UA120642C2 - Новий штам paenibacillus, протигрибкові сполуки та способи їх застосування - Google Patents

Новий штам paenibacillus, протигрибкові сполуки та способи їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA120642C2
UA120642C2 UAA201710266A UAA201710266A UA120642C2 UA 120642 C2 UA120642 C2 UA 120642C2 UA A201710266 A UAA201710266 A UA A201710266A UA A201710266 A UAA201710266 A UA A201710266A UA 120642 C2 UA120642 C2 UA 120642C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sho
shi
shk
shchi
still
Prior art date
Application number
UAA201710266A
Other languages
English (en)
Inventor
Джеремі Бо
Джереми Бо
Деніел М. Джу
Дениел М. Джу
Патрік Швінтек
Патрик ШВИНТЕК
Коллін С. Тейлор
Коллин С. ТЕЙЛОР
Бйорн А. Траг
Original Assignee
Байєр Кропсайєнс Лп
Байер Кропсайенс Лп
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байєр Кропсайєнс Лп, Байер Кропсайенс Лп filed Critical Байєр Кропсайєнс Лп
Publication of UA120642C2 publication Critical patent/UA120642C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/25—Paenibacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
    • A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K11/02—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof cyclic, e.g. valinomycins ; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується композиції, яка включає біологічно чисту культуру фунгіцидного штаму виду Paenibacillus, який включає варіант фусарицидинсинтетази без функціонального домену аденілування у третьому модулі (FusA-A3), причому брак функціональної FusA-А3 інгібує синтез фусарицидинів з тирозином або фенілаланіном в амінокислотному залишку (3) порівняно з синтезом фусарицидинів штамом виду Paenibacillus, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу і причому варіантна фусарицидинсинтетаза включає амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 90 % ідентичності послідовності з SEQ ID NO: 10.

Description

фусарицидинів з тирозином або фенілаланіном в амінокислотному залишку (3) порівняно з синтезом фусарицидинів штамом виду Раепірасілиз, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу і причому варіантна фусарицидинсинтетаза включає амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з ФЕО ІЮ МО: 10. ши нин нн нн п п п п НЕ пиши и ни нн п о п о
Шнпудененинини (неподанні ОЗОН пиши ши п п п п п ши ши ши ши ни и » ее пи нн п по по о п х
ШИ Го БОР. ши НИМ НИ І ВИМ 2 ці пиши и нн о п п п п не а ям Ж вне в шини ши ши шин Еш я пиши ши ши ще вк пиши ше о по о по В ВЕ я
МАЯКИ зевееннн й
НЕ АСУ ВИЗ окре я Кк кемя, з
Перехресне посилання на споріднені заявки
Дана заявка заявляє пріоритет для Попередньої патентної заявки США Мо 62/138,765, поданої 26 березня 2015 р., та Попередньої патентної заявки США Мо 62/232,205, поданої 24 вересня 2015 р., і зміст обох заявок включено до цього опису шляхом посилання у повному обсязі.
Посилання на перелік послідовностей, представлений в електронному форматі
Офіційну копію переліку послідовностей представлено в електронному форматі через ЕЕ5- умер як о АБСІІ-форматований перелік послідовностей з файлом під назвою "в8с5159002УМ0 5тТ25.4х", який було створено 21 березня 2016 р., і який має розмір 68 кілобайт і є поданим одночасно з цим описом. Перелік послідовностей, який міститься в цьому АЗСІІ- форматованому документі, є частиною опису і, таким чином, включається до нього у повному обсязі.
Галузь винаходу
Даний винахід стосується галузі бактеріальних штамів та їх здатності до контролю над хворобами рослин. Зокрема, даний винахід є спрямованим проти штаму Раепірасійи5 5р. з відносно високим рівнем протигрибкової дії широкого спектра.
Рівень техніки
Фунгіциди мають безліч призначень, включаючи застосування як засобів захисту культур; як консервантів для продуктів харчування та кормів і косметичних засобів; як терапевтичних засобів для лікування людей та тварин. Зниження врожайності культур, наявність хвороб харчового походження та грибкових інфекцій у людей та тварин є проблемою як у розвинутих країнах, так і у країнах, що розвиваються.
Синтетичні інсектициди або фунгіциди часто є неспецифічними, а отже, можуть діяти на організми, відмінні від цільових, включаючи інші природні сприятливі організми. За хімічним характером вони також можуть бути токсичними й такими, що не піддаються біодеградації.
Споживачі в усьому світі дедалі більше усвідомлюють потенційні проблеми для навколишнього середовища та здоров'я, пов'язані з залишками хімікатів, зокрема, у харчових продуктах. В результаті споживачі стають більш вимогливими щодо зниження використання або принаймні зменшення кількості хімічних (тобто, синтетичних) пестицидів. Таким чином, існує потреба у
Зо контролі над вимогами до харчового ланцюга при збереженні можливостей ефективної боротьби зі шкідниками.
Ще однією проблемою, яка виникає у зв'язку з застосуванням синтетичних інсектицидів або фунгіцидів, є те, що багаторазове й виключне застосування інсектициду або фунгіцидів часто призводить до відбору резистентних патогенних мікроорганізмів. Зазвичай такі штами також є перехресно резистентними до інших активних інгредієнтів, які мають такий самий спосіб дії.
Ефективний контроль над патогенами при зазначених активних сполуках у такому разі стає неможливим. Однак розробка активних інгредієнтів, які мають нові механізми дії, вимагають чималих зусиль та витрат.
Ризик вироблення резистентності у популяціях патогенів, а також проблеми, пов'язані з екологією та людським здоров'ям, сприяли зацікавленості у пошуку альтернатив синтетичним інсектицидам та фунгіцидам для боротьби з хворобами рослин. Застосування засобів біологічного контролю є однією з альтернатив.
Нерибосомні пептиди, такі, як фусарицидини, є широко відомими завдяки їхнім антимікробним властивостям і застосовуються у галузі захисту культур. Їхній спосіб дії також дозволяє застосовувати їх у біофармацевтиці та інших галузях біотехнологій. Фусарицидини можуть бути виділені з виду Раєпірасійи5 і мають кільцеву структуру, яка складається з 6 амінокислотних залишків, додатково до 15-гуанідино-3-гідроксипентадеканової кислоти. До фусарицидинів, виділених з Раепірасійи5 роїутуха, належать ГІ-РОЗ, І І-Е04, ГІ-РО5, ГІ-РО7 та ГІ-
ЕО8 І(Кигизи К, ОНба К, Агаії Т апа РикКивпіта К., У. Апііріоїісв5, 40: 1506-1514, 1987), а також повідомляється про додаткові фусарицидини А, В, С та О ІКартига М апа Капеда М., 5.
Апііріоїїс5, 49: 129-135, 1996; Ка|ітига У апа Капеда М., 9. Апіібіоїіс5, 50: 220-228, 1997).
Відомо, що деякі фусарицидини мають герміцидну активність проти патогенних для рослин грибів, таких, як Ризагішт охузрогит, Аврегоїййи5 підег, АзрегудйШи5 огулає та РепісшШіит отії.
Деякі фусарицидини також мають герміцидну активність проти грампозитивних бактерій, включаючи 5іарпуіососсив ацйгеи5 ІКазтига М апа Капеда М., У. Апіібіоїіс5, 49: 129-135, 1996;
Карйтига М апа Капеда М., У. Апііріоїіс5, 50: 220-228, 1997). Крім того, було виявлено, що специфічні фусарицидини мають протигрибкову активність проти І еріоз5рпаєтіа тасціап5, що викликає чорну кореневу гниль каноли |Веацу РН апа депзеп 5Е., Сап. 9. Місгобіо!., 48: 159-169, 20021. Існує потреба у подальшій характеризації сполук фусарицидину та розпізнаванні штамів бо виду Раепібрасійи5, які виробляють фусарицидини, що забезпечують широкий спектр протигрибкової активності при відносно низьких нормах внесення.
Фусарицидини та інші протигрибкові метаболіти одержують шляхом ферментації виду
Раєепірасійи5. Однак багато штамів виду Раєпібасійн5 також виробляють антибіотики, відомі як поліміксини. Поліміксини є вибірково токсичними для грамнегативних бактерій і можуть мати нейротоксичний або нефротоксичний вплив при введенні людині. Глобальна проблема розвитку резистентності до антимікробних засобів та відносної токсичності поліміксинів вимагає обережного застосування та внесення цих антибіотиків. З цієї причини дуже бажано, щоб штам виду Раепірасійй5, розроблений для застосування у сільському господарстві, експресував відносно високий рівень фусарицидинів без поліміксинів, які піддаються виявленню. Такий штам не створює або майже не створює ризику для працівників та споживачів. Крім того, існує потреба у визначенні штамів виду Раеєпібасіїїн5, які б демонстрували широкий спектр активності.
Існує велика потреба у поліпшенні ефективності існуючих фунгіцидів, зокрема, тих, які не є сприйнятливими до вироблення грибкової резистентності.
Короткий опис винаходу
Даний винахід стосується композиції, яка включає біологічно чисту культуру фунгіцидного штаму виду Раепібасіїйй5, який включає варіант фусарицидинсинтетази без функціонального домену аденілування у третьому модулі (Ги5А-АЗ), причому брак функціональної ЕРи5зА-АЗ інгібує синтез фусарицидинів з тирозином або фенілаланіном в амінокислотному залишку (3) порівняно з синтезом фусарицидинів штамом виду Раепірасійй5, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу. У деяких аспектах варіантна фусарицидинсинтетаза включає делецію у Би5А-АЗ принаймні одного, принаймні двох, принаймні трьох, принаймні чотирьох, принаймні п'яти, принаймні шести, принаймні семи, принаймні восьми, принаймні дев'яти або десяти амінокислотних залишків, які визначають субстратну специфічність. В одному аспекті амінокислотні залишки вибирають з групи, до якої належать А5р235, АІа236,
Зег239, Тиг278, І ец299, АІазО1, АІа/СіуЗз22, Маї330, Суз331, І уз517 та їх комбінації.
В одному варіанті втілення амінокислотні залишки розташовуються у позиціях 3203, 3204, 3207, 3246, 3267, 3269, 3290, 3298, 3299 та/або 3486 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 11. В іншому варіанті втілення варіантна фусарицидинсинтетаза включає делецію у Ги5зА-АЗ позицій Азра235,
АІіа236, Зег239, Тпг278, І еи299, АІаз301, АїІа/сІу322, МаїЗ30 та Суб5331. У деяких варіантах
Зо втілення варіантна фусарицидинсинтетаза включає 5ЕО ІЮ МО: 10.
Даний винахід також забезпечує композицію, яка включає біологічно чисту культуру фунгіцидного штаму виду Раєпібасійн5, або його безклітинний екстракт, який включає принаймні один Раєпізегіпе та принаймні один Раепіргоїїхіп.
У деяких аспектах принаймні один Раепізхегіпе вибирають з групи, до якої належать
Раєпізетіпе АТ, Раєпізегіпе Аг, Раєпізегіпе АЗ, Раєпізегіпе А4, Раєпізегіпе ВІ, Раєпізегіпе В2,
Раєпізегіпе В3, Раеєпізегіпе В4, Раєпізегіпе С1, Раєпізегіпе С2 та Раєпізтегіпе С3.
В інших аспектах принаймні один Раєеєпіргоїїхіп вибирають з групи, до якої належать
Раєпіргоїїхіп АТ, Раєпіргоїїхіп Аг, Раеєпіргоїїхіп ВІ, Раеєпіргоїїхіп В2, Раеєпіргоїїхіп С1, Раєпіргоїїхіп 01, Раепіргоїїхіп Е1, Раепіргоїїхіп Е2, Раепіргоїїхіп Е1, Раепіргоїїхіп Е2, Раепіргоїїхіп 1 та
Раєпіргоїїхіп (2.
У деяких варіантах втілення композиція включає фусарицидин А, ГігОва, Раепізегіпе АТ,
Раепізегіпе В1, Раеєпіргоїїхіп А2 та Раепіргоїїхіп В2.
У деяких варіантах втілення композиція не включає ГіБбОЗа, ГІРОЗБ, ГІРОЗс, Гігоза, Гіго7а,
МРО7р, СЕО7с та/або ГіБ07а. В інших варіантах втілення композиція включає Раепізегіпе А1,
Раєпізегіпе ВІ, Раепіргоїїхіп А2 та Раєпіргоїїхіп В2 у синергетично ефективній кількості.
У деяких аспектах даний винахід стосується композиції, в якій штам виду РаепірасшШив5 являє собою штам виду Раєпірасійи5 МАК В-50972, штам виду Раепібасіїйн5 МК. В-67129 або його фунгіцидний мутантний штам. Композиція може включати продукт ферментації штаму виду
Раепібасійи5 МАВІ В-50972, штаму виду Раепірбасійй5 МЕКІ В-67129 або його фунгіцидного мутантного штаму.
У деяких варіантах втілення фунгіцидний мутантний штам має геномну послідовність, яка має більше, ніж приблизно 90 95 ідентичності послідовності з штамом виду Раєпірбасійи5 МАК
В-50972. В інших варіантах втілення фунгіцидний мутантний штам має фунгіцидну активність та/або рівень фусарицидину, Раеєпізегіпе та/або Раеєпіргоїїхіп, який є порівнянним або кращим за рівень штаму виду Раєепірасійй5 МКК. В-50972. В інших варіантах втілення продукт ферментації не включає поліміксин.
У деяких аспектах продукт ферментації являє собою рідку композицію. Рідка композиція може бути концентратом суспензії або олійною дисперсією. В одному варіанті втілення композиція включає принаймні приблизно 1 х 107 КУО штаму/мл рідкої композиції. В іншому бо варіанті втілення композиція включає від приблизно 1 95 до приблизно 25 95 твердих продуктів ферментації.
В інших аспектах даний винахід стосується композиції, яка включає: а) принаймні один фусарицидин; та б) принаймні один Раеєпізегіпе або принаймні один Раеєпіргоїїхіп у синергетично ефективній кількості В одному варіанті втілення Раепізегіпе є принаймні одним з-поміж
Раєпізетіпе АТ, Раєпізегіпе Аг, Раєпізегіпе АЗ, Раєпізегіпе А4, Раєпізегіпе ВІ, Раєпізегіпе В2,
Раепізегіпе ВЗ, Раепізегіпе В4, Раеєпізегіпе С1, Раепізегіпе С2 та Раеєпізегіпе С3. В іншому варіанті втілення Раепіргоїїхіп є принаймні одним 3-поміж Раепіргоїїхіп Ат, Раепіргоїїхіп Аг,
Раєпіргоїїхіп ВІ, Раєпіргоїїхіп В2, Раепіргоїїхіп С1, Раєпіргоїїхіп 01, Раєпіргоїїхіп ЕТ, Раєпіргоїїхіп
Е2, Раеєпіргоїїхіп Е1, Раепіргоїїхіп Е2, Раеєпіргоїїхіп 51 та Раепіргоїїхіп С2.
Зокрема, в одному варіанті втілення синергетичне співвідношення принаймні одного фусарицидину та принаймні одного Раеєпізегіпе або принаймні одного Раеєпіргоїїхіп становить від 1:1000 до 1000:1, в оптимальному варіанті - у межах від 1:500 до 500:1, у ще кращому варіанті - у межах від 1:250 до 250:1. В іншому варіанті втілення синергетичне масове співвідношення принаймні одного фусарицидину та принаймні одного Раєпізегіпе або принаймні одного Раєпіргоїїхіп становить від 1:100 до 100:1, в оптимальному варіанті - у межах від 1:100 до 10:1 або навіть у межах від 1:50 до 25:1. В одному аспекті фусарицидин являє собою Фусарицидин А. В іншому аспекті Раеєепізегіпе являє собою Раеєпізегіпе АТ. У ще одному аспекті Раеєпіргоїїхіп являє собою Раепіргоїїхіп С1.
В інших аспектах даний винахід стосується виділеної сполуки, яка має структуру (1):
СНУ. но 7 (8) о МН мно А од К- ня МН о сна в о щі о ри : с МН щік
НМ МН п он о (І) де
В" та К2 кожен незалежно є -СН(СНз)г або -СН(СНзі)СНеСН»;
ВЗ є -СНС(О)МН» або -(СНг)25С(О)МН»; і п є цілим числом від 13 до 20; включаючи їх солі, гідрати, сольвати, поліморфи, оптичні ізомери, геометричні ізомери, енантіомери, діастереомери, ациклічні аналоги та суміші.
У деяких варіантах втілення КЗ є -СНоС(О)МН:. В інших варіантах втілення КЗ є - (СнНг)»С(О)МН». В одному аспекті К" є -СН(СНз)». В іншому аспекті КЕ" є -СН(СНз)СнНеСН». В одному аспекті 2 є -СН(СНЗз)». У ще одному аспекті К2 є -СН(СНз)СНеСН».
Зо В інших аспектах даний винахід стосується виділеної сполуки, яка має структуру (І):
во р нс о МН Мн в
Ів)
Нас
НМ МН в) сн,
НУ
Мн о о
МН» сне тт,
З не Мн 1 он (в) (9) де
А' є -СН2ОН або -СН(ОН) СН»;
В2 є -СНС(О)МН» або -(СНг)25С(О)МН»; і
ВЗ є Н або СН»; за умови, що якщо К!' є -СНоОН, і К2 є -«СН-С(О)МН», то ЕЗ є Н; включаючи їх солі, гідрати, сольвати, поліморфи, оптичні ізомери, геометричні ізомери, енантіомери, діастереомери, ациклічні аналоги та суміші.
У деяких варіантах втілення ЕКЗ є СН». В інших варіантах втілення ЕКЗ є Н. В одному аспекті ЕК" є-СНОН. В іншому аспекті К! є -СН(ОН)Сн». В одному аспекті К2 є -СНС(О)МН». У ще одному аспекті К2 є -«(СНг)2С(О)МН».
В одному варіанті втілення даний винахід стосується композиції, яка включає описану авторами виділену сполуку та прийнятний для застосування у сільському господарстві носій.
У деяких варіантах втілення даний винахід стосується розчину, який включає сполука структури (І), причому концентрація сполуки становить принаймні 0,001 мг/мл, принаймні 0,01 мг/мл або принаймні 0,1 мг/мл. В іншому варіанті втілення даний винахід стосується розчину, який включає сполуку структури (І), причому концентрація сполуки становить принаймні 0,001 мг/мл, принаймні 0,01 мг/мл або принаймні 0,1 мг/мл. У деяких аспектах описані розчини також включають прийнятний для застосування у сільському господарстві носій.
У ще одному варіанті втілення даний винахід стосується способу обробки рослини для боротьби з хворобою, причому спосіб включає нанесення ефективної кількості описаної авторами композиції на рослину, частину рослини та/або місце вирощування рослини. У деяких аспектах композиція являє собою продукт ферментації штаму виду Раепібасійй5 МЕРІ. В-50972, штаму виду Раепібасійй5 МАК. В-67129 або його фунгіцидного мутантного штаму. В інших аспектах спосіб включає нанесення композиції на частини листяних рослин. В інших аспектах композицію застосовують у кількості від приблизно 1 х 109 до приблизно 1 х 1072 колонієутворюючих одиниць (КУО) штаму виду Раепірасіййи5 МК 8В-50972, штаму виду
Раепібасійи5 МАВІ 8В-67129 або його фунгіцидного мутантного штаму на гектар. В одному варіанті втілення композицію застосовують у кількості від приблизно 0,5 кг до приблизно 5 кг
Зо твердих продуктів ферментації на гектар.
У деяких аспектах хвороба рослин викликається грибком. В інших аспектах хворобою рослин є борошниста роса або іржа. В одному варіанті втілення борошниста роса є справжньою борошнистою росою або псевдоборошнистою росою. В іншому варіанті втілення іржа є вибраною з групи, до якої належать листкова іржа пшениці, листкова іржа ячменю, листкова іржа жита, бура листкова іржа, корончаста іржа та стеблова іржа.
У деяких варіантах втілення грибок є вибраним з групи, до якої належать Айегпагіа акегпаїа,
АПегпагіа 5оїапі, Воїгуїїз сіпегєа, СоПеюїіснит Іадепагішт, Ризапйцт сиїтогит, РіаєозрНнаєтіа подогит, 2утозеріогіа іпійсі, Рпуїорпіпога сгуріодеа, Рпуїорпїтога іптебіап5, РуїШішт ийітит,
Мадпароппе оогулає, Тпапаїерпогиб5 сиситегі5, ОбШадо 5едеїшт маг. амепає, ПОготусе5 аррепаїсціасив та Риссіпіа ігйісіпа.
В інших варіантах втілення хвороба рослин викликається бактеріями. В одному аспекті бактерії є вибраними з групи, до якої належать Хапіпотопах сатревбігі5, Рзендотопах 5угіпдає та Егм/іпіа сагоїомога.
Даний винахід також стосується застосування описаних композицій для боротьби з фітопатогенними організмами у корисних рослинах. У деяких аспектах фітопатогенний організм є вибраним з групи, до якої належать АйПегпагіа акегпага, АКегпага 5оїапі, Воїгуїі5 сіпегеа,
СоПейфоїйспит Іадепагішт, Еивагшт сцітогит, РНаеозрнаєтіа подогит, 7утозеріога (іпйісі,
Рпуюріїйога сгуріодеа, РНуюрншога іпіезіап5, Руїйішт иШітит, Мадпаропне огугав,
Тпапагерпоги5 сиситегі5, Обзіцадо 5едешт маг. амепає, Оготусе5 аррепаісшайи5 та Риссіпіа іпйісіпа. В інших аспектах фітопатогенний організм є вибраним з групи, до якої належать
ХапШпотопавх сатрезігі5, Рзейидотопазв зугіпдає та Егм/іпіа сагоїомога.
В інших аспектах корисні рослини є вибраними з групи, до якої належать яблуня, банани, цитрусові, ківі, дині, персики, груші, ананаси, зерняткові плоди, гранати, капуста, цвітна капуста, огірки, гарбузи, томати, картопля, пшениця, рис та соя.
Короткий опис Фігур
Фіг. 1 показує іп ріапіа фунгіцидну активність суцільних бульйонів штаму виду Раєпірбасійи5 проти фітофторозу томатів (РНУТІМ), сірої гнилі (ВОТКСІ) та листкової іржі пшениці (РОССКТ).
Фіг. 2 показує іп міго протигрибкову активність екстрактів фусарицидину з суцільних бульйонів штаму виду РаепібасіШи5 проти АйЦегпага анегпага (АГТЕАЇ), Воїгуїйв сіпегєа (ВОТАСІ), Ризагійт сиітогит (РОБАСИ), Рнаєозрпаєта подогит (ГЕРТМО), 7утозеріогіа інісі (ЗЕРРТВ), Рпуторпїтога сгуріодєа (РНУТСВ), РНуїорнпіїнога іпгезіапо (РНУТІМ), Руїішт иШітит (РУТНИЇ), Мадпаропне огулає (РУВІОВ), Тнапаїерногив сиситетгів (ВНІ25О), Овійадо зедейшт маг. амепає (ШБТІАМ) та Оготусез аррепаісшат5 (ШКОМАР).
Фіг. З показує розкриття кільцевої структури у ГіБО4а (також відомої як фусарицидин А) для утворення ациклічного аналога, ГІг04с. Подібним чином трапляються ациклічні аналоги кожного з фусарицидинів та подібних до фусарицидину сполук.
Фіг. 4А представляє діаграму, на якій показано структуру відомих фусарицидинів з консервативними амінокислотами у розпізнаних позиціях (1), (4) та (б) та амінокислотами, що змінюються, які позначаються як АА (амінокислота). Хвіст 15-гуанідино-3- гідроксипентадеканової кислоти (ЗНРО)) утворює амідний зв'язок з М-кінцем І -треоніну у позиції
Зо (1). С-кінець Ю-аланіну у позиції (6) утворює естерний зв'язок з гідроксигрупою І -треоніну у позиції (1), позначеній стрілками, які вказують на "ОО". ФІГ. 48 показує ВЕРХ/М5 ТОБ- хроматограму з екстракту клітин виду Раепірасійй5, на якій розпізнано відомі фусарицидини.
ФІГ. 4С показує відомі фусарицидини, які можуть бути розпізнані в екстракті клітин зі штаму виду Раєпібрасіїйи5 МАНІ В-50972 та/або похідних від нього штамів.
Фіг. 5А представляє діаграму, на якій показано структуру Раєпізегіпе. Цей клас сполук є подібним до фусарицидинів, за винятком того, що один або обидва консервативні треоніни у позиціях (1) та (4) є заміщеними серином. ФІГ. 5В показує ВЕРХ/М5 ТОЕ-хроматограму екстракту клітин зі штаму виду Раєпірасійи5 МЕР. В-50972 та/або похідних від нього штамів, на якій розпізнаються Раеєпізегіпе. ФІГ. 5С показує Раеєпізегіпе, які можуть бути виявлені в екстракті клітин зі штаму виду Раєпірасійи5 МАК. В-50972 та/або похідних від нього штамів. Значення т/7 та час утримання (КТ) показано для всіх виявлених сполук.
Фіг. бА показує хімічну структуру Раеєпізегіпе АТ, визначену на основі ОРГ С/М5 Тгіріе ТОБЕ- спектра, показаного на ФІГ. 68.
Фіг. 7А показує хімічну структуру Раеєпізегіпе В1, визначену на основі ОРГ С/М5 Тгіріе ТОБЕ- спектра, показаного на ФІГ. 7В.
Фіг. ВА представляє діаграму, на якій показано структуру Раепіргоїїхіп. Цей клас сполук є подібним до фусарицидинів, за винятком того, що довжина хвоста СНРО є збільшеною з - (СНгн2- до -(СНег)14- або -(СНег)і6-. ФІГ. 88 показує ВЕРХ/М5З ТОЕ-хроматограму екстракту клітин зі штаму виду Раєпірбасіййи5 МАК. В-50972 та/або похідних від нього штамів, на якій розпізнано Раепіргоїїхіп. ФІГ. 8С показує Раепіргоїїхіп, які можуть бути виявлені в екстракті клітин зі штаму виду Раєпірасійи5 МАК. В-50972 та/або похідних від нього штамів. Значення т/7 та час утримання (КТ) показано для всіх виявлених сполук.
Фіг. 9А показує хімічну структуру Раепіргоїїхіп С1, визначену на основі ОРІ С/М5 Ттгіріе ТОБ- спектра, показаного на ФІГ. 98.
Фіг. 10А показує хімічну структуру Раепіргоїїхіп О1, визначену на основі ОРІ С/М5 Ттгіріє ТОЕ- спектра, показаного на ФІГ. 108.
Фіг. 11 показує дискодифузійний аналіз Кірбі-'Бауера на чутливість до антибіотиків для фусарицидинів А та В ("АВ"), Раєпізегіпе АТ та В1 ("868"), Раєпіргоїїхіп А2 та В2 ("938") або комбінації 868 та 938, які наносили на культуру спор СоПейюігіспит Іадепагішт (СОГІ ГА) на бо планшеті з агаром. Діаметр кожного диска з його зоною інгібування росту грибків вказано у міліметрах.
Фіг. 12А показує хімічну структуру фусарицидину А спрощене зображення цієї структури.
ФІГУРИ 128-12Е показують спрощені зображення комбінацій фусарицидинів, Раепізегіпе та/або
Раеєпіргоїїхіп, які дає штам виду Раєепірасійй5 МКК В-50972 та похідні від нього штами.
Комбінації на зразок цих можуть створювати синергетичний протигрибковий ефект і відповідають за відносно високу ефективність та широкий спектр протигрибкової активності, які спостерігаються для штаму виду Раеєпірасійи5 МЕКГ В-50972 та похідних від нього штамів.
Фіг. 13 представляє множинне вирівнювання послідовностей сегмента фусарицидинсинтетази Ри5А, яка експресується такими штамами Раепірасійш5: Раепірасійив5 реоїїає А (5ЕО ІО МО: 1); Раєпібасіїи5 роїутуха А (5ЕО ІО МО: 2); Раєпірасіїн5 роїутуха РКВІ1 (СепВапк АВО96384.2; 5ЕО ІО МО: 3); Раєпірасіїи5 роїутуха Е681 (СепВапк АОМб7985.1; 5ЕО
ІО МО: 4); Раєпірасіїшв роїутуха В (5ЕО ІО МО: 5); Раепірасіїй5 роїутуха БОВ (СепВапк
АНМб63812.1; 5ЕО ІО МО: 6); Раепірасіїн5 роїутуха С (ЗЕО ІО МО: 7); Раєпібасійи5 роїутуха МІ (СепВапк ССС83015.1; 5ЕО ІЮ МО: 8); Раєпібасіїи5 роїутуха 502 (СепВапк АСА09733.2; 5ЕО
ІО МО: 9); штам виду Раєепірасійи5 МЕРІ. В-50972 (5ЕО І МО: 10); та штамом виду Раепірасіїйи5
А (ЗЕО ІЮ МО: 11). Амінокислотні залишки, які визначають субстратну специфічність, виділено чорним контуром (див. також Таблицю 1). Ці амінокислотні залишки розташовуються у позиціях 3203, 3204, 3207, 3246, 3267, 3269, 3290, 3298, 3299 та 3486 послідовностей 5ЕО ІЮО МО: 1-5 та 11 ї у позиціях 3204, 3205, 3208, 3247, 3268, 3270, 3291, 3299, 3300 та 3487 послідовностей 5ЕО
ІО МО: 6-9.
Фіг. 14 показує кластер генів фусарицидину у штамі виду Раепірасіййш5 МКК В-50972 та штам виду Раепібрасійи5 А ("Штам А"). Стрілки представляють окремі гени у кластері (тобто, Ти5О представлено стрілкою "с", ї5Е представлено стрілкою "Б", і т. д.). Найбільша стрілка представляє ген фусарицидинсинтетази їи5А з такими скороченнями та символами: А - домен аденілування (розпізнавання та активація субстрату); С - домен конденсації (утворення пептидного зв'язку); Е - домен епімеризації (рацемізація субстрату); ТЕ - домен тіоестерази (вивільнення продукту); овал без літери - домен тіолування (Т) (білок-носій пептиду). Ген ТА має шість модулів, які відповідають за включення амінокислот, вказаних прямокутниках вище або нижче кожного кластера генів. Штам А має типовий кластер генів фусарицидину, тоді як
Зо кластер генів фусарицидину штаму виду Раєпірбасійи5 МАК! В-50972 не має функціонального домену А у модулі 3. В результаті фусарицидини, які виробляються штамом виду Раєпірасійи5
МАНІ. В-50972, не містять тирозину та фенілаланіні в позиції (3) ії включають лише валін або ізолейцин.
Фіг. 15 показує вирівнювання послідовностей гена 5робА у штамі виду Раєепірасійй5 МКК В- 50972 (ЗЕО ІЮ МО: 12) та штамі виду Раєпірбасійи5 МЕКГ В-67129 (5ЕО ІО МО: 13).
Фіг. 16 показує вирівнювання послідовностей ортологів Зро0А з утворюючих ендоспори бактерій, яке вказує на те, що зміна нуклеотидів у кодуючій послідовності штаму виду
Раєпібасіїи5 МАВГ. В-67129 в результаті веде до єдиної амінокислотної заміни у консервативній ділянці. Вирівняними ортологічними послідовностями ЗробА є: 5робА РаепірасшШиз їегпає (ЗЕО
ІО МО: 14), 5роб0А штаму виду РаєпірасШи5 МЕР В-50972 (ЗЕО ІО МО: 15), 5роб0А штаму виду
Раєпірасіни5 МАВ В-67129 (5ЕО ІО МО: 16), 5робА Раеєпібасіїїшв роїутуха (ЗЕО ІО МО: 17), зробОА Васійи5 зирійв (БО ІЮ МО: 18), 5ро0А Васійи5 сегеи5 (ЗЕБО ІЮ МО: 19) та 5робА
Сіозіайт равівигіапит (5ЕО ІО МО: 20).
Фіг. 17 показує значення мінімальної інгібуючої концентрації для 80 95 (МІС80) показників кількох фусарицидинів, Раепізегіпе та Раепіргоїїхіп з грибковими патогенами АкКегпагіа 5оіапі (АГТЕ5О) та СоПефїгіспит Іадепагійт (СО І А).
Детальний опис винаходу
Даний винахід забезпечує штам виду Раєпібасійй5 МК. В-50972 або фунгіцидний мутант (штам), який від нього походить. Було виявлено, що штам виду Раєпірасіїйи5 МАК. В-50972 має широкий спектр активності пороти фітопатогенів.
Усі мікроорганізми, зокрема, описані авторами штами, якщо конкретно не зазначено іншого, беруть у природі й вирощують у штучних умовах, наприклад, у колбах для культивування зі струшуванням, або з застосуванням виробничих процесів у збільшених масштабах, наприклад, у біореакторах, для забезпечення максимального вироблення біологічно активного метаболіту.
Вирощування за таких умов веде до "одомашнювання" штаму. Зазвичай такий "одомашнений" штам відрізняється від своїх природних відповідників тим, що його культивують як однорідну популяцію, яка не зазнає тиску відбору, який відбувається у природному середовищі, але піддається тискові штучного відбору.
У контексті цього опису термін "виділений" стосується сполуки, яку було збагачено або 60 концентровано у суцільному бульйоні або продукті ферментації, або яка є частково або суттєво очищеною від суцільного бульйону або продукту ферментації.
В одному варіанті втілення забезпечується мутантний штам виду Раепірасійи5 МАК В- 50972. Термін "мутант" означає генетичний варіант, який походить від штаму виду Раепірасійи5
МАНІ В-50972. В одному варіанті втілення мутант має одну або кілька або всі відмітні (функціональні) характеристики штаму виду Раепірасійи5 МКК. В-50972. У конкретному випадку мутант або продукт його ферментації контролює ріст (що є його відмітною функціональною характеристикою) грибів, ооміцетів та/або бактерій принаймні так само, як і батьківський штам виду Раєпірасійи5 МКК. В-50972. Такі мутанти можуть бути генетичними варіантами, які мають геномну послідовність, яка має більше, ніж приблизно 85 95, більше, ніж приблизно 90 95, більше, ніж приблизно 95 95, більше, ніж приблизно 98 95, або більше, ніж приблизно 99 95 ідентичності послідовності 3 штам виду Раепірасійй5 МЕАЕКІ В-50972. Мутанти одержують шляхом обробки клітин штаму виду Раєпірасійш5 МЕКІ В-50972 хімікатами або опромінення, або шляхом відбору спонтанних мутантів з популяції клітин штаму виду Раєпірасійи5 МЕКІ. В- 50972 (таких, як фагостійкі або стійкі до антибіотиків мутанти) або іншими способами, добре відомими спеціалістам у даній галузі.
Штам виду Раепірасійи5 МКК В-50972 та його мутанти мають активність проти широкого спектра рослинних патогенів. В одному аспекті штам має активність проти грибів, таких, як антракноз огірків, справжня борошниста роса огірків, листкова іржа пшениці, справжня борошниста роса ячменю та ботритіоз; Ооміцети, такі, як фітофтороз томатів, псевдоборошниста роса огірків та псевдоборошниста роса капусти; та/або бактерії, такі, як
Рзепйдотопав, Хапіпотопавз та Егміпіа.
У деяких аспектах штам виду Раеєпібрасіїй5 включає послідовність ДНК, яка має принаймні 75 95 ідентичності послідовності, принаймні 80 95 ідентичності послідовності, принаймні 90 95 ідентичності послідовності, принаймні 9595 ідентичності послідовності, принаймні 96 95 ідентичності послідовності, принаймні 9795 ідентичності послідовності, принаймні 98 95 ідентичності послідовності або принаймні 99 95 ідентичності послідовності з «ФЕО ІЮ МО: 10.
У деяких аспектах даний винахід стосується продукту ферментації, який включає штам виду
Раєепірасійй5, причому штам виду Раеєпірасіййи5 виробляє фусарицидини, Раеєепізегіпе та/або
Раепіргоїїхіп. Фусарицидини являють собою родину депсипептидів з хвостом 15-гуанідино-3- гідроксипентадеканової кислоти (ЗНРО), а також їх лінійні відповідники. Конкретними консервативними характеристиками фусарицидинів є цей хвіст ЗНРО, а також три з шести амінокислот у такій послідовності: (1) треонін, (4) треонін та (6) аланін.
Первісно виявлені, але не охарактеризовані у публікації МаКаїта еї аї. (9. Апіібріої. 1972, 25, 243 - 247) у середині 70-х років, фусарицидини було описано у публікації Кигизи еї аї. (у.
Апііріої., 1987, 40, 1506 - 1514) наприкінці 1980-х. Вони були додатково досліджені авторами
Каїїтига еї аї. (У. Апііріої., 1996, 49, 129 - 135; У. Апііріої., 1997 50, 220 - 228), Кигода еї а).
ІНеїегосусієв, 2000, 53, 1533 - 1549; 3). Мавв Зресігот., 2001, 36, 30 - 37| та Веацу еї аї. |(Сап. у.
Містгобріо!., 2002, 48, 159 - 169) протягом періоду з середини 1990-х до початку 2000-х. Протягом цього періоду активних досліджень ці сполуки кілька разів перейменовувалися, залежно від автора (Фусарицидин А також є відомим як І ігО4а, Саїамаїййп або навіть КТ-6291А). Хоча існує багато публікацій з цієї теми, щоразу описується відбір сполук з однієї групи з 24-х відомих фусарицидинів.
Після дещо спокійнішого періоду стосовно цієї теми у публікації Маїег еї аї. (9. Ат. 5ос. Мавб5
Зресігот., 2015, 26, 1130-1141) було описано з'ясування структури фусарицидинів шляхом мас- спектрометрії з описом кількох аналогів з цієї родини. Маїег еї аІ. Розпізнали новий клас подібних до фусарицидину сполук з сімома амінокислотами (тобто, додатковим аланіном, з'єднаним з (4) треоніновим залишком у пептидній послідовності). У контексті цього опису термін "ациклічний аналог" стосується сполуки, яка відповідає фусарицидинові або подібній до фусарицидину сполуці (наприклад, Раєпізегіпе або Раепіргоїїхіп), але не має естерного зв'язку, результатом чого є лінійна структура.
Амінокислотні ланцюги фусарицидинів з'єднуються й модифікуються нерибосомною пептидсинтетазою (МКРБ5). Багатодоменна МКР5 включає до 15000 амінокислот, а отже, вважається одним з найдовших білків у природі |(Зспу/агег еї аї., (2003) Мопгірозотаї! Рерійдев:
Егот Сепев о Ргодисів. Маї. Ргод. Вер. 20, 275 - 287). Включення МКР5З не обмежується 21 стандартними амінокислотами, які транслюються рибосомою, і ця невпорядкованість сприяє великому структурному різноманіттю та біологічній активності нерибосомних пептидів Гі апа
Уепзеп, (2008). Мопгірозотаї! Біозупіпевів ої Тизагісідіпє Бу Раєпірасйи5 роїутуха РКВІ іпмоїЇме5 дігесі асіїмайіоп ої а а-атіпо асіа. Снет. Віої. 15, 118 - 127).
У Р. роїутуха Еб8 було охарактеризовано біосинтетичний кластер генів фусарицидину 60 (5 РЕОСВА), і, за спостереженнями, кодуюча послідовність МЕКР5, найбільша кодуюча послідовність ДНК (СО5) у кластері, кодує шестимодульний пептид |Спої еї аї., ІЗепійсайноп апа
Еипсійопа! Апаїузів ої Ше Ривзагісідіп Віозупіпеїїс Сепе ої Раєпібасіїшв роїутуха Еб681. Віоспет.
Віорпуз. Не5. Соттип. 365, 89 - 95; Ії апа Уепзеп, Ідепійісайоп апа ЕРипсіїопа! Апаїувзів ої Ше
Еизагісідіп ВіозупіНеїїс Сепе ої Раєпібасіїш5 роїутуха Еб81. Віоспет. Віорпуз. Ве5. Соттип. 365,89 - 95; Ії еї а)., (2013). Рготоїег Апаїузіз апа Тгапзстгіріоп Недшіайоп ої Ти Сепе Сіи5іег
Везропзвівіє Тог Ризагісідіп Зупіпевів ої Раепірасіїїй5 роїутуха 5ОВ8-21. Аррі. Містобріо!. Віоїеснпої. 97, 9479 - 9489). Біосинтетичний кластер включає іншу СО5, яка відповідає за біосинтез ліпідного компонента, але не містить гени-репортери Сі апа депзеп, (2008). Мопгірозхотаї!
Віозупіпевів ої Ризагісідіп5 Бу Раєпібасіи5 роїутуха РКВІ Іпмоїмез Оігесі Асіїмайоп ої а а-атіпо асій. Спет. Віої. 15, 118 - 127). У Р. роїутуха було розпізнано промотор для оперона із і виявлено, що він зв'язується транскрипційним репресором (АргВ), який у попередніх дослідженнях розглядався як регулятор споруляції; інтерес до нього зумовлено тим, що фусарицидин за спостереженнями синтезується під час споруляції, таким чином, координуючи вторинний метаболізм мікроба в його життєвому циклі (Гі еї аї!., (2013). Рготоїег Апаїувзів апа
Тгкапвсетіріоп ВНедиїайоп ої Ти5 Сєпе СіІивієг Незропвібіе їог Ризаїгісідіп Зупіпевів ої Раєпібасіїшв роїутуха 5ОВ-21. Аррі. Містобіої. ВіоїесНпої. 97, 9479 - 94891.
Зазвичай вважається, що алельне різноманіття зумовлює наявність хімічного різноманіття.
Однак цікавою особливістю кластера из є те, що різноманіття фусарицидинів, які відрізняються включеними амінокислотами (Туг, Маї, Пе, ало-Пе, Рпе), може бути створене єдиним алелем
Ти5А; механізм, який лежить в основі цього процесу, полягає в тому, що А-домен МКР5Б, який відповідає за розпізнавання амінокислот, має ослаблену субстратну специфічність ІНап еї аї., (2012). Зйе-Оігесівєйд Моадіїісайноп ої Те Адепуїанйоп Ротаїп ої Шїе Ризагісідіп Мопгірозотаї! Реріїде зЗупіпеїазе їог Еппапсей Ргодисійп ої Ризаїсідіп Апаіодв. Віоїесппої. І ей.34, 1327 - 1334; Моиза еї а!., (2015) Віодімегтейу ої Сепе5 Епсодіпу Апіі-Містобіа! Тгайв мйпіп Ріапі Авзосіаїєд Місторев,
Егопі Ріапі 5сі. 2015; 6: 2311.
Структуру А-домену, який відповідає за розпізнавання та активацію субстрату у гені Т5А, було визначено за Сг5А з застосуванням Рентгенівської кристалографії, і було розпізнано 10 амінокислотних залишків, які визначають субстратну специфічність (Азр235, АІа236, Тгр239,
Тпг278, Пе299, АІа301, Аіа322, Пе330, Суз331 та І уз517) |(Спаїй5 еї аї., (2000) Ргедісіїме, Бігисіите-
Коо) Вазед Моадвеї ої Атіпо Асій Весодпйіоп Бу Мопгірозотаї! Реріїде 5упіпеїазе Адепуїанйоп Юотаїпв.
Спет Віої! 7: 211 - 224; МаспеїІнаиз еї аї., (1999) Те Зресіїїсну Сопіегпіпуд Соде ої Адепуїайоп
Ботаїпе іп Мопгірозота! Реріїде бупіпейазез. Спет Віо! 6: 493 - 505). Ці 10 сигнатурних залишків можуть бути розділені на три підгрупи залежно від їхньої функції у межах сайта зв'язування з субстратом. А5зр235 та І уз517 взаємодіяли з карбоксильним та амінним кінцями субстрату, відповідно, і аналіз послідовності виявив, що їхня позиція в А-домені МАКРО є інваріантною. АІа236, АІа301 та Пез330 є помірно варіабельними у межах А-доменів, специфічних до амінокислотних субстратів, які мають аліфатичний боковий ланцюг. Тгр239, Тпг278, Пе299,
АІа322 та Суб5331 є високоваріабельними позиціями і вважаються важливими для розрізнення та відбору різних субстратів (Спаїй5 еї аї., (2000) Ргедісіме, 5ігисішге-Вазед Моавеї! ої Атіпо Асій
Весодпйоп Бу Мопгірозотаї! Реріїде Зупіпеїазе Адепуїайоп Юотаїіпв. Сет Віо! 7: 211 - 224;
ФеіаспеїіНацз еї аї., (1999) Тне бресіїсну Сопіегтіпуд Соде ої Адепуїайоп Юотаїпв іп Мопгірозотаї
Реріїде зупіпеїазез5. Спет Віо! 6: 493 - 505). Пе299 був найбільш варіабельною позицією серед усіх у межах послідовності, яка надає субстратної специфічності (аспеїІнацз еї аї., (1999) Тне зЗресіїйсну Соп'іегтіпу Соде ої Адепуїайоп Ботаїпв5 іп Мопгірозотаї! Реріїде 5упіпеїазез. Снет Віої! 6: 493 - 505). 10 амінокислотних залишків, які визначають субстратну специфічність у фусарицидинсинтетазі, показано у Таблиці 1. Домени аденілування (А-домени) для кожного з шести модулів у синтетазі є відомими як ГизА-АТ для першого модуля, Ри5А-А2 для другого модуля, Ри5А-АЗ для третього модуля і т. д. Ці 10 амінокислотних залишків також розпізнаються у множинному вирівнюванні послідовностей Би5зА з різних штамів виду Раепіврасіїйи5, представлених на Фіг. 13.
Таблиця 1 ни Позиції залишків, задіяних у розпізнаванні субстрату вн у фусарицидині
Рода! | о | ЕМ М/о м/иуУ|нікіст щ сс27С у
О-Маї, О-аїпо-Іе,
І-Тук, Г-РНе, І -маї,
Ризд-Аї | о | є | М м | соми у ноу ок О-айю-тнг
РивА-АБЄЇ | о | | тк || ЕМ | а к (|О-Авпабо О-СІп
Гозд-А6Є | 0 | є | Р. | М | є | с 71 1 | М | М | кола 7771
У деяких аспектах фунгіцидний штам виду Раепірасійй5 експресує варіантну фусарицидинсинтетазу, яка включає делецію принаймні одного, принаймні двох, принаймні трьох, принаймні чотирьох, принаймні п'яти, принаймні шести, принаймні семи, принаймні восьми, принаймні дев'яти або всіх десяти амінокислотних залишків, які визначають субстратну специфічність у Би5А-АЗ. В інших аспектах фунгіцидний штам виду Раеєпібрасіїййи5 експресує фусарицидинсинтетазу з делецією у Ри5А-АЗ принаймні одного амінокислотного залишку, вибраного з групи, до якої належать Азр235, АІа236, Зег239, ТПг278, І ен299, АІа301, АІа/сІуз322,
Уа1І330, Суб5331, І уз517 та їх комбінації.
Делеції у Ги5А-АЗ, описані авторами, впливають на здатність фусарицидинсинтетази до включення конкретних амінокислот в амінокислотній позиції (3) пептидного кільця у фусарицидині або подібній до фусарицидину сполуці. Наприклад, штам виду РаепірасШи5 МАМІ.
В-50972 включає делеції у БизА-АЗ і не може утворювати сполуки фусарицидину з амінокислотами тирозином або фенілаланіном в амінокислотній позиції (3). Без прив'язування до будь-якої теорії може статися так, що делеції у РБи5А-АЗ віддаляють метаболізм від біосинтезу класичних фусарицидинів і наближають до біосинтезу подібних до фусарицидину сполук, таких, як Раєпізегіпе та Раепіргоїїхіп.
У деяких варіантах втілення даний винахід стосується композиції, яка включає біологічно чисту культуру фунгіцидного штаму виду Раепірасійй5, яка включає варіантну фусарицидинсинтетазу без функціонального домену аденілування у третьому модулі (Би5А-АЗ), а також включає принаймні один Раєпізегіпе та принаймні один Раепіргоїїхіп. У деяких аспектах принаймні один Раеєпізегіпе та принаймні один Раепіргоїїхіп є виділеними або збагаченими у композиції.
У деяких варіантах втілення виділена сполука або Раеєпіргоїїхіп являє собою
ОН ОО 007 Мн, у Ше я М й Х в
Еш й іч
Со. МН би ух ба (а)
Тех он Й о ке Но Що бу "юн бо а В . Ц М і де сная «М. сне -й ; ях х «ЇМ, Мн я вер Ба се вс зве ай Вей ке ей я ї ла ще Ми як б .
-
Ів ск М ий "ЕК хх
А йо М й х дико Й в не х ек Зв З лин
Км А ее -к Ж
Її шк (ІБ) з не: ЧИНИ б ще й я Щи "ях КК сь сш АХ
М оби «З У н ак ке ше х ще М. ВО ще й я Кай о ней й м й й Ше й Й хо я й г їх паї я й о и і ; ї Е
В з Ї ху си м Ки Б ши: ак ке -- й в « ш ж
КУ м Кк ж пишним ее бе ї : 7 (Іс)
СУ що бок я що м ши нн ї ї Зі і І ЖЕ ще ху есе Ж «хо сеанси яка о Ящя М. Я Ме ай о з З в Кол бо, и й
І шщ ши -й сх а Вк сш й
І ї
З ж 1 кож й
ОК і: т хх он о ще
Бе Ме
Ї їЕ :
ІЗ вон на: оку й й ких Ве ЕК ва зе з в М ша Охшуї (9) ї їх й | : З:
Ше ре бо Ж С Й її ЕЗ В й 3 ом І МАМ кв
У Ж й Ї кх . 1
А ку
Тая ва ї х ї е-яй ве с зви хх шо З щі Я х с шко дет де
Оп. Мн я нак рено Ж. Ку
Бе -- х К Мох Є
Ей ши (Іє) х
Зк, я : с ка сх жк Ж
ШИ . ї х К с хх ! І Моя | п ше
Куеас са о А Не ож ке ді В В ще де Ой м, З я "ях ГК й шк Те не й: ха ки Є - ї ше й й І
З . 1
КО Р як
ЖЕНЕ КЕ ше НН ДИ, ей
Ї яз ххх ак ой
УВУ у: ее ом є і
Ж Ек ІЗ х У Е
КЗ В КЗ реа яку ек ККУ не еко я а як - зе В ж
Я хх Ж Що : жк) СЯ КУ ! Я я ХМ ж З пе ден їх М ща Я хи «Б ЖІ са -ї дж де ЕТ. х йо ве (19 ї ї є. х же з. Н шк Х
М ке ЧИН Ше ж : й
Щи ЯЗ ме дк ххх з й М г ку їх З я в
З УЖЕ хе ЕЕ
ГУ Я КЕ й ЖЕ КЕ КОЖ.
ГУ : сно КЯ У х Я 15 В -
ІУ Й ХЕ їх ІЧ Я Е 5. ши ши ши ще чаш
Кен дк м мах сне Сех бок ще б кі ще ту хх . й ях ей я м де ся р в о З
Б Е де Ха З
Е ві у ЖК 3 я г І ес щ В. і й Ї
Й 1 і
КУ
.
Б ж кове а Я хіх : ; ї
ОМ о й КН, і й г г
Х нас м ру в жі се Зо хх З НК ННЯ хе в ГБ й "рення Є В й (З ся
ОХ
КУЩ -
Я; Ви о с, хх ВЖЕ ще Я
Ще Буш вки Я У (19) їЗ о Б су К їх ох ее я З жк я ж м н мая ки ях - м
ІЗ ї ! БУ ек х І: іч Я Я їх Е; Х ї їх ї хх х хе Б 6 . Х ч щ- с ке Жх, мех Кк, сон Й В М. Ех ЖК
Бе с ек ай че и а х Сас кі йо ЕЙ Ух : х
Е М тів І
ЕК Ж м в 1
Ко Мн вся х ж ек .
.
ЯКУ хе З оч хх он о Ї "Мн, ре ХК шен У хе с ій гаУ й ре
Б ШЕ ВВ ї: Є
У Ох (п) б м З в: й 3 М г Шон СО Со я вуж з Ше й в з сш Мч ха ше НУ
М ль ї
Ко о МА 1 се я зх б Ше а в ще ши ЕВ а я | 5
Се «МН і. ї Я і Се Й
Ї | (ї) о шк че ж, ЗИ 2 хх
ЕЗ х З
Ав ши ш.
Й х ще и зх ще Меч З "ке о й щей ТЕ їз
Хо 5 ї ЖЖ
М в --- о КН що у !
Ї
1
- Ку К
НОМ ва она 24 Кк щи
З ши: ше се Ї. сок - ще в шт т й они В : Ай з
Се ОК и (І) г й Я М їі Бе я : З з ві
Фо Я ї Її Е ї х БЖ | Е Е М ще см. 5 м я ках а х віз гу о щи М ще с ге де мес шк в що г
Ї в ло ї як йо " 1
Т о що вес Шк, Ной я ук 2 щи і г рооююокю.
Ох МН Ач, сю в Б ТУ їх ой зх 55
У с й жд і ех й се є ххх
Кк ще я о ом
Аа щ- хе Ж. Ка ВХ КУ ЕС х хе - ке ту ой я ще а че ЩІ Ж и я З Ха ЩІ - М КУ їі г і зі В г ща ще : не СЕ БЕ Х 1 я й с ее К шк х с тр Не В як СН шк іч в І о Ке й Б М ; ї с З їз й й «М. се: не щем 2 «А с. А Ві
Ще Ми Ще ЗМ - вч її щі Ж, ще Ух
Ех. їв ке З о М М он нс о
А ніс нання "Мн нас о ни
Мн о (Іт) сн. нас
МА о
МН -О яке; жк Ей /
ШЖ-О а: ен
Нм МН МН з 16 і по о ; або ни
Й їз т і НІ о; не і ІЙ сли ї і Й
Ян ! --Фя мін ри ра йо; ; и м, я М На
АХ. Кк и й Є рови ше ; / шо з
НУ і
МА судо ! (п)
Ко
Й жу нано М Сн. не а х
Ко и х я
М і А ко
МН. С | т Шк: що ро ню фо і й І М душе А КЕ - вв сн
Зм "м с у ї Ка мА з бот шо! рих З но З
У деяких варіантах втілення виділена сполука або Раєпізегіпе являє собою ї сх чу я п
Се БУ Й щЕ х й ї Й ж ї ке М и й й М - ун т ку ( Ї а) ї ІЗ хх І КУ 3 х тет их бе Зв в бий бий кий ий Ме: еще: м Ко; вн. а Ей ою Й , се Мне
З Що
Я ї В
ОД я ця як Ши Зм - Ше
З М БУ х би Ой (ПБ) ! Ка х шим КО бот юн «а о оюн мн
Й ям, о щем с я ще й вожея дет, в ке ке ше ее о. туя М бн о в і а і р в ек им : В Н В 7 а м , й 1 го т т : - КІ ке в МЕ вам З їх веж тк й г г Кк ж На з го щ "у Ба щ те ЕФ ЕВ щи
КУ їх ІЗ їх ГУ 3 ц Ух 1 КУ ї ци 3 ше ІЗ їх «3 3 З : ї х ї ГУ хх м Х. М М. що Х Б в я я ке з я Км с по а и а ан а о а а а а
МГУ й: й м сере се В ве й "а жде Зжде жде о с а м вм.
ІЗ )у З а во й ие не НИ ШЕ ие: ПИ З М й
І г ї її й х ГУ Що
Я син Я о кт КЕ У ж ' 1
С У
Зони МНе і
Ї
Ї
Ї сом 3 Й й вих й як й ж сх УК, я хх Бе с шо чя «З ке:
Мине НИ кп з» п п Ме
М М : В М З 1 м і В 3 в Па ї ГУ 3 що У ІЗ КУ ме ї МУ ї г кА 55. Ко МА У ня Я БУ -о КУ о хе хе З КЗ КЗ о Х. о іа п по в В о а і в і р о о і о й о о ке в дк
ЗХ і: т У те "я З о Я Бе ее же же пн нс КУ вно : Х М Н М ГУ Н х М ГУ 7 й МА З 5 що і КУ В
Бе: о М я, -- -е Ка ех . 1
Ге
АХ с їх шт сеї о ї що і і З ї ї І ї к Х. я ре лики, я с, Ко жи тоди хх МО ру
І і У х
Н зи х х і І рій х шт 25 мк шоссе її щи У с
Б ше Ї5У ех КЗ ай ХАтед : З (Пе)
Н Н
: ке бе вою, З це "ву мох 2 кі К ї іх З СЯ Бас щи 4 з Е ГУ
Н Е М ЕН Е ї ї і в В ї ї
У не КУ -х Е х, х. ж. м -- А о у а дже Шон ик, сн, у, мета рек ве ше У я п сер шк ко пон В о не а я о вч ще т з М ше со ее М мМ тих
ІЗ ї ; х ТК ; і н н
Е в що ек М о . 1 тк ЯЗ ще «На
І
ІЗ
: ї
А ї Е І ! х Е я І х
Я ї ї ї А то в Шия ще ве з в: ї ГУ вх
І Со х
В М СЇ і ще і й ту кжюжюжеюююх гх КЕ І ту
Б х я Ж ІЙ сю Беесоюй ( ) ї Н є шк СКУ з я що мк я ЕІ Щеня Ж чу ж ще у о ОМ МН ї Я ї І Ж і ЕІ | А : В с м Ей 5 М ЕЯ ле АЖ, шк ше ши, роя ох шт не о ке КО есе тк, ке с. С Ку в якою, я ко Се ях, соня Кох сх тк м - с щИк: е ник бок беж ях? ня ща Зако х г т те ЩІ че тя тех з их зт Не 13 Ех тт ї хх мк Б вай ная ' 1 ї 3: ГКУ
М я Й -к Ук ВО -
Се ее Я ви Я Мо о меч хіх в ни ; нн ні и п о а п в
Е пу Же Ж з їх ТЕ їх КУ ї ЧУ
В : ЗЕ м ї ВІ : Ні Ж З М ІЇ ши ни: ан А а: а НД і: и НД НН а а СЯ ще я М, ( 9) щ й зе й й за" В З ка ше Ве: ме Ве о со с мВ о ВЕНИ ни ши ше ши и ни ни Є М й 1 - як Н їх
ГУ Се; лечо Що
М ях . 1
Кк х.
ГУ Мн ди
Н ма
У Б Я КА, хе - я - ек ск во са Уч шяж
АН г що зе г: и ШЕ: Ну ее ни пи соми кн М З хе МИ УНН Є Пп
Х. в ЕД У х М М ї Б у З ХЕ ве Яд Дива м п и Я п и де ДІ Я а о со ев сн «
Му й З м те же в бо ше ВЕ ва і п хв ЕС И
Е «ШЕ: НИМ ЗИ: Ми у З ШЕ М Ще г м я хх З в М М
Кх Меч о НКУ
ЗБЕ мая .
ще о тонн, у вч ї «ех т -- Б н
В У з р й
З щи У Сл . о шк
Зер ші (Ії) і м г і і чай Ше Ше вай и ва вчи т во чис ша хх Ж ко вм 5 ! Її М М Й
Н т ре т .
ГКЯ М. в ь х шо о м ше дней Е З і н Я К о ОМ М. Я ІІ)
Ша й що бе тв тв он шН п тих з "в Зк о ве ше й ке сл зв Я мн. і | м М 7
Е сх ре . а ск їх дк ех жк сс -ое ще ни ши ши ші ши ни ме о кн (пю)
МУ їх ї КУ 3 х х Вк Х ТЕ х З ше ши: ни шк и: и ШК ЧЕ го й й м Мк и це
КЕ х А ; або ен М а щ т а ц те З це йе з, о сим че (1) ж ши МИ З В м я Й и І в ен
В інших аспектах даний винахід стосується способу розпізнавання фунгіцидного штаму виду
Раепірасійи5 та/або створення відповідного продукту ферментації. Спосіб включає секвенування Би5А-АЗ у штамі виду РаепірасіШи5 для характеризації варіантної фусарицидинсинтетази та аналізу фунгіцидної активності штаму виду Раепірасійй5. У деяких аспектах Ри5А-АЗ секвенують з застосуванням праймерів на основі однієї або кількох послідовностей, показаних на Фіг. 13 (тобто, 5ЕО ІЮ МО: 1-11). У деяких варіантах втілення перед скринінгом здійснюють вирощування клітин та відбір клітин з однією або кількома такими характеристиками: рівнем фусарицидинів з тирозином або фенілаланіном в амінокислотному залишку (3) (наприклад, ГібОЗа, ГІРОЗБ, ГігОЗс, Гігоза, ГігО7а, ГІБО7Б, ГіБ07с та/або ПІБО7а), який не піддається виявленню або є зниженим порівняно з фусарицидинами, підрахованими у контрольному штамі виду Раеєпібасіїйш5, який містить фусарицидинсинтетазу дикого типу (тобто, експресує функціональну Еи5А-АЗ); та/або підвищеним рівнем Раєепізегіпе (наприклад,
Раепізегіпе Аї та/або Раепізегіпе ВІ) та/або Раєепіргоїїхіп порівняно з підрахованими у контрольному штамі виду Раепірасійй5, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу (тобто, експресує функціональну Ри5А-АЗ).
В одному аспекті даний винахід включає спосіб одержання продукту ферментації з широким спектром протигрибкової активності, причому спосіб включає культивування штаму виду
Раепірасійи5 з варіантною фусарицидинсинтетазою до споруляції.
В іншому варіанті втілення даний винахід стосується способу розпізнавання фунгіцидного штаму виду РаепірасіШйш5 з широким спектром протигрибкової активності, причому спосіб включає: а) секвенування Би5А-АЗ у штамі виду Раєпірасійй5 для характеризації варіантної фусарицидинсинтетази; б) аналіз фунгіцидної активності штаму виду Раєпірасійи5 з варіантною фусарицидинсинтетазою; та в) вибір фунгіцидного штаму виду РаепібасіШи5 як такого, що має широкий спектр протигрибкової активності, якщо штам виду Раєпірасійш5 включає варіантну фусарицидинсинтетазу і демонструє підвищену фунгіцидну активність порівняно з контрольним штамом виду Раепірасійй5, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу. Спосіб також може включати кількісне визначення Раеєпізегіпе та/або Раеєпіргоїїхіп, які продукуються штамом виду Раепібасійй5, та вибір штаму виду Раепірасій5 як такого, що має широкий спектр протигрибкової активності, якщо штам виду Раепірасійш5 продукує підвищений рівень
Раєепізегіпе та/або Раеєпіргоїїхіп порівняно з контрольним штамом виду Раеєпірасійи5, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу. В іншому аспекті спосіб також включає культивування фунгіцидного штаму виду Раепірасійй5 для одержання фунгіцидного продукту ферментації.
В одному варіанті втілення даний винахід стосується способу одержання протигрибкового продукту ферментації, який включає фунгіцидний штам виду Раепірасійни5 з широким спектром протигрибкової активності, причому спосіб включає: а) секвенування Би5А-АЗ у штамі виду
Раепірасій5 для характеризації варіантної фусарицидинсинтетази; б) аналіз фунгіцидної активності штаму виду РаепібасШи5 з варіантною фусарицидинсинтетазою; в) вибір фунгіцидного штаму виду Раепірасій5 як такого, що має широкий спектр протигрибкової активності, якщо штам виду Раепірбасійш5 включає варіантну фусарицидинсинтетазу і демонструє підвищену фунгіцидну активність порівняно з контрольним штамом виду
Раепірасійй5, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу; та г) культивування фунгіцидного штаму виду Раєпібасіїи5 для одержання фунгіцидного продукту ферментації.
У деяких варіантах втілення варіантна фусарицидинсинтетаза включає делецію принаймні одного, принаймні двох, принаймні трьох, принаймні чотирьох, принаймні п'яти, принаймні шести, принаймні семи, принаймні восьми, принаймні дев'яти або всіх десяти амінокислотних залишків, які визначають субстратну специфічність у Ги5А-АЗ. В інших аспектах варіантна
Зо фусарицидинсинтетаза включає делецію у ГизА-АЗ принаймні одного амінокислотного залишку, вибраного з групи, до якої належать Азр235, АІа236, Зег239, ТПг278, І ен299, АІа301, АІа/сІуз322,
МУа1!І330, Суз331, І уз517 та їх комбінації.
Даний винахід також включає способи обробки рослин для боротьби з хворобами рослин шляхом застосування до рослини або частини рослини, такої, як листя, стебла, квітки плоди, коріння або насіння, або внесення у місце росту рослини або частини рослини, наприклад, у грунт, штаму виду Раепірасійи5 МАР В-50972 або його мутантів або їх безклітинних препаратів або їх метаболітів.
При здійсненні способу згідно з винаходом композиція, що містить штам виду Раепірасіи5
МАНІ. В-50972 або його фунгіцидний мутант, може бути застосована до будь-якої рослини або будь-якої частини будь-якої рослини, яку вирощують у будь-якому типі середовищ, яке застосовують для вирощування рослин (наприклад, у грунті, вермикуліті, нарізаному картоні та воді), або наносять на рослини або частини рослин, які вирощують у повітрі, наприклад, орхідеї або платицеріум. Композицію наносять, наприклад, шляхом розбризкування, розпилення, випарювання, розсіювання, опудрювання, поливання, упорскування, окроплення, заливання або окурювання. Як уже було зазначено вище, застосування може здійснюватись у будь-якому потрібному місці, в якому перебуває дана рослина, наприклад, у полі, саду, лісі, на плантації, у розсаднику, на ділянці для органічного вирощування, на газоні та у міському середовищі.
Композиції згідно з даним винаходом можуть бути одержані шляхом культивування штаму виду Раєепірбасійи5 МКМ. В-50972 або фунгіцидного мутанта (штаму), який від нього походить, згідно зі способами, добре відомими спеціалістам у даній галузі, включаючи застосування середовищ та інших способів, описаних нижче у прикладах. До традиційних великомасштабних процесів культивування мікробів належать глибинна ферментація, твердофазна ферментація або рідиннофазне культивування. Ближче до кінця ферментації, з вичерпанням поживних речовин, клітини починають переходити від фази росту до фази споруляції, таким чином, що кінцевий продукт ферментації здебільшого складають спори, метаболіти та залишкове ферментаційне середовище. Споруляція є частиною природного життєвого циклу Раєепірасій5 і зазвичай започатковується клітинами у відповідь на обмеження поживних речовин.
Ферментацію конФігурують таким чином, щоб досягався високий рівень колонієутворюючих одиниць та забезпечувалося сприяння споруляції. Бактеріальні клітини, спори та метаболіти у бо культуральному середовищі, яке утворюється в результаті ферментації, можуть бути використані безпосередньо або концентровані традиційними промисловими способами, такими, як центрифугування, тангенціальна потокова фільтрація, глибинна фільтрація та випарювання.
Композиції згідно з даним винаходом включають продукти ферментації. У деяких варіантах втілення концентрований ферментаційний бульйон промивають, наприклад, з застосуванням процесу діафільтрації, для видалення залишкового ферментаційного бульйону та метаболітів. У контексті цього опису термін "концентрат бульйону" стосується суцільного бульйону (ферментаційного бульйону), який було концентровано традиційними промисловими способами, як описано вище, але він залишається у рідкій формі. Термін "ферментаційна тверда речовина" у контексті цього опису означає твердий матеріал, який залишається після висушування ферментаційного бульйону. Термін "продукт ферментації" у контексті цього опису стосується суцільного бульйону, концентрату бульйону та/або твердих продуктів ферментації.
Композиції згідно з даним винаходом включають продукти ферментації.
Ферментаційний бульйон або концентрат бульйону висушують з додаванням або без додавання носіїв з застосуванням традиційних процесів висушування або таких способів, як висушування розпиленням, висушування заморожуванням, висушування на лотоках, висушування у псевдорозрідженому шарі, висушування у барабанній сушарці або випарювання.
Утворені в результаті сухі продукти можуть піддаватися подальшій обробці, такій, як перемелювання або грануляція, для досягнення конкретного розміру частинок або фізичного формату. Після висушування також можуть додаватись описані нижче носії.
Безклітинні препарати ферментаційного бульйону штамів згідно з даним винаходом можуть бути одержані у будь-який спосіб, відомий спеціалістам у даній галузі, такий, як екстракція, центрифугування та/або фільтрація ферментаційного бульйону. Спеціалістам у даній галузі стане зрозуміло, що так свані безклітинні композиції можуть не бути позбавлені клітин, а бути здебільшого безклітинними або практично безклітинними, залежно від технології (наприклад, швидкості центрифугування), застосовуваної для видалення клітин. Утворений в результаті безклітинний препарат може бути підданий висушуванню та/або рецептуванню з компонентами, які сприяють його застосуванню до рослин або середовищ росту рослин. Способи концентрування та висушування, описані вище для ферментаційного бульйону також можуть бути застосовані для безклітинних препаратів.
Зо В одному варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 107 колонієутворюючих одиниць (КУС) мікроорганізму (наприклад, штаму виду Раепірасійи5 МАК.
В-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)/мл бульйону. В іншому варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 105 колонієутворюючих одиниць (КУО) мікроорганізму (наприклад, штаму виду Раєпірасіййи5 МАК 8-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)мл бульйону. В іншому варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 105 КУО мікроорганізму (наприклад, штаму виду Раєпірбасійи5 МЕРІ. В- 50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)/мл бульйону. У ще одному варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 107 КУО мікроорганізму (наприклад, штаму виду Раєпірасійй5 МАК. В-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)/мл бульйону.
В іншому варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 108 КУО мікроорганізму (наприклад, штаму виду Раєпірасіййи5 МАК 8-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)мл бульйону. В іншому варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 109 КУО мікроорганізму (наприклад, штаму виду РаєпірасйШи5 МЕКІ. В- 50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)/мл бульйону. В іншому варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 1010 КУО мікроорганізму (наприклад, штаму виду Раєпірасійи5 МАК. В-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)/мл бульйону.
В іншому варіанті втілення продукт ферментації включає принаймні приблизно 1 х 10" КУО мікроорганізму (наприклад, штаму виду Раепірасійй5 МАК 8-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму)/мл бульйону.
Композиції згідно з винаходом можуть застосовуватись як такі або, залежно від їх конкретних фізичних та/або хімічних властивостей, у формі їх рецептур або приготовлених з них форм для застосування, таких, як аерозолі, суспензії для капсул, концентрати для холодного розпилення, концентрати для теплого розпилення, гранули у капсулах, тонкодисперсні гранули, текучі концентрати для обробки насіння, готові для застосування розчини, розпилювані порошки, емульговані концентрати, емульсії "олія у воді", емульсії "вода в олії", макрогранули, мікрогранули, дисперговані в олії порошки, змішувані з олією текучі концентрати, змішувані з олією рідини, газ (під тиском), газогенеруючий продукт, піни, пасти, вкрите пестицидами насіння, концентрати суспензій, олійна дисперсія, суспоемульсійні концентрати, розчинні концентрати, суспензії, змочувані порошки, розчинні порошки, дусти та гранули, водорозчинні та дисперговані 60 у воді гранули або таблетки, водорозчинні та дисперговані у воді порошки для обробки насіння,
змочувані порошки, природні продукти та синтетичні речовини, просочені активним інгредієнтом, а також мікроінкапсуляції у полімерних речовинах та у матеріалах покриття для насіння, а також УЛВ-композиції холодного розпилення та теплого розпилення.
У деяких варіантах втілення композиції згідно з винаходом є рідкими композиціями.
Необмежувальними прикладами рідких композицій є концентровані суспензії та олійні дисперсії.
В інших варіантах втілення композиції згідно з винаходом є твердими композиціями.
Необмежувальними прикладами рідких композицій можуть бути висушені заморожуванням порошки та висушені розпиленням порошки.
Композиції згідно з даним винаходом можуть включати інертні компоненти для рецептування, які додають до композицій, що включають клітини, безклітинних препаратів або метаболітів для поліпшення ефективності, стійкості та придатності до використання і/або для полегшення обробки, пакування та кінцевого застосування. До таких інертних компонентів та інгредієнтів для рецептування можуть належати носії, стабілізатори, поживні речовини або модифікатори фізичних властивостей, які можуть додаватись окремо або у комбінації. У деяких варіантах втілення носії можуть включати рідкі матеріали, такі, як вода, олія та інші органічні або неорганічні розчинники, та тверді матеріали, такі, як мінерали, полімери або полімерні комплекси, одержані біологічно або шляхом хімічного синтезу. У деяких варіантах втілення носієм є зв'язувальна речовина або адгезив, що сприяє прилипанню композиції до частини рослини, такої, як насіння або коріння. Див., наприклад, (Тауог, А.Сї., єї аЇ., "Сопсерів апа
ТесНпоіодіеє ої 5еїІесієй беей Тгєаїйтепів", Аппи. Нем. РПуїораїйої. 28: 321-339 (1990)). До стабілізаторів можуть належати засоби проти грудкування, антиоксиданти, сикативи, протравлювачі або консерванти. До поживних речовин можуть належати джерела вуглецю, азоту та фосфору, такі, як цукри, полісахариди, олія, білки, амінокислоти, жирні кислоти та фосфати. До модифікаторів фізичних властивостей можуть належати об'ємоутворювальні агенти, змочувальні агенти, загусники, модифікатори рН, модифікатори реологічних властивостей, диспергатори, ад'юванти, поверхнево-активні речовини, антифризи або барвники. У деяких варіантах втілення композиція, яка включає клітини, безклітинний препарат або метаболіти, одержані шляхом ферментації, можуть застосовуватися безпосередньо з водою як розріджувачем або без неї і без подальшого приготування композиції. У деяких
Зо варіантах втілення інертні компоненти для рецептування додають після концентрування ферментаційного бульйону й під час та/або після висушування.
Усі рослини та частини рослин можуть піддаватись обробці згідно з винаходом. У даному контексті під рослинами слід розуміти всі рослини та популяції рослин, такі, як бажані та небажані дикі рослини або культурні рослини (включаючи природні культурні рослини).
Культурними рослинами можуть бути рослини, які можуть бути одержані з застосуванням традиційних способів селекції та оптимізації або біотехнологічних та рекомбінантних способів або комбінацій цих способів, включаючи трансгенні рослини та сорти рослин, які можуть або не можуть бути захищені Правами рослинників-селекціонерів. Під частинами рослин слід розуміти всі надземні та підземні частини та органи рослин, такі, як пагони, листя, квітки та коріння, прикладами яких можуть бути листя, хвоя, ніжки, стебла, квітки, плодові тіла, плоди та насіння, а також коріння, бульбоплоди та кореневища. До частин рослин також належить вирощений матеріал і матеріал вегетативного та генеративного розмноження, наприклад, живці, бульбоплоди, кореневища, пагони та насіння.
Як уже було згадано вище, усі рослини та їхні частини можуть піддаватись обробці згідно з винаходом. В оптимальному варіанті втілення обробці піддають види та сорти рослин та їхні частини, які ростуть у диких умовах, або які одержують традиційними способами біологічної селекції, такими, як гібридизація або злиття протопластів. В іншому оптимальному варіанті втілення обробці піддають трансгенні рослини та сорти рослин, які було одержано рекомбінантними способами, у разі доцільності - у комбінації з традиційними способами (генетично модифіковані організми) та їхні частини. Термін "частини" або "частини рослин" пояснювався вище. Згідно з винаходом, особливу перевагу віддають рослинам сортів, які у кожному разі є доступними через торгову мережу або перебувають у використанні. Під сортами рослин слід розуміти рослини з новими властивостями, які було виведено шляхом традиційної селекції, шляхом мутагенезу або з застосуванням технологій рекомбінантних ДНК. Вони можуть набувати форми сортів, різновидів, біотипів та генотипів.
Обробку рослин та частин рослин композиціями згідно з винаходом здійснюють безпосередньо або шляхом впливу на середовище, ареал або місце зберігання з застосуванням традиційних способів обробки, наприклад, шляхом занурення, розбризкування, розпилення, напилення, випарювання, опудрювання, дрібнокрапельного обприскування, 60 розсіювання, спінювання, нанесення пензлем, розкидання, упорскування, просочування,
струменевого зрошення та, у разі матеріалу для розмноження, зокрема, у разі насіння, а саме при здійсненні способів сухого протруювання насіння, мокрого протруювання насіння, напівсухого протруювання спосіб, інкрустації, вкривання одним або кількома шарами покриття і т. ін. Крім того, існує можливість нанесення активних речовин з застосуванням способу ультрамалооб'ємного обприскування або упорскування композиції активної речовини або самої активної речовини у грунт.
Оптимальним способом безпосередньої обробки рослин є нанесення на листя, тобто, композиції згідно з винаходом наносять прямо на листя, причому існує можливість регулювання частоти обробки та норми внесення відповідно до ступеня інфікування даним патогеном.
У разі системно активних сполук композиції згідно з винаходом досягають рослини через кореневу систему. У цьому разі обробку рослин здійснюють, дозволяючи композиціям згідно з винаходом діяти на середовище рослини. Це може здійснюватися, наприклад, шляхом просочування, включення у грунт або розчин поживних речовин, тобто, місце росту рослини (наприклад, грунт або гідропонічні системи) просочують рідкою формою композицій згідно з винаходом, або внесення у грунт, тобто, композиції згідно з винаходом включають у місце росту рослин у твердій формі (наприклад, у формі гранул). У разі рисових культур це також може здійснюватися шляхом внесення відміряної кількості композицій згідно з винаходом у залитий рисовий чек у твердій формі (наприклад, у формі гранул).
Оптимальними рослинами є рослини з групи корисних рослин, декоративних рослин, дернових рослин, звичайних дерев, які використовують як декоративні рослини у громадському та побутовому секторах, та лісових дерев. До лісових дерев належать дерева для виробництва лісоматеріалу, целюлози, паперу та продуктів, які виробляють з частин дерев.
Термін "корисні рослини" у контексті цього опису стосується культурних рослин, які застосовують для одержання продуктів харчування, кормів, палива або для промислових цілей.
До корисних рослин, які можуть бути піддані обробці та/"або поліпшенню з застосуванням композицій та способів згідно з даним винаходом, належать, наприклад, такі типи рослин: дернові рослини, виноград, злаки, наприклад, пшениця, ячмінь, жито, овес, рис, кукурудза та просо / сорго; буряк, наприклад, цукровий буряк та кормовий буряк; плодові рослини, наприклад, зерняткові плоди, кісточкові плоди та соковиті плоди, наприклад, яблуні, груші,
Зо сливи, персики, мигдаль, вишні та ягоди, наприклад, полуниця, малина, ожина; бобові, наприклад, квасоля, сочевиця, горох та соя; олійні культури, наприклад, олійний рапс, гірчиця, мак, оливки, соняшник, кокос, рицина, какао та арахіс; гарбузи або кабачки, огірки та дині; волокнисті рослини, наприклад, бавовна, льон, коноплі та джут; цитрусові плоди, наприклад, апельсини, лимони, грейпфрути та мандарини; овочеві культури, наприклад, шпинат, салат, спаржа, види капусти, морква, цибуля, томати, картопля та болгарський перець; лаврові, наприклад, авокадо, кориця, камфора або інші рослини, такі, як тютюн, горіхи, кава, баклажан, цукрова тростина, чай, перець, виноград, хміль, банани, каучуконосні рослини та декоративні рослини, наприклад, квіткові рослини, чагарники, листопадні дерева та хвойні дерева. Цей перелік є необмеженим.
Зазначені нижче рослини вважаються особливо придатними як цільові культури для застосування композицій та способів згідно з даним винаходом: бавовна, баклажан, дернові рослини, зерняткові плоди, кісточкові плоди, соковиті плоди, кукурудза, пшениця, ячмінь, огірки, тютюн, виноград, рис, злаки, горох, квасоля, соя, олійний рапс, томати, болгарський перець, дині, капуста, картопля та яблуня.
Прикладами дерев, які можуть бути поліпшені з застосуванням способу згідно з винаходом, можуть бути: Абрієз5 5р., Еисаїуріи5 5р., Рісеа 5р., Ріпив 5р., Аезсціив5 5р., Ріаїапив в5р., Тіїа 5р.,
Асег в5р., Т5цда 5р., Егахіпив 5р., Зогрив звр., Веїшціа 5р., Стаїаєдив 5р., ШІтив в5р., Оцегсив вр.,
Еадиз 5р., Заїїх в5р., Роршив» в5р.
Оптимальними деревами, які можуть бути поліпшені з застосуванням способу згідно з винаходом, є представники видів дерев Аезсціи5: А. пірросазіапит, А. рагійога, А. сагпеа; представники видів дерев Ріаїапивх: Р. асегіпйога, Р. оссідепіаїї5, Р. гасетоза; представники видів дерев Рісеєа: Р. аріє5; представники видів дерев Ріпив: Р. гадіава, Р. ропдегоза, Р. сопіопа, Р. вуїмезіге, Р. еїПоції, Р. топіесоїа, Р. аїБісаціїє, Р. гевзіпоза, Р. раївій5, Р. їаєда, Р. Лехіїїв, Р. )епгеді, Р. ракзіапа, Р. 5ігори5; представники видів дерев Еисаїуріи5: Е. дгапаї5, Е. діоршив5, Е. сатадепіїв, Е. пітеп5, Е. обіїдца, Е. гедпапв, Е. ріїшіагив.
Особливу перевагу серед дерев, які можуть бути поліпшені з застосуванням способу згідно з винаходом, віддають таким представникам видів дерев, як Ріпив: Р. гадіайа, Р. ропаегоза, Р. сопюгіа, Р. зуїмевзіге, Р. вігориз; представникам видів дерев ЕЄисаїуріи5: Е. дгапаї5, Е. діобшиив5, Е. сатадепіїв. 60 Найбільшу перевагу серед дерев, які можуть бути поліпшені з застосуванням способу згідно з винаходом, віддають таким видам, як кінський каштан, платан, липа, клен.
Даний винахід також може застосовуватися для будь-яких дернових трав, включаючи холодостійкі дернові трави та теплолюбні дернові трави. Прикладами холодостійких дернових трав можуть бути тонконіг (Роа 5рр.), такий, як тонконіг луговий (Роа ргаїепвів І.), тонконіг звичайний (Роа Ігіміайі5 І.), тонконіг сплющений (Роа сотргезза І/.), тонконіг однорічний (Роа аппиа Г.), тонконіг гайовий (Роа діаисапійа Сашцайп), тонконіг лісовий (Роа петогаїї5 І.) та тонконіг бульбистий (Роа риїбоза І.); мітлиці (Аадгобвії5 5рр.), такі, як мітлиця болотна (Адговії5 раїшвігіє Ниа5з.), мітлиця тонка (Адгобії5 їепиі5 5іБІй.), мітлиця собача (Адговії5 сапіпа ІГ.),, південнонімецька змішана мітлиця (види Адговії5, включаючи Ааговії5 їепиі5 ЗІБІЙ., Адговіі5 сапіпа Г. та Адговії5 раїшивігіз Ниа5.) та польовиця (Адгозвіїз аїБа І.);
Костриці (РГезїиса 5рр.), такі, як костриця червона (Ревіийса гибга І., види гибга), костриця повзуча (Резіиса гибга Г.), костриця червона мінлива (Резішса гибга соттшага саца.), костриця овеча (Резшса оміпа І.), костриця жорсткувата (Ревіиса Іопойоїйа Тпий!.), костриця аметистова (Гезіиси сарійава Гат.), костриця очеретяна (Ревішса агипаіпасеа Зспгер.) та костриця лугова (Резшса еїапог І.); пажитниці (ІГоїЇйшт 5рр.), такі, як пажитниця багатоквіткова (І от птиййогит іат.), пажитниця багаторічна (І оїїшт регеппе І.) та пажитниця італійська (І оЇїшт тикШогит ГГ ат.); та житняки (Адгоругоп 5рр.), такий, як житняк гребінчастий (Адгоругоп сгібїайт (І.) саегіп.), житняк пустельний (Адгоругоп дезепогит (Рібзсп.) ЗсСпий.) та житняк Сміта (Адгоругоп 5тйпії
Вуаб.)
Прикладами інших холодостійких дернових трав є амофіли (Атторпійа Бгеміїдчіага Регп.), стоколос безостий (Вготи5 іпегтів І еуз5.), рогозові, такі, як тимофіївка (РпІешт ргаїепзе І.), типофіївка тіщана (РпІешт зибриЇайшт /.), грястиця збірна (Сасіуїіє діотегаїа І.), покісниця розставлена (Риссіпеїа дієтапз (І...) Раїї.) та гребінник звичайний (Супозиги5 сгієтацив 1.)
Прикладами теплолюбних дернових трав є бермудська трава (Суподоп 5рр. ЇЇ. С. Кісп), цойсія (2о0узіа 5рр. УМІа.), августинова трава (5іепоїарпгит зесипдашт Умаїї Кипі7е), еремохлоя змієхвоста (Егетоспіса орпіигоїде5 Мипго Наск.), аксонопус афінський (Ахопоризх айіпіз Спавзе), гречка помітна (Разраїшт поїайт Рісдде), кікуйя (Реппізешт сіапаевііпит НосНві. ех СпПіоу.), бізонова трава (Виспіоеє дасіуїоїд5 (Мий.) Епдеїт.), грамова трава (Вошціейоца дгасіїї5 (Н.В.К.) І ад.
Зо ех Сгінйн5), паспалум піхвовий (Разраїшт мадіпайшт Змагі7) та бутелоуа коротконизхідна (Вошеїоцча сигіїрепашіа (Міспх. Тоїт.). Зазвичай холодостійким дерновим травам віддають перевагу згідно з винаходом. Особливу перевагу віддають таким рослинам, як тонконіг, мітлиця та польовиця, костриці та пажитниці. Особливу перевагу віддають мітлиці.
Композиції згідно з винаходом мають потужну мікробіцидну активність і можуть застосовуватися для боротьби з небажаними мікроорганізмами, такими, як грибки та бактерії, для захисту культур та захисту матеріалів.
Винахід також стосується способу боротьби з небажаними мікроорганізмами, який характеризується тим, що композиції згідно з винаходом застосовують до фітопатогенних грибів, фітопатогенних бактерій та/або їхнього середовища.
Фунгіциди застосовують для захисту культур у боротьбі з фітопатогенними грибами. Вони характеризуються чудовою ефективністю проти широкого спектра фітопатогенних грибів, включаючи грунтові патогени, які є конкретними представниками класів Ріазтодіорпоготусегїев,
Регопозроготусеїєз (бБуп. Ооміцети), СНуїйідіотусеїе5, 7удотусеїе5, Авзсотусеїев5,
Вазідіотусеїез та Оешіеготусеїе5з (синонім ЕРипді ітрегіесії). Деякі фунгіциди є системно активними і можуть застосовуватися для захисту рослин як фунгіцид для обробки листя, протруювання насіння або внесення у грунт. Крім того, вони є прийнятними для боротьби з грибками, які, крім іншого, уражують деревину або коріння рослин.
Бактерициди застосовують для захисту культур у боротьбі з Рвзейдотопадасеає,
ВПі2обіасеає, Епіегобасієгіасєає, Согуперасієїасєає та 5ігеріотусеїасеав.
Необмежувальними прикладами патогенів грибкових захворювань, які піддаються лікуванню згідно з винаходом, можуть бути: хвороби, викликані патогенами справжньої борошнистої роси, наприклад, видів Віштегіа, наприклад, Віштегіа дгатіпіє; видів Родозрпаєга, наприклад, Родозрпаєга Іеисоїісна; видів
Зрпаєтоїпеса, наприклад, 5рпаєгоїнеса Шіїдіпєеа; видів Опсіпиа, наприклад, Опсіпціа песапог; хвороби, викликані патогенами захворювання інші, наприклад, видів Сбутпозрогапаіт, наприклад, Сутпозрогапдійшт забіпає; видів Нетіїєїа, наприклад, Нетіїєїа мавіайіх; видів
РпаКорзога, наприклад, РІПакорзога распуігі та РІаКорзога теіротіає; видів Риссіпіа, наприклад, Риссіпіа гесопайє, Р. іп йісіпа, Р. дгатіпіз або Р. вігітогтіє; видів ШОготусев, наприклад, Оготусез аррепаїісшатив; 60 хвороби, викликані патогенами з групи, до якої належать ооміцети, наприклад, видів АІБридо,
наприклад, АЇдиро сапаіїда; видів Вгєтіа, наприклад, Вгетіа Іасіисає; видів Регопозрога, наприклад, Регопозрога різі або Р. Бгаззісає; видів фітофтор, наприклад, Рпуїорнінога іп'езіапв; видів Ріазторага, наприклад, Ріазторага мійсоіїа; видів Реейдорегопозрога, наприклад,
Резєндорегопозрога пити або Реєцдорегопозрога сибрепвів; видів пітіозної кореневої гнилі, наприклад, Руїпійт иПітит; хвороби плямистості листя та хвороби вілту листя, викликані, наприклад, видами АПегпагіа, наприклад, Айетага зоЇапії видами Сегсозрога, наприклад, Сегсозрога бБеїїсоЇїа; видами
СіІадіозрогішт, наприклад, Сіадіоврогішт сиситегіпит; видами СосНіоБоЇш5, наприклад,
Соспіороїшє займи5 (форма конідій: ЮОгесп5іега, синонім: Неїтіпі(позрогішт), СоспіобоЇи5 тіуабеапиє; видами СоїІеїоїгіспит, наприклад, СоППейфїйіснит ІІпдетиїШйапішт; видами
Сусіосопішт, наприклад, Сусіосопішт оІєадіпит; видами Ріаропне, наприклад, Оіаропне сіні; видами ЕїІвіпое, наприклад, ЕІвіпое Там/сейії; видами Сіоєозропйцт, наприклад, Сщіоєвозрогійт
Іаєїйсоїог; видами СіотегеїЇа, наприклад, СіотегеПа сіпдшіайа; видами Сшпідпагаїа, наприклад,
Сиідпагайа бБідмеїїї; видами Іеріозрнаєгтіа, наприклад, І еріозрпаєтіа тасшціапв5, І еріозрНнаєтіа подогит; видами Мадпаропйе, наприклад, Мадпаропне дгізеа; видами Маг55опіа, наприклад,
Магезопіа согопагіа; видами Містодоспішт, наприклад, Містодоспішт пімаіє; видами
МусозрпаєгеїїІа, наприклад, МусозрНаєгеїїа дгатіпісоїа, М. агаспідісоїа та М. йіепвіб; видами
Рпаєозрпаєта, наприклад, РПаєозрпаєта подогит; видами Ругепорпога, наприклад,
Ругепорнога іеге5, Ругепорпога іпйісі герепіїз; видами Натишиіагіа, наприклад, Натшіага соїо- судпі, Натшіага агеоїа; видами Апупспозрогпцт, наприклад, Апупспозрогіцт 5есаїїв5; видами зеріогіа, наприклад, Зеріогіа арії, Зеріога Іусорегвзі; видами Турпша, наприклад, Турпша іпсатаїйа; видами Мепішіа, наприклад, Мепішгіа іпаедпиаїв; хвороби коріння та стебел, викликані, наприклад, видами Согпісішт, наприклад, Сопісійт дгатіпеагит; видами Ризагішт, наприклад, Ризагішт охузрогит; видами Саєиштаппотусев, наприклад, Ссавеиштаппотусез агатіпіє; видами ВПі2осіопіа, такими, як, наприклад, ВНігосіопіа 5зоЇапі; хвороби бЗагосіадішт, викликані, наприклад, Загосіадіит огулає; хвороби 5сієгоїййт, викликані, наприклад, бсіегоїшт огугає; видами Тарезіа, наприклад, Тарезіа асшогтів; видами
Тпівіаміорвзі5, наприклад, ПпієЇїаміорвзів равісоїа; хвороби колосся та волоті (включаючи качани кукурудзи), викликані, наприклад, видами
Аепагіа, наприклад, АГегпагіа 5рр.; видами Азрегдін5, наприклад, Азрегайив5 Памиб5; видами
Сіадозрогійт, наприклад, Сіадозрогійт сіадозрогіоїде5; видами Сіамісерв5, наприклад, Сіамісерв ригритєа; видами Еизагішт, наприклад, Еивагішт сиітогит; видами сСіррегеїїа, наприклад, сиіррегеНа 2есеає; видами Моподгарпеїйа, наприклад, Моподгарпеїа пімаїїє; видами зеріогіа, наприклад, берюїга подогит; хвороби, викликані сажковими грибами, наприклад, видів брпасеіоїпеса, наприклад,
ЗрпасеЇоїпеса геїйапа; видів ТіПейа, наприклад, ПіПейа сагієб5, ГТ. сопігомегза; видів Огосузіїв, наприклад, Огосувії5 оссина; видів Об5іадо, наприклад, О5цадо пида, 0. пида іийсі; плодова гниль, викликана, наприклад, видами Азрегойив5, наприклад, АврегайШив Памив; видами Воїгуїї5, наприклад, Воїгуїї5 сіпегеа; видами Репісійшт, наприклад, РепісйШит ехрапзит та Р. ригтритодепит; видами осіегоїїпіа, наприклад, 5сіегоїїпіа зсієгоїогит; видами Мепісійт, наприклад, Мепісійшт аіІроаїгит;
Пов'язані з цвіллю, вілтом, гниллю та виляганням хвороби, які передаються через насіння та грунт і викликаються, наприклад, видами АЦегпагіа, викликаються, наприклад, АКегпагіа ргазвзісісоїа; видами Арпапотусев5, викликаються, наприклад, Арпапотусевз ешеіспе5; видами
Авсоспуїа, викликаються, наприклад, АвзсосПпуїа Іепіїх; видами Азрегадіїйи5, викликаються, наприклад, Азрегдйй5 Яйами5; видами Сіадозрогішт, викликаються, наприклад, Сіадозрогійт
Ппеграгит; видами СоспПіороЇш5, викликаються, наприклад, Соспіїороїи5 5аїїми5; (форма конідії:
ЮОгеспзіега, Віроїагі5, синонім: НеїЇтіпіпозрогішт); видами СоїПейоїйгіспут, викликаються, наприклад, СоППейоїгіспит соссодеб5; видами Ризагішт, викликаються, наприклад, Еизагійт сцітогит; видами СірбегеїЇїа, викликаються, наприклад, СіррегеїІйа геає; видами Масгорпотіпа, викликаються, наприклад, Масгорпотіпа рНпазеоїїпа; видами Моподгарпеїйа, викликаються, наприклад, Моподгарпейа пімаїї5; видами Репісійшт, викликаються, наприклад, Репісшит ехрапзит; видами РІПота, викликаються, наприклад, Рота Іпдат; видами РПіоторвів, викликаються, наприклад, Рпоторзіз зоздае; видами РНуїорпїпога, викликаються, наприклад,
Рпуїорпїтога сасіогит; видами Ругепорпога, викликаються, наприклад, Ругепорпога дгатіпеа; видами Ругісціагіа, викликаються, наприклад, Ругісціагіа огулає; видами Руїпішт, викликаються, наприклад, Руїйішт иКітит; видами ВНігосюпіа, викликаються, наприклад, КПі2осіопіа 501апі; видами НПі2ори5, викликаються, наприклад, Кпігорих5 огулае; видами 5сієгоїйШт, викликаються, наприклад, 5сіегоїйцт гоїї5іїї видами 5беріогіа, викликаються, наприклад, Зеріогіа подогит; 60 видами Турпшіа, викликаються, наприклад, Турпша іпсагпага; видами МепісіПит, викликаються,
наприклад, Мепісійшт аапііає; пухлини, гали та відьмині мітли, викликані, наприклад, видами Месійа, наприклад, Месійа даїПпдепа; хвороби вілту, викликані, наприклад, видами Мопіїпіа, наприклад, Мопіїїпіа Іаха; хвороби пухирчастості листя або курчавості листя, викликані, наприклад, видами
Ехобразідіит, наприклад, Ехобавзіаіит мехапв; видами Тарнгіпа, наприклад, Тарнгіпа детогтапв; пов'язані з ослабленням деревних рослин хвороби, викликані, наприклад, хворобою еска, викликані, наприклад, РпаетопієЇйа сіатудозрога, Рпаєоастетопішт аІеорпішт та ЕРотіїрогіа теаіїїєтапеа; еутипоз, викликаний, наприклад, Ешура Іайїа; хвороби генодерма, викликані, наприклад, Саподегта бБопіпепхе; хвороби Кідідороги5, викликані, наприклад, Рідідороги5
Ідпо5ивб; хвороби квіток та насіння, викликані, наприклад, видами Воїгуїі5, наприклад, Воїгуїі5 сіпегєа; хвороби бульбоплодів рослин, викликані, наприклад, видами КПігосіопіа, наприклад,
Впі2осіопіа 5оЇапі; видами Неїтіпіпозрогійт, наприклад, НеІтіпіпозрогіит 5оїапі;
Кіла хрестоцвітних, викликана, наприклад, видами Ріазтодіорпога, наприклад,
Ріатоаіорнога Бгазвісав; хвороби, викликані бактеріальними патогенами, наприклад, видами ХапіпотопаФ, наприклад, Хапіпотопах сатрезвігіз ру. огугає; видами Рзхепдотопавх, наприклад, Рхзендотопав зугіпдає ру. Іаспгутапв; видами Егміпіа, наприклад, Егміпіа атуомога.
Переважно контролюють нижчезазначені хвороби сої:
Грибкові захворювання листя, стебел, стручків та насіння, викликані, наприклад, плямистістю листя АКегпагіа (АйПегпагпа 5рес. аїгап5 іепиівзвіта), Апіпгаспозе (СоїІефтіснит діоєозрогоїде5 детайит маг. ігипсашт), бурою плямистістю (Зеріогіа діусіпе5), церкоспорозною плямистістю та пошкодженням листя (Сегсоврога Кікиспії), викликаною хоанефорою плямистістю листя (Споапернога іпішпаїриійега ізрога (Зуп.)), викликаною дактуліофорою плямистістю листя (ЮОасішіорпога діусіпе5), псевдоборошнистою росою (Регопозрога тапвпшгіса), плямистістю Дрехслера (Огеспзіега діусіпі), селеноморфозною плямистістю листя (Сегсозрога 5оііпа), викликаною лептосферуліною плямистістю листя (І еріозрпаєтиїїйпа іпіоїїї),
Зо філостиктозною плямистістю листя (РПуїовіїсіа зо|аесоїіа), гниллю бобів та стебел (Рпоторвів 5о|іає), справжньою борошнистою росою (Містозрпаєта айва), викликаною піренохетою плямистістю листя (Ругепоспаєїа діусіпе5), ризоктоніозом надземних частин та листя (ВНігосюпіа 5оїапі), іржею (РпаКорзога распугтнігі, РнаКорзога теіротіає), паршею (5рпасеїота діусіпе5), стемфіліозом (5іетрНпуїййт Боїуовит), мішенеподібною плямистістю листя (Согупезрога савззіїсоїа).
Грибкові захворювання коріння та основ стебел, викликані, наприклад, чорною кореневою гниллю (Саіопесігйа сгоїаіагає), вугільною гниллю (Масторпотіпа рНазеоїїпа), фузаріозною гниллю або в'яненням, кореневою гниллю та гниллю бобів та гілок (Ризапйцт охузрогит,
Еизатпцт оппосегав, Ривзагцт 5етіїесішт, Ривзалпцт едиїібеїї), викликаною міколептодискусом кореневою гниллю (МусоіІеріодібзсив Іеїтевігів), неокосмоспорою (Меосозтозрога мавіптесіа), гниллю бобів та стебел (Оіаропне рпазеоіогит), стебловим раком (Оіаропне рпазеоіогит маг. саціїмога), фітофторозом (Рпуїорпійога тедавзрепта), бурою гниллю стебел (РНіаіорнога дгедаїа), грибною гниллю (Руїйпішт арпапідептатшт, Руїйпішт імтедшіаге, Руїпішт дерагуапит,
Рукішт тугіоїуїшт, Руїйішт ийітит), ризоктоніозною кореневою гниллю, гниллю стебел та виляганням (НАПіг2осіопіа зоїапі), склероціальною гниллю стебел (Зсієгоїїпіа зсіеговйогит), південною склероціальною гниллю (5сієгоїїпіа гоїївії), викликаною тієлавіопсисом кореневою гниллю (ТПівіаміорвзів равісоїа).
Фунгіцидні композиції згідно з винаходом застосовують для лікувального або захисного / профілактичного контролю над фітопатогенними грибами. Отже, винахід також стосується лікувальних та захисних способів для боротьби з фітопатогенними грибами шляхом застосування композицій згідно з винаходом, які застосовують до насіння, рослини або частин рослини, плодів або грунту, в якому вирощують рослину.
Той факт, що композиції добре переносяться рослинами у концентрації, що вимагається для контролю над хворобами рослин, дозволяє обробляти надземні частини рослин, матеріал для розмноження та насіння, а також грунт.
Згідно з винаходом, обробці піддаються всі рослини та частини рослин, включаючи різновиди та сорти рослин (незалежно від того, чи захищені вони законами про охорону сортів або захист прав селекціонерів). Різновиди та сорти рослин можуть бути рослинами, одержаними традиційними способами розмноження та селекції, яким можуть сприяти або які бо можуть супроводжувати один або кілька біотехнологічних способів, таких, як застосування подвійних гаплоїдів, злиття протопластів, випадковий та спрямований мутагенез, молекулярні або генетичні маркери, або способами біоінженерії та генної інженерії способи.
У деяких аспектах композиції згідно з даним винаходом застосовують у кількості від приблизно 1 х 108 до приблизно 1 х 1077 колонієутворюючих одиниць (КУО) фунгіцидного штаму виду Раепірасійй5 МЕ! В-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму на гектар. В інших аспектах композиції згідно з даним винаходом застосовують у кількості від приблизно 1 х 109 до приблизно 1 х 1073 колонієутворюючих одиниць (КУО) фунгіцидного штаму виду Раепірасійи5
МАНІ. В-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму на гектар. В інших аспектах композиції згідно з даним винаходом застосовують у кількості від приблизно 1 х 1079 до приблизно 1 х 1072 колонієутворюючих одиниць (КУС) фунгіцидного штаму виду Раепібасійш5 МЕКІ В-50972 або його фунгіцидного мутантного штаму на гектар.
У деяких варіантах втілення композиції згідно з даним винаходом застосовують у кількості від приблизно 0,1 кг до приблизно 10 кг твердих продуктів ферментації на гектар. В інших варіантах втілення композиції згідно з даним винаходом застосовують у кількості від приблизно 0,25 кг до приблизно 7,5 кг твердих продуктів ферментації на гектар. В інших варіантах втілення композиції згідно з даним винаходом застосовують у кількості від приблизно 0,5 кг до приблизно 5 кг твердих продуктів ферментації на гектар. Композиції згідно з даним винаходом також можуть застосовуватись у кількості приблизно 1 кг або приблизно 2 кг твердих продуктів ферментації на гектар.
Композиції згідно з винаходом, якщо вони добре переносяться рослинами, мають сприятливу гомеотермну токсичність і добре переносяться середовищем, є придатними для захисту рослин та органів рослин, для підвищення врожайності, для поліпшення якості зібраного матеріалу. В оптимальному варіанті вони можуть застосовуватись як композиції для захисту культур. Вони є активними проти нормально чутливих та резистентних видів і проти всіх або деяких стадій розвитку.
До рослин, які можуть піддаватись обробці згідно з винаходом, належать такі основні культурні рослини: кукурудза, соя, люцерна, бавовна, соняшник, олійні культури Вгазвіса, такі, як Вгаззіса пари5 (наприклад, канола, рапс), Вгаззіса гара, В. |шпсеа (наприклад, гірчиця(польова)) та види Вгазв5іса сагіпайа, Агесасеає (наприклад, олійна пальма, кокос), рис,
Зо пшениця, цукровий буряк, цукрова тростина, овес, жито, ячмінь, просо та сорго, тритикале, льон, горіхи, різні сорти винограду і різні фруктові та овочеві культури з різних ботанічних таксонів, наприклад, видів Козасеає (наприклад, зерняткові плодові культури, такі, як яблуні та груші, а також кісточкові плодові культури, такі, як абрикоси, вишня, мигдаль, сливи та персики, та ягідні культури, такі, як полуниця, малина, порічка та чорна смородина та агрус), Кірезіоіїдає 5р., Упаіапдасєає зр., Веїшіасєає 5р., Апасагаіасєаеє 5р., Гадасеає 5р., Могасєає з5р., ОІвсасєає 5р. (наприклад, оливкове дерево), Асііпідасеає 5р., І ашгасеає 5р. (наприклад, авокадо, кориця, камфора), Мизасеає 5р. (наприклад, бананові дерева та плантації), Кибіасеає 5р. (наприклад, кавове дерево), Тпеасеае 5р. (наприклад, чай), Зіегсціісеаеє 5р., Кшасеаєе 5р. (наприклад, лимони, апельсини, мандарини та грейпфрути); Зоіапасеає 5р. (наприклад, томати, картопля, перець, червоний перець, баклажани, тютюн), І йПасеає 5р., Сотрозйає 5р. (наприклад, салат, артишоки та цикорій, включаючи цикорій кореневий, ендивій або цикорій звичайний),
Отбвеїїїегає 5р. (наприклад, морква, петрушка, селера), Сисигрйасеаеє 5р. (наприклад, огірки, включаючи корнішони, а також гарбузи, кавуни, горлянки та дині), АПасеаєе 5р. (наприклад, порей та цибуля), Сгисітегає 5р. (наприклад, капуста білокачанна, капуста червонокачанна, броколі, цвітна капуста, брюссельська капуста, пекінська капуста, кольрабі, редис, хрін, крес- салат та петсай), І едитіпозає 5р. (наприклад, арахіс, горох, сочевиця та квасоля, наприклад, квасоля звичайна та кормові боби), Спепородіасеаеє 5р. (наприклад, листовий буряк, кормовий буряк, шпинат, червоний буряк), І іпасеає 5р. (наприклад, коноплі), Саппабеасеа 5р. (наприклад, коноплі посівні), Маїмасеає 5р. (наприклад, окра, какао), Рарамегасеае (наприклад, мак),
Аврагадасеає (наприклад, спаржа); корисні рослини та декоративні рослини у садах та лісах, включаючи дернові та газонні трави та Зіеміа герацдіапа; і, у будь-якому разі, генетично модифіковані типи цих рослин.
У деяких аспектах продукт ферментації також включає інгредієнт для рецептування.
Інгредієнтом для рецептування може бути зволожувальний агент, наповнювач, розчинник, засіб, який сприяє текучості, емульгатор, диспергатор, антифриз, загусник та/або ад'ювант. В одному варіанті втілення інгредієнтом для рецептування є зволожувальний агент. В інших аспектах продуктом ферментації є висушений заморожуванням порошок або висушений розпиленням порошок.
Композиції згідно з даним винаходом можуть включати інгредієнти для рецептування, які 60 додають до композицій згідно з даним винаходом для поліпшення відновлення, ефективності або фізичних властивостей та/або для сприяння обробці, пакуванню та введенню. Такі інгредієнти для рецептування можуть додаватись окремо або у комбінації.
Інгредієнти для рецептування додають до композицій, які включають клітини, безклітинні препарати, виділені сполуки та/або метаболіти, для поліпшення ефективності, стійкості та фізичних властивостей, придатності до використання та/або для сприяння обробці, пакуванню та кінцевому застосуванню. До таких інгредієнтів для рецептування можуть належать прийнятні для застосування у сільському господарстві носії, інертні компоненти, стабілізатори, консерванти, поживні речовини або модифікатори фізичних властивостей, які можуть додаватись окремо або у комбінації. У деяких варіантах втілення носії можуть включати рідкі матеріали, такі, як вода, олія та інші органічні або неорганічні розчинники, та тверді матеріали, такі, як мінерали, полімери або полімерні комплекси, одержані біологічно або шляхом хімічного синтезу. У деяких варіантах втілення інгредієнтом для рецептування є зв'язувальна речовина, ад'ювант або адгезив, який сприяє прилипанню композиції до частини рослини, такої, як листя, насіння або коріння. Див., наприклад, |Тауїог, А.С, єї аІ., "Сопсері5 апа Тесппоіодієз ої Зеїесієй
Зеей Тгеайтепів, " Аппи. Кеу. Рпуїораййої., 28: 321-339 (1990)). Стабілізатори можуть включати засоби проти грудкування, антиоксиданти, протиосаджувальні засоби, протиспінювачі, сикативи, протравлювачі або консерванти. Поживні речовини можуть включати джерела вуглецю, азоту та фосфору, такі як цукри, полісахариди, олія, білки, амінокислоти, жирні кислоти та фосфати.
Модифікатори фізичних властивостей можуть включати об'ємоутворювальні агенти, змочувальні агенти, загусники, модифікатори рН, модифікатори реологічних властивостей, диспергатори, ад'юванти, поверхнево-активні речовини, плівкоутворювачі, гідротропи, наповнювачі, антифризи або барвники. У деяких варіантах втілення композиція, яка включає клітини, безклітинний препарат та/або метаболіти, утворені шляхом ферментації, може бути застосована безпосередньо з водою як розріджувачем або без неї і без подальшого приготування композиції. У конкретному варіанті втілення зволожувальний агент або диспергатор додають до ферментаційної твердої речовини, такої як висушений заморожуванням або висушений розпиленням порошок. Зволожувальний агент поліпшує властивості розтікання та проникнення, а диспергатор підвищує диспергованість та розчинність активного інгредієнта (вже розведеного), коли його наносять на поверхні. Типові змочувальні
Зо агенти є відомими спеціалістам у даній галузі, ії до них належать сульфосукцинати та похідні, такі, як МОСТІММЕТ "М МО-7ОЕ (Сгода Іпс., Едізоп, МУ); силоксани, такі, як ВРЕАК-ТНВОЄ (Емопік,
Септапу); неіонні сполуки, такі, як АТ ОХ М 4894 (Сгода Іпс., Едізоп, МУ); алкілполігллюкозиди, такі, як ТЕЕМУЕТ? 3001 (Нипівтап Іпіегпайопа! ГІ С, Тне М/осдіапав, Техаз); С12-С14 етоксилати спиртів, такі, як ТЕКСІТОЇ 2 15-5-15 (Те Юом/ Спетіса! Сотрапу, Міаіапа, Міспідап); естери фосфорної кислоти, такі, як ЕНОБАБАС? Ва-510 (КПодіа, Іпс.); та карбоксилати алкілових етерів, такі, як ЕМОЇ ЗОСЕМТМ І 5 (Сіапапі Согрогаїйоп, Мой Сагоїїпа).
Інформація про депонування
Зразок штаму виду Раеєпірасіїйш5 згідно з винаходом було депоновано у Колекції культур
Служби сільськогосподарських досліджень, яка розташовується у Національному центрі досліджень використання сільськогосподарської продукції Служби сільськогосподарських досліджень Міністерства сільського господарства США (МКК), 1815 Мопйп Опімегейу 5ігеві,
Реогіа, І 61604, 0О.5.А., згідно з Будапештською угодою 28 серпня 2014 р., і йому було присвоєно такий номер доступу: МКК. В-50972.
Зразок штаму виду Раеєпірасійс5, який походить від штаму виду Раєпірасійи5 МКК В-50972, що демонструє стійку структуру колоній, було депоновано у Колекції культур Служби сільськогосподарських досліджень, яка розташовується у Національному центрі досліджень використання сільськогосподарської продукції Служби сільськогосподарських досліджень
Міністерства сільського господарства США (МКК), 1815 Могій Опімегейу 5ігеєї, Реогіа, І. 61604,
О.5.А., згідно з Будапештською угодою 1 вересня 2015 р. і йому було присвоєно такий номер доступу: МАК. В-67129.
Штам виду Раеєпібасійн5 було депоновано на умовах, які гарантують доступ до культури протягом періоду розгляду цієї патентної заявки особі, визначеній Комісаром з патентів та товарних знаків як така, що має на це право згідно з Кодексом федеральних правил США 37
С.Б.К. 5 1.14 та Кодексу законів США 35 0.5.0. 5122. Однак слід розуміти, що доступність депонованого зразка не передбачає ліцензії на практичне здійснення даного винаходу у порядку відступу від патентних прав, які надаються урядовими органами.
Представлені нижче приклади є лише пояснювальними і не обмежують обсягу даного винаходу.
Приклади бо Приклад 1. Вибір Раєпірбасіи5 5р. МЕКГІ. В-50972
Геноми кількох штамів виду Раєепірасійй5 піддавали секвенуванню. Геномні дані аналізували для розпізнавання штамів з кластером генів біосинтезу фусарицидину, але без кластера генів поліміксинсинтетази. Кластер генів, який відповідає за біосинтез фусарицидину (Ти5А), було розпізнано й охарактеризовано раніше, так само, як і кластер генів поліміксинсинтетази. Див., наприклад, Ці єї аї., "Мопібозотаї! Віозупіпеві5 ої Ризагісідіп5 Бу Раєпірасйи5 роїутуха РКВ1
Іпмоїме5 Оігесі Асіїмайоп ої а О-Атіпо Асід, " Спетівігу 5 Віоіоду, 15: 118-127 (2008); Ії еї аї., "Рготоїег Апаїузів апа Тгапзсгіріоп Неашіайоп ої Ти С(3епе Сіивієї Незропвіріє їТог Ривзагісідіп зЗупіпевзів ої Раєпібасіїїшв5 роїутуха 5ОВ-21," Арріїейа Місгобіо! Віотесппої, 97: 9479-9489 (2013); та
Спої еї аї., "Ідепійісайоп ої а Роїутухіп Зупіпеїазе Сепе Сішивієг ої Раєпірасійи5 роїутуха апа
Неїегоїодои5 Ехргеззіоп ої Ше Сепе іп Васійи5 5и,ибБійї5, " доигпа! ої Васіегіоїоду, 191(10): 3350- 3358 (2009)|.
Штами, розпізнані шляхом цього аналізу, піддавали подальшій оцінці для підтвердження вироблення фусарицидину. У загальних рисах, кожен штам культивували у середовищі на основі сої і ліпофільну фракцію суцільного бульйону екстрагували. Екстракт суцільного бульйону аналізували шляхом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) і присутність фусарицидину А визначали на основі профілю ВЕРХ, отриманого зі стандартним зразком, який містив фусарицидин А.
Приклад 2. Іп ріапіа протигрибкова активність суцільних бульйонів штамів виду Раєпірасійи5
Вибрані штами виду Раепірасійй5, які включали штам виду Раєпірасійй5 МЕМ В-50972, вирощували у середовищі на основі сої для продукування культур у суцільних бульйонах.
Дистильовану воду додавали до кожного з суцільних бульйонів для одержання 10 95 кінцевого розведення.
Розведені суцільні бульйони наносили на листя молодих рослин, які потім піддавали дії грибкового інокулуму фітофторозу томатів (РНУТІМ), сірої гнилі (ВОТКСІ) або листкової іржі пшениці (РОССЕТ). Необроблений контрольний зразок включали до кожного аналізу з метою порівняння. Через кілька днів після піддавання дії грибкових інокулумів визначали показники кожної рослини для відсоткового контролю патогенів відносно необроблених контрольних рослин. Кожну обробку оцінювали у трьох примірниках, і середній відсотковий контроль для суцільного бульйону кожного штаму виду Раеєпібасіїйц5 показано на ФІГ. 1.
Зо З 23 штамів, випробуваних на протигрибкову активність проти РНУТІМ, ВОТЕСІ та РОССЕТ штам виду Раеєпібрасійи5 МАККІ В-50972 був одним з небагатьох штамів, який мав відносно високий рівень активності проти всіх трьох грибкових патогенів.
Приклад 3. Іп мійго біологічна ефективність фусарицидинового екстракту штаму виду
Раєпібасіїи5 МАГ в-50972
Культури у суцільних бульйонах кількох штамів виду Раепібасіїш5, включаючи Раепірасіїїй5 5р. МАНІ. В-50972, приготовляли, використовуючи середовище на основі сої. Ліпофільні фракції, які містили фусарицидини, екстрагували з суцільних бульйонів. Три окремі фракції, які містили різні фусарицидини та протигрибкові метаболіти, одержували з екстракту суцільного бульйону з першого штаму виду Раеєпібасіїйи5 (тобто, Фракцію 1, Фракцію 2 та Фракцію 3). Екстракт зі штаму виду Раєепірбасійи5 МКК. В-50972 не піддавали подальшому відокремленню.
Фракції, що містили фусарицидин, з кожного штаму випробували на таких дванадцяти грибкових патогенах: АКегпагіа акегпага (АГ ТЕАЇ), Воїгуїі5 сіпегеа (ВОТЕСІ), Ризагішт сиітогит (РОБАСИ), Рпаеозрпаєтіа подогит (ГЕРТМО), 2утовзеріогіа ійісі (ЗЕРРТА), РНуїорптога сгуріодеа (РНУТСРЕ), РНуїорпінога іпгезіап5 (РНУТІМ), Руктішт ийітит (РУИТНОГ), Мадпаропне огулає (РУКІОК), Тнапасгерпоги5 сиситегіз (КНІ25О), О5Шадо зедешт маг. амепає (О5БТІАМ) та
Оготусе5 аррепаїсшіаєе (КОМАР). Інгібування росту грибкових клітин різними фракціями визначали у середовищі на основі сої і порівнювали з ростом необроблених контрольних зразків. Випробували вісім доз кожної фракції від 0,005 ррт до 100 ррт. Ефективні дози, які забезпечують 50 95 інгібування (ЕОзо) та 80 95 інгібування (ЕОзво), вказано у таблиці на Фіг. 2.
Фракція, що містила фусарицидин, штаму виду Раепірасіїйи5 МАК. 8В-50972, демонструвала широкий спектр протигрибкової активності у дванадцяти аналізах, що не спостерігалося для фракцій з іншого штаму виду Раепірасійй5. Фракція штаму виду Раєпірасійи5 МАК В-50972 також демонструвала значно більшу активність в аналізах порівняно з тією, яка спостерігалася для фракцій з іншого штаму виду Раеєепірасійиз (див. Фіг. 2).
Приклад 4. Іп мімо профілактичне випробування на томатах, інфікованих фітофторою
У цьому здійснюваному в оранжереї випробуванні рослинного патогену продукт ферментації штаму виду Раєпірасійи5 МАК В-50972 випробували у порівнянні з трьома іншими штамами виду Раепірасійш5, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах. Для приготування придатної композиції сполук 1 частину за 60 масою висушеного розпиленням порошку суцільного бульйону з кожного штаму, культивованого у середовищі на основі сої, змішували з водою та 0,1 частини за масою емульгатора (полігліколевого етеру аралкілу), а потім розводили водою до потрібної концентрації.
Для випробування профілактичної активності молоді рослини обприскували композицією сполуки при зазначеній нормі застосування. Після висихання нанесеного обприскуванням покриття, рослини інокулювали водною суспензією спор Рпуорпїпога іп'ебзіап5. Після цього рослини поміщали до інкубаційної камери при приблизно 20 "С та відносній вологості атмосфери 100 об.
Результати випробування оцінювали через З дні після інокуляції. 0 95 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця 2
Іп мімо профілактичне випробування на Рпуїорпїпога (томати) (штамвиду Раєпірасіїшей | 0 10000777 | 68 2
Приклад 5. Іп мімо профілактичне випробування на винограді, інфікованому Ріахторага
У цьому здійснюваному в оранжереї випробуванні рослинного патогену продукт ферментації штаму виду Раепірасіїйш5 МЕРІ. В-50972 випробували у порівнянні з трьома іншими штамами виду Раепірасійш5, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах. Для приготування придатної композиції сполук 1 частину за масою висушеного розпиленням порошку, приготовленого, як у Прикладі 5, змішували з водою та 0,1 частини за масою емульгатора (полігліколевого етеру аралкілу), а потім розводили водою до потрібної концентрації.
Для випробування профілактичної активності молоді рослини обприскували композицією сполуки при зазначеній нормі застосування. Після висихання нанесеного обприскуванням покриття, рослини інокулювали водною суспензією спор Ріазторага мійсоїа, а потім залишали на 1 день в інкубаційній камері при приблизно 20 "С та відносній вологості атмосфери 100 95.
Після цього рослини поміщали на 4 дні до оранжереї при приблизно 21 "С та відносній вологості атмосфери приблизно 90 95. Після цього рослини обприскували і поміщали на 1 день до інкубаційної камери.
Результати випробування оцінювали через б днів після інокуляції. 095 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як
Зо ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця З
Іп мімо профілактичне випробування Ріахторага (виноград)
Приклад 6. Іп мімо профілактичне випробування квасолі, інфікованої Оготусев
У цьому здійснюваному в оранжереї випробуванні рослинного патогену продукт ферментації штаму виду Раепірасіїйш5 МАРК. В-50972 випробували у порівнянні з трьома іншими штамами виду Раепірасійш5, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах. Для приготування придатної композиції сполук 1 частину за масою висушеного розпиленням порошку, приготовленого, як у Прикладі 5 змішували з водою та 0,1 частини за масою емульгатора (полігліколевого етеру аралкілу), а потім розводили водою до потрібної концентрації.
Для випробування профілактичної активності молоді рослини обприскували композицією сполуки при зазначеній нормі застосування. Після висихання нанесеного обприскуванням покриття, рослини інокулювали водною суспензією спор збудника іржі бобових (готусев5 аррепаїсціайв5), а потім залишали на 1 день в інкубаційній камері при приблизно 20 "С та відносній вологості атмосфери 100 95.
Після цього рослини поміщали до оранжереї при приблизно 21 "С та відносній вологості атмосфери приблизно 90 95.
Результати випробування оцінювали через 10 днів після інокуляції. 090 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця 4
Іп мімо профілактичне випробування Оготусез (квасоля)
Приклад 7. Порівняння штамів Раєпібасійн5 у польовому випробуванні цукіні, інфікованого справжньою борошнистою росою (Зрпаеєгоїпеса иїдіпеа)
Здійснювали два польові випробування на цукіні, штучно інокульованого Зрпаегоїпеса
ТчІїдіпеа. П'ять зразків для обробки з висушеним розпиленням порошком суцільного бульйону з кожного штаму виду Раепірбасійй5, який культивували у середовищі на основі сої, повторно суспендували у воді в об'ємі для застосування 1000 л/га і наносили на рослини з 15 липня по 8 серпня на стадії росту з ВВСН5Я по ВВСН?2 з 4-8-денними інтервалами, як зазначено у Таблиці 6. Відсоток контролю над хворобою, показаний у Таблиці 5, є результатом останньої оцінки, здійсненої через 10 днів після кінцевого застосування, яку здійснювали шляхом візуального спостереження за симптомами хвороби. 0 95 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця 5 оза - Контроль над хворобою у 95 поеняюннння шк 2 5 оо зразок сштамвиду Раєпірасіше У 4 | АВСОЕ | ' 66 р К(БВВ/
Таблиця 6
В111111111111111112злилня./////////7/717171717171711117165СсС 61111111 ясерпня./////7/ 1717171717111111172ССсСС
Зо
Результати у Таблиці 4 чітко демонструють, що активність штаму виду Раєпірасійи5 МЕРІ. В- 50972, яка спостерігається, переважає показники інших штамів, які випробували в цьому польовому випробуванні, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах.
Приклад 8. Порівняння штамів Раепірасійй5 у польовому випробуванні на винограді, інфікованому справжньою борошнистою росою (Опсіпша Месаюг)
Здійснювали два польові випробування на винограді, природно інфікованому Опсіпиїа песайог. Шість зразків для обробки з висушеними розпиленням порошками, які описано у
Прикладі 8, повторно суспендували у воді в об'ємі для застосування 1000 л/га і наносили на рослини з З червня по 1 липня на стадії росту з ВВСН57 по ВВСН?»5 з 5-7-денними інтервалами, як зазначено у Таблиці 8. Відсоток контролю над хворобою, показаний у Таблиці 7, є результатом останньої оцінки, здійсненої 15 днів після кінцевого застосування, яку здійснювали шляхом візуального спостереження за симптомами хвороби. 0 95 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця 7
Доза . Контроль над хворобою у 95
Шреененнья | | одини | кр зразок сштамвиду Раєпірасіше У | 4 | АВСОЕЕ 77777777 667777сСсСсСсСсС2шС сштамвиду Раєпірасіше У | 2 | АВСОЕЕ |/77777777777/7607777ссСсСсСсСс2шС
Таблиця 8
В лочервня./:.:.:5Л/: | 60777сСсСсСсшС у 61111111111111111111111112ілчервня.:.;:|::;:/3З3З/|| 7 С
Результати у Таблиці 7 чітко демонструють, що активність штаму виду Раєпірасійи5 МЕРІ. В- 50972, яка спостерігається, переважає показники інших штамів, які випробували в цьому польовому випробуванні, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах.
Приклад 9. Порівняння штамів Раепірасійй5 у польових випробуваннях на томатах, інфікованих альтернаріозом (АКегпагіа зоіапі)
Здійснювали два польові випробування на рослинах томатів, штучно інокульованих
АКегпаїгіа 5оїІапі. Три зразки для обробки з висушеними розпиленням порошками, які описано у
Прикладі 8, повторно суспендували у воді в об'ємі для застосування 1000 л/га і наносили на рослини з 26 червня по 10 липня на стадії росту з ВВСН5ЬІЇ по ВВСН5ТУ з 6-8-денними інтервалами, як зазначено у Таблиці 10. Відсоток контролю над хворобою, показаний у Таблиці
Зо 9, є результатом останньої оцінки, здійсненої 8 днів після кінцевого застосування, яку здійснювали шляхом візуального спостереження за симптомами хвороби. 095 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця 9
Доза - Контроль над хворобою у 95 зенежнння || 18 1335 зразок
Раепірасіїив зр. МАВ. 8-50972 | 2 | АВС (77777768 сш
Таблиця 10 нини жит шини ши
Результати у Таблиці 9 чітко демонструють, що активність штаму виду Раєпірасійи5 МЕРІ. В- 50972, яка спостерігається, переважає показники інших штамів, які випробували в цьому польовому випробуванні, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах.
Приклад 10. Порівняння штамів Раєпірасійй5 у польових випробуваннях на картоплі, інфікованій альтернаріозом (АгКегпагіа з5оіапі)
Здійснювали польове випробування на рослинах картоплі, штучно інокульованих АКегпагіа 5оЇапі. П'ять зразків для обробки з висушеними розпиленням порошками, які описано у Прикладі 8, повторно суспендували у воді в об'ємі для застосування 500 л/га і наносили на рослини з 25 червня по 19 липня на стадії росту з ВВСНЗУ по ВВСН55 з 4-8-денними інтервалами, як зазначено у Таблиці 12. Відсоток контролю над хворобою, показаний у Таблиці 11, є результатом останньої оцінки, здійсненої 6 днів після кінцевого застосування, яку здійснювали шляхом візуального спостереження за симптомами хвороби. 0 95 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця 11 п Доза . о (Необроблений контрольнийзразок!ї | 77777710
Раепірасіїиє зр. МАВ. В-50972 | 4 | АВСОЕ | -, 80ЙДЙ.Кк
Таблиця 12
В111111111111111111111липня.д///////// 11111114 нин: пи ТТ: я ПО: СУ
Результати у Таблиці 11 чітко демонструють, що активність штаму виду Раєпірасійй5 МЕМ.
В-50972, яка спостерігається, переважає показники інших штамів, які випробували в цьому польовому випробуванні, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах.
Приклад 11. Порівняння штамів Раєпірасійй5 у польових випробуваннях на картоплі, інфікованій альтернаріозом (АгКегпагіа з5оіапі)
Здійснювали польове випробування на рослинах картоплі, штучно інокульованих АКегпагіа 5зоЇапі. Три зразки для обробки з висушеними розпиленням порошками, які описано у Прикладі 8, повторно суспендували у воді в об'ємі для застосування 500 л/га і наносили на рослини з 24 липня по 5 серпня на стадії росту з ВВСНЗ7 по ВВСНОІ з б-денними інтервалами, як зазначено у Таблиці 14. Відсоток контролю над хворобою, показаний у Таблиці 13, є результатом останньої оцінки, здійсненої б днів після кінцевого застосування, яку здійснювали шляхом візуального спостереження за симптомами хвороби. 0 95 означає ефективність, яка відповідає показникові необробленого контрольного зразка, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Таблиця 13
Доза . о (Необроблений контрольнийзразок!ї | 7777/1770
Таблиця 14 нини: ІН ЕТО ТТ: Я ПО т по
Результати у Таблиці 13 чітко демонструють, що активність штаму виду Раєпірасійй5 МЕМ.
В-50972, яка спостерігається, переважає показники інших штамів, які випробували в цьому польовому випробуванні, які продемонстрували відносно високу протигрибкову активність у попередніх відбірних аналізах.
Приклад 12. Розпізнавання варіації Ти5А у штамі виду Раепірасійи5 МАК. В-50972
Для додаткової характеризації штаму виду Раепірасійй5 МКК 8-50972 геномну послідовність гена їи5А, який кодує Би5А фусарицидинсинтетазу, визначали стандартними способами секвенування і розпізнавали відповідну амінокислотну послідовність. Амінокислотну послідовність з Еи5А, що експресується штамом виду Раепірасіїййи5 МАК. В-50972, порівнювали з послідовністю кількох інших штамів Раепібрасійи5, включаючи ті, які описуються у таких публікаціях:
ІС 5., еї аї., (2014). "Сотрієїе Сепоте бедиепсе ої Раєпірасійн5 роїутуха 5ОВ-21, а Ріапі
Стоулп-Рготоїіпуд КПпігобасіегішт м/йй Апійипда! Асіїміу апа Кпігозрпеге Соіопігайоп АбБіїйу, "
Сепоте Аппошпс, 2(2):НАЗН(ОО х 743ар288);
Міч В., єї а!., (2011). "/не Сепоте ої Ше Ріапі Стомлйи-Рготоїїпу Впі2орасієтгішт Раепірасіи5 роїутуха М-1 Сопіаййв Міпе 5пйез ЮОедісаївей юю Мопгірозота! Зупіпевів ої Іірореріїде5 апа
РоїуКеїідев, 7" У). Васіетіої!. 193(20): 5862-3;
Ма М., єї аї!., (2011) "Сотрієїе Сепоте бедиепсе ої Раєпірбасійи5 роїутуха 5С2, А 5ігаїп ої
Ріапі Стоулп-Рготоїїпу ВНігорасієгішт м/йй Вгоаа-Зресігит Апійптісгобіа! Асіїмпцу, " у. Васіепіої!. 193(1): 311-2; та
Її апа Уепзеп, (2008). Мопгірозотаї! Віозупіпевзів ої Еивзаїісідіп5 Бу Раєпірасіїн5 роїтутуха
РКВІ Іпмоїмез бігесі Асіїмайіоп ої а д-атіпо Асіа. Снет. Віої. 15, 118 - 127)
Вирівнювання, показане на Фіг.13, виявило значні делеції у варіантній Еи5А фусарицидинсинтетазі, яка експресується Раепірасійи5 5р. МКК В-50972. Перша делеція простягається від позиції 3009 до позиції 3037 відповідної послідовності у штамі виду
РаєпірасішШив А (ЗЕО ІО МО: 11). Друга делеція простягається від позиції 3047 до позиції 3317 відповідної послідовності у штамі виду РаепірасйШиє А (ЗЕО ІЮО МО: 11). Обидві делеції обмежуються А доменом третього модуля фусарицидинсинтетази РизА (тобто, Би5А-АЗ).
Як пояснювалося вище, кожен з А доменів містить десять консервативних амінокислотних залишків, які відповідають за розпізнавання та активацію субстрату (див. Таблицю 1). Ці консервативні амінокислотні залишки є обведеними у вирівнюванні, показаному на фіг. 13.
Делеції, розпізнані у варіантній ГизА фусарицидинсинтетазі, яка експресується штамом виду
Раєпірасійшх МАНІ 8-50972, видаляють усі консервативні амінокислотні залишки, крім останнього (тобто, І уз517, розташованого у позиції 3486 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 11).
Ці дві делеції у варіантній Ри5А фусарицидинсинтетазі є присутніми у штамах, які походять від штаму виду Раеєпірасіїйи5 МКК В-50972, включаючи варіантний штам зі стійкою структурою колоній, позначений авторами як штам виду Раепірасійш5 МКК В-67129. Випадкові мутантні штами, які походять від штаму виду Раепірасійи5 МКМ. В-50972, зазвичай зберігають делеції у варіанті Ги5А-АЗ, оскільки зворотна мутація до дикого типу Ги5А-АЗ є дуже малоймовірною через широкий характер делецій.
Приклад 13. Порівняння вироблення фусарицидину у штамі виду Раепірасійш5 МАК В- 50972 та штамі А виду Раєепірасійи5
Для визначення впливу варіанта Ри5А-АЗ кількісно визначали панель фусарицидинів та
Раепізегіпе у штамі виду Раєепірасійи5 МАК. 8-50972 (який експресує варіант Ги5А-АЗ) та штамі виду Раеєпірасійи5 А (який експресує Ги5А-АЗ дикого типу) з застосуванням способу, описаного у
Прикладі 14. Справжність кожної сполуки визначали за її унікальними часом утримання та масою. Відносну інтенсивність сигналу кожного піка у спектрах представлено у Таблиці 15.
Абсолютне кількісне визначення було неможливе за відсутності очищених стандартів.
Щоправда, кожен екстракт клітин вводили майже в однаковій кількості, і відносна кількість сполук може бути визначена за отриманою інтенсивністю сигналу.
Таблиця 15
ФусарицидинС | 10,95 | 946,66 | -::КГ 0 77777701 226457229 Щ
ФусарицидинО | 1043 | 9606 | -:(хКГ 07777701 16424723 Щ
Раепізейіпей! | 11.00 | 868655 | 208029.....:/(|У' | 0 ж го? 77777777 | л18мо | 9446 | -:К 07777701 263137626 ЩГ/
Рота 77777771 | 182 | 9306. | .777ЮюЮюЮюЮюЮ/70777171717111111 171 522229025
У ГизА фусарицидинсинтетазі дикого типу ГизА-АЗ відповідає за включення І-Туг, І -РПе, І1- маї, І-Пе або І -аПо-Пе до сполуки фусарицидину в амінокислотній позиції (3) (див. Таблицю 1).
Варіант Ри5А-АЗ у штамі виду Раепірасійш5 МАК В-50972 дає екстракт без будь-якого помітного фусарицидину С, фусарицидину ОО, ГіБ07а або ІБО7р. Фусарицидин С та фусарицидин Ю мають тирозин в амінокислотній позиції (3), тоді як ГІБО7а та ГІБО76 мають фенілаланін в амінокислотній позиції (3). Ці експериментальні дані демонструють, що генетична варіація у Би5А-АЗ, що експресується штамом виду Раепірасійш5 МАКРІ В-50972, інгібує біосинтез фусарицидинів з тирозином або фенілаланіном в амінокислотній позиції (3) (див. ФІГ. 14).
Таким чином, штам виду Раєпірасіййи5 МКК. В-50972 та мутантні штами, які походять від штаму виду Раепірбасійш5 МАК В-50972, не є здатними продукувати помітну кількість фусарицидинів або подібних до фусарицидину сполук з тирозином або фенілаланіном в амінокислотній позиції (3) (наприклад, Фусарицидинів С та ЮО або ГіБО7а та ГіБО075). Аналіз варіанта Би5зА-АЗ у штамі виду Раепірасійи5 МКК. В-50972 вказує, що цей штам та його мутанти генетично не здатні продукувати фусарицидини або аналоги фусарицидину з пептидними кільцями, які включають амінокислоту тирозин або амінокислоту фенілаланін в амінокислотній позиції (3).
З двох проаналізованих Раепізегіпе лише один виявлявся у штамі виду РаєепірасшШив А, і інтенсивність його сигналу була меншою за половину відповідної інтенсивності сигналу, яку спостерігали в екстракті штаму виду Раєпірасійи5 МАРК В-50972. Без прив'язування до будь- якої теорії виявляється, що одна або кілька з перших дев'яти консервативних амінокислот у
Еи5А-АЗ (тобто, Азр235, АІа236, Зег239, ТПг278, І еи299, Аіа301, АІа/сІу322, МаЇ330 та Суб5331) відповідають за розпізнавання та активацію тирозину та фенілаланіну в позиції (3) у сполуках фусарицидину. Крім того, варіант Ри5А-АЗ, який експресується штамом виду РаєпірасншШив5 МКК.
В-50972, може зсувати проміжні продукти обміну речовин від продукування деяких фусарицидинів у напрямку біосинтезу ширшого кола подібних до фусарицидину сполук (наприклад, Раеєпізегіпе).
Приклад 14. Порівняння біоактивності штаму виду Раепірасіййи5 МЕРІ. В-50972 та штам виду
Раєпібасіїїи5 А
Штам виду Раеєепірасіййи5 МКК В-50972 (який експресує варіант Би5А-АЗ) та штам виду
Раепірасіїйи5 А (який експресує дикого типу Ги5А-АЗ) культивували у середовищі на основі сої для одержання суцільних бульйонів. Суцільні бульйони розводили у суміші води та органічного
Зо розчинника до концентрації 1095, 595, 2,595 та 1,2595. Розведені суцільні бульйони застосовували до молодих рослин, які потім піддавали дії інокулуму Риссіпіа ійісіпа (РОССРВТ),
Воїгуїє сіпегеа (ВОТКСІ) або РПпуюрпїтога іптесїап5 (РНУТІМ). Через кілька днів після піддавання дії інокулуму рослинного патогена, визначали показники кожної рослини для відсоткового контролю патогенів відносно необроблених контрольних рослин. Кожну обробку оцінювали у трьох примірниках і вказували середній відсоток контролю (див. Таблиці 16-18).
У кожному з аналізів штам виду РаепірасшШив МКК В-50972 демонстрував кращий контроль порівняно зі штамом виду Раепірбасійи5 А. Ці експериментальні дані свідчать, що варіантна фусарицидинсинтетаза та викликані в результаті зміни у біосинтезі фусарицидинів та подібних до фусарицидину сполук забезпечують кращий контроль над рослинними патогенами зі штамом виду Раєпірбасіййи5 МКК В-50972.
Таблиця 16
Контроль над Риссіпіа ігйісіпа (РОССКТ), який досягається з застосуванням штаму виду
Раєпібасіїи5 МАНІ. В-50972 та штаму виду РаєпірасшШив
А при ступенях розведення 10 95, 5 95, 2,5 9о та 1,25 95.
ШтамвидурРаєепірасіїш5 МАВ. В-50972 | 1095 | -//7777/с9847ИЙИЙ;Й2 в 111111111111118871 нюиниининининшир:жнишиншнн ни 11111 Ї11111111111101 вс нюнлшиининининнн:жнишиннншишшшшй 11111 |.11171717171717171101
Таблиця 17
Контроль над Воїгуїіз сіпегеа (ВОТЕКСІ), який досягається з застосуванням штаму виду
Раєпібасіїи5 МАНІ. В-50972 та штаму виду РаєпірасшШив
А при ступенях розведення 10 95, 5 95, 2,5 9о та 1,25 95. нІНІІВВЛІТТОООООЛОЛОВОЛВОЛВОЛВОВЛОВВОВОВОМСТВОВОВОООВОЛВОЛЛОЛОВОЛОЛОВОООЄ ТТ Я 11111 1111111111111719871 ниююинининниниш зни шЕ нин вв ню: жзни,иншиннншЕЖ лиш 11111 |.11171717171717171101
Таблиця 18
Контроль над Рпуїорпїнога іпт'езтапзо (РНУТІМ), який досягається з застосуванням штаму виду
Раєпібасіїи5 МАНІ. В-50972 та штаму виду РаєпірасшШив
А при ступенях розведення 10 95, 5 95, 2,5 9о та 1,25 95. нн: шишишш ню: зни ши ннНШЖІНКННВВЛЛ ІОВ ОІВ ОЛОВО: ТЯ ню шини:жнншнншш лиш ню: зни лиш 11111
Приклад 15. Розпізнавання фусарицидинів в екстракті клітин виду Раепірасни5
Штам виду Раєпібасійш5 МАК В-50972 та/або похідні від нього штами вирощували у середовищі на основі сої доти, доки вони не досягали стаціонарної фази, після чого культуру суцільного бульйону збирали й екстрагували органічним розчинником для одержання екстракту клітин.
Хроматографічний спосіб з застосуванням високоефективної рідинної хроматографії / часопролітної мас-спектрометрії (ВЕРХ/М5 ТОБ) було розроблено для відокремлення багатьох подібних до фусарицидину молекул від екстракту клітин: колонка: УМС"М Вавіс 4,6 х 250 мм, 5 мкм; вода (0,1 9о ЕА) та ацетонітрил (0,1 96 мурашиної кислоти (ЕА)); градієнт (908): 0-9 хв 28-
ЗО Фо; 9-14 хв 30-33 90; 14-34 хв 33-50 90; промивання.
Хроматограму екстракту клітин, у якому розпізнано відомі фусарицидини, показано на
Фіг. 48. Загальну структуру фусарицидинів представлено на Фіг. 4А. Кожен циклічний фусарицидин має відповідний ациклічний аналог.
Усі фусарицидини в екстракті клітин, які піддаються виявленню, розпізнавали на основі їхнього час утримання та значень Іп/7 (див. ФІГ. 4С). Цікавим є те, що фусарицидини С та О та інші фусарицидини, в яких амінокислотою у позиції (3) є тирозин або фенілаланін, в екстракті клітин не виявлялися.
Приклад 16. Характеризація Раеєпізегіпе в екстракті клітин виду Раєпірасійи5
Для розпізнавання інших сполук в екстракті клітин штаму виду РаеєпірасшШив МКК. В-50972 та/або похідних від нього штамів було розроблено хроматографічний спосіб з застосуванням надефективної рідинної хроматографії / мас-спектрометрії з потрійним часом прольоту (ОРІ С/М5 Ттіріе ТОЕ) для фрагментації багатьох подібних до фусарицидину молекул: колонка: 7ОВВАХ"М Есіїрзе Ріи5, 2,1 х 100 мм, 1,8 мкм; вода (0,1 95 РА) та ацетонітрил (0,1 95 БА); градієнт (908): 0-5 хв 10-95 95; промивання.
У такий спосіб заявником було охарактеризовано нову родину Раєпізегіпе, що належить до фусарицидинів, шляхом дослідження мас-спектрів фрагментації, одержаних за допомогою мас-
Зо спектрометра АВ 5СІЕХ ТКІРІЕ ТОБЕУ, а також шляхом порівняння спектрів з даними,
опублікованими у літературі. Заявник назвав цю нову родину Раеєпізегіпе. Типові мас-спектри фрагментації з застосуванням ОРІ С/М5 Ттгіріе ТОБ та відповідні хімічні структури для
Раепіхегіпе А! та Раєпізегіпе ВІ показано на ФІГУРАХ 5 та 6, відповідно. Подібний аналіз виконували для кожного Раеєпізегіпе, виявленого в екстракті клітин.
Раепізегіпе було так названо через значне відхилення від фусарицидинового скелета з одним або кількома сериновими заміщеннями (див. Фіг. 5А). Традиційно для того, щоб вважатися фусарицидином, пептидна послідовність містила три консервативні амінокислоти: (1) треонін, (4) треонін та (6) аланін. Однак Раєпізегіпе демонструють нові заміщення одного або обох треонінових залишків (1) та (4), замінених на серин. Амінокислоти у позиціях (2) та (3) обидві є валіном у Раепізегіпе, охарактеризованих Заявником. Хроматограму, на якій розпізнано піки, які відповідають Раєпізегіпе, показано на Фіг. 5В.
Заявник також охарактеризував цю родину серин-заміщених подібних до фусарицидину сполук в екстракті клітин на основі їхнього часу утримання та значень Іп/: (див. ФІГ. 5С). Хоча
Раепізегіпе С4 не виявлявся, логічно було б очікувати його продукування, грунтуючись на структурах охарактеризованих раніше фусарицидинів. Так само, як фусарицидини, кожен циклічний Раеєпізегіпе має відповідний ациклічний аналог.
Важливо зазначити, що хоча Раеєпізегіпе, охарактеризовані Заявником, мають амінокислоту валін у залишках (2) та (3), очевидно, існують сполуки з варіаціями у цих позиціях. Ці можливі варіації мають бути подібними до аналогів фусарицидину / ГЕ з такими амінокислотами, як ізолейцин, фенілаланін та тирозин як залишками (2) та (3). Крім того, хоча хвіст ЗНРО було описано вище, є ймовірність існування сполук з варіаціями у довжині хвоста, які є подібними до родини Раєпіргоїїхіп (див. Приклад 17).
Приклад 17. Характеризація Раеєпіргоїїхіп в екстракті клітин виду Раепірасійи5
Екстракт клітин штаму виду Раепірасійи5 МАК В-50972 та/або похідних від нього штамів додатково аналізували, застосовуючи хроматографічний спосіб, описаний у Прикладі 14. Нову родину фусарицидинів характеризували шляхом дослідження мас-спектра фрагментації, отриманого за допомогою мас-спектрометра АВ 5СІЕХ ТВІР Е ТОБЕУ, а також шляхом порівняння спектрів з опублікованими у літературі. Заявник назвав цю нову родину Раєпіргоїїхіп.
Типові мас-спектри фрагментації ОРІ С/М5 Тгіріе ТОБ та відповідні хімічні структури для
Раепіргоїїхіп С1 та Раепіргоїїхіп 01 показано на Фігурах 8 та 9, відповідно. Подібний аналіз виконували для кожного з Раеєепіргоїїхіп, виявлених в екстракті клітин.
Раепіргоїїхіп було названо за латинським словом "Рргоїїх" ("довгий") через ще одне значне відхилення від скелета фусарицидину в аліфатичному хвості, тобто, Раєпіргоїїхіп мають довший хвіст, ніж у фусарицидинів. Раніше спостерігалися лише фусарицидини, які мають конкретний хвіст ЗНРО. Це було відображено навіть у найпізнішій публікації з даної теми |(гобто, Матег еї аї.,
У. Ат. бос. Ма55 Зресігот., 2015, 26, 1130-1141), у якій автори заявляють, що "це відкриття
Їчітко консервативний хвіст ЗНРОЇ контрастує з багатьма іншими ліпопептидами, про які повідомляється в літературі, у яких жирнокислотна частина є головним об'єктом структурної варіації, наприклад, як у сурфактинах, ітуринах та фенгіцинах". Заявник розпізнав родину подібних до фусарицидину сполук з довшим хвостом (тобто, 17-гуанідино-3- гідроксигсептадеканова кислота або СНРОш2СН: та 19-гуанідино-3-гідроксинонадеканова кислота або ОНРОж4сСнН 5) (див. ФІГ. 8А) в екстракті клітин виду Раепібасіи5 МАВ В-50972. На відміну від Раєпізегіпе, Раєпіргоїїхіп зберігають консервативні амінокислотні залишки І -треоніну у позиції (1) та О-аІПо-треоніну у позиції (4).
Важливо зазначити, що хоча Раєпіргоїїхіп, охарактеризовані Заявником, мали амінокислоти валін або ізолейцин у залишках (2) та (3), існує ймовірність існування сполук з варіаціями в цих позиціях. Ці можливі варіації мають бути подібними до аналогів фусарицидину / ГІР, наприклад, з іншими комбінаціями валіну, ізолейцину або інших амінокислот, таких, як фенілаланін та тирозин, як залишків (2) та (3). Крім того, існує ймовірність існування гібридних комбінацій з
Раєпізегіпе, описаних вище, які мають більшу довжину хвоста.
Хроматограму, на якій розпізнано піки, які відповідають Раепіргоїїхіп, показано на Фіг. 88. Ця родина подібних до фусарицидину сполук з довшими хвостами СНРО також було охарактеризовано на основі їхнього часу утримання та значень Іп/7 (див. Фіг. 8С). Хоча
Раепіргоїїхіп С2 та р2 не виявлялися, логічно було б очікувати їх продукування, грунтуючись на структурах охарактеризованих раніше фусарицидинів. Так само, як фусарицидини, кожен циклічний Раепіргоїїхіп має відповідний ациклічний аналог.
Приклад 18. Профілі протигрибкової біоактивності Раепізегіпе, Раепіргоїїхіп та інших фусарицидинів
Зразки, показані у Таблиці 19, виділяли з клітин виду Раепірасійш5. Ферментований бо суцільний бульйон центрифугували для видалення супернатанту. Утворений осад потім екстрагували у метанолі. Одержаний в результаті екстракт фракціонували, застосовуючи рідинну хроматографію середнього тиску з оберненням фаз. Потім фракції піддавали подальшому очищенню, застосовуючи препаративну хроматографію високого тиску з оберненням фаз.
Таблиця 19
Для іп міго аналізу на протигрибкову активність у 9б6-лунковому планшеті застосовують реагент для визначення життєздатності клітин на основі резазурину РКЕБТОВІ ОЕЗУ як індикатор росту грибів. Починаючи з грибкових спор, аналіз дозволяє вимірювати здатність зразка до інгібування проростання грибкових спор та/або росту грибкових клітин. Аналіз здійснювали для трьох пов'язаних з сільським господарством грибкових захворювань: АКегпагіа зоЇапі (А ТЕ5О), СоПеїтіспит Іадепагішт (СОЦІ А) та Воїгуїі5 сіпегеа (ВОТКСІ).
Усі зразки, вказані у Таблиці 19, виявились активними проти пов'язаних з сільським господарством грибкових захворювань (див. мінімальну інгібуючу концентрацію для 80 95 (МІС80) значень, представлених в одиницях на мільйон (рріт) для кожного зразка у Таблиці 20).
Цікавим є те, що деякі сполуки, очевидно, мають мінливу активність проти певних хвороб.
Наприклад, хоча аналоги аспарагіну у Зразку З, очевидно, є важливими для контролю над
АЇ ТЕ5О, глутамінові відповідники такого самого типу сполуки у Зразку 4 були більш задіяними у контролі над СОЇ. ГА. Аналоги з довшим хвостом у Зразку б були найбільш потужними інгібіторами СОП ГА. Це свідчить про те, що, хоча всі вони є активними самі по собі, комбінація цих складових є важливою для кінцевої ефективності готового продукту та спектра його контролю над хворобою.
Таблиця 20 11111111 МмісвосуУррт/////ССС
І Зразокб |Раєпірюїхпй.////////7/|Ї7771711775 177780 | юю 50
Приклад 19. Профілі антибактеріальної біоактивності Раепізегіпе, Раепіргоїїхіп та інших фусарицидинів
Для іп міго аналізу на антибактеріальну активність у 96-лунковому планшеті використовують поглинальну здатність як індикатор бактеріального росту. Аналіз дозволяє вимірювати ефективність зразка в інгібуванні бактеріального росту шляхом порівняння поглинальної
Зо здатності необроблених лунок та лунок зі зразком. Останнє розведення/концентрація, що інгібує ріст бактерій, називається МІС (мінімальною інгібуючою концентрація), і це значення може використовуватися для порівняння ефективності різних зразків. Аналіз оцінювали з трьома пов'язаними з сільським господарством бактеріальними хворобами: Хапіпотопа5 сатребвігіб (ХАМТАМ), Рзхейдотопаз зугіпдає (РЗОМТМ) та Егм/іпіа сагоїомога (ЕКУМІСА).
Зразки, вказані у Таблиці 19, застосовували в антибактеріальних аналізах для визначення значень МІС8О для кожного бактеріального патогена. Результати аналізів представлено у
Таблиці 21. Зразки 1-5 виявились активними проти пов'язаних з сільським господарством бактеріальних хвороб. Цікавим є те, що деякі сполуки, очевидно, мають мінливу активність проти певних хвороб. Наприклад, Раеєпізегіпе добре доповнюють Фусарицидин А, оскільки вони є здатними контролювати РЗОМТМ, а це є слабкою стороною Фусарицидину А. З іншого боку,
Фусарицидин А компенсує недостатній контроль над ЕКУМІСА, який спостерігається для
Раєпізегіпе. Так само, як в аналізах для грибкових хвороб, виявляється, що, хоча всі вони є активними самі по собі, комбінація цих складових є важливою для кінцевої ефективності готового продукту та спектра його контролю над хворобою.
Таблиця 21 11111111 МІсво(уУррту/////ССС
Зразок! |Раєпівейпе г |777799 17111144 | Мо "МОК: результат не виявляється (тобто, відсутнє інгібування бактеріального росту при найвищій випробуваній концентрації) "«Зразок був нерозчинним у мікробному середовищі і не піддавався випробуванню.
Приклад 20. Виявлення синергізму через дискодифузійний аналіз Кірбі-Бауера на чутливість до антибіотиків
Для отримання первісної оцінки синергізму між різними класами подібних до фусарицидину сполук виконували біоаналіз, використовуючи рослинний патоген СОЇ ГА. Біоаналіз являв собою класичний дискодифузійний аналіз Кірбі-Бауера на чутливість до антибіотиків на агарі
ІВанег, А. МУ., єї аі!., 1966 Ат. .). Сііп. Раїйої!. 36: 493-496). У загальних рисах, чисті стерильні диски, завантажені однаковою кількістю різних зразків, поміщали на чашку Петрі, інокульовану культурою спор СОЇ І А. Чашку Петрі інкубували і активність записували як розмір діаметра зони інгібування, яка виявлялася навколо кожного диска. Результати показано на Фіг. 11.
Результати цього попереднього аналізу вказують на те, що синергетичний ефект виникає тоді, коли деякі Раєпізегіпе та Раеєпіргоїїхіп застосовують разом. Раеєпізегіпе А! та ВІ ("868") або
Раеєпіргоїїхіп А2 та В2 ("938") при окремому застосуванні в цьому аналізі демонструють відносно малі зони інгібування. Однак їх комбінація ("868/938") показує найбільшу й найчистішу зону інгібування, що перевершує результати, отримані при застосуванні 868, 938 або фусарицидинів
А та В САВ"). Загалом приблизно 0,1 мг матеріалу наносили на кожен стерильний диск для зразків АВ, 868 та 938. Диск, який містив зразки 868 та 938, містив приблизно 0,05 мг кожного зразка, таким чином, щоб загальна кількість матеріалу на диску 868/938 становила приблизно 0,1 мг.
Обмеженням цього аналізу є вимога, згідно з якою сполуки фусарицидину повинні дифундувати крізь агар для інгібування росту грибів. Ця первісна ознака синергетичного ефекту має бути додатково піддана оцінці через застосування іп міго аналізів протигрибкової дії у рідких середовищах.
Приклад 21. Іп мійго аналізи протигрибкової дії для демонстрації синергізму комбінацій фусарицидину
Зо Крім комбінацій фусарицидинів, вказаних у Прикладі 17, іп міго аналізи на протигрибкову дію у рідких середовищах виконують для демонстрації запропонованого синергізму, який є результатом застосування комбінацій фусарицидинів та/або подібних до фусарицидину сполук, як показано на Фіг. 12. Кожну з груп, показаних на Фіг. 12, оцінюють спочатку окремо для того, щоб оцінити структурні характеристики, а потім у комбінаціях для оцінки синергізму. Оцінюють як подвійні, так і потрійні суміші.
Хоча окремі сполуки можуть демонструвати недоліки стосовно фунгіцидної активності, комбінації мають активність, яка перевершує просту суму значень їх активності.
Синергетичний ефект фунгіцидів завжди є присутнім, коли фунгіцидна активність комбінацій активних сполук перевершує суму показників активності активних сполук при їх окремому застосуванні.
Очікувана активність для даної комбінації з двох або трьох активних сполук може бути розрахована у представлений нижче спосіб (пор. СоІру, 5.К., "СаІсшайпд Зупегдієйіс апа
Апіадопівіїс Незропзез ої Нетбісіде Сотрбіпаїйіоп5, УУеєдз 1967, 15, 20-22:
Якщо
Х є ефективністю у разі, коли активну сполуку А застосовують у нормі внесення т ррт (або г/га),
У є ефективністю у разі, коли активну сполуку В застосовують у нормі внесення п ррт (або г/га), 7 є ефективністю у разі, коли активну сполуку В застосовують у нормі внесення г ррт (або г/га),
Е: є ефективністю у разі, коли активні сполуки А та В застосовують у нормі внесення т та п ррт (або г/га), відповідно,
Ег є ефективністю у разі, коли активні сполуки А, В та С застосовують у нормі внесення п, п та г ррт (або г/га), відповідно, то для подвійної суміші:
Е-Хх ща 100 і для потрійної суміші:
Е» ххх -(КМажва я) яке 100 10000
Вказується ступінь ефективності, виражена у 95. 0 906 означає ефективність, яка відповідає показникові контролю, тоді як ефективність 100 95 означає, що хвороба не спостерігалася.
Якщо фактична фунгіцидна активність перевищує розраховане значення, активність комбінації є суперадитивною, тобто, є наявним синергетичний ефект. У цьому разі ефективність, яка фактично може спостерігатися, повинна бути більшою за значення очікуваної ефективності (Е), розраховане за вищезазначеною формулою.
Ще одним способом демонстрації синергетичного ефекту є спосіб, описаний у публікації
І|Гаттев пор. "ІзороЇе5, А Старніс Нергезепіайоп ої Зупегдівт іп Ревіїсідеб5" іп Меїй. У. Ріапі
Раї., 1964, 70, 73-80.
Приклад 22. Вибір варіанта штаму виду Раепірасіїйй5 МЕРІ. В-50972
За стандартних лабораторних умов штам виду Раєпібасійй5 МКК. В-50972 продукує багато структур колонії на твердому агаровому середовищі. Кілька морфологічно відмінних колоній розпізнавали й зберігали у гліцерині при -80 "С. Культури в рідкому середовищі інокулювали з використанням цих запасів, які походять від різних фенотипів колоній, і після кількох циклів вирощування у рідкому середовищі повторно інокулювали на тверде агарове середовище. З нього розпізнавали один ізолят, який мав стійкий фенотип колонії за випробуваних умов, при цьому зберігаючи здатність до продукування термостійких спор та складових фусарицидину.
Зо Ізолят зі стійкою структурою колоній є бажаним для подальшого поліпшення штаму (див.
Приклад 23). Цей ізолят було депоновано у МКК. 1 вересня 2015 р., і йому було присвоєно такий номер доступу: МКК В-67129.
Приклад 23. Випадковий мутагенез для одержання поліпшених мутантів виду Раепірасійи5
Хімічний мутагенез
Для створення пулу генетично відмінних ізолятів штаму виду Раєпірасійй5 МАК В-67129, вирощену в рідині культуру штаму осаджували шляхом центрифугування і ресуспендували у буфері, який містив 1-метил-З-нітро-1-нітрогуанідін (МТС) у кінцевій концентрації 400 мкг/мл. Як контроль приготовляли другий зразок без МТ. Зразки інкубували протягом 1 години при 30 "С та 220 об/хв. Через 1 годину зразки осаджували шляхом центрифугування, промивали буфером, який не містив МТО і остаточно ресуспендували в такому самому об'ємі свіжого буфера. Аліквоти нерозведеної культури заморожували у гліцерині при -8070. Зразки розводили й поміщали на чашки з агаром для визначення колонієутворювальних одиниць, і відсоток знищення визначали як еталон для ступеня мутацій на геном. Поліпшені ізоляти, вибрані з першого циклу відбору, піддавали одному або кільком наступним циклам обробки
МТС, як описано вище, і відбирали для подальшого поліпшення у продукуванні фусарицидину.
Продукування фусарицидину визначали за відносною кількістю кількох сполук, включаючи фусарицидин А (також відомий як ГіБО4а або "Ри5 А"); ГіБОва; Раєпізегіпе А! та ВІ (також відомий як "М868" або "8687"); та Раеєпіргоїїхіп А2 та В2 (також відомий як "МО38" або "938").
Високопродуктивний скринінг та характеризація ізоляту
Оброблені МТО зразки розводили й поміщали на чашки з агаром для одержання окремих колоній. Окремі колонії інокулювали у 9б-лункові блоки з глибокими лунками, які містили середовище для посіву, які інкубували зі збовтуванням протягом 2 днів при 30 "С. Після цього нові 9б-лункові блоки з глибокими лунками, які містили середовище на основі сої для продукування, інокулювали й інкубували зі збовтуванням протягом 5 днів при 30 "С. Через 5 днів приготовляли зразки у гліцерині з кожного зразка в окремій лунці і зберігали при -80 С і зразок піддавали хімічному аналізові чотирьох біомаркерів фусарицидину, які було розпізнано раніше. У цьому первинному відборі окремі ізоляти розглядали як збіги, якщо їх "загальне значення фусарицидину" (тобто, сума чотирьох аналізованих біомаркерів фусарицидину відносно середнього показника значень дикого типу) було вищим за середній показник значень дикого типу плюс Зх стандартне відхилення від значень дикого типу. 8 примірників кожного ізоляту, вибраних на основі цього критерію, вирощували й аналізували, як описано вище.
Зразки, у яких підтверджувалося надпродукування фусарицидину, далі піддавали збільшенню масштабу у 50 мл об'ємі у 250 мл колбах для культивування зі збовтуванням і характеризували стосовно споруляції, продукування фусарицидину та біоактивності. Пріоритетні ізоляти піддавали подальшому збільшенню масштабу з перенесенням до біореакторів і знову характеризували стосовно споруляції, в'язкості, продукування фусарицидину та біоактивності.
Кілька мутантних штамів одержували від другого циклу обробки МТС та скринінгу, і було виявлено, що вони мають чудове продукування біомаркерів фусарицидину та біоактивність.
Приклад 24. Характеризація чутливості до антибіотиків штаму виду Раепірасійи5 МК В- 50972
Штам виду Раеєпібасіїй5 МКК. В-50972 інокулювали на твердому 5І В агаровому середовищі та 5 В агаровому середовищі, доповненому антибіотиками у типовій концентрації. Чашки з агаром інкубували при 302 С їі ріст оцінювали через 24, 48 та 72 годин. Чутливість штаму виду
Раепірбасійи5 МАВ. В-50972 до кожного з випробуваних антибіотиків показано у Таблиці 22.
Таблиця 22
Чутливість до антибіотиків штаму виду Раеєпібасіи5 МКК Вв-50972.
Приклад 25. Характеризація зробА у штамі виду Раєпірасіїйи5 МКК В-50972 та штамі виду
Раєпібасіїи5 МАВ. В-67129
Геноми штаму виду Раепірасійи5 МАНІ. В8-50972 та штаму виду Раєпірасійи5 МАВ. В-67129 піддавали секвенуванню. Порівняння двох геномних послідовностей виявило характерну різницю у 5робА гені у двох штамах. Як показано у вирівнюванні послідовностей на Фігурі 15, штам виду Раєпірасійй5 МАВ в-50972 та штам виду Раепірасійй5 МАВ В-67129 відрізняються одним нуклеотидом у напрямку 3'-кінця 5робА гена. Різницю в один нуклеотид було розпізнано і вказано червоною стрілкою під послідовністю на Фігурі 15. Номери нуклеотидів відносно першого нуклеотиду 5робА гена вказано над послідовностями.
Вирівнювання 5робА ортологів від утворюючих ендоспори бактерій вказувало, що зміна
Зо нуклеотиду в кодуючій послідовності штаму виду Раепірасійи5 МАНІ. В-67129 в результаті веде до заміщення однієї амінокислоти в консервативній ділянці (див. Фігуру 16). Амінокислотні послідовності Зроб0А з Раєпірасіїїи5 їетає (еталонна послідовність МСВІ: МУР 044647644.1),
Раєпірасіи5 роїутуха 5ОВ8-21 (СепВапк: АНМб66630.1), підв. Васіїїив5 з,ибБій5 штаму 5и,ибійїй5 168 (еталонна послідовність МСВІ: МР 390302.1), Васійи5 сегеив ЕЗЗІ (СепВапк: АлЛІ26924.1) та
Сіовігідінт разівешіапит О5М 525 (СепВапк: ААА1Т8883.1) вирівнювали у співставленні з амінокислотними послідовностями 5робА зі штаму виду Раєпірбасійи5 МАВ 8-50972 та штаму виду Раєпірасійи5 МАВ. В-67129. Стрілка на Фігурі 16 вказує на єдине амінокислотне заміщення у БРробА зі штаму виду Раепірасіиз МАНІ. В-67129.
Приклад 26. Дослідження залежності активності від структури фусарицидинів, Раеєпізегіпе та
Раепіргоїїхіп
Залежність активності від структури кількох очищених фусарицидинів, Раепізегіпе та
Раеєпіргоїїхіп досліджували з застосуванням іп міїго аналізу, описаного у Прикладі 16. У першому експерименті порівнювали найбільш поширені пари фусарицидинів. Варіація в цих фусарицидинах трапляється в амінокислотній позиції (5) кільця/ланцюга з аспарагіном або глутаміном. У цьому дослідженні Фусарицидин А порівнювали з Фусарицидином В, а ГіБОва порівнювали з Гіг08Б6 відносно рослинного патогена АкКегпагіа 5оЇапі (АСТЕ5О). В обох випадках аналог аспарагіну був більш, ніж удвічі ефективнішим за його глутаміновий відповідник (див. Фіг. 17).
В іншому експерименті порівнювали циклічні форми фусарицидинів з ациклічними.
Залишилося нез'ясованим, чи є ациклічні форми фусарицидинів попередниками чи продуктами розпаду кінцевої сполуки; однак вони скрізь трапляються у ферментаційному бульйоні штаму виду Раепірасіййш5 МАК. В-50972 і є поширеним забруднювачем очищених фусарицидинів з цього ферментаційного бульйону. Протигрибкову активність фусарицидину А порівнювали з сумішшю ГБО4с та ГіБО44 (ациклічних аналогів Фусарицидинів А та В) в іп міго аналізі з рослинним патогеном АГСТЕ5О. Існує значний вплив розкриття пептидного кільця в естерному зв'язку. Ациклічні аналоги були неактивними у найвищій випробуваній концентрації (див. Фіг. 17). Це є важливим з точки зору структурної інформації та для демонстрації того, що ці сполуки, які зазвичай є домішками у в цілому очищених фусарицидинах, очевидно, не беруть участі у протигрибковій активності.
Також досліджували амінокислотні заміщення в амінокислотних позиціях (2) та (3) кільця/ланцюга. Аналоги Фусарицидин А, ГіБО5а, ГіБОба та І ібОва відрізняються в цих позиціях комбінаціями валіну або ізолейцину. Їх випробували в іп міго аналізі з рослинним патогеном
АЇТЕБО. Двома найбільш ефективними аналогами були Фусарицидин А (валін / валін) та
ЛРОова (ізолейцин / ізолейцин). Інші два аналоги, які складалися з суміші валіну / ізолейцину, були більш, ніж утричі слабшими (див. ФІГ. 17).
Також досліджували розбіжності у протигрибковій активності з новими Раеєпізегіпе. У цьому разі також оцінювали дію проти АЇТЕ5О та відмінності в амінокислотних позиціях (1) та (4) кільця/ланцюга. Класичні фусарицидини обмежуються треоніном у цих позиціях, тоді як у
Раепізегіпе можуть чергуватися треонін та серин. У цьому аналізі Раепізегіпе продемонстрували протигрибкову активність, подібну до дії фусарицидину А (див. Фіг. 17).
Протигрибкову активність Раепіргоїїхіп (тобто, аналогів з різною довжиною бокового ланцюга) також досліджували шляхом іп міїго аналізів на дію проти грибкових патогенів АСТЕБО та СоПефюігіспит Іадепагішт (СОЇ ГГ А). Класичний фусарицидин включає 15-гуанідино-3- гідроксипентадеканову кислоту як боковий ланцюг. Було виявлено, що Раеєпіргоїїхіп мають 2 з 4 додаткових метиленових груп у ланцюгу. Було продемонстровано, що довжина бокового ланцюга має явний вплив на біоактивність, і виявлено розбіжності з конкретними грибковими патогенами. Проти АГТЕ5О незмінна довжина СНРО була найбільш ефективною, зменшуючись з кожною додатковою метиленовою групою. Проти СО ГА найбільш ефективною довжиною була СНРО-2 Сн» (див. Фіг. 17).
Приклад 27. Синергетична протигрибкова активність сумішей Фусарицидину А з Раеєпізегіпе
А1 або Равепіргоїїхіп С1
Іп міго аналіз протигрибкової дії на 96-лунковому планшеті з реагентом для визначення життєздатності клітин на основі резазурину РЕРЕЗТОВІ ШЕ? (див. Приклад 18) застосовували для оцінки протигрибкової активності фусарицидинів, Раєпізегіпе та Раеєепіргоїїхіп, окремо та у двох комбінаціях. Протигрибкову активність розраховували відносно показників необробленого контрольного зразка за таким рівнянням:
Ефективність - (100 - відносний ріст необробленого контрольного зразка) 100 95 ефективність вказувала на відсутність росту грибів порівняно з необробленим контрольним зразком, а 0 95 ефективність вказувала на відсутність інгібування росту грибків порівняно з необробленим контрольним зразком.
У Таблицях 23 та 24 чітко показано, що активність комбінацій активних сполук згідно з винаходом, яка спостерігалася, була більшою за розраховану активність, тобто, був наявний синергетичний ефект.
Таблиця 23
Протигрибкова активність проти АкКегпагіа 5оЇїапі Фусарицидину А окремо,
Раепізегіпе А1 окремо та Фусарицидину АтРаепізегіпе А1 . Норма внесення активної сполуки у Ефективність у 95
Активні сполуки ж жк мг/мл виявл. розрах.
Фусарицидин А 11111025. | 390 | щ щКрИиВесСво
Раепізегіпе А! 0,0083 05
Фусарицидин АтРаєпізегіпе А! 0,25-0,0083 х виявл. - виявлена активність "к розрах. - активність, розрахована за формулою Колбі
Таблиця 24
Протигрибкова активність проти АкКегпагіа 5оЇїапі Фусарицидину А окремо,
Раепіргоїїхіп окремо та Фусарицидину АжвРаепіргоїїхіп С1 . . Ефективність у 95
Активні сполуки Норма внесення активної сполуки у мг/мл ж жк виявл." розрах.
Фусарицидин А 11111025. 1420 2
Раєпіргоїїхіп СІ 0,0083 25
Фусарицидин АтРаєеєпіргоїїхіп С 1 0,25-0,025 х виявл. - виявлена активність "к розрах. - активність, розрахована за формулою Колбі
Якщо немає іншого визначення, усі технічні та наукові терміни у тексті мають значення, які є загальноприйнятими серед спеціалістів у галузі, до якої належить даний винахід. Усі наведені публікації, патенти та патентні публікації включено до цього опису шляхом посилання у повному обсязі з будь-якої точки зору.
Слід розуміти, що описаний винахід не обмежується описаними способами, протоколами та матеріалами, оскільки вони можуть змінюватися. Також слід розуміти, що застосовану авторами термінологію вжито лише з метою опису конкретних варіантів втілення, але не для обмеження обсягу даного винаходу, який обмежується лише супровідною формулою винаходу.
Спеціалісти у даній галузі на основі звичних експериментів зможуть визнати й пересвідчитися в існуванні багатьох еквівалентів описаних авторами конкретних варіантів втілення винаходу. Такі еквіваленти охоплюються представленою нижче формулою винаходу.
ПЕВЕНІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«М» Яаувг Сторесіввсе ЕР «120» НОйИиМ ШТАМ РАЄМІВАСЄТЬОуВ, ПЕОТИГРИБКОВІ СПОЛУКИ ТА СПОСОБИ їх ЗАСТОСУВАННЯ «іще» всі о «В» о цБ5 ба, 7655 «і15із 01550356 «1505 5 бо, Ох «іі 2015-09-24 «150 0 «МЛ» Ратеніїїв верстя 3.5 «і» ії «ех 50 «їй» РЕТ «ії» Раепійпасі!)Їб5 реогіде «МН» їі
Аза Аїз вен ма! ТУг АкроРго Уа! ТВготіє бін біп їі із біу нів 1 5 іа 15 ізш уді Ні5 бен мет сім зів їі Уа! бід асп орго Аїд ЇТв бег Уді
За
АВ АЇа бен бін беб оУуді Твг о бго бій бів Аго біц бій тів сеу дал
БЕ 45
УВІ Тео біу ази ТвгоГуз бі Хе Туг єв Мі Суб ап Те Рае нів
БО 55 5 бі бен бен сів сіб бій лів бі аАго ТВгоВго ав дія те А їв 65 та 75 БО
Тер овне біс др біш бег ів Тйг о Туг аїа біш їеу дбп Аа гу діа 85 Ко р а5а біу цен ліз ака Ага сечо ага Те бій біу Її уз ТВг обіУ Абр 100 105 1 їеци ча! С1у сео їТе АТа біб Ага бек обею сбіш Мет її узі СТУ ІТе
115 120 125 тув біу їіе Меї іу5 Аа біу сі Аїя Туг Уа! Рго їі Ахр Рго бі 130 135 150 ту РгОо груз біз Аг її Зег Туг Ме ви бів а5розег ді Аа рух 135 150 155 1 їев її цеу твгосівй аїя нія Ре іву бід Мі бен обі Тгротаг єї1у 155 170 175 азп Уа! Кен оіїецз їец АБробіц бегобег ТВг о Туг дзр о АБа АБО ОТГ 5ег 150 185 а мир івц бів аАзо ТНг о Аїз біу Бго ар оаБроїви Ав Туг УВІ тів Туг 155 200 205
Твгозег о біу ївгб о тТнг обіуУу бів врго фух біу Уаїф івеу уаі бін нів Агу бі фен вго ахпоіен баг Ар омді Туб бі АТ Ні Ре біз уаі Тве
Ех 230 235 240 вго бій" Або Ага тів уУуаї бій ре Аїз чек їв баб ве ар Аа заг
Ах ШЕУ КЕ 245 250 255 чаї Баг сію тів ев тВгодія бею его нів о1у бі уд! сен Суб Ї1і1в
БО 25 27
Рго бБег Тато бів Азр Ті іец АзЗр нНіз діа беу Ре біц бів РВе мех
ВО виь
АБп дЗроіу5 біу Узі Тпг Узі Аїд ТВг оїеу Рго Рго Аїа Туг Ааїа Ті
З 295 303
Ні ен Ар овго бів Аг фец РгОо Твб ів Аго Сух Кен оіви Твк ді 305 ве 315 320 біу Бег Аа АТа бек Уві бі цей Тіе біб сію Тер аг фу5 НІ5 уд! 325 30 355 ага Ту баг Аза бі Тугб бі го ТВе обі Аа Бак омаї бує ТНК тТВе
340 5 350 їі ткр бер уз! Бго азробБвг бів біз Аїва Таб азр їі Уді бек їв 355 36 3655 біх св Рго їіе діз дхп Мміз бек уві ТУг Ті ге Ар о АКоО НІТя РНе
ЗО 175 ї80
Агод іем біп Рго Уві сбіу Узі Аа біУу бів іву Су Кі беб зег Тв 385 що 335 апо сіу мен Аїд Аго пі Туг ні АБп бів вго Бу Ге) Ме аАБробію вух 805 «10 415
Ре чаї Ар Аа РгО РНе Аа РгГоО бі бів Аг Меї тТук Аг тТпг обі 42о0 45 430 деріен та! ака Тгроіви го АБИ бі тТвг оті бій туго ви біу Ага 435 «40 445
Хіе ар ніх бів аї бує Х16 Аго сту Туг Аго Хе бій ву 51іУу бів а) 455 ко
Уа! бі Аїа бій Меї і-й Аго Уві Рго бек уа! бів біш Уа! Уві Аа яв а 45 ко
Меє Аза Ав бін бпіу бїйш йзр о Сіу Туг уз азроїіви Уві дія Тук вве 455 Б 5 чаї аіа вів сів ух сеч біз маї 5ег сій іву аго аїа УдДі гео зеб 550 505 510
ЧФім мес ен овго біу Туг Мет ІТ РГО бег АКоО Рйе іє біп беу бів зі5 КУ 525 кро мет РгОо Сей тик о 5ег ав бі ух ті Ар Аго СУ АЇв ген пів 53 515 Бе бі зіц Ага біу Тер дів 545 550 «ій
«Ф1їз 550 о «Мах ВЕ. що «Іі3» РаепіВасі!із5 роіутшуха «ех й д5п Аїд мер ма! туг дер обіп ма! Твг їі біу біп їТе Ку сіу нів ї 5 10 ї5 іївч Уаї Ні5 цез Меї Сію бій її Уві бів Аа о рКо АТа їі его уд! 0 25 вій ав Аа івеи бі ген уд! тТвговго сій біц Аго сіб бій ів вен Ап 15 40 45 чві їтр біУу ай Меї груз біу ЇЇ Туг бін ніз Суз Ази Тнг Ре Ні 50 55 БО бу еу їви січ сів бів Ав бі Агі ТВКЕ Рге АБО Аа ТнР Аа де
БЕ о 75 що
Ттре вве бів А5р осів бегосец твгоТує Аїа бів ген деп АЇВз хв АТа зо 95 ви ціУ іве Аїа агЯ АК іео аго їв бів о1їу 116 зуб Те б1У АБВ цю ке 110 іви Уві біу Кеш Те Ав сів Ага Бег ем сів Мет лів уві біу Хів 115 155 125
ТУуг бі Хіє Меї 5 Аа біУу бі діа Туг уді Рго їі Або орго бів
Туг Рго уз біз Аге Хі бБег Туг Меї ів 5іб Ар Зег бі АЇа ух 145 1383 155 15 ін їі веб таб біб Аїа ні ем іво бів ні без бі Тгротвг бій 165 т 175 ап ма! Бецч їеноіїен Ав бі баг обЗвг ТВг оТуг Ар АТя ар ТвВг Зег іо 155 193
А5п веу бін ар тн АЇа сіу Рго Ар оахроїво Аїа Туг о маї жів тує
Та Ка 25
Твг о дег о біу ТВготТве обі бій Рго і Біу ЖаїЇ бец Ууді біз Ні Аг хат Ж | ехо сСіУ сен Рго дей ін бег Ап Уді туго біу від Ні бВе бів маї тТВе тео 30 235 24) го бів Ар Ага їі узі бів Ре Аа баг ої) б5ег рве АБр Аїд 5ег 245 2 5О 255 чаї бек бів т1іе Бен о твг оаїа сви беконі сіу біу Уді бец Суб Тв 25О 255 я рго бек таг обі АЗв їі сец азр ні Аа іївео вве бі: бів Ре Ммеї ей 285 ап аробух біу Те Тнг Уа! йїа тйгогей Рго рго ліз Туг АТа Те
І 295 300 ні фен ар РГО біШ АКРО їеу РгО Тйгогбеу дго СуУ5 Мей фе тн АТа 3 що 315 32о біу бЗег Аїа Аа бЗег уа! бін іен її біш Біш Тер оаго Бубз Мі Уді 325 330 315
Аг Туг бег о азп обію Тугобіу Рго Те бів Авробег Уа! Суз ТВ ОтТНг 340 345 зх їіа тгр Баг уві Рго АБО бес сів біШ Аїа Тйг о Ахр їі Уаї бек їв 355 300 355
Сіу ага Рго їів АїЗ Ап оНі5 его ма Тут Ті ву А5рой5р нів ее 370 175 за
АгГО Кен сій РКО Уаї сіу Уа! діз бі бід бен Сжае Хі бег 5етг Те ї85 зо 395 аю
Сіу сви Аїа Аго біу ТуУук Ні й5пП Ага Рго біз сви Мет а5р обі уз 05 10 415
РнНе Уа! Азр аБп Рго РВе Аа его сбіу біб Ага Меє Туг АгОо ТР одіу 420 425 436
АВ іви Уа! Аго Тгр осез рго а5а біу Твкг їі бів Тк бе біу Аг 435 ве 445 тіе ахв о ніз бій ма! суб Хі агу бі туго аго Тіє біб бе СТУ бів 450 455 що таї бів Аїя бів Меї се аг маї Вго бег Ууаї біп біз Уді Уві Аїд 465 470 475 480 ет Аїд Уві бін бі Ар Аз о ОіУ туго і дБ5рівц Уа Аа ТУР РАВ 485 чо 495
Уві аїа Аїд іп осує ви біц чаї Зеб бів беу Аг Аа ма! фен Зег а 5 510 бій їі івгу вго біу Туг Меж Її Рго бег Агу Ре їі сів беу 51 515 ей 25 ар Меї Рго вец ТВгобег Аа біУу ух Те АБроАго у Аа Се бів 530 535 540 сіу бів Ага бі тро Аа заз 550 сек е ж ЩІ «81їз 550 «Іі3» Раеп'засі!ій5 роїутеха «НО» З аїа вен уд! тТуг або Рг Уа Тнг о жіє ст) бів ів вуз Сіу нів ії 5 10 15 їси уд! Мі5 бео Меї біб біп ї1е Уаї сіб аха Рго Атя ів бек уд!
АБО Аіа сен бі іво уві тТВгоРРО бін біб Ага біш бів тів Бей дей
Уаї тго біж Ап тТвВгогуз біу їі Тек бін Ні Суб Ахи ТВг вне ні зо 55 БО
Сіу вм оїен бів бі бій аїа біу Аго тТВгоРгО азр о АЇа тнгоАїа Те 55 о 75 ЩО
Тго» вве біз а5о біш Зегоге) ТВ Туг АТа бі сен АБИ Ааїа вуз Аа 85 зо Бо вп біх їжу Аа аг дго цез агу твг осів біу тів бух твк о сіу ар 100 105 о іез маї біхж ви їі діа бій аге б5ег сви біб Мет їТіє Уві біу Те 125 125 тус біу їіє Меї уз Аа СіУу бі Аа Тук Уа! Бго їЇі6 Ав о Рго бу 30 135 130
Тут Бго уз біц ага їі бег Тук Меї бе біз Азр о бег біу АВ Гу 155 150 155 150 ів0 ї1і2е їец о тпгосіп ліз Мі Бе оівем обі Мі5 сей біу тТеротнг у 1655 179 175
Ап оуаі Бей івн сей Ар обію бек обег Тв Туг Ар Аа ав тТпг Заг
ЗО 155 зо деп се бін АЗзр ТВг о АТа СіУ РгО АБр АБ оце діа тТуг уві Ії тТуг 195 200 205
Твг бек о біу Тиготвиг о біу біп Рго бух біу Узі ву Ууя! іш Ні Аго 210 215 22а0 біу цен рРго Ах їен Зег ар уві Туг біуУ Твгонів РБе бів уУді Те 230 5 248
Рго бій ар Аг їіе Уаї сів РВе Аїд бегоївб бег Ре Ар Аа бег 245 250 255
Уа! Зег сіб Ті це ТК одіз беу его мі5 біу б1у Уа! їви Суб їв «БО 255 В
Рго Зек о Твг бій ар їі ев Ах ні від фев ве біз бій вве Мех жа 28 ак5
БО да ав ої бі ї1а ТВг Ома! АТа ТВгоїеу бко вро Аа Тук АТа Те 298 а щю
Ніз іез а5р Рго біц Аго без бго ТВгоїеоз Аго Суз себе твг аа 305 3 35 320
Зіу Заг АТа Аїа Зег о уаї біц Кей Сів бів біб Тер Ага уз Ні ма! 325 338 335
АР тує бак аа бі Тук бі Рез ТР осів АБО бБегоуді Суз ТВе Твг 380 345 350
Те тер оЗег уаї вго азробзег біб біз іа ївйгб оАзр оті Уа! бег Ше 360 з біу вагу Рго Ті аіз А5поніз бег Ма! Туг тів сем Ар д5рв Мія рРНе 370 395 їв аго івц біп рго ув! біу Уа! діа біу біц цем Сух їі бег Зег Тв 385 з 395 о біж меи дія Аг біу тує ніх Ап Ака Бго Бій бе) Меб ар бін ух 425 410 «15
Рпе уаї ар АБа Рго Рпе Аїа Рго Сіу біш Ага Мех тТуг Аго ТВе о сіу 420 425 430 дер іец чаї аго Тгрогер о Рго аа сбіж Вб оКіє ОТ туго беу СТУ АгО аї5 40 чав їі дзр нів біп Ууаї груз 112 Аго біу туго заго хїе біб їв Фу 619 450 455 60
Уа! біз Ав бій мес без заго Уа! Рго бек Уа! іп бін Уа! Уа! Аїд 470 475 45о
Меє Аїа Узі! бі бі Аєр Ар біу Туг їв дЕр Сен за! Аз тук Не 453 498 455
УВІ Аїв Ав бів муз сен біб чаї бЗег бі; Бей Аго Аза Уа веу бек
Мю 55 510
БІ сін меї їву ро бі Туг Мет ів Рго Бег дго Ре їі бій бе бі 515 520 БИ вав о Меї бго ев ТК обег ахАа біу іух Іі ар Аг бу5 дія Гец вух 55 5
Фіу Бі Ага пі Тгр аа 545 50 «Я «їх 550 «зх» Б що «ЯЗ» Распіває? ії: воїущшуха «МН» 4 дхп Аїа івеи ува Туг Ар о Рго Уаї ТВг бів біу бів Зі гфу5 бу Ніє 1 5 10 15 йец узі ніх ев мет бій біп їі Уа! бі Ай Рго із те бег Узі «о 25 ХО
Азов аа їеу бін ен Ті Те бко бій Бім Агу бів бів їі і ви Ап ав 45
Ууаї тт біу А5п о Твг о фуз йіа Хі Туг бій Ні Туг дп ТВг о РНе Ні 5 55 В. сіу ем ів бі бін біп аїд бі Ага тТВгорРго АБр Аїа аіз Аа її 7 7 КО
Тгв вна бій Ар Осій бек ів ТК Тур йа?я Фі гей ач Аа туз Аа 85 чо 935
Ап осіу цеч лій Аго Аг кеу АгРО Твйгосій бі тів вух ТР ОбіУ Або
НЕ 105 110 меи ма! біу іс тіє аа біз Аго Зегоїен бі мет Ті ха! біу тів 115 15 125
ТУуг біт ІТ Мет гу5 Аїа бі бу АТа туго Уа! рго хв АхВ РКО Су 133 1135 140
Б2
Туг Вго біп бів Аго Ті ЗегоТук Мет іви бів Абробеб біу Аа Бу 145 158 155 150 це їіе цен тпгосбіай аіа нії цем бе сіб Ні ве бі Ткр отак сти 165 170 175
Ап Ул! Бей ів сен ар біц бег бег Тнг о ТУг АБр від Ар о тТВг бег 15о 185 о ахв мен бі йхр тТВК йїа бу Рго аАзроАзр о бец Аїа тТуг жа! їв Туг їз юю 205
ТвВг о бегодфіу Так оте осі бій Рго вух біу ма? се Узі бін нія Ага 210 5 20 бі фен го Ахап без бек ойзро уві Туг біу Аа нів Рне бій уУаї ТВг 225 230 235 240
Рго зіп ар ойго її уді біп Ре Аїа бег ву бег Ре Ахр АВ бер 245 250 255
Уа! зег бів тів сем Те оаїв Бец бек Ні біу сіу Узі без Сух Те 250 255 27О
Рг зег о ліа сіп дер тів рез др нії Аіа бен Ре біб бів Ре мех 75 еВ 285 дя" Ар губ сіу ів тик оуа! Аїа твг оіец вго РКО Аїа Туг дія Тє ха гав 300
Ні ве АБр РГО сіб АгО бен Рго ТВг оїеу Ага Суб сен ев тТвг від 305 З1о 315 32о бі баг ТВке дід 5ег їі біб фей їі бів бій ТкроаАга у Ні Уа! 325 330 135
Ага ТУР 5Зег азп Бі Ту біу вгш Тве осіб Аз озег о уаі Ск Тнг отне 340 345 5 ї16 тер б5ег уді РгОо Ар бек біб бі) Авіа твг Аа їів Уа! 5вг їв 155 160 зБ5 сі ага бго їі8 Аїа Аа нів хек оуді ТУг їв іеу Ар Ар нія вве 37О 375 ко
АгО бец біп Рго Уві біу маї Аа сіу іш Бей Суз Ті бБег о б5ег Пе
Зк Б 95 щю сіу без Аїа Ага біу Туг Ні Аби Ако Рго бім ге Мет Азро бів Куз міх 40 215
Ре маї азр Ап РгО Не дід вБго бі зіц Аг МеЄ Тук Аго ТВг о б1у 420 425 430 азрівн ма! Аго тТвробен вго Аа о біу азп їі біб Тукг ви біу ага 435 345 445 ї1е АБО ні бій Уа! ух Ті Ага б1у тут Ага ї1е бів Кеч с1у б
АБО 455 450
Уа! бів Аа біп мМеб їеци Аго Уа! Рго бег Уа! біб біз Ул! Уві ліз 4655 470 475 450
Мет аїа Уді бін бі Ах др о сіу ТуУуг їу5 вв ву уд! аіа Тук рве 4855 що 495 чаї Аїа Аїа біп о їух бен бів Ууді бег біб гез Аго Аїд Уаї бе сег
БОЮ ах 510 сім Меї бен его сіу Туг Ме Сів Рго 5ег Ага вне їЇв бій сей бів 515 ка 525
АВ Мет сен їв тб обег Ах біу їух Ііе Ахр Аг уз Аз їв бій
З 535 540 бік біб Аго біу Тго дів 545 550 «і0з 5 «її» 550 «212» РЕТ «еі3» Раєпівасі!їн5 роїУтУуха «ЗК» 5
Ахп Аїа бецч уаії тук Ар бій уаії Тнг Кі бів біб Хі уз бів мів 5А іец ма! Ніз їеи Меї біб бів Ті Тіє бій ап Рго АЇа Твг бек ма го 25 30 аер аїа їен сію їеи Уа Тве о Рго Біб сін ага бі сій їв сеч Аба ча! Тер обіу а5а Твгоаба Уа) Суб Туг бі ні АБа бег о Твг о РНе нів 5о 55 БО
СіУу ів їв біш біб бів Аза о1У Аго тйг ого Ар Аа Тпг Аа ем 7О а КО імец бе бі А5р біз Мет цеч твготук аіа бій сецз аха Ав ух діа 85 о а5
Ап біу му дія Аг Агу сем Абу тиг обівй біу Хі був Твк о сіу азр а 305 мо сви Уві біу ем їі Ааїя сім Аго Зег бен біз Меї тів ві б1у Тв 115 120 125
Туг бБіу їі Мет їуз Ав бік сіу дів Тук уд! Рко їі Азр РКО бі щюЮ 135 140
Тук РгОо уз біш Аго тТв бек отук мет се бі Авр бег су Аа вує 145 50 155 ївбо ви Жів цец тТпгбобіб діа Мі веу себобіу Міб5 ев бі Тгротак сі 155 170 175 заг Ууді іец ви фе ар осіб бег обер ТНг о Туг Ар Аїа а5В Таг Бог 1850 185 о
Мув ей біз Азр ТВк Аїа сіу вгРо Ах йзвр бе Аїд Тує Уа; Хв тук 195 200 «5
ТБгобег осів твготвгобіу сіб Рго іу5 біу Уді вн о маї он ніх аго «2 215 2
Сік бек рРго Аа феч о бег Ахроуаї туго сСіу дід ні Рпе бїц Уді ТВ
225 2130 235 240 рго бів яахр ага їі чаї бів не Аа Зег бен Заг Ре ар дід ве 245 250 55 тУаї его піц Ті рез ТВг Аа гей бег НіЗ бі Біу чаї бер Суб Те 260 25 20
Бго Зак отнеозіп Або їі кви аронії Ууаї сей рве сіб бій Ре меє 275 2850 285
Ахп АБробУх Сіу ів тВгоУаі дід Тбгобео бго Бго Аа ТУуг а1Я Ше 2 2 ЗО ніх сей Або РСО бій аго ей вгОо тагоїез Аго Суб бен оїец тТвг віз.
М що 315 20 біу бек аАїа Аїа Бек хуаї біб цец Хі біш бі Тгр Ага Ку5 Ні Уа! 325 30 315
Ага Туг баг аби бі Тує бі Рго Твтг обі АБробеак Уді Сух ТВг ТВ 340 345 350
Її Тгроб5ег Уа! Рго азр бек сін біу Аїа ТВгоАзр о їіе Ууді бег їв 155 35о ле сім Агу Рго Кі Аа аа Ні бегоуві Туг Сів веу Ар АБо Ні вве 370 375 Зо
Ага Меп осіп Ро чаї Б5іу мазі Аїа біу бів бе Су5 516 Бек 01уУ 1Ле 385 390 395 щю біу бен віз Ага біу тує Мі5 д5п бій Вго біб Без Меб Або бі у 405 мо 315
Ре Узі др АБИ РО вве АЇа Рго біу сію Аго мМеї туго Аго ТВг обу а2о 425 4130
Акроіен Уа! Аго Тгроівн о Бго Ап бі таб оїів бі туг оіву Фу аго 415 440 445 їіе Ар Ні бій уа! уз хів аго біу тук вго ї112е бів івги с1у Су
455 460
Уві б'ю Аа бій їіе зво Агу Уаї Рго бег узі сій біб уві Узі Аа
ЯЗ Я 475 я мет Ааіа чаї бів бі ар Ав о біу ТУ уз йзр бен ча! діа Туг РНе 485 ща 495
Ууаі аїа яівз сів ух йец бін Уві бег бій їеу Аго аїа Уа! сеу бег мщюЮ ще 510 біц Мет ісу Рго б0іу Тук мет хі Рго бег Аго бе 118 сів ен Ар 515 о Би
АВ Мет го сей тнгобек Аа бі ух маї Ар Аг Бу Аїя Ге бів 530 535 54 сі Біб Аг біУ Тгр Аа за5 550 «Ох б «ії» 50 «Ф1й» ВТ І «ії» Равпібаєі!іЇб5 роіувуха «НН» б
А5п о Аїа фен узі Туг Аробго Аїд таг Хі бін бів їіе бу5 бі НІ 1 5 10 ї5 іен вне мі5 сем Меї бів бів Ті Уа! бін Аа Рго дія Ті 5ег Уд! а ях ви
Ав Аа Бей бій фей узі Тв овго бій біб ага бін бій ї16 бец бек чо 45 ча! то біу біб Тнгобів із бер обег гуз НіЗ Аа ТВг о тТвг вве ні
У 55 во оіу шеу без біб біб бів Аїа іа аго Твговго А5в Аза тТвг Аза зе 70 75 що із вне сіш А5п біб Меб іви ТВгоТуг Аіз біз гу Абп аїа бух Аа 5 що 5 ах біУу їец іа Агу ага сем аАго АТа біз сіу їі бу5 Те СТУ АБ цю 105 110 івеи маї бік ей оіво ма! бін Ака бек ТВг о азр меж Ті Уді біу мех ка. 120 125
Тут Фіу їв мет бух дів біу біу АЇа Тук Уа! Рго ї1е А5р РКО біш 13 135 140
ТУР рго вух Сі Ага ів деп о Тує Меї фец бій АБробег біу ТВгофує 145 15 135 1850 мет їіе цен тве бів аїа нія сецоїез сів ніє тів су їгромежх сіу 1655 172 1975 ах Уа! ген оіев меш бів Сі вго бег ТВг оТуУуК АБр Аа Азр обі Бек 150 155 Гю
Ап ви іує Аво ТвВг о аїа Ахвобег Азв Ар оіец Аз ТуУуг ча! Ті тус 195 о 25
ТвР обег о біу Тег отв обі бій Рго уз біж уаї бе Уа! біш Ні ака кан 215 22 сі еп Аг АБа Мен жег Ахв Уа! Туг Аго біу фев Ре біш ма! ТВ 225 3 235 240 рго бій др ака їі узі бій Ре ліз бек оїеу зеб бе лей дід бег сах щи же чаї Бег бін її Іі тнг о АТа іву Звг нів бу Аїя ТВгоїви Су Те
Бго бег Тиг бів Азрвоїіе іец й5р Ні Аа їец Ре бі бій Ре мет
НО 85
Ап оБег уз йіва їі тТнк їі Аз ТвВгоіео рго РКО Аа Туг їі їі в «Я БА, мі5 без сію го Бін аго бу Рго Аїз ву дго сСуз ву вец таг о аїа чо що 315 320 біу бег Аїда Тийгобег узі біб без 11 бі ув тТгро Ага бух нів чаї 325 330 335 біп Тувє РБе деп сіу ТУб біу Рко тТВг обі АБО 5егоуаї сСу5 ТВг ОТГ 340 345 35
Мех їТкр о Тнгомаї рРко Ар обес бі бі Тиг мет он Аго Уві Баг її 355 35 355
Фіу біп Бго Хіе Аа Аха нів Аго ма! Туг Їів ен Азр о АБр Ні Ре 370 375 38о
Ага Уві це Рго маї біу чаї Аїа біу біц вбеу Суб 112 бег о1у їв 385 КО 395 БЕ біу сви Аїд аго біу Тує Ні ап бів бго діа без Меє азр бій вуз
Ре Узі а5р Ап Рго Ре Те Рго Сіу бін Агу Меї Тук аго Тнг біу 420 425 430 й5рівецн Уа! Аго Терен Рго Авробіу Твйг обі біб тТуг бен біу Аг 435 440 445
Тіе дхр нів бій Уа! Ух Зі Аг обіу Тугб Ага тів біб ев бі 51М 450 455 ай чаї бід Аа ніх Меї маш аго Уа! Рго Ре уд! сій бю Уаї маі АТа
Яб5 470 475 489 сей АЇв Уа! бів бег бібю АБО о сСіу Тук тує Ар іеу уаі аз Тук Рве 485 га 435
Уві Аїа Аа сій ух їец бі ма! беб бі сен аг АТа хаї беу заг 505 510 сів мек сво вго біу Тук Меж їі Рко бек ага Ре Уа! бій беци бів 515 52 525
АБ МОЖ ргО іев ТК бек ах» біт уз тів а5р аАго уз АЗа ви бій 530 535 540
БО бі» бБіч бів біу їгр зів ках Б «105 7 «їх 550 «а РЕ «її» Раепібаєсі)Їв5 ооїіувуха «НЕ» Я
Ахи АВ іец уві Тук азр РКО баб Твг оті біш бів Сів ге С1у нія 1 5 ів 15 іви вбе ніх сви мет біз сій їі уаї бі деп овРго ад Ті Зег ха!
М 25 30
АБр Аа сви бін бецй о уаї ТвВгоРГО біп біш АгО біб біп бі6 беу Ап 15 40 45
Ууаї тт обі бів ТвВе Бі Аїа бек заг цу Ні АКО твг отваг о РНе ніх 5 БО сіу сечо іеч біб) біз біб оаїа йіз Агу тТаг о Рго АБр о АТа тве о Аїа те 05 70 5 КО іец РНе біб Аа бі) Меб сез тнг туго діа біз веву А5п ав вух діа
К5 зо 95 деп бу іен Атїа Аго Агу іеу аго Аїа бів біу Хе рух таг о фіу а5р
Мо 105 мо їец ха! біу во» Меси Уа! біб ако бег ТНК о АБроМет їі узі біу мех 115 їхО 175
Туг біу її мет гу Аа сіу біу Аїа Тук маї Ро Меї а5р Ро сій 130 115 140
ТУг Бго цуз біц Аку Іі АБпП Туг Мек Мем біз Азр бег бі Тнгогув 1435 що 155 150
Мек їі ву Ата біп діа мів бе ем Сію Ммі5 Її Ахр Тер мех о1у 165 170 175 бо дхп Уді іен фен огец бів бів Бго бек ТвВг Тут др АТ Ар оБію Заг їх 185 ча деп огец фу Ар о тТвг діа ап Зег дя Ар ви мів тТуг чУаї їв Тег 155 20 25 тТвг обБег обі ТВгоТвг обі бів Рго уз сіу ві їви Уді 5ію Мі Ага 210 215 22
ЧіУу ін аг ах іец бок Аброуаї Туг Агу біу без вве біб та! тТВе
Бго біп дер Аго тіе жа! біп вве Аїда Зегоїеу бег Бе аАБр Ага 5ег 245 250 255 чаї бек сім Те Хе Тв о АТа сец бегонії бію Аїа Твг овен сСух Тів
БО 255 270
Бго беєг тВтг бів ав Сів зіву або Ні діа сец Бе біо біп бе меф 275 ещО0 а ай Зег іуя А1їа ті ТНг її АЇя тВкоїец РКО вго Аа Туг Її їв 290 295 Зоо
Ні без сію Рго біб Аг о гСез Бго АТа без аго Ск Гец бе Твг аа 305 зо 15 32 сіу Баг аіз ТВг обБег а ів ву тіє Бій ву тТгРр о АКа фує Мі Уві 335 330 335 сій Тег вне Ап осі Тук б1у Рго тг обід Або баг уд! Суб ТНгОТНе 340 345 350 мет ттротиг" оУді Рго АЗе его оіц бів тве мет соти асо Уа? его їїе 3653 305 біу бів вгОо ті Аа Аа нія Аг Уаї Тук їв ів ахо Ар нів вве зт З 350 аго ма! сен РГо маї сіу чаї віз бі сіб їеш Суб Х16 5ог Сіу їв
Зв за 395 4 в1 сіу їв вів ага біу Тук ніз азп бій ко яіз бе Мет ар обі Гу 305 АТО СЯ
Ре Уа! Ар АБ рРГО Ре Таб оРго сіу Сію АК Мет тує аго пе оо1у й 425 А
Ар ме Уа? аАго тгроіен вго Азросім Твк жів біб Туг бе зіу Аг 35 340 445
Ііе Азов о ніз біп Уа?! вуз 112 Аго сіу Туг Аг їі біз бво біу біб 455 455 450 уаї біз АТа ніз Меї Бен аго Уа! Рго Ре ма! бій бів Уа? Уаї Аїа 455 лі 475 що іїви вліз узі біб бег біз яБросіу туго фу Ар сен Узі дія Туг вве 485 490 35
Уді Аа Аа біп бух бен біз Уа! 5ег бім сен аго Аїа щі це бег 500 Ох 53 ів мат бец рго біу Туг Меї Т1е Рго баг аАго вве Узі бій беи бі 52 525
Абр мет рго сем те о бег дяп обі уз їТ1е Ахр о Аго губ Аз ви бій 530 535 ща біж іш іп сіїу тер Аїа 545 550 «ах В не: 5 «її» Равпібасі!ін5 роїушуха «Щі» 8
Ах Аа фец уа! Тук Ар оРгО АТа Тк їі Сів сій їі ух б1у нів ї 5 10 15
Ме впе нів ігц Ме біб біз їі Уаі сіб зп РРО Аїв їів ог о уді ре за
Ав о Аїз бви бі беу уаі ТВговго біп бів аго бі бій іа бе; Аза 35 40 45
Ууаї тгробіу ахр о Твгобіу аїз яегобегофух Ніз Ага ТВгоТвВг рве ніх що 55 БО сі ви сви біб бін бів Аїз бі аг те овго дер Аа Твг Аа хів 55 7а 75 Що
Уа! вве біз аАбп о біц узі без ТВготТук Аіз бін ес Ап Аа ух діа о 25
Ап біу мен діа Аго аго іем дго дів бів біу Ті вуз ТВт Оу Ахр 100 це 10 бен уді Сіу їви Ті Уа! СТУ Ага беє ТР АБр Мет тів узі сіу мех 120 125
Туг бі їів меї уз аіз біу бі аід ТуУгоулі Рго тів Або РГО Оу їх 135 145
Туг РБго бу5 бін агод Ті ахп Туг Меї сей біз АЗр о бег біу ТВг оку» 145 158 155 150
Ммеї Ге фей АТа біп Аа Ніб5 їв івеу біш ні аку біу го так обіу ї65 17 ї75 йкп ма! ген йеу сей ар о біцч Рг Бек Твг Тук Ахв АТа АБО тТНе аг ї15о 155 190
Ап обец ух Ар ТК Аа Ар ого аАхр АЗр осені туго ма! тів Туг 15 2 05
Твг обегобіж ТвгоТвк сбіу Агу Рго щув біу ві бен Уа! бій Ні Ага 21 ЗЕ з ' 210 І М біу Кеу біп АБпоїен о зег ав узі туг Аг біу ву Рпе біу маї Тне 5 230 235 24О го бів аБр Аг їі Ууаі бій вве АТа зег бе бег Ре абр о Аїа Зег 245 250 255 уаї зег бій їі ів твгб отв осеу бег ніз біу Аа Твгоїео Су Пе 2656 в та
Бго бБег тигосіп біч їі їеи дзр нів Аа сен вне бід бів вне мех 275 зо 285 ахп ав був сіу Хе Твгоуаї Аїа Тнг осей Рго бро аїа тук діт Те ни 25 З мі« Бен біш Рго бів Аг ей рго тйгоіен дго Суб беу їв так Аїа 305 Зо 315 32
Зіу бег АЇа Тнгозає чаї біз гео Т12е бі уз Тгр Ага уз Ні чаї 325 330 315
Сіпй ТУг рве Аха АфЇа Туг біу бго тТвгобії АЗробег о маї Су ТНК ОТве 140 345 35
Її Тгр ап АЇа бій Ахп бек ові біЮ тТвг Уа! сіу їі Уві чек Ге 155 3650 105 біу іа вко її АТЗ Ап ні Ага Уві туУук її беу яБросів Ні РАае 170 375 зо
АгО їви їв рго Уа! біу Уа Аа бі бію бец Суз Ті бегобіу Ті 385 в У 400 біу зви Аа Ага біу ТуУук Мі Ай Ага РКО СБ фей МеєЄ Ахо Бін уз 405 що 415
Рйе ув! АБр Ап РКО Туг діа вго біу бі агуо мет Туг аг твнгосіу 4-3 42ь 43
А5роіви Уа Аго тТероіен о бег яз" біу ТВе їі сі) Тук гву сіх го 435 о Ах їі Азов Ні бів Уді уз їі аго біу Туг Ага ї1іее сів сво сім 16 уз 455 4650 чаї сій Аїа ніх меж іво аго ді го бег омаї та бір Уа! уві уд! 455 хо 475 450 їец о аіз Ууаї біб б5ег Ахрв о Ахр обі Тук фу Ахроїеу Уді Аїд Тує РНе 45 ее 435 уа! Аїа Аа сій уз йез бі) Маї зЗег бід ген Аго Аа АБроец зег що 505 50 сі Меї бе) со біж Те меї бів Ро бек АКа Ре Кі бій бец іш 520 Бо
Ар Меї РгГо ме) твгобек Аа біу ух їі Ар Ага вує Аа сен бій 53 535 540 бі бі» Агу ТУ Тгр Аїв 545 550 «210 З «гії» 550 «дій» ВЕК шк І «813» рРаєтівасі!їц5 роіушуха «НЮхх 5
Ахп ав іен ув! Туг ар Рго АТа Тег Ті с1ібв бій ів вуз бію нів ї З 10 15 їец Ре Ні5 ів Меї біб біп Тіє Ууаї бій А5п Рго Аза Тіє 5Беє Уа! 2 25 ЗО
Ар Аа ги бі їеу Уа! Тк оРго бів бів Аго бін сів їі ев дай
БІ 45 чаї Тгр о біу Ахр Тапг обі Аїа б5его5ег Бу5 ніх Аго тТвгоОтТвго ре нів 50 55 БО бі еп івн сіб бій бів Аїа бі Аго Твг о вго АЗр Аа Ве АТа те й 75 Во
Уві вве бім дя біб жа! без тве оТуб ад біз ву ах" дів уз Аа 5 Зо З5
Аха біу бен дід АгГу аго іви Аг аіз бін ЄїУу ї118 вух ТВг обу АВ 100 пе 1
Мем Узі сіу се ЇЇ ма! біб Аге бек ТВг Ар мес тіє Ууаі сіу Меї
115 120 125
Тут біу Те Меї їує Аїз біу біу Аїа Туг Ууді рго ЇТіе Ар о Рго сів 3 5 148
Туг Вго їуз біз Ага Хі А5п о Туг Мет їв біз азробег біу ТВг вуз 145 їх 155 15 мМеї тів ви аіз бій аїз ніх іву їв біш Ніз ага бі тго тн у 165 ТО 175
АБ УВІ івц оівсу сей азробіц Рге бег ТвгоТує Азр дія Азо о ТиРг Зег ї8о 185 199 а5п о іец іу5 Ах» ТЯГ о Аїа Ахрорго азр ар оіви АЇа Туг узі тів Туг 155 20О 205
Тк Бек біу тик о тТвгобіу аго РКО їуУу5 біу уаї їв Уа)! біз Ні Аго
КК І 22 сі бе сій Аа Кеш зег АБрома! тг о Агоа сію без Бе сію жа тТАг 225 230 235 40
Рго бів Ав Ага їі у! бів Ре Аїа 5ег їеу чЗег рве др діа заг чаї Бег сі) тів цез Те ТВг осеу зе? нів біу діа їВйг беу сСуз ї1а бо 255 270
Рг 5ег Те бів сіїб Її сен а5р ні аа бе РНе біц біп Ре меї ках 2 5
Ап АБО уз біу Ті Тйк оуа! Аїа тик сец РгОо Рго Аїа Туг Аа Іїе 20 295 що
Ні5 цем сів Рго біб Аг ев о рРгО Тйг оце аго Сух себе) твг Аїа 319 315 320 біу бек діа тТВг озек узі біш Сец їїе біб вуб5 тео Аго їУ5 нів Уді що 335 сів туг ре Ап аіа тТук біу Рго тт осів Ав обег о маї Су ТВг оте
Іі тгродчхпап Аїд сів ай зег обі біз твгоУді біу їі Узі 5ег ї1е сіу біп рго їі аїа Аза Ні Аго Уа! Туг Хі ее а5р сію Ні Ре 39 375 ЗО ага сечо бво вго Уаї біу маї АТа бі бів сечу Сух тт бег обі Тв 385 3 за5 00 біт гео аа аг біу ТуУуб Нія Абв Аго го біб зіец Мет Ар обі уз
Б що я
Рйе уаї а5р Аза РГО Туг АЇа Рко біу біз Аг Меї Туг ато Тне б1у
СУ 325 ЩО ав Кен Уві Аг тероіви зЗег аа бі тТвг їі біб Туг бву сіу АгО 435 440 «45 їі а5о Ні біп Уа! фу їі Аг біж Тук Ага Ті БіШ ів біу бій 455 450 чаї біз Аіа ні Меї їз дко Уа! Рго Зег ма! бій зії маї уаї хв 465 зо 475 Во іеч Аза УВІ бій бБег Ар оаб5р о біу Тугофуз Ахробви ча! Аа тує РНе 455 о 49
Уа! Аїа Аа бій бує сец о обі Ууді 5ег обі іеу ага Аза а5о сво Бег
ОО щі5 510
Сів Мет зей РгО біу Туг Меї Кі Рго 5ег Аго ве Ті біб беб бів
Вл НН. заз
Ар Ме РГО Се тТвго5ег ап бі їу5 118 Ар Аг уз дія ву іп 530 535 40
Фу біз Аго біу Тер аз 545 550 «Оз 1
«21 250 «аа РЕ «евіЗ» Раєсєпіваєі!1їи5 зр. «вх о
Ап тйгоїец Уа! Туг аАБробег бек Аха тів бі» Аго Ті Аго біу ніх ї 5 ни, 15 їец Узі ніх сецз меє бі біб Ії ді бух а5п о Бго біу Хів бег Уа!
ЩЕ вич за го 2 вій азр авіа ви бів іец ма! Твбгорго сів біз аго ар нів ів ву Ай 435 40 45
Т1е тер о фу5 ав 116 діз Уві ро Тук біз нів Тук АТа бі ву нів 50 55 БО
Аіа бів Аїа бів твгоаїз го Ті біу бів Рго Азп Уа! Туг То уд 55 7 75 ко ахр Ар ні Ре Аго іс о їво Рго УВі біу а! АТа оту БТ бен сСуз 85 чо НЕ її Аа біу уаї Сіу Рйеє тйг Агу бі Ні нів Ап Ні Рго бім Сем і ї1а5 М
Твтг АВ бій бух Бе жа Або Ахий РКО РНЕ Аа вгО сі бін Аг мет 115 їх 125
Туг АгРО Тве біУ Ахроїєу діа Аго Терен бго Азробіу ТВг о тіе бів
Що 135 148
Тук Кен біу ага Ууаї азр нів бій чаї їу5 їв Аго біу Туб аго чаї 145 153 155 15 сі фен обекє бін Уі біш АЇз сій Мет сем їуз маї 5іва бек омаї сій 1865 за 175 дер ма! Уа! Уа! Меї Аз Уаї біб бі ар Азов біу Мі фу5 А5ріги 150 155 190 рве Аа Тут Ре Уа! Аїя Аво бів тТВк ів 610 ї1е 5ег обід ец АгО 205
Аа чаї фен бег сій їец сец Рго уаї Тує Меж Кіе Рго бек нів Рве 210 215 220 чві біп без бів аза бро ген оіео тег РГО Зеб біж уз Ті дзр Аго де5 230 «35 Ав іуУу5 Аа іец бій біУу Сім ако бі тгровів 245 25 «їй» 1 «вії» 550 «Вій» РЕ. «ії» ВБаепібасііінц5 50. «кН» і
Ап Аз бец Уа! Туг А5робій Уа! ТНе їі бів сів Ті Бу5 бі Ні ії 5 10 15 ів ча)! ні івгь Мат біз біз їі Уві біб Аа без дів Ті Зег У!
Ав Аїа ген бів їец о уаї ТвгоРКгО бій сів Ага бів ви тіє бе Абр ї5 «0 45
Уі тгробіх Аза тагобуз Ууші Зак туг цію Ні Суз а5А ТВг вве нів | БО сіу ем іви біш сів бій аіз б1у аго Твг ого біб АТа те о АТа ї1а 55 70 75 а
Уві рве бі Ахрв бій Меї сец тТнг о тТук Аа біцівв дя дів фе Аїд ях З вх
Ази біу ву АЇа йго іуз зви аго а5а сів бу Ті бій тТвг о сіу Або то 5 що іви ув! біу бен Іі Аа АБр ага бег бег бії меї Те маї сі ІТів 115 128 125
Тиг біу 112 Мет ух АТа сіУу БіУ АТа Ту Уді Рго тів Ахр о рго бів 130 135 150
Туг вгОо уз бін Ага ї1е бек тТук мех сец біш Ахр бе сіу Аїа уз 145 159 155 ї50 їцво уві фец Тк ост» АТа Аго Бен без бі Ні веб бу Тгр ТВЕ б» 155 179 195 ап ді йеч їсц їеи й5робіц Рго 5еб ТВе Туг АБр оАТЯ АБротає 5ег 150 185 193 деп фен іх Ар отвг уз! біу Рго А5р оаАха ев Аа Туг Уді Жів Тук 195 юю 205
Твгобек о біу тб оте о сіу біп Рго уз біу маї їен о маї іш ніх Аго 2 215 24О
Сіу без біп ахп обер бек йБр о Уаі Тук біу ТБгоТук Ре сів Уві тТее 225 23о 215 240 вго бів Ар оаАго тів Ууді бів Ре Аїя Зег ген бег Ре ар Аа ес 245 250 255 ча! бБег бін Ууді цеу тТвк оаід іео бег ніз Фіу Аїа із рей сСух Хе
Бо 2655 27о
Рго аег Твгобів азр тів фев Абротук АТа ге Ре сіц бій вБе Те 275 е що 285 дп АБр Суб Біу Ків тївйк їі Аїа тк осез Рго Рсо ліз тук Аа тів 250 «85 300
Ні ев бів РКО біб АКо бе Рго АЇв ев Аго Суз свв вео ТВе дів 05 що 315 320 ціУу бег Аіа Ав зекоуа! сіб без Ті біб уз Тгроаго бує ніх уд! 325 330 335 аАго Ту обег о азп осі Туг бі Рго Тк бів аАзр бек їі Суб ТВК отв 34 345 350 ї1є Тер озег уді его Азробег сів бін тб огец біб Те ма! зек їв 155 1650 365 сі ага Рго їїе їз ахпоніб5 бегоуді Туг Уудї оз Ар бів нів Те
З 375 зо ага їв бів рго уа! сСіу уві Уа ді бішіви Суз тів бег о Біу Тв 155 Зо 5 аю біу бен Аїа Аго біу Тук Ні Ап АгО РКО АїЗ бе Мет АБВ стю Бу ах 410 315 бве Ууді бін ап Рго РБе твг о Рго бі бід го Ме Туг бро тн су щ-о ща 5 ах іец чаї аго Тгроіви Рго дай біу тТвгоХТе бі тує Уа! СТУ АгО 435 Се 345
Ї1е Ахо нів сіп уді ух Хі Ага бі Ткг Аг їв біб сев біу бід 455 450 чай сій діз біп Меї су ага Узі бій звгоУді бій обію УЗ Уді Аа 465 АВ 5 ко мес аіїд Узі сій бі Ахо АБО бі бів бує ар сви жі дід тує вп чкх о 435 ча! Аїа аїа аго біч без бій маф зег біз сей бій ТвгоУа! беу бек
ОО 505 5 сіц Мет реч его біу тує Мет ті Рг бег ако РНЕ ї18 бій іги сій 515 а 525
Ажр Мет Рго рец ТвВкоЗег деп біУу рух ї1і6 Ап аго уз АТа без бів з 535 з4а0 зі» вів ага б1у тгв ав 345 ЗО «її» ща «від» ДНК «213» РаєпівВвноіїіфцу5 5. «Ю» 12 сосСзаазаа гспзоотасх зісоосто сасалссодю засстасода соц осс алататвіст сспзтсвоов посатаєодаа зстасСаоуая ссоесстасза єс ояа 120 т тссязс асаїсоасаця вгсссосває зсасстовсо ХасттвнессЄ зоасастатс їво акасстсвІс сбазТааЕсЄЕ соосасаіто озососетоз олоззатоазва сетотестеса 240 сапссдязаа їсабтасост оасєосаєєс здісвадава атаєтасоса азазассота 30о свасссеаоцо савісстатєтств бассттстоазо ссосстовся тодаваКтаєх ссессвассоде
ЗО чссоссавї Тїспососоасс асааттавоєс яеслосавсс сеесчасомк ссусссаа савсствато їозлптассавтї сабдсалазсо заазаєстод ачесаостає сасеюсатх 450 атесатовав їсинастасс зостсатаєс зашнитасс затаствеа соазаассау 540 аствісостаЄ асаатвататї сувааеттста оотоссасса ссааласакт ятассссоса вісоссовая засттвавас оасоцєсатссс сососооває осуссаєссо тсатассате
ОО
Задвтоасає чеасасотво сзасатсоас аосятстстс асстестсвоа сбасасеатх 72О зататссссв заїссзадсс зпассавстса дае татта сосок товсазостх 780 сс вова атакує стох кщ «иїї» 8 каїйж ДНК «ії» РаепібБасіїїЇ)х зр. «ФОП» 13 гтусадлава ттЗазотаєт аттоостває пзсаасєсвоо ватстасозва ссЕдсттосе
ЗО вещшац ссчаєсводпа асСатасзоза ссіасзпова ссосстатаза сСоогозаоая 1 : о атострсвас асвісцсвюа ассоасвас пшассізато тасстаєсст звозсвітатє 150 акоасстсаїс торатоцісєт суосотасто свосостоора здаозаатова сстесссса 250 садсспаазва їсвттатУсєт дастосаїєс доїсазозал асаїїасоса азоазоссота що свастсачод саїсєттаєка тастттоввоа ссассстдаса тодавотаЄєт ссссавссоє
З
Іс ссяВІ содіосвес асваєєзакс восаосачєс сютовсоаЗс сссктссаго 420 сачсстаато тобтодєсзат содсззавсо азазаєстов атоссватаї тасрассатх «5о віссзісаав їсозасвасєс зостсвівіЕ вмер таєс засвсссвся суавессасх
Ба астассвсє зспаїзатає сосавасс а зетоссатса ссваазсяєЄ ататсессося
БО вісоссодана ааїктазавс дасоцсаєсс сеосодаває фооуссатеса тсатоєсаке
БО бадатадсах ппдасасоатою сласвісдасє зосатсієтс асо сод стасяссатх жа - ясний тк вататстсса заїтссавасс сассзастса саутттаєто соастзоєвах соасавосЕх "о сосастозаз атязоассотс стда вок
У и І «А» Б; «ій» РЕТ «Я» Равпібасііце55 теггає «МК 14
Ме бів 5 Тв біс Уа! іеу сез лів Ар о аБр о Аха Аго сім еве твг 1 5 10 15 ап Сен із АТа біцш тує ї1е бег дер сів бів Ахр Мет ств Узі тв 20 25 за віх тів Аа тТуг Абп бТу бів сів уд! ев піп Ні5 Хіе Аа бін бег 35 о 45 дга Ахап Ууаі Рго Ахр о Уаї йбеу їі фен дер ї11іе ІЇ2 Меї рго ніз ге
БО дер обіу шви бі Уа! 2 біб Аго Бен аго біз Меї Аза бен хек вро 70 їх що
Зіп о рго уз ї12 її мет із Так о АЇїа рве сіу бій біц Аа тів тТАг 85 0 25 бів Ага Аїа ма! бів бе біу Аа бог Ту Тук Ті ви руб РгГО РН їв 105 Мо вер Мет бі Уа! сен Аа АБп В ча! Агу сіп о іев уві біу го бів 115 їх 125 івм У! Зак бег бегоРго ву Тйгожаї Зет бЗег меї го бЗег Ап Уві 130 135 140
Уа! Рго Мессі муз ТК о дуУу5 а5и іеу А5р Аїа бБег їтіє тВг Аїа тів
ЗУ 150 155 ії
КТ нів бін тів бі маї вбго дія нія тів руб сіу Туг о біп Туг сво 165 17а 175
Ага бін Аа їіе ївВгомеж уд Туг азп о азп їі сіб їТіе ген сіу 818 що 185 190
Тіе ТВг обу ТВгогбеб Туг о Рго дід Ті АТа біб бух Рпе бух ТВг ТВг 135 аю 05
Аїа бек АгО УДІ біц ака Аїа тів аку мі Аїа тів сіб Узі Аза тер 210 215 М;
ТВг аАго бі Аа ті а5робег Хі зЗег Мі грец рве сію тук ТВ їв 225 230 235 240
Ази Кі Бег (суб Бег Гуз Рго ТР АБп бег бі Ре хів Аїа Ме Уа 245 250 55 іа АБр ув сеч дко її сіб дев тує узі бег 250 65 «їз БУ
«їх ВНТ «213» равепівВасії1їі56 58. «ЩЮх 15 іви біп уз Ті бії Уа! фено їец аїа ар оазр о йзп Аг бзіш Бе ТНг 1 5 1 55
Аква їеноіен ліз біц тТуг їі Зв Ав бів бі) Ар омеї біб уд тТАг 20 ве 30 біу їі Аїда туго азп о біу біб бій Ууаї сем бів НІ 112 Аїа бін бег 40 45 дга йзп уві Рго азроУаЇ ів їіе бец йазр Тіє Тів Меї Рго Ні5 г гу 5 55 БО
АБв о біу єв біу уві бе б5іц аго бен аго біш Мет Ачзп о цеу бег рго 55 70 75 КО сіа Бго рух їі ті Мет їез Тк Аа рве бі бій бів ах" Те ТВе що За 5
Бій аго АЇа Уві біпоівен бі Аа бег тує туго її ем о фу5 его вне
Ав Меї бій Уаї їез АЇва А5п о АКо Уаї аАго біб фен уві біу Рго біп 15 125 іви Ууді баг бог бег рго Уа! тТнг Уа! бег олег Мет агро баг дев худі 1 135 140 маї рго меї біу ух ТВговуз Аза бви Ахр Аза Зег їі ТТН АТ їв 5 ї155 155 160
Тіе ніз бів 116 біу жаї Рго Аа Ні Іі ту біу Тує Єїв Тук фен 165 170 175 ага сін ліз Хі Тв омет узі Туг Ах Ап тів бії тів ев бі АВ 159 15 190
Те Твгосух тТвговеу Тук о вго аїа ї1е Ааїа бір вуз Рйе був тве тТве
Не 200 205
Аіз 5ег аго маї бів Ага АТа Хе аго нія Аа тів бів Уаї Аа тер 210 215 220
ТВг Аго біу а5п їв азробег Ті бег Ні бец вве о біу Туг ТВг ої ах 230 235 24
Аза їі его бух Заг оіу Бго ТвВК ой Бек обі Ре їі аа меж уді 245 250 255 діа Ар іух ви агу Ті ЗіБ Аза Гуз Уві баг 26 205 «их 16 «1ї» 257 «аа ВЕТО «Ї3» БавлівВакі их 50. «ННІ» 16 ім бів уз Те бі Уві їез фер Аа ар Ар Ап Ага бі Ре ТВ ї 5 10 15
Азпосеи бец діа біз Тук їі бер ав о біп бію ар мет бід Уді тВг за сіу тів Аїз Тук Аза бі бі біб Уа! рез бів ні її АТа бі 5ег
Зо 45 ага йбзап Уа! Рго Азроуаї іео Ї1е зецз азр о їіе Те Мек Ро Міз ге 5
АБр осі ву ді маї сви біз АгУ ву аг бі) мес ап сви бегорго 55 7 75 о сіа РгОо уз Ті Тіе Мет се ТВгоАТа Ре бі бів біз ап Зв те 85 За 35
Сів йго Аїа маї сій без бі» Аа бег о Туг Тує ІїЇв Сем обу РРО РНе 100 105 їх
Азр о Мех сію Уві ївео Аа АЗп о аго Уа! Ага бій іво Ууді сіу рго бів 115 120 125 івги Ууді Заг о бзек бак о рго чаї ТВг Узі Заг бег мет аго бег Ап Уді 150 115 ії
Уа! Вго Меї біу ух Тагоїуя А5В ізн о йзр АТа бег Тів Твг АТа тів їБ 150 155 150 тів нік біз їі біу та! Рго Аїа нія Тіє ГСух бБіу Туг бїп Туг сви 155 170 175 ага Бін Аа їіе тТвгомекс жа! Туг Ап Ай Іі біз Хі цен Сіу ліз 180 185 190
Ії твгорух ТВгРоїею тує вгОо АТа хів Аїз біц бує Ре фу тТВгОтТАаг 155 2 205
Аїа бЗег дго уаї Сію яаго Аїа її Аго ніх Аїд ті біц уз! ді твор 21 5 220
Фо ей ее» ся
Тнг Ага біу аб Хі а5р озЗег Ж18 баг ні Свеу Ве бі Тує Твг Єв 230 235 ай дей хів бек рух бег гу ргО тТВг Ах баг біз Ре ї18 Аа мет ма 245 5 255 маї А5В уз сво Ага ї1е біб Аза зу Уаї бек "БО 283 «Ом ї7 «її 85 «їй» ВЕ «213» Вавпібасіїіч рофчвуха «00 1 мех бій бух І116 біз Уа! без ів Аза Ахр АбБр Ах Аго бів Ре ТАг ї 5 10 15
Ап ово сен Аа біз туго тів 5ег Ар бій біз ав Меї бів Уді тВе 2 а за
СіУу жів діа тує ах с1у сін бін Уа? ме бій аго 116 АТа бін 5ег
Ага АБп Уа РГО аеро уаії іву її гесц ар о їтіе ї11і6 Меї Рго ніх їеу
50 55 БО ав біУу їеу біх уаї їеу біб Аг їез Аго бі Ме Ази бе» тб РКО 55 20 75 ВО сіп вго був Ті їі Меб без ТВг аа рве біу бів бій ваша хТе тНг що 5 сСіп аго діа уаї біп ів біу Ааіз бБеготуг тук їі веб бу5 го вне 100 105 то
Ар мет біц ма! ве Аїд аА5п Ага Уа! Аго сій кеоз ма! біу го бів 115 120 125 їец Уві бек бег звг о Бго Уа! ТагоУві бек бек Меж Аго бег ай ха їх 135 14 чаї го мет сіу вуз тТагогує Ап ої ву АЗр Аа 5ег Ків тТвг АїВ їїе їі45 150 155 160
Те ніх бів їТе бі Уаї Рго АТ Ні Хв ух бі Тук бій Туг вв 165 ТУ 175
Ага біз дів їі тВг о Меї чаї Туг да Ах5а її бі тів гео сі діз 150 ве 130
Те тТвг офу5 Тнгоївн Ту бго діа їі Аїда бів фу5 Ра суб ТВгоОТне їз 200 205
АїЇа бек Ага Уа! бін аАго Ав ті агро ні АЇїв 116 сіб уві АЇа тер 210 715 220
Твг аго віу АзпоХіе Азробег Хі бЗег Ніз ву Рее біу Тук ТВг їв за5 2 235 «о аєи їів бег вух Баг о рує РРО ТВг о Аяй его біш РВе їі АТ веж Уді 245 25 235
Уа! Ар вує ву Аг їТе Сі АБА буз жа! Бер
БО 255
«21ї2 287 «й12 ЕТ. с. «їі» васфі1в5 зи «НИ» 18
Меї біз уз Ті іуз Узі Суз ма! Аїд Азр о АЗр о Аха Аго БІВ Бец узі ї З 10 ї5
Ззег о і2р їеу бЗег біб ТуУуг Хі бін бі бів біб Абзор Мебї бію уаї Ті сіу Ууаї Ата тує дей сіу бій біз бух без 5ег ів РНе гу бін Гуз 315 40 45
АвроРгГОо аБроуа! бец Ул! сеш АброТіе Тіе Меї Рго Ні Кеу АБо біу 53 БО
Сен аїа Уа! сен бін аАКФ о бес ага бід бек аброгец ух вує іп вго за 75 о дп оУуаі їі мет бец твг Аа рве біу сів сій Ар щі Твгб ож ух й5 Зо 5
Аїв УВІ! АБр ен сіу Аа бек Туг пе Їів це цуз Рго РНе Ар мех
Сім а5п о веу узі біу мні Хі Аго біп ма! его біу Абап Аїа бег 5ег 115 120 125
Узі Твг міх аго дія Бго Зег бег зіп Зег 5ег Ті Ті Аго Чек чег о їх Її біп о бго бів Рго ГУу5 уз уз А5п о їен Ар аіз бег їі твВе обег їв 145 156 155 ї6о їі нів сів Сів бі Уві Бго А Ніє їі уз бі Туг бец туг Кен 155 178 Її
Ага зі ліз Ті 5ег Мет Уа! Тугк де Ар ої біз бе сец бі бат 150 155 190
Їіе ТнгофуУух уд! ен отуг Рго й5» ЇЇ Аа бух вує Ре деп о ТВгОТВг кан 2 205
Аїа чес Ага чаї біб ага Аа Ті ага нія аа тів бів Уві Аїя тер 210 215 220 чек Ага бім а5и Ті ахр о Зек Тів Звгозег бен РНе бі Тук тТВаг о Уді 230 їх 248
Заг меж твгофуз Ааіа уз Рго Твг Аа бек бін Бе їі ав Меї Уді 245 25 жах
Аїа аАзр су ву Ага сев бін нія уз Аа бек 250 205 «10» 195 «ії» ем «зі ВЕТО «еі3» васі!їїн5 сегеце «Нюх 195
Ме: бін цуб5 їі уз Уа! Су5 цеу Уа! АБр Ар о АБа ву Бін Бен уд ї 5 19 15 -ег мМеї сен обіц заг оТук уді АЇз аз бів дов або Мет бів Узі її за
Фіу Тв діа Туг ази сі» бів біз Су» цей Азп ев іо уз а5Д Гук ї5 «о 45 біп о РгОо АБроМа! бе уві себ Ар Ті Хе Меї Бго нНі5 беу ав о біх
У 55 БО
Бен АТа ча! гей бін вух Мет дго ніз ті бін АК ів ака вів вго ве то 75 80
Баг у! ї12е Меї гео Тк оаїа вбе біу бій бів а5р уаї ТР ух фу 5 о 85
Аїа Уві А5робецз сі ліз бек оТуг Ве її іви бух Рго вве Або мех 100 1 мо біз Аби вени Тйг обек нів ї1е аг бій уд! хек сіу вує Аа Ап АЇЯ 115 120 125
Твк Ії уз Аг Вго Бей Бко бег РВе Аго бег Аїд ТвгоТнг Уа! Азр 135 35 140 бі іже рго уз Аща їси др Аїд Бег тЇе тТйпб 5вг гів хів ні бів 145 що 155 ї6О ї1е бі ма! рго Аза Ні їі уз біу Туг Меж тук цеи Ак біц Аа 105 170 175 їі баг меї узі Туг Аєп ав Тіе біб їен обво біу бег Жіє Таб оцуз їх 155 150
Уві без тує вго зо їі дія ух уз Туг Ап Те ТВг о АТЯ Заг Агу 195 о 205
Уа! бій аго Аїа їЇє Аго нія Аїз їі біз маї дія ТгроЗег аго біу іо 215 Ра: а5п їв ар обег їі бег бег ен Рбе бі Туг ТВгоуа!ї бег Мет бег 225 23 235 зі ув Аа ух рРГО ТБг Ал бег бій Ве їі Ага меб маї Аїа Ар ух 245 25 55 ів; ага іви сін ніх їУ5 Аа Баг «БО «й» 80 «211» 873 «їй» РЕТ «її» Сіо5БІгійічш разбвигіалиут «0» 20 мет бін туг бег вуз Кіз Баг Узі іеи тів Аїа АБр Ар АБп У ОЇ 1 5 10 15 рве Суз Азп ІІ їіеи АБап АБр оТуг бе цем Ахп біп Зег Ар ЇЇ ув! 20 25 КВ
Уа! Уа! сіу Хіе АТз ух Ар сім Ті бі АЇз це ух їеи Те ЄЮ
Бе 45 біц У уз Рго йзо Тен ма! Ті їец Азр сі ів Ме Рго Азлп Мет єд 5 5 5 БО
Ар обіж іви Уа! Уді еч СІ іУ5 ем А Ап ОТ АЙ Лів АБО га то 75 о ча! Рго а5п узі жів Уа! ву его діа чаї біУу біп АБО вуз Те тве 85 що 25
Сіп алго аіа їі твго сен біу Аїд А5ротук Туг чаї ма! вуз вго Ре 100 ї05 їю
Авр Мет дхр уді Ре тнг о буз аго 112 АГЕ обі Мет рРае дп дей ТВ 115 що 125
Її їез Азробег сію ТВгобуз бух ТНК оМеї РгОо Її бек біс уз АТа віз Азр Уа! уз їів лег біп Зег уві Рго їги Азр без біз Азр бів 145 ї50 ї55 ТО заг Ті Же ні біз їі біуУу Уа! во Аа ніз Хі рух БіУу ТуУуг меж 1855 170 175
ТЖг ів Аг біб віз їіе ай Меї уді Узі а5р Ап хів сіб іву ге 1850 155 190 «ег аіа Уа! ТНгобУ5 біц бен тує вго Бек Сів аа вуз уз Туг БА 195 200 205
Тйг отаг о Аїа бек Аго Уа! біб ага діа їі аго нів Аїа їв бу Уві! 210 215 235 дід Тгрозег Агу біу бій ма) Ав отТвг оте ап фуз ву РВе біу Туг же 23 215 КЕ;
Твк бів нів а5п обіу уз бію Бу го ТК аа Берг о біц вРВе їв 81З 245 ке ЖЕ
Мет тів Аїзв Ар цуз ім АгО цей зсув АБп ув маї цув АП Ма! АТа 26 25 я бів 5

Claims (15)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Композиція, яка включає біологічно чисту культуру фунгіцидного штаму виду Раєпібастив, який включає варіант фусарицидинсинтетази без функціонального домену аденілування у третьому модулі (Ри5зА-АЗ), причому брак функціональної ЕибвА-АЗ інгібує синтез фусарицидинів з тирозином або фенілаланіном в амінокислотному залишку (3) порівняно з синтезом фусарицидинів штамом виду Раепібасійи5, який включає фусарицидинсинтетазу дикого типу, і причому варіантна фусарицидинсинтетаза включає амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з ФЕО ІЮ МО: 10.
2. Композиція за п. 1, у якій варіантна фусарицидинсинтетаза включає 5ЕО ІЮО МО: 10.
3. Композиція за п. 1, яка додатково включає щонайменше один Раеплізегіпе та щонайменше один Раепіргоїїхіп.
4. Композиція за п. 3, яка відрізняється тим, що щонайменше один Раеєепізегіпе вибраний з групи, до якої належать Раепізеппе А1, Раепізеппе Аг, Раепізеппе АЗ, Раепізеппе Аа4, Раепізегіпе ВІ, Раепізепіпе В2, Раепізегіпе ВЗ, Раепізегіпе В4, Раепізегіпе Сі, Раепізегіпе С2 та Раепізетіпе СЗ, і причому щонайменше один Раеєпіргоїїхіп вибраний з групи, до якої належать Раепіргоїїхіп А1, Раепіргоїїхіп Аг, Раепіргоїїхіп ВІ, Раепіргоїїхіп В2, Раепіргоїїхіп СІ, Раепіргоїїхіп Рі, Раепіргоїїхіп ЕЇ, Раепіргоїїхіп Ег2, Раепіргоїїхіп НІ, Раепіргоїїхіп 2, Раепіргоїїхіп Ці та Раепіргоїїхіп С.
5. Композиція за будь-яким з пп. З і 4, яка відрізняється тим, що композиція включає фусарицидин А, ГіБОвВа, Раепізегіпе АІ, Раепізетпіпе ВІ, Раепіргоїїхіп Аг і Раепіргоїїхіп В2.
6. Композиція за будь-яким з пп. 3-5, яка відрізняється тим, що композиція не включає І ігОЗа, ШПЕОЗБ, ГігОЗс, ГіРОоЗа, ГігО7а, ГІРО7Б, ГігО7с і/або ГїгО7а.
7. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що штам виду Раепірасілйих являє собою штам виду Раєпірбасійих МАВІ В-50972 або штам виду РаєпібастШив
МАВ. В-67129.
8. Композиція за п. 7, яка включає продукт ферментації штаму виду Раепібасійих МАВ в-50972 або штаму виду Раєпібастйиз МАВ В-67129. Зо
9. Композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що продукт ферментації не включає поліміксин.
10. Композиція за будь-яким з пп. 8-9, яка відрізняється тим, що продукт ферментації являє собою рідку композицію.
11. Спосіб обробки рослини для боротьби з хворобою, який включає нанесення ефективної кількості композиції за будь-яким з пп. 1-10 на рослину, частину рослини та/або місце вирощування рослини.
12. Спосіб за п. 11, де спосіб включає нанесення композиції на частини листяних рослин.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 11-12, який відрізняється тим, що хвороба рослин викликається грибком або бактерією.
14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що хворобою рослин, яка викликана грибком, є борошниста роса або іржа або бактерію вибирають із групи, до якої належать Хапіпотопав сатревійв, Рзенпдотопазх 5угіпдає й Епуіпіа сагоїомога.
15. Застосування композиції за будь-яким з пп. 1-10 для боротьби з фітопатогенним організмом у корисних рослинах.
СРО ро не се вен ' вн М ОО ОО ММК ТЕ ше ЕЕ ши ш н п о пох п по о ра нев ЗЕ МечА ним ни но по п по п по до шишиши ши ниши ш нн нн нин нн п нн п п ех ним нн ни по о п ни по М т нин по п п п зе ЗУ ВИ НИМ НК ПІ НН НО ПО ПА НО МАН щи пиши ши и І І Ж ЕК Кен В нн Ж ВИН НН НН ПО ПН ПН ень й зкечЕ пи ник и пи ни п ВЕ ВЕН РЕ 0 вва сер щі ши чи нини но о п п п кн ве Ні 1 040004..4.....1. ВВЕ ще що ес ее п и о а ВИ ос о Во ВИ ож у м мо и В Ха З МИ КЕ З ОК ВИ їзоак ннезкхун значна вену евотмісох же ее оно з ша ни З В шини нн Н Н петунння і і : пи ши ИН Ї пи ши Ро. НИЙ езі г Н і ВО жі 188 і и іс 12523 ОЕМ Н Н ее Ох Н ї-к ОІВ : вт і НУ спід Гран та Нема А : іч пис їі ех ІАТА і і Н п фея : ТАТА : Н ї Н я АОАТАА Й Р - хі1А Її, р Е і реннфння ші ЕН і зенннню ЕН: Гео ШЕ Доннннндннннкн ШО в Н ї пи ни Н І Н мк ц ГИ і Н Н | Н щі НЕ ЕВ ця зе ШИ щЩ і25! ФІ Ті Я Н Пред кче; А Н сі і ІОВ. нон ік БІВ Н : б а КК 1 їх Н ї їс ї--х їх ІК . Н ко се їх їх ? 1 ' Н пава НЕча ІА ї Н Н сани ї НЯ гі» : ї 1 я Н ї Це і. і і нене ни МН Ї і. и і ! шо ' пифриртр Н Н Ї пет . Н : Тен! У ' жі і о є т -
Це. 12 1- Б: БІК не і І ІБ 2515 Не ' : іі ки іш іх ТА: ї І Е 1 тік ХАТА ї І пен їх ІА, : : ї вва : ІІ А НЕ : : Т і НЕ Е нини зни : жі | Енн іш : ук ше ше що і Н що зі жі: КМ Б НЯ я БА ОВ Бик ее Н ; Те шо : НАД : іме фе і ю 7 Н Н Н У ох ІА! НЕ НЕ диня ше 1 А 1 і Гі мне ни ік Ач Н ї т Н КІ ТЕ ! Н Н пл ї ! Н ї и Не Н т.і і мин нення мо Н : Н Тк! пан ШЕ і пре іст ЕК ШЕ Н Таз що ДН хе інж | пі іх Ук Н Еш Не З Я : ско КИ 1Кн РА Ж ХК, рі 4 рих ТАТА ! ! і --- те 1 З: і зве в мій НЕ ШЕ ГИ: і КО ви ши ше ше І шк нин рої Н Н се р. 1 Те іст веЯ НЕ. Н їм їж Тек | же с Не ш я воя. гі ост : Н пк 1-2 іс іч ' ї ій ЖК і-ї : Н , | ї Од КК ІК ши Хі ; і і іже ЕНН НИ перен Н Я їх : ї : фено : щі і Ї фен ! : Не фетр ; Н ї Нм Чит Алі І
М... і : : : іст Те р ЕЕ - БУ І р, Н іні я і-ї хі Фа 1-3 сі Н Іс і щі пот,
Ще. КН пд рух ТАКІ і СЯ ' че ри ТАМ її" Н , ре р Мі, и Н , ' і-ї Ач Н : Н щі ч" виш и І: і ЕН ЩО ! НЕ Н Ї С. і їі їі Н тт Носов ї ший Н Ї ні й дн І її. пря ши ше Те в інннннн | | Н | ІК. ж р м ї що Н НУ Ї і і і рев: Нся Ї длил жі із ше І р 1 ііі Н ' ЗІ Я ША» й Н Н ЕР Н М: ! Н
8. 1 Гете ех хі і і : ве Ух ЗА ТАТА Гї Н Глен Н їх. СК ЧННИе Н ї фея А | рення С т ЩЕ я ПЕ ! ; яишишни Її з зеіж Ї і Н іш іє ІІ хі Фі іФфі Баня і І біс |Кя 1сзі Н : Ж ді іні АР І Н ра 325 Н іє р і лі І Н Щі и виш ЗА 1 і Н г Ще АІАїА ро Н фея щій | З Н не вони за рі Н понад ШЕ М Н і жеї ХК. іс ! і знана: ЕН НИ пиши З що іт ія Н ї | НИ НИК інн Її : пс с Неае; Н Я І ЖІ іч НА 251 ун ЕН р Н Преси; фе |» Н ше Н НЯ ітьи З Н і Н на огех ТА ід Н : : не пе: м КНУ Н ї фен ЗА рі Н р Н і | пре і Не ' : Міннея Н ї Н у
М. нер ши ще іре нер ШЕ У іде ГУ Ц 5 Н ої її Н Х ялях мі іо шОВІЖ НУ ЯК ко ЖК х б БЕ 1 му 1, Н , іще | по ри і Н : НЯ 155 рин ін хі і : : р рек іл : Н Н Кіш ем Вин дій 1 вон а ТА ШЕ Н пеня і Не | Н Н п ш: Н ї І дн НЕ НИ ! рт, і Н їі , Н І руч : - з кі о. Н Тл и ї їі Н її сн і-й зе - ЧЕК : іт ее ; і Н - трі РА ! г. Це ІА | и Н шини
НИ. НЕ і ннин Н ря Н Н Н ння Н ШІ ОХ Н Н Я пер ті щі ме ва шле нн МР о ння ії Фе рах НО На Не Н РР КЗ НД ЗР ОР ка Не 1 м - : Не ЦК ма А Мо шення Н і ОБ НІ ДА ДИ Я Н ії І Й М З Н ГУ т» ще ' М ; рт і ї- Вечеря | Н ех Н Н Н Н 1 ІЗ Кк х х Пов ІЗ КЕ х х п- Н і Н Н Тон Н | Н Н І, Н ї Н Н МН УФ Н сш ре САНЯ ЖІ тр ші Фі щі ві Н З Ше Не Імя моя Ба 5 рен КЗ ші що щі жі Щі хі ів Ж: В ан екіх що Ж, дет а. Но т їх віх м і р гі мк, гі Ів ші Н ак 1 Ніні збіннння Н -х ї- дядя ! те есте Мн й н ХК он ї й МН. ух ж " зе п. І в Ж ЗК фусвунввави А" аз мн 5 никлічна сполука ре а ж Ту ун А зу го щи : АХ. а наве ж о о о о п в о б-ки к.
о. М ? о т и ДН кож ШЕ ЛК й пциклізих гполуки 2 І ж но - Ї ва й: з т. а у х 28 вн кв Ї Ї ій ща зр и и у ша я вий ши и и и
! І. я і |. В Е Ї х Кк : З А ї й 7 д кове и | " 3 о бьаюттчійреею АКА се АВ з о. ' о а зн З у у ек Іх- Я їй це АД зання ААУ ояженюо РОД) явно а не ; ще т ху ї Е Нео МК ши : і» й й дин - сен г ше Х Ех ! не шини Ж во нин У ши - ве ! ШЕ ! не ит 1. З З Ві р ! мех щі 2 сист В , ОЙ і Кит нонннннтнняюн НЯ Е-И 858 нн В ВА Я -й о І | ск м Осн стентів ет : с Є | -йба захи ан а о и з нь о т нн В В Я з В я В я В о ВК я ШЕ нн, т у гом поз оз оз нн о ее ЄСпехнука | чи ! Молекулярна ! Аза | ЗА | А ! ящвіЖ утримання 00000 века) | ши ОЗСНОАНКЯа о Циклічни о СеНеМис» 0 Мо Уго Аза 0000 Невнявленюо
ОЕМ. ЕВЗЬ Циклічна | Сейм СУ ни: ше ше: же жк с и нини ни І ЯВеЯ о Айнклічна бейямесюв 0 0УВ 00 їУг 00 бо 000 Мевнивеню СтВеТРЛЕОЯЬ Неклння сейм Уві бо ЖИ ЩЕ айва Ацекічня бежева АЖ Б ше ши шини ни сш ОЖІКОЖЬ 0 Циклічна бойове БО бя Б ШТЕРН циклі с еНамнюю Же А 956 о ШО САвиклчна СейюМною Уа Ме 0 єв 09396503 оо арва ійнкнічна о СеМемМеює 00080 Ав 0 Яе 00017 ОКО 0 ПЦеютчна о бойамебв о йо ув б НІВ, тр Ов Хавкіне бойяюеют | Є БО я ЗБЕ на СурАнякачна Собейноюм | йео00УаР 0 бів 6 МЕ ШЕ ши СеНаМебо 0 Уві | Бе 00 б5 0000 Мевнеменю ОВ 0 Авяктчна СеНеМаєюв 09 0 бе 0 Абе 000 Невже Сб Афетчне Сейямибво ОО 00 Пон Го ажкова 0 Мекнічна | баебе Пе Се ож ож 9 ОО варовь Шк ши ши як ик Ш НА "ГА внюлічня Санемномо 0 Лео Ше Аза 96 МО ШЕ Арена СонюмМаєв Моб) б 0 Зб МО
Фіг. 4С ГО ААЯр сення ААЦВ) сен ПнАіВ В а щ о он і | і і ІЗ ; УМАЗК зве МА) ження ДАО сення 7 Ши й Ше к Я сво МО.
Фіг. 5А г : дян в-я ПО нвавв ч о о Й тет Я і Що 1 5 ше -- ! ! : ща пи ще т п. г. п, 8 ше 3 : : : у - ж Й Й Пенн х. 2 .
Е. . . : . со М УМ ї -В в шин ТО ! Що ще Й мктжнжклдлихиміх 0 дили тт іх - а 75 В Ес щ и те шо що із й о я шин Яр : Б ! це о не т- : - рі : й нь ля сов ля к ше 3 : ро дз й ; СТ в : : 5 « ген : Не бояр сок є у мой оч чо со ге св и мин а п не М я М М МС я ВЗ М з Я КК
ПТ овеічна ую І й І о Молекулернй ай 1 А ЇЇ АК Шк Я Єполука БО І Бо н-що 1 ВАЙ С УЖОВЖМИОНВК й | : ооо бфермулаї ОН г, і Е вав жчня і і і | їх! : о Расвінеіве АЛ С Цеклічна | СебзмчюЄь | бер о 0 Лі 0 А 855 На. во нн нний зн них понині ен мое зни конання ниви пан зно унх пи ин іЕаспінчівей» Миклічна ЄзеАзМеЄбн ої ев Сто що ПЕД: іРаецібетівс АЯ С Ациклічна Самі ненІ бер 1 А! ЩЕ БЕ : рн ин епох пив но лин зинарння КА ни ання нон сивини зн нини шо у пн нен ІБосвіеєіве Ай бцдиклічна | ЄВбеМиб Же Вк р обі 16 ї ві ! ом опи Чо ен зо ни ни МН прут па пи нини нн: пом панни пи рен іРаспібеніве НІ Циклічна о СеНоМибе 0 ТВЕоЇ еф р ля : СЕН 1187 оно в пи пи Он ин и пня зви перінни зими пон повин ек у ктнтннян ПО Расвіенве НЯ 00 Циклічна | Себбачніо: о бПж об Беж З бік! БЩ55 | пав: феденнння пово п о о зи» Ду тннн ук енннн кри ж дих зн зн ван нні руни ання ния ПО Раєвікегіе НЯ Ампиклен її бензин їв ої о- Р Ав ої 8ЯУ 5 : родити омивання ну пишу мс ня Пн ПН нн і Басвіжентве Я Авмюпчна о Себінебні 00 мо бек б 1 ОН, ща і і Баевібетте СЮ 1 Цеклічна о ЄзАаею: 000ОБех | що Ах ВК я ! "Расзібетіве СХ Цеющена о Себе; ої Зб о бб6ї 00 бів | ВО. ща ! Енн о ДВО ни но ОКОМ ЗІНЯ Зр н е в и ПИ они зи оон по Ан Пен ли пред М Коасваеківе 3 Ациклічна Семи 0086 ОБ АБ Я Тх і Коен у тн ру о Раезіненвс СЯ | Апикніна СемМес» 0 Зеє 1 Якоб Неннявлено - 3 Ап Я і св У я Твг І п. ке ї я ше К М; Ж Ї г р ца и дів ти ж ши Ше м КИ оон З С и Со ям я ве Ех в ра І -й т МН т од ОН во МН ПД МД ННЯ і : Ї якісне р Уві іззм рн І І: їш ож й рей я шк - шт пох шт ро: яю, роя рень он на сх г сс З ри тм" вч че ки вики че т вч ж в й кн. і г ІВ М і.
М а ВВЕ" й 5ег 855 - й Уві Фіг. бА ів ї : НІ ві мя Ко 5 Це 18: Во Тен : 5) Б ш ен 7 те ВВ нн : КІ І ш Ж З ше г СЯ ї ос Я «о Нав : ж ШИ Ше що - 2 : Зк ж 48: ЕВ ай І 1 се 9 В рення 1 що - ММ Зк «к ДВО ЯщІ жів Мк її І 5 є 5 че м наше ШК - ДЖ фен ч . о ше ї- Е е В. їв ко ШЕ 8. її н іш птн : щі 55 у Женя м зику п ях І Лех Що В В... : НЕ Ж ж що В : і ГК пе
ІІ. 5 ин: ШИ Б - : р СН З Еш соки К Ще Є 5 й -4 : гу Ф-Я : 23 я : яром я з, : г кВ Додрд др нн нд 0 аомВвианеня :
м ЕН АЗпов Зег сн а ав т 7 МН й і Пов Н НЕ : Що - і шк У ; - щі 7 їй щ м -- т - зян А | З о: Ш НО и ЧИ Ос, МН Му Кк сою Со ЯН Ку а протя ще і я и ех щі ху їй а ази "ЯМ ей с шк ж з щк Ма дві о: ! ії іш ше Її, : от, «МИ сит «М шк, сх о реч шк шк шим, Ме газ т ук бе --- ви М Мо ке би вк Зв Мн. и ВЕ з 3 н «МЕ да В ее І и Ав Б ТАг 255 АТ Уа! Фіг. 7А 6 і Не б і с, т т т 7 варене ій ї 51 що с Її «Фі че З пе -ЩА-В Ух Б: че х «о І 1 чі ш Ж В а мк ї «Кк ях ІВ ка ші мок НЕСЕ ЕС хі МОНЕ жОЖ - ЖІ Ох 5 Кк 4 що я хх я В. що Я лу й я ХО ни НЕ сеу Ж дв вад зх ФІ І ж. зевкї Ж - ря с Й я щХ їх Ше Н рр ння шк Ц чі пі В й ГУ ! ши КЗ ни « | шк г ! й т т вишки рен ники Ше 8 кеш Ко не ! ш-к леж. і й пт і щі панди - Н в ї - ух В ду 15. пе Гл хе і вро КВ Би док 5 МУ ЩЕ хі М ще 15, т що як її пшй а пол їх охоссеов М ЕЕ, щ я БУ ж БК КЗ чих - З Є т ТА с ВІ й. 55 ою В «- «5 вн Ж і Сайті); ее АКА, сне ТА пів СН» - Фусарицедин Нео ХВ ; п 38 Се «Равпіргойків АС група І А ! п 18 СН» «Равпіргойхій ГУК пла ! З оон ! т ре я М - се р і ! АКА зве АКА жено ВТБ ення МН» - ния ще НН | нн | ї : Ще : ТЕ ІВ дет: фе : | ! дян В вс жна МИ ННЯ тв і З я є га х Не їй «ЕЕ БО з 8 а у 5 Я ЕЕ не . Я З б. 5 чі у їв ке семи ке
Я. ЕЕ : в Я х й ви це нь поои ; і є й: їв ХО з . І; Що я Сн пк ка : Шен Се
: . Може де З 1 мані Еш же бох - її пз ж о т- Б Я в Ж в пан ж З те бе Певне КВ, Я я : хе І в Ге ще ! Б Птн оо, Гек) кН арен нина АННА УНН Ш « «В но а ; ай 110 ответ рани с Б - дві ж п дян дн Ф и. а їк Шк БО нн о їх З ше а В. ни т а іч сю нн о : -й ж : нин яке ! ов : : : 7 Фо : й . пек Др Н ванн вИ У й «ех пет АК НЕ КІ ю : : ше - пл те
І . . о не 1 Же 1 їчу НН, ж и а и І А ож жк ФУ сш є хх Кк -ш З ОЗ і вх. . кк : о Чає і р Міеелекжлавн о Аа АА А | ще ! й Н І ЄнполУка ! пн чн Хнісх Ро внжо 0 УЖрнМма й і афеоеряульї 1036 ! ви і ИН: В | ; інн іхв) кн нвненннннн панни п вич ЗНО ніни пн прово пу пане пи ння Распіргоімів АТ 0 ЄСебемебне 0 аб: бе ої зе ЗОНРОКНТЬ 9256 000 Расвіртойкнв АХ Сейючнон У Пе ої спа аНРОАСЬ, рОощоа АЖ промо о о оон пон ни п нини ПИ КО НН В пер вон ПН р нн пи ок Тагвівкойхів ВІ 0 Свв мхнюн о Ше в А СНРООСТЬ об36Б 001 пчииудаичшлле мини поро о о он пон пи зв о моно Ам Аанн зни причи шк ТКасвпіртейхв ВІ 0 ЄСвНюМебна ої бе УВК бів ОСНРОЄЄТЬ 95» 0 ОХ / Басвозонн я ее. Ще 00йе ої де ОСНОВНІ щоб 455 Я зевцзго хів с: Сажмомивів її Не ої Не ої ЛВ ПНР 96 осо фея пу мим ам пр попів мин пон аааааананннннннн і Басвірнмиів СХ 0 Сейачиєв: ї Ще бе 1 Св З СНРОЮЄВН Це виявлено і крччцчишшиачачанананаааааеаєнюьши ни пив цен нн оо не нон зн тету Рагспіртніюв БНО 0 Себюхньр о У Уві о Ахв ЗОНРОНКВ 9юма : Олтдо пото вно понині пив нон ПИ од ння сна пон ие похо кан ин нн Раєвівтойхів БО З Себе УВО У 0 Сб ООНРЕНЯСНЬУ 0 Не виявлено а а о п ки нан ро АААААААЛААННКХ Расаірехів КІ І Себе УВ о Пе ої о Ахв ОСНОВНУ ОЗ5зеа с виш п а а а п п п з т кох - Її ях Ж ок їжи г : чук ЇХ хутір ягчву вт, Н с Тагпіртойхеа КІ 0 Собебебин о Уві Я ої біб СНРЕНЯСНУ 9576 0002550 пнФчУуши ие нн ру у 7 ее т | реваквкькти м іні нх пиши оон завів в і Раєвірконхів Б СейжМай: 0 її Уві Ав ОСНРЕНЯСНІ ЗБ БТ А о М і п а п СОН В ПО Н з З 2-3 єю НИ Н - і 7 І ех г: уд НІ Алл Н Гачвач : Тасвцнейва 2 ОЇ СойеМесбь о ії о Уві бів ОСНРЕНЯСНІ ЗБ765 0006 не оно о пон п у он и п он ПИ ня ПО он поро оо нн зн уко ння МИ З Баєвігоівів 51 0 СебчнНбнь о БЕ 0 Це о 0оАхв ОЗНРВНЯСВІ ЗБО1ОВБНЮ І а п В а і А З ВОК КО щини 4 їж з ВА тую ДМ Тож Н С ї НИ НА Її кю: - ді скеквує З і Васвіргейннів Я і ЄСебеМаби ої Пе о Пе ої св | ОНР НАСЬ Не звхваеме і о Ахп й А ре ТО о го СВ ті Я Н 55 Е А Ї І: т шк ТК, шк НАХ Аів т зу НУ ден М КН і ЕЕ: Ка Б в ооо її уд от Стець О Ох шо о с шу чу Як Її що, т Он ОНКО ян т Щеея іч - Бу ран як Ген нене ре ре о шк, их, што я ат Гая з й Бо - г 7 ої дж подія ли зякт ня вчи скит ЗУ ; ма ї 5. НІ Г53 Кох М мо тан В й да й й ке Тв Не ! І Іг 9 ї ее Е рівнин а і Б ї ; З з'ш їз ях ЖЕ ге д пр рн М Я і КС їз слу й 5 я Я ож сі т В . на . мЗи вен М Е ІВ - ЩІ МІК ші Ж і факооФоу хо ї я ее і она От Ще ку я ШИ ШЕ Ж НН г « т 15 і с ще м лен кю м ї т На і КУ га Я - ЩІ 1 В мк ил ке - м ЖІ 1 ге В! і -ї-5 й х ЕЗ у ч - еВ Го - п шк ша МО р 2 нн ях го і я ХХ кн Ока ж З ЖЖ Яков З Бей мсек Я ше ек Ве же Ка ЕК ЕР ренні щу 7 Пак ї У 5 в Ми НУ - і А Но - М з 4 Її 8) Яке дя Но А і НУ її г ка й і УАЗ т а і уЯ Е Ка т ЗВ де хе Моя пекан ї Ф ї , я рення с - М Й -- о Мк ща жк ЖЕ в ГО ще З Бо Беж в Р ще В - І е « Е ; ії 12 В и и ни и ИН НЕ: ІІ дк х у Я З З З а ж 5 Ж Б Ж Я 8 «мвнанзнаан її З Ачпої ск ЕФ оон, Та і ДСН г Н 1: 7 Н т Я. ок а вве Аа КУ й КМ ут ше | ше У ее М м що Ка вза ЗПиХ Й ще долоня у МН. ж а он ка Маїс ов оУу | Пояс Кк ТЕ з ра те зу ва в б я т тк щи и Меч «он. : ВЕ М Й о г З і о ? я я з ТЕ С Шо Фіг. 10А
ІГ.
Ка цех і їі
В. хе пот чо й пед ннннння З що В я і ок ах ка й ШУ яко ек Фо й і : БЕ «і З Н Ше Ж жк і Цо Му БЕу ОКО жів «о щи Же | БОШ же ! КО ті ОК ЯВІ жит 1 о З х (З я 15 Ж ння Те Хе і Кі 15 як що ЕЕ к і М до я КО ОО Б Н Ге х і 5 ння Н Си У Н ЗМК Ж Н ТЯ ох --- ВВ ' ІВ; ї5 ра ще я о ОК М 5 Б Ед - Н бак З ! ЗШ Ба ї 2 : СУМА | ше ! ее КС ї ру ЕМ шию теж 23 шо . с 5 - У їх КУ; в і ЗО Фо о Не : бах шк кі і Їду рення Я Н І5 ї й ях Бя Ішов й р зв і-5/ ця ПЗ й як « З БК ншкя на ї
-. ЯКЕ й ех ях м. - нн: ж Е ай че ї Е я ЕЗ Б т З яю
Фо. Ме я я М Є ів 2 щ ес Бош 00 ЗВЕБ ЕВ е» ко п ЖЗНЯКОНеНІ
КО зх х Со ж. о З о 55 а : КК о ше. КВ о.
ЖЕ. В о - й я о с Б. С І КК ПВ КЕ З я о о. сах Ку я КО ЗВ СО що КО де с с ОК Хе нд ме З а: Ех ко о Ж и ее 5 щей Й о Ох ЩЕ а М г т о 5 соди до с т сн ОО дн Не дн Я ях е ПО с НК о т Те є КК ОХ ї о Ме ПН о а о с. дк ї ТЕ Се - до ще КОХ г я о с ща дов о Е ща Б о в ох що ках к. я о ПЗ о є й о Бо о ка о : Ко о З в ме : я с : г З г с й г ЕЕ с щ Бех с Сх -- З у о й с ОО ве У Осо соКя я о. хо х ж МК др з п о - Те в: 7. м Ж о ще чо с КЕ о п о Ко о ЕВ Ох о За о Б о Я . З - КЕ су
Х. п о Ух сла Б х й КЕ Б ех КИ МИХ В З КОХ НИХ о се й о М о че о о о. о. ща є хв о я Ох Ко Зх о ще У КЕ г З З о. пом КЗ о о ЕЕ З ЗО пря С 55 . я ше 7 о 3. ОТ І оо ння І о. СКУ 5 ен о о о. З ЕІ Я . х шк 7 о
З . по ї с ще й З як ХЕ ТОК оо ПЕН с о о І ОХ Б СМ З нн й ще У У о с с х ех Те п. с КК У о С о о є Кох о І уЗЯщиУ о о У х я о - о .- я - х сосок о 5 о п о ТЕ о. ЕК о м ще Я що с: о ;; г о С с о /. З о З Ей х ох З КК с о т Ме Х
Ж . й С ей о С о Ка - і ї жо о . о З КУ КЕ І вже о а 4 КЗ ДЗ ек о. 4 КЗ МК: З о ОХ я х хх о с Соя КЗ КЕ НВ НК о х ОО С й к КН кн ЗО ях о хе м , Ей Зк кн М о. Є 7 Е --- й д чн СО З ОО 0 я ОО КК о . КЗ й шт Її хаокнх СО сш ях ОО Ох ., КЗ Й : и Є що СО ОХ У КЗ ' с зо Ох ие сх В о» Кк панни Я хх ше ХККХю МАХ Х пе Кк ЩЕ й | ї ОО й п 1.1... і о У 5 й ох й к ще хе КЕ НИ За сій - я ! Усаг в Я дека ше Вик зни МО к. --- і сот ШИ тот ши г ! шосе Мо хІн ча Ві -- «М кое хін Х а ТКА піна АЛ Ві з Пввсія З - ти ШИ з п з З рорчу т МЕМ 3) пе пня " тт БАБУ т ху М мини вк --
Ї ни Яся шк Ж ДІ ща я до су сл Х ги Пий мч рі з в
ВШ. те В он ян ве утри ж и в пав я ША яв. Гі кн КЯ ай а Кай й Ак) п, В нуту - же єть З «о Хвіст НРО я Ши нан ще пекеменйнннюя пснювнте
Фіг. 12А т я : севе є 9 ШЕ с а З Б х й р "ані Й - У (2) х Кк ; і ОБ іш СМ я ля Її і; ш « З єї ев. к, С 5 і х ш й ще ще г г (2) у Е, ве з З Е о а я ся З З І : ; ща | /
1. щ р. в Її з я З гато шал (т) (Е) ь с І й Я Е , Ге / з й шо у її ! | : | - Й и З паї по « с ж Ж щі щі щ (5 же: у | . : Ж З Е З за ЕЕ т (1) (Е, ;ч я Є, у ї І. ( -е-е- КИ с.
г ж ві ; ; їт- з зе ж: щі |і п и в. 1. Ф (2) - ь, о 9 с У лк ,. Ше: у шен с Шк В. не х к че В 5 С ш
Еш. КЗ Е: т ; -ї г ЩІ 5 . 5 щ В. Рі Кй З ї (1) (г) м3/ Ку Ещ х шШнх
Же Ве | ( тве | «ес нмМутлнцннмосмє єм Й кова і Аесе) с, о (дв) У це | Ст) М НИЙ сови й чи Ше Равепіртонхій Аз у Ас) Се) ШИН ЩІ зни "и С Ше Раепіргойхів Еї
Фіг. 12Е с окр фс вух кош ка ШО св ФУ КУ с оКуЄ КО М ЄЮ ФА Ох г» ЇЙ ОЗ ФАО ХО СО С С КОХ «ноще и ще ХК МО КК МР АЮ Я хе Є ЖУР ЕХ» (ж (Ж а ух «дя У ль лож СК ОК СУ я Оле щу Я Ол ду срм же СЄФфОСрсхро т с с єм тброгоу єр ЕК фєр тро стю рр сю Евер ож М ож уж кет як Я кн вч ня в мя НОЯ хом Ж ще ща ОБ) М Ж: МУ ХО Кт с Сі Ох рр в ие не м мине а и иа На хпОда й ОО ХОМ МО У Ж Сея вона вч ові ва не я ма Б а ня ж с МИ смс я о ЗУ Сх ОС СХ СЯ СХ С С С СВ ня те Ж, й Ж 0 МУ Ж Ж а Я 0 я ШТ іхр рі їм: Б ВрОБ їмо 23 їх: з» КП Кк о КК ко ко Шо ок оїМ й сб Ще ФУ з с п; опе ОЖ хи У ле ОО Ж МО Ж БОМ ОО ях КР оїх? 3 їх? ХО БВЧ ФО Бл ОщІ ОЗ хі ж пе А А ПЕВ НВ ЗО ВИН ВС ВИ Ся СХ СЯ СВ СК СВ СК СВ С Ек їх р оМф ві мі в БР ОБР ОБР) 0 ох роб бо «У фу Км оФ фо їв а бо ож с З о Зх З с Ве Бе Бе Ве Бе Бе Бя Бе Бе бе б ож Фе ож дж ж їн од 0 ож МОЖ мкл ки ЖЖ ки Ул ки й окт ока «є Б Ба ВЗ Б: БЗ ОБО БУ ЕХ з їх оно вя нн вно он а АН НИ МЕ ОМ ЧЕ ШИНУ їх ШроїМ: ШІ ОЇХЕ Мер їм 33 0 О1х3 що рало КОМІ су ше а жиле ни ша жиле шо віщі Бі бо: 3 па ма ОБ се В З Ехо з НИ ЗО Я ВОЛЗ Є Є ОКУ щоб бе КО ОС ПАОЖК ОМ ще ОКУ шРОПВ ОЖО КЗ С Кл ж ві ОБР що МК БР 031 з їй Ше о Ме ьо у» й у» Ше умо де й ож їж.
Ми їж обо» (хо їв о їйх їв і їх: Оз ма ху ма ФУ МО сп рок КО ее ВА Шо п ВЕ НЄ вові овЯ ма БЯ в вВЯ ове вЯ ря ня во Те З мо МИ В о а В ЗК В НЕ МВ ре АН В з с НИ М М і і оо ком ко я о ок Ж» оби же о Шхойе (моїм оїМ ОБ» ої Мох Ед В ко Ж- ж Я Б: Я З Вол ва в ОБУ Ві лова Боб іх з ша опо п З ОЯ а Р ропй веж І З А Но В а В ща йно Сб їм об ож їх» Бої Оїх вва ока мя Мі овЯ Ма о вЯ МУ ва ніх дм о ве Ба ов о Бе Же Ба Ге о фя фо їх СЕ Сх СХ СХ СХ С СЯ КУ КМ КВ СХ жк об о кор об ОДУ ОК па щі б мом ЩІ пог 03 І і) ях МВ Ок ко о «о Ж Ж ж и Ж ОО Ж КО А А оо ЗЕ НЯ пп че и ча че ВЧ ВИ Пола ВИ ОС ИН ЗИ ОВ ОСМ СЕ Сх СХ СВ СХ СМ ОС МІ ОО ІД ЩО ООП ж ЩІ їх мі Бб щі Бі 3 23 3 У опе Ме ух Ме Їмо Її» Їм оф с» їх о» щої Ві БІО ЩО БІ Я БІ ої пе че а Ши КД м ке ВИН ОК МК ка же ми чи и Че ми ШИ КИ А НИ МВ Ом (ШОЇ О.О ХО пл ОО що Ох пера тика ша ние песни ЛИ НЕ и ШК НК ФЕНА ВЕ 5 І ІЗ КІЗ 03 С с як й М Ве МОЗ БО МІ ОО ОМ ЩІ ЦПпОХм ОМ Ощі ща щІ ЩООРОТ ВОМУ вно вЯ ма Я ве вч ок мм в ож Фо бечо Бо бої: Їз б; їм ої» роХу КВ СЯ СВ С Ж Я СК КК ЖК Ве Же фе Бя Бе я Бе йя Бе йе робм Ор БМ ЛО 23 гм в) їх: ой їх! і Ом Ж М Б Бе їз о їло рою с жов Я ка ва Я вЯ Мі вч вЯ Ва ж ше ШО КО й КО ОРОС ; СЕС ЕСЕНЕ ЕЕ ож по Пе оце Пе о С) ко ко о» їм Мр їмо їх! шо во ВУ БО й я» КВОЄОЮ ль ФО С о ше» о ЖМ Ом ца КС ше Мч їм Я (ЗОМ ФУ МУ ех пора го Ка ОС КРОСУ С дрож ва мя в в щі Р ря г ть їй " п оуя ве ум Ве ом дм їмо ше 04 ох ЕН АК «у по хо я ке пе Сх І їле т Ме ше де Пе ук пе дк ще у Ж ом божа хх Р О0х ЩО Оу ком кі кі ко мом кі і і р ж ще Ж) вч фа Б Бе Б БА БУ в; м а ко КК У хо ПОКИ ХМ Б щі ех жо хх дО ож МІ Оу ОКУ КО ОМ є ОМ Ж ХО дО ХО Жх МО Ж ЖИ МУ Ск В и а КО МИ ОС ЕФ СН г р ре ге ятоя У я ще й ос її с щу ПО Осю С м що м чо КАУ - м МОМ СХ сі и яЩ йе дО МОАЛО СЯ МОВ кцожв о ВвРО ФСК ЖМО РРО М М НИМ и и НО НЕ мож що о о олу іб в шт вв ких м м М и М мм ве в НН І о Фо оп ож ум умо ше й Ше ДВ Фо оше м Сб їм ум оре Тч Мо жч ум у УМ мое ХМю се че щу СК Мао єв о шч о уч пе мч ЗУ Ж є Сена песто ок Шк ме ках ШІ ШК 1 поета Ша не Пи Ша и НИ ОРЕ ОК СЮ сою го У они ор и о Зо ПИ НЕ в ВЕНИ Уа Мо їм осМ БОЖКО ЩЬьОКВ Її ОВ ОВ Може Же ОШЬ ЕМ ОКМ ОСЬ ЇМ 0.ООБРОшж НИ НЕ ПО ДІ ПДК М А МО В МИ: УЮ ОП ЗУ до що ші ро МК оф Ярош м оф о 3 мою Фо рожі ШО щої) ПОЇ про їх йроОшЕОщОщР Оле ОО їх Золоті по во Шо ня НВ а НИ У ро а вози По в НИ Во А НН ШНЯ ве аа в и ШЕ а По М В В У са но нє Шо З ее Во и Но ВИ НИ реа В В ШЕ МН сно ВЕ ЕН ВК НУ сс рт ооо 0: ор З що соя що тоопу щ о аль оп оо до я см я Аа кдд ДК мож дама ою га вели оо и я МЕ НО ЕК В Я ЗИ В Я все ро НН НК НВ А М о: їх Щ хх щ Гео Кан Го т їх К щ к їх к ї сошйоКкодОощо ш ЩО Ще ДР обро й фо про ЩОБ ОМ ож фо що ово т Ек 5 В що кот що от а ах мо сг що би моїм Ка Є бі же ом ощь ЇМ бе боб» МОЯ їм би сю ЇМ су й,
т Ол я їх ит суб сво ФО жу б ст її 5 ЕЛЬ ОТ со ст А СВО йо сФЗОВОСІ ка у Кг со с с ща ск - І ТОВ ОСх ОКЯ КУ Ки хх с с Ж сх Єброгку їх ра ІК о-ви щй щкХ «-к У Восток ло їх оре ст (тріть ік т та Фощрохж ку з Ка КВ я М тросу Тех хі г - шк «оди З рен «с к 7 : їх.
Ворон кті ЗОНУ ЖЕ мо м ва вх ня щи тка їх шрот уні На че вч оя ен їз їбройг пот х -і т) оку ЇХ росла» из на З рштю гу ста тек ож во Мох тож що Я овЯовяїовя шо отр їх ск ях я га от т- по Е й Її Ох хг ск їм оті їм: (її. от що їх : в с т ма ІК ши оо щі оїМ ке -ї ї- шої то ла кчоОдЬ Її ше жо б м ах Її ща Со цій Ух па а й. 5 да о ошхх ЩЖ р БУ ОА грві г: ла м сло гм Міг й йо ВХ ОМ М М І їЄє я С ЖЕО їм й: ої їм їх хм: ОЗ Ж ОО «око ки екю юс З ІЗ ка Зк їж їво0х о хноїМм їй ен ШКО БМ око ко Й що З том жк м Вк пох Ве дя Вч мая ЗЕ я М ро іа ої їх Та дя б но: - ОКОМ ока па ОО СО Ше Раш чи т оїхРр Кі Її х пчооОУх мовно ни Ов Ов по щт го г й; й. п; й їхр КН ОїЇ її кож пох що х що і Е шщщ щоби й ЗМ ОБО о гі І БОМ що 3 З, ЩО РОЛ ОСІ Її КО пої і щи се ние Шо пІожо шик ор вн шРааПЬОШЬЮ ОМ п ро ПИ ОщЩ «она о а Мох дина пора ка хо п Ооше Р ОлУ ди жк кое і Я Ям Що «Ж о що їм й Я няня бо їх їх БА МІ Ок ОГО С: Її ме вм оїВОо ям го її ке М ш-я ПОС ОВУ ЛІ Ух МОЖЕ ЖК щоку Ше б Те» Беожмо ко щі й БО т проь сло ІЙ хи ої З хх ща Ки Х.
Хм ою хх З «м РО ї- де Бе Ех Б альо ца й а бюро дм ух тож ки Ми Ух Кот Му ре че фа ЩІ Б ОМ х Рос» те бкощи Ох м ба мо Ух КОїх п. об ка га ог га Р ов фло БА о Еї БУ пе на ЗВО ЯКО ї УК Ошю ПЗ ОлЗ Ос Наши Я «а и ОК КК ок є ТЯ роя «КО КИ вн МО ОПРОПЗ ОЗ ГУ ІНІЙ ОКО вок не Пе ОАЕ бок і що ах Ко МРІЕП ЕЕ ія око ко й ток км кі о во я (ВЕ НЯ мог У и У Комо ме т вою М гос о ЕКО У Х ін ОІВ Ті й ач спр и Ес і Кк й вія м АМОКУ тт ЕТ он ГУ М но ШО СЕ г з й ко кї ШОК А ща Ка о Ха ща В Тжя ле бю ля ма рога те НОЯ У Кк щи ом їх шо Ба я й же р їхе хе 1-3 Ша ох см ку г Кк.
Моя ХА ОК й Ба й 4 меш ї Уже Що ОВОМО В Ов С ШОТРОЮ боб; ОВ ФІ Ба Б. оз Ба що Ж ОО щі Ж МО пз са до й св отр отр З З Ма чом дме ХО КІ, га тА КА Ки я 5 щи ОСИ ШЕУ поз вт вчомх в ж ож як БО І ОБ КИ «п їм Що ЩО 4. М САН НИ КАК ЕК в окя о вЯ я З жк го мо ро вії ца м ої М мя ОКА Ка КУ З ва пу ка срок б ом м га їх їв: їх порів кт ж кл т.
М ях ії її З ШЕ оре ух дя дз дя еВ ШИ пра ра щі па оф Р-Н тот же йх 3 М ока кА Ма о її ком тщим гл о Хробю Хлоз Я а і 53 у А м а МЕРІ ВІ ОО | Є йони ні 771 сек НИ Ех З шо Фе Ж Фа БО І-ї РОКИ ПИ МИ ЗУ: я яю Хе йх ши и І ГТ ТА ан ЩО ема - і віях ГН а й ХУ ст хе хх 15 їх Ме ба Мк ом» З опи Пе А я важ мя ва мя - ТВО ЇВ ЇХ 5 їх Те Уре шко ую пеш т У Км ОТ Ша фа Ша К. по» що ЕКО КВ ом шк Кор ОО мохи Ва в на і У пі бе ЗО кок хе МпООВ. пи ОО здо х - іо о ко яю еОЛШЕИСЯ т пої п Ос «т ЖЕ ЖЕ що о шоп їх щрора 3 кожи ки де КУ она І вм ху 0 х їх то їх хо Ж ОО РИ БИ их шо нн х жо я З г і ТУ Зео прх ях з: не: о СЕДИ ЗИ лож вх ян НЕ роли ни п Я Ж Же Ж ОС ож Б Б | ге ХУ АН АННЯЄ АН ШЕ не ТОЇ ОТОІХ яд ую ДК щока ит, як ОБ Н це ше 3 чн ПК сра Ух ЗАКО, х ОКО щі по Її То ее Рг Я ОУЖ ОХ роде що в ж пото пром ою Оу пе Не ШВА ШИ Не ВС ФК: їОЖВ ПІ ОВО їх! Ох по ро км ще -4 6-2 Ні ОЦЕ ОР ОХ Ом їх! ЩЕ їх: щі УМ Ше чо ТОновЯ шо її Ма ЕК кг кг СИНУ їх Б Її хх ха у хх я см ху й росі я ЖОВ як вв БІ й оф ові З - ВІ Ор -овоня нНЯ з ее ее о оку їм Зі | ОО НИ тт ов на в ок й їз ее їх од НЕ ИН: Щі п3 З хх кое мо ей о ва З їх т-Щонрні ні не: ША: зе В ЗЕ пр инним м он мим во в їм Я 1 НН АННА З ГБ.
У ЕП ЕІ ОЇ кож ч шк сере к 1 Я З ФІН І мік йо шшишк Як Хе дю ше М тв офчЧ іп он б мох ХТО оса аа З решение дю ж сте мор ої доки ше Ай ке щОЩІО Ох ра о нн ко КаО хх ше ше і їй ее я Ко охо ка Ес ока з га г ТО І; Не ШО уЯ В Я Х му Корок ОВ ОТЙ тА при Ей ка ов вч КЗ ЕМ СЯ ОСВОЯ КУ ра МК Мр тя ж пЗ Ощше Р ОЇ 53 6154 й о Бя В жо вешщакЯ Косх ч НУ де хв С 1-4 - що Є «у ; в Ж Ех пк (пл г й - Ні ня с РЕ щи бю да оз ВЗ КУ ря ії р Ка мрРОмУ Б ра фа 3 мі кі кі -е м жо ЕВ вч Кз | їх 123 4 вч овня вчою меч Яни: --4 й МКУ КИ кож Янг - - он нн ш кова ня м мо мі Мо Ж; я хе ш ін З Фу ж Мав Ор охх ше шу оовні В о УЖ п Мох ж ж ОКО -ї рез іЗ ровно вів КО мона жо мі ОТ КО О 3 ке піл КОЖ як їз «ок ок Оки ЩІ ХО МІ ОХ зі еВ км МО іп: клю МАША Но «Мох лох А й а їй ТЗ ЖЕ ми ЕН НАУ рим ів МА же фе йз Ше йя бло вом дм 3 ОЗ ж рі рі: йно о ох Бе Ех Єз КЗ Б як ПАН НЕ осв са в прі ІВ Кок ОПО її де ток ко ко Кох -х чу Чл сот ср ріІВ пря ЩО їв Що пе ІВАК ко 10 Ж щі а Є З 5 5 їі 7 викине ш ен обо: ОЕ пз г ООН Е ой що -- Ян мі в ого му і пі - а і ч ше М Ук Оши мох ІН МИ НН т ОН ОМ хх т.х сті х т ща може Ії пп ОЇ Ва НО ї хі -4 чом ма пр і т мо їх то же зо ОЇ 0. Я га жо оєЄту ння М А її.
Мо їЖ її г ОЇ х й чі її хх об д Му їни З на то оте п ОЇ о.
І мо дх» кож ще ме Щи і 3 м : ПОРО що МБ і ще в пам нний Мо пише я бю ож м ЗІ МЕ ШЕ с тро умов о Ім хар От М З Ся т олеО св Хоч З У ЗК М су У хОоКМ ож жа 1 Ос С" і - " ку і о п- То: тс, т нки Ше ги раки і х ша М й ме На - - о йо їй п М-х - ПОН ре с М Ома ЩІ то х Б Ме у В щі р В щи М й сх К ко і 1 ту, У а пе -щ хо дк ї ї 3 : і ї-х МЕ чих уч ля оту іо я : х Н ї : ре нм Ж Ж моз - ОО От 7 : ІН сн: М Вишня ом Ор ор аю тож в ех ОЦ ах Ж М м хом що рр фова Кк їв я бю де оте хм х б, Н Е | УКХ еВ лоз Еш те їхч у по ко пахощі і 3 ї Н п - ОО ЕХ ка Єві км кі т жов Й Н ' ЯН ОКО що АЖ хм х щощо що ни шо Ж м Ж М ФО ОК -а що хх Ол Мох о оч ум шоБоЕЖ ОВ По їх.
А у м ож нні и км ор ще Кон уд - Ще бу їм кош: Т що А Ум вожоч ШО сх КЕ - ші бе бу ле Ух ооо ко у, ОМ Б шодо се ЩО ОСМ о ше оо сь: і я Ше лю ІМ Божок щої ММ ОМ їм КМ Ос сь; - ее М М Еш Н ї шрам: У х г п" п ху КУ сльне шини й п ох КУ Зк У ПИ ни ИН ще ЖвО ХВОЇ М іч ув овну - Хм, ук МОЄ гоже 3 ї ! оку м КОМ ЩО ос1 З вам алое ях М ї М З со т ' ї з . с З Я ря со - с -- - о НЯ ї ко У ОК ОК й х : Н ї Н опе 0 о ел кожна і Н а НАС щ Ошя о ю | боку Ах Си З о ях препа іа М щоб БОР і ОЕМ ОБ їх Уч ке Коні я то Кеш ї НІ і ПНЯ МОм я І к-ї тоні нина ПО щей що ї ! Н Н нин ет шосе М Конні - тро нЕ ме о я пен : ї : яку Рон няно у Ше кое меч шо т йо дов щі ОТ ок СН не не не Шан ення тро оз ЩО її осяє он "т сення шток ко коя хро ре шоя ту ВЕ: Го ніч -н ее оо оо Я ваша ОО от КЕ ТК о у мала Ша ' ї он Н НУ попу ще ок у ОН ДНУ зач 7 ен ї от С коша ОМ ки шу АК ! ен ян ж КІ АХ її г - под оп я (З Я онкні : ЇХ к-т . ОК АХ я реве то ж їз фі щі - зон шифону ен чні Поза сш Зо да коси оомикоскті пек рокі М Я ми А що т се НО ЕН ож е жі ях кої рою мкА Лео с Що ем хі ре, й шо ОБОВ роко ха че ше о» Ку мон ож он ее КЗ МОЄ сх мо том и оо й шок що ра ен: ЩО чо ОБОВ що їх оОшОок ТА їн дер ул Я я шоп ток Ох Том й й НЕ форс й х Мото «о що Б Ки ох т ХОЛІ І п А г щощот мОщО шо фі о с перо тя нь й; їм ЩО ої ра т о у Май БУ решшеи шого ол ней лад Ка бу ОВО ж ЩО ЯР оду хх тон х с « Щи її О по її М ну й оц КИ т шоОошоОщоє мої хм щ хх з подК о а - ко дих МО шо що т УМ що па (М па їм й оо «Ба Її йо г ча і їм ОТ їв одо у М їв 00 щі Од сот; «СМ ях со с КВ КЗ с «ФІ» сс с С) КУ З цу їх гос ст КО КВ В КО СУ «У ок ох щи хи ом м мі м -е нема нин аа НЕ НО НЕ - счя с с сч сор га єм га СЯ с трі с г с піст аа а а МВ МИ: шпор МР ор ол Фе ше їм Обвоїв Ше сь йхої (М ок о ко Кк кі Ше ке ЩоКО їм йо їм оку; їм о дь тпм їж Ка б оїм ом од оба їмо її Що ПОД НН Я пев яв ж св ся ши сх есе юс пис и ПИ ОКУ КК ун з: зем з ик ММС кова вже вЯ вч вч вч вч ЮК овя о про Ви и о и ВЕН ож п ой ПО їв п Об ох Ш- фе Бе осно фея б- з Бе Бя | ре пое ссКККЬоа г Ппеома вч ов іч овч в в не фо -ї ел а ел ак в М В Я: М ЦЕ ес 3 п сн кі СЕ СИ М пу СХ ах ЖІ сх їжу ж Ж З ОО ВЗ ож фе бе Бе ї-9 о Ез ЕЕ Бе Ром Ще попою У У з її мм шо ме ЛЬ ух ше ух ше у роде МО Ох дет окт ях жо» хм же я 1 Ж щі опр їм Р ові плої о ВіорРОІ У Ох ше шк дм що до М ДОК їх: Хм їж: їц Їм: їм іх: 5 їм її о ЇМ; їх б їх; Ми: їш 0; о ї6 Х: їм 3 їх ООП КО ЩО 5 ні й ОМ ПЕВ СЕ СВОЯ СХ СЕ СВ Юх ОС я КЕ Бе кб кб З ПРІ ОР о ва па І БРОНІ Б І БМ ОБ б Рой ОБР їх рез я я ЗАМ У їзх що з о бххо бхо (хх б Їх М) З їх; й їмо Ма моде б ой моя меча м и и а зи и и а ки а ВИ а М ЗЕ Ммжо де ме Се бю Се 0 Се ої» 10» Оз ах з ВСУ Зо У ОБО КЗ Ка ла ОК З Ка ОРОС дО ЩІ ЗО БОМ ОО ЩООСВОРОФ б мі ши ло чо РО ОВ КЗ Ка ша а ОС КО ше ОЗ оо а нн о с а Ма а М ККУ аж и хе ВИ Ем ВИ ПИВ За Га ПИ ЗИ доки т ЖИ ЩЕ дО ще дО Од мя ВРОвЯ човна в Ма рови Шон СД Хе см йо ОО СК СУ РОСЕ ЩЕ З С С С БЕЗ З мі а кі кі м коків півроку СУ шо ще ше б ох Бх Бе Без о Бе Я фо ей й оп ойбБ об що 00 ОВ (5 БО РОК зом зі о З а щ ПО ОО ЩІ 0 Те ОБ пс Що ошм ої смоїйб 0. ої їм їз» З їх щі щі мо Ві щі Б) іш ІЮ в: рої ор ві мя ві ва Я ов т ве С В СИ ШК сновок енокожан ен У На мя м я я ек - кі її - ка - - АНЯ я ї ге т сте ве шк ве шо ост ве НИ Ше ше вот ЦО шк Ве Жч Ше йч оф оф Тв Брізіз з б» Брі» з Ї5 То роїв кос ою о 0 ДУ ож з о А ме УМ Се МИ ЯЗ па ие ВЕ В СИ Ше: о Жм о Ма ше їм їв ОМ б ЇМ ОЇ 0 (ОТ ОМ МОЗ ОО ОО ж сх с С яв ОХ ма м с КА У а ще я ж Ошенен жОен Он мне ВАС НАЄ ПА А ВИК НА НИ НН ШИН НВ Бе ожЖя Бе вч фея й Бе чо ФК РОБ «кв ок ек шок Бе я окд о Кз ов Бе тя Бе офя Кз оре 45 о робпя щ- Ва ВЗ Ба 5 В ке бя кКе їв ша во а ро - мі нні Я в чом м он СІ і обр б р р зр У юОоа веовч в внНоНняІ мі вом ня їм й ЕВ чо фе вхо фе Бо оБа Бз о Кофз НЕО И ЕК КА ТЕЕИЕСКИКЕНИИИеЯ гав! ве я Бе зн З дове у ВО Род ПЕН ЕМО МО ЕН, ва в'я мя ве ва ве мі ва ВЯ роВя і: ві ай Міо их и нн в шанс о оо с ос В Я що ЩІ що 9 І Б об; Бо Зб Бе моб» Б бер робо нефінненн е неіне ті ннннтннеснн ні пошив В НИ У ми Ма їм оБа м мо що о Бромяо її З оз З КЗ ок) З Є З ОК Ох мі ох ох ща б м М) Що ої Ос я роб га є в ва Є є г РО комуні мі ка кі с ока КО щи " шк п ши -ч С х з в -ок їх же їх і КЗ со що мок ДОК п с Оу хі: С - Ся мо Сх - А щ щ їм ВОЩО ШК У С: «о шм КО ОВЯ с Є ОО а ж ово я ОО ОР ОР а щороку з т и щі шоп Що мо Мом М ож моні хи Ме мк хх ЙО Те мо уе чо бе» чо Хм он ЇХ І се мч 0 б ле чо б лю Ж Може дк ие дом мч мою ММО КИ мі бе може Шм йч дм бе Шм ММ СЯ кт ін не зи кання Пи и ПІН щоФ о сю с ХУ що 0 осо с сю с, ху ЖЕО КВОКх зо МЖМОЖВОКЬ ОО ЖОФФ пеоїМ ої.
Ж оОїь БОЇ ТМ ЇМ я Ом НВ ПОД о о по У и НИ МО НЕ МИ а фо оз Б ОО о зр одю В шо ощошжф дл т ощФфром й Фе ча ШОЮ ПРО ШО 0 ШЕ ШЕ 0 ОО щодо прот їх с оо и зас М МИ о М З а ен В м и а м ВИ А ВИ ше нан ни А и В МН ЕН ЕМ а а и ма ва а пон неон ни и А ме ши п м а п асо ою ово и ОО 0 о а яКощоео ВОВОу лох що ота о жа М АВ КІ ДІ КОД Я рок и Ж м я М поши ши ние и и ни и М пи м п и п о на п а том ох їх їх З: оє) РрощО ХО, щока ОКО ОКР ОшО що МО Од МК У З ВЕ В З ЕМ МІН ШО ОО о во ЗО БА І А З МО ВВ В У що а о т що оо йно о ВМО же о ЇМ ХО МОЛЬ їм о: ЇМ о б о ЖМмОо0М о щи їм йо їм про Огу і К и а Чи ФОТО се «Ж Ух ТОВ ОС» «М те ЛУ Ж КИ Є «ЖЕ ТІ І «КІ ОСТ су «с СЕ АЖ СХ ЦЮ «ПО І КЗ хи очи ми хро ол З С Мр ох хх пух сте СОЦ ОО Кок и ну м У ю са ож ФО с см є сту схз см те КОЮ тю ук) ту ту ср сту У Ку єхх че ге НІ Ох - хх окт не и п о с хро сті б ст тк іх б хх г Тбу ть сб тб їКр б ямах сть ті утеренсроесерсрестротест родео роросрогосооцосоооросососоорон вокіровя мов вВЯ Вфовя 4 бе ро чне енениенижаш 3 В перо опо а и п а Бе МУ й Му Уво Же Му Хе КА рок м рі КІ 31 МИ ИН М НИ НА. - непо ав о Че ав Я пек ма у со м ки ока а Ки: УЗ м м У МІ р МА кеш ШОК З КЗ Є Олю о г т Ока рос ен зо и жи По и НК В о и щу га па а гл ока ба ри з Ід ст 333 (і: г ж Мо ім ві мі хм ХМ І хм ке ек МО МЕ спе ї- йщ- Бе о Ббя Ех фе па Б о Б.ої о ї- ен ик зн ик м м ча м и пи а ми ЧИ в ен що х ще тА хе от су 4 3 туї ТА їх тю гу ї3 4 й. Ка ФО їм КМ оїЇ6 Ко Кз оїМО її кі м м ом їм їмо УМ бю Щи МІ Я т ТК ім м ик соток т Не м п м а не ріллі стрімко ан а ПИ ЕЕ Ви ВИ ВЕ ОНИ ОК ен че и п и МИ НЕ ЧЕН - прак пр ей ст м Кн В КН НН ко КІ КО ко ке Кк: х Ве С т С 0 3 0 шо в її ЕК їж Ж кА омк я р уж у уж ов Ж одною ооо ооо ооо ую удо із із 5 б б5 фі бз ЇЗ 15 25 Му з ха ях сх в дах Ж ж Жх я? ху водо сг м МК ме й о2ро їх ФХЗ їХх Хв їх: 3 їм її па а о а па п у в ОХ у ШРОШІ У УЮ УЮ Моїх Ма їм ої о цу Еш хо зн Я в х : К Ач Уа: У Ни лай ща То я 07 ум ом їм Ше 7 їн КО Шо йи Ше ОЇ Ой: Її їз Хе а ЇМ ОЇМ х пн ма аа о Кл ооо В мое и пп о ПВ п МИ б ши у ом С С кі пек щі КК І Х с в а а І ЧО: о. Пе б ль 0» б б їх бом ої они В ев В ВГ О Оп ОО ОХ ФО ПІ ОО, що ЦО о Ще 2 по ЩО вОТО в: Я ДОНУ ОКО МО М Бе ООН Ех Шо ІБ ооо о ев а в КЛ Б НВ З НН що КеоМе Їм Ше обер їм Їм Фе їм Їх: 3 ох» міо ВОМ МО МР С МР РО Боба Їм бе б фе їм бу бю бої є то ЩО що вх їх 3 и ж 0. МО (МОХ Ж. ОМ ОК Мом ЇМО МУ її б ме б бо с а а са п о М сома Я Оп БО Ж о Ом ж о ОО ЗО ОС КК КІ У КО БО ОЗ ОКО я УОУК Ого Ух ОКО ух щ ве. щока ос г КО Є КЗ ТЗ бу 2 ж й їла оц Її ху ОО ХЕ їх слини зе ие пи ок ин ЗИ и ча ав зи ЗВ ак ка йо мо б ці МОУ с 2 оц а -- а З а че її Її БО ща БОЇ БД їх ої ОК Я во ов кох ра хх ще ж вч ня Р КІ вч рон ве зовн в вон вч ВК ОВЯ Я Я р ех ка ча дике м чо ПИ Чак ПИ ЧІ МИ ЧИ НИ вх: шва ше Шк ВК С В М СКУ о ко не в М о ВИ В а ЗИ у ї І ї Є ія Є г є ж ї ій ; хх чриРЧвНяЯ чен у х Ж хе но Мк ооо кот сю М її 03 о їхі ЩО 225 Зх (2 БК їх ОЗ ОЇ ХОМ Ол фо уко ую ух ул пов Ох лише їхі м Ох х ї х КЕ й я пк ку хи о нн оо о а т Ме Пк ре Я де ої І 0» Їх ОТ» УршРь м м го ЩО 05 ОМ Ома ін нумшочі Ех ї, ще у Ух ма чн а о а я п с що УЮ УЮ рт У УЮ ОХ по ОО ОПО ЗУ МО 0 Оп пока в й ОВ и в ВИ в У хи Ку хи хм ху ший Мк су 5 хм. ко Ко хв КО фе йя Б Ба ої ЗК Хоми ХА ОК МО ОКХ п яр и М » Де ИН ЗНИДННН в пр о п пи Код кож де ке од МИ ЇМ ок х ЕК зе В М З В з З з ЯКО хх ЕОМ ОКО кб о жМ КО ОКО ней Міо» МР УЮ У мс г Ох Мч вн НЕ я в-аож-ю я Я НЯ она ях щі ом; ма мі МІ щі є ЧУ М Ох к: " " г. Ох т кави ОН А НК М ОШе о йоїн о йо жМ ої би со Твої 5 МИ МИ ЗВ ЗИНИ Й пов: вро по СВ СЮ Є С ко бе ОО ОК о С С ЗНИК ЕМ ОБГ ОЇв ФК Ка ТБ ОБУ г Іа Кл Є я два он дна лав ра дво зо оо нини ша Я Ка Со ОО ЕО пе Де ек ДЕ І Мох ПИШЕ Кз окз ока КЗ ке ка КЗ ка Я ЗОгУ Вдлодо оклади АнАХ ооо мо ооо тот тя бу г їх вх т ся вх вро мм мн ні вх мом що) ср о сх МР ЕК 5252538 3 Восьме Тв бх об Оз їх мої їх ТУТ і потом шко рою уко ум уко на ж ана их ни ах ом, НН мов А в н- ма -4 3 5 її КОМ їБ ХО БО ФЩщ п-оОу МіО ка вок) я ще вени т? не М и че и МИ ВИ ЧА М ЧА: пз опо щока ва БОР ОО РОЇ а ж Пи не ев оо Но а НИ а що мов ВЕ ОО Я З Її їз бе Я Бя кб оц о Жя в. В ОоЖу З ОБЯ Я БМ Ба у Ж У Мом т А. що М В мот А В зни нн З ИН ЗНА шок 0 до се» їм ом» ої йо ост. їв ої й. «о ОВО Ок Б ВО кі Бопч | - нк з З 0 Кох ТО її М гу ту Ки ги ЦД г. - 3-3 ННІ м МН 3 по щі Сб За о 4 ЦД ЕФ Ух КО А Щи М же ке не и и НИ З НУ Ж пе и м в по хх тхї сг хі гЕЗ Тахо їх 23 їх Я Вико пхОшО ОО Їй Її ОО. їх! То БО ЇХ - іх я з З оц й -щоші Бе ща ОБ хр а 03 хр ої ої щі го Зими ЧК 4 с ОМ ще ме км м о я не ож х в о й я ек і Шосе о сь ої шо 0 Її рої Її кА КЗ ОКУ ОС ОКЗ са Од що і ще ач а ни и ОН НЕ МИ АН Щи ої сь йо бен ої ба б З йк Мі ша же Ба ЩО МО й ОО ОО. мі їмо ке ЇВ їеорвоЖь Во й й і їх х сс и ча НН пе б ме ба хх Хе б» б око сх он Я мі ни НЯ ня міх ке а о м р ве НН наш НІШ ХО ЗХ Ол ЩИТ: ОО чо р о р нов ЩО ЗО ТУ ток ши НН пом отдел дк Ме б ХО Ме: но ввеомч вЯ во вм вБЯя вя мя Я їв ро о о п М м С ш- мо СНИ дея ко 2-81 мя фо 44 МО МЕ Ммх А М Е ко о а кщ Єва ов Кк кої Кк Ов о ва вч ом с я з » ан ОД ОК й й не е ше Е т Мода ша 1 ху шо у їм Зм о фмо б моїм за и В ВИ В М КИ ВИ т ан п ад а о а РІК Ка о йз їх ще па ж жо ху ЕЕ с хви С З ЗМЕН -8-оОБЯ фе Бе Ббя Бе Ще Бл Б Р ож е " п ши с с м т - ІЗ гам) мені ПА «ет їй г що кит поши -х шодо ща с ХХ СО ВН го я ке МІ ОМ Ж - 5 щі мі ці СУ - їх о ча чн и Що рЯ оеий кі ох Ух м ВІ ОО ОС і в-во ЩІ СОМ З. Кара ютер що пон почни пом на В от МДЕ НИ У А НИ НС с М НІ А НЕ НИ НЕ НУ іт шт п ж от тод кот п що де ро жо я ок НИ а т що вх й : хол щоохи ч В А о Мом ож М мо М М Мо щ кох те М х х мох - дош Ум оюч ум Уч й чо уч МУ а Ана АН АНА ВАН до ощІ ЖИ 3 щі її ФфЩ МІ ху ую чт Що й БЕ М що БІО ЇХ твкЕКЕВЕ В п БЕШЕВЕЕ, Кк: З ко о ач Не Моїх бе й ум з дю їм ІЧ х Се Мі ос чо Хе мб м ше чо де ОБУ, т ї : ; 3 ; Н гу : Зо от і шо Шок ти зо кох как Пре ее х і Дно М пос Шов ою Ше Шо Мо ее Н ї поля же и НН ОН ЧНКЯ що є) т бробЄю їх ст; го З ще в М Юм ють оо МОЖ Мох хо ХМ ок ОКХ ОБОХ о ЕКО Мом ВО ва ма БО, ще о Я ЇЧ ї з Н іч ї х ї Н 1 ї Н Її ї ' ї Н КЕ І: ЩЕ ян НИ НЕ НИК й АН я кі ХВ ОК оче ОК С ВЕ СН тож зр от я хр о вовк ву ШО ОшШО ВОЗ о ш Одес бро ш"оЗв'яю о шо З шо о й шо що жо шОшІ ОмО:З ОпЩроз ШОУ РОК ОХ ОЇ ТК; о, си иа на ни а По Ве МИ ни В ШИН их ес на Шо ВИ В и В пе В в В ВК и М мене с и з нм и В иа нои и ни о и и Чи я сб окт екон ний : : и и и В Я МЕ Я х її х кох кот. й Соошош Ор СТ г її шо о оо А о ен по інших мм не виь що я що п Мо, чі що по що що оп зн о не не ше не є кі Кого то тро г ВИ ЯЗ Ж яз а А Кк Я ХХ дя м о м М дя м МО ра но А М о ВЕ Коня пасе они и В В С М НО щ- ши о нн я че ни нн Аж е на са ен а ОА НН а а и що що шо шого шоу шошощощокотро о мою оо щі і о до о люк міо дров ой ХО ді оо С ОВ ЗЕ М ІНК ж в В В «оОошоОо щом йоЯ то п чоОоЩщоОо ож о л іощі З с2я АТАК Ки о тот СИ ме ши че я во Жим ойе ої їм ще ОЇ ьо (М МОЇ Що єм С ої Же о ЄМ ОО КМ ОЇ со с у, сп о кх КЗ дз КЗ ФВ се ос є ФУ СВ що ко З ЩО во бо с у я КО КВ ДВ т ж и ж ож у мМ В МУ Мі жу ст Єр ту ТКУ ФК ому кож до «ЖЕО ЖК М МК щи хто ми ог о кк строку сту КК Оу бю су) сту єур ох т їТЗОЕУрОЇКЮ КУ У мах) гру У т ще КЗ Ка КУ С роса г Є З ОЗ я С ОСх СХ С СЯ СУ СУ СЕ С СХ ях о не М з с НІС лан з з ПИ НЯ ЕКО ВК ке «коки о хо КО С ке п (ЇМО Ос МО ОЇ Ох «око оку Й КО КО Ох шо му о У МЕМ ОМ КОМОРУ ЖЙ ЮР дб о ЮбОх ме м ан ки о и м м а и з ВМО Я їхх ВМО 3 Мч о кош Мах що Ме оз» 0 Ж Тек їм обме рмО0Мю де дя їн їн: фе Ж шеф дю йч їм ме 0 де чОде лож а ОР їм Р пз їмхР ом Б) ОА СХ їх як с З с ЕС З Я ка ва ва ві ва ве ВЯ в ва МУ в ох щмомж ко ум ув гм ук де ме Ме дея Бе Бе ої ХМ Офе пе Бл Ба фе фе де о» м пе НИХ ПНО ИН Не НЕ ше У ЩО ще АВ М КМ АЮ МУ шт З Еш) С Ка Є б КР ОСЗ Є ЕХ З щу ши ОО ШІ І Ма ОЄЛОДе ОБ ОО хе 2 М КО мово З Б ОО МІ Ох Ше М ОКО ЇМ ОЇ 03 ХМ ср Дю їмо» чом ФМ м 0 мое їмо 0 ЦІ СЕ ек рю км кі м і кі кі я МО) МО КО ЩО МРС 1 ПОЖЕЖ Ж МО ОКО ОО ОО х Се ща а ОЗ ОС ща С С з Шо ше ОЇ ро 025 сб ОО КО моСся МІ ОЗ Я КЗ СЯ ОО шІ МОЛ ОС КМ ча нев е онв в В о А о ол о Ба ВО НЕ У ВИ ОК ВЕ ОН по в В а а не ке ші п) оці М) Я щоб пом бос ож ше З па ОЗ ОК ОС ок хо Ше ТМ Ще ПМ м де Ух Пе 0 хз СНІВ ІВ 05 ЄВ ФО (Б 3 4 м я Ко ко о ко кі ко ко Ок їз о Жя Бе ре Ба о БЯ Жя бе Ба Бе обе Ж хо а Ж о нн МОЖ та їх БОЖКО БОЇ БОС Пе БЕЖ о М З З Ве М ЧО с їм дм дм їн т мое м Ж ен п Ва ос а с В оо Ж род жи де мм МО І Ж МОХ ше Пе де ше де ух Пе ше це Ше ух ож ЩО о се ВА МОЇ Що ра ФО ох С ОЇхР що фр о0хр 0 О2ХР 2) ЇХРОМЗ (бро ей ОО Я Ой БО гі о) БО пі бю Бі ж ПУ СЕ ОСХ СВ СУ Ге СУ М СХ СВ тк щі ОБ ІВ В І І х ее и о ос п НЕ о С НЯ Що йб о БвоЇм фев об бе офе оф ФМ оїмо ж ОР Б) я їв Її МРОБУ Я т т кож о кшо ко Бе Бя око кро ох Щи фо їмо дної мдф» ом йо» С ОГУ Їмо Їх їм о Фечофчр їх; Ма фч а бо їм; в» М їв бої (в ол» б б» їх з бе ож т Бе їМмоїе їмо Ме ФМ о Веде ЕВ фе оїМ є КОКО БОБ Ос й ОФ Ор оди У 5 о : т п де Це Ок Фк бЖ Бе Їж о кл кі ай кі Я і 3 3 3» ДІ КРОСУ КЗ ОС ОК ОК Я ЩІ М 0 я» ОО ож М КО ЖО Ж Ю хх не Не ше п їх це с їх не ж це Ж на ЕЕ: З Щк са ще ж ж с в за я НЕО ся б М пз обо У Ох Її» пух жа ее Ше ШК ШИ г бро) Ж: мо МО М ХК ом ОО Мох што а БО ОО ОБ 25 ці омУ ОЗ Мі ож ПЕВНЕ ННЯ Кен З З КН З КАН ШЯ пе» М ТМ їх їх Зої ОМ ої» мк ж ь воша шоп дО щі оши Коса о лох ШЕ ОЇхР Ще фе їх) бе) с ОБ їх: р г о У і М ож жоейї же я Ж МЕМ І КЗ (ЗІБ ОХ І КЗ Із ст он на нм ні на я ні ніх па а и у и че В На В а ВИ ВИ ТИ ШК РО їЗ ПЗ Р оЄй о кж і Б) ОО ші ві ОБ 03 їй ощРовР о БІ ові ж гав! Що бе мо шмо ше КМ ОК ОМ ог ог ОООЖ ме вЯ ва вч ОВЯ вч В НІ ВЯ Де ОМ о» і ФО 0 СЖ С СМ ФК ше ШО ос ФК ОК ШЕ ФО ог порі п до ко 0 де жи хо КА мож КМ мо хм ж шо Ж м ся УМ де ж дм дя М Я я М: оОх що ЖОВ ОК ОС ОК Ж» зі трів віз співі сх (С то дЯ де Я с де Ом сх ЩО деко ЇЙ БО ЩО Ре ОХ Ох Кб ОО о чик шо І Ко І С кн Хо с ни з и В В А В НКУ по Обб (болю ЇМО 25 ОМ ОК Ой ДО 0о Ж МОМ: ОМ; мі Мб м ж Ж ОМм: о Ж Оох - Сх аз а м: ЗД с В З їх де де Їх де б» 0» об» ом Оз б» З с о мя ни мі в Я Я КЗ Боні ях пика не а КК ВЕС ПЗ ЦЕ Се ФВ КО ж ЦпОЦШОЇВ ОО МІ ОО С0К ОО оз У " шк п ки КЗ ск : - її.
Фон їх ях Ша Кк РЕАК щ пон пз с» ї-ж 4 ок» зі 10 СУ - з МІОМо ГКУ - є М М ОМ С ДО СУ «ой в ЩІ 8 б) жо : М м В МИ НИ ПОД МД Ен: я ОО рого іо ярок ол фот іш що о ато щомож мож мом ож моні мож ом Мом Мох мой Зрожх см ше чо Ух Хм дя с ПУ де м оо ше см ж цю КЕ Мо хуя ум ж ШО УМ дк МОМ У Мросуч о е сях ЇМ м; чу» см МОУ вен В о В В ЧЕ ВИ ЗИ з ас ВЕН ВР М В ВИ З що Фк ща є ЇМ їх фо с а ЮК їх їв ОСЬ Об о меоїМ ПВ ОКМ ЇМ У ОЗ ХО ЕМ БЬ БМ С ОїМ о Сь 0 ХМ оФфЬОЗІ ж и и п ПК НН кН НВ нн НИ НИ и Мо то по НО НЕ: ФоОомря яБОЧ ФоЗ) моб м т оВр оф фо зро рот шоп ої тю т) 0 0 ог 0 0 шої ол оп ово йо пен В а ЕЕ се и р нн НК НИ В ИН роз Широко Ше Но а НИ В а все не Ша: Шо и В НН НН В ШЕ пили Неси ее о не о М М В Я яко не ян ж ні тя шо є о 01 У шо а) тр є род ще о кп ох о З ооо с що пр вес те Пс нс о Пр В А НК В пе ж п а м ки п па шОоОошОоОв о КОощоКоФокоє її шо шою шОоКоЮ що щодо що що мМ о ЩО ФО ЩЕ ДК оо щропео о про о о «З щолу ОО по йо ді й що Що ої: Ж» ої Ж їв ОїМ йи оїМ у їМопь ої йод. 02; ої Її ОЩл їдь сем Ко км се СК У ЩО ШО хо шо кум ий А и Ж у т Ко с «у Їж сОЇХ КО ЩО КЗ ща сво хи ож Мо хе «м (У ГІ р ня у ЇїЄбю єр тб; сур уж ТС стро їть (3 Ок ок ЕК М о в Ох т че дж шеж бдж чу до сх бу МА бж Шк де Ох умо хх у М УЖ ЦЕХ ОЗ А ОКМ ОТ Б Їй Кп Ой я уй КА ЮА я АМОММ КМ О КЯ КВОБМ КЮЦх ОЇ б 5 (С ОХ ІК Ой рве о на вн У У Я Ма оїх) щмо мо вх Ма ба о СЕ оїх1 З пз о на нн кі НН Он НН А КУ лань а в В Ви ПЕ СЯ ЗО С СХ КЕ С ЖК Я СМ КУ КИ СА Аа УА ИН од ге се З В о М о М В СО СИНЯ конання пу ху Бк хе пу У Б Же Ку ОК оху Сх мо М м М МУ Ж м 0 МІ б Ж Оле ее не о и и нє Ме ще ОК Мч ОМА Що З Б ОФюЮ МОЇ ЩО ХО Сх сх М ОС ОО ЕХ МОЩІ ЩО М ОК С ОКО є Ди и да и І Мет ізн Ме С МИ мом и У и Ми АМКУ Х яд Вуж ра біж бах сож бмову жовту міш жи нн о я м а М о а а Ва Ух ШКО ЩІ оМ бК ОО ра ке ОС) «ж БЕБІ ОКЛОВБУ Б: БУ З КЗ ВЗ ВЗ Б З х ч 0 пок з й ож ке ни В Не В о с ВИК М Ов М ОК ношах от т А їі їм бл» У ЛЬ ТМ по; їм ої БО ОЇ дя жу вд му вк м ах ж о хо рро МИ Іо й ОА м МО МІ 0 ОО ЕМО, поко нов А НО На НН на НА НН НК щоощУ о ОЦ У І У їйроїх: с Би Кл о їх щої Р 0 їх ях Й пасив а ві вона п о о п ПИ о МІЙ зно, Я хв МнЯнЯуЖ Аа о у а а о ан КОСИ С КК С Б С С С СХ я іч --щроня я ня ях Я вЯ ХМ сх» вот Я З ох пише ння ій ме хі Мао ба. об їх; Ка їм іх Її; х МО ОБ б ОК ЕОМ ОБ ВО ФК МО ТА гРуУхЄ ЇМО ФиЄ сух хе п же г Уж про з Іл У Му У с КУ ФО МО гц їмо Ки (Мо й» ої йо ох . вРов вЯ ВЯ вЯ о рвя мя вЯ Ма у в Оз (еВ; ож и ж жо жу дл Мо ждх мч мох І ОЩО шо де М де Хч о ж дО А ие ОА 5 «ОО й чо фе чо мо до у ЇМО дю МОХ ШО С С г и а а ча а ше оЖМм ой» Ка ще» ої ОО а їоОЇМ ЇМ ож 4 ие ни о а о па о пн п а о п св ка и ко ШИ СОС НЕ М НЯ режи но ни а ВС В ЕН З ЗАС В З ЗИ С З АМВО й І спис ВУС Є НОВ ЕЙ Іі Б ОБР ЗІ КЗ ца щф ОБО хР 10 ох С а на ну на ня на нь НА НО НН ННЯ ь п мір мМ Ух МЕ с ух рт в ж ном НЯ М о мі НН о У пом о ча о у ан мм Мт жит фу МО ух ше ЩА ХК уко з все а п І В А ПИ ВН ІЙ Може КО ву ВОК О ке кх в По БОШ Од СО ФО я кн а нн а І Но п І о шни ни н а и к а е пир я їх ще їх 81 їз а ФО 0 мі ж чі а и о А нн й рома ку За Мр КУ мо лою току МО уж Шк Ме Пе хо вя йх о» я от Блом г Ти Б КК ух З щі щі її; мі ОЇ ЙО 35 БО ОБ За ; хх КІШКУ й в щЯ хх 0лову ві ж й ен и м з о ко Со В В за В и НЕ ОН и ери а Тож УОЗ сх: МУ М Ом Б ЦЗ « " п шк Кщ - У у яко щи М Ос й ПУ чит їх ва ; ще ко М ЕЕ ол зи Ан а ШИН НЕ НН НН ку ом мм МОМ ЗА Кр м : ї ! Н Н : Н рих ра ї ї з Н Н Н Н НЕ Зо о І КЕ ЗУ ярок мм Ми ка чі Ос с о А В НК КО: м и Не оце еще ом оя мо уМмоще я пч КЕ я--р ЖИТ ОЖЖ м: МІ ВОМ Її їж РОБ око БОБ ОБО ОБ ОВО БО: ; ОКО Ко ДОК СУ Ко.
З уз жим уми шк умх ше Хе МУ ХО и м м А и М р с ек Се -- У ек Кк що ха ОК Кк Її яз ж ше не чк пока м ко мМ ОБ ЖЇМ о КМ Її Її щоФ ни ник нн п НІ НЕ НИ що Брот» Вр ОЇ т оз) шо зр с ШОЕ о ше с с Її ос 33 55 а ке нн Ше ее оо со а вно ША НУ ее ек жи ни Ша ах М а В НЯ ни: ши не ШК ЕН В В В У р Її 53 т. фі грог т кі г ки слини они Кл СО Се НК тю М о ооо кр ой Ко тю А Фо Ко Кк У ОО Ка Я ха МОМ М АЛОКІ АД ОК ме и м м А я п ще що ж Ко що мог щ пу мі З І п лі У й я мя й мошок щі - нн У, Я Ук. ія Ух, У З ее дея МОМ ще у опо йо оїхі че їм бе ої Є ОКО ЇВ о.
ря І їй ї пог ле х з о сег ет
. . ще СОМ ще с ЕУАА т о г ше ПЕН Ф ТК ее ее? Же З шо «КЗ «о ще ще ко ом ща се Фо р З чо со Юда о нео і нео мив; ЧК ви М о он ми В ж но оо нь ва ве ее о ж ЕК ше «ко вок «о в в до по а - я «ке во ще це ЖК ОО о Фе ся вок В о рек ФО во мое Фе «о пе ве ке вовк Фо о ре в- за ща а о ща о що дао Сея ож. ро во ве о о я ва ке ін хе що еЯ їн ре Ся я ре ве вер ок о вою ок з а со лі нн и нн КОН КОН КЕ МИ СК де о ві во до ве ве па ен ве ож вся ря с «КК во ее: ні о ї- в я о ве о во ож ню ок ве ве ва І оо во вок ше СО Я о ок о ве о 5 о ває не о о во по еконо м воно нн ши Й шо ше я мем ве о що що де ща ою ве ве по ща ож ора ож ває со ОК в в- с я во зо що яко вою ее о о оо обо оо -о «о а не ше оо вве ее со ою мое не Се се ОО о) ср ее 2 а ГО оо оо че ко жя до вав ою ве оо чок чої Ей вою ше ЖЖ БЕ ж а шо я ж и Бе о за ве Ге во о Сея 0 Ж . о іх їх ве 15 а ве ре 33 фех фе фо фо | Шк Со оо ща Мо щі ре фе ее Ок оааокконнча В во о СЕ о са в- в с: ж що інш е Оки Бе ей Едем ва За жк оо од око ке й у -ок . У її г ; г я в ж що як я ж я Бе щ- в Ве фе ве і тк і Ж ее ча 3 не Фе Фа ещ коник) С жо а во гай вве «кое ж ва о ек жк по ів ще ЕМЕШЕ ОК а: ГИ: ше - З бо в оо во ко ше во Гео и «Ко во «о вне о вв ва ою се ва жк ке о ШЕ о за ОО ОО ож що їн 0 о ве век ж ве ся ває ро по ех ж; во Бе во С вк Я 5 «о Бе Бор ше ЖК не БКДЕ о Зі «, І 5 х Се с, з чи й я я Б во са Я го М Х я х вок о во НИЖ со ее ке ожшж КК ва ов ке ав о во що ца ро ща до З ок ж БО во мене ре а що вн во о Ж ве ре ве ве 2 о Шу во жо 9 Ко ст 4 ЕВ Я ка В Кк св Ой не ше хом ве м ре їм ке ВК пс МЕ Зк ВК севва ше М Зо Фо що щі шо що що 5 що СИН КО п Вк а що ЩЕ ма ща в є в Фо ща в ев ше ЯЗ «йо щі сі ей і лоб я ей ей - що БЕ Б пЯех що що ж збу. зо хх нобе ож жо «х же Каша яке ие я Бк їм їе ро ре Ше вою ще вен ек ж Ше 3 Ще в ще Х в- ве Ж і вн В ПК ве ре ве Кк фе оф ор ве ся ож Фе ЖЖ Фо о шо ва о сш ре РЕЖ. є ср ща сор Ж) ож ше жо, о ща Я о шо ож вве в- ке о ее; СОЯ) Б ЕЯ Фо Бех Ж я Еея а) во а ве ве 5 во Зо Ся ве НЕ вве вою за во зе ах шкі і о зни нн кни и СИНИ КЕ Ьь ми вве Я Ся ве ке о «ОЖ Гоше ро ве ка ве ве ве ре ве ОК вк ве Я ож ває с р рве Ба ее ЕІ Те 33 «ЖК «о ша Ен ме во ЕВ во Сея ее ОН пе ся ф-о ж о о ом ре ве ка се сі що аж ва ОО х а Гая в ще 5 Ко вок. ин нене шк и фонова лено УК сколи и они ек пи ж: мае ве пиття ве ве Я ре ве Ся КЕ їн ве К а ве ве Б КО ве ве ве я г що о ож зе ве т о що ща 3 ве ве фе ве ве т Я с щоб їв с фен фея Ф Я ща вн е ме за же «ок Я т са ПО «о - о ко ЖЕК я Я ПеЖЕ й ше ва З щи по «о о Я; вою ве 13 ож с ЖЖ жо вк ко ба ке рей Я ве вх ве ве Ся 3 Га че СО Ж кея вно фе зо во ся З ос ся о Ж Фо сс «о Ши дао вок Со МОЖ ж во «« 7 о о «Фо до Б аа ОЗ з-е ща с що СЯ Сея ко во ее ож оо во ва ще во 1 їеккфоо йее» бою Ве бе ою бе колиш ж в ж п не С м й МЕ я . вве КВ ве в я вн се ев ЛЕ ШИ ШИ За вою «о от тре ве веж га 2 я жо В чо 29 ши век в-ове ве ох За ва ї- ве в ся в жа ГК «Кок (3 55 г ож ве ре ке ве ве о ее: ща ОК ГЕ ме в- в во во Си Ся с жо ож Фе ок р-ее «ж ї- ке Ж ся вк Я ща С ся СО 3 я ж «о ве Ж во що Кая -е шк Ве ОоЮ Ж ою ке о о вок оо ве вх в ре во ве фе ОО о КЕ а Бе Бе зе ще ва ха а ОКУ во т З ре ве м ве ве о о Да о вся ж о т «КО ве а глухе з яко х с» х ск с --а Ще ож УМ ож ХВ же ЕЕоже ож ща оже КО ге пове І ве ма ж в» «а те СУ ре ща о ка мк що о мк ма о о т в І ща І З «в «В вх в а соня солей пеболей он сеошой кед сад щей ще що Ж ЕЕ ж жЕЯ Ж ш Ж я Ще о ЩО що ЖЖ ж Ж ЖОЖ о МО о Ж Ж й че ж кс СМС В щі з о а З цх їх КОР ЩО є «т дО КИ а ща ЩО ОКО «м що І М щеожхи же ж жк ух ке таз ка м с б 5 ОБО о ех ЯК Ох ж Ж ЖЖ ж Фо м. фо Ме Же жо ву не Ак п а а а с и ЗЕМ щі м Ж Ж З 5 ВО Б В БА п шо Я вн в дю «ЕК ЖЕ Ж КО тех юю т КО КЗ Є КО КО - УК я мож мож ж мя бо ояовоо У ЗД чек ой о ой Ж ОМ КОЖ: ФО Ж Ку м нн нн и ххх М) Юр се М до ДЮ ДЬ ЩЮ ЇМ ОБО М вловтюю ТОЩО БОЇ ОЇ ФК Ж «А Я ДК Шов В Мом мо бою яка Ж Ж Ж ж РІ МУ Б В ЖК ЕХ реа ИН МІ Б) ХВ Ж Пн ля я ЖЮ люко кн яння пес ом У М жо Ве оф фе ве бю бю бю З Хе Хо р їх хх ххх хх сх Ж ххх хх ой я ККОКОохе мож Ж ж ж ЖЖ ххлхХххмхж с у ше Я пу м им око Ж щи це Здн зе сі до фо сєдко до ско коже су сю ше КА КР СХ КО КУ ОК ОО С жов Же верх ве ке вн ве ткож жо ОО ЕП АП МЕН ОО ШОЇ с: ос ХХ скожжо жо ж жо шюммж ім Ж хх ххх хх кю ЩОЛУХ ж сік «ее вел и АК -ох 2 п? ї - де От й 2 а Ка Б КО У Кк ее З ЯН ХО Ж Ко Ко ее ши Ве ке В ШК ДЕК лав хе о ахкй яння сяк осям СЬОБРОС Ка КЗ С Ка все пен и хкУжик, ЩМОБКОСМ МОЇМ ЕОМ ОК ОК КОКО що амМ ва Ма да КОВО КМ С КИ ою їх пе пе р х Шк Хе де се ха жо Аж ско ж ха мж о ЄЖУх сжхяжжх Б «Ох ЖЕ « «а Б ЖЖ Ж: ОК Ж ОО хв ЖЖ Кок о па ШИ 7 и Жим їх - да оо о шоу ху хж жк схо ха ка ха жи хи ху у і ЖЖ жом шк жк й ПЕ ЛЕ КА ОО не кож к я дю юю Ж ся х кою - х ТЗ ФУ ЛЕ МО МОМ се КК ЖК АК дк кое оон в в Я щі о С ДАЙ жене ск скоб не и ве І ва иа ху КК Ж ХО п 0 ОК ОО в в в ВК ох Ше Но Ме Ме Ме Мх Цх тоже ню М й те вен в о У а Ве ве ве ве ШК ООЖ ме и ме ме м Ж ОО ой ж Ж сом ою ня ххх хх кю МУ) Лю) БУ ЄВ дом сюс с шРсЬсЬ в ее ЖЖ ОО ОЖ ОО зефоа лох мото М.
ВА МА Ме М.
Цо щи щі Же ке вх ре ре ре ме ше оп Ше ж - ««оош оо к я У у ож м й їх 4 її ее їх а ща у МОЮ ВКОКЕ ЕОМ ЖЖ МО ОД ОДО КОКО ОВ мм о Я БМ ВХ БА ж ж ЖЖ Кок ожМожмі ол ей хі хЕкхишиЕхх мМ пе ШК я дод од де й де МУ ЕК ЖК ше Ов шеоможоеоже не Ук В СЕ КВК З я ЕЕ жшжжхмжмжмжх се ко Шах я, а НУ с ч У у й т з тя г. ее є ОО охо хх ем ом о Оу пе де ож де Де де де с сих ші ве б Й жк х он пРІВБ шоожхю хх с МВ МУ де в в ес «ФС М З ж ж ж ж ЖК КО зх оз ж М хе У М КК ск лад (яд Ах АХА КАН хх ке а со ХОМ ІЛ М КО КИ КО ФК ЖЖ шу Моне же ме ме ре ве Ше о рх фе фо хх ух ЇХ рен АК ШК: «МО КК де пе з де жо ех Пед Хе ше хе де де СС Се ЩО ЖК Ого до са ха с В щі щем ШеОУМ Ше ШО ДО Ох Ух Ук у УК де Де УК Оу шко цю о во КО ЖК ч- В ке я КК ІВІЇпІх ВІВ іВ ; : АЙ ; «Ж М хх КАХ вона нау А МОАМОАМ МІ КИ КИ яко й ол оон ч- мозком -кожомк о жкожножони ох ж ДЕ ОХ Ма щі кА ХК С СУ у Мін щі ее а зво хх т С ОК КИ КК ве Бе фе ре ре ре юх шик мих хх дня жкЖе жк ке ках | ше КЕ ЕК КО зеоме ме ем МОМ о же хх хо сою дк хх жкх Я І ЩО МІ І МІ ве пре БУ АК Ж ЯМ Ж жОЖОЖж жЖОЖх сх ж юю жк лях п мех Се ка сх ОК Ка З меж лях кали яежю яю МО АК ші ьм «Ж о Ж сх ФІ снояже кю хек охкхожхю Ж ! ше демомомо ве СЕС Кс Ме ре ре вх вх ре ЦИ кжЖжижЖж шов ОК 0 ФВ 00ожжнсяюю 0 РОБ ІВ ІВ ж Ж Ж Ех Во. м. н- Ж ОО ща ХК а мі БО ЩІ ока є пи п Ди ВИК ЖЖ Я С У фе ре м ве В Дю рої кі ри с феод іх вм Ж. уче є Її с» Де 0» 0» З Шен шій В я фе фе ре бе вк ве м Ж З З КБ КЗ З ЗЕ вих Ж ож Ж шу ей й я сей с леї жі жид од юой «у ре Ме ме фе ж бе Щі кх о у сх їх жо ко ще с дюобю я ке ока ве ВУ ух дк а В Ж КК ОК КО Ж ОМ ЖОВ педе де де де ех м ВОМ Я А сек ЖЖ ЖЖ яляеоххлоохялео ее хм мм ж с ДЯН АВК Мово ні В нич ж ЖЖ ж ж ж жа же и м що щі щ щі і щі якос ж жк МОЛОТ ве ке ме ве що ОХ ЖУЖ ЯК дже «УМ -ЖУХ ох жк м ж ж х м Ж Ж Ж Ж хх ож ж хо Ве хшОЖООдКЕ МОЖ ОМ ОХ ПО ВОО0У ХДУ М ШК М о м Ж ЖЖ с КЗ г п КЗ Ех сс ЖЖ Ме що Ж КО КЗ КМ КУ КЗ ІЗ п щ щОКО Ж ОХ їх У В ЇМ ХО КО ЇМ ож дю м я ж хе змо «КЗ КК Том; ша Ме м С З б Ж соя ЕВ ен пи неви ПА А МАКИ біз во ВЖК по сні й КИ КА я ж Ж З МОЖ вот ВЕК ші пе дО ТМ Ох ФК ОКО Ж В кое вою ооо ох МЕ Б Ва ЖОВ ші жи У ОШМ ІМ Ск - ме Ж ж Ж сш ЖЖ оте ФО ж ж: Ж мож М Ж зеболявожив он в КМоя Жив «к и «М Ж КК КК вояж хг ід ЖЕК КС ож ж МУ МУ ВО КЗ МУ Фо ве ве Ме ве ке вк рн пили ши шмшщш ВК Ж С ве фе би ре вх ре фе ЦЕ КЗ МО Бе ща під ей ей й й й КМ о Ж Б шо КК хжжмжжижх МЕ со кв М ВО в ж В ФР Ж а фу Мо Бо це Ко Ма бе ж с в ВВ Я КК о КК, «о й КОЖ В Ж Є ХХ же с Ваши в У вих во З 5 ших З т ЗК М БА ба КК Ті 2 8 В СХ вк о БО я Ка ах СУК де Я а КК У ЖКЕ Ж ЩО ХО УК ЕХ І ШК МО ЖК КУ о М ОМУ МО Ще Ж ФВ БУ ТЗ ЩО ма М МУ АХ г З ОС чя щі пос З 5 що ок п ми Ж т ІЛ хх вм Ж КЕ КУ ом ЕН ин вояк КВ Мо В ОМ Беж В Б шк в Ме Б ФО Бо хо ам Що в М В ЕО бета лави Зав Ви Яви ой дО м км.
М ОМВО Ж З -к м А ВИ Кк ду Я, Ух З 5 З «с З що Ж - Кк У ЗЯ п Кв С Ж ФК: се ШК ЕВ ОДИНН кий М В еко КОМ свя ММА з Ж щ Ж Ах щ ОО а ща хе ОД КУ ж КЗ ща - ЦО г ще де Еш вка що ХЕ м 55 Ж 5 5 Б ож «3 же ха Ух жк А «їх Ж Ж Що і г 1 Ко.
UAA201710266A 2015-03-26 2016-03-23 Новий штам paenibacillus, протигрибкові сполуки та способи їх застосування UA120642C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562138765P 2015-03-26 2015-03-26
US201562232205P 2015-09-24 2015-09-24
PCT/US2016/023760 WO2016154297A1 (en) 2015-03-26 2016-03-23 A novel paenibacillus strain, antifungal compounds, and methods for their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120642C2 true UA120642C2 (uk) 2020-01-10

Family

ID=55646922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201710266A UA120642C2 (uk) 2015-03-26 2016-03-23 Новий штам paenibacillus, протигрибкові сполуки та способи їх застосування

Country Status (20)

Country Link
US (5) US9883676B2 (uk)
EP (3) EP3274443B1 (uk)
JP (3) JP6916737B2 (uk)
KR (2) KR20240015158A (uk)
CN (2) CN107995925B (uk)
AU (2) AU2016235208B2 (uk)
BR (4) BR112017020604B1 (uk)
CA (1) CA2980723A1 (uk)
CL (3) CL2017002425A1 (uk)
CO (1) CO2017009663A2 (uk)
ES (2) ES2804732T3 (uk)
HU (2) HUE049475T2 (uk)
MX (2) MX2017012305A (uk)
PE (2) PE20221728A1 (uk)
PH (1) PH12017501757A1 (uk)
PL (2) PL3274443T3 (uk)
PT (2) PT3594225T (uk)
RU (2) RU2021135364A (uk)
UA (1) UA120642C2 (uk)
WO (1) WO2016154297A1 (uk)

Families Citing this family (155)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6916737B2 (ja) * 2015-03-26 2021-08-11 バイエル クロップサイエンス エルピーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｐ 新規なパエニバチルス（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株、抗真菌化合物、およびそれらの使用のための方法
GB201622086D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Scientia Terrae Vzw And Katholieke Univ Leuven And Proefstation Groenteteelt And Proefcentrum Hoogst Biocontrol organism
CN107012106B (zh) * 2017-02-21 2019-07-26 北京农学院 对百合镰刀菌有拮抗作用的邻苯二甲酸降解菌及其应用
CA3057972A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Tenfold Technologies, LLC Methods and agricultural compositions for preventing or controlling plant diseases
TWI782983B (zh) 2017-04-27 2022-11-11 德商拜耳廠股份有限公司 雜芳基苯基胺基喹啉及類似物
BR112019023037A2 (pt) 2017-05-03 2020-06-02 Bayer Aktiengesellschaft Sisilbenzilbenzimidazóis trissubstituídos e análogos
EP3618632A1 (en) 2017-05-03 2020-03-11 Bayer Aktiengesellschaft Trisubstitutedsilylheteroaryloxyquinolines and analogues
CN110582484A (zh) 2017-05-03 2019-12-17 拜耳公司 三取代的甲硅烷基甲基苯氧基喹啉及其类似物
CN111629592A (zh) 2017-08-17 2020-09-04 拜耳作物科学有限合伙公司 液体肥料分散性组合物及其方法
US11213031B2 (en) 2017-11-13 2022-01-04 Bayer Aktiengesellschaft Tetrazolylpropyl derivatives and their use as fungicides
BR112020009618A2 (pt) 2017-11-16 2020-11-24 Bayer Cropscience Lp plataforma, produtos e métodos de exibição de endósporo à base de paenibacillus
TW201927768A (zh) 2017-12-21 2019-07-16 德商拜耳廠股份有限公司 三取代矽基甲基雜芳氧基喹啉及類似物
KR102012583B1 (ko) 2018-01-22 2019-08-21 안동대학교 산학협력단 신규한 페니바실러스 엘기 ＡＭ-67 균주 및 이를 함유한 배추무름병 원인균 Ｅｒｗｉｎｉａ．ｓｐ．미생물 제어용 친환경생물농약 조성물
WO2019142963A1 (ko) * 2018-01-22 2019-07-25 안동대학교 산학협력단 신규한 페니바실러스 엘기 ＡＭ-67 균주 및 이를 함유한 배추무름병 Ｅｒｗｉｎｉａ．ｓｐ．제어용 친환경생물농약 조성물
CN108192846B (zh) * 2018-02-06 2019-10-01 沈阳农业大学 一种用于防治小麦叶锈病菌的多粘类芽孢杆菌及其应用
EP3752492B1 (en) 2018-02-12 2022-12-21 Bayer Aktiengesellschaft Fungicidal oxadiazoles
WO2019162228A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Bayer Aktiengesellschaft 1-(5-substituted imidazol-1-yl)but-3-en derivatives and their use as fungicides
US20210147371A1 (en) 2018-04-10 2021-05-20 Bayer Aktiengesellschaft Oxadiazoline derivatives
AU2019269315A1 (en) * 2018-05-14 2020-12-10 Bayer Cropscience Lp Mutants of paenibacillus and methods for their use
CN112423593A (zh) * 2018-05-17 2021-02-26 拜耳作物科学有限合伙公司 稳定的杀真菌组合物
CR20200641A (es) 2018-07-05 2021-02-16 Bayer Ag Tiofenocarboxamidas sustituidas y analogos como agentes antibacterianos
US20210282404A1 (en) 2018-07-17 2021-09-16 Bayer Sas Biological methods for controlling phytopathogenic fungi
WO2020020813A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Bayer Aktiengesellschaft Fungicidal active compound combinations
US20210251237A1 (en) * 2018-07-25 2021-08-19 Regents Of The University Of Minnesota Platform for developing soil-borne plant pathogen inhibiting microbial consortia
WO2020020816A1 (en) 2018-07-26 2020-01-30 Bayer Aktiengesellschaft Novel triazole derivatives
CN109136132B (zh) * 2018-08-27 2021-05-14 田璨熙 一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7及其培养方法和应用
BR112021004865A2 (pt) 2018-09-17 2021-06-01 Bayer Aktiengesellschaft uso do fungicida isoflucypram para controlar claviceps purpurea e reduzir esclerócios em cereais
BR112021004889A2 (pt) 2018-09-20 2021-06-01 Bayer Cropscience Lp método para controlar pestes animais com paenibacillus terrae
WO2020070050A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Bayer Aktiengesellschaft Fungicidal 5-substituted imidazol-1-yl carbinol derivatives
AR116747A1 (es) 2018-10-18 2021-06-09 Bayer Ag Piridilfenilaminoquinolinas y análogos de las mismas
BR112021007333A2 (pt) 2018-10-18 2021-07-20 Bayer Aktiengesellschaft heteroarilaminoquinolinas e análogos
TW202028193A (zh) 2018-10-20 2020-08-01 德商拜耳廠股份有限公司 氧雜環丁基苯氧基喹啉及類似物
AR117169A1 (es) 2018-11-28 2021-07-14 Bayer Ag (tio)amidas de piridazina como compuestos fungicidas
CN109456921B (zh) * 2018-11-30 2021-06-08 郝志敏 一种多粘类芽孢杆菌、应用及微生物菌剂、粉剂和颗粒剂
EP3620052A1 (en) 2018-12-12 2020-03-11 Bayer Aktiengesellschaft Use of phenoxypyridinyl-substituted (1h-1,2,4-triazol-1-yl)alcohols for controlling fungicidal diseases in maize
MX2021007515A (es) 2018-12-20 2021-08-05 Bayer Ag Compuestos de heterociclil piridazina como fungicidas.
CN113473860A (zh) 2018-12-21 2021-10-01 拜耳公司 作为新的抗真菌剂的1，3，4-噁二唑及其衍生物
EP3669652A1 (en) 2018-12-21 2020-06-24 Bayer AG Active compound combination
EP3679789A1 (en) 2019-01-08 2020-07-15 Bayer AG Active compound combinations
EP3679790A1 (en) 2019-01-08 2020-07-15 Bayer AG Active compound combinations
EP3679791A1 (en) 2019-01-08 2020-07-15 Bayer AG Active compound combinations
EP3679792A1 (en) 2019-01-08 2020-07-15 Bayer AG Active compound combinations
EP3679793A1 (en) 2019-01-08 2020-07-15 Bayer AG Active compound combinations
US11470793B2 (en) 2019-02-01 2022-10-18 Kontzamanis Graumann Smith Macmillan Inc. Bacterial strain having anti-fungal properties and uses thereof
WO2020178307A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
EP3934429A1 (en) 2019-03-07 2022-01-12 Bayer CropScience LP Paenibacillus strains and methods for their use
WO2020182929A1 (en) 2019-03-13 2020-09-17 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
CN109917048B (zh) * 2019-04-18 2022-03-08 江阴天江药业有限公司 一种秦皮药材的uplc特征图谱的构建方法及其应用
CN113840533A (zh) 2019-05-08 2021-12-24 拜耳公司 活性化合物结合物
US20220240508A1 (en) 2019-05-10 2022-08-04 Bayer Cropscience Lp Active compound combinations
CN110229856B (zh) * 2019-06-19 2022-09-23 光明乳业股份有限公司 一种环脂肽类抗生素Fusaricidin B的制备方法
BR112021025700A2 (pt) 2019-06-21 2022-02-08 Bayer Ag Hidróxi-isoxazolinas e derivados das mesmas
WO2020254489A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Bayer Aktiengesellschaft Benzylphenyl hydroxyisoxazolines and analogues as new antifungal agents
BR112021025317A2 (pt) 2019-06-21 2022-03-15 Bayer Ag Tienilhidroxiisoxazolinas e derivados das mesmas
WO2020254488A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Bayer Aktiengesellschaft Hydroxyisoxazolines and use thereof as fungicides
BR112021025865A2 (pt) 2019-06-21 2022-03-03 Bayer Ag Hidróxi-isoxazolinas e derivados das mesmas
WO2020254486A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Bayer Aktiengesellschaft Hydroxyisoxazolines and derivatives thereof
WO2020254494A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Bayer Aktiengesellschaft Fungicidal oxadiazoles
BR112021025264A2 (pt) 2019-06-21 2022-01-25 Bayer Ag Fenoxifenil hidróxi-isoxazolinas e análogos como novos agentes antifúngicos
CA3144598A1 (en) 2019-06-24 2020-12-30 Auburn University A bacillus strain and methods of its use for plant growth promotion
CR20210678A (es) 2019-07-03 2022-02-15 Bayer Ag Carboxamidas de tiofeno sustituidas y derivados de estas
EP3701796A1 (en) 2019-08-08 2020-09-02 Bayer AG Active compound combinations
CA3156302A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Bayer Aktiengesellschaft COMBINATIONS OF ACTIVE COMPOUNDS INCLUDING FATTY ACIDS
WO2021097162A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Bayer Cropscience Lp Beneficial combinations with paenibacillus
CA3165263A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Bayer Aktiengesellschaft Thienyloxazolones and analogues
KR20220119651A (ko) 2019-12-20 2022-08-30 바이엘 악티엔게젤샤프트 치환된 티오펜 카르복스아미드, 티오펜 카르복실산 및 그의 유도체
EP3708565A1 (en) 2020-03-04 2020-09-16 Bayer AG Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides
KR102339765B1 (ko) * 2020-03-13 2021-12-15 동아대학교 산학협력단 플라보박테리움 속 tch3-2 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도
CN111454860B (zh) * 2020-04-09 2022-01-18 广西乐土生物科技有限公司 一种多粘芽孢杆菌菌剂及其制备方法
CN111378780B (zh) * 2020-04-09 2022-05-10 中国科学院微生物研究所 柱锈菌科多基因谱系筛查方法
BR112022020774A2 (pt) 2020-04-16 2022-11-29 Bayer Ag Combinações de compostos ativos e composições fungicidas compreendendo as mesmas
CN115551352A (zh) 2020-04-16 2022-12-30 拜耳公司 活性化合物组合以及包含它们的杀真菌剂组合物
UY39169A (es) 2020-04-16 2021-11-30 Bayer Ag Combinaciones de compuestos activos, composiciones fungicidas que los comprenden, uso de las mismas y métodos para controlar microorganismos
WO2021209366A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations and fungicide compositions comprising those
WO2021209490A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides
AU2021257572A1 (en) 2020-04-16 2022-11-10 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations and fungicide compositions comprising those
US20230348392A1 (en) 2020-05-06 2023-11-02 Bayer Aktiengesellschaft Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds
US20230180756A1 (en) 2020-05-12 2023-06-15 Bayer Aktiengesellschaft Triazine and pyrimidine (thio)amides as fungicidal compounds
EP4153566A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Azabicyclic(thio)amides as fungicidal compounds
JP2023527036A (ja) 2020-05-27 2023-06-26 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 活性化合物の組合せ物
US20230278994A1 (en) 2020-06-04 2023-09-07 Bayer Aktiengesellschaft Heterocyclyl pyrimidines and triazines as novel fungicides
CN116057056A (zh) 2020-06-10 2023-05-02 拜耳公司 作为杀真菌剂的氮杂双环取代的杂环化合物
JP2023532224A (ja) 2020-06-18 2023-07-27 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 新規殺菌剤としてのオキサジアジニルピリダジン
AU2021291371A1 (en) 2020-06-18 2023-02-02 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations
BR112022025710A2 (pt) 2020-06-19 2023-03-07 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas
UY39276A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones.
WO2021255093A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
BR112022025692A2 (pt) 2020-06-19 2023-02-28 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas
UY39275A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos
KR20230043864A (ko) 2020-07-31 2023-03-31 바스프 에스이 푸사리시딘 생산 박테리아를 위한 신규 농약 제형
WO2022058327A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
EP3915371A1 (en) 2020-11-04 2021-12-01 Bayer AG Active compound combinations and fungicide compositions comprising those
EP3915971A1 (en) 2020-12-16 2021-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2022128812A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Basf Se Spore compositions, production and uses thereof
WO2022129188A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides
WO2022129190A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
WO2022129196A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
US20240065271A1 (en) 2020-12-23 2024-02-29 Basf Se Mixtures and compositions comprising fusaricidin a, fusaricidin b and fungicides
US11889794B2 (en) 2020-12-30 2024-02-06 Milwaukee Electric Tool Corporation Handheld blower
CN112795507A (zh) * 2021-01-07 2021-05-14 河南省农业科学院植物保护研究所 一种能够防治丹参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用
WO2022157334A1 (en) 2021-01-21 2022-07-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN112760258B (zh) * 2021-01-27 2022-02-01 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一株皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性软腐病中的应用
WO2022207494A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
BR112023019788A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
AR125342A1 (es) 2021-04-16 2023-07-05 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de amina cíclica activos como plaguicidas
CN113278601B (zh) * 2021-05-17 2022-07-08 浙江工业大学 一种腺苷酰化蛋白a6突变体及其编码基因与应用
WO2022258481A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active diazine-amide compounds
CN113354718B (zh) * 2021-06-21 2023-06-02 重庆市畜牧科学院 一种哌尼生素前体、表达盒及其制备方法
AU2022299145A1 (en) 2021-06-24 2023-12-07 Syngenta Crop Protection Ag 2-[3-[1 [(quinazolin-4-yl)amino]ethyl]pyrazin-2-yl]thiazole-5-carbonitrile derivatives and similar compounds as pesticides
US20240324594A1 (en) 2021-07-27 2024-10-03 Syngenta Crop Protection Ag Method for Controlling Diamide Resistant Pests and Compounds Therefor
US20240308988A1 (en) 2021-08-05 2024-09-19 Syngenta Crop Protection Ag Method For Controlling Diamide Resistant Pests and Compounds Therefor
JP2024531177A (ja) 2021-08-10 2024-08-29 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物剤としての２，２－ジフルオロ－５Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｆ］イソインドール－７－オン誘導体
AR126729A1 (es) 2021-08-10 2023-11-08 Syngenta Crop Protection Ag Mezcla fungicida
AU2022326207A1 (en) 2021-08-13 2024-02-15 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations and fungicide compositions comprising those
CA3228896A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Tobias May Paenibacillus strains producing low amounts of exopolysaccarides
CN118804924A (zh) 2021-09-10 2024-10-18 巴斯夫欧洲公司 产生胞外多糖的微生物及其用途
MX2024004237A (es) 2021-10-14 2024-04-24 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de imidazo[1,2-a]piridina.
WO2023072945A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023072849A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazinone compounds
CN118541353A (zh) 2021-11-03 2024-08-23 拜耳公司 作为杀真菌化合物的双(杂)芳基硫醚(硫代)酰胺
WO2023088791A1 (en) * 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Paenibacillus strains producing low amounts of dab comprising compounds.
CN118317956A (zh) 2021-11-30 2024-07-09 拜耳公司 作为杀真菌化合物的双(杂)芳基硫醚噁二嗪
WO2023104714A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazinone compounds
WO2023110710A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4197333A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
WO2023148369A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023148368A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023187191A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023213626A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms
WO2023213670A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine
WO2023247360A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
WO2024017788A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Solid form of a heterocyclic amide derivative
WO2024022910A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag 1-[1-[2-(pyrimidin-4-yl)-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-3-[2,4-dichloro-5-phenyl]urea derivatives and similar compounds as pesticides
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
WO2024056732A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2024068518A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
EP4295688A1 (en) 2022-09-28 2023-12-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
WO2024068517A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
GB202214202D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Agricultural methods
WO2024068519A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
GB202214203D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024068520A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024089023A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024094575A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024104643A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Bayer Aktiengesellschaft Use of isotianil for controlling plasmodiophora brassica
WO2024110215A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2024126388A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024126404A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
WO2024126407A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Benzimidazole derivatives
WO2024133426A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests and compounds therefor
WO2024133551A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazine compounds
WO2024146945A1 (en) 2023-01-07 2024-07-11 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide and sulfonamide pesticidal compounds
WO2024170339A1 (en) 2023-02-13 2024-08-22 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active bicyclic compounds
CN116694652B (zh) * 2023-08-01 2023-10-27 中国农业科学院生物技术研究所 大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段及干扰载体和应用
CN116926088B (zh) * 2023-09-14 2023-12-12 中国农业科学院生物技术研究所 大丽轮枝菌VdNRPS6基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2384967A1 (en) * 1999-09-15 2001-03-22 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active bacillus thuringiensis .delta.-endotoxin compositions and methods of use
US20040110184A1 (en) * 2002-06-28 2004-06-10 Dow Agrosciences Llc Pesticidally active proteins and polynucleotides obtainable from Paenibacillus species
US7935335B2 (en) 2004-08-09 2011-05-03 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Strains belonging to the genus Paenibacillus and method of controlling plant disease by using these strains or culture thereof
KR100762315B1 (ko) * 2006-01-24 2007-10-04 한국생명공학연구원 푸자리시딘 생합성 효소 및 이를 코딩하는 유전자
EP2170082A4 (en) * 2007-06-29 2012-01-11 Commw Scient Ind Res Org PROCESS FOR REMOVING TOXIC COMPOUNDS
US9809865B2 (en) 2009-12-09 2017-11-07 Best Environmental Technologies, Inc. Anti-microbial agent from Paenibacillus sp. and methods and uses thereof
KR101313900B1 (ko) * 2010-04-28 2013-09-30 대한민국(농촌진흥청장) 푸자리시딘을 이용한 식물 보호 방법
KR101250604B1 (ko) * 2010-08-20 2013-04-03 고려대학교 산학협력단 푸자리시딘 유도체 ｌｉ－ｆ０７의 생산량이 증가된 패니바실러스 폴리믹사 디비비１７０９의 변이균주와 이의 제조방법
CN101962401B (zh) * 2010-09-01 2012-06-13 浙江大学 一种多肽菌素及其制备与应用
CN102168053B (zh) * 2011-02-13 2013-09-25 南京农业大学 一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用
RU2013150203A (ru) * 2011-04-12 2015-05-20 Оро Фину Партисипасойнс Э Эмпреендиментус С/А Пептиды с противомикробной активностью, лекарственные композиции для лечения и профилактики животных, композиции для лечения и профилактики растений, применения указанных пептидов и применения экстракта из paenibacillus elgii ourofinensis
KR101541446B1 (ko) 2012-12-11 2015-08-06 한국생명공학연구원 푸자리시딘 생산 균주 및 이를 이용한 푸자리시딘의 대량 생산방법
RU2539738C1 (ru) * 2013-08-20 2015-01-27 Закрытое акционерное общество научно-производственное предприятие "Биомедхим" (ЗАО НПП "Биомедхим") ШТАММ БАКТЕРИЙ Paenibacillus sp. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПШЕНИЦЫ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ
RU2529958C1 (ru) * 2013-08-20 2014-10-10 Закрытое акционерное общество научно-производственное предприятие "Биомедхим" (ЗАО НПП "Биомедхим") Штамм азотфиксирующих бактерий pseudomonas sp. для получения биопрепарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами, и повышения урожайности
CN106793781B (zh) * 2014-05-28 2020-07-28 拜耳作物科学有限合伙公司 用于防治植物中的真菌性病害和细菌性病害的组合物和方法
HUE045008T2 (hu) 2014-08-04 2019-12-30 Basf Se Antifungális Paenibacillus törzsek, fusaricidin-típusú vegyületek és alkalmazásuk
CL2014002101A1 (es) 2014-08-08 2015-01-30 Univ Santiago Chile Cepa bacteriana paenibacilus polymyxa schc33, agente de control biologico para hongos fitopatogenos tales como botrytis cinerea y uso para combatir tales hongos en frutas, hortalizas o plantas ornamentales, en condiciones de pre- post cosecha.
AU2015317724B2 (en) * 2014-09-17 2019-10-24 Basf Corporation Compositions comprising recombinant Bacillus cells and an insecticide
JP6916737B2 (ja) * 2015-03-26 2021-08-11 バイエル クロップサイエンス エルピーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｐ 新規なパエニバチルス（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株、抗真菌化合物、およびそれらの使用のための方法
AU2019269315A1 (en) * 2018-05-14 2020-12-10 Bayer Cropscience Lp Mutants of paenibacillus and methods for their use

Also Published As

Publication number Publication date
HUE056482T2 (hu) 2022-02-28
CL2017002425A1 (es) 2018-05-11
BR112017020604A2 (pt) 2018-07-17
PT3274443T (pt) 2020-07-08
EP3594225A1 (en) 2020-01-15
PH12017501757A1 (en) 2018-04-23
JP2021169507A (ja) 2021-10-28
US20200054023A1 (en) 2020-02-20
EP3838914A1 (en) 2021-06-23
US10499656B2 (en) 2019-12-10
JP6916737B2 (ja) 2021-08-11
PE20221728A1 (es) 2022-11-04
PT3594225T (pt) 2021-12-07
PL3274443T3 (pl) 2020-09-21
JP2023153947A (ja) 2023-10-18
NZ735632A (en) 2021-05-28
CL2019001810A1 (es) 2019-11-29
RU2021135364A (ru) 2021-12-28
AU2022203326A1 (en) 2022-06-09
JP7369741B2 (ja) 2023-10-26
US20230234988A1 (en) 2023-07-27
US9883676B2 (en) 2018-02-06
US11623944B2 (en) 2023-04-11
PE20181360A1 (es) 2018-08-22
US20190069557A1 (en) 2019-03-07
ES2804732T3 (es) 2021-02-09
AU2016235208A1 (en) 2017-10-19
BR122021017017B1 (pt) 2022-11-29
JP2018517396A (ja) 2018-07-05
CN107995925A (zh) 2018-05-04
CO2017009663A2 (es) 2017-12-15
CN107995925B (zh) 2022-04-29
BR112017020604B1 (pt) 2022-09-27
CN114292799A (zh) 2022-04-08
US20180146682A1 (en) 2018-05-31
BR122021017006B1 (pt) 2022-11-16
WO2016154297A1 (en) 2016-09-29
US10159257B2 (en) 2018-12-25
BR122021017060B1 (pt) 2022-12-06
US20160278388A1 (en) 2016-09-29
RU2017135499A (ru) 2019-04-26
RU2017135499A3 (uk) 2020-01-27
KR20240015158A (ko) 2024-02-02
MX2017012305A (es) 2018-01-18
EP3594225B1 (en) 2021-09-15
AU2016235208B2 (en) 2022-06-09
CA2980723A1 (en) 2016-09-29
HUE049475T2 (hu) 2020-09-28
MX2021011119A (es) 2021-10-13
EP3274443A1 (en) 2018-01-31
KR102629565B1 (ko) 2024-01-29
EP3274443B1 (en) 2020-04-22
ES2900458T3 (es) 2022-03-17
KR20170129921A (ko) 2017-11-27
PL3594225T3 (pl) 2022-01-31
CL2018002899A1 (es) 2019-02-01
RU2763542C2 (ru) 2021-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120642C2 (uk) Новий штам paenibacillus, протигрибкові сполуки та способи їх застосування
KR102179224B1 (ko) 재조합 바실루스 세포 및 또 다른 생물학적 방제제를 포함하는 조성물
JP6758296B2 (ja) 植物の成長に利益をもたらす及び植物病害を治療するための微生物組成物
JP2018508472A (ja) バチルス・アミロリケファシエンス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ｒｔｉ４７２組成物および植物成長に利益を与えかつ植物病害を処置するための使用方法
TW201639462A (zh) 有益於植物生長及治療植物疾病之解澱粉芽孢桿菌ｒｔｉ３０１組合物及使用方法
JP2021522833A (ja) パエニバシラスの突然変異体およびその使用方法
TW201138632A (en) Active compound combinations
US10477865B2 (en) Fungicidal compounds and methods of their use
JP2022502404A (ja) 細菌の生物学的防除剤と脂肪酸の併用
CN113766833A (zh) 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株及其使用方法
UA128423C2 (uk) Застосування клітинного екстракту мікроскопічної водорості виду amphidinium carterae для його фунгіцидної активності відносно грибів та/або ооміцетів рослин і насіння культур
US20190075801A1 (en) Synergy-based biocontrol of plant pathogens
JP2021524479A (ja) 菌類病原体を予防及び防除するための殺真菌剤
JP2017501742A (ja) 寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、および、植物を保護する、または植物を処理する方法
KR102670172B1 (ko) 트리코더마 롱기브라키아툼 균주로부터 유래된 살균 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법
Nguyen et al. Exploration of a multifunctional biocontrol agent Streptomyces sp. JCK-8055 for the management of apple fire blight
Lavado Tolardo et al. Biological control: isolated and in mixtures and genetic control of Meloidogyne exigua in coffee.
Tolardo et al. Biological control: isolated and in mixtures and genetic control of Meloidogyne exigua in coffee
TW201740808A (zh) 解澱粉芽孢桿菌ｒｔｉ４７２組合物及其於使植物生長獲益及治療植物疾病之使用方法
Jang et al. Selection of fungicides for control of apple bitter rot based on the ecology of the disease
Park et al. Degree of Incidences, Resistance of cultivars and Chemical control of White rust on Chrysanthemum