ES2900458T3

ES2900458T3 - Cepa de Paenibacillus, compuestos antifúngicos y procedimientos para su uso

Info

Publication number: ES2900458T3
Application number: ES19164025T
Authority: ES
Inventors: Jeremy Beau; Daniel Joo; Patrick Schwientek; Colleen Taylor; Bjorn Traag
Original assignee: Bayer CropScience LP
Current assignee: Bayer CropScience LP
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2016-03-23
Publication date: 2022-03-17
Anticipated expiration: 2036-03-23
Also published as: HUE056482T2; CL2017002425A1; BR112017020604A2; PT3274443T; EP3594225A1; PH12017501757A1; JP2021169507A; US20200054023A1; EP3838914A1; US10499656B2; JP6916737B2; PE20221728A1; PT3594225T; PL3274443T3; JP2023153947A; NZ735632A; CL2019001810A1; RU2021135364A; AU2022203326A1; JP7369741B2

Abstract

Un compuesto aislado que tiene la estructura (I): **(Ver fórmula)** en el que R1 y R2 son cada uno de manera independiente -CH(CH3)2 o -CH(CH3)CH2CH3; R3 es -CH2C(O)NH2 o -(CH2)2C(O)NH2; y n es un número entero entre 14 y 20; incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereómeros y mezclas de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepa de Paenibacillus, compuestos antifúngicos y procedimientos para su uso

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de cepas bacterianas y su capacidad para controlar enfermedades de plantas. En particular, la presente invención se refiere a una cepa de Paenibacillus sp. con un nivel relativamente alto de actividad antifúngica de amplio espectro.

Antecedentes

Los fungicidas tienen múltiples usos, incluso en la protección de cultivos; como conservantes de alimentos, piensos y cosméticos; y como agentes terapéuticos en aplicaciones tanto en seres humanos como en veterinaria. La reducción del rendimiento de los cultivos, las enfermedades de origen alimentario y las infecciones fúngicas en seres humanos y en animales son un problema tanto en países desarrollados como países en desarrollo.

A menudo, los insecticidas o fungicidas sintéticos no son específicos y por lo tanto pueden actuar sobre organismos distintos de los organismos diana, incluyendo otros organismos beneficiosos de origen natural. Debido a su naturaleza química, también pueden ser tóxicos y no biodegradables. Los consumidores en todo el mundo se han vuelto cada vez más conscientes de los potenciales problemas ambientales y sanitarios asociados con los restos de las sustancias químicas, en particular en los productos alimenticios. Esto ha dado como resultado una creciente presión por parte de los consumidores para reducir el uso o al menos la cantidad de plaguicidas químicos (es decir, sintéticos). Por lo tanto, persiste la necesidad de manejar los requerimientos de la cadena de producción de alimentos permitiendo al mismo tiempo un control de plagas eficaz.

Un problema adicional que surge con el uso de insecticidas o fungicidas sintéticos es que la aplicación repetida y exclusiva de un insecticida o de fungicidas a menudo conduce a la selección de microorganismos patógenos resistentes. Normalmente, dichas cepas también presentan una resistencia cruzada contra otros principios activos que tienen el mismo modo de acción. Entonces, ya no será posible un control eficaz de los patógenos con dichos compuestos activos. Sin embargo, el desarrollo de principios activos con mecanismos de acción nuevos es difícil y costoso.

El riesgo de desarrollar resistencia en las poblaciones de patógenos, así como la preocupación respecto al medio ambiente y la salud humana han fomentado el interés en la identificación de alternativas a los insecticidas y fungicidas sintéticos para el manejo de enfermedades en plantas. El uso de agentes de control biológico es una alternativa.

Los péptidos no ribosómicos, tales como las fusaricidinas, son bien reconocidos por sus propiedades antimicrobianas y se han utilizado en el campo de la protección de cultivos. Debido a su modo de acción, también tienen usos potenciales en aplicaciones biofarmacéuticas y otras aplicaciones de biotecnología. Las fusaricidinas se pueden aislar a partir de Paenibacillus sp. y tienen una estructura en anillo compuesta por 6 restos de aminoácidos además de ácido 15-guanidin-3-hidroxipentadecanoico. Las fusaricidinas aisladas de Paenibacillus polimyxa incluyen LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 y LI-F08 (Kurusu K, Ohba K, Arai T y Fukushima K., J. Antibiotics, 40: 1506-1514, 1987) y se han descrito fusaricidinas adicionales A, B, C y D (Kajimura Y Kaneda M., J. Antibiotics, 49: 129-135, 1996; Kajimura Y y Kaneda M., J. Antibiotics, 50: 220-228, 1997).

Se sabe que determinadas fusaricidinas tienen actividad germicida contra hongos patógenos de plantas tales como Fusarium oxisporum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Penicillium thomii. Algunas fusaricidinas también tienen actividad germicida contra bacterias grampositivas, incluyendo Staphylococcus aureus (Kajimura Y y Kaneda M., J. Antibiotics, 49: 129-135, 1996; Kajimura Y y Kaneda M., J. Antibiotics, 50: 220-228, 1997). Además, se ha encontrado que algunas fusaricidinas específicas tienen actividad antifúngica contra Leptosphaeria maculans, que provoca la podredumbre negra de la raíz en canola (Beatty PH y Jensen SE., Can. J. Microbiol., 48: 159-169, 2002). Hay una necesidad de caracterizar adicionalmente los compuestos de fusaricidina y de identificar cepas de Paenibacillus sp. que produzcan las fusaricidinas que proporcionen un amplio espectro de actividad antifúngica a índices de aplicación relativamente bajos.

El documento WO2007/086645 desvela la cepa E681 de Paenibacillus polymyxa, el documento EP1788074 desvela depsipéptidos obtenidos de Paenibacillus. Seo Hyeon Lee y col. (Phytoparasitica 41 (1): 49-58) desvelan una fusaricidina expresada por E681.

Las fusaricidinas y otros metabolitos antifúngicos se pueden obtener por fermentación de Paenibacillus sp. Sin embargo, muchas cepas de Paenibacillus sp. también producen antibióticos conocidos como polimixinas. Las polimixinas son selectivamente tóxicas para bacterias gramnegativas y pueden tener un efecto neurotóxico o nefrotóxico cuando son las administra a pacientes humanos. El problema global del avance de la resistencia antimicrobiana y la toxicidad relativa de las polimixinas requieren de un uso y administración cuidadosos de estos antibióticos. Por este motivo, resulta muy conveniente que una cepa de Paenibacillus sp. desarrollada para su uso en la agricultura exprese niveles relativamente altos de las fusaricidinas y polimixinas no detectables. Una cepa tal representaría poco o ningún riesgo para los trabajadores y consumidores. Además, persiste la necesidad de identificar cepas de Paenibacillus sp. que presenten un amplio espectro de actividad. Resulta muy conveniente lograr mejoras en la eficacia de los fungicidas existentes, en especial de los que no son susceptibles al desarrollo de resistencia fúngica.

Sumario

En el presente documento se describe una composición que comprende un cultivo biológicamente puro de una cepa fungicida de Paenibacillus sp. que comprende una variante de la fusaricidina sintasa que carece de un dominio de adenilación funcional en el tercer módulo (FusA-A3), en la que la falta de un FusA-A3 funcional inhibe la síntesis de fusaricidinas con una tirosina o una fenilalanina en el resto de aminoácido (3) en comparación con la síntesis de fusaricidinas por una cepa de Paenibacillus sp. que comprende una fusaricidina sintasa de tipo silvestre. En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende: a) al menos una fusaricidina; y b) al menos una Paeniserina o al menos una Paeniprolixina en una cantidad sinérgicamente eficaz como se caracteriza en las reivindicaciones. En una realización, la Paeniserina es al menos una de Paeniserina A1, Paeniserina A2, Paeniserina A3, Paeniserina A4, Paeniserina B1, Paeniserina B2, Paeniserina B3, Paeniserina B4, Paeniserina C1, Paeniserina C2 y Paeniserina C3. En otra realización, la Paeniprolixina es al menos una de Paeniprolixina A1, Paeniprolixina a 2, Paeniprolixina B1, Paeniprolixina B2, Paeniprolixina C1, Paeniprolixina D1, Paeniprolixina E1, Paeniprolixina E2, Paeniprolixina F1, Paeniprolixina F2, Paeniprolixina G1 y Paeniprolixina G2.

En particular, en una realización la relación sinérgica de la al menos una fusaricidina y la al menos una Paeniserina o al menos una Paeniprolixina se encuentra en el intervalo de entre 1:1000 y 1000:1, preferentemente en el intervalo de entre 1:500 y 500:1, más preferentemente en el intervalo de entre 1:250 y 250:1. En otra realización, la relación en peso sinérgica de la al menos una fusaricidina y la al menos una Paeniserina o al menos una Paeniprolixina se encuentra en el intervalo de entre 1:100 y 100:1, preferentemente en el intervalo de entre 1:100 y 10:1 o incluso en el intervalo de entre 1:50 y 25:1. En un aspecto, la fusaricidina es fusaricidina A. En otro aspecto, la Paeniserina es Paeniserina A1. En aún otro aspecto, la Paeniprolixina es Paeniprolixina C1.

La presente invención se refiere a un compuesto aislado que tiene la estructura (I):

en la que

R1 y R2 son, cada uno de manera independiente, -CH(CH3)2 o -CH(CH3)CH2CH3;

R3 es -CH2C(O)NH2 o -(CH2)2C(O)NH2; y

n es un número entero entre 14 y 20;

incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereómeros y mezclas de los mismos.

En algunas realizaciones, R3 es -CH2C(O)NH2 En otras realizaciones, R3 es -(CH2)2C(O)NH2. En un aspecto, R1 es -CH(CH3)2. En otro aspecto, R1 es -c H(Ch3)CH2CH3. En un aspecto, R2 es -CH(c H3)2. En aún otro aspecto, R2 es -CH(CH3)CH2CH3.

La presente invención también se refiere a una composición que comprende, además de un compuesto que tiene la estructura (I), un compuesto aislado que tiene la estructura (II):

en la que

R1 es -CH2OH o -CH(OH)CHs;

R2 es -CH2C(O)NH2 o -(CH2)2C(O)NH2; y

R3 es H o CH3;

con la condición de que si R1 es -CH2OH y R2 es -CH2C(O)NH2 entonces R3 es H;

En algunas realizaciones, R3 es CH3. En otras realizaciones, R3 es H. En un aspecto, R1 es -CH2OH. En otro aspecto, R1 es -CH(OH)CH3. En un aspecto, R2 es -CH2C(O)NH2. En aún otro aspecto, R2 es -(CH2)2C(O)NH2.

En una realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto aislado desvelado en el presente documento y un vehículo agrícolamente aceptable.

En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a una solución que comprende un compuesto de estructura (I), en la que la concentración del compuesto es de al menos 0,001 mg/ml, al menos 0,01 mg/ml o al menos 0,1 mg/ml. En otra realización, la presente invención se refiere a una solución que comprende un compuesto de estructura (II), en la que la concentración del compuesto es de al menos 0,001 mg/ml, al menos 0,01 mg/ml o al menos 0,1 mg/ml. En determinados aspectos, las soluciones desveladas comprenden además un vehículo agronómicamente aceptable.

En aún otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de una planta para controlar una enfermedad, en el que el procedimiento comprende aplicar una cantidad eficaz de una composición desvelada en el presente documento a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar donde se encuentra la planta. En determinados aspectos, la composición es un producto de fermentación de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp, la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. o una cepa mutante fungicida de las mismas. En otros aspectos, el procedimiento comprende aplicar la composición a las partes foliares de la planta. En aún otros aspectos, la composición se aplica a entre aproximadamente 1 x 1010 y aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias (UFC) de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp, la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. o una cepa mutante fungicida de las mismas por hectárea. En una realización, la composición se aplica a entre aproximadamente 0,5 kg y aproximadamente 5 kg de sólidos de fermentación por hectárea.

En algunos aspectos, la enfermedad de la planta está provocada por un hongo. En otros aspectos, la enfermedad de la planta es una enfermedad de mildiú o de roya. En una realización, el mildiú es un mildiú pulverulento o un mildiú velloso. En otra realización, la enfermedad de roya se selecciona del grupo que consiste en roya de la hoja de trigo, roya de la hoja de cebada, roya de la hoja de centeno, roya de la hoja marrón, roya coronada y roya de los tallos.

En algunas realizaciones, el hongo se selecciona del grupo que consiste en Alternaría alternata, Alternaría solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus y Puccinia triticina.

En otras realizaciones, la enfermedad de la planta es provocada por bacterias. En un aspecto, las bacterias se seleccionan del grupo que consiste en Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae y Erwinia carotovora.

La presente invención también se refiere al uso de las composiciones desveladas para el control de un organismo fitopatógeno en plantas útiles. En determinados aspectos, el organismo fitopatógeno se selecciona del grupo que consiste en Alternaría alternata, Alternaría solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus y Puccinia triticina. En otros aspectos, el organismo fitopatógeno se selecciona del grupo que consiste en Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae y Erwinia carotovora.

En aún otros aspectos, las plantas útiles se seleccionan del grupo que consiste en manzanas, bananas, cítricos, kiwi, melones, melocotones, peras, piña, frutas con pipas, granada, col, coliflor, pepinos, curcubitáceas, tomates, patatas, trigo, arroz y soja.

Descripción breve de los dibujos

La FIG. 1 representa la actividad fungicida in planta de caldos completos de cepas de Paenibacillus sp. contra el tizón tardío de tomate (PHYTIN), el moho gris (BOTRCI) y la roya de la hoja de trigo (PUCCRT).

La FIG. 2 representa la actividad antifúngica in vitro de extractos de fusaricidina a partir de caldos completos de cepas de Paenibacillus sp. contra Alternaría alternata (ALTEAL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Fusarium culmorum (FUSACU), Phaeosphaeria nodorum (LEPTNO), Zymoseptoria tritici (SEPPTR), Phytophthora cryptogea (PHYTCR), Phytophthora infestans (p Hy TIN), Pythium ultimum (PYTHUL), Magnaporthe oryzae (PYRIOR), Thanatephorus cucumeris (RHIZSO), Ustilago segetum var. avenae (USTIAV) y Uromyces appendiculatus (UROMAP).

La FIG. 3 muestra la apertura de estructura del anillo en LiF04a (también conocida como fusaricidina A) para producir el análogo acíclico, LiF04c. Los análogos acíclicos de cada una de las fusaricidinas y de los compuestos tipo fusaricidina se producen de manera similar.

La FIG. 4A presenta un diagrama que presenta la estructura de las fusaricidinas conocidas con los aminoácidos conservados en las posiciones (1), (4) y (6) identificados y los aminoácidos que varían se indican como AA (aminoácido). La cola de ácido 15-guanidin-3-hidroxipentadecanoico (GHPD) forma un enlace amida con el extremo N de la L-treonina en la posición (1). El extremo C de la D-alanina en la posición (6) forma un enlace éster con el grupo hidroxilo de la L-treonina en la posición (1), indicado con flechas que apuntan a una “O”. La FIG. 4B muestra un cromatograma de HPLC/MS TOF de un extracto de células de Paenibacillus sp. en el cual se identifican fusaricidinas conocidas. La FIG. 4C representa las fusaricidinas conocidas detectables en un extracto de células de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o de cepas procedentes de la misma.

La FIG. 5A presenta un diagrama que presenta la estructura de las Paeniserinas. Esta clase de compuestos es similar a las fusaricidinas excepto que una o ambas treoninas conservadas en las posiciones (1) y (4) están sustituidas por una serina.

La FIG. 5B muestra un cromatograma de HPLC/MS TOF de un extracto de células de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o de cepas procedentes de la misma, en el cual se identifican las Paeniserinas. La FIG. 5C representa las Paeniserinas detectables en un extracto de células de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o de cepas precedentes de la misma. Se muestran los valores de m/z y los tiempos de retención (TR) para todos los compuestos detectados.

La FIG. 6A representa la estructura química de la Paeniserina A1 obtenida del espectro UPLC/MS Triple TOF que se muestra en la FIG. 6B.

La FIG. 7A representa la estructura química de la Paeniserina B1 obtenida del espectro UPLC/MS Triple TOF que se muestra en la FIG. 7B.

La FIG. 8A presenta un diagrama que presenta la estructura de las Paeniprolixinas. Esta clase de compuestos es similar a las fusaricidinas excepto que la longitud de la cola GHPD se extiende de -(CH2)12- a -(CH2)-m- o -(CH2)16-.

La FIG. 8B muestra un cromatograma de HPLC/MS TOF de un extracto de células de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o de cepas procedentes de la misma, en el cual se identifican las Paeniprolixinas. La FIG. 8C representa las Paeniprolixinas detectables en un extracto de células de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o de cepas procedentes de la misma. Se muestran los valores de m/z y los tiempos de retención (TR) para todos los compuestos detectados.

La FIG. 9A representa la estructura química de la Paeniprolixina C1 obtenida del espectro UPLC/MS Triple TOF que se muestra en la FIG. 9B.

La FIG. 10A representa la estructura química de la Paeniprolixina D1 obtenida del espectro UPLC/MS Triple TOF que se muestra en la FIG. 10B.

La FIG. 11 representa un ensayo de difusión de discos de antibióticos de Kirby-Bauer con fusaricidinas A y B (“AB”), Paeniserinas A1 y B1 (“868”), las Paeniprolixinas A2 y B2 (“938”) o una combinación de 868 y 938 aplicadas a una capa de esporas de Colletotrichum lagenarium (COLLLA) sobre una placa de agar. Se indica el diámetro de cada disco con su zona de inhibición del crecimiento fúngico en milímetros.

La FIG. 12A se muestra la estructura química de la fusaricidina A y una representación simplificada de esta estructura. Las FIG. 12B-12E representan representaciones simplificadas de combinaciones de las fusaricidinas, Paeniserinas y/o Paeniprolixinas producidas por la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y de cepas procedentes de la misma. Las combinaciones, tales como las mencionadas, pueden producir un efecto antifúngico sinérgico y son responsables de la eficacia relativamente alta y la actividad antifúngica de amplio espectro observadas con la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y las cepas procedentes de la misma.

La FIG. 13 presenta un alineamiento de múltiples secuencias de un segmento de la FusA fusaricidina sintasa expresada por las siguientes cepas de Paenibacillus: Paenibacillus peoriae A (SEQ ID NO: 1); Paenibacillus polymyxa A (SEQ ID NO: 2); Paenibacillus polymyxa PKB1 (GenBank ABQ96384.2; SEQ ID NO: 3); Paenibacillus polymyxa E681 (GenBank ADM67985.1; SEQ ID NO: 4); Paenibacillus polymyxa B (SEQ ID NO: 5); Paenibacillus polymyxa SQR (GenBank AHM63812.1; SEQ ID NO: 6); Paenibacillus polymyxa C (SEQ ID NO: 7); Paenibacillus polymyxa M1 (GenBank CCC83015.1; SEQ ID NO: 8); Paenibacillus polymyxa SC2 (GenBank ACA09733.2; SEQ ID NO: 9); la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (SEQ ID NO: 10) y la cepa A de Paenibacillus sp. (SEQ ID NO: 11). Los restos de aminoácidos que determinan la especificidad de sustrato están identificados con un recuadro negro (véase también la Tabla 1). Estos restos de aminoácidos están ubicados en las posiciones 3203, 3204, 3207, 3246, 3267, 3269, 3290, 3298, 3299 y 3486 de las SEQ ID NO: 1-5 y 11 y en las posiciones 3204, 3205, 3208, 3247, 3268, 3270, 3291, 3299, 3300 y 3487 de las SEQ ID NO: 6-9.

La FIG. 14 representa la agrupación de genes de fusaricidina en la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa A de Paenibacillus sp. (“Cepa A”). Las flechas representan genes individuales dentro de la agrupación (es decir, fusG está representado por la flecha “G”, fusF está representado por la flecha “F”, etc.). La flecha más grande representa el gene de la fusA fusaricidina sintasa con las siguientes abreviaturas y símbolos: A = dominio de adenilación (reconocimiento del sustrato y activación); C = dominio de condensación (formación de enlaces peptídicos); E = dominio de epimerización (racemización del sustrato); TE =dominio tioesterasa (liberación del producto); óvalo sin letra =dominio de tiolación (T) (proteína transportadora de péptido). El gen fusA tiene seis módulos responsables de la incorporación de los aminoácidos indicados en los cuadros arriba o debajo de cada agrupación de genes. La cepa A tiene una típica agrupación de genes de fusaricidina mientras que a la agrupación de genes de fusaricidina de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. le falta un dominio A funcional en el módulo 3. Como resultado de ello, las fusaricidinas producidas por la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. carecen de tirosina y fenilalanina en la posición (3) y solamente incorporan valina o isoleucina.

La FIG. 15 representa un alineamiento de secuencias del gen spoOA en la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (SEQ ID NO: 12) y de la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. (SEQ ID NO: 13).

La FIG. 16 representa un alineamiento de secuencias de ortólogos de SpoOA de bacterias formadoras de endosporas que indica que el cambio de nucleótidos en la secuencia codificante de la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. da como resultado una sola sustitución de aminoácidos en una región conservada. Las secuencias alineadas de ortólogos de SpoOA son: SpoOA de Paenibacillus terrae (SEQ ID NO: 14), SpoOA de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (SEQ ID No : 15), SpoOA de la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. (SEQ ID NO: 16), SpoOA de Paenibacilluspolimyxa (SEQ iD NO: 17), SpoOA de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 18), SpoOA de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 19) y SpoOA de Clostridium pasteurianum (SEQ ID NO: 20).

La FIG. 17 representa las concentraciones inhibidoras mínimas para los valores de 80% (CIM80) de varias fusaricidinas, Paeniserinas y Paeniprolixinas con los patógenos fúngicos Alternaría solani (ALTESO) y Colletotrichum lagenarium (COLLLA).

Descripción detallada

En el presente documento se describe la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. o un mutante (cepa) fungicida procedente de la misma. Se ha descubierto que la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. tiene un amplio espectro de actividad contra fitopatógenos.

Los microorganismos y las cepas particulares que se describen en el presente documento, a menos que específicamente se indique de otra manera, se separaron todos de la naturaleza y se cultivaron en condiciones artificiales, tal como en cultivos en frascos con agitación, o mediante procedimientos de fabricación con aumento de escala, tal como en biorreactores para maximizar, por ejemplo, la producción metabolitos bioactivos. El cultivo en dichas condiciones conduce a la “domesticación” de cepas. En general, tal cepa “domesticada” difiere de sus homólogos encontrados en la naturaleza en cuanto a que se cultiva como una población homogénea que no está sometida a las presiones de selección encontradas en el entorno natural sino más bien a presiones de selección artificiales.

Como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a un compuesto que se ha enriquecido o concentrado en un caldo completo o un producto de fermentación o que se ha purificado parcial o sustancialmente a partir de un caldo completo o de un producto de fermentación.

La cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y mutantes de la misma tienen actividad contra una amplia gama de patógenos de plantas. En un aspecto, la cepa tiene actividad contra hongos, tal como antracnosa de pepino, el mildiú pulverulento de pepino, la roya de la hoja de trigo, mildiú pulverulento y botritis de cebada; Oomycetos, tales como el tizón tardío de tomate, el mildiú velloso de pepino y el mildiú velloso de Brassica; y/o bacterias, tales como Pseudomonas, Xanthomonas y Erwinia.

En el presente documento también se describe un producto de fermentación que comprende una cepa de Paenibacillus sp, en la que la cepa de Paenibacillus sp. produce fusaricidinas, Paeniserinas y/o Paeniprolixinas. Las fusaricidinas son una familia de depsipéptidos con una cola de ácido 15-guanidin-3-hidroxipentadecanoico (GHPD), así como sus equivalentes lineales. Las características conservadas específicas de las fusaricidinas son esta cola de GHPD, así como tres de los seis aminoácidos en la secuencia: (1) treonina, (4) treonina y (6) alanina.

Originalmente las fusaricidinas fueron descubiertas, pero no caracterizadas, por Nakajima y col., (J. Antibiot. 1972, 25, 243-247) a mediados de la década de los años 70, fueron descritas por Kurusu y col. (J. Antibiot., 1987, 40, 1506 1514) hacia fines de la década de los años 80. Kajimura y col. (J. Antibiot., 1996, 49, 129-135; J. Antibiot., 1997 50, 220-228), Kuroda y col. (Heterocycles, 2000, 53, 1533-1549; J. Mass Spectrom., 2001, 36, 30-37) y Beatty y col. (Can. J. Microbiol., 2002, 48, 159-169) desde mediados de la década de los años 90 hasta principios de la década de los años 2000 las estudiaron adicionalmente. Durante este período de investigación intensa, se cambió el nombre de estos compuestos varias veces dependiendo del autor (la fusaricidina A también se conoce como LiF04a, gatavalina o incluso KT-6291A). Aunque hay muchas publicaciones sobre el tema, cada vez se describen compuestos selectos del mismo grupo de 24 fusaricidinas conocidas.

Después de un período sin grandes novedades en el tema, Vater y col., (J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2015, 26, 1130 1141) describieron la elucidación estructural de las fusaricidinas por espectrometría de masas y describieron varios análogos de la familia. Vater y col. identificaron una nueva clase de compuestos de tipo fusaricidina con siete aminoácidos (es decir, una alanina adicional unida al resto treonina (4) en la secuencia peptídica). Como se usa en el presente documento, la expresión “análogo acíclico” se refiere al compuesto que corresponde a la fusaricidina o a un compuesto de tipo fusaricidina (por ejemplo, una Paeniserina o una Paeniprolixina) pero que carece del enlace éster, dando como resultado una estructura lineal.

Las cadenas de aminoácidos de las fusaricidinas están unidas entre sí y las modifica una péptido sintasa no ribosómica (NRPS, forma siglada de non-ribosomal peptide synthetase). La NRPS multidominio consiste en hasta 15.000 aminoácidos y, por lo tanto, se la considera entre las proteínas más largas de la naturaleza (Schwarzer y col., (2003) Nonribosomal Peptides: From Genes to Products; Nat. Prod. Rep., 20, 275-287). La incorporación de la NRPS no se limita a los 21 aminoácidos convencionales traducidos por el ribosoma, y esta promiscuidad contribuye a la gran diversidad estructural y actividad biológica de los péptidos no ribosómicos (Li y Jensen, (2008), Nonribosomal biosynthesis of fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 involves direct activation of a d-amino acid (Chem. Biol., 15, 118-127).

En la E68 de P. polimyxa se ha caracterizado la agrupación de genes biosintéticos de la fusaricidina (fusGFEDCBA) y se observó que la secuencia codificante de la NRPS, la mayor secuencia de ADN codificante (CDS, forma siglada de coding DNA sequence) de la agrupación, codifica un péptido de seis módulos (Choi y col., Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681; Biochem. Biophys. Res. Commun., 365, 89-95; Li y Jensen, Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681; Biochem. Biophys. Res. Commun., 365, 89-95; Li y col., (2013); Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21; Appl. MicroBiol. Biotechnol., 97, 9479-9489). La agrupación biosintética incluye otras CDS responsables de la biosíntesis de la fracción lipídica pero no contiene genes de transportadores (Li y Jensen, (2008), Nonribosomal Biosynthesis of Fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a d-amino acid; Chem. Biol., 15, 118-127). En P. polimyxa, se identificó un promotor para el operón fus y se demostró que se une a un represor de la transcripción (AbrB) que se implicó en estudios previos como un regulador de la esporulación; esto resulta interesante dado que se observó que la fusaricidina se sintetiza durante la esporulación, coordinando así el metabolismo secundario del microbio con su ciclo de vida (Li y col., (2013); Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polimyxa SQR-21; Appl. MicroBiol. Biotechnol., 97, 9479-9489).

Normalmente, se cree que la diversidad alélica es responsable de producir la diversidad química. Sin embargo, una característica interesante de la agrupación fus es que un solo alelo de fusA puede producir una diversidad de fusaricidinas, que difieren en sus aminoácidos incorporados (Tyr, Val, Ile, allo-Ile, Phe); el mecanismo subyacente es que el dominio NRPS A, responsable del reconocimiento de aminoácidos, tiene una especificidad de sustrato relajada (Han y col., (2012); Site-Directed Modification of the Adenylation Domain of the Fusaricidin Nonribosomal Peptide Synthetase for Enhanced Production of Fusaricidin Analogs; Biotechnol. Lett. 34, 1327-1334; Mousa y col., (2015) Biodiversity of Genes Encoding Anti-Microbial Traits within Plant Associated Microbes, Front Plant Sci., 2015; 6:231).

La estructura del dominio A, que es responsable del reconocimiento y la activación del sustrato en el gen fusA, se determinó a partir de GrsA utilizando cristalografía de rayos X, y se identificaron los 10 restos de aminoácidos que determinan la especificidad de sustrato (Asp235, Ala236, Trp239, Thr278, Ile299, Ala301, Ala322, Ile330, Cys331 y Lys517) (Challis y col., (2000) Predictive, Structure-Based Model of Amino Acid Recognition by Nonribosomal Peptide Synthetase Adenylation Domains; Chem Biol 7: 211-224; Stachelhaus y col., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases; Chem Biol 6: 493-505). Estos 10 restos distintivos se pueden clasificar en tres subgrupos basado en su función dentro del sitio de unión al sustrato. Los restos Asp235 y Lys517 interactuaron con los extremos carboxilo y amino del sustrato, respectivamente, y el análisis de secuencia reveló que su posición en el dominio A de las NRPS era invariable. Los restos Ala236, Ala301 e Ile330 son moderadamente variables dentro de los dominios A específicos para los sustratos aminoacídicos que tienen cadenas laterales alifáticas. Trp239, Thr278, Ile299, Ala322 y Cys331 son posiciones muy variables y se cree que son importantes en la discriminación y selección de diferentes sustratos (Challis y col., (2000) Predictive, Structure-Based Model of Amino Acid Recognition by Nonribosomal Peptide Synthetase Adenylation Domains; Chem Biol, 7: 211-224; Stachelhaus y col., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases; Chem Biol, 6: 493-505). Ile299 era la posición más variable de todas dentro de la secuencia que confiere especificidad de sustrato (Stachelhaus y col., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases; Chem Biol, 6: 493-505).

Los 10 restos de aminoácidos que determinan la especificidad de sustrato en la fusaricidina sintasa se muestran en la Tabla 1. Los dominios de adenilación (dominios A) de cada uno de los seis módulos en la sintasa se conocen como FusA-A1 para el primer módulo, FusA-A2 para el segundo módulo, FusA-A3 para el tercer módulo, etc. Estos 10 restos de aminoácidos también se identifican en el alineamiento de múltiples secuencias de FusA de diversas cepas de Paenibacillus sp. que se muestra en la FIG. 13.

Tabla 1

En algunas realizaciones, el compuesto aislado o Paeniprolixina es

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En algunas realizaciones, el compuesto aislado o Paeniserina es

Las composiciones de la presente invención se pueden obtener mediante cultivo de la cepa NRRL B-50972 o un mutante fungicida (cepa) derivado de la misma de Paenibacillus sp. de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo mediante uso de medios y otros procedimientos descritos más adelante en los ejemplos. Los procedimientos de cultivo microbiano a gran escala convencionales incluyen fermentación sumergida, fermentación en estado sólido o cultivo en superficie líquida. Hacia el final de la fermentación, a medida que se van agotando los nutrientes, las células comienzan la transición de la fase de crecimiento a la fase de esporulación, de manera tal que el producto de fermentación final comprende mayormente esporas, metabolitos y medio de fermentación residual. La esporulación forma parte del ciclo de vida natural de Paenibacillus y en general la célula la inicia en respuesta a la limitación de nutrientes. La fermentación está configurada para obtener niveles altos de unidades formadoras de colonias y para promover la esporulación. Las células, esporas y metabolitos bacterianos del medio de cultivo que son el resultado de la fermentación se pueden utilizar directamente o se pueden concentrar utilizando procedimientos industriales convencionales, tales como centrifugación, filtración por flujo tangencial, filtración profunda y evaporación.

Las composiciones de la presente invención incluyen productos de fermentación. En algunas realizaciones, el caldo de fermentación concentrado se lava, por ejemplo, mediante un procedimiento de diafiltración, para eliminar el caldo de fermentación residual y los metabolitos. La expresión “caldo concentrado”, como se usa en el presente documento, se refiere al caldo completo (caldo de fermentación) que se ha concentrado mediante procedimientos industriales convencionales, como se describió previamente, pero que permanece en una forma líquida. La expresión “sólido de fermentación”, como se usa en el presente documento, se refiere al material sólido remanente después de secar el caldo de fermentación. La expresión “producto de fermentación”, como se usa en el presente documento, se refiere al caldo completo, a un concentrado del caldo y/o a sólidos de fermentación. Las composiciones de la presente invención incluyen productos de fermentación.

El caldo de fermentación o el caldo concentrado se puede secar con o sin la adición de vehículos, utilizando procesos o procedimientos de secado convencionales tales como secado por pulverización, liofilización, secado en bandeja, secado en lecho fluido, secado en tambor o evaporación.

Los productos secos resultantes se pueden procesar adicionalmente, tal como por molienda o granulación, para lograr un tamaño de partícula o un formato físico específico. Además, se pueden añadir vehículos, que se describen más adelante, después del secado.

Las preparaciones sin células del caldo de fermentación de las cepas de la presente invención se pueden obtener mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como extracción, centrifugación y/o filtración del caldo de fermentación. Los expertos en la materia podrán apreciar que las denominadas preparaciones sin células pueden no carecer de células, sino que mayormente no contienen células o esencialmente no contienen células, dependiendo de la técnica usada (por ejemplo, velocidad de centrifugación) para eliminar las células. La preparación sin células resultante se puede secar y/o formular con componentes que ayudan en su aplicación a las plantas o al medio de cultivo vegetal. Los procedimientos de concentración y las técnicas de secado descritas anteriormente para el caldo de fermentación también son aplicables a las preparaciones sin células.

Las composiciones de la invención se pueden utilizar como tales o, dependiendo de sus propiedades físicas y/o químicas particulares, en la forma de sus formulaciones o las formas de uso preparadas a partir de las mismas, tales como aerosoles, cápsulas, suspensiones, concentrados de neblina fría, concentrados de neblina caliente, gránulos encapsulados, gránulos finos, concentrados fluidos para el tratamiento de semillas, soluciones listas para usar, polvos espolvoreables, concentrados emulsionables, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, macrogránulos, microgránulos, polvos dispersables en aceite, concentrados fluidos miscibles en aceite, líquidos miscibles en aceite, gas (bajo presión), productos generadores de gases, espumas, pastas, semillas recubiertas con plaguicidas, concentrados en suspensión, dispersión oleosas, concentrados de suspoemulsiones, concentrados solubles, suspensiones, polvos humectables, polvos solubles, polvos finos y gránulos, gránulos o comprimidos solubles en agua y dispersables en agua, polvos solubles en agua y dispersables en agua para el tratamiento de semillas, polvos humectables, productos naturales y sustancias sintéticas impregnadas con el principio activo, y también microencapsulamientos en sustancias poliméricas y en materiales de recubrimiento para semillas, y también formulaciones de neblina en frío y neblina en caliente de VUB.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son formulaciones líquidas. Los ejemplos de formulaciones líquidas incluyen concentraciones en suspensión y dispersiones oleosas. En otras realizaciones, las composiciones de la invención son formulaciones sólidas. Los ejemplos de formulaciones líquidas incluyen polvos liofilizados y polvos secados por pulverización.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir inertes de formulación que se añaden a las composiciones que comprenden células, preparaciones sin células o metabolitos para mejorar la eficacia, la estabilidad y utilidad y/o para facilitar el procesamiento, el envasado y la aplicación de uso final. Dichos inertes o ingredientes de formulación pueden incluir vehículos, agentes de estabilización, nutrientes o agentes modificadores de las propiedades físicas, que se pueden añadir individualmente o combinados. En algunas realizaciones, los vehículos pueden incluir materiales líquidos tales como agua, aceite y otros disolventes orgánicos o inorgánicos y materiales sólidos tales como minerales, polímeros o complejos poliméricos obtenidos biológicamente o mediante síntesis química. En algunas realizaciones, el vehículo es un aglutinante o un adhesivo que facilita la adherencia de la composición a una parte de planta, tal como una semilla o raíz. Véase, por ejemplo, Taylor, A.G., y col., “Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments”, Annu. Rev. Phytopathol., 28: 321-339 (1990). Los agentes de estabilización pueden incluir agentes antiapelmazantes, agentes antioxidantes, secantes, protectores o conservantes. Los nutrientes pueden incluir fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, tales como azúcares, polisacáridos, aceite, proteínas, aminoácidos, ácidos grasos y fosfatos. Los modificadores de las propiedades físicas pueden incluir agentes formadores de volumen, agentes humectantes, espesantes, modificadores del pH, modificadores de la reología, dispersantes, adyuvantes, tensioactivos, agentes anticongelantes o colorantes. En algunas realizaciones, la composición que comprende células, una preparación sin células o los metabolitos producidos por fermentación se pueden utilizar directamente con o sin agua como diluyente, sin ninguna otra preparación de formulación. En algunas realizaciones, los inertes de formulación se añaden después de concentrar el caldo de fermentación y durante y/o después del secado.

Todas las plantas y partes de planta pueden tratarse en conformidad con la invención. En el presente contexto, se entiende que plantas significa todas las plantas y poblaciones vegetales, tales como plantas silvestres deseadas e indeseadas, o plantas de cultivo (incluyendo plantas de cultivo de origen natural). Las plantas de cultivo pueden ser plantas que se pueden obtener mediante mejora genética y procedimientos de optimización tradicionales o mediante procedimientos biotecnológicos y recombinantes o mediante combinaciones de estos procedimientos, incluyendo las plantas transgénicas e incluyendo las variedades vegetales que pueden estar protegidas, o no, por Derechos de Obtentores. Se entiende que partes de planta significa todas las partes y los órganos aéreos y subterráneos de las plantas, tales como brotes, hojas, flores y raíces, y como ejemplos se pueden mencionar hojas, agujas, tronco, tallos, flores, cuerpos de fructificación, frutos y semillas, y también raíces, tubérculos y rizomas. Las partes de planta también incluyen material de cultivo y material de propagación vegetativa y generativa, por ejemplo, estacas, tubérculos, rizomas, esquejes y semillas.

Como ya se mencionó anteriormente, es posible tratar todas las plantas y sus partes en conformidad con la invención. En una realización preferida, se tratan especies de plantas y variedades vegetales, y sus partes, que crecen de manera silvestre o que se obtienen mediante procedimientos biológicos de mejora genética tradicionales, tales como hibridación o fusión de protoplastos. En una realización preferida adicional, se tratan plantas transgénicas y variedades vegetales que se obtuvieron mediante procedimientos recombinantes, si fuera apropiado en combinación con procedimientos tradicionales (organismos modificados genéticamente) y sus partes. El término “partes” o la expresión “partes de planta” ya se explicaron anteriormente. Las plantas de las variedades vegetales que en cada caso están comercialmente disponibles o en uso se tratan en especial preferentemente en conformidad con la invención. Se entiende que variedades vegetales significa las plantas con rasgos novedosos que se obtuvieron mediante mejora genética tradicional, mediante mutagénesis o mediante técnicas de ADN recombinante. Pueden tomar la forma de variedades, razas, biotipos y genotipos.

El tratamiento de las plantas y partes de planta con las composiciones de acuerdo con la invención se lleva a cabo directamente o mediante acción sobre el entorno, hábitat o espacio de almacenamiento utilizando procedimientos de tratamiento habituales, por ejemplo mediante inmersión, pulverización, atomización, nebulización, evaporación, espolvoreado, formación de niebla, dispersión, formación de espuma, pintura, extensión, inyección, empapando, irrigación por goteo y, en el caso de material de propagación, en particular en el caso de semillas, además mediante el procedimiento de tratamiento de semillas en seco, el procedimiento de tratamiento de semillas húmedo, el procedimiento de tratamiento con suspensión, mediante incrustación, mediante recubrimiento con uno o más recubrimientos y similares. Adicionalmente, es posible aplicar las sustancias activas mediante el procedimiento de volumen ultrabajo o inyectar la preparación de sustancia activa o la propia sustancia activa en el suelo.

Un tratamiento directo preferido de las plantas es el tratamiento de aplicación foliar, es decir, las composiciones de acuerdo con la invención se aplican al follaje, pudiéndose corresponder la frecuencia de tratamiento y el índice de aplicación con la presión de infección del patógeno en cuestión.

En el caso de compuestos activos de forma sistémica, las composiciones de acuerdo con la invención alcanzan a las plantas a través del sistema radicular. En este caso, el tratamiento de las plantas se efectúa permitiendo que las composiciones de acuerdo con la invención actúen sobre el entorno de la planta. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante empapamiento, por incorporación en el suelo o en la solución de nutrientes, es decir, la ubicación de la planta (por ejemplo, el suelo o sistemas hidropónicos) se impregna con una forma líquida de las composiciones de acuerdo con la invención, o mediante aplicación al suelo, es decir, las composiciones de acuerdo con la invención se incorporan en la ubicación de las plantas en una forma sólida (por ejemplo, en la forma de gránulos). En el caso de los cultivos en arrozales, esto también se puede realizar dosificando las composiciones de acuerdo con la invención en un arrozal inundado en una forma de uso sólida (por ejemplo, en la forma de gránulos).

Las plantas preferidas son las del grupo de las plantas útiles, ornamentales, céspedes, los árboles de uso general que se emplean como ornamentales en los sectores públicos y domésticos, y los árboles de silvicultura. Los árboles de silvicultura comprenden árboles para la obtención de madera, celulosa, papel y productos fabricados a partir de partes de los árboles.

La expresión “plantas útiles”, como se usa en el presente contexto, se refiere a las plantas de cultivo que se emplean como plantas para obtener productos alimenticios, piensos, combustibles o con fines industriales.

Las plantas útiles que se pueden tratar y/o mejorar con las composiciones y los procedimientos de la presente invención incluyen, por ejemplo, los siguientes tipos de plantas: céspedes, vides, cereales, por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, maíz y mijo/sorgo; remolachas, por ejemplo, remolacha azucarera y forrajera; frutas, por ejemplo, frutas de pepitas, fruta con hueso y frutos blandos, por ejemplo, manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas y bayas, por ejemplo fresas, frambuesas, moras; legumbres, por ejemplo, habas, lentejas, guisantes y soja; cultivos de oleaginosas, por ejemplo, colza de semillas oleaginosas, mostaza, amapolas, olivas, girasoles, cocos, plantas de aceite de ricino, cacao y cacahuetes; cucurbitáceas, por ejemplo calabaza/calabacín, pepinos y melones; plantas fibrosas, por ejemplo, algodón, lino, cáñamo y yute; cítricos, por ejemplo, naranjas, limones, pomelos y mandarinas; hortalizas, por ejemplo, espinacas, lechuga, espárragos, especies de coles, zanahorias, cebollas, tomates, patatas y pimientos; lauráceas, por ejemplo, palta, canela, alcanfor u otras plantas tales como tabaco, frutos secos, café, berenjena, caña de azúcar, té, pimienta, vid, lúpulo, bananas, plantas de látex y ornamentales, por ejemplo, flores, arbustos, árboles de hoja caduca y árboles de coníferas.

Se considera que las siguientes plantas son cultivos objetivo particularmente adecuados para aplicar las composiciones y los procedimientos de la presente invención: algodón, berenjena, césped, frutas de pepitas, frutos con hueso, frutos rojos, maíz, trigo, cebada, pepino, tabaco, vides, arroz, cereales, pera, habas, soja, colza de semillas oleaginosas, tomate, pimiento, melones, col, patata y manzana.

Los ejemplos de árboles que se pueden mejorar en conformidad con el procedimiento de acuerdo con la invención son: Abies sp., Eucalyptus sp., Picea sp., Pinus sp., Aesculus sp., Platanus sp., Tilia sp., Acer sp., Tsuga sp., Fraxinus sp., Sorbus sp., Betula sp., Crataegus sp., Ulmus sp., Quercus sp., Fagus sp., Salix sp., Populus sp.

Los árboles preferidos que se pueden mejorar en conformidad con el procedimiento de acuerdo con la invención son: de especies de árboles de Aesculus: A. hippocastanum, A. pariflora, A. carnea; de especies de árboles de Platanus: P. aceriflora, P. occidentalis, P. racemosa; de especies de árboles de Picea: P. abies; de especies de árboles de Pinus: P. radiata, P. ponderosa, P. contorta, P. sylvestre, P. elliottii, P. montecola, P. albicaulis, P. resinosa, P. palustris, P. taeda, P. flexilis, P. jeffregi, P. baksiana, P. strobus; de especies de árboles de Eucalyptus: E. grandis, E. globulus, E. camadentis, E. nitens, E. obliqua, E. regnans, E. pilularus.

Los árboles especialmente preferidos que se pueden mejorar en conformidad con el procedimiento de acuerdo con la invención son: de especies de árboles de Pinus: P. radiata, P. ponderosa, P. contorta, P. sylvestre, P. strobus; de especies de árboles de Eucalyptus: E. grandis, E. globulus, E. camadentis.

Los árboles muy particularmente preferidos que se pueden mejorar en conformidad con el procedimiento de acuerdo con la invención son: los árboles de castaño de indias, de Platanaceae, tilo, arce.

La presente invención también se puede aplicar a cualquier tipo de gramíneas cespitosas, incluyendo gramíneas cespitosas de invierno y gramíneas cespitosas de verano. Los ejemplos de gramíneas cespitosas de invierno son las poas (bluegrasses) (Poa spp.), tal como el pasto azul de Kentucky (Poa pratensis L.), gramilla (Poa trivialis L.), pasto azul de Canadá (Poa compressa L.), pasto azul anual (Poa annua L.), pasto azul de tierras altas (Poa glaucantha Gaudin), pasto azul leñoso (Poa nemoralis L.) y pasto azul bulboso (Poa bulbosa L.); agróstidas (Agrostis spp.) tales como grama rastrera (Agrostis palustris Huds.), grama colonial (Agrostis tenuis Sibth.), grama aterciopelada (Agrostis canina L.), grama mixta de Alemania del Sur (Agrostis spp. incluyendo Agrostis tenuis Sibth., Agrostis canina L. y Agrostis palustris Huds.) y grama mayor (Agrostis alba L.);

festucas (Festuca spp.), tal como festuca roja (Festuca rubra L. spp. rubra), festuca rastrera (Festuca rubra L.), festuca encarnada (Festuca rubra commutata Gaud.), pan de corderos (Festuca ovina L.), festuca dura (Festuca longifolia Thuill.), festuca pilosa (Festucu capillata Lam.), festuca alta (Festuca arundinacea Schreb.) y festuca de los prados (Festuca elanor L.);

pastos centeno (Lolium spp.), tal como el pasto centeno anual (Lolium multiflorum Lam.), el pasto centeno perenne (Lolium perenne L.) y el pasto centeno italiano (Lolium multiflorum Lam.);

y agropiros o pastos de trigo (Agropyron spp.), tal como el pasto de trigo o agropiro gramillado (Agropyron cristatum (L.) Gaertn.), el pasto de trigo o agropiro crestado (Agropyron desertorum (Fisch.) Schult.) y el pasto de trigo o agropiro del oeste (Agropyron smithii Rydb.)

Los ejemplos de otras gramíneas cespitosas de invierno son el barrón (Ammophila breviligulata Fern.), bromo suave (Bromus inermis Leyss.), espadañas tal como Timothy (Phleum pratense L.), espadaña de la arena (Phleum subulatum L.), pasto ovillo (Dactylis glomerata L.), pasto llorón (Puccinellia distans (L.) Par1.) y cola de perro crestado (Cynosurus cristatus L.)

Los ejemplos de gramíneas cespitosas de verano comprenden pasto Bermuda (Cynodon spp. L. C. Rich), pasto zoysia (Zoysia spp. Willd.), pasto San Agustín (Stenotaphrum secundatum Walt Kuntze), hierba centípeda (Eremochloa ophiuroides Munro Hack.), pasto alfombra (Axonopus affinis Chase), pasto bahiano (Paspalum notatum Flugge), pasto Kikuyu (Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov.), pasto de búfalo (Buchloe dactyloids (Nutt.) Engelm.), grama azul (Bouteloua gracilis (H.B.K.) Lag. ex Griffiths), grama de agua (Paspalum vaginatum Swartz) y grama del cerro (Bouteloua curtipendula (Michx. Torr.). En general se prefieren las gramíneas cespitosas de invierno para su uso de acuerdo con la invención. Se prefieren especialmente la poa, pastos en manojos y grama mayor, festucas y pastos centeno. Se prefiere especialmente la grama.

Las composiciones de la invención tienen una potente actividad microbicida y se pueden utilizar para el control de microorganismos indeseados, tales como hongos y bacterias, en la protección de cultivos y en la protección de materiales.

La invención también se refiere a un procedimiento para controlar microorganismos indeseados, caracterizado porque las composiciones de la invención se aplican a los hongos fitopatógenos, a las bacterias fitopatógenas y/o a su hábitat.

Los fungicidas se pueden utilizar en la protección de cultivos para el control de hongos fitopatógenos. Se caracterizan por una eficacia sobresaliente contra un amplio espectro de hongos fitopatógenos, incluyendo patógenos del suelo, que en particular son miembros de las clases Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (Sin. Oomycetes), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes (Sin. Fungi imperfecti). Algunos fungicidas son activos de forma sistémica y se pueden utilizar en la protección vegetal como un fungicida foliar, para el tratamiento de semillas o para el suelo. Adicionalmente, son adecuados para combatir hongos que infestan, entre otros, la madera o las raíces de las plantas.

Se pueden utilizar bactericidas en la protección de cultivos para controlar Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae y Streptomycetaceae.

Los ejemplos de patógenos de enfermedades fúngicas que pueden tratarse en conformidad con la invención incluyen:

enfermedades provocadas por patógenos de mildiú pulverulento, por ejemplo, especies de Blumeria, por ejemplo, Blumeria graminis; especies de Podosphaera, por ejemplo, Podosphaera leucotricha; especies de Sphaerotheca, por ejemplo, Sphaerotheca fuliginea; especies de Uncinula, por ejemplo, Uncinula necator;

enfermedades provocadas por patógenos de enfermedades de roya, por ejemplo, especies de Gymnosporangium, por ejemplo, Gymnosporangium sabinae; especies de Hemileia, por ejemplo, Hemileia vastatrix; especies de Phakopsora, por ejemplo, Phakopsora pachyrhizi y Phakopsora meibomiae; especies de Puccinia, por ejemplo, Puccinia recondite, P. triticina, P. graminis o P. striiformis; especies de Uromyces, por ejemplo, Uromyces appendiculatus;

enfermedades provocadas por patógenos del grupo Oomycetes, por ejemplo, especies de Albugo, por ejemplo, Algubo candida; especies de Bremia, por ejemplo, Bremia lactucae; especies de Peronospora, por ejemplo, Peronospora pisi o P. brassicae; especies de Phytophthora, por ejemplo, Phytophthora infestans; especies de Plasmopara, por ejemplo, Plasmopara viticola; especies de Pseudoperonospora, por ejemplo, Pseudoperonospora humuli o Pseudoperonospora cubensis; especies de Pythium, por ejemplo, Pythium ultimum;

enfermedades de manchas foliares y enfermedades de marchitamiento de las hojas provocadas, por ejemplo,, por especies de Alternaría, por ejemplo, Alternaria solani; especies de Cercospora, por ejemplo, Cercospora beticola; especies de Cladiosporium, por ejemplo, Cladiosporium cucumerinum; especies de Cochliobolus, por ejemplo, Cochliobolus sativus (forma de conidios: Drechslera, Sin: Helminthosporium), Cochliobolus miyabeanus; especies de Colletotrichum, por ejemplo, Colletotrichum lindemuthanium; especies de Cycloconium, por ejemplo, Cycloconium oleaginum; especies de Diaporthe, por ejemplo, Diaporthe citri; especies de Elsinoe, por ejemplo, Elsinoe fawcettii; especies de Gloeosporium, por ejemplo, Gloeosporium laeticolor, especies de Glomerella, por ejemplo, Glomerella cingulata; especies de Guignardia, por ejemplo, Guignardia bidwelli; especies de Leptosphaeria, por ejemplo, Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria nodorum; especies de Magnaporthe, por ejemplo, Magnaporthe grisea; especies de Marssonia, por ejemplo,, Marssonia coronaria; especies de Microdochium, por ejemplo, Microdochium nivale; especies de Mycosphaerella, por ejemplo, Mycosphaerella graminicola, M. arachidicola y M. fijiensis; especies de Phaeosphaeria, por ejemplo, Phaeosphaeria nodorum; especies de Pyrenophora, por ejemplo, Pyrenophora teres, Pyrenophora tritici repentis; especies de Ramularia, por ejemplo, Ramularia collo-cygni, Ramularia areola; especies de Rhynchosporium, por ejemplo, Rhynchosporium secalis; especies de Septoria, por ejemplo, Septoria apii, Septoria lycopersii; especies de Typhula, por ejemplo, Typhula incarnata; especies de Venturia, por ejemplo, Venturia inaequalis;

enfermedades de raíces y tallos provocadas, por ejemplo,, por especies de Corticium, por ejemplo, Corticium graminearum; especies de Fusarium, por ejemplo, Fusarium oxisporum; especies de Gaeumannomyces, por ejemplo, Gaeumannomyces graminis; especies de Rhizoctonia, tal como, por ejemplo, Rhizoctonia solani; enfermedades por Sarocladium provocadas, por ejemplo, por Sarocladium oryzae; enfermedades por Sclerotium provocadas, por ejemplo,, por Sclerotium oryzae; especies de Tapesia, por ejemplo, Tapesia acuformis; especies de Thielaviopsis, por ejemplo, Thielaviopsis basicola;

enfermedades de mazorcas y panojas (incluyendo, mazorcas de maíz) provocadas, por ejemplo,, por especies de Alternaría, por ejemplo, Alternaria spp.; especies de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus flavus; especies de Cladosporium, por ejemplo, Cladosporium cladosporioides; especies de Claviceps, por ejemplo, Claviceps purpurea; especies de Fusarium, por ejemplo, Fusarium culmorum; especies de Gibberella, por ejemplo, Gibberella zeae; especies de Monographella, por ejemplo, Monographella nivalis; especies de Septoria, por ejemplo, Septoria nodorum;

enfermedades provocadas por hongos del tizón, por ejemplo, especies de Sphacelotheca, por ejemplo, Sphacelotheca reiliana; especies de Tilletia, por ejemplo, Tilletia caries, T. controversa; especies de Urocystis, por ejemplo, Urocystis occulta; especies de Ustilago, por ejemplo, Ustilago nuda, U. nuda tritici;

podredumbre de los frutos provocada, por ejemplo, por especies de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus flavus; especies de Botrytis, por ejemplo, Botrytis cinerea; especies de Penicillium, por ejemplo, Penicillium expansum y P. purpurogenum; especies de Sclerotinia, por ejemplo, Sclerotinia sclerotiorum; especies de Verticilium, por ejemplo, Verticilium alboatrum;

enfermedades de semillas y descomposición en la tierra, moho, marchitamiento, podredumbre y mal de los semilleros provocadas, por ejemplo,, por especies de Alternaría, provocadas por ejemplo, por Alternaria brassicicola; especies de Aphanomyces, provocadas por ejemplo, por Aphanomyces euteiches; especies de Ascochyta, provocadas por ejemplo, por Ascochyta lentis; especies de Aspergillus, provocadas por ejemplo, por Aspergillus flavus; especies de Cladosporium, provocadas por ejemplo, por Cladosporium herbarum; especies de Cochliobolus, provocadas por ejemplo, por Cochliobolus sativus; (Conidioformes: Drechslera, Bipolaris Sin; Helminthosporium); especies de Colletotrichum, provocadas por ejemplo, por Colletotrichum coccodes; especies de Fusarium, provocadas por ejemplo, por Fusarium culmorum; especies de Gibberella, provocadas por ejemplo, por Gibberella zeae; especies de Macrophomina, provocadas por ejemplo, por Macrophomina phaseolina; especies de Monographella, provocadas por ejemplo, por Monographella nivalis; especies de Penicillium, provocadas por ejemplo, por Penicillium expansum; especies de Phoma, provocadas por ejemplo, por Phoma lingam; especies de Phomopsis, provocadas por ejemplo, por Phomopsis sojae; especies de Phytophthora, provocadas por ejemplo, por Phytophthora cactorum; especies de Pyrenophora, provocadas por ejemplo, por Pyrenophora graminea; especies de Pyricularia, provocadas por ejemplo, por Pyricularia oryzae; especies de Pythium, provocadas por ejemplo, por Pythium ultimum; especies de Rhizoctonia, provocadas por ejemplo, por Rhizoctonia solani; especies de Rhizopus, provocadas por ejemplo, por Rhizopus oryzae; especies de Sclerotium, provocadas por ejemplo, por Sclerotium rolfsii; especies de Septoria, provocadas por ejemplo, por Septoria nodorum; especies de Typhula, provocadas por ejemplo, por Typhula incarnata; especies de Verticillium, provocadas por ejemplo, por Verticillium dahliae;

cánceres, agallas y escobas de bruja provocados, por ejemplo, por especies de Nectria, por ejemplo, Nectria galligena;

enfermedades de marchitamiento provocadas, por ejemplo, por especies de Monilinia, por ejemplo, Monilinia laxa; enfermedades de ampollas foliares o de enrollamiento foliar provocadas, por ejemplo, por especies de Exobasidium, por ejemplo, Exobasidium vexans;

especies de Taphrina, por ejemplo, Taphrina deformans;

enfermedades de descomposición de las plantas leñosas provocadas, por ejemplo, por la enfermedad de Esca, provocada, por ejemplo, por Phaemoniella clamydospora, Phaeoacremonium aleophilum y Fomitiporia mediterranea; Eutipiosis por Eutypa, provocada, por ejemplo, por Eutypa lata; enfermedades provocadas por Ganoderma, por ejemplo, por Ganoderma boninense; enfermedades provocadas por Rigidoporus, por ejemplo, por Rigidoporus lignosus;

enfermedades de flores y semillas provocadas, por ejemplo, por especies de Botrytis, por ejemplo, Botrytis cinerea; enfermedades de los tubérculos de plantas provocadas, por ejemplo, por especies de Rhizoctonia, por ejemplo, Rhizoctonia solani; especies de Helminthosporium, por ejemplo, Helminthosporium solani;

hernia de la col provocada, por ejemplo, por especies de Plasmodiophora, por ejemplo, Plamodiophora brassicae; enfermedades provocadas por patógenos bacterianos, por ejemplo, especies de Xanthomonas, por ejemplo, Xanthomonas campestris pv. oryzae; especies de Pseudomonas, por ejemplo, Pseudomonas syringae pv. lachrymans; especies de Erwinia, por ejemplo, Erwinia amylovora.

Con preferencia se pueden controlar las siguientes enfermedades de la soja:

Enfermedades fúngicas sobre hojas, tallos, vainas y semillas provocadas, por ejemplo, por mancha foliar de Alternaria (Alternaria espec. atrans tenuissima), antracnosis (Colletotrichum gloeosporoides dematium var. truncatum), mancha marrón (Septoria glycines), mancha foliar y tizón de Cercospora (Cercospora kikuchii), tizón de las hojas por Choanephora (Choanephora infundibulifera trispora (Sin.)), mancha foliar por Dactuliophora (Dactuliophora glycines), mildiú lanoso (Peronospora manshurica), tizón por Drechslera (Drechslera glycini), mancha foliar ojo de rana (Cercospora sojina), mancha foliar por Leptosphaerulina (Leptosphaerulina trifolii), mancha foliar por Phyllostica (Phyllosticta sojaecola), tizón de vainas y tallos (Phomopsis sojae), mildiú pulverulento (Microsphaera difusa), mancha foliar por Pyrenochaeta (Pyrenochaeta glycines), tizón aéreo, del follaje y de telaraña por Rhizoctonia (Rhizoctonia solani), roya (Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae), sarna de soja (Sphaceloma glycines), tizón de las hojas por Stemphylium (Stemphylium botryosum), mancha anillada (Corynespora cassiicola).

Enfermedades fúngicas en las raíces y la base del tallo provocadas, por ejemplo, por podredumbre radicular negra (Calonectria crotalariae), podredumbre carbonosa (Macrophomina phaseolina), tizón o marchitamiento, podredumbre radicular, y podredumbre de vaina y collar por Fusarium (Fusarium oxisporum, Fusarium orthoceras, Fusarium semitectum, Fusarium equiseti), podredumbre radicular por Mycoleptodiscus (Mycoleptodiscus terrestris), neocosmospora (Neocosmospora vasinfecta), tizón de vainas y tallos (Diaporthe phaseolorum), cancro del tallo (Diaporthe phaseolorum var. caulivora), podredumbre de Phytophthora (Phytophthora megasperma), podredumbre de tallo marrón (Phialophora gregata), podredumbre por Pythium (Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium myriotylum, Pythium ultimum), podredumbre radicular, descomposición de tallos y mal de los semilleros por Rhizoctonia (Rhizoctonia solani), descomposición de los tallos por Sclerotinia (Sclerotinia sclerotiorum), tizón del sur por Sclerotinia (Sclerotinia rolfsii), podredumbre radicular por Thielaviopsis (Thielaviopsis basicola).

Las composiciones fungicidas de la invención se pueden utilizar para el control curativo o protector/preventivo de hongos fitopatógenos. Por lo tanto, la invención también se refiere a procedimientos curativos y protectores para el control de hongos fitopatógenos mediante el uso de las composiciones de la invención, que se aplican a las semillas, la planta o parte de planta, los frutos o el suelo en el cual crecen las plantas.

El hecho que las composiciones sean bien toleradas por las plantas a las concentraciones necesarias para el control de enfermedades en plantas permite el tratamiento de las partes aéreas de las plantas, de las reservas de propagación y de semillas, y del suelo.

De acuerdo con la invención, se pueden tratar todas las plantas y las partes de planta, incluyendo cultivares y variedades vegetales (ya sea si pueden protegerse o no por los derechos de obtentor de plantas o de variedades vegetales). Los cultivares y las variedades de plantas pueden ser plantas obtenidas mediante procedimientos de propagación y mejora genética convencionales que pueden estar asistidos o complementados por uno o más procedimientos biotecnológicos, tal como mediante el uso de haploides dobles, fusión de protoplastos, mutagénesis aleatoria y dirigida, marcadores moleculares o genéticos, o mediante procedimientos de bioingeniería o de ingeniería genética.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención se aplican a entre aproximadamente 0,1 kg y aproximadamente 10 kg de sólidos de fermentación por hectárea. En otras realizaciones, las composiciones de la presente invención se aplican a entre aproximadamente 0,25 kg y aproximadamente 7,5 kg de sólidos de fermentación por hectárea. En aún otras realizaciones, las composiciones de la presente invención se aplican a entre aproximadamente 0,5 kg y aproximadamente 5 kg de sólidos de fermentación por hectárea. Las composiciones de la presente invención también se pueden aplicar a aproximadamente 1 kg o aproximadamente 2 kg de sólidos de fermentación por hectárea.

Las composiciones de la invención, cuando las plantas las toleran bien, tienen una toxicidad homeoterma favorable y el entorno las tolera bien, son adecuadas para la protección vegetal y de órganos vegetales, para potenciar los rendimientos de cosecha, para mejorar la calidad del material cosechado. Preferentemente, se pueden utilizar como composiciones de protección de cultivos. Son activas contra las especies normalmente sensibles y resistentes y contra todas o algunas fases del desarrollo.

Las plantas que pueden tratarse en conformidad con la invención incluyen las siguientes plantas de cultivo importantes: maíz, soja, alfalfa, algodón, girasol, semillas oleaginosas de Brassica tales como Brassica napus (por ejemplo, canola, colza), Brassica rapa, B. juncea (por ejemplo mostaza (de campo)) y Brassica carinata, Arecaceae sp. (por ejemplo, palma oleaginosa, coco), arroz, trigo, remolacha azucarera, caña de azúcar, avena, centeno, cebada, mijo y sorgo, triticale, lino, frutos secos, uvas y vides, y diversos frutos y hortalizas de diversos taxones botánicos, por ejemplo Rosaceae sp. (por ejemplo, frutos de pepitas tales como manzanas y peras, pero también frutos con hueso tales como albaricoques, cerezas, almendras, ciruelas y melocotones, y bayas tales como fresas, frambuesas, grosellas rojas y negras y grosella espinosa), Ribesioidae sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp.. (por ejemplo, olivo), Actinidaceae sp., Lauraceae sp. (por ejemplo, aguacate, canela, alcanfor), Musaceae sp. (por ejemplo, árboles y plantaciones de bananos), Rubiaceae sp. (por ejemplo, café), Theaceae sp. (por ejemplo, té), Sterculiceae sp., Rutaceae sp. (por ejemplo, limones, naranjas, mandarinas y pomelos); Solanaceae sp. (por ejemplo, tomates, patatas, pimientos, pimiento morrón, berenjenas, tabaco), Liliaceae sp., Compositae sp. (por ejemplo, lechuga, alcachofas y achicoria - incluyendo raíz de achicoria, endivias o achicoria común), Umbelliferae sp. (por ejemplo, zanahorias, perejil, apio y raíz de apio), Cucurbitaceae sp. (por ejemplo, pepinos - incluyendo pepinillos, zapallos, sandías, calabazas y melones), Alliaceae sp. (por ejemplo, puerros y cebollas), Cruciferae sp. (por ejemplo, col blanca, col roja, brócoli, coliflor, coles de Bruselas, pak choi, col kohlrabi, rábanos, rábano picante, berro y col china), Leguminosae sp. (por ejemplo, cacahuete, guisantes, lentejas y habas -por ejemplo habas comunes y haba de mayo), Chenopodiaceae sp. (por ejemplo, cardo suizo, remolacha forrajera, espinaca, remolacha), Linaceae sp. (por ejemplo, cáñamo), Cannabeacea sp. (por ejemplo, cánabis), Malvaceae sp. (por ejemplo, quingombó, cacao), Papaveraceae (por ejemplo, amapola), Asparagaceae (por ejemplo, espárrago); plantas útiles y plantas ornamentales de jardín y bosques incluyendo grama, césped, pasto y Stevia rebaudiana; y en cada caso los tipos modificados genéticamente de estas plantas.

En determinados aspectos, el producto de fermentación comprende además un ingrediente de formulación. El ingrediente de formulación puede ser un agente humectante, un expansor, un disolvente, un promotor instantáneo, un emulsionante, un dispersante, un crioprotector, un espesante y/o un adyuvante. En una realización, el ingrediente de formulación es un agente humectante. En otros aspectos, el producto de fermentación es un polvo secado por liofilización o un polvo secado por pulverización.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir ingredientes de formulación añadidos a las composiciones de la presente invención para mejorar la recuperación, la eficacia o las propiedades físicas y/o para ayudar en el procesamiento, el envasado y la administración. Dichos ingredientes de formulación se pueden añadir individualmente o combinados.

Los ingredientes de formulación se pueden añadir a composiciones que comprenden células, a preparaciones sin células, a compuestos aislados y/o a metabolitos para mejorar la eficacia, la estabilidad y las propiedades físicas, la utilidad y/o para facilitar el procesamiento, el envasado y la aplicación de uso final. Dichos ingredientes de formulación pueden incluir vehículos, agentes inertes, de estabilización, conservantes, nutrientes o agentes modificadores de las propiedades físicas agronómicamente aceptables, que se pueden añadir individualmente o combinados. En algunas realizaciones, los vehículos pueden incluir materiales líquidos tales como agua, aceite y otros disolventes orgánicos o inorgánicos y materiales sólidos tales como minerales, polímeros o complejos poliméricos obtenidos biológicamente o mediante síntesis química. En algunas realizaciones, el ingrediente de formulación es un aglutinante, un adyuvante o un adhesivo que facilita la adherencia de la composición a una parte de planta, tal como hojas, semillas o raíces. Véase, por ejemplo, Taylor, A.G., y col., “Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments”, Annu. Rev. Phytopathol., 28: 321-339 (1990). Los agentes de estabilización pueden incluir agentes antiaglomerantes, agentes antioxidantes, agentes antisedimentación, agentes antiespumantes, secantes, protectores o conservantes. Los nutrientes pueden incluir fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, tales como azúcares, polisacáridos, aceite, proteínas, aminoácidos, ácidos grasos y fosfatos. Los modificadores de las propiedades físicas pueden incluir agentes formadores de volumen, agentes humectantes, espesantes, modificadores del pH, modificadores de la reología, dispersantes, adyuvantes, tensioactivos, formadores de películas, hidrótropos, aditivos, agentes anticongelantes o colorantes. En algunas realizaciones, la composición que comprende células, la preparación sin células y/o los metabolitos producidos por fermentación se pueden utilizar directamente con o sin agua como diluyente, sin ninguna otra preparación de formulación. En una realización particular, se añade un agente humectante o un dispersante un sólido de fermentación, tal como un polvo liofilizado o secado por pulverización. El agente humectante aumenta las propiedades de dispersión y de penetración, o el dispersante aumenta la dispersabilidad y la solubilidad del principio activo (una vez diluido) cuando se aplica a superficies. Los agentes humectantes ejemplares son conocidos para los expertos en la materia e incluyen sulfosuccinatos y derivados, tal como MULTIWET™ MO-70R (Croda Inc., Edison, NJ); siloxanos tal como BREAK-THRU® (Evonik, Alemania); compuestos no iónicos, tal como ATLOXTM 4894 (Croda Inc., Edison, NJ); alquilpoliglucósidos, tal como TERWET® 3001 (Huntsman International LLC, The Woodlands, Texas); etoxilato de alcohol C12-C14, tal como TERGITOL® 15-S-15 (The Dow Chemical Company, Midland, Michigan); ésteres de fosfato, tal como RHODAFAC® BG-510 (Rhodia, Inc.) y carboxilatos de alquiléter, tal como EMULSOGEN™ LS (Clariant Corporation, Carolina del Norte).

INFORMACIÓN DE DEPÓSITOS

Se ha depositado una muestra de una cepa de Paenibacillus sp. descrita en el presente documento en la Agricultural Research Service Culture Collection del National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (NRRL) , 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, EE.UU., en virtud del Tratado de Budapest, el 28 de agosto de 2014, y se le asignó el siguiente número de referencia: NRRL B-50972.

Se ha depositado una muestra de la cepa de Paenibacillus sp. obtenida de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. que demuestra una morfología de colonias estable en la Agricultural Research Service Culture Collection del National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, EE.UU., en virtud del Tratado de Budapest el 1 de septiembre de 2015 y se le asignó el siguiente número de referencia: NRRL B-67129.

Los siguientes ejemplos solamente se ofrecen a efectos puramente ilustrativos y fines de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Selección de NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.

Se secuenciaron los genomas de varias cepas de Paenibacillus sp. Este dato genómico se analizó a fin de identificar cepas con la agrupación de genes de biosíntesis de la fusaricidina pero que no carecen de la agrupación de genes de la polimixina sintasa. Se ha identificado y caracterizado la agrupación de genes responsable de la biosíntesis de fusaricidina (fusA) con anterioridad, así como se había hecho con la agrupación de genes de la polimixina sintasa. Véase, por ejemplo, Li y col., “Nonribosomal Biosynthesis of Fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a D-Amino Acid”, Chemistry & Biology, 15: 118-127 (2008); Li y col., “Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21”, Applied Microbiol Biotechnol, 97: 9479-9489 (2013); y Choi y col., “ Identification of a Polymyxin Synthetase Gene Cluster of Paenibacillus polymyxa and Heterologous Expression of the Gene in Bacillus subtilis", Journal of Bacteriology, 191(10): 3350-3358 (2009).

Las cepas identificadas con este análisis se evaluaron además para confirmar la producción de fusaricidina. Brevemente, cada cepa se cultivó en un medio basado en soja y se extrajo la fracción lipófila del caldo completo. El extracto de caldo completo se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la presencia de la fusaricidina A se identificó basándose en el perfil de HPLC generado con una muestra patrón que contenía fusaricidina A.

Ejemplo 2. Actividad antifúngica in p lan ta de caldos completos de las cepas de P aenibacillus sp.

Se cultivaron cepas seleccionadas de Paenibacillus sp., incluyendo la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., en un medio basado en soja para producir cultivos en caldo completo. Se añadió agua destilada a cada uno de los caldos completos para obtener una dilución final del 10 %.

Los caldos completos diluidos se aplicaron a las hojas de plantas jóvenes que luego se expusieron a un inóculo fúngico del tizón tardío de tomate (PHYTIN), moho gris (BOTRCI) o roya de la hoja de trigo (PUCCRT). En cada ensayo se incluyó un control no tratado a efectos comparativos. Varios días después de la exposición a los inóculos fúngicos, se puntuó cada planta en cuanto al porcentaje de control del patógeno con respecto a las plantas de control no tratadas. Cada tratamiento se evaluó con tres repeticiones y el porcentaje de control promedio con cada caldo completo de una cepa de Paenibacillus sp. se muestra en la FIG. 1.

De las 23 cepas analizadas en cuanto a su actividad antifúngica contra PHYTIN, BOTRCI y PUCCRT, la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. era una de las pocas cepas que tenía un nivel de actividad relativamente alto contra los tres patógenos fúngicos.

Ejemplo 3. Eficacia biológica in vitro del extracto de fusaricidina de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.

Se prepararon cultivos de caldo completo de varias cepas de Paenibacillus sp., incluyendo NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., utilizando un medio basado en soja. Se extrajeron de los caldos completos las fracciones lipófilas que contenían fusaricidinas. Se hicieron tres fracciones separadas que contenían diversas fusaricidinas y metabolitos antifúngicos a partir del extracto de caldo completo de la primera cepa de Paenibacillus sp. (es decir, la Fracción 1, la Fracción 2 y la Fracción 3). El extracto de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. no se separó adicionalmente.

Las fracciones que contienen fusaricidina de cada cepa se analizaron contra los siguientes doce patógenos fúngicos: Alternaria alternata (ALTEAL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Fusarium culmorum (FUSACU), Phaeosphaeria nodorum (LEPTNO), Zymoseptoria tritici (SEPPTR), Ph^ophthora cryptogea (PHYTCR), Phytophthora infestans (PHYTIN), Pythium ultimum (PYTHUL), Magnaporthe oryzae (PYRIOR), Thanatephorus cucumeris (RHIZSO), Ustilago segetum var. avenae (USTIAV) y Uromyces appendiculatus (UROMAP). Se evaluó la inhibición del crecimiento de las células fúngicas por las diferentes fracciones en un medio basado en soja y se comparó con el crecimiento de los controles no tratados. Se analizaron ocho dosis de cada fracción, que variaban de entre 0,005 ppm y 100 ppm. Las dosis eficaces que producían un 50 % de inhibición (DE50) y un 80 % de inhibición (DE80) se informan en la tabla de la FIG. 2.

La fracción que contiene fusaricidina de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. mostraba una actividad antifúngica de amplio espectro en los doce ensayos que no se observó con las fracciones de la otra cepa de Paenibacillus sp. La fracción de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. también mostró una actividad mucho mayor en los ensayos que la observada con las fracciones de la otra cepa de Paenibacillus sp. (véase la FIG. 2).

Ejemplo 4. Prueba preventiva in vivo en tomates infectados con P hytophthora

En este ensayo en invernadero con patógenos de plantas, se analizó el producto de fermentación de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. en comparación con otras tres cepas de Paenibacillus sp. que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores. Para producir una preparación adecuada de los compuestos, se mezcló 1 parte en peso del polvo de caldo completo secado por pulverización de cada cepa cultivada en un medio basado en soja con agua y 0,1 partes en peso de emulsionante (alquilaril poliglicol éter) y posteriormente se diluyó con agua hasta la concentración deseada.

Para probar la actividad preventiva, se pulverizaron plantas jóvenes con la preparación del compuesto al índice de aplicación establecido. Después que se secara el recubrimiento de pulverizado, las plantas se inocularon con una suspensión acuosa de esporas de Phytophthora infestans. Las plantas se colocaron luego en una cabina de incubación a aproximadamente 20 °C y a una humedad atmosférica relativa del 100 %.

La prueba se evaluó 3 días después de la inoculación. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observa enfermedad.

Tabla 2: Prueba preventiva in vivo con Phytophthora (tomates)

Ejemplo 5. Prueba preventiva in vivo en vides infectadas con P lasm opara

En este ensayo en invernadero con patógenos de plantas, se analizó el producto de fermentación de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. en comparación con otras tres cepas de Paenibacillus sp. que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores. Para producir una preparación adecuada de los compuestos, se mezcló 1 parte en peso del polvo de caldo completo secado por pulverización preparado como se describe en el Ejemplo 5 con 0,1 partes en peso de emulsionante (alquilaril poliglicol éter) y posteriormente se diluyó con agua hasta la concentración deseada.

Para probar la actividad preventiva, se pulverizaron plantas jóvenes con la preparación del compuesto al índice de aplicación establecido. Después que se secara el recubrimiento de pulverizado, las plantas se inocularon con una suspensión de esporas acuosa de Plasmopara viticola y luego permanecieron durante 1 día en una cabina de incubación a aproximadamente 20 °C y a una humedad atmosférica relativa del 100 %. Posteriormente las plantas se colocaron durante 4 días en un invernadero a aproximadamente 21 °C y a una humedad atmosférica relativa de aproximadamente el 90 %. Después, las plantas se humedecieron por rociado y se colocaron durante 1 día en una cabina de incubación.

La prueba se evaluó 6 días después de la inoculación. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observa enfermedad.

Tabla 3: Prueba preventiva in vivo con Plasm opara (vides)

Ejemplo 6. Prueba preventiva in vivo en habas infectadas con Urom yces

En este ensayo en invernadero con patógenos de plantas, se analizaron el producto de fermentación de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. en comparación con otras tres cepas de Paenibacillus sp. que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores. Para producir una preparación adecuada de los compuestos, se mezcló 1 parte en peso del polvo de caldo completo secado por pulverización preparado como se describe en el Ejemplo 5 con 0,1 partes en peso de emulsionante (alquilaril poliglicol éter) y posteriormente se diluyó con agua hasta la concentración deseada.

Para probar la actividad preventiva, se pulverizaron plantas jóvenes con la preparación del compuesto al índice de aplicación establecido. Después que se secara el recubrimiento de pulverizado, las plantas se inocularon con una suspensión de esporas acuosa del agente causal de la roya de habas ( Uromyces appendiculatus) y luego permanecieron durante 1 día en una cabina de incubación a aproximadamente 20 °C y a una humedad atmosférica relativa del 100%.

Las plantas se colocaron luego en un invernadero a aproximadamente 21 °C y a una humedad atmosférica relativa de aproximadamente el 90 %.

La prueba se evaluó 10 días después de la inoculación. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observa enfermedad.

Tabla 4: Prueba preventiva in vivo con Urom yces (habas)

Ejemplo 7. Comparación de las cepas de Paenibacillus en un ensayo de campo de calabacines infectados con mildiú pulverulento (Sphaerotheca fuliginea)

Se realizaron dos ensayos de campo con calabacines, inoculados artificialmente con Sphaerotheca fuliginea. Se resuspendieron cinco tratamientos con polvo de caldo completo secado por pulverización de cada cepa de Paenibacillus sp. cultivada en un medio basado en soja en agua a un volumen de aplicación de 1000 l/ha y se aplicaron a las plantas entre el 15 de julio y el 8 de agosto en una fase de crecimiento de BBCH59 a BBCH72 con un intervalo de 4 a 8 días como se indica en la Tabla 6. El porcentaje de control de la enfermedad que se muestra en la Tabla 5 es el resultado de la última evaluación efectuada 10 días después de la aplicación final, efectuada por observación visual de los síntomas de la enfermedad. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observó enfermedad.

Tabla 5

Tabla 6

Los resultados de la Tabla 4 muestran claramente que la actividad observada de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. es superior en comparación con las otras cepas analizadas en este ensayo de campo, que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores.

Ejemplo 8. Comparación de cepas de Paenibacillus en un ensayo de campo de vid infectada con mildiú pulverulento (Uncinula necator)

Se realizaron dos ensayos de campo con vid, infectada naturalmente con Uncinula necator. Se resuspendieron seis tratamientos con los polvos secados por pulverización descritos en el Ejemplo 8 en agua a un volumen de aplicación de 1000 l/ha y se aplicaron a las plantas entre el 3 de junio y el 1 de julio, en una fase de crecimiento de BBCH57 a BBCH75 a intervalos de 5 a 7 días como se indica en la Tabla 8. El porcentaje de control de la enfermedad que se muestra en la Tabla 7 es el resultado de la última evaluación efectuada 15 días después de la aplicación final, efectuada por observación visual de los síntomas de la enfermedad. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observó enfermedad.

Tabla 7

Tabla 8

Los resultados de la Tabla 7 muestran claramente que la actividad observada de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. es superior en comparación con las otras cepas analizadas en este ensayo de campo, que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores.

Ejemplo 9. Comparación de las cepas de Paenibacillus en un ensayo de campo con tomate infectado con el tizón temprano (A lternaría solani)

Se realizaron dos ensayos de campo con plantas de tomate, inoculadas artificialmente con Alternaría solani. Se resuspendieron tres tratamientos con los polvos secados por pulverización descritos en el Ejemplo 8 en agua a un volumen de aplicación de 1000 l/ha y se aplicaron a las plantas entre el 26 de junio y el 10 de julio, en una fase de crecimiento de BBCH51 a BBCH59 a intervalos de 6 a 8 días como se indica en la Tabla 10. El porcentaje de control de la enfermedad que se muestra en la Tabla 9 es el resultado de la última evaluación efectuada 8 días después de la aplicación final, efectuada por observación visual de los síntomas de la enfermedad. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observó enfermedad.

Tabla 9

continuación

Tabla 10

Los resultados de la Tabla 9 muestran claramente que la actividad observada de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. es superior en comparación con las otras cepas analizadas en este ensayo de campo, que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores.

Ejemplo 10. Comparación de las cepas de Paenibacillus en un ensayo de campo con patata infectada con el tizón temprano (A lternaría solani)

Se realizó un ensayo de campo con plantas de patata, inoculadas artificialmente con Alternaría solani. Se resuspendieron cinco tratamientos con los polvos secados por pulverización descritos en el Ejemplo 8 en agua a un volumen de aplicación de 500 l/ha y se aplicaron a las plantas entre el 26 de junio y el 19 de julio, en una fase de crecimiento de BBCH37 a BBCH55 a intervalos de 4 a 8 días como se indica en la Tabla 12. El porcentaje de control de la enfermedad que se muestra en la Tabla 11 es el resultado de la última evaluación efectuada 6 días después de la aplicación final, efectuada por observación visual de los síntomas de la enfermedad. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observó enfermedad.

Tabla 11

Tabla 12

continuación

Los resultados de la Tabla 11 muestran claramente que la actividad observada de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. es superior en comparación con las otras cepas analizadas en este ensayo de campo, que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores.

Ejemplo 11. Comparación de las cepas de Paenibacillus en un ensayo de campo con patata infectada con el tizón temprano (A lternaría solani)

Se realizó un ensayo de campo con plantas de patata, inoculadas artificialmente con Alternaría solani. Se resuspendieron tres tratamientos con los polvos secados por pulverización descritos en el Ejemplo 8 en agua a un volumen de aplicación de 500 l/ha y se aplicaron a las plantas entre el 24 de julio y el 5 de agosto, en una fase de crecimiento de BBCH37 a BBCH51 a intervalos de 6 días como se indica en la Tabla 14. El porcentaje de control de la enfermedad que se muestra en la Tabla 13 es el resultado de la última evaluación efectuada 6 días después de la aplicación final, efectuada por observación visual de los síntomas de la enfermedad. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control no tratado en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observó enfermedad.

Tabla 13

Tabla 14

Los resultados de la Tabla 13 muestran claramente que la actividad observada de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. es superior en comparación con las otras cepas analizadas en este ensayo de campo, que habían demostrado una actividad antifúngica relativamente alta en ensayos de cribado anteriores.

Ejemplo 12. Identificación de la variación fusA en la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.

Para caracterizar adicionalmente la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., se determinó la secuencia genómica del gen fusA que codifica la FusA fusaricidina sintasa con procedimientos de secuenciación convencionales, y se identificó la secuencia aminoácidos relacionada. Se comparó la secuencia de aminoácidos de FusA expresada por la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. con la de varias otras cepas de Paenibacillus incluyendo las que se describen en las siguientes publicaciones:

Li S., y col., (2014). " Complete Genome Sequence of Paenibacillus polymyxa SQR-21, a Plant Growth-Promoting Rhizobacterium with Antifungal Activity and Rhizosphere Colonization Ability ', Genome Announc, 2(2):HASH(0x743db288);

Niu B., y col., (2011). " The Genome of the Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Paenibacillus polymyxa M-1 Contains Nine Sites Dedicated to Nonribosomal Synthesis of Lipopeptides and Polyketides", J. Bacteriol.

193(20):5862-3;

Ma M., y col., (2011) "Complete Genome Sequence of Paenibacillus polymyxa SC2, A Strain of Plant Growth-Promoting Rhizobacterium with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity", J. Bacteriol. 193(1):311-2; y

Li and Jensen, (2008). Nonribosomal Biosynthesis of Fusaricidins by PaenibaciNus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a d-amino Acid. Chem. Biol. 15, 118-127.

El alineamiento que se muestra en la FIG. 13 reveló deleciones significativas en la variante de FusA fusaricidina sintasa expresada por la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Una primera deleción se extiende de la posición 3009 a la posición 3037 de la correspondiente secuencia en la cepa A de Paenibacillus sp. (SEQ ID NO: 11). Una segunda deleción se extiende de la posición 3047 a la posición 3317 de la correspondiente secuencia en la cepa A de Paenibacillus sp. (SEQ ID NO: 11). Ambas deleciones se encuentran dentro del dominio A del tercer módulo de la FusA fusaricidina sintasa (es decir, FusA-A3).

Como se explicó anteriormente, cada uno de los dominios A contiene diez restos de aminoácidos conservados responsables del reconocimiento y la activación del sustrato (véase la Tabla 1). Estos restos de aminoácidos conservados se indican en el alineamiento que se muestra en la FIG. 13. Las deleciones identificadas en la variante de la FusA fusaricidina sintasa expresada por la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. eliminan todos restos de aminoácido conservados salvo el último (es decir, Lys517 ubicado en la posición 3486 de la SEQ ID NO: 11).

Estas dos deleciones en la variante de la FusA fusaricidina sintasa están presentes en las cepas procedentes de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp., incluyendo la cepa variante con una morfología de colonia estable designada en el presente documento como la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. Las cepas mutantes aleatorias procedentes de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. generalmente van a mantener las deleciones en la variante de FusA-A3 ya que es extremadamente improbable una retromutación a la FusA-A3 de tipo silvestre debido a la naturaleza extensa de las deleciones.

Ejemplo 13. Comparación de la producción de fusaricidina en la cepa NRRL B-50972 de P aenibacillus sp. y la cepa A de Paenibacillus sp.

Para determinar el efecto de la variante de FusA-A3, se cuantificó un panel de fusaricidinas y Paeniserinas en la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (que expresa la variante de FusA-A3) y la cepa A de Paenibacillus sp. (que expresa la FusA-A3 de tipo silvestre) utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 14. La identidad de cada compuesto se determinó por su tiempo de retención y masa distintivos. Las intensidades de señal relativas de cada pico en los espectros se presentan en la Tabla 15. No fue posible una cuantificación absoluta en ausencia de patrones purificados. Sin embargo, se inyectaron cantidades similares de cada extracto celular y se pueden estimar las cantidades relativas de los compuestos a partir de las intensidades de señal resultantes.

Tabla 15

En la FusA fusaricidina sintasa de tipo silvestre, FusA-A3 es responsable de la incorporación de L-Tyr, L-Phe, L-Val, L-Ile o L-allo-Ile en el compuesto de fusaricidina en la posición de aminoácido (3) (véase la Tabla 1). La variante de FusA-A3 en la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. dio como resultado un extracto sin nada de fusaricidina C, fusaricidina D, LiF07a o LiF07b detectables. Las fusaricidina C y fusaricidina D tienen una tirosina en la posición de aminoácido (3) en tanto que LiF07a y LiF07b tienen una fenilalanina en la posición de aminoácido (3). Estos datos experimentales demuestran que la variación genética en FusA-A3 expresada por la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. inhibe la biosíntesis de fusaricidinas con una tirosina o una fenilalanina en la posición de aminoácido (3) (véase la FIG. 14).

Por lo tanto, la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y las cepas mutantes procedentes de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. no pueden producir cantidades detectables de fusaricidinas o compuestos de tipo fusaricidina con una tirosina o fenilalanina en la posición de aminoácido (3) (por ejemplo, las fusaricidinas C y D o LiF07a y LiF07b). El análisis de la variante de FusA-A3 en la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. indica que esta cepa y sus mutantes son genéticamente incapaces de producir fusaricidinas o análogos de fusaricidina con anillos peptídicos que comprenden un aminoácido tirosina o un aminoácido fenilalanina en la posición de aminoácido (3).

De las dos Paeniserinas analizadas, solamente una era detectable en la cepa A de Paenibacillus sp., y su intensidad de señal era menos de la mitad de la correspondiente intensidad de señal observada con el extracto de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, parece que uno o más de los primeros nueve aminoácidos conservados en FusA-A3 (es decir, Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Va1330 y Cys331) son responsables del reconocimiento y la activación de la tirosina y la fenilalanina en la posición (3) en los compuestos de fusaricidina. Además, la variante de FusA-A3 expresada por la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. puede desviar los intermediarios metabólicos de la producción de determinadas fusaricidinas hacia la biosíntesis de una gama más amplio de compuestos de tipo fusaricidina (por ejemplo, las Paeniserinas).

Ejemplo 14. Comparación de la bioactividad de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa A de P aenibacillus sp.

Se cultivó la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. (que expresa la variante de FusA-A3) y la cepa A de Paenibacillus sp. (que expresa la FusA-A3 de tipo silvestre) en un medio basado en soja para producir caldos completos. Los caldos completos se diluyeron en una mezcla de agua y un disolvente orgánico hasta concentraciones de un 10%, un 5%, un 2,5% y un 1,25%. Los caldos completos diluidos se aplicaron a plantas jóvenes que posteriormente se expusieron a un inóculo de Puccinia triticina (PUCCRT), Botrytis cinerea (BOTRCI) o Phytophthora infestans (PHYTIN). Varios días después de la exposición al inóculo del patógeno vegetal, cada planta se puntuó por el porcentaje de control del patógeno con respecto a las plantas de control no tratadas. Cada tratamiento se evaluó con tres repeticiones y se informó el porcentaje de control promedio (véanse las Tablas 16-18).

En cada uno de los ensayos, la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. demostró un control superior a la cepa A de Paenibacillus sp. Estos datos experimentales sugieren que la variante de la fusaricidina sintasa y los cambios resultantes en la biosíntesis de las fusaricidinas y de compuestos de tipo fusaricidina dio como resultado un control potenciado de los patógenos vegetales con la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.

Tabla 16. Control de Puccinia triticina (PUCCRT) logrado con la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa A de Paenibacillus sp. a índices de dilución del 10 %, 5 %, 2,5 % y 1,25 %.

Tabla 17. Control de Botrytis cinerea (BOTRCI) logrado con la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa A de Paenibacillus sp. a índices de dilución del 10 %, 5 %, 2,5 % y 1,25 %.

continuación

Tabla 18. Control de Phytophthora infestans (PHYTIN) logrado con la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa A de Paenibacillus sp. a índices de dilución del l0 %, 5 %, 2,5 % y 1,25 %.

Ejemplo 15. Identificación de las fusaricidinas en un extracto celular de P aenibacillus sp.

La cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o las cepas procedentes de la misma se cultivaron en un medio basado en soja hasta que alcanzaron la fase estacionaria, en cuyo momento el cultivo de caldo completo se recogió y se extrajo con un disolvente orgánico para producir un extracto celular.

Se desarrolló un procedimiento cromatográfico utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas con tiempo de vuelo (HPLC/MS TOF) para separar las numerosas moléculas de tipo fusaricidina a partir del extracto celular: columna: YMCTM Basic 4,6 x 250 mm, 5 pm; agua (FA al 0,1 %) y acetonitrilo (ácido fórmico (FA) al 0,1 %); gradiente (% de B): 0-9 min al 28-30 %; 9-14 min al 30-33 %; 14-34 min al 33-50 %; lavado.

En la FIG. 4B se muestra un cromatograma del extracto celular en el cual se identifican las fusaricidinas conocidas. La estructura general de las fusaricidinas se presenta en la FIG. 4A. Cada fusaricidina cíclica tiene un análogo acíclico correspondiente.

Todas las fusaricidinas detectables en el extracto celular se identificaron basándose en sus tiempos de retención y valores m/z (véase la FIG. 4C). Notablemente, las fusaricidinas C y D y otras fusaricidinas en las cuales el aminoácido en la posición (3) es una tirosina o una fenilalanina no fueron detectables en el extracto celular.

Ejemplo 16. Caracterización de las Paeniserinas en un extracto celular de Paenibacillus sp.

Para identificar otros compuestos en el extracto celular de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o de las cepas procedentes de la misma se desarrolló un procedimiento cromatográfico utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas con triple tiempo de vuelo (UPLC/MS Triple TOF) para fragmentar las numerosas moléculas de tipo fusaricidina: columna: ZORBAX™ Eclipse Plus, 2,1 x 100 mm, 1,8 pm; agua (FA al 0,1 %) y acetonitrilo (FA al 0,1 %); gradiente ( % de B): 0-5 min al 10-95 %; lavado.

Con este procedimiento el Solicitante de la Patente caracterizó una nueva familia de Paeniserinas fusaricidinas mediante el examen de los patrones de fragmentación de masas obtenidos con un espectrómetro de masas AB SCIEX TRIPLE TOF® así como por comparación de los espectros con la bibliografía publicada. El Solicitante de la Patente nombró a esta nueva familia Paeniserinas. Los patrones de fragmentación representativos de UPLC/MS Triple TOF y las correspondientes estructuras químicas para la Paeniserina A1 y la Paeniserina B1 se muestran en las FIG. 5 y 6, respectivamente. Se realizó un análisis similar para cada una de las Paeniserinas detectadas en el extracto celular.

Las Paeniserinas se nombraron de esa manera debido a la diferencia importante respecto a la estructura principal de la fusaricidina con una o más sustituciones de serina (véase la FIG. 5A). Históricamente, para que fuera considerada como una fusaricidina la secuencia peptídica contenía tres aminoácidos conservados: (1) treonina, (4) treonina y (6) alanina. Sin embargo, las Paeniserinas presentan nuevas sustituciones, con reemplazo de uno o ambos restos de treonina (1) y (4) por una serina. Ambos aminoácidos en las posiciones (2) y (3) son valina en las Paeniserinas que caracterizó el Solicitante de la Patente. En la FIG. 5B se muestra un cromatograma en el cual se identifican los picos correspondientes a las Paeniserinas.

El Solicitante de la Patente también caracterizó esta familia de compuestos de tipo fusaricidina sustituidos con serina en el extracto celular, basándose en sus tiempos de retención y valores de m/z (véase la FIG. 5C). Aunque la Paeniserina C4 no era detectable resulta razonable esperar que se produzca basándose en las estructuras de las fusaricidinas caracterizadas previamente. Al igual que en el caso de las fusaricidinas, cada Paeniserina cíclica tiene un análogo acíclico correspondiente.

Debe tenerse en cuenta que, aunque las Paeniserinas que caracterizó el Solicitante de la Patente tenían un aminoácido valina en los restos (2) y (3), es probable que existan compuestos con variaciones en esas posiciones. Estas variaciones posibles serían similares a los análogos de fusaricidina/LiF con aminoácidos tales como isoleucina, fenilalanina y tirosina como los restos (2) y (3). Además, aunque previamente se describió la cola de GHPD, es probable que existan compuestos con variaciones en las longitudes de la cola similares a las observadas en la familia de las Paeniprolixinas (véase el Ejemplo 17).

Ejemplo 17. Caracterización de las Paeniprolixinas en un extracto celular de Paenibacillus sp.

Además, se analizó el extracto celular de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y/o las cepas procedentes de la misma con el procedimiento cromatográfico descrito en el Ejemplo 14. Se caracterizó una nueva familia de fusaricidinas mediante el examen de los patrones de fragmentación de masas obtenidos con un espectrómetro de masas AB SCIEX TRIPLE TOF® así como por comparación de los espectros con la bibliografía publicada. El Solicitante de la Patente nombró a esta nueva familia Paeniprolixinas. Los patrones de fragmentación representativos de UPLC/MS Triple TOF y las correspondientes estructuras químicas para la Paeniprolixina C1 y la Paeniprolixina D1 se muestran en las FIG. 8 y 9, respectivamente. Se realizó un análisis similar para cada una de las Paeniprolixinas detectadas en el extracto celular.

Las Paeniprolixinas se nombraron por la palabra en latín prolix (que significa largo) debido a otra diferencia importante respecto a la estructura principal de la fusaricidina en la cola alifática, a saber, las Paeniprolixinas tienen una cola más larga que las fusaricidinas. Históricamente, en las fusaricidinas solo se ha observado la cola de GHPD específica. Se ha demostrado que esto es consistente aún en la publicación más reciente sobre el tema (es decir, Vater y col., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2015, 26, 1130-1141) en la cual los autores reivindican que “Este hallazgo [la cola de GHPD estrictamente conservada] se contrapone a muchos otros lipopéptidos informados en la bibliografía, donde la parte de ácido graso es un diana importante de variación estructural [tal como en] las surfactinas, las iturinas y las fengicinas”. El Solicitante de la Patente identificó una familia de compuestos de tipo fusaricidina de cola más larga (es decir, ácido 17-guanidin-3-hidroxiheptadecanoico o GHPD 2 CH2 y ácido 19-guanidin-3-hidroxinonadecanoico o GHPD 4 CH2) (véase la FIG. 8A) en el extracto celular de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. A diferencia de las Paeniserinas, las Paeniprolixinas conservan los restos de aminoácidos conservados L-treonina en la posición (1) y D-allo-treonina en la posición (4).

Debe tenerse en cuenta que, aunque las Paeniprolixinas que el Solicitante de la Patente caracterizó tenían ya sea un aminoácido valina o un aminoácido isoleucina en los restos (2) y (3), es probable que existan compuestos con variaciones en esas posiciones. Estas posibles variaciones serían similares a los análogos de fusaricidina/LiF tales como otras combinaciones de valina, isoleucina o u otros aminoácidos, tales como fenilalanina y tirosina como los restos (2) y (3). Además, es posible que existan combinaciones híbridas con las Paeniserinas descritas anteriormente que tienen longitudes de cola más extensas.

En la FIG. 8B se muestra un cromatograma en el cual se identifican los picos correspondientes a las Paeniprolixinas. Esta familia de compuestos de tipo fusaricidina con colas de GHPD más largas también se caracterizó basándose en sus tiempos de retención y valores de m/z (véase la FIG.8C). Aunque las Paeniprolixinas C2 y D2 no eran detectables resulta razonable esperar que se produzcan basándose en las estructuras de las fusaricidinas caracterizadas previamente. Al igual que en el caso de las fusaricidinas, cada Paeniprolixina cíclica tiene un análogo acíclico correspondiente.

Ejemplo 18. Perfiles de bioactividad antifúngica de las Paeniserinas, Paeniprolixinas y otras fusaricidinas

Las muestras mostradas en la Tabla 19 se aislaron de células de Paenibacillus sp. El caldo de fermentación completo se centrifugó a fin de eliminar el sobrenadante. El sedimento obtenido se extrajo luego en metanol. El extracto resultante se fraccionó utilizando cromatografía líquida de media presión en fase inversa. Las fracciones se purificaron adicionalmente utilizando cromatografía líquida de alta presión preparatoria en fase inversa.

Tabla 19

El ensayo antifúngico in vitro en placa de 96 pocilios utiliza el reactivo de viabilidad celular basado en resazurina PRESTOBLUE® como un indicador del crecimiento fúngico. Comenzando a partir de esporas fúngicas, el ensayo mide la potencia de una muestra para inhibir la germinación de esporas fúngicas y/o el crecimiento de células fúngicas. El ensayo se preparó con tres enfermedades fúngicas importantes para la agricultura: Alternaria solani (ALTESO), Colletotrichum lagenarium (COLLLA) y Botrytis cinerea (BOTRCI).

Todas las muestras indicadas en la Tabla 19 resultaron ser activas contra las enfermedades fúngicas importantes para la agricultura (véase la concentración inhibidora mínima para un 80 % (CIM80) proporcionados en unidades de partes por millón (ppm) para cada muestra de la Tabla 20). Notablemente, determinados compuestos parecen tener una actividad variable contra enfermedades específicas. Por ejemplo, en tanto que los análogos con asparagina de la Muestra 3 parecen ser importantes en el control de ALTESO, las equivalentes con glutamina del mismo tipo de compuesto de la Muestra 4 estaban más implicadas en el control de COLLLA. Los análogos de cola más larga de la Muestra 6 eran los inhibidores más potentes de COLLLA. Esto sugiere que, si bien todas son activas por sí mismas, es importante una combinación de estas químicas para la potencia final y el espectro de control de enfermedades del producto final.

Tabla 20

Ejemplo 19. Perfiles de bioactividad antibacteriana de las Paeniserinas, Paeniprolixinas y otras fusaricidinas

El ensayo antibacteriano in vitro en placa de 96 pocillos emplea absorbancia como un indicador del crecimiento bacteriano. El ensayo mide la potencia de una muestra para inhibir el crecimiento bacteriano por comparación de la absorbancia de los pocillos no tratados con la absorbancia de los pocillos de las muestras. La última dilución/concentración que inhibe el crecimiento de las bacterias se denomina CIM (concentración inhibidora mínima) y este valor se puede utilizar para comparar la eficacia de las diferentes muestras. El ensayo se evaluó con tres enfermedades bacterianas importantes para la agricultura: Xanthomonas campestris (XANTAV), Pseudomonas syringae (PSDMTM) y Erwinia carotovora (ERWICA).

Las muestras indicadas en la Tabla 19 se aplicaron en los ensayos antibacterianos para determinar los valores de CIM80 con cada patógeno bacteriano. Los resultados de los ensayos se presentan en la Tabla 21. Las muestras 1-5 han resultado ser activas contra las enfermedades bacterianas importantes para la agricultura. Notablemente, determinados compuestos parecen presentar una actividad variable contra enfermedades específicas. Por ejemplo, las Paeniserinas se complementan bien con la Fusaricidina A en el aspecto de que pueden controlar PSDMTM, una debilidad de la Fusaricidina A. Por otro lado, la Fusaricidina A compensa la debilidad en el control de ERWICA observado con las Paeniserinas. Al igual que en el caso de los ensayos fúngicos, esto sugiere que, si bien todas son activas por sí mismas, es importante una combinación de estas químicas para la potencia final y el espectro de control de enfermedades del producto final.

Tabla 21

continuación

Ejemplo 20. Indicación de sinergia con un ensayo de difusión de discos de antibióticos de Kirby-Bauer A fin de lograr una evaluación inicial de sinergia entre las diversas clases de compuestos de tipo fusaricidina, se realizó un bioensayo utilizando el patógeno vegetal COLLLA. El bioensayo era el ensayo clásico de difusión de discos de antibióticos de Kirby-Bauer sobre agar (Bauer, A. W., y col., 1966, Am. J. Clin. Pathol., 36: 493-496). Brevemente, se colocaron discos estériles de blanco cargados con cantidades similares de las diversas muestras sobre una cápsula de Petri inoculada con un césped de esporas de COLLLA. La cápsula de Petri se incubó y se registró la actividad como el tamaño del diámetro de la zona de inhibición presente alrededor de cada disco. Los resultados se ilustran en la FIG. 11.

Los resultados de este ensayo preliminar sugieren un efecto sinérgico cuando se aplican juntas determinadas Paeniserinas y Paeniprolixinas. En este ensayo, cuando las Paeniserinas A1 y B1 (“868”) o las Paeniprolixinas A2 y B2 (“938”) se aplican por separado muestran zonas de inhibición relativamente pequeñas. Sin embargo, su combinación (“868/938”) presenta la zona de inhibición más grande y nítida, excediendo los resultados obtenidos con la aplicación de 868, 938 o las fusaricidinas A y B (“AB”). Se aplicaron aproximadamente 0,1 mg de material total a cada disco estéril para las muestras AB, 868 y 938. El disco que contenía ambas muestras 868 y 938 contenía aproximadamente 0,05 mg de cada muestra, de modo que la cantidad total de material sobre el disco de 868/938 era de aproximadamente 0,1 mg.

Una limitación de este ensayo es el requisito de que los compuestos de fusaricidina deben difundir a través del agar para inhibir el crecimiento fúngico. Esta indicación inicial de un efecto sinérgico se evaluará adicionalmente utilizando ensayos antifúngicos in vitro en un medio líquido.

Ejemplo 21. Ensayos antifúngicos in v itro para demostrar la sinergia de las combinaciones de fusaricidinas Además de las combinaciones de fusaricidinas indicadas en el Ejemplo 17, se realizarán ensayos antifúngicos in vitro en un medio líquido para demostrar la sinergia propuesta resultante de la aplicación de las combinaciones de fusaricidinas y/o de compuestos de tipo fusaricidina que se muestran en la FIG. 12. Cada uno de los grupos que se muestran en la FIG. 12 se evaluará individualmente para evaluar primero las características estructurales y luego en combinaciones para abordar la sinergia. Se evaluarán mezclas tanto binarias como ternarias.

Aunque los compuestos individuales pueden presentar debilidad con respecto a la actividad fungicida, las combinaciones tendrán una actividad que excede la simple adición de las actividades.

Siempre está presente un efecto sinérgico de los fungicidas cuando la actividad fungicida de las combinaciones de compuestos activos excede el total de las actividades de los compuestos activos cuando se aplican individualmente. La actividad esperada para una combinación dada de dos o tres compuestos activos se puede calcular de la siguiente manera (véase, Colby, S.R., " Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations", Weeds, 1967, 15, 20-22):

Si:

X es la eficacia cuando el compuesto activo A se aplica a un índice de aplicación de m ppm (o g/ha),

Y es la eficacia cuando el compuesto activo B se aplica a un índice de aplicación de n ppm (o g/ha),

Z es la eficacia cuando el compuesto activo B se aplica a un índice de aplicación de r ppm (o g/ha),

Ei es la eficacia cuando los compuestos activos A y B se aplican a índice de aplicación de m y n ppm (o g/ha), respectivamente,

E2 es la eficacia cuando los compuestos activos A, B y C se aplican a índice de aplicación de m, n y r ppm (o g/ha), respectivamente,

Entonces, para una mezcla binaria:

X ■ Y

EÍ = X Y

100

y para una mezcla ternaria:

X- Y - Z

10000

Se indica el grado de eficacia, expresado en %. 0 % significa una eficacia que corresponde a la del control en tanto que una eficacia del 100 % significa que no se observa enfermedad.

Si la actividad fungicida real excede el valor calculado, entonces la actividad de la combinación es superaditiva, es decir existe un efecto sinérgico. En este caso, la eficacia observada realmente debe ser mayor que el valor de la eficacia esperada (E) calculada con la fórmula mencionada anteriormente.

Una manera adicional de demostrar un efecto sinérgico es el procedimiento de Tammes (véase, “ Isoboles, A Graphic Representaron o f Synergism in Pesticides” en Neth. J. Plant Path., 1964, 70, 73-80).

Ejemplo 22. Selección de una cepa variante de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.

La cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. produce múltiples morfologías de colonia sobre un medio de agar sólido en condiciones de laboratorio convencionales. Se identificaron varias colonias morfológicamente distintas y se almacenaron como soluciones madre de glicerol a -80 °C. Los cultivos en medio líquido se inocularon utilizando soluciones madre obtenidas de los diferentes fenotipos de colonias, y después de varias rondas de crecimiento en medio líquido, se volvieron a inocular sobre medio de agar sólido. A partir de eso, se identificó un aislado con un fenotipo de colonia estable en las condiciones analizadas, en tanto que aún tenían la capacidad para producir esporas resistentes al calor y una química de fusaricidinas. Resulta conveniente un aislado con una morfología de colonia estable para poder lograr mejoras adicionales de la cepa (véase el Ejemplo 23). Este aislado se depositó en la NRRL el 1 de septiembre de 2015, y se le asignó el siguiente número de referencia: NRRL B-67129.

Ejemplo 23. Mutagénesis aleatoria para generar mutantes de Paenibacillus sp. mejorados

Mutagénesis química

A fin de crear un conjunto de aislados genéticamente diversos de la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp., se sedimentó mediante centrifugación un cultivo de la cepa cultivado en medio líquido, y se resuspendió en un tampón que contenía 1-metil-3-nitro-1-nitroguanidina (NTG) a una concentración final de 400 ^g/ml. Como referencia, se preparó una segunda muestra sin NTG. Las muestras se incubaron durante 1 hora a 30 °C y 220 rpm. Después de 1 hora, las muestras se sedimentaron mediante centrifugación, se lavaron con un tampón que no contenía NTG y finalmente se resuspendieron en el mismo volumen de tampón fresco. Se congelaron alícuotas del cultivo no diluido como soluciones madre de glicerol a -80 °C. Las muestras se diluyeron y se sembraron en placas de agar para determinar las unidades formadoras de colonias, y se determinó el porcentaje de destrucción como una referencia para el grado de mutaciones por genoma. Los aislados mejorados seleccionados en una primera ronda de cribado se sometieron a una o más rondas posteriores de tratamiento con NTG como se describió previamente y se cribaron en cuanto mejoras adicionales en la producción de fusaricidina. La producción de fusaricidina se determinó por las cantidades relativas de varios compuestos incluyendo la fusaricidina A (también conocida como LiF04a o “Fus A”); LiF08a; las Paeniserinas A1 y B1 (también conocidas como “M868” o “868”) y las Paeniprolixinas A2 y B2 (también conocidas como “M938” o “938”).

Cribado de alto rendimiento y caracterización del aislado

Las muestras tratadas con NTG se diluyeron y se sembraron en placas de agar para obtener colonias individuales. Las colonias individuales se inocularon en bloques de 96 pocillos profundos que contenían medio de siembra, los cuales se incubaron con agitación durante 2 días a 30 °C. Después de eso, se inocularon nuevos bloques de 96 pocillos profundos que contenían un medio de producción basado en soja y se incubaron con agitación durante 5 días a 30 °C. Después de 5 días, se prepararon soluciones madre de glicerol a partir de cada muestra de un pocillo individual y se almacenaron a -80 °C, y una muestra se sometió a análisis químico para los cuatro biomarcadores de fusaricidina identificados anteriormente. En este cribado primario, los aislados individuales eran considerados como aciertos si su “valor de fusaricidina total” (es decir, la suma de los cuatro biomarcadores de fusaricidina analizados con respecto a la media de los valores de tipo silvestre) era más alto que la media de los valores de tipo silvestre más 3x la desviación típica de los valores de tipo silvestre. Se cultivaron 8 repeticiones de cada aislado seleccionado basándose en este criterio y se analizaron como se describió anteriormente. Después, se aumentó la escala de los sobreproductores de fusaricidina confirmados a volúmenes de 50 ml en frascos de agitación de 250 ml y se caracterizaron en cuanto a la esporulación, la producción de fusaricidina y la bioactividad. Se aumentó aún más la escala de los aislados a los que se dio prioridad en biorreactores y nuevamente se caracterizaron en cuanto a esporulación, viscosidad, producción de fusaricidina y bioactividad. Se obtuvieron varias cepas mutantes a partir de la segunda ronda del tratamiento con NTG y cribado, y se encontró que tenían una producción de biomarcadores y bioactividad de fusaricidina superiores.

Ejemplo 24. Caracterización de la sensibilidad a antibióticos de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.

La cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. se inoculó sobre medio de agar sLB sólido y medio de agar sLB complementado con antibióticos a las concentraciones típicas. Las placas de agar se incubaron a 30 °C, y se evaluó el crecimiento después de 24, 48 y 72 horas. En la Tabla 22 se muestra la sensibilidad de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. a cada uno de los antibióticos analizados.

Tabla 22: Sensibilidad a antibióticos de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp.

Ejemplo 25. Caracterización de spoOA en la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp.

Se secuenciaron los genomas de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. La comparación de las dos secuencias genómicas permitió identificar una diferencia característica en el gen spoOA en las dos cepas. Como se muestra en el alineamiento de secuencias en la FIG. 15, la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. difieren en un nucleótido hacia el extreme 3' del gen spoOA. Se identificó una diferencia de un solo nucleótido y está indicada con una flecha roja debajo de la secuencia de la FIG. 15. Los números de nucleótido con respecto al primer nucleótido del gen spoOA están indicados arriba de las secuencias.

Un alineamiento de ortólogos de SpoOA de bacterias formadoras de endosporas indica que el cambio de nucleótidos en la secuencia codificante de la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. da como resultado una sola sustitución de aminoácido en una región conservada (Véase la FIG. 16). Se alinearon las secuencias de aminoácidos de SpoOA de Paenibacillus terrae (NCBI, secuencia de referencia: w P_044647644.1), Paenibacillus polimyxa SQR-21 (GenBank: AHM66630.1), Bacillus subtilis subsp. subtilis, cepa 168 (NCBI, secuencia de referencia: NP_390302.1), Bacillus cereus E33L (GenBank: AJI26924.1) y Clostridium pasteurianum DSM 525 (GenBank: AAA18883.1) con las secuencias de aminoácidos de SpoOA de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp. Una flecha en la FIG. 16 indica una sustitución de un solo aminoácido en SpoOA de la cepa NRRL B-67129 de Paenibacillus sp.

Ejemplo 26. Estudios de la relación estructura-actividad con fusaricidinas, Paeniserinas y Paeniprolixinas

Se investigó la relación de estructura-actividad de varias fusaricidinas, Paeniserinas y Paeniprolixinas purificadas utilizando el ensayo in vitro que se describe en el Ejemplo 16. En un primer experimento, se compararon las parejas de fusaricidinas más comunes. En estas fusaricidinas se produce una variación en la posición de aminoácido (5) del anillo/cadena, ya sea por asparagina o glutamina. En este estudio, se comparó la fusaricidina A con la fusaricidina B, y se comparó LiF08a con LiF08b contra el patógeno vegetal Alternaría solani (ALTESO). En ambos casos, el análogo con asparagina era más de dos veces más potente que su equivalente con glutamina (véase la FIG. 17).

En otro experimento, se compararon las formas cíclicas frente a las formas acíclicas de las fusaricidinas. No queda claro si las formas acíclicas de las fusaricidinas son productos precursores o de degradación del compuesto final; sin embargo, son ubicuos en el caldo de fermentación de la cepa NRRL B-50972 de Paenibacillus sp. y un contaminante común de las fusaricidinas purificadas a partir de este caldo de fermentación. Se comparó la actividad antifúngica de la fusaricidina A con una mezcla de LiF04c y LiF04d (análogos acíclicos de las fusaricidinas A y B) en el ensayo in vitro con el patógeno vegetal ALTESO. Hay un impacto significativo de la apertura del anillo peptídico en el enlace éster. Los análogos acíclicos eran inactivos a las concentraciones más altas evaluadas (véase la FIG. 17). Esto es importante en cuanto a la información estructural y para demostrar que estos compuestos que normalmente conforman las impurezas de las fusaricidinas por lo demás purificadas probablemente no contribuyan en la actividad antifúngica.

Además, se investigaron las sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácido (2) y (3) del anillo/cadena. Los análogos fusaricidina A, LiF05a, LiF06a y LiF08a difieren en esas posiciones por combinaciones ya sean de valina o de isoleucina. Se analizaron en el ensayo in vitro con el patógeno vegetal ALTESO. Los dos análogos más potentes eran la fusaricidina A (valina/valina) y LiF08a (isoleucina/isoleucina). Los otros dos análogos, que comprenden una mezcla de valina/isoleucina, eran más de tres veces menos potentes (véase la FIG. 17).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto aislado que tiene la estructura I:

en el que

R1 y R2 son cada uno de manera independiente -CH(CH3)2 o -CH(CH3)CH2CH3;

R3 es -CH2C(O)NH2 o -(CH2)2C(O)NH2; y

n es un número entero entre 14 y 20;

incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereómeros y mezclas de los mismos.

2. El compuesto aislado de la reivindicación 1, en el que n es 14 o 16.

3. El compuesto aislado de la reivindicación 2, en el que el compuesto es

4. Una composición que comprende el compuesto aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo agrícolamente aceptable.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además un compuesto aislado que tiene la estructura (II):

en la que

R1 es -CH2OH o -CH(OH)CH3;

R2 es -CH2C(O)NH2 o -(CH2)2C(O)NH2; y

R3 es H o CH3;

con la condición de que si R1 es -CH2OH y R2 es -CH2C(O)NH2 entonces R3 es H; incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereómeros y mezclas de los mismos.

6. La composición de la reivindicación 5, en la que el compuesto que tiene la estructura (II) es

7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que el compuesto está en una solución a una concentración de al menos 0,001 mg/ml.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende:

a) al menos una fusaricidina; y

b) al menos una Paeniserina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y opcionalmente al menos una Paeniprolixina de acuerdo con la reivindicación 5 o 6

en una cantidad sinérgicamente eficaz.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que la fusaricidina es Fusaricidina A.

10. La composición de la reivindicación 8 o 9, en la que la Paeniserina es Paeniserina A1.

11. La composición de la reivindicación 8 o 9, en la que la Paeniprolixina es Paeniprolixina C1.

12. Un procedimiento de tratamiento de una planta para controlar una enfermedad, en el que el procedimiento comprende aplicar una cantidad eficaz de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11o un compuesto aislado de acuerdo con una cualquier de las reivindicaciones 1 a 3 a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar donde se encuentra la planta.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la enfermedad de la planta está provocada por un hongo o por una bacteria.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la enfermedad de la planta es mildiú o una enfermedad de la roya.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el mildiú es mildiú pulverulento o mildiú velloso o en el que la enfermedad de la roya se selecciona del grupo que consiste en roya de la hoja de trigo, roya de la hoja de cebada, roya de la hoja de centeno, roya de la hoja marrón, roya coronada y roya de los tallos.

16. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el hongo se selecciona del grupo que consiste en Alternaría alternata, Alternaría solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus y Puccinia triticina o en el que las bacterias se seleccionan del grupo que consiste en Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae y Erwinia carotovora .

17. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11 o un compuesto aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el control de un organismo fitopatógeno en plantas de cultivo.