são incorporadas a título de referência no presente documento em sua totalidade para todos os propósitos.
[000203] Entende-se que a invenção revelada não é limitada à meto-dologia, protocolos e materiais particulares descritos, visto que esses podem variar. Entende-se também que a terminologia usada no presente documento é apenas para o propósito de descrever as modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[000204] Os elementos versados na técnica irão observar, ou poderão verificar com o uso de não mais que a experimentação de rotina, diversos equivalentes das modalidades específicas da invenção des-critas neste documento. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims (10)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um composto apresentando a Estrutura (II):
Figure img0033
na qual (a) R1 é -CH2OH; R2 é -CH2C(O)NH2; e R3 é H; (b) R1 é -CH2OH; R2 é -(CH2)2C(O)NH2; e R3 é H; (c) R1 é -CH2OH; R2 é -(CH2)2C(O)NH2; e R3 é CH3; (d) R1 é -CH(OH)CH3; R2 é -CH2C(O)NH2; e R3 é H; ou (e) R1 é -CH(OH)CH3; R2 é -(CH2)2C(O)NH2; e R3 é H; incluindo sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isômeros ópti-cos, isômeros geométricos, enantiômeros, diastereômeros, análogos acíclicos, e misturas do mesmo; e (f) ) um inerte de formulação, que é um agente de estabiliza-ção.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo fato de que o referido composto apresentando a Estrutura (II) é:
Figure img0034
Figure img0035
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que o referido composto está em uma solução a uma concentração de pelo menos 0,001 mg/mL.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma fusaricidina.
5. Método para tratamento de uma planta para controlar uma doença, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma quantidade eficaz de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, à planta, a uma parte da planta e/ou a um local da planta.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida composição é um produto de fermentação da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., da cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp., ou de uma cepa mutante fungicida das mesmas.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri-zado pelo fato de que a referida composição é aplicada a cerca de 1 x 1010 a cerca de 1 x io12 unidades formadoras de colônia (UFC) da cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., da cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. ou de uma cepa mutante fungicida das mesmas por hectare.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a referida doença de planta é ocasionada por um fungo.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida doença de planta é míldio ou uma doença de ferrugem.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo que a referida doença de planta é ocasionada por bactérias.
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