CN107012106B - 对百合镰刀菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其应用 - Google Patents

对百合镰刀菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株植对百合镰刀菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其应用。该邻苯二甲酸降解菌为台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3CGMCC NO.13340。该植物病原真菌拮抗菌台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3可以防治尖孢镰刀菌引起的百合根腐病，并且能够以百合连作过程中产生的有害物质邻苯二甲酸作为唯一碳源。

Description

对百合镰刀菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种对百合镰刀菌根腐病病原菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其应用，特别涉及一株对百合镰刀菌根腐病病原菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其在防治百合镰刀菌根腐病中的应用。
背景技术
1904年德国微生物学家Lorenz Hiltner提出了根际概念,他将根际定义为根系周围、受根系生长影响的土体。大多数根际微生物对植物无害，或对植物生长有促进作用。它们在根际的生命活动中，由呼吸作用放出二氧化碳或代谢产酸有助于难溶矿物质的溶解，增加植物对磷及其他矿质元素的吸收。它们分泌的生长激素类物质(如吲哚乙酸，赤霉素等)还能促进植物生长。另外，许多根际微生物及其代谢产物能够抑制植物病原菌的生长发育，因此从根际土壤中筛选植物病原菌的拮抗菌，用于植物病害的生物防治既可以减少化学农药带来的环境污染，又解决了抗病品种筛选周期长、抗病单一的缺点，已经成为国内外学者研究的热点。
具有生防作用的土壤微生物在植物病害防治中具有很强的应用潜力，特别是对于植物根部病害的防治是当前研究的一个热点。具有生防作用的微生物种类繁多，包括真菌、细菌、放线菌等。其中由于生防细菌具有繁殖快、种类多、易于人工培养等优点，目前已经在生产上广泛应用。生防细菌防治植物病害所涉及的因素很多，其作用方式也各有不同，目前研究的比较清楚的防病机制主要有拮抗、竞争、寄生及诱导植物获得系统抗病性等。其中的拮抗作用使指细菌通过同化作用产生抗菌物质来抑制有害病原物的生长和发展，或者直接杀灭病原物。由于生防细菌拮抗病原菌的能力易通过实验进行测定，所以拮抗目标病原菌的能力已成为生防菌筛选的首要评价指标。
大量的研究表明植物根部分泌的物质不仅能够直接抑制植物自身的生长，产生自毒作用，而且能够间接地刺激土传病原菌，导致病害发生加重。邻苯二甲酸是甜瓜、豇豆、甜椒等多种植物的主要自毒物质之一，它在抑制植物自身生长的同时还能够促进病原尖孢镰刀菌对植物的致病作用。邻苯二甲酸也是百合根部分泌的主要的自毒物质，在多年连续种植百合的土壤中大量积累，并能够促进百合尖孢镰刀菌毒素的产生以及致病性相关酶的活性。因此减少连作百合田地里邻苯二甲酸的含量，对于百合尖孢镰刀菌枯萎病的防治具有重要意义。
尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)是引起百合根腐病的主要病原菌。由于百合的连年种植及种植面积的不断扩大，病害发生日益严重，已成为危害百合的重要病害之一，该病主要危害植株的地下部分，导致百合萎蔫、黄化、种球和鳞茎腐烂，严重影响百合的产量和品质，造成巨大的经济损失。百合枯萎病是土传病害，镰刀菌可以以菌丝体在种球内或以菌丝体、厚垣孢子或菌核随病残体长期存活于土壤中。目前化学防治方法是防治百合枯萎病的主要措施，但是由于该病的土传特性及病原菌抗药性的产生，使化学防治方法收效甚微。同时化学农药的长期、大量和反复使用，带来环境污染。因此，应用绿色无污染的生物防治来防治百合镰刀菌枯萎病是未来发展的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一株对百合镰刀菌根腐菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其在防治百合根腐病中的应用。
本发明所提供的百合镰刀菌根腐病拮抗菌为台中类芽胞杆菌(Paenibacillustaichungensis)CGMCC No.13340。
所述台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3，已于2016年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为NO.13340。所述台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3分离自连作3年的百合的根际土壤，为革兰氏阳性菌。菌体在LB培养基上能形成微黄色的菌落，菌落圆形边缘规则，光滑扁平不透明，表面湿润，能够在以邻苯二甲酸为唯一碳源的MSM培养基上生长。
以上述台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3为活性成分的生物菌剂或微生物菌肥也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明中对百合镰刀菌根腐病病原菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌为台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3，对引起百合根腐病的镰刀菌具有较好的抑制作用，可以对该病害起到较好的防治作用。所述百合的品种为东方百合西伯利亚(Lilium‘Oriental Hybrids’cv.Siberia)，所述引起百合根腐病的镰刀菌为尖孢镰刀菌，即为尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)。
台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3对邻苯二甲酸具有很好的降解作用。
本发明的对百合镰刀菌根腐病菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌为台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3，分离自连作3年的百合的根际土壤，是一株百合根际细菌。平板对峙实验表明该菌株对引起百合根腐病的尖孢镰刀菌有较好的拮抗作用。离体鳞片防效试验表明该菌株对百合镰刀菌根腐病的防效可达80％。盆栽试验表明该菌株对百合镰刀菌根腐病的防效可达65.2％。该菌株的获得有望为百合镰刀菌根腐病的防治提供一条环保、简单、有效的途径。本发明的台中类芽胞杆菌(Paenibacillustaichungensis)H3Y3是一株具有良好生防应用前景的菌株。
附图说明
图1为台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3和百合根腐病病原菌的对峙培养试验结果；图中，A为无抑制效果的对照菌，B为H3Y3对病原菌(Fusariumoxysporum)的拮抗效果。
图2为台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3在百合离体鳞片上对尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)的防治试验结果；图中A为清水对照，B为尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)接种处理，C为预先接种H3Y3后3天接种尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)。
图3为台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3菌液对百合镰刀菌根腐病的防治试验；图中，A为清水对照处理，B为病原菌尖孢镰刀菌百合专化型(Fusariumoxysporum f.sp.lilii)对照处理，C为预先接种H3Y3 3天后接种尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)处理。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例中的百合品种东方百合西伯利亚(Lilium‘Oriental Hybrids’cv.Siberia)种球可从北京农学院园林学院购买。
实施例1、拮抗百合根腐病菌的邻苯二甲酸降解菌的筛选
本菌株是从北京农学院东大地温室连续种植3年百合的根际土壤中分离到的，具体方法为：称取根际土壤5g，放入装有100mL MSM液体培养基(每L含磷酸氢二钾5.8g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸铵2.0g，氯化镁0.16g，氯化钙0.02g，氯化钠0.2g,二水合氯化锰0.0015g，氯化铁0.0018g，蒸馏水1000mL，pH7.0)的300mL三角瓶(加入邻苯二甲酸0.02mg)，30℃，避光，170rpm，震荡培养7天；取上述土壤悬浮液2mL富集培养物转入装有100mL液体MSM培养基的300mL三角瓶(加入邻苯二甲酸0.03mg)继续培养7天，培养条件同上；取上述富集培养物2mL转入装有100mL MSM液体培养基的300mL三角瓶(加入邻苯二甲酸0.04mg)继续培养7天，培养条件同上；取上述富集培养物2mL转入装有100mL MSM液体培养基的300mL三角瓶(加入邻苯二甲酸0.05mg)继续培养7天，培养条件同上。取最后一次培养悬浮液2mL,1mL,0.5mL,和0.1mL均匀涂布于MSM平板(每L含磷酸氢二钾5.8g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸铵2.0g，氯化镁0.16g，氯化钙0.02g，氯化钠0.2g,二水合氯化锰0.0015g，氯化铁0.0018g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0；加入邻苯二甲酸0.5mg)。涂好的MSM平板于30℃，置培养，连续观察7d，随机挑取单个菌落100个，再次划线纯化保存备用。在倒好的MSM平板中央接种新鲜的百合根腐病病原菌(该病原菌分离自百合根腐病发病病植株，保存于北京农学院园林学院)菌饼，在距离菌饼3cm处用灭菌牙签接种分离纯化后的菌株，进行拮抗菌株筛选。通过多年的筛选，共筛选出37株对百合根腐病病原菌具有拮抗作用的菌株。其中效果最好的一株命名为H3Y3,与其他的菌株有显著差异，该菌株对百合根腐病病原菌拮抗作用如图1所示。
实施例2、H3Y3菌株种属鉴定
采用常规生理生化及16S rDNA序列分析对H3Y3菌株进行鉴定，确认该菌株属于台中类芽胞杆菌。该菌株的生理生化及基本生物学特性见表3。
表3.H3Y3的基本生物学特征
注：“+”表示能够利用碳源(或氮源)，“－”表示不能利用碳源(或氮源)
以H3Y3的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物作为引物(27F：5’-AGAGTITGATCCTG GCTCAG-3’；反向引物为1492R：5’-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR扩增出约为1.5kb左右的产物片段，用27F引物测序得到1424个核苷酸(序列表中序列1)。将该序列与台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)进行blast比对，结果表明H3Y3的16SrDNA序列与Paenibacillus taichungensis(登陆号：HQ224631)同源性最高，达99％。
依据《常见细菌鉴定手册》，H3Y3菌株以上生理生化特征均与类芽胞杆菌属相同，结合上述分子鉴定，将其鉴定为台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)。将H3Y3命名为台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3。该台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3菌株，已于2016年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.13340。
实施例3、台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3CGMCC NO.13340对百合镰刀菌根腐病的防治效果评价
1.离体鳞片法测定
将台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3CGMCC NO.13340接种到LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，于30℃、170rpm震荡培养过夜，然后4000rpm离心10min去除上清液，以无菌水重悬沉淀菌体并调节至浓度为OD600＝0.5。从供试百合(东方百合西伯利亚(Lilium‘Oriental Hybrids’cv.Siberia))鳞茎上剥下健康的鳞片用75％酒精消毒10min，无菌水冲洗3次。用制备好的H3Y3菌悬液浸泡无菌百合鳞片1小时后，置于铺有灭菌纱布的培养皿中，每培养皿加入10mL无菌水保湿。22℃培养2天后接种0.5mL 106cfu/mL的病原菌(尖孢镰刀菌百合专化型(Fusariumoxysporum f.sp.lilii))孢子悬浮液。每处理3片鳞片，3次重复。无菌水作对照。培养10天后观察发病情况。按照下面的分级标准计算不同处理的病情指数和防效。
发病率(％)＝出现病斑鳞片数/供试鳞片数株×100
病情指数(％)＝[∑(各级发病鳞片数×该病级)]/(调查总鳞片数×最高病级)×100
防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
表1.离体鳞片病情分级(病级)标准
病级 分级标准
0级 鳞片无病斑
1级 鳞片病斑面积在20％以下
2级 鳞片病斑面积在20％-40％之间
3级 鳞片病斑面积在40％-60％之间
4级 鳞片病斑面积在60％-80％之间
5级 鳞片病斑面积在80％至全部腐烂
注：病情级数按发病症状和程度不同分为0级、1级、2级、3级、4级和5级。
人工接种10天后，统计试验结果(图2)，结果见表2，实验结果表明预先接种H3Y3后能够有效的抑制百合根腐病病原菌的生长,防效可达80％。
表2、离体鳞片法测定H3Y3对百合镰刀菌根腐病的防治效果
2.盆栽实验
将台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3分离株接种到LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，于30℃、170rpm震荡培养过夜，然后4000rpm离心去除上清液，以无菌水重悬沉淀菌体调节至浓度为OD600＝0.5。用制备好的台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3菌悬液浸泡百合种球，70rpm摇床震荡培养2小时，以无菌水作对照。将接种后的种球种植在盛有连续4年种植百合带有病原菌(尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii))的土壤的营养钵中。光照培养箱25℃/20℃(光照/黑暗16/8h)培养2天后，每营养钵接种20mL 106cfu/mL的病原菌(尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii))孢子悬浮液。每处理3盆，3次重复。继续在光照培养箱培养，40天后观察记录发病情况。
发病率(％)＝出现病斑种球数/供试种球数×100
病情指数(％)＝[∑(各级发病种球数×该病级)]/(调查总种球数×最高病级)×100
防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
表3.盆栽试验病情分级(病级)标准
病级 分级标准
0级 种球表面无病斑
1级 种球表面病斑面积在20％以下
2级 种球表面病斑面积在20％-40％之间
3级 种球表面病斑面积在40％-60％之间
4级 种球表面病斑面积在60％-80％之间
5级 种球表面病斑面积在80％至全部腐烂
注：病情级数按发病症状和程度不同分为0级、1级、2级、3级、4级和5级。
人工接种40d后，统计试验结果(图3)，结果见表4。清水对照组的百合种球均有病斑出现，病情指数达到31.1％。H3Y3菌悬液预先处理之后接种病原菌病情指数仅为17.8％，防效达到65.2％。试验结果表明预先接种H3Y3能够有效的预防百合镰刀菌根腐病的发生，是一种比较好的防治百合镰刀菌根腐病的方法。
表4、H3Y3对百合镰刀菌根腐病的温室防治效果
实施例4、台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3降解邻苯二甲酸能力测定
将台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3分离株接种到LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，于30℃、170rpm震荡培养过夜，然后4000rpm离心去除上清液，以无菌水重悬沉淀菌体调节至浓度为OD600＝0.5。称取500g连作百合的土壤，置于营养钵中，每营养钵接种OD600＝0.5的H3Y3菌悬液50mL，搅拌均匀后于光照培养箱25℃/20℃(光照/黑暗16/8h)，放置60天后测定邻苯二甲酸含量。每处理3盆，无菌水做对照。土壤样品处理放置于通风干燥处晾晒后进行研磨，过60目筛。称取1kg土壤样品置于圆底烧瓶中，加入5L去离子水浸泡24h后用滤纸过滤。滤液采用高效液相色谱仪进行分析，色谱柱：XDB-C18柱(4.6mm×250mm),柱温室温。乙酸/甲醇(99/1,V/V)作为分离相，流速为0.5mL/min，外标法计算邻苯二甲酸含量。
H3Y3处理60天后土壤中邻苯二甲酸的含量检测结果见表5。清水对照组的邻苯二甲酸含量为每克土壤干重18.3μg，H3Y3处理组邻苯二甲酸含量为12.4μg，降解率为32.2％。
表5、H3Y3对土壤中邻苯二甲酸的降解效果
处理 每克土壤邻苯二甲酸含量(μg) 降解率(％)
清水对照 18.3 /
H3Y3 12.4 32.2％
由上述实验表明，本发明的台中类芽胞杆菌(Paenibacilus taichungensis)H3Y3菌株对土壤中的邻苯二甲酸残留具有很好的降解作用。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 北京农学院
<120> 对百合镰刀菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其应用
<130> WHOI170004
<160> 1
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213>台中类芽胞杆菌（Paenibacillus taichungensis）
<400> 1
aagtcgagcg gacttgaaga gaagcttgct tctctgatgg ttagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtagg caacctgccc tcaagtttgg gacaactacc ggaaacggta gctaataccg 120
aatagttgtt ttcttctcct gaagaaaact ggaaagacgg agcaatctgt cacttgggga 180
tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaat gccgcgtgag 360
tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgccaggga agaacgcttg ggagagtaac 420
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tcatttaagt ctggtgttta atcccggggc tcaaccccgg atcgcactgg aaactgggtg 600
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cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctag 780
gtgttagggg tttcgatacc cttggtgccg aagttaacac attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcagtggagt 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc cctctgatcg 960
gtacagagat gtatctttcc ttcgggacag aggagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcatttcg gatgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtactaca atggccggta 1200
caacgggctg tgaagccgcg aggtggaacg aatcctaaaa agccggtctc agttcggatt 1260
gcaggctgca actcgcctgc atgaagtcgg aattgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttataaca 1380
cccgaagtcg gtggggtaac cgcaaggagc cagccgccga aggt 1424

Claims (8)

1.一株台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)，名称为H3Y3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13340。
2.台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3 CGMCC No.13340在防治植物病害中的应用；所述植物病害为尖孢镰刀菌引起的百合根腐病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物病害为百合上发生的病害。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述百合的品种为东方百合西伯利亚(Lilium‘Oriental Hybrids’cv.Siberia)，所述尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)。
5.台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3 CGMCC No.13340在制备针对尖孢镰刀菌引起的百合根腐病的生防菌剂或微生物菌肥中的应用。
6.一种防治植物病害的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分为台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3 CGMCC No.13340；所述植物病害为尖孢镰刀菌引起的百合根腐病。
7.一种防治植物病害的微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥的活性成分为台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3 CGMCC No.13340；所述植物病害为尖孢镰刀菌引起的百合根腐病。
8.台中类芽胞杆菌(Paenibacillus taichungensis)H3Y3 CGMCC NO.13340在降解邻苯二甲酸中的应用。
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