CN109136132B - 一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7及其培养方法和应用 - Google Patents

一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ‑B7及其培养方法和应用，属于猕猴桃溃疡病防治技术领域。本发明提供的假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ‑B7能够有效防治猕猴桃溃疡病，防效高达79.53％，且在防治猕猴桃溃疡病上表现出一定防止重复感病性。

Description

一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及猕猴桃溃疡病防治技术领域，具体涉及一株假单胞菌Pseudomonassp.KXJ-B7及其培养方法和应用。
背景技术
猕猴桃溃疡病是一种毁灭性细菌病害，目前尚无特异性防治药物。病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae)。该病主要危害猕猴桃的主干、枝蔓、新梢和叶片，一般造成枝蔓枯死，发病严重时，植株整株枯死，不同植株间感染速度快，疫情发展快，严重情况下很容易绝收。目前用于防治的手段主要为利用春雷霉素，铜制剂，梧宁霉素等化学防治手段，但防治效果无长效性，病原重复感染率较高，且频繁使用化学制剂已使病原菌产生一定的耐药性。目前利用颉颃菌进行生物防治的方法被认为是最长效的防治方法，目前利用颉颃菌进行防治的方法仍处于研究开发阶段，已发现的颉颃菌局限于芽孢杆菌属与放线杆菌属，并不表现降低重复感染率的效果，易受环境的影响，使防治效果降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7及其培养方法和应用。本发明提供的假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7能够有效防治猕猴桃溃疡病。
本发明提供了一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7，所述假单胞菌Pseudomonassp.KXJ-B7的保藏编号为CCTCCNO：M2018261。
本发明还提供了上述技术方案所述假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的培养方法，包括以下步骤：
1)将假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7接种于LB液体培养基中，扩大培养至假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的浓度至少为1×108CFU/mL，得到种子液；
2)将步骤1)得到的种子液接种于发酵培养基中，发酵培养22～26h；所述发酵培养基包括质量体积比为0.5～5％的蔗糖、0.5～3％的蛋白胨和0.05～0.5％的磷酸氢二钾。
优选的是，步骤1)所述扩大培养的温度为18～26℃，转速为100～250rpm。
优选的是，步骤1)所述扩大培养的时间为14～18h。
优选的是，步骤2)所述发酵培养的温度为18～26℃，转速为100～250rpm。
优选的是，所述发酵培养后，还包括离心取沉淀的过程。
优选的是，所述离心的条件为：6000～12000rpm离心5～40min。
本发明还提供了上述技术方案所述假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7或上述技术方案所述培养方法得到的假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7作为生物农药添加剂的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7或上述技术方案所述培养方法得到的假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7作为防治猕猴桃溃疡病菌剂的应用。
优选的是，所述菌剂中假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的浓度为1×108～1×109CFU/mL。
本发明提供了一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7。本发明提供的假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7能够有效防治猕猴桃溃疡病，对猕猴桃溃疡病的防治率为79.53％，与常用化学防治用药效果相当，且使用假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7菌剂较使用化学农药对降低猕猴桃溃疡病重复感病率更有效，本发明菌株在防治猕猴桃溃疡病上表现出一定防止重复感病性。
具体实施方式
本发明提供了一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7，所述假单胞菌Pseudomonassp.KXJ-B7的保藏编号为CCTCC NO：M 2018261。本菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏时间2018年5月10日。
本发明还提供了上述技术方案所述假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的培养方法，包括以下步骤：
1)将假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7接种于LB液体培养基中，扩大培养至假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的浓度至少为1×108CFU/mL，得到种子液；
2)将步骤1)得到的种子液接种于发酵培养基中，发酵培养22～26h；所述发酵培养基包括质量体积比为0.5～5％的蔗糖、0.5～3％的蛋白胨和0.05～0.5％的磷酸氢二钾。
本发明将假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7接种于LB液体培养基中，扩大培养至假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的浓度至少为1×108CFU/mL，得到种子液。在本发明中，所述扩大培养的温度为18～26℃，更优选为24℃，转速为100～250rpm，更优选为180rpm。在本发明中，所述扩大培养的时间优选为14～18h，更优选为16h。
得到种子液后，本发明将种子液接种于发酵培养基中，发酵培养22～26h；所述发酵培养基包括质量体积比为0.5～5％的蔗糖、0.5～3％的蛋白胨和0.05～0.5％的磷酸氢二钾。在本发明中，所述发酵培养基优选包括质量体积比为1％的蔗糖、1％的蛋白胨和0.2％的磷酸氢二钾。在本发明中，种子液的接种量优选为0.2％。本发明所述发酵培养基中蔗糖的添加能够显著提高假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的颉颃活性。在本发明中，所述蛋白胨为假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7扩大培养所需的有机氮源，磷酸氢二钾能够提高假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的扩繁速率和提高假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的颉颃活性。在本发明中，所述发酵培养的温度为18～26℃，更优选为24℃，转速为100～250rpm，更优选为140rpm。在本发明中，所述发酵培养后，优选还包括离心取沉淀的过程。在本发明中，所述离心的条件为：6000～12000rpm离心5～40min，更优选10000rpm离心10min。本发明得到的菌体优选制备成菌剂，所述菌剂的溶剂优选包括水。
本发明还提供了上述技术方案所述假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7或上述技术方案所述培养方法得到的假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7作为生物农药添加剂的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7或上述技术方案所述培养方法得到的假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7作为防治猕猴桃溃疡病菌剂的应用。在本发明中，所述菌剂中假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的浓度优选为1×108～1×109CFU/mL。在本发明中，所述菌剂优选为水剂。在本发明中，所述菌剂的使用方法优选为：以水剂形式对植株表面进行喷淋或涂抹以及灌根处理。
下面结合具体实施例对本发明所述的一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7及其培养方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1分离方法
假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7(CCTCC NO.M 2018261)由湖南省凤凰县野生猕猴桃科植株内分离到。分离方法如下：将叶组织切成1cm的小片，用1％的次氯酸钠浸泡5min，70％酒精浸泡1～2min，无菌水清洗3次(取最后一次清洗的溶液100μl涂于LB固体培养基上培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌)。取3g消毒好的样品置于菌研钵中，加入27mL无菌的0.85％NaCl，研磨，用无菌的0.85％NaCl梯度稀释。取10-1、10-2、10-3三个梯度的稀释液各100μl涂于LB固体培养基上，24℃培养24h。挑取最大的单菌落接种到新鲜LB固体培养基，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用30％甘油保藏。
2筛选方法
将收集得到的单菌落依次与猕猴桃致病菌纯培养在加入蔗糖1％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.15％的固体培养基中做对峙生长试验，以产生的透明圈直径大小作为依据，选取优势菌落作为目标菌，即假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7。
Pseudomonas sp.KXJ-B7鉴定方法
将Pseudomonas sp.KXJ-B7在LB培养基中24℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16SrRNA基因扩增通用引物27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO.2)，1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO.3)从基因组DNA中扩增出16S rRNA基因片段。PCR产物送华大基因生物工程有限公司进行测序。通过对测定16S rRNA基因序列进行同源性比较，将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.KXJ-B7)
16sDNA序列如SEQ ID NO.1所示：
GCCTACAATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCCGAATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTCTCGAAAGGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTACCACGATGAT。
将假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7进行比对，比对结果如表1所示。
表1假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B716sDNA序列比对结果
菌株 最相似菌株 相似度(％)
Pseudomonassp.KXJ-B7 Pseudomonassp.BM-2 99
实施例2
假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7颉颃猕猴桃细菌性溃疡病病原菌(丁香假单胞菌猕猴桃致病变种)的培养条件实验
分别用甘油1％，蔗糖1％，无水硫酸镁0.15％，磷酸氢二钾0.15％，分别添加于LB培养基中与丁香假单胞菌猕猴桃致病变种共培养24h后观察抑菌圈大小，分别做3组平行实验，结果如表2所示：
表2不同培养条件下抑菌圈大小
培养基 LB+1％甘油 LB+1％蔗糖 LB+0.15％磷酸氢二钾 LB+0.15％硫酸镁
抑菌圈大小均值(cm) 0 1.94 1.21 0.5
不同培养条件下的颉颃效果与培养条件不同所引起的细菌代谢变化相关。试验表明假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的颉颃活性的高低是可以通过代谢调控实现，蔗糖作为主要碳源的培养条件下，可显著提高假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7的对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的颉颃活性，区别于其它生防菌。
实施例3
假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7对不同细菌的颉颃活性检测
检测结果如表3所示：
表3假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7对不同细菌的颉颃活性检测
Figure BDA0001778165860000061
Figure BDA0001778165860000071
根据表3能够得出：假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7不具有广谱抑菌性，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的体现出专一的颉颃活性，而对一般微生物菌群无颉颃性。因此其对土壤及植株原生菌群结构无较大影响，有利于应用。
将假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B715h培养物1mL(浓度约为1*107CFU/mL)与猕猴桃溃疡病病原菌(丁香假单胞菌猕猴桃致病变种)1mL(浓度约为1*108CFU/mL)24h培养物同时接种于50mL新鲜LB液体培养基，共培养48小时后，对培养基中所含细菌种类进行检测，结果显示LB培养基中只含有假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7，无丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。表明假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7能有效抑制丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的繁殖。
实施例4
温室测定Pseudomonas sp.KXJ-B7菌剂对猕猴桃溃疡病的防效试验
采用两年生健康的红阳实生苗，每组30株，每株猕猴桃接种部位3个，重复三次。各组处理如表4所示：
表4不同组处理结果
Figure BDA0001778165860000072
Figure BDA0001778165860000081
上述各组经处理后，均进入常规管理，接种30d后测量病斑直径，并计算病情指数，发病率和防治效果。
猕猴桃溃疡病分级标准如表5所示，
表5猕猴桃溃疡病分级标准
级别 代表值 发病枝条比例或病斑横径占树径周长比例(X)
1 0 0
2 1 X≤1/3
3 2 1/3≤X≤2/3
4 3 2/3≤X≤4/5
5 4 死亡
发病率(％)＝发病株数/总株数*100％；
防治效果(％)＝(对照病指-处理病指)*100/处理病指
病情指数＝[∑(病级病株数*代表级值)/(调查总株数*发病最高级代表值)]*100
温室试验测定各处理组对猕猴桃溃疡病的防效(相同处理平行组间无显著差异，结果如表6所示)：在生防菌剂Pseudomonas sp.KXJ-B7第1次处理30d后的调查结果显示，生防菌剂Pseudomonas sp.KXJ-B7对猕猴桃溃疡病的生物防治效果(以下简称防效)达到79.53％。结果表明生防菌剂Pseudomonas sp.KXJ-B7对丁香假单胞菌属猕猴桃致病变种的防治效果是有效的。菌剂防治效果79.53％与较高浓度的噻霉酮对丁香假单胞菌属猕猴桃致病变种的防治效果85.71％接近，且两种处理在植株出现的发病率上差异并不大。生防菌剂Pseudomonas sp.KXJ-B7对猕猴桃溃疡病的生物防治效果显著。
表6各处理组对猕猴桃溃疡病的防效结果
处理 病情指数 发病率(％) 防治效果
阳性组 58.33±1.38 88±2.31 -
试验组1 11.94±1.10 18.88±1.11 79.53
实验组2 8.33±1.12 16.67±2.23 85.71
阴性组 0 0 -
温室测定KXJ-B7菌剂对猕猴桃溃疡病感染的防治的长效性实验
将所述经处理后的试验组1与实验组2植株中未感染溃疡病的植株分别随机选取30株，进入常规管理40d后，分别在原烫伤韧皮部位划道(伤口深度约为0.5cm)，原位喷雾接种丁香假单胞菌属猕猴桃致病变种菌液2mL(浓度约为1*107CFU/mL)，每株猕猴桃接种部位3个，伤口保湿120h后均进入常规管理，接种30d后测量病斑直径，并计算病情指数，发病率和防治效果，结果如表7所示。
表7接种30d后的防效结果
处理 病情指数 发病率(％)
阳性组 62.5 83.33
试验组1 18.33 35.56
实验组2 47.22 77.77
根据表7可以得出：经过接种生防菌剂Pseudomonas sp.KXJ-B7的猕猴桃植株较喷淋药物处理后的猕猴桃植株具有更高的防止二次感染的概率。以上两种处理方式得到的植株表现出的二次发病率出现显著的差异性——经过菌剂处理后再次接种病原菌的试验组1出现的发病率35.56％，远低于经化学药物处理后再次接种病原菌的实验组2所出现的发病率77.77％，且试验组1的二次病情指数(18.33％，略高于初始值11.94％)远小于实验组2的二次病情指数(47.22％，远高于初始值8.33％)——表明接种生防菌剂Pseudomonassp.KXJ-B7具有一定防止重复感病性(或表述为防治长效性)，而化学药物(噻霉酮)不具有此作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 田璨熙
<120> 一株假单胞菌Pseudomonas sp.KXJ-B7及其培养方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctacaatg caagtcgagc ggatgacggg agcttgctcc cgaattcagc ggcggacggg 60
tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggacaac gtctcgaaag ggacgctaat 120
accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc 180
ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg 240
tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca 300
gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag 360
aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaaat taatactttg 420
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tacagagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggtttgt 540
taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg cattcaaaac tgacaagcta 600
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gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt 780
tgggagcctt gagctcttag tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac 840
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<212> DNA
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tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)KXJ-B7，其特征在于，所述假单胞菌KXJ-B7的保藏编号为CCTCCNO：M 2018261。
2.权利要求1所述假单胞菌KXJ-B7的培养方法，包括以下步骤：
1)将假单胞菌KXJ-B7接种于LB液体培养基中，扩大培养至假单胞菌KXJ-B7的浓度至少为1×108CFU/mL，得到种子液；
2)将步骤1)得到的种子液接种于发酵培养基中，发酵培养22～26h；所述发酵培养基包括质量体积比为0.5～5％的蔗糖、0.5～3％的蛋白胨和0.05～0.5％的磷酸氢二钾。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤1)所述扩大培养的温度为18～26℃，转速为100～250rpm。
4.根据权利要求2或3所述的培养方法，其特征在于，步骤1)所述扩大培养的时间为14～18h。
5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养的温度为18～26℃，转速为100～250rpm。
6.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养后，还包括离心取沉淀的过程。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述离心的条件为：6000～12000rpm离心5～40min。
8.权利要求1所述假单胞菌KXJ-B7或权利要求2～7任一项所述培养方法得到的假单胞菌KXJ-B7作为生物农药添加剂的应用。
9.权利要求1所述假单胞菌KXJ-B7或权利要求2～7任一项所述培养方法得到的假单胞菌KXJ-B7作为防治猕猴桃溃疡病菌剂的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述菌剂中假单胞菌KXJ-B7的浓度为1×108～1×109CFU/mL。
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