ES2311731T3 - Proteinas de accion pesticida y polinucleotidos que se pueden obtener a partir de especies de paenibacillus. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de selección de un cultivo de aislamiento de Paenibacillus para un gen que codifica una proteína seleccionada entre el grupo constituido por una proteína de complejo de toxina, en el que dicho procedimiento comprende al menos una de las siguientes etapas: (a) obtener ADN a partir de dicho cultivo y ensayar dicho ADN para evaluar la presencia de dicho gen; y (b) obtener proteína producida por dicho cultivo y ensayar dicha proteína para evaluar la presencia de una proteína que indica la presencia de una proteína que indica la presencia de dicho gen en dicho aislamiento, y al menos una de las siguientes etapas: (c) realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con al menos un cebador que se hibrida en condiciones de PCR con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41, (d) inmunorreacción de un anticuerpo con dicha proteína en la que dicho anticuerpo se une a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41, e (e) hibridar una sonda de ácido nucleico con dicho ADN en el que dicha sonda se hibrida en condiciones de rigurosidad moderada a alta con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41.
Description
Proteínas de acción pesticida y polinucleótidos
que se pueden obtener a partir de especies de
Paenibacillus.
Esta solicitud reivindica prioridad a la
solicitud provisional Nº de serie 60/392.633, presentada el 28 de
junio de 2002, y a la solicitud provisional Nº de serie 60/441.647,
presentada el 21 de enero de 2003.
Los insectos y plagas cuestan a los granjeros
miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de cosechas y
en gasto de mantenimiento de estas plagas bajo control. Las pérdidas
provocadas por plagas de insectos en ambientes de producción
agrícola incluyen disminuciones en el rendimiento de las cosechas,
reducción en la calidad de la cosecha, y aumento de los costes de
la recolección. Las plagas de insectos también son una carga para
los cultivadores de hortalizas y frutos, a los productores de flores
ornamentales y a los jardineros del hogar y a los dueños de la
casa.
Los procedimientos de cultivo, tal como una
rotación de cosechas y la aplicación de altos niveles de
fertilizadores de nitrógeno, han dirigido parcialmente los
problemas provocados por las plagas agrícolas. Sin embargo, las
demandas económicas de la utilización de la tierra cultivada
restringen el uso de la rotación de cosechas. Además, las
características de hibernación de algunos insectos desbaratan las
rotaciones de las cosechas en algunas áreas.
De este modo, los insecticidas químicos
sintéticos confían en la mayor medida en lograr un nivel suficiente
de control. Sin embargo, el uso de insecticidas químicos sintéticos
puede tener varios inconvenientes. Por ejemplo, el uso de algunos
de estos compuestos químicos puede afectar de manera adversa a los
insectos beneficiosos. Los insectos diana también han desarrollado
resistencia a algunos pesticidas químicos. Esto se ha aliviado
parcialmente mediante diversas estrategias de dirección a la
resistencia, pero existe una creciente necesidad de agentes
alternativos de control de plagas. Además, grandes poblaciones de
gorgojos, abundantes lluvias, y calibración impropia de equipo de
aplicación de insecticida puede dar como resultado un escaso
control. El uso inapropiado de insecticidas alcanza asuntos
ambientales tales como la contaminación d suelo y de tanto los
suministros de agua superficial como subterráneos. Los residuos
también pueden permanecer en los frutos tratados, hortalizas y
otras plantas tratadas. El trabajo con algunos insecticidas también
puede plantear riesgos para las personas que los aplican. Por lo
tanto, los insecticidas químicos sintéticos se están examinando de
manera creciente por sus consecuencias ambientales potencialmente
tóxicas. Las nuevas restricciones rigurosas en el uso de pesticidas
y la eliminación de algunos pesticidas eficaces del mercado pueden
limitar las opciones económicas y eficaces para el control de las
plagas dañinas y costosas.
Debido a los problemas asociados al uso de
pesticidas químicos sintéticos, existe una evidente necesidad de
limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar
agentes de control alternativos. El reemplazo de pesticidas
químicos sintéticos, o las combinaciones de estos agentes con
pesticidas biológicos, puede reducir los niveles de compuestos
químicos tóxicos en el ambiente.
Algunos agentes pesticidas biológicos que ahora
se están usando con algo de éxito se derivan de microbios del suelo
Bacillus thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo
Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria
Gram-positiva, formadora de esporas. La mayoría de
las cepas de B.t. no muestran actividad pesticida. Algunas
cepas de B.t. producen, y se pueden caracterizar mediante,
inclusiones de proteína cristalina parasporal. Estas inclusiones a
menudo aparecen de manera microscópica como cristales configurados
de manera característica. Algunas proteínas de B.t. son
altamente tóxicas par alas plagas, tales como insectos, y son
específicos en su actividad tóxica. Ciertas proteínas de
B.t. están asociadas a las inclusiones. Estas
"\delta-endotoxinas" son diferentes de las
exotoxinas, que tienen una gama de huésped no específica. Otras
especies de Bacillus también producen proteínas
pesticidas.
Ciertos genes de la toxina de Bacillus se
han aislado y secuenciado, y los productos a base de ADN
recombinante se han producido y aprobado para uso. Además, con el
uso de técnicas de ingeniería genética, se están perfeccionando
diversos planteamientos para administrar estas toxinas a ambientes
agrícolas. Éstos incluyen el uso de plantas modificadas por
ingeniería genética con genes de toxinas para resistencia a insectos
y el uso de células microbianas intactas estabilizadas como
vehículos de distribución de toxinas. De este modo, los genes de
toxina aislados de Bacillus llegan a ser valiosos desde el
punto de vista comercial.
El uso comercial de los pesticidas de
B.t. estaba inicialmente restringido a la dirección de un
intervalo estrecho de plagas de lepidópteros (oruga). Las
preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis
subespecie kurstaki se han usado durante muchos años como
insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo,
B. thuringiensis var. kurstaki HD-1
produce una \delta-
\hbox{endotoxina que es tóxica para las larvas de numerosos insectos de lepidópteros.}
Más recientemente, se han identificado nuevas
subespecies de B.t., y se han aislado los genes responsables
de las proteínas activas de \delta-endotoxina.
Höfte y Whiteley clasificaron los genes de la proteína cristalina
de B.t. en cuatro clases principales (Höfte, H., H.R.
Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52 (2): 242 - 255). Las
clases eran CryI (específica de Lepidoptera), CryII
(específica de Lepidoptera y Diptera), CryIII (específica de
Coleópteros), y CryIV (específica de Diptera). Se ha reseñado
el descubrimiento de cepas específicamente toxicas para otras
plagas. Por ejemplo, CryV y CryVI se propusieron para
designar una clase de genes de toxina que son específicas de
nematodos.
Las proteínas cristalinas CryI
específicas de lepidópteros, en su estado natural, proteínas de
aproximadamente 130 a 140 kDa, que se acumulan en las inclusiones
cristalinas bipiramidales durante la esporulación de B.
thuringiensis. Estas proteínas son protoxinas que se solubilizan
en ambiente alcalino del intestino medio de insectos y se
convierten de manera proteolítica mediante proteasas asociadas a
cristal o del intestino medio de larvas en un fragmento del núcleo
tóxico de 60 a 70 kDa. Esta activación también se puede llevar a
cabo in vitro con una diversidad de proteasas. El dominio
tóxico se localiza en la mitad N-terminal de la
protoxina. Esto se demostró para las proteínas
CryIA(b) y CryIC mediante la secuenciación de
aminoácidos N- terminal de la toxina activada por tripsina. Höfte
et al. 1989. La escisión se produce en el extreme
C-terminal de una región conservada llamada
"Bloque 5", que forma de esta manera el extremo C de la toxina
del núcleo. Un segmento corto de protoxina N - terminal también se
puede procesar fuera. El sitio de la escisión
N-terminal está también altamente conservado para
las proteínas CryIA y CryID, que sugiere que estas
proteínas, el extremo N del fragmento tóxico se localiza en la misma
posición. Sin embargo, CryIB, es diferente de las otras
proteínas de CryI en esta región. Se ha sabido si esta
proteína también se procesa en el extremo N. Höfte et al.
1989.
El análisis de supresión de varios genes
cryI confirmó además que la mitad 3' de la protoxina no se
requiere para la actividad tóxica. Uno de los fragmentos reseñados
más cortos se localizó entre los codones 29 y 607 para
CryIAb. Además la retirada de cuatro codones del extremo 3' u
ocho codones de codones del extremo 5' completamente suprimían la
actividad tóxica del producto génico. Se realizaron observaciones
similares para los genes cryIA(a) y
cryLA(c). Höfte et al. 1989.
Los genes cryII codifican las proteínas
de 65 kDa que forman inclusiones en forma de cubo en cepas de
varias subespecies. Estas proteínas cristalinas se designaron
previamente proteínas "P2", como opuestas a las proteínas
cristalinas de 130 kDa P1 presentes en las mismas cepas. Höfte et
al. 1989.
Un gen A cryILA se clonó a partir de
B. thuringiensis subsp. kurstaki HD- 263 y se expresó
en Bacillus megaterium. Las células que producen la proteína
CryIIA eran tóxicas para las especies de lepidópteros
Heliothis virescens y Lymantria dispar así como para
las larvas de los dípteros Aedes aegypti. Widner y Whitely
(1989, J. Bacteriol. 171:965 - 974) dos genes clonados relacionados
(cryIIA y cryIIB) de B. thuringgiensis subsp.
kurstaki HD-1. Ambos genes codifican las
proteínas de 633 aminoácidos con una masa molecular predicha de 71
kDa (ligeramente mayor que la masa molecular aparente determinada
para las proteínas P2 producidas en B. thuringieiensis).
Aunque las proteínas CryIIA y CryIIB son altamente
homólogas (\sim 87% de identidad de aminoácidos), difieren en el
espectro insecticida. CryIIA is es activa tanto contra una
especie de lepidópteros (Manduca sexta) como una de dípteros
(Aedes aegypti), mientras cryIIB es tóxica solamente
para los insectos lepidópteros. Höfte et al. 1989. Las
toxinas CryII, como grupo, tienden a ser relativamente más
conservadas a nivel de secuencias (> 80% de identidad) que otros
grupos. Por el contrario, existen muchas toxinas CryI, por
ejemplo, incluyendo algunas que son menos de 60% idénticas.
El esquema de nomenclatura y clasificación de
1989 de Höfte y Whiteley para las proteínas cristalinas se basaba
en tanto la secuencia de aminoácidos deducida como la gama de
huésped de la toxina. Ese sistema se adaptó para cubrir 14 tipos
diferentes de genes de toxinas que se dividieron en cinco clases
principales. El esquema de nomenclatura de 1989 llegó a no poderse
utilizar ya que se descubrieron más y más genes que codificaban
proteínas con espectros variables de actividad pesticida. De este
modo, se adoptó un esquema de nomenclatura revisado, que se basa
solamente en la identidad de aminoácidos (Crickmore et al.,
1998, Microbiology y Molecular Biology Reviews 62: 807 - 813). El
código mnemotécnico "cry" se ha mantenido para todos los
genes de toxinas excepto cytA y cytB, que mantiene una clase
separada. Se han cambiado los números romanos por números árabes en
la categoría primaria, y y se han eliminado los paréntesis en la
categoría terciaria. Muchos de los nombres originales se han
mantenido, con las excepciones indicadas, aunque se han vuelto a
clasificar numerosas. Existen ahora al menos 37 clases primarias de
proteínas Cry, y y dos clases primarias de toxinas
cyt. Otros tipos de toxinas, tales como las de los
documentos WO 98/18932 y WO 97/40162, se han descubierto a partir
de B. thuringiensis.
Existen algunos obstáculos para el uso exitoso
agrícola de proteínas pesticidas de Bacillus (y otras
especies biológicas). Ciertos insectos pueden ser refractarios a
las toxinas de Bacillus. Los insectos tales como los grillos
de la cápsula del algodonero, gusano negro, y Helicoverpa
zea, así como insectos adultos de la mayoría de las especies,
no han demostrado hasta ahora ninguna sensibilidad significativa a
muchas \delta-endotoxinas de B.t.
Otro obstáculo potencial es el desarrollo de
resistencia a toxinas de B.t. por los insectos. Las toxinas
de proteínas de B.t. se formularon inicialmente como agentes
de control de insectos pulverizables. Una aplicación más reciente
de la tecnología de B.t. ha sido aislar y transformar
plantas con genes que codifican estas toxinas. Las plantas
transgénicas posteriormente producen estas toxinas, proporcionando
por lo tanto control de insectos. Véase Las patentes de
Estados Unidos números 5,380,831; 5,567,600; y 5,567,862 de Mycogen
Corporation. Las plantas de B.t. transgénicas son
completamente eficaces, y se predice que el uso sea alto en algunos
cultivos y áreas. Esto ha provocado que pueda surgir algún interés
en los asuntos de manejo de resistencia más rápidamente que con las
aplicaciones pulverizables. Aunque numerosos insectos se han
seleccionado para la resistencia a toxinas de B.t. en el
laboratorio, solamente la polilla de dorso diamante (Plutella
xylostella) ha demostrado resistencia en un campo establecido
(Ferre, J. y Van Rie, J., Annu. Rev. Entomol. 47: 501 - 533,
2002).
Las estrategias de manejo de resistencia en la
tecnología de plantas transgénicas en B.t. han llegado
a ser de gran interés (por ejemplo, como en una bacteria natural,
se pueden exponer en la misma planta diversas toxinas múltiples,
reduciendo por lo tanto en gran medida la posibilidad de que un
insecto que podría ser resistente a una toxina sobreviviera para
ampliar la resistencia). Se han sugerido diversas estrategias para
conservar la capacidad de usar de manera eficaz toxinas de B.
thuringiensis. Estas estrategias incluyen alta dosis con
protección, y alternando con, o despliegue conjunto de, diferentes
toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance
Management", Nature Biotechnol 16: 144 - 146).
De este modo, existe una gran necesidad de
desarrollar genes adicionales que se pueden expresar en plantas con
el fin de controlar de manera eficaz diversos insectos. Además de
intentar continuamente descubrir nuevas toxinas de B.t.,
sería completamente deseable descubrir otras fuentes bacterianas
(distintas de B.t.) que producen toxinas que se podrían usar
en estrategias de plantas transgénicas, o que se podrían combinar
con B.t.s para producir plantas transgénicas que
controlan insectos.
Los esfuerzos recientes para clonar genes de
toxinas insecticidas a partir del grupo de bacterias
Photorhabdus/Xenorhabdus presentan potenciales
alternativas a las toxinas derivadas de B. thuringiensis. Se
ha sabido en la técnica que las bacterias del género
Xenorhabdus están asociadas de manera simbiótica con el
nematodo Steinernema. Desafortunadamente, como se indica en
numerosos artículos, las bacterias solamente tienen actividad
pesticida cuando se inyectan en larvas de insecto y no mostraron
actividad biológica cuando se administran por vía oral.
Ha sido difícil explotar de manera eficaz las
propiedades insecticidas del nematodo su bacteria simbiótica. De
este modo, sería totalmente deseable descubrir agentes proteináceos
de las bacterias Xenorhabdus que tienen actividad oral se
manera que los productos producidos a partir de ellos se podrían
formular en forma de un insecticida pulverizable, o los genes
bacterianos que codifican dichos agentes proteináceos se pueden
aislar y usar en la producción de plantas transgénicas. El documento
WO 95/00647 se refiere al uso de la toxina proteica de
Xenorhabdus para controlar insectos, pero no reconoce toxinas
activas por vía oral. El documento WO 98/08388 se refiere a agentes
pesticidas administrados por vía oral de Xenorhabdus. La
patente de Estados Unidos Nº 6.048.838 se refiere a complejos
toxinas proteicas/toxina, que tienen actividad oral, que se puede
obtener a partir de especies y cepas de Xenorhabdus.
Photorhabdus y Xenorhabdus spp. Son
bacterias Gram negativas que de manera entomopatogénica y simbiótica
están asociadas a nematodos del suelo. Estas bacterias se
encuentran en el intestino de nematodos entomopatogénica que
invaden y matan insectos. Cuando el nematodo invade un huésped
insecto, las bacterias se liberan en el hemocoel de insectos (el
sistema circulatorio abierto), y tanto las bacterias como los
nematodos sometidos a múltiples rondas de replicación; el huésped
insecto típicamente muere. Estas bacterias se pueden cultivar fuera
de los huéspedes nematodos. Para una descripción más detallada de
estas bacterias, véase Forst y Nealson, 60 Microbiol. Rev. 1
(1996), p. 21 - 43.
El género Xenorhabdus se define de manera
taxonómica como un miembro de la familia Enterobacteriaceae,
aunque tiene ciertos caracteres atípicos de esta familia. Por
ejemplo, cepas de este género son típicamente negativas a la
reducción de nitratos y catalasa negativas. Xenorhabdus se ha
subdividido solamente recientemente para crear un Segundo género,
Photorhabdus, que comprende especies individuales
Photorhabdus luminescens (previamente Xenorhabdus
luminescens) (Boemare et al., 1993 Int. J. Syst.
Bacteriol. 43, 249-255). Esta diferenciación se
basa en varias características distintivas que se identifican
fácilmente por los expertos en la técnica. Estas diferencias
incluyen las siguientes: estudios de caracterización de
ADN-ADN; presencia (Photorhabdus) o ausencia
fenotípica (Xenorhabdus) de actividad catalítica; presencia
(Photorhabdus) o ausencia (Xenorhabdus) de
bioluminescencia; la Familia del huésped nematodo en la que
Xenorhabdus se encuentra en Steinernematidae y
Photorhabdus la pase encuentra en Heterorhabditidae);
así como en comparación, análisis de ácidos grasos celulares
(Janse et al. 1990, Lett. Appl. Microbiol. 10, 131 - 135;
Suzuki et al. 1990, J. Gen. Appl. Microbiol., 36, 393 - 401).
Además, recientes estudios moleculares centralizados en análisis de
secuencia (Rainey et al. 1995, Int. J. Syst. Bacteriol., 45,
379 - 381) y de restricción (Brunel et al., 1997, App.
Environ. Micro., 63, 574 - 580) de los genes de 16S rRNA también
apoyan la separación de estos dos géneros.
Los caracteres esperados para Xenorhabdus
son los siguientes: bastones Gram negativos, colonia de pigmentación
amarilla/parda, presencia de cuerpos de inclusión, ausencia de
catalasa, incapacidad de reducir nitratos, ausencia de
bioluminiscencia, capacidad de aceptar tintes del medio, hidrólisis
por gelatina positiva, crecimiento en medios selectivos de
Enterobacteriaceae, crecimiento por debajo de una temperatura
de 37ºC, supervivencia en condiciones anaeróbicas, y motilidad.
Actualmente, el género bacteriano
Xenorhabdus comprende cuatro especies reconocidas,
Xenorhabdus nematophilus, Xenorhabdus poinarii,
Xenorhabdus bovienii y Xenorhabdus beddingii (Brunel et
al., 1997, App. Environ. Micro., 63, 574 - 580). Se han
descrito una diversidad de cepas relacionadas en la bibliografía
(por ejemplo, Akhurst y Boemare 1988 J. Gen. Microbiol.,
134, 1835 - 1845; Boemare et al. 1993 Int. J. Syst.
Bacteriol. 43, p. 249 - 255; Putz et al. 1990, Appl.
Environ. Microbiol., 56, 181 - 186, Brunel et al.,1997,App.
Environ. Micro., 63, 574 -5 80, Rainey et al. 1995, Int. J.
Syst. Bacteriol., 45, 379- 381).
Las bacterias Xenorhabdus y Photorhabdus
secretan una amplia diversidad de substancias en el medio de
cultivo; estas secreciones incluyen lipasas, proteasa, antibióticos
y lipopolisacáridos. La purificación de diferentes fracciones de
proteasa se ha demostrado claramente que no están implicadas en la
actividad tóxica oral del medio de cultivo de P. luminescens
(que se ha determinado posteriormente que reside con las proteínas
Tc solamente). Varias de estas sustancias han estado previamente
implicadas en la toxicidad de insectos pero hasta recientemente no
se había clonado ningún gen insecticida. Sin embargo, la
purificación y separación de proteasas también facilitará un examen
de de su papel supuesto en, por ejemplo, inhibición de las proteínas
antibacterianas tal como cecropina. R.H.
ffrench-Constant y Bowen, Current Opinions in
Micriobiology, 1999, 12: 284 - 288. Véase R.H.
ffrench-Constant et al. 66 AEM No. 8, p. 3310
- 3329 (agosto. 2000), para una revisión de los diversos factores
implicados en la virulencia de Photorhabdus de insectos.
Ha habido un progreso sustancial en la clonación
de genes que codifican toxinas insecticidas tanto de Photorhabdus
luminescens como de Xenorhabdus nematophilus. El
complejo de toxina que codifica los genes de P. luminescens
se examinaron primero. Veáse, por ejemplo, el documento WO
98/08932. Los genes "Paralelos" se clonaron más recientemente
a partir de X. nematophilus. Morgan et al.,
Applied and Environmental Microbiology 2001, 67: 2062 - 69.
Se han identificado cuatro diferentes complejos
de toxinas (TCs)-Tca, Tcb, Tcc y Tcd en
Photorhabdus spp. Cada uno de estos complejos de toxina
resuelve tanto especies individuales como dímeras en un gel de
agarosa nativo pero la resolución en un gel desnaturalizante revela
que cada complejo consta de un intervalo de especies entre 25 - 280
kDa. Los ORF que codifican las TC de Photorhabdus,
conjuntamente con los sitios de escisión de proteasas (flechas
verticales), se ilustran en la Figura 1. Véase también R.H.
ffrench-Constant y Bowen, 57 Cell. Mol. Life Sci.
828 - 833 (2000).
Las bibliotecas genómicas de P.
luminescens se seleccionaron con sondas de ADN y con anticuerpos
monoclonales y/o policlonales inducidos contra las toxinas. Se
clonaron cuatro loci de tc: tca, tcb, tcc y
tcd. El locus tca es un operón supuesto de tres marcos
abiertos de lectura (ORFs), tcaA, tcaB, y tcaC
transcritos a partir de la misma hebra de ADN, con un ORF terminal
más pequeño (tcaZ) que se transcribe en la dirección
opuesta. El locus tcc también comprende tres ORF
supuestamente transcritos en la misma dirección (tccA,
tccB, y tccC). El locus tcb es un único ORF
grande (tcbA), y el locus tcd se compone de dos ORF
(tcdA y tcdB); tcbA y tcdA, cada uno de
aproximadamente 7,5 kb, codifican grandes toxinas de insectos. TcdB
tiene homología con TcaC. Muchos de estos productos génicos se
determinaron que estaban escindidos por proteasas. Por ejemplo,
tanto TcbA como TcdA se escinden en tres fragmentos denominados i,
ii y iii (por ejemplo, TcbAi, TcbAii y TcbAiii). Los productos de
los ORFs tca y tcc también se escinden. Véase
la Figura 1. Véase también R.H.
ffrench-Constant y D.J. Bowen, Current Opinions in
Microbiology, 1999, 12:284 - 288.
Los bioensayos de de los complejos de toxina Tca
revelaron que eran altamente tóxicos para el gusano cornudo del
tomate en primera fase (Manduca sexta) cuando se proporciona
por vía oral (LD50 de 875 ng por centímetro cuadrado de dieta
artificial). R.H. ffrench-Constant y Bowen 1999.
La alimentación se inhibió a dosis de Tca tan
bajas como 40 ng/cm^{2}. dado el alto peso molecular predicho de
Tca, en base molar, las toxinas de P. luminescens son
altamente activas y relativamente pocas moléculas parecen ser
necesarias para ejercer un efecto tóxico R.H.
ffrench-Constant y Bowen, Current Opinions in
Micriobiology, 1999, 12:284 - 288.
Ninguno de los cuatro loci mostraban similitud
global con todas las secuencias de función conocida en GenBank.
Las regiones de similitud de secuencia realzaban alguna sugerencia
de que estas proteínas (TcaC y TccA) pueden superar la inmunidad de
insectos mediante ataque a los hemocitos de insecto. R.H.
ffrench-Constant y Bowen, Current Opinions in
Microbiology, 1999, 12:284 - 288.
TcaB, TcbA, y TcdA todas muestran la
conservación de aminoácidos (\sim 50% de identidad), comparados
entre sí, inmediatamente alrededor de sus sitios de escisión de
proteasas predicho. Esta conservación entre tres diferentes
proteínas TC que sugieren que todas pueden estar procesadas por las
mismas o similares proteasas. TcbA y TcdA también comparten \sim
50% de identidad global, así como un patrón pronosticado similar de
la escisión tanto carboxi- como amino- terminal. Se postula que
estas proteínas podrían así ser homólogas de otras. Además, el
tamaño similar, grande de TcbA y TcdA, y también el hecho que ambas
toxinas parece que actúan sobre el intestino del insecto, puede
sugerir modos similares de acción. R.H. ffrench-
\hbox{Constant y Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999, 12: 284 - 288.}
Los estudios de supresión/inactivación genética
sugieren que los productos de los loci tca y tcd loci son
responsables de la toxicidad oral para los lepidópteros. La
supresión de cualquiera de los genes tca o tcd
reducía en gran medida la actividad oral contra Manduca
sexta. Esto es, los productos de los loci tca y tcd loci
son toxinas orales para los lepidópteros por sí mismas; su efecto
combinado contribuía a la mayoría de la actividad oral secretado.
R.H. ffrench-Constant y D.J. Bowen, 57 Cell. Mol.
Life. Sci. 831 (2000). De manera interesante, la supresión de
cualquiera de los loci tcb o tcc solo también reduce
la mortalidad, los que sugiere que existen interacciones de complejo
entre los productos génicos diferentes. De este modo, los productos
del locus tca pueden potenciar la toxicidad de los productos
tcd. Como alternativa, los productos tcd pueden
modular la toxicidad de los productos tca y posiblemente
otros complejos. Hay que hacer notar que lo anterior se relaciona
con la actividad oral contra una única especie de insecto, los loci
tcb o tcc pueden producir toxinas que son más activas
contra grupos de insectos (o activos mediante la inyección
directamente en la vía hemocoel de insectos-normal
de administración cuando se secreta mediante las bacterias in
vivo). R.H. ffrench- Constant y Bowen, Current Opinions in
Microbiology, 1999, 12: 284 - 288.
El documento WO 01/11029 describe secuencias de
nucleótidos que codifican TcdA y TcbA y tienen composiciones de
base que se han alterado a partir de los genes nativos para hacerlos
más similares a los genes de plantas. También se describen plantas
transgénicas que expresan la Toxina A y Toxina B.
De las toxinas separadas aisladas de
Photorhabdus luminescens (W- 14), las denominadas Toxina A y
Toxina B han sido el sujeto de la investigación centralizada para
su actividad contra especies de insecto diana de interés (por
ejemplo, el gusano de la raíz del maíz). La toxina A comprende
dos subunidades diferentes. El gen nativo tcdA codifica la
protoxina TcdA. Como se determina mediante espectrometría de masas,
TcdA se procesa por una o más proteasas para proporcionar la Toxina
A. Más específicamente, TcdA es una proteína de aproximadamente
282,9 kDa (2516 aa) que se procesa para proporcionar TcdAi (los
primeros 88 aminoácidos), TcdAii (los siguientes 1849 aa; una
proteína de aproximadamente 208,2 kDa codificada por los nucleótidos
265 - 5811 de tcdA), y TcdAiii, una proteína de
aproximadamente 63,5 kDa (579 aa) (codificada por los nucleótidos
5812 - 7551 de tcdA). TcdAii y TcdAiii parecen ensamblarse en
un dímero (quizás ayudada por TcdAi), y los dímeros se ensamblan en
un tetrámero de cuatro dímeros. La toxina B se deriva de manera
similar de TcbA.
Aunque las interacciones moleculares exactas de
las proteínas TC entre sí, y su mecanismo(s) de acción, no
se entienden actualmente, se sabe, por ejemplo, que el complejo de
toxina Tca de Photorhabdus es tóxico para Manduca
sexta. Además, algunas proteínas TC se sabe que tienen actividad
insecticida "autónomas", mientras otras proteínas de TC se
sabe que potencian o aumentan la actividad de las toxinas autónomas.
Se sabe que la proteína TcdA es activa, sola, contra Manduca
sexta, pero que TcdB y TccC, conjuntamente, se pueden usar para
potenciar la actividad de TcdA. Waterfield, N. et al., Appl.
Environ. Microbiol. 2001, 67:5017 - 5024. TcbA (existe solamente
una proteína Tcb) es otra toxina autónoma de Photorhabdus. La
actividad de esta toxina (TcbA) también se puede potenciar mediante
TcdB conjuntamente con proteínas de tipo TccC.
La solicitud de Patente de Estados Unidos
20020078478 proporciona secuencias de nucleótidos para dos genes
potenciadores, tcdB2 y tccC2, de la región genómica de tcd de
Photorhabdus luminescens W-14. Se sabe en
este documento que la coexpresión de tcdB y tccC1 con tcdA da como
resultado niveles potenciados de toxicidad a los insectos oral
comparada a la obtenida cuando tcdA se expresa solo. La expresión
conjunta de tcdB y tccC1 con tcdA o tcbA proporciona actividad de
insecto oral potenciada.
Como se indica en la Tabla a continuación, TccA
tiene un nivel de homología con el extremo N de TcdA, y TccB tiene
algún nivel de homología con el extremo C de TcdA. TccA y TccB son
mucho menos activos sobre ciertos insectos de ensayo que es TcdA.
TccA y TccB de la cepa Photorhabdus W-14 se
llaman "Toxina D". "Toxina A" (TcdA), "Toxina B"
(TcbA), y "Toxina C" (TcaA y TcaB) también se indican a
continuación. Además, TcaA tiene algún nivel de homología con TccA
y del mismo modo con el extremo N de TcdA. Incluso además, TcaB
tiene algún nivel de homología con TccB y del mismo modo con el
extremo N de TcdA. TccA y TcaA son de tamaño similar, como lo son
TccB y TcaB. TcdB tiene un nivel significativo de similitud (tanto
en secuencia como en tamaño) a TcaC.
El epitelio del intestino medio de insectos
contiene tanto células en forma de columna (estructurales) como de
copa (secretorias. La ingestión de los productos de tca por
M. sexta conduce a una ingestión apical de y formación de
burbujas de grandes vesículas citoplásmicas por las células en forma
de columna, que conducen a la extrusión eventual de núcleos de
células en vesículas en el lumen del intestino. Las células de copa
también están afectadas aparentemente de la misma manera. Los
productos de tca actúan en el intestino medio después de
cualquier administración oral o inyección. R.H.
ffrench-Constant and D.J. Bowen, Current Opinions
in Microbiology, 1999, 12: 284 - 288. Los productos purificados de
tca han mostrado toxicidad oral contra Manduca sexta
(DL_{50} de 875 ng/cm^{2}). R.H.
ffrench-Constant y D.J. Bowen, 57 Cell. Mol. Life
Sci. 828 - 833 (2000).
El documento WO 99/42589 y la patente de Estados
Unidos Nº 6.281.413 describe los QRF de tipo TC de Photorhabdus
luminescens. Los documentos WO 00/30453 y WO 00/42855 describen
las proteínas de tipo TC de Xenorhabdus. Los documentos WO
99/03328 y WO 99/54472 (y las patentes de Estados unidos números
6.174.860 y 6.277.823) se refieren a otras toxinas de
Xenorhabdus y Photorhabdus.
Los esfuerzos de clonación relativamente
recientes en Xenorhabdus nematophilus también parecen haber
identificado genes de toxina insecticidas novedosos con homología
con los loci de P. luminescens tc. Véase, por ejemplo,
el documento WO 98/08388 y Morgan et al., Applied y
Environmental Microbiologyy 2001, 67: 2062 - 69. En R.H.
ffrench-Constant y D.J. Bowen, Current Opinions in
Microbiology, 1999,12: 284 - 288, clones de cósmidos se
seleccionaron directamente para evaluar toxicidad oral a otros
lepidópteros, Pieris brassicae. Se secuenció un clon de
cósmido tóxico por vía oral. El análisis de la secuencia en el que
el cósmido sugería que existen cinco ORF diferentes con similitud
con los genes de Photorhabdus tc; orf2 y orf5 ambos
tienen algún nivel se relación de secuencias a tanto tcbA como
tcdA, mientras orf1 es similar a tccB, orf3 es
similar a tccC y orf4 es similar a tcaC. De manera
importante, numerosos de estos ORF también comparten el sitio de
escisión supuesto documentado en P. luminescens, sugiriendo
que las toxinas activas también se pueden procesar de manera
proteolítica.
Existen cinco proteínas TC de Xenorhabdus
típicas: XptA1, XptA2, XptB1, XptC1, y XptD1. XptA1 es una toxina
"autónoma". XptA2 es otra proteína TC de Xenorhabdus que
tiene actividad de la toxina autónoma. Véase GENBANK Nº de acceso
AJ308438 para las secuencias de Xenorhabdus nematophilus.
XptB1 y XptC1 son los potenciadotes de Xenorhabdus que
pueden potenciar la actividad de o bien (o ambas) toxinas de XptA.
XptD1 tiene algún nivel de homología con TccB. XptC1tiene algún
nivel de similitud con TcaC. La proteína XptA2 de
Xenorhabdus tiene algún grado de similitud con TcdA la
proteína. XptB1 tiene algún grado de similitud con TccC.
El hallazgo de algo de similitud, los loci que
codifican toxinas en estas dos diferentes bacterias es interesante
en términos de los posibles orígenes de estos genes de virulencia.
El cósmido de X. nematophilus también parece que
contiene secuencias de tipo transposasa cuya presencia puede puede
sugerir que estos loci se puedan transferir de manera horizontal
entre diferentes cepas o especies de bacterias. Un intervalo de
tales episodios de transferencia también puede explicar la
organización genómica aparentemente diferente de los operones
tc en las dos bacterias diferentes. Además, solamente un
subconjunto de cepas de X. nematophilus y P.
luminescens parecen tóxicas para M. sexta,
sugiriendo o bien que diferentes cepas carecen de los genes
tc o que pueden llevar un complemento del gen tc
diferente. El análisis detallado de tanto una cepa como una
filogenia de toxina dentro, y entre, estas especies bacterianas
deben ayudar a clarificar el origen probable de los genes de toxina
y cómo se mantienen en diferentes poblaciones de bacterias. R.H.
ffrench- Constant y Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999,
12: 284 - 288.
Las proteínas y genes de TC se han descrito más
recientemente a partir de otras bacterias asociadas a insectos
tales como Serratia entomophila, un patógeno de insectos.
Waterfield et al., TRENDS in Microbiology, Vol. 9, No. 4,
April 2001.
En resumen, las proteínas del complejo de
toxinas de P. luminescens y X. nematophilus parecen
tener poca homología con las toxinas bacterianas identificadas
previamente y deben proporcionar alternativas útiles a las toxinas
derivadas de B. thuringiensis. Aunque tienen efectos tóxicos
similares en el intestino medio de insecto a otras toxinas activas
por vía oral, su modo preciso de acción permanece oscuro. El trabajo
futuro podría clarificar su mecanismo de acción.
Aunque algunas proteínas TC de
Xenorhabdus se encontraron que "corresponden" (tienen
una función similar y algún nivel de homología de secuencias) con
alguna de las proteína TC de Photorhabdus, una proteína de
Photorhabdus dada comparte solamente aproximadamente 40% de
identidad de secuencia con la proteína de Xenorhabdus
"correspondiente". Esto se ilustra más adelante para cuatro
toxinas "autónomas":
(Para una revisión más completa,
véase, por ejemplo, Morgan et al., "Sequence
Analysis of Insecticidal Genes from Xenorhabdus nematophiles
PMFI296", Vol. 67, Applied y Environmental Microbiology, May
2001, p. 2062 -
2069).
Las bacterias del género Paenibacillus
son distinguibles de otras bacterias mediante características de
ARNr y fenotípicas distintivas (C. Ash et al. (1993),
"Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow,
Wallbanks y Collins) usando un ensayo de sonda de PCR: Propuesto
para la creación de un género nuevo Paenibacillus", Antonie Van
Leeuwenhoek 64: 253 - 260). El análisis de secuencia de ARNr 16 S
comparativo demostró que el género Bacillus constaba al
menos de cinco líneas filéticas. Los bacilos del grupo 3 de ARN
ribosómico (de Ash, Farrow, Wallbanks, y Collins (1991), que
comprenden Bacillus polymyxa y estrechamente relacionados),
está filogenéticamente así eliminado de Bacillus subtilis
(las especies tipo del género y otros bacilos aerobios, formadores
de endosporas) que se volvieron a clasificar como un nuevo género,
Paenibacillus.
Algunas especies en este género se conocerá que
son patogénicos para las abejas de miel (Paenibacillus
Larvae) y larvas de escarabajos (P. popilliae y P.
lentimorbus). Algunas otras especies de Paenibacillus se
han encontrado que están asociados a las abejas de miel, pero no son
patógenos. Al menos 18 especies adicionales se conocen en este
género, incluyendo P. thiaminolyticus; no se ha conocido
asociación a insectos (Shida et al., 1997; Pettersson et
al., 1999). Los escarabajos (coleópteros) son plagas graves de
césped, semilleros, y cultivos alimentarios por toda Norte América,
y son de interés de cuarentena. Véase, la página web de
Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Servicio de
Investigación Agrícola.
P. larvae, P. popilliae, y P. lentimorbus
se consideran patógenos de insectos obligados implicados en la
bacteriosis lechosa de escarabajos (D.P. Stahly et al.
(1992), "The genus Bacillus: insect pathogens", p. 1697 -
1745, en A. Balows et al., ed., The Procaryotes, 2ª Ed., Vol.
2, Springer-Verlag, New York, NY). Estas tres
especies de Paenibacillus son característicamente organismos
fastidiosos de lento crecimiento que provocan enfermedad mediante
un procedimiento invasivo en el que las bacterias cruzan el
intestino medio y proliferan hasta altos números en la hemolinfa y
otros tejidos. Para estas tres especies se han propuesto algunas
indicaciones generales de la implicación de proteína en la
patogenicidad de insectos; sin embargo no se ha demostrado ningún
papel específico para una proteína específica. Stahly et al.
concluyeron para P. larvae que una cuestión de la
implicación de una toxina es una abierta, y que la causa precisa de
muerte en bacteriosis lechosa (de escarabajos) no se entiende.
Una toxina de escarabajo (coleóptero),
Cry18, se ha identificado en cepas de P. popilliae y P.
lentimorbus. Cry18 tiene aproximadamente 40% de
identidad con las proteínas Cry2 (Zhang et al., 1997;
Harrison et al., 2000). Mientras Zhang et al. (1997)
especulan que Cry18 ataca al intestino medio para facilitar
la entrada de células vegetativas al hemocoel, Harrison et
al. Indican que no existe evidencia directa de este papel y
además establecen que "el papel, si existe, de la proteína de
parasporas en bacteriosis lechosa no se conoce" J. Zhang et
al. (1997), "Cloning y Analysis of the First cry Gene from
Bacillus popilliae", J. Bacteriol. 179: 4336 - 4341; H.
Harrison et al. (2000), "Paenibacillus Associated
with Milky Disease in Central y South American Scarabs", J.
Invertebr. Pathol. 76(3):169 - 175.
Stahly et al., Zhang et al., y
Harrison et al. todos apuntan al contraste en evidencia para
el papel de proteínas cristalinas de B. thuringiensis
en la intoxicación de insectos (donde la alta frecuencia de
síntomas de insecto se pueden explicar mediante las proteínas de las
proteínas cristalinas específicas), contra el caso de
Paenibacillus y bacteriosis lechosa (donde no hay tal lazo
para los efectos de una toxina específica).
De este modo, mientras que algunas especies de
Paenibacillus se conoce que son patogénicos para ciertos
coleópteros y algunas asociadas a ciertos coleópteros y algunas
asociadas a abejas de miel, no era hasta ahora conocida ninguna
cepa de Paenibacillus que fuera tóxica para lepidópteros. De
manera similar, las proteínas TC y proteínas Cry tóxicas
para lepidópteros nunca se han reseñado en Paenibacillus.
Esta es la primera descripción conocida de las
toxinas de proteínas de Paenibacillus que tienen actividad
contra plagas de lepidópteros. Algunas especies de
Paenibacillus se conoce que son insecticidas, pero no tienen
actividad contra gorgojos/escarabajos/coleópteros. No se han
conocido reseñas de una especie o cepa de Paenibacillus que
tenga toxicidad para lepidópteros. De este modo, la invención
presente se refiere en general a la selección de
Paenibacillus spp. Para las proteínas que tienen una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41, y su uso.
Más específicamente, la invención presente
inicialmente provenía de un descubrimiento de una cepa novedosa de
Paenibacillus mencionada en este documento como DAS1529. Esto
era un sorprendente descubrimiento por una diversidad de razones.
Esta cepa produce una única proteína tóxica para los lepidópteros.
Esta cepa, así como DB482, producen proteínas únicas de tipo TC de
complejo de toxinas (que tienen alguna similitud con las TC de
Xenorhabdus/Photorhabdus).
Esta es la primera reseña conocida de
Paenibacillus que tiene proteínas de tipo TC. De este modo,
la invención presente se refiere a procedimientos de selección de
Paenibacillus spp. Para los genes y proteínas de tipo TC
como antes. Las proteínas Tc de Paenibacillus de la invención
presente se muestra en el presente documento que son útiles para
aumentar o potenciar la actividad de una proteína de toxina
"autónoma" de Xenorhabdus, por ejemplo. Los genes de
tipo TC -identificados en el presente documento no se conocía hasta
ahora que existieran en el género Paenibacillus. El
descubrimiento amplía el ámbito de organismos (género bacteriano en
los que los genes de tipo TC se han encontrado. De este modo, la
invención presente en general se refiere a proteínas de tipo TC
como antes que se pueden obtener a partir de especies de
Paenibacillus, a procedimientos de selección de especies de
Paenibacillus para tales proteínas, y similares. Un ejemplo
es Paenibacillus apairius, que también se encuentra que
produce proteínas de tipo TC.
Mientras las proteínas de tipo TC sujeto tienen
alguna conexión de secuencia, y características en común con las
proteínas de tipo TC de Xenorhabdus y Photorabdus, las
secuencias de las proteínas de tipo TC sujeto son muy diferentes de
las proteínas de TC conocidas previamente. De este modo, la
solicitud sujeto proporciona nuevas clases de proteínas y genes de
tipo TC que codifican estas proteínas, que se pueden obtener a
partir de bacterias en el género Paenibacillus,.
Otra característica sorprendente de la cepa DAS
1529 es que produce una única proteína Cry de tipo
B.t. que es tóxica para los lepidópteros. La toxina
Cry sujeto es comprimida/corta y parece que carece de una
porción protoxina típica en su estado de tipo salvaje.
Esta cepa es el primer ejemplo conocido de una
bacteria natural que produce tanto una toxina de tipo Cry y
proteínas de tipo TC. Además es sorprendente que este es el primer
ejemplo conocido de un gen de toxina cry que está
estrechamente asociado a (en proximidad genética a) los genes de
proteína TC. Estas observaciones pioneras tienen amplias
implicaciones y de este modo permiten que los expertos en la técnica
seleccionen especies apropiadas de bacterias para estos tipos de
operones únicos y para estos tipos de componentes adicionales de
operones
conocidos.
conocidos.
Una descripción adicional de la invención
presente proviene del sorprendente descubrimiento de que la cepa
DAS 1529 también produce una toxina de insecto soluble que se
encontró que era muy similar a una tiaminasa. Era sorprendente que
la proteína de tiaminasa de Paenibacillus se encontró que
tenía actividad insecticida. Mientras esta proteína se conocía, no
se esperaba de ninguna manera en la técnica que esta enzima hubiera
mostrado actividad de tipo toxina contra plagas de insectos/de tipo
insecto.
Otros objetos, ventajas, y características de la
invención presente será evidente para los expertos en la técnica
que tienen el beneficio de la descripción sujeto.
La Figura 4 muestra resultados de ensayo de
tiaminasa purificada de DAS 1529 en CEW.
La Figura 5 muestra ORF3-ORF6 en
pEt101D.
La Figura 6 muestra Cry1529 (ORF 7)
contra el gusano de la yema de tabaco (TBW).
La Figura 7 muestra una comparación/alineación
de la SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:5 (tcaB2 a tcaB1); los paréntesis
muestran la conexión de ORF2.
La Figura 8 muestra un árbol filogenético de
ORF7 de DAS1529 (Cry1529) comparado con otras proteínas de
Cry.
Las Figuras 9 y 10 muestran los resultados de la
digestión por tripsina de las proteínas Cry1529 de tipo
salvaje y modificadas.
Las Figuras 11A y 11B muestran las alineaciones
de secuencias para el diseño de cebador de tcaA.
Las Figuras 12A-D muestran las
alineaciones de secuencias para el diseño de cebador de tcaB.
Las Figuras 13A y 13B muestran las alineaciones
de secuencias para el diseño de cebador de tcaC.
Las Figuras 14A y 14B muestran las alineaciones
de secuencias para el diseño de cebador de tccC.
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ácido
nucleico de la inserción entera de SB12.
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de ácido
nucleico de ORF1, que codifica una proteína de tipo tcaA (gen
tcaA1, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del
organismo fuente designación del gen
tcaA1-1529).
La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos
codificada por ORF1.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ácido
nucleico de ORF2, con un elemento IS eliminado, que codifica una
proteína de tipo tcaB (gen tcaB1, la cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus del organismo fuente, designación del gen
tcaB1-1529).
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos
codificada por ORF2.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de ácido
nucleico de ORF3, que codifica una proteína de tipo tcaA (gene
tcaA2, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del
organismo fuente, designación del gen
tcaA2-1529).
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos
codificada por ORF3.
La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de ácido
nucleico de ORF4, que codifica una proteína de tipo tcaB (gen
tcaB2, la cepa IDEAS 1529 de Paenibacillus del
organismo fuente, designación del gen
tcaB2-1529).
La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos
codificada por ORF4.
La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de ácido
nucleico de ORF5, que codifica una proteína de tipo tcaC (gen
tcaC, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del
organismo fuente, designación del gen
tcaC-1529).
La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos
codificada por ORF5.
La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de ácido
nucleico de ORF6, que codifica una proteína de tipo tccC.
La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos
codificada por ORF6.
La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de ácido
nucleico de ORF7, que codifica una proteína de tipo Cry.
La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos
codificada por ORF7.
La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de ácido
nucleico parcial del ADNr 16S de DAS 1529 usado para la colocación
taxonómica.
SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos
N-terminal para la toxina purificada de la fracción
de caldo de DAS1529.
La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos
de tiaminasa I de Bacillus thiaminolyticus (Campobasso et
al., J. Biochem. 37(45): 15981 - 15989 (1998)).
La SEQ ID NO: 19 es una secuencia de aminoácidos
alternativa codificada por la proteína de ORF6 (gen tccC, la
cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del organismo fuente,
designación del gen tccC-1529).
La SEQ ID NO: 20 es el gen xptC1, cepa
Xwide Xenorhabdus del organismo fuente, designación del gen
xptC1-Xwi.
La SEQ ID NO: 21 es el gen xptB1, cepa
Xwide Xenorhabdus del organismo fuente, designación del gen
xptB1-Xwi.
La SEQ ID NO: 22 es el cebador SB101.
La SEQ ID NO: 23 es el cebador SB102.
La SEQ ID NO: 24 es el cebador SB103.
La SEQ ID NO: 25 es el cebador SB104.
La SEQ ID NO: 26 es el cebador SB105.
La SEQ ID NO: 27 es el cebador SB106.
La SEQ ID NO: 28 es el cebador SB212.
La SEQ ID NO: 29 es el cebador SB213.
La SEQ ID NO: 30 es el cebador SB215.
La SEQ ID NO: 31 es el cebador SB217.
La SEQ ID NO: 32 es una secuencia de nucleótidos
de un gen de tipo tcaA de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 33 es una secuencia de aminoácidos
de una proteína de tipo TcaA de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 34 es una secuencia de nucleótidos
de un gen de tipo tcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 35 es una secuencia de nucleótidos
de un gen de tipo tcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 36 es una secuencia de aminoácidos
de una proteína de tipo TcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 37 es una secuencia de aminoácidos
de una proteína de tipo TcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 38 es una secuencia de nucleótidos
de un gen de tipo tcaC de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 39 es una secuencia de aminoácidos
de una proteína de tipo TcaC de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 40 es una secuencia de nucleótidos
de un gen de tipo tccC de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 41 es una secuencia de aminoácidos
de una proteína de tipo TccC de la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius.
La SEQ ID NO: 42 es el gen tcdB1, cepa
W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen
tcdB1-W14.
La SEQ ID NO: 43 es el gen tcdB2, cepa
W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen
tcdB2-W14.
La SEQ ID NO: 44 es el gen tccC1, cepa
W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen
tccC1-W14.
La SEQ ID NO: 45 es el gen tccC2, cepa
W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen
tccC2-W14.
La SEQ ID NO: 46 es el gen tccC3, cepa
W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen
tccC3-W14.
La SEQ ID NO: 47 es el gen tccC4, cepa
W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen
tccC4-W14.
La SEQ ID NO: 48 es el gen tccC5, cepa
W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen
tccC5-W14.
La SEQ ID NO: 49 es la secuencia de aminoácidos
de la proteína TC de XptA2 de Xenorhabdus nematophilus
Xwi.
La invención presente proporciona alternativas
biológicas únicas para el control de plagas. Más específicamente,
la invención presente proporciona fuentes nuevas de proteínas que
tienen actividad de toxinas contra insectos, preferiblemente
lepidópteros, y otras plagas similares. La invención también se
refiere a nuevas fuentes de polinucleótidos novedosos que se pueden
usar para codificar tales toxinas, y a procedimientos de preparación
y procedimientos de uso de las toxinas y secuencias de ácido
nucleico correspondientes para controlar insectos y otras plagas de
plantas. La presente invención se refiere a la necesidad de agentes
novedosos de control de insectos. La presente invención a proteínas
novedosas pesticidas que se pueden obtener a partir de bacterias
Paenibacillus.
La invención presente inicialmente proviene de
un descubrimiento de una cepa novedosa de Paenibacillus.
Esta cepa se denomina en el presente documento como DAS1529. Para
demostrar las amplias implicaciones de este descubrimiento, también
se ejemplifica el descubrimiento de otra cepa de
Paenibacillus. Estas cepas se han depositado en la Colección
de Cultivos De Patentes del Servicio de Investigación Agrícola
(NRRL) en 1815 North University Street Peoria, Ill. 61604 Estados
Unidos. Las cepas depositadas y las fechas de depósito
correspondientes son como sigue:
Estos cultivos se han depositado para los
propósitos de esta solicitud de patente y se depositaron en las
condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos está
disponible durante el estado pendiente de esta solicitud de patente
a la determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas Comerciales
que se denomina además 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. Estos depósitos
estarán disponibles cuando se requieran por las leyes de patentes
extranjeras en los países en los que las homólogas de la solicitud
sujeto, o sus descendientes se presenten. Sin embargo se debe
entender que al disponibilidad de un depósito no constituye una
licencia para practicar la invención presente en la derogación de
de los derechos de patentes concedidos por la acción
gubernamental.
Además, los depósitos de cultivo sujeto se
realizaron de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest
para el depósito de Microorganismos, es decir, se almacenarán con
todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y no
contaminados durante un período de al menos cinco años después de la
petición más reciente para el suministro de una muestra del
depósito, y en cualquier caso durante un período de al menos (30)
años después de la fecha de depósito o para la vida ejecutiva de
cualquier patente que puede publicar la descripción del cultivo. El
depositante reconoce el deber de reemplazar el depósito el
depositado debe ser incapaz de proporcionar una muestra cuando se
requiera, debido a la condición del depósito. Todas las
restricciones sobre la disponibilidad al público de los depósitos
de cultivo sujeto se eliminarán irrevocablemente tras la concesión
de una patente que los describa.
El descubrimiento de la cepa DAS1529 sujeto fue
sorprendentemente por una diversidad de rezones. La cepa produce
una única proteína Cry tóxica para los lepidópteros. Esta
cepa, así como DB482, también producen proteínas de tipo (TC)
complejo de toxinas (que tienen alguna similitud con las TC de
Xenorhabdus/Photorhabdus).
Esta es la primera descripción conocida de una
toxina proteica de Paenibacillus que tiene actividad contra
una plaga de lepidópteros. Esto fue un descubrimiento sorprendente.
Algunas especies de Paenibacillus se conocía que tenían
actividad insecticida contra gorgojos/escarabajos/coleópteros. No se
han conocido reseñas de una especie o cepa de Paenibacillus
que tenga toxicidad para los lepidópteros. De este modo, la
invención presente en general describe especies de
Paenibacillus que tienen actividad contra lepidópteros, y
selección de cultivos de Paenibacillus, proteínas de los
mismos, y genotecas de clones de los mismos, para actividad contra
lepidópteros, y/o para genes que codifican "toxinas lep", y más
particularmente, para proteínas Cry tóxicas para los
lepidópteros.
Esta es también la primera reseña conocida de
Paenibacillus que tiene proteínas de tipo TC. De este modo,
la invención presente se refiere a procedimientos de selección de
Paenibacillus spp. Para los genes y proteínas de tipo TC que
tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por la SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. Fue muy
sorprendente encontrar que las cepas DAS 1529 y DB482 tienen
operones de tipo TC y producen estas proteínas TC (que tienen algún
nivel de similitud con las proteínas TC de Xenorhabdus y
Photorhabdus). Las proteínas TC y genes identificados en el
presente documento no se conocía hasta ahora que exista en el
género Paenibacillus. Este descubrimiento amplía el ámbito de
los organismos (géneros bacterianos) en los que se han encontrado
los genes de las proteínas TC De este modo, la invención presente
en general se refiere a proteínas TC que se pueden obtener a partir
de especies de Paenibacillus que tienen una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No.
13, y SEQ ID No. 41, y a procedimientos de selección de especies de
Paenibacillus para tales proteínas que tienen una secuencia
de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID
No. 13, y SEOQ ID No. 41. Un ejemplo de una especie de
Paenibacillus encontrada usando los procedimientos de la
invención presente es la cepa DB482 de Paenibacillus
apairius. Esta cepa de P. apairius también produce
proteínas únicas de tipo TC que tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ
ID
No. 41.
No. 41.
Aunque las proteínas TC sujeto tienen algunas
características en común con las proteínasTC de Xenorhabdus
y Photorabdus, las proteínas TC sujeto son únicas y
diferentes de las proteínas TC conocidas previamente. De este modo,
la aplicación sujeto proporciona nuevas clases de proteínas y genes
de tipo TC que codifican estas proteínas que se pueden obtener a
partir de bacterias en el género Paenibacillus.
La toxina Cry deDAS1529 es una toxina de
la proteína Cry de tipo B.t.. Otra cepa de
Paenibacillus, una cepa con actividad contra gorgojos, se
sabía que producía una proteína Cry tóxica para los
coleópteros. Esa era una proteína Cry18, que estaba más
relacionada con las proteínas Cry2 (pero solamente
aproximadamente 40% de identidad). La proteína Cry
ejemplificada en el presente documento muestra solamente un bajo
nivel de identidad y similitud de secuencia a las proteínas
Cry conocidas previamente. Con eso indicado, de todas las
proteínas Cry de B.t. Cry, la proteína Cry
sujeto comparte la mayoría de la similitud con las proteínas
Cry1. Un aspecto sorprendente de de la proteína Cry
sujeto es que es muy corta, es decir incluso más corto que la
toxina del núcleo Cry1Fa. La proteína Cry sujeto tiene
una región 5 de bloque que se puede identificar en o cerca de su
extremo C. Esta toxina en su estado de tipo salvaje no tiene la
parte de protoxina, que se encuentra típicamente en las toxinas
Cry1. La toxina Cry sujeto está sorprendentemente
comprimida. Esta descripción es también significativa para la
investigación de genes cry adicionales de Bacillus
thuringiensis (B.t.). Como será evidente por los expertos
en al técnica que tengan el beneficio de la descripción sujeto,
otras bacterias, tales como B.t. y otras
Bacillus spp. Se pueden seleccionar para para toxinas
similares y genes de toxinas.
La cepa DAS1529 es el primer ejemplo conocido de
una bacteria natural que produce tanto toxina de tipo Cry
como las proteínas de tipo TC. Además sorprendentemente es que esto
es el primer ejemplo conocido de un gen de toxina cry que
está estrechamente asociado a (en proximidad genética c) genes de
proteínas TC. Estas observaciones pioneras de este modo permiten a
los expertos en la técnica seleccionar especies apropiadas de
bacterias para estos tipos de operones únicos y para estos tipos de
componentes adicionales de operones conocidos, Esto es un ejemplo
interesante de una cepa de tipo salvaje que tiene un operón de tipo
TC con genes de proteínas TC múltiples del mismo tipo general (es
decir, en este caso, dos genes de tipo tcaA y dos de tipo tcaB).
Estos descubrimientos sorprendentes tienen amplias implicaciones
para el descubrimiento de genes adicionales.
Una descripción adicional se deriva del
descubrimiento sorprendente que la proteína de tiaminasa de
Paenibacillus tiene actividad insecticida. Aunque esta
proteína se conocía, no se esperaba de ninguna forma en la técnica
que esta enzima mostraría actividad de tipo toxina contra plagas de
insectos/de tipo insecto.
Más específicamente con relación a las proteínas
TC ejemplificadas, las siguientes proteínas TC de la cepa DAS 1529
se han caracterizado completamente en el presente documento: dos
proteínas de tipo TcaA (TcaA1 y TcaA2), dos proteínas de tipo TcaB
(TcaB1 y TcaB2), una proteína TcaC, y una proteína de tipo TccC. Las
proteínas TcaA1 y TcaA2 son similares en gran medida entre sí a la
secuencia a nivel de secuencia, y las proteínas tcaB1 y tcaB2 son
similares en gran medida entre sí a nivel de secuencia. Las
proteínas de tipo TC que se pueden obtener a partir de
Paenibacillus apairius también se ejemplifican en el presente
documento.
Las proteínas TC de la invención presente que
tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por la SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41 se pueden usar
como otras proteínas TC. Esto sería fácilmente evidente para los
expertos en la técnica que tienen el beneficio de la descripción
sujeto cuando se contempla a la luz de lo que conoce en la técnica.
Véase, por ejemplo, la sección de antecedentes anterior, que
describe R.H. ffrench-Constant y Bowen (2000) y La
patente de Estados Unidos Nº 6.048.838. Por ejemplo, se sabía que
el complejo de toxina Tca de Photorhabdus es altamente tóxico
para Manduca sexta.
Aunque las interacciones moleculares exactas de
las proteínas TC entre sí, y su(s) mecanismo(s) de
acción, no se entienden actualmente, algunas proteínas TC se sabían
que tenían actividad insecticida "autónoma", y otras proteínas
TC se sabía que potenciaban la actividad de las toxinas autónomas
Producidas por el mismo organismo dado. Por ejemplo, se sabía que la
proteína TcdA era activa contra Manduca sexta. TcaC y TccC,
se pueden usar conjuntamente para potenciar la actividad de TcdA.
TcdB se puede usar (en lugar de TcaC) con TccC como un potenciador.
TcbA es otra proteína TC de Photorhabdus con actividad
tóxica autónoma. TcaC (o TcdB) conjuntamente con TccC también se
puede usar para aumentar/potenciar la actividad tóxica de
TcbA.
Las proteínas TC de Photorhabdus y
proteínas/genes de TC "correspondientes" de
Paenibacillus se resumen a continuación.
Como se ha indicado anteriormente, TccA tiene
algún nivel de homología con el extremo N de TcdA, y TccB tiene
algún nivel de homología con el extremo C de TcdA. Además, TcdA es
de aproximadamente 280 kDa, y TccA conjuntamente con TccB son de
aproximadamente el mismo tamaño, si se combinan, que TcdA. Además,
TcaA tiene algún nivel de homología con TccA y del mismo modo con
el extremo N de TcdA. Incluso además, TcaB tiene algún nivel de
homología con TccB y del mismo modo con el extremo N de TcdA. TccA y
TcaA son de tamaño similar, que TccB y TcaB.
Aunque algunas proteínas TC de
Xenorhabdus se encontró que "corresponden" con algunas
de las proteínas TC de Photorhabdus, las proteínas
"correspondientes" comparten solamente aproximadamente 40%
(aproximadamente) de identidad de secuencia entre sí. Las proteínas
TC sujeto de TC de Paenibacillus tienen aproximadamente el
mismo grado de conexión de secuencias (\sim 40% de identidad) con
las proteínas TC anteriores.
Como se ha descrito en más detalle más adelante,
una o más toxinas de la invención presente se pueden usar en
combinación entre sí y/o con otras toxinas (es decir, el complejo
Photorhabdus Tca se conocía que era activo contra Manduca
sexta; diversas "combinaciones" de proteínas TC de
Photorhabdus, por ejemplo, se pueden usar conjuntamente para
potenciar la actividad de otras, toxinas de Photorhabdus
autónomas; el uso de las toxinas de Photorhabdus "con"
toxinas de B.t., por ejemplo, se ha propuesto para el
manejo de resistencia). Además, las proteínas TC de
Paenibacillus de la invención presente que tienen una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre grupo constituido por
SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41 se muestra en el presente
documento que son útiles para aumentar o potenciar la actividad de
una proteína de toxina de Xenorhabdus "autónoma", por
ejemplo. La solicitud provisional No. 60/441,723 (Timothy D. Hey
et al.), titulada "Mezcla y Emparejamiento de Proteínas TC
para el Control de Plagas", se refiere al descubrimiento
sorprendente que una proteína TC derivada de un organismo de un
género tal como Photorhabdus se pueda usar de manera
indistinta con una proteína TC "correspondiente" derivada de un
organismo de otro género, Además los datos sorprendentes junto con
estas líneas se presentan más adelante que además ilustran la
utilidad de las proteínas TC de Paenibacillus de la
invención presente que tienen una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID
No. 41. Una razón de que estos resultados pudieran ser
sorprendentes es que existe solamente \sim 40% de identidad de
secuencia entre las proteínas TC "correspondientes" de
Xhenorhabdus, Photorhabdus, y Paenibacillus
sujeto.
Proteínas y toxinas. La presente
invención proteínas funcionales que se administran fácilmente que
tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. La presente
invención también proporciona un procedimiento para distribuir
toxinas insecticidas que son funcionalmente activas y eficaces
contra muchos órdenes de insectos, preferiblemente insectos
lepidópteros. Por "actividad funcional" (o "activo
contra") significa en el presente documento que las toxinas
proteicas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41
funcionan como agentes de control de insectos activos por vía oral
(solos o en combinación con otras proteínas), que las proteínas
tienen un efecto tóxico (solos o en combinación con otras
proteínas), o son capaces de interrumpir o detener crecimiento y/o
alimentación de insectos que pueden o no pueden provocar muerte del
insecto. Cuando un insecto se pone en contacto con una cantidad
eficaz de una "toxina" de la invención presente distribuida la
expresión de plantas transgénicas, composición(es) de
proteína formulada(s), composición(es) de proteína
pulverizable(s), una matriz de cebo u otro sistema de
distribución, los resultados son típicamente muerte del insecto,
inhibición del crecimiento y/o prevención de los insectos a partir
de la alimentación sobre la fuente (preferiblemente una planta
transgénica) que hace que las toxinas estén disponibles para los
insectos. Las proteínas funcionales de la invención presente
también pueden potenciar o mejorar la actividad de las otras
toxinas proteicas. Los términos "tóxico", "toxicidad", y
"actividad tóxica" como se usan en el presente significa que
las "toxinas" sujeto tienen "actividad funcional" como se
ha definido en el presente
documento.
documento.
Se prefiere la letalidad completa para alimentar
a los pero no se requiere que logre actividad funcional. Si un
insecto evita la toxina o cesa en la alimentación, esa evitación
será útil en algunas aplicaciones, incluso si los efectos son
subletales o si la letalidad se retarda o es indirecta. Por ejemplo,
si se desean plantas transgénicas resistentes a insectos, la
renuncia de insectos a alimentarse sobre las plantas es tan útil
como la toxicidad letal para los insectos debido a que el último
objetivo es evitar el daño a las plantas inducido por insectos.
Existen otras muchas formas en las que las
toxinas se pueden incorporar a una dieta de insectos. Por ejemplo,
es posible adulterar la fuente de alimento de las larvas con la
proteína de toxina pulverizando el alimento con una solución de
proteína, como se describe en el presente documento. Como
alternativa, la proteína modificada se puede modificar por
ingeniería genética en otra bacteria diferente no dañina, que
después se puede hacer crecer en cultivo, y o bien aplicar a la
fuente de alimentación o permitir que resida en el suelo en un área
en la que se deseará la erradicación del insecto. También, la
proteína se puede modificar por ingeniería genética directamente en
una fuente de alimento de insecto. Por ejemplo, la fuente de
alimento principal para muchas larvas de insecto es material
vegetal. Por lo tanto los genes que codifican las toxinas se pueden
transferir al material vegetal de manera que dicho material de
plante exprese la toxina de interés.
La transferencia de la actividad funcional a
sistemas vegetales o bacterianos requiere típicamente secuencias de
ácido nucleico, que codifican las secuencias de aminoácidos para las
toxinas, integradas en un vector de expresión de proteína apropiado
para el huésped en el que el vector residirá. Una forma de obtener
una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína con
actividad funcional es aislar el material genético nativo a partir
de las especies bacterianas que producen las toxinas, usando la
información deducida de la secuencia de aminoácidos de la toxina,
como se describe en el presente documento. Las secuencias nativas se
pueden optimizar para la expresión en plantas, por ejemplo, como se
describe en más detalle más adelante. El polinucleótido optimizado
también se puede diseñar basándose en la secuencia de proteína.
La invención presente proporciona nuevas clases
de toxinas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41
que tienen actividades pesticidas ventajosas. Una forma de
caracterizar tres clases de toxinas y los polinucleótidos que las
codifican es mediante la definición de un polinucleótido por su
capacidad de hibridarse, en un intervalo de condiciones
especificadas, con una secuencia de nucleótidos ejemplificada (su
complemento y/o una sonda o sondas derivadas de cualquier hebra)
y/o por su capacidad a amplificarse mediante la PCR usando cebadores
derivados de las secuencias ejemplificadas.
Existen numerosos procedimientos para obtener
las toxinas pesticidas de la presente invención que tienen una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por
SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. Por ejemplo, anticuerpos para
las toxinas pesticidas descritas y reivindicadas en el presente
documento se pueden usar para identificar y aislar otras toxinas a
partir de una mezcla de proteínas. De manera específica, los
anticuerpos se pueden inducir para las partes de las toxinas que
son las más constantes y las más diferentes de otras toxinas. Estos
anticuerpos se pueden después usar para identificar específicamente
toxinas equivalentes con la actividad característica por
inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima
(ELISA), o transferencia de western. Los anticuerpos para las
toxinas descritas en el presente documento, o para toxinas
equivalentes, o para fragmentos de estas toxinas, se pueden
preparar fácilmente usando procedimientos convencionales. Las
toxinas de la invención presente se pueden obtener a partir de una
diversidad de fuentes/microorganismos fuente.
Los expertos en la técnica reconocerían
fácilmente que las toxinas (y genes) de la invención presente se
pueden obtener a partir de una diversidad de fuentes. Una toxina
"de" o "que se puede obtener a partir de" el aislamiento
sujeto DAS 1529 y/o el aislamiento de P. apiarius significa
que la toxina (o una toxina similar) se puede obtener a partir de
este aislamiento o alguna otra fuente, tal como otra cepa bacteriana
o una planta transgénica. Por ejemplo, los expertos en la técnica
reconocerán fácilmente que, dada la descripción de un gen
bacteriano y toxina, se puede modificar por ingeniería genética una
planta para producir la toxina. Las preparaciones de anticuerpo,
sondas de ácido nucleico (ADN y ARN), y similares se pueden preparar
usando el polinucleótido y/o secuencias de aminoácidos descritas en
el presente documento y usarse para seleccionar y recuperar otros
genes de toxinas a partir de otras fuentes
(naturales).
(naturales).
Polinucleótidos y sondas. La invención
presente además describe secuencias de nucleótidos que
codifican las toxinas de la invención presente que tienen una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. La invención presente además
proporciona procedimientos de identificación y caracterización de
genes que codifican toxinas pesticidas. En una realización, la
invención presente describe secuencias de nucleótidos únicas que
son útiles como sondas de hibridación y/o cebadores para las
técnicas de PCR. Los cebadores producen fragmentos génicos
característicos que se pueden usar en la identificación,
caracterización y/o aislamiento de de genes de toxinas específicos.
Las secuencias de nucleótidos como se ha descrito codifican
toxinas que son distintas de las toxinas anteriormente
descritas.
Los polinucleótidos como se describen se
pueden usar para completar "genes" que codifican proteínas o
péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, como los
expertos en la técnica reconocerán fácilmente, los polinucleótidos
sujeto se pueden colocar de manera apropiada bajo el control de un
promotor, en un huésped de interés, como se sabe fácilmente en la
técnica.
Como saben los expertos en la técnica, el ADN
existe típicamente, en una forma de doble hebra. En esta
disposición, una hebra es complementaria a la otra hebra y
viceversa. A medida que se replica el ADN en una planta (por
ejemplo), se producen hebras complementarias adicionales de AD, La
"hebra codificante" a medida se usa en la técnica para
referirse a la hebra que se une con la hebra no codificante. El ARNm
se transcribe a partir de la hebra "no codificante" de ADN. La
hebra "de sentido positivo" o "codificante" tiene una
serie de codones (un codón son tres nucleótidos que se pueden leer
como una unidad de tres restos para especificar un aminoácido
particular) que se puede leer como un marco abierto de lectura (ORF)
para formar una proteína o péptido de interés. Con el fin de
expresar una proteína in vivo, una hebra de ADN se transcribe
típicamente en una hebra complementaria de ARNm que se usa como el
molde de proteína. De este modo, la invención presente describe el
uso de los polinucleótidos ejemplificados mostrados en el listado de
secuencia unida y/o equivalentes que incluyen las hebras
complementarias. Se describen ARN y PNA (ácidos nucleicos de
péptidos) que son funcionalmente equivalentes con el ADN
ejemplificado.
ejemplificado.
Los aislamientos bacterianos se pueden cultivar
en condiciones que dan como resultado una alta multiplicación de
del microbio. Después de tratar el microbio para proporcionar ácido
nucleico genómico de una sola cadena, el And se puede poner en
contacto con los cebadores de la invención y someterse a
amplificación por la PCR. Los fragmentos característicos de genes
que codifican toxina se amplificarán mediante el procedimiento,
identificando de este modo la presencia del (de los) gen(es)
que codifica(n) toxina.
Además se describen genes y aislamientos
identificados usando los procedimientos y secuencias de nucleótidos
descritas en el presente documento. Los genes de este modo
identificados codifican toxinas activas contra plagas.
Las toxinas que tienen una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No.
13, y SEQ ID No. 41 y genes de la invención presente se pueden
identificar y obtener usando sondas de oligonucleótidos, por
ejemplo. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables que
se pueden detector en virtud de una etiqueta apropiada o se puede
hacer fluorescente de manera interesante como se describe en la
Solicitud internacional Nº. WO 93/16094. Las sondas (y los
polinucleótidos de la invención presente) pueden ser ADN, ARN, o
PNA. Además de la adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina
(T), y uracilo (U; para moléculas de ARN), sondas sintéticas (y
polinucleótidos) de la invención presente también pueden tener
inosina (una base neutra capaz de capaz de aparearse con las cuatro
bases; algunas veces usadas en lugar de una mezcla de las cuatro
bases en sondas sintéticas). De este modo, cuando un
oligonucleótido sintético, degenerado se menciona en el presente
documento, y "n" se usa< de manera genérica, "n" puede
ser G, A, T, C, o inosina. Los códigos de ambigüedad como se usan
en el presente documento están de acuerdo con las convenciones de
nomenclatura IUPAC convencionales como la de la presentación de la
solicitud sujeto (por ejemplo, R significa A o G, Y significa C o
T, etc.).
Como se conoce bien en la técnica, si una
molécula de sonda se hibrida con una muestra de ácido nucleico, se
puede asumir de manera razonable que la sonda y muestra tienen
homología/similitud/identidad sustancial. Preferiblemente la
hibridación del polinucleótido se lleva a cabo primeramente mediante
lavados en condiciones de baja, moderada, o alta rigurosidad
mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe en,
por ejemplo, Keller, G.H., M.M. Manak (1987) ADN Probes, Stockton
Press, Nueva York, NY, p. 169 - 170. Por ejemplo, como se establece
en ese documento, se pueden lograr condiciones de baja rigurosidad
mediante lavado con 2 x SSC Citrato Solución salina Estándar)/0,1%
de SDS (Dodecil sulfato de Sodio) durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Se realizan típicamente dos lavados. Después se puede
lograr una mayor rigurosidad reduciendo la concentración de sal y/o
elevando la temperatura. Por ejemplo, al lavado descrito
anteriormente puede seguir dos lavados con 0,1 x SSC/0,1% de SDS
durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente seguido de
posteriores lavados con 0,1 x SSC/0,1% SDS durante 30 minutos cada
uno a 55ºC. Estas temperaturas se pueden usar con otros protocolos
de hibridación y de lavado establecidos en el presente documento y
como conocerán los expertos en la técnica (SSPE se puede usar como
la sal en lugar de SSC, por ejemplo). El 2 x SSC/0,1% de SDS se
puede preparar mediante la adición de 50 ml de 20 x SSC y 5 ml de
10% de SDS a 445 ml de agua. 20 x SSC se puede preparar mediante la
combinación de NaCl (175,3 g/0,150 M), citrato de sodio (88,2
g/0,015 M), y agua hasta 1 litro, seguido de ajuste de pH a 7,0 con
10 N NaOH. 10% de SDS se puede preparar disolviendo 10 g de SDS en
50 ml de agua esterilizada en autoclave, diluyendo hasta 100 ml, y
tomando alícuotas.
La detección de la sonda proporciona un medio
para determinar de una manera conocida si la hibridación se ha
mantenido. Tal análisis de sonda proporciona un procedimiento rápido
para identificar los genes que codifican toxina de la invención
presente. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas
como se describe de acuerdo con la invención se pueden
sintetizar usando un sintetizador de ADN y procedimientos
convencionales. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden
usar como cebadores de la PCR para amplificar genes de la
invención
presente.
presente.
Las sondas para uso de acuerdo con la invención
presente se pueden derivar de una diversidad de fuentes, tal como
cualquier gen mencionado o sugerido en el presente documento. Por
ejemplo, toda o parte de cualesquiera de los genes (codificantes
y/o no codificantes o sus hebras complementarias) se pueden usar de
acuerdo con la invención presente: tcaA, tcaB, tcaC, tcbA, tccA,
tccB, tccC, tcdA, tcdB, xptA1, xptD1, xptB1, xptc1, xptA2, sepA,
sepB, y sepC. Salvo que se especifique de otra manera, la referencia
a un gen "tccC", por ejemplo, incluye todos los alelos
específicos (tales como tccC1 y tccC2) de este tipo de gen. Lo mismo
es verdad para todos los otros genes (por ejemplo, tcdB2, tccC3, y
los alelos mencionados en la Tabla 17).
Las características de hibridización de una
molécula se pueden usar para definir los polinucleótidos de la
invención presente. De este modo, la invención presente describe
polinucleótidos (y/o sus complementos, preferiblemente sus
complementos completos) que se hibridan con un polinucleótido (o un
oligonucleótido o cebador) ejemplificado o sugerido en el presente
documento.
Como se usan en el presente documento
condiciones "rigurosas" para hibridación se refiere a
condiciones que logran el mismo, o aproximadamente, el mismo grado
de especificidad de hibridización que las condiciones empleadas por
los solicitantes actuales. De manera específica, la hibridación de
ADN inmovilizado sobre transferencias de Southern con sondas
específicas de gen marcadas con 32P se realizó mediante
procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Maniatis,
T., E.F. Fritsch, J. Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). En
general, la hibridación y posteriores lavados se pueden llevar a
cabo en condiciones que permiten la detección de secuencias diana.
Para las sondas de genes de ADN de doble cadena, la hibridación se
llevó a cabo durante toda una noche 20 - 25ºC por debajo de la
temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6 x SSPE, 5x de
solución de Denhardt, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizada.
La temperatura de fusión se describe mediante la siguiente fórmula
(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas, y F.C.
Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman y K.
Moldave [eds.] Academic Press, New York 100: 266 - 285):
Tm =
81.5^{o}C\ +\ 16.6\ Log[Na+]\ +\ 0.41(%G+C) -
0.61(%formamida) - 600/longitud\ de dúplex\ en\ pares\ de\
bases.
Los lavados se llevan a caso típicamente como
sigue:
(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15
minutos en 1 x SSPE, 0,1% de SDS (lavado de baja rigurosidad).
(2) Una vez a Tm - 20ºC durante 15 minutos en
0,2 x SSPE, 0,1% de SDS (lavado con rigurosidad moderada).
\newpage
Para las sondas de oligonucleótidos, la
hibridación se llevó a cabo durante toda una noche a 10 - 20ºC por
debajo de la temperatura de de fusión (Tm) del híbrido en 6 x SSPE,
5 x de solución de Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml de ADN
desnaturalizado. Tm para sondas de oligonucleótidos se determinó
mediante la siguiente fórmula:
Tm (^{o}C) =
2\ (número\ de\ pares\ de\ bases\ T/A) + 4\ (número\ de\ pares\ de\
bases\
G/C)
(Suggs, S. V., T. Miyake, E. H.
Kawashime, M. J. Johnson, K. Itakura, y R. B. Wallace [1981]
ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes,
D.D. Brown [ed.], Academic Press, Nueva York, 23: 683 -
693).
Los lavados se llevaron a cabo típicamente como
sigue:
(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15
minutos 1x SSPE, 0,1% SDS (lavado de rigurosidad baja).
(2) Una vez a la temperatura de hibridación
durante 15 minutos en 1 x SSPE, 0,1% de SDS (lavado de rigurosidad
moderada).
En general, la sal y/o temperatura se puede
alterar para cambiar la rigurosidad. Con un fragmento de ADN >
70 o aproximadamente bases de longitud, se pueden usar las
siguientes condiciones:
- Bajo:
- 1 ó 2 x SSPE, temperatura ambiente
- Bajo:
- 1 ó 2 x SSPE, 42ºC
- Moderado:
- 0.2 x ó 1 x SSPE, 65ºC
- Alto:
- 0,1 x SSPE, 65ºC.
La formación dúplex y estabilidad dependen de la
complementariedad sustancial entre las dos hebras de un híbrido y
dos hebras de un híbrido, y como se ha indicado anteriormente, se
puede tolerar un cierto grado de discordancia. Por lo tanto, las
secuencias de sonda como se ha descrito, incluyen mutaciones
(tanto individuales como múltiples), supresiones, inserciones de
las secuencias descritas, y sus combinaciones, en las que dichas
mutaciones, inserciones y supresiones permiten la formación de
híbridos estables con el polinucleótido diana de interés. Las
mutaciones, inserciones, y supresiones se pueden producir en una
secuencia de polinucleótido dada de muchas maneras, y estos
procedimientos se conocen por los expertos en la técnica. Otros
procedimientos se llegarán a conocer en el
futuro.
futuro.
Tecnología de la PCR: la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva,
enzimática, cebada de una secuencia de ácido nucleico. Este
procedimiento se conoce bien y se usa de manera común por los
expertos en la técnica (véanse Mullis, patentes de Estados Unidos
números 4,683.195, 4.683.202. y 4.800.159; Saiki, Randall K.,
Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry
A. Erlich, Norman Arnheim "Enzymatic Amplification of
\beta-Globin Genomic Sequences y Restriction Site
Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230: 1350
- 1354). Las reacciones de la PCR se basa en la amplificación
enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueado
por dos cebadores de oligonucleótidos que se hibridan con hebras
opuestas de la secuencia diana. Los cebadores se orientan con los
extremos 3 N que apuntan hacia otro. Los ciclos repetidos de
desnaturalización por calor del molde, la hibridación de los
cebadores con sus secuencias complementarias, y extensión de los
cebadores hibridazos con una ADn polimerasa da como resultado la
amplificación del segmento definido por los extremos 5 N de los
cebadores de la PCR. El producto de extensión de cada cebador puede
servir como un molde para el otro cebador, de este modo cada ciclo
esencialmente doble la cantidad de fragmento de ADN producido en el
ciclo anterior. Esto da como resultado la acumulación exponencial
de los fragmentos diana específicos, hasta varios millones de veces
en unas pocas horas. Mediante el uso de una ADN polimerasa
termoestable tal como Taq polimerasa, aislada de la bacteria
termófila Thermus aquaticus, el procedimiento de
amplificación se puede automatizar completamente. Otras enzimas que
se pueden usar son conocidas por los expertos en la técnica.
Las secuencias de ADN como se describen
en la invención presente se pueden usar como cebadores para la
amplificación por la PCR. En la realización de la amplificación por
PCR, se puede tolerar un cierto grado de discordancia entre cebador
y molde. Por lo tanto, las mutaciones, supresiones, e inserciones
(especialmente adiciones de nucleótidos al extremo 5 N) de los
cebadores ejemplificados caen dentro del ámbito de la invención
presente. Las mutaciones, inserciones y supresiones se pueden
producir en un cebador dado mediante procedimientos conocidos por
los expertos en la técnica.
Modificaciones de genes y toxinas. Los
genes y toxinas útiles de acuerdo con la invención presente no
incluyen solamente las secuencias de longitud completa
ejemplificadas específicamente, sino también porciones, segmentos
y/o fragmentos (que incluyen supresiones internas y/o terminales
comparadas con las moléculas de longitud completa) de estas
secuencias, variantes, mutantes, quiméricas, y sus fusiones. Por
ejemplo, toxinas de la invención presente se pueden usar en la
forma de toxinas quiméricas producidas por la combinación de
porciones de dos o más toxinas/proteínas.
Las proteínas de la invención presente pueden
tener aminoácidos sustituidos mientras puedan mantenerla actividad
pesticida/funcional característica de las proteínas ejemplificadas
de manera específica en el presente documento. Genes
"variantes" tienen secuencias de nucleótidos que codifican las
mismas toxinas o toxinas equivalentes que tienen actividad
pesticida equivalente con una proteína ejemplificada. Los términos
"proteínas variantes" y "toxinas equivalentes" se
refieren a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma
actividad biológica/funcional contra las plagas diana y secuencias
equivalentes que las toxinas ejemplificadas. Como se usa en el
presente documento, referencia a una secuencia "equivalente" se
refiere a secuencias que tienen sustituciones, supresiones,
adiciones, o inserciones de aminoácidos, que mejoran o no de manera
adversa a la actividad pesticida. Los fragmentos que retienen la
actividad pesticida también se incluyen en esta definición. Los
fragmentos y otros equivalentes que retienen la misma o similar
función, o "actividad de toxina", de un fragmento
correspondiente de una toxina están dentro del ámbito de la
invención presente. Se pueden realizar cambios, tales como
sustituciones o adiciones de aminoácidos para una diversidad de
propósitos, tal como incremento (o disminución) de la estabilidad
de proteasa de la proteína (sin disminución
materialmente/sustancialmente de la actividad funcional de la
toxina).
toxina).
Las toxinas equivalentes y/o genes que codifican
estas toxinas equivalentes se pueden obtener/derivar de bacterias
de tipo salvaje o recombinante y/o de otros microorganismos de tipo
salvaje o recombinante usando las enseñanzas proporcionadas en el
presente documento. Otras especies de Paenibacillus, por
ejemplo, se pueden usar como aislamientos de fuente.
Se pueden construir fácilmente variaciones de
genes usando técnicas convencionales para preparar mutaciones
puntuales, por ejemplo. Además, la patente de Estados Unidos Nº
5.605.793, por ejemplo, describe procedimientos para generar
diversidad molecular adicional mediante el uso de reensamblaje de
ADN después de la fragmentación al azar. Se pueden usar genes
variantes para producir proteínas variantes. Usando estas técnicas
de "recomposición de genes", se pueden construir genes y
proteínas equivalentes que comprenden cualesquiera 5, 10, ó 20
restos contiguos (aminoácidos o nucleótido) de cualquier secuencia
ejemplificada en el presente documento. Como conocen los expertos
en la técnica, la técnica de recomposición de genes se pueden
ajustar para que tengan, por ejemplo, 1,2,3,4,5,6,7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,
63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,
80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,
111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,
124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136,
137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149,
150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162,
163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175,
176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188,
189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,
202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214,
215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227,
228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240,
241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253,
254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266,
267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279,
280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292,
293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305,
306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318,
319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331,
332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344,
345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357,
358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370,
371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383,
384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396,
397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409,
410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422,
423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435,
436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448,
449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461,
462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474,
475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487,
488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ó 500 o
más restos contiguos (aminoácidos o nucleótido), correspondientes a
un segmento (del mismo tamaño) en cualquiera de las secuencias
ejemplificadas (o los complementos (complementos totales) de los
mismos). De manera similar segmentos ajustados de tamaño,
especialmente aquellos par alas regiones conservadas, también se
pueden usar como sondas y/o
cebadores.
cebadores.
Los fragmentos de los genes de longitud completa
se pueden preparar usando exonucleasas o endonucleasas disponibles
comercialmente de acuerdo con procedimientos convencionales. Por
ejemplo, enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al
sitio se pueden usar para cortar de manera sistemáticamente de los
extremos de los extremos de estos genes. También, los genes que
codifican fragmentos activos se pueden obtener usando una diversidad
de enzimas de restricción. Las proteasas se pueden usar para
obtener directamente fragmentos activos de estas
toxinas.
toxinas.
Está dentro del ámbito de la invención como se
describe en el presente documento que las toxinas pueden estar
truncadas y todavía mantener la actividad funcional. Por " toxina
truncada" se entiende que una porción de una proteína de toxina
se puede escindir y todavía mantener la actividad funcional después
de la escisión. La escisión se puede lograr mediante proteasas
dentro o fuera del intestino del insecto. Además, las proteínas
escindidas de manera efectiva se pueden producir usando técnicas de
biología molecular en las que las bases de ADN que codifican dicha
toxina se retiran o bien mediante digestión con endonucleasas de
restricción u otras técnicas disponibles por los expertos en la
técnica. Después del truncamiento, dichas proteínas se pueden
expresar en sistemas heterólogos tales como E. coli,
baculovirus, sistemas virales basados en plantas, levaduras y
similares y después se colocan en ensayos de insecto como se
describe en el presente documento para determinar la actividad. Se
conoce bien en la técnica que las toxinas truncadas se pueden
producir de manera exitosa de manera que retengan la actividad
funcional mientras que tienen menos que la secuencia entera, de
longitud completa. Se conoce bien en la técnica que las toxinas de
B.t. toxinas se pueden usar en forma truncada (toxina del núcleo).
Véase, por ejemplo, Adang et al., Gene 36: 289 - 300
(1985), "Characterized full-length y truncated
plasmid clones of the crystal protein of Bacillus
thuringiensis subsp kurstaki HD-73 and
their toxicity to Manduca sexta". Existen otros ejemplos
de proteínas truncadas que retienen la actividad insecticida,
incluyendo la hormona esterasa juvenil (Patente de Estados Unidos
nº 5.674.485 de los Regenets de la Universidad de California). Como
se usa en el presente documento, el término "toxina" también
quiere decir que incluye truncamientos funcionalmente activos.
Ciertas toxinas de la invención presente se han
ejemplificado de manera específica en el presente documento
mediante la SEQ ID No. 13, y 41. Debe ser fácilmente evidente
que la invención presente comprende toxinas variantes o
equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican toxinas
equivalentes) que tienen la misma o similar actividad pesticida de
la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán similitud
(y/ o homología) de aminoácidos con una toxina ejemplificada. La
identidad de aminoácidos típicamente será mayor que 60%,
preferiblemente mayor que 75%, más preferiblemente mayor que 80%,
incluso más preferiblemente mayor que 90%, y puede ser mayor que
95%. Los polinucleótidos y proteínas preferidos la invención
presente también se pueden definir en términos de identidad más
particular y/o intervalos de similitud. Por ejemplo, la identidad
y/o similitud puede ser 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,
60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, ó 99% cuando se compara con una secuencia
ejemplificada en el presente documento. Salvo que se especifique de
otra manera, como se usan en el presente documento porcentaje de
identidad y/o similitud de secuencia de dos ácidos nucleicos se
determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264 - 2268, modificado en Karlin y
Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 - 5877. Tal
algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul
et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 402 - 410. Las
investigaciones de nucleótidos de BLAST se realizan con el programa
NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabras = 12. Para obtener
las alineaciones de huecos para propósitos de comparación, se usa,
Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997),
Nucl. Acids Res. 25: 3389 - 3402. Cuando se utilizan los programas
BLAST y Gapped BLAST, se usan los parámetros por defecto de los
programas respectivos (NBLAST y XBLAST). Véase la página web
de NCBI/NIH. Las puntuaciones también se pueden calcular usando
los procedimientos y algoritmos de Crickmore et al. Como se
describe en la sección de antecedentes,
anteriormente.
anteriormente.
La homología/similitud/identidad serán las
mayores en las regiones críticas de la toxina que son responsables
de la actividad biológica o están implicadas en la determinación de
la configuración de tres dimensiones que es por último responsable
de la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones de
aminoácidos son aceptables y se puede esperar que sean toleradas.
Por ejemplo, estas sustituciones pueden estar en regiones de la
proteína que no son críticas para la actividad. El análisis de la
estructura cristalina de una proteína, y modelado de la estructura
de proteína basada en software, se pueden usar para identificar
regiones de una proteína que se puede modificar (usando la
mutagénesis dirigida al sitio, recomposición, etc.) para cambiar de
manera real las propiedades y/o incrementar la funcionalidad de la
proteína.
También se pueden cambiar diversas propiedades y
características de 3 D diana de la proteína sin afectar de manera
adversa la actividad/funcionalidad de la proteína. Las
sustituciones de aminoácidos conservadas se puede esperar que sean
toleradas/no afectar de manera adversa la configuración de tres
dimensiones de la molécula. Los aminoácidos se pueden situar en las
siguientes clases: no-polar, polar sin carga,
básico, y ácido. Las sustituciones conservadoras por las cuales un
aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido del mismo
tipo cae dentro del ámbito de la invención presente mientras que la
sustitución no sea adversa a la actividad biológica del compuesto.
La Tabla 1 proporciona un listado de ejemplos de de aminoácidos que
pertenece a cada clase.
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En algunos casos, también se pueden hacer
sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas
sustituciones no deben disminuir de manera significativa de la
actividad funcional/actividad biológica de la toxina.
Como se usa en el presente documento, referencia
a polinucleótidos "aislados" y/o toxinas "purificadas" se
refiere a estas moléculas cuando no están asociadas con las otras
moléculas con la que se unirían en la naturaleza. De este modo, la
referencia a "aislado" y/o "purificado" significa la
implicación de la "mano del hombre" como se describe en el
presente documento. Por ejemplo, un "gen" de toxina bacteriano
de la invención presente puesto en una planta para la expresión es
un "polinucleótido aislado". Del mismo modo, una proteína de
Paenibacillus, ejemplificada en el presente documento,
producido por una planta es una "proteína aislada".
Debido a la degeneración/redundancia del código
genético, una diversidad de secuencias diferentes de ADN se pueden
codificar las secuencias de aminoácidos descritas en el presente
documento. Los expertos en la técnica saben bien crear secuencias d
ADN alternativas que codifican la misma o esencialmente las mismas
toxinas. Se describen estas secuencias variantes de ADN.
Optimización de secuencia para la expresión
en plantas. Para obtener una alta expresión de genes heterólogos
en plantas se puede preferir volver a modificar por ingeniería
genética dichos genes de manera que se expresen de manera más
eficaz en (el citoplasma de) células de plantas. El maíz es una de
tales plantas donde puede ser preferible volver a diseñar
el(los) gen(es) heterólogo(s) antes de la
transformación para incrementar su nivel de expresión en dicha
planta. Por lo tanto, una etapa adicional en el diseño de genes que
codifican una toxina bacteriana se vuelve a modificar por
ingeniaría genética de un gen heterólogo para la expresión
óptima.
Una razón para volver a modificar por ingeniería
genética una toxina bacteriana para la expresión en maíz se debe al
contenido de G+C no óptimo del gen nativo. Por ejemplo, el muy bajo
contenido de G+C de muchos genes bacterianos nativos (y posterior
sesgado hacia alto contenido de A+T) da como resultado la
generación de secuencias que imitan o duplican las secuencias de
control de genes de plantas que se conocen que son altamente ricas
en A+T. La presencia de algunas secuencias ricas en A+T con
el(los) gen(es) de ADN introducidos en plantas
(por ejemplo, regiones de casillas TATA que se encuentran
normalmente en los promotores de genes) puede dar como resultado la
transcripción aberrante del(de los) gen(es). Por otra
parte, la presencia de otras secuencias reguladoras que residen en
el ARNm trascrito (por ejemplo, secuencias de señal
depoliadenilación (AAUAAA), o secuencias complementarias con los
ARN nucleares pequeños implicados en el ayuste de preARNm) puede
conducir a la inestabilidad de ARN. Por lo tanto, un objetivo en el
diseño de genes que codifican una toxina bacteriana para la
expresión de maíz, más preferiblemente denominado como
gen(es) optimizados de plantas, es generar una secuencia de
ADN que tiene un contenido de G+C mayor, y preferiblemente uno
cercano a los genes de maíz que codifican enzimas metabólicas. Otro
objetivo en el diseño del gen(es) optimizado(s) de
plantas que codifican una toxina bacteriana es para generar una
secuencia de ADN en el que las modificaciones de secuencia no
impiden la
traducción.
traducción.
La Tabla a continuación (Tabla 2) cómo de alto
es el contenido de G+C en maíz. Para los datos en la Tabla 2, que
codifican las regiones de los genes se extrajeron de las entradas
del GenBank (Liberación 71), y composiciones de base se calcularon
usando el programa MacVector.TM. (IBI, New Haven, Conn.). Las
secuencias de intrones se ignoraron en los cálculos.
Debido a la plasticidad producida por la
redundancia/degeneración del código genético (es decir, algunos
aminoácidos se especifican por más de un codón), evolución de los
genomas en organismos o clases diferentes de organismos ha dado
como resultado un uso diferencial de codones redundantes. Esta
"desviación de codón" se refleja en la composición de base
media de regiones que codifican proteínas. Por ejemplo, organismos
con contenidos relativamente bajos de G+C utilizan codones que
tienen A o T en la tercera posición de codones redundantes,
mientras que los que tienen contenidos de G+C mayores utilizan
codones que tienen G o C en la tercera posición. Se cree que la
presencia de codones "menores " dentro de un ARNm puede reducir
la velocidad de traducción absoluta de ese ARNm, especialmente
cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que corresponde al
menor codón es baja. Una extensión de esto es que la disminución de
la velocidad de traducción por codones menores individuales sería
al menos aditivo para codones múltiples. Por lo tanto, los ARNm que
tienen altos contenidos relativos de codones menores tendrían
velocidades de traducción relativamente bajas. Esta velocidad se
reflejaría mediante bajos niveles posteriores de la proteína
codificada.
En la remodificación por ingeniería genética de
los genes que codifican una toxina bacteriana para la expresión en
maíz (u otra planta, tal como algodón o soja), se ha determinado la
desviación del codón de la planta. La desviación del codón para
maíz es la distribución del codón estadística que usa la planta para
codificar sus proteínas y el uso de codón preferido se muestra en
la Tabla 3. Después de determinar la desviación, se determina el
porcentaje de frecuencia de los codones en el gen(es) de
interés. Los codones primarios preferidos por la planta se debe
determinar así como la segunda y tercera elección de los codones
preferidos. Después de esto, la secuencia de aminoácidos de la
toxina bacteriana de interés se traslada de manera inversa de manera
que la secuencia de ácido nucleico resultante codifica exactamente
la misma proteína que el gen nativo que se desea que se exprese de
manera heteróloga. La nueva secuencia de ADN se diseña usando la
información de desviación de codón de manera que corresponda a la
mayoría de los codones preferidos de la planta deseada. La nueva
secuencia se analiza después para determinar los sitios de enzimas
de restricción que se pudieran haber creado por la modificación.
Los sitios identificados se modifican además reemplazando los
codones con la segunda o tercera elección preferida de codones.
Otros sitios en la secuencia que podrían afectar a la transcripción
o traducción del gen de interés son las uniones exón : intrón (5' ó
3'), señales de adición de poli A, o señales de terminación de la
ARN polimerasa. Además se analiza y modifica la secuencia para
reducir la frecuencia de dobletes TA o GC. Además de los dobletes,
los bloques de secuencia G o C que tienen más que aproximadamente
cuatro restos que son el mismo pueden afectar a la transcripción de
las secuencias. Por lo tanto, estos bloques también se modifican
reemplazando los codones de la primera o segunda elección, etc.,
con el siguiente codón preferido de elección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefiere que el(los) gen(es)
que codifica(n) una toxina bacteriana contenga(n)
aproximadamente 63% de la primera elección de codones, entre
aproximadamente 22% y aproximadamente 37% de la segunda elección de
codones, y entre aproximadamente 15% y aproximadamente 0% de la
tercera elección de codones, donde el porcentaje total es 100%. Los
más preferido es que el(los) gen(es) contengan
aproximadamente 63% de la primera elección de codones, al menos
aproximadamente 22% de la segunda elección de codones,
aproximadamente 7.5% de la tercera elección de codones, y
aproximadamente 7,5% de la cuarta elección de codones, donde el
porcentaje total es 100%. El uso del codón preferido para la
modificación por ingeniería genética de los genes para la expresión
en maíz se muestra en la Tabla 3. El procedimiento descrito
anteriormente permite a los expertos en la técnica modificar
el(los) gen(es) que son extraños para una planta
particular de manera que los genes se expresan de manera óptima en
plantas. El procedimiento además se ilustra en la solicitud PCT WO
97/13402.
Con el fin de diseñar los genes optimizados de
plantas que codifican una toxina bacteriana, la secuencia de
aminoácidos de dicha proteína se traduce de manera inversa en una
secuencia de ADN que utiliza un código genético no reducido de una
tabla de desviación de codón para las secuencias de genes para la
planta particular, como se muestra en la Tabla 2. La secuencia de
ADN resultante, que es completamente homogénea en el uso de codón,
se modifica además para establecer una secuencia de ADN que, además
de tener un grado mayor de diversidad de codón, también contiene
sitios de reconocimiento de enzimas colocados de manera estratégica,
deseable composición de bases, y una carencia de las secuencias que
podrían interferir en la transcripción del gen, o traducción del
ARNm
producto.
producto.
\vskip1.000000\baselineskip
De este modo, los genes sintéticos que son
funcionalmente equivalentes a las toxinas de la invención presente
se pueden usar para transformar huéspedes, incluyendo plantas. La
guía adicional con relación a la producción de los genes sintéticos
se pueden encontrar, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº
5.380.831.
En algunos casos, especialmente durante la
expresión en plantas, puede ser ventajoso usar genes truncados que
expresan proteínas truncadas. Höfte et al. 1989, por ejemplo,
descrito en la sección de antecedentes anteriormente, describían
segmentos de protoxina y toxina de núcleo de las toxinas de
B.t. Los genes truncados preferidos codificarán
típicamente 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, S0, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,
88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% de la toxina de
longitud completa.
\newpage
Huéspedes transgénicos. Los genes que
codifican toxinas como se describe se pueden introducir en
una amplia diversidad de huéspedes microbianos o de plantas. En las
realizaciones preferidas, se usan las células de las plantas
transgénicas y plantas. Las plantas preferidas (y células de
plantas) son avena, maíz y algodón.
En las realizaciones preferidas, la expresión de
un gen de toxina da como resultado, directa o indirectamente, la
producción intracelular (y mantenimiento) de las proteínas
pesticidas. Las plantas se pueden hacer resistentes a insectos de
esta manera. Cuando, las células huésped
transgénicas/recombinantes/transformadas/transfectadas (o sus
contenidos) se ingieren por las plagas, las plagas ingerirán las
toxinas. Esta es la manera preferida que provoca el contacto de la
plaga con la toxina. El resultado es el control (muerte o que
enferme) de la plaga. Las plagas chupadoras también se pueden
controlar de una manera similar. Como alternativa, se pueden
aplicar huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo
Pseudomonas tal como P. fluorescens, se pueden
aplicar cuando las plagas diana están presentes, los microbios
pueden proliferar ahí, y se ingieren por las plagas diana. El
microbio que alberga el gen de toxina se puede tratar en condiciones
que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La
célula tratada, que mantiene la actividad tóxica, se puede aplicar
después al ambiente de la plaga diana.
Cuando el gen de toxina se introduce mediante un
vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped se aplica
al ambiente en un estado vivo, se deben usar ciertos microbios
huésped. Los huéspedes de microorganismos se seleccionan para que
ocupen la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera, y/o
rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos
se seleccionan de manera que sean capaces de de competir de manera
exitosa en el ambiente particular (hábitat de cultivos y otros
insectos) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionan el
mantenimiento y expresión estable del gen que expresa el polipéptido
pesticida, y, de manera deseable, proporcionan una mejora en la
protección del pesticida de la degradación e inactivación
ambiental.
Se conocen un gran número de microorganismos que
inhabilitan el filoplano (la superficie de las hojas de las
plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de la
planta) de una diversidad amplia de cultivos importantes. Estos
microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De particular
interés son los microorganismos, tales como bacterias, por
ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia,
Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium,
Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter,
Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y
Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por
ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus,
Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y
Aureobasidium. De particular interés son especies de
bacterias de fitosfera tales como Pseudomonas syringae,
Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum,
Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas
campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter
vinlandii; y especies de levadura de fotosfera tales como
Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca,
Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces
rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S.
odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans.
También de interés son los microorganismo pigmentados.
Inserción de genes para formar huéspedes
transgénicos. Se describe la transformación/infección de
plantas, células de plantas y otras células huésped con
polinucleótidos como se describe que expresa proteínas de la
invención presente. Las plantas transformadas de esta manera se
pueden volver resistentes al ataque de la(s) plaga(s)
diana(s).
Están disponibles una diversidad de
procedimientos para introducir un gen que codifica una proteína
pesticida en el huésped diana en condiciones que permiten el
mantenimiento estable y una expresión del gen. Estos procedimientos
son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen,
por ejemplo, in Patente de Estados Unidos Nº 5.135.867.
Por ejemplo, un gran número de vectores de
clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli
y un marcador que permite la selección de de las células
transformadas están disponibles para la preparación de la inserción
de genes extraños en las plantas superiores. Los vectores
comprenden, por ejemplo, la serie pBR322, pUC, serie M13mp,
pACYC184, etc. De acuerdo con lo anterior, la secuencia que codifica
la toxina se puede insertar en el vector en un sitio de restricción
adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación en
E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un
medio nutriente adecuado, después se cosechan y se lisan. Se
recupera el plásmido. El análisis de secuencia, análisis de
restricción, electroforesis, y otros procedimientos bioquímicos -
moleculares - biológicos se llevan a cabo en general como
procedimientos de análisis. Después de cada manipulación, la
secuencia de ADN usada se puede escindir y unir a la siguiente
secuencia de AND. Cada secuencia de plásmido se puede clonar en el
mismo u otro plásmido. Dependiendo del procedimiento de inserción
de los genes deseados en la planta, otras secuencias de ADN pueden
ser necesarias. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se usa para la
transformación de la célula de plantas, entonces al menos el borde
derecho, pero a menudo el borde derecho y el izquierdo del
T-ADN del plásmido Ti o Ri, tiene que unirse a la
región flanqueante de los genes a insertar. El uso de
T-ADN para la transformación de de las células de
plantas se ha vuelto a investigar y descrito de manera intensiva en
el documento EP 120 516; Hoekema (1985) en: The Binary Plant Vector
System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam,
capítulo 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1 - 46;
y An et al. (1985) EMBO J. 4:277 - 287.
Están disponibles un gran número de técnicas
para insertar el ADN en una célula huésped de plantas. Aquellas
técnicas incluyen la transformación con T-ADN que
usa Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección,
biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación así
como otros procedimientos posibles. Si se usan Agrobacteria
para la transformación, el ADN a insertar tiene que clonarse en
plásmidos especiales, a saber o bien en un vector intermedio o en un
vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el
plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga debido a las
secuencias que son homólogas a las secuencias en el
T-ADN. El plásmido Ti o Ri también comprende la
región vir necesaria para la transferencia del
T-ADN. Los vectores intermedios no se pueden
replicar ellos mismos en Agrobacteria. El vector intermedio
se puede transferir en Agrobacterium tumefaciens mediante un
plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios se pueden
replicar ellos mismos tanto en E. coli como en
Agrobacteria. Comprenden un gen marcador de selección y un
engarce o poliengarce que se encuadran mediante las regiones de
borde de T-ADN derecha e izquierda. Se pueden
transformar directamente en Agrobacteria (Holsters et
al. [1978] Mol. Gen. Genet. 163: 181 - 187). El
Agrobacterium usado como célula huésped es para comprender
un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria
para la transferencia del T-ADN en la célula
vegetal. Puede estar contenido T-ADN adicional. La
bacteria así transformada se usa para la transformación de células
vegetales. Los explantes de plantas se pueden cultivar de manera
ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal.
Después las plantas enteras se pueden regenerar a partir de material
vegetal infectado (por ejemplo, partes de hoja, segmentos de tallo,
raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en
suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o
biocidas para selección. Las plantas así obtenida se pueden después
ensayar para determinar la presencia del ADN insertado. No se
realiza ninguna demanda especial de los plásmidos en el caso de
inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos ordinarios,
tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
Las células transformadas crecen en el interior
de las plantas de la manera usual. Pueden formar células germinales
y transmitir el(los) carácter(es) a las plantas de
progenie. Tales plantas se pueden desarrollar de la manera normal y
cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios
transformados u otros factores hereditarios. Los individuos
híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas
correspondientes.
Los genes que codifican la toxina bacteriana se
pueden expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en
el genoma de plantas. Preferiblemente, dichas unidades de
transcripción son vectores recombinantes capaces de la integración
estable en el genoma de plantas y permitir la selección de líneas
vegetales transformadas que expresan ARNm que codifican las
proteínas.
Una vez que se ha integrado el ADN insertado en
el genoma, es relativamente estable ahí (y no sale de nuevo).
Normalmente contiene un marcador de selección que confiere a las
células de plantas transformadas resistencia a un biocida o un
antibiótico, tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o
cloranfenicol, inter alia. El marcador empleado
individualmente debe de acuerdo con lo anterior permitir la
selección de células transformadas en lugar de las células que no
contienen el ADN insertado. El(los) gen(es) de interés
se expresan preferiblemente o bien mediante promotores
constitutivos o inducibles en la célula vegetal. Una vez que se ha
expresado, el ARNm se traduce en proteínas, incorporando por lo
tanto los aminoácidos de interés en la proteína. Los genes que
codifican una toxina expresada en las células vegetales puede estar
bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor específico
de tejido, o un promotor inducible.
Existen varias técnicas para introducir vectores
recombinantes extraños en las células vegetales, y para obtener
plantas que mantienen y se expresan de manera estable el gen
introducido (Patentes de Estados Unidos Números 4.945,050 de
Cornell y 5.141.131 de DowElanco, ahora Dow AgroSciences, LLC).
Además, las plantas se pueden transformar usando tecnología de
Agrobacterium, véase Patente de Estados Unidos Nº
5.177.010 de La Universidad de Toledo; 5.104.310 de Texas A&M;
Solicitud de Patente Europea 0131624B1; Solicitud de Patente
Europea 120516, 159418B1 y 176.112 de Schilperoot; Patentes de
Estados Unidos Números 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940,838
y 4.693,976 de Schilperoot; Solicitudes de Patente Europea 116718,
290799, 320500 todas de Max Planck; Solicitudes de Patente Europea
604662 y 627752, y Patente de Estados Unidos Nº 5.591.616, de Japan
Tobacco; Solicitudes de Patente Europea 0267159 y 0292435, y Patente
de Estados Unidos Nº 5.231.019, todas de Ciba Geigy, ahora
Novartis; Patentes de Estados Unidos Números 5.463.174 y 4.762.785,
ambas de Calgene; y Patentes de Estados Unidos Números 5.004.863 y
5.159.135, ambas de Agracetus. Otra tecnología de transformación
incluye la tecnología de patillas. Véase Patentes de Estados
Unidos Números 5.302.523 y 5.464.765, ambas de Zeneca. También se
ha usado tecnología de electroporación para transformar plantas.
Véase el documento WO 87/06614 del Instituto Boyce Thompson;
Patentes de Estados Unidos Números 5.472.869 y 5.384.253, ambas de
Dekalb; y el documento WO 92/09696 y WO 93/21335, ambos de Plant
Genetic Systems. Además, también se pueden usar vectores virales
para producir plantas transgénicas que expresan la proteína de
interés. Por ejemplo, se pueden transformar plantas
monocotiledóneas con un vector viral usando los procedimientos
descritos en las Patentes de Estados Unidos Números 5.569.597 de
Mycogen Plant Science y Ciba-Giegy, ahora Novartis,
así como las Patentes de Estados Unidos Números 5.589.367 y
5.316.931, ambas de Biosource.
Como se ha mencionado anteriormente, la manera
en la que la construcción de ADN se introduce en la planta huésped
no es crítica. Se puede emplear cualquier procedimiento que
proporcione la transformación eficaz. Por ejemplo, se describen en
el presente documento varios procedimientos para la transformación
de células de plantas e incluyen el uso de plásmidos Ti o Ri y
similares para realizar la transformación mediada por
Agrobacterium. En muchos casos, será deseable que tengan la
construcción usada para la transformación que bordea uno o ambos
lados por bordes de T-ADN, más específicamente el
borde derecho. Esto es particularmente útil cuando la construcción
usa Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes como un modo de transformación, aunque los bordes de
T-ADN pueden encontrar uso con otros modos de
transformación. Cuando se usa Agrobacterium para la
transformación de células vegetales, se puede usar un vector que se
puede introducir en el huésped para la recombinación homóloga con
T-ADN o el plásmido Ti o Ri presente en el huésped.
La introducción del vector se puede realizar mediante
electroporación, emparejamiento tri-parental y otras
técnicas para transformar las bacterias
gram-negativas que con conocidas por los expertos en
la técnica. El medio del vector de transformación en el huésped de
Agrobacterium no es crítico. El plásmido de Ti o Ri que
contiene el T-ADN para recombinación puede ser capaz
de o incapaz de provocar la formación de agallas, y no es crítico
mientras que los genes vir estén presentes en dicho huésped.
En algunos casos cuando se usa
Agrobacterium para la transformación, la construcción de la
expresión que está dentro de los bordes de T-ADN se
insertará en un vector de alto espectro tal como pRK2 o sus
derivados como se describe en Ditta et al., (PNAS USA (1980)
77: 7347 - 7351 y EPO 0 120 515, que se incorporan en el presente
documento por referencia. Incluidos dentro de la construcción de
expresión y el T-ADN estará uno o más marcadores
como se describe en el presente documento que permite la selección
de Agrobacterium transformado y células vegetales
transformadas. El marcador particular empleado no es esencial,
dependiendo del marcador preferido del huésped y construcción
usados.
Para la transformación de células vegetales que
usan Agrobacterium, se pueden combinar explantes e incubar
con el Agrobacterium transformado durante tiempo suficiente
para permitir su transformación. Después de la transformación, los
Agrobacteria se matan mediante selección con el antibiótico
apropiado y las células vegetales se cultivan con el medio
selectivo apropiado. una vez que se forman callos, la formación de
brotes se puede estimular empleando las hormonas de plantas
apropiadas de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en la
técnica de cultivo de tejidos de plantas y regeneración de plantas.
Sin embargo, una fase intermedia de callo no es siempre necesario.
Después de la formación de brotes, dichas plantas vegetales se
pueden transferir al medio que estimula la formación de raíces
completando por lo tanto la regeneración de plantas. Después las
plantas se pueden cultivar hasta semilla y dicha semilla se pueden
usar en el establecimiento de generaciones futuras.
Independientemente de la técnica de transformación, el gen que
codifica una toxina de bacteria se incorpora de manera preferible
en un vector de transferencia de genes adaptado para expresar dicho
gen en una célula vegetal incluyendo en el vector un elemento
regulador de promotor de plantas, así como regiones de terminación
de la transcripción no traducida en 3' tal como Nos y
similares.
similares.
Además de las numerosas tecnologías para la
transformación de plantas, el tipo de tejido que se pone en
contacto con los genes extraños puede variar también. Tal tejido
incluiría pero no se limitaría a tejido embriogénico, tejido de
callo tipos I, II, y III, hipocotilo, meristemo, tejido radicular,
tejidos para la expresión en el floema, y similares. Casi todos los
tejidos de plantas se pueden transformar mediante la
dediferenciación usando técnicas apropiadas descritas en el
presente documento.
Como se ha mencionado anteriormente, se puede
usar una diversidad de marcadores que se pueden seleccionar, si se
desea. La preferencia de un marcador está a la discreción del
experto en la técnica, pero cualquiera de los marcadores que se
puede seleccionar se puede usar junto con cualquier otra otro gen no
enumerado en el presente documento que podría funcionar como un
marcador que se puede seleccionar. Tales marcadores que se pueden
seleccionar incluyen pero no se limitan a gen de aminoglicósido
fosfotransferasa de transposón Tn5 (Aph II) que codifica la
resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y G418, así
como aquellos genes que codifican la resistencia o tolerancia a los
herbicidas glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina
(bialafos); imidazolinonas, sulfonilureas y triazolopirimidina,
tales como clorsulfuron; bromoxinil, dalapon y similares.
Además de un marcador que se puede seleccionar,
puede ser deseable usar un gen indicador. En algunos casos se puede
usar un gen indicador con o sin un marcador que se puede
seleccionar. Los genes indicadores son genes que típicamente no
están presentes en el organismo o tejido receptor y típicamente
codifican proteínas que dan como resultado algún cambio fenotípico
o propiedad enzimática. Los ejemplos de tales genes se proporcionan
en K. Wising et al. Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988). Los
genes indicadores preferidos incluyen la
beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de
E. coli, el gen de cloramfenicol acetil transferasa de Tn9 de
E. coli, la proteína verde fluorescente de la medusa
bioluminiscente Aequorea victoria, y los genes de luciferasa
de la luciérnaga Photinus pyralis. Un ensayo para detectarla
expresión del gen indicador se puede después realizar en un tiempo
adecuado después de que dicho se haya introducido en las células
receptoras. Uno de tales ensayos preferidos supone el uso del gen
que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus
uidA de E. coli como describe Jefferson et
al., (1987 Biochem. Soc. Trans. 15, 17 - 19) para identificar
células transformadas.
Además de los elementos reguladores de los
promotores de plantas, los elementos reguladores de los promotores
de una diversidad de fuentes se pueden usar de manera eficaz en
células vegetales para expresar los genes extraños. Por ejemplo,
los elementos reguladores de los promotores de origen bacteriano,
tales como el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina
sintasa, el promotor de mannopina sintasa; promotores de origen
viral, tal como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S),
35T (que es un promotor remodificado por ingeniería genética 35S,
véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.166.302,
especialmente el ejemplo 7E) y similares se pueden usar. Los
elementos reguladores del promotor de plantas incluyen pero no se
limitan a la subunidad pequeña de
ribulosa-1,6-bisfosfato (RUBP)
carboxilasa (ssu), promotor de beta-conglicinin,
promotor de beta-faseolin, promotor de ADH,
promotores de choque térmico, y promotores específicos de tejidos.
Otros elementos tales como regiones de unión a matriz, regiones de
unión a andamio, intrones, potenciadores, secuencias de
poliadenilación y similares pueden estar presentes y de este modo,
pueden mejorar la eficacia de transcripción o integración de ADN.
Tales elementos pueden o no pueden ser necesarios para la función
del ADN, aunque pueden proporcionar una mejor expresión o
funcionamiento del ADN afectando a la transcripción, estabilidad de
ARNm, y similares. Tales elementos pueden estar incluidos en el ADN
según se desee para obtener la realización óptima del ADN
transformado en la planta. Los elementos típicos incluyen pero no se
limitan a Adh-intrón 1, Adhintrón 6, la secuencia
guía de la proteína de revestimiento del virus del mosaico de la
alfalfa, la secuencia guía de la proteína de revestimiento del virus
del rayado de maíz, así como otros disponibles por los expertos en
la técnica. Los elementos reguladores de los promotores
constitutivos también se pueden usar por lo tanto dirigiendo la
expresión del gen continuo en todos los tipos de células y en todos
los momentos (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S, y
similares). Los elementos reguladores de los promotores específicos
de tejidos son responsables de la expresión génica en tipos de
células o tejidos específicos, tales como hojas o semillas (por
ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y
éstos también se pueden usar.
Los elementos reguladores de los promotores
también pueden ser activos durante una cierta fase del desarrollo
de las plantas así como activos en tejidos y órganos de plantas. Los
ejemplos de tales incluyen pero no se limitan a elementos
reguladores de los promotores específicos de polen, específicos de
embrión, específicos de seda de maíz, específicos de fibra de
algodón, específicos de raíces, específicos de endospermo de semilla
y similares. En ciertas circunstancias puede ser deseable usar un
elemento regulador de los promotores, que es responsable de la
expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como un
estímulo físico (genes de choque térmico), luz (RUBP carboxilasa),
hormona (Em), metabolitos, compuesto químico, y estrés. Se pueden
usar otros elementos de transcripción y traducción deseables que
funcionan en plantas. Se conocen en la técnica numerosos vectores
de transferencia de genes específicos de plantas.
Se pueden usar técnicas de biología molecular
para clonar y secuenciar las toxinas descritas en el presente
documento. Se puede encontrar información adicional en Sambrook, J.,
Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, que se incorpora en el
presente documento por
referencia.
referencia.
Manejo de resistencia. Con el incremento
del uso comercial de proteínas insecticidas en plantas transgénicas,
una consideración es el manejo de la resistencia. Esto es, existen
numerosas compañías que usan toxinas de Bacillus
thuringiensis en sus productos, y existe un asunto sobre
insectos que desarrollan resistencia a toxinas de
B.t.. Una estrategia para el manejo de la resistencia
sería combinar las toxinas de TC toxinas producidas por
Xenorhabdus, Photorhabdus, y similares con las toxinas tales
como B.t., toxinas cristalinas, proteínas
insecticidas solubles de cepas de Bacillus (véase, por
ejemplo, los documentosWO98/18932 y WO99/57282), u otras
toxinas de insectos. Las combinaciones se pueden formular para una
aplicación pulverizable o pueden ser combinaciones moleculares. Las
plantas se pueden transformar con genes bacterianos que producen
dos o más toxinas de insecto diferentes (véase, por ejemplo,
Gould, 38 Bioscience 26 - 33 (1988) y La patente de Estados Unidos
Nº 5.500.365; del mismo modo, la solicitud de patente europea 0 400
246 A1 y las patentes de Estados Unidos números 5.866.784;
5.908.970; y 6.172.281 también describen la transformación de una
planta con dos toxinas cristalinas de B.t.). Otro
procedimiento de producción de una planta transgénica que contiene
más de un gen de resistencia a insecto sería primero producir dos
plantas, conteniendo cada planta un gen de resistencia a insectos
gene. Estas plantas se pueden después cruzar usando las técnicas de
mejora de plantas tradicionales para producir una planta que
contiene más de un gen de resistencia a insecto. De este modo, debe
ser evidente que la frase "que comprende un polinucleótido"
como se usan en el presente documento significa al menos un
polinucleótido (y posiblemente más, contiguo o no) salvo que se
indique específicamente de otra
manera.
manera.
Formulaciones y otros sistemas de
distribución. Los gránulos de cebo formulados que contienen
esporas y/o cristales del aislamiento sujeto de
Paenibacillus, o microbios recombinantes que comprenden los
genes que se pueden obtener a partir del aislamiento descrito en el
presente documento, se pueden aplicar al suelo. El producto
formulado también se puede aplicar en forma de un recubrimiento de
semilla o tratamiento de raíz o tratamiento de planta total en las
fases tardías del ciclo de cultivo. Los tratamientos de planta y
suelo de células se pueden emplear en forma de polvos o gránulos o
polvos humectables, mezclando con diversos materiales inertes,
tales como minerales orgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos,
fosfatos, y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en
polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez, y similares). Las
formulaciones pueden incluir adyuvantes de dispersión - adherencia,
agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas, o tensioactivos.
Las formulaciones líquidas pueden ser en base acuosa o no acuosa y
emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados
emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes
reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes, o
polímeros.
Como apreciarán los expertos en la técnica, la
concentración de pesticida variará ampliamente dependiendo de la
naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un
concentrado o se va a usar directamente. El pesticida estará
presente en al menos 1% en peso y puede ser un 100% en peso. Las
formulaciones secas tendrán entre aproximadamente 1 - 95% en peso
del pesticida mientras que las formulaciones líquidas en general
estarán entre aproximadamente 1 - 60% en peso de los sólidos en la
fase líquida. Las formulaciones en general tendrán entre
aproximadamente 10^{2} y aproximadamente 10^{4} células/mg.
Estas formulaciones se administrarán a aproximadamente 50 mg
(líquido o seco) hasta 1 kg o más por hectárea.
Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente
de la plaga, por ejemplo, suelo y follaje, mediante
pulverización espolvoreado, rociado, o similares.
Otro esquema de distribución es la incorporación
del material genético de las toxinas en un vector de baculovirus.
Los baculovirus infectan huéspedes de insectos particulares,
incluyendo los dirigidos de manera deseable con las toxinas. Los
baculovirus infecciosos que albergan una construcción de expresión
para las toxinas se pueden introducir en áreas de infestación de
insectos para intoxicar por lo tanto o envenenar insectos
infectados.
Los virus de insectos, o baculovirus, se sabe
que infectan y afectan de manera inversa ciertos insectos. La
afectación de los virus o insectos es lenta, y los virus no detienen
inmediatamente la alimentación de insectos. De este modo, los virus
no se contemplan que sean óptimos como agentes de control de plagas
de insectos. Sin embargo, la combinación de los genes de toxinas en
un vector de baculovirus puede proporcionar una forma eficaz de de
transmitir las toxinas. Además, ya que diferentes baculovirus son
específicos para diferentes insectos, puede ser posible usar una
toxina particular para dirigir de manera selectiva particularmente
dañando las plagas de insectos. Un vector particularmente útil
para los genes de toxinas es el virus de polihedrosis nuclear. Los
vectores de transferencia que usan este virus se han descrito y son
ahora los vectores de elección para transferir genes extraños a
insectos. El recombinante del gen de la toxina de virus se puede
construir en una forma que se puede transmitir por vía oral. Los
baculovirus normalmente infectan las víctimas de insectos a través
de la mucosa intestinal del intestino medio. El gen de la toxina
insertado detrás de un promotor de la proteína de recubrimiento
viral fuerte se expresaría y debe matar rápidamente el insecto
infectado.
Además de un virus o baculovirus de insecto o
sistema de distribución de plantas par alas toxinas de las proteínas
de la presente invención, las proteínas se pueden encapsular usando
la tecnología de encapsulación de Bacillus thuringiensis tal
como pero no limitada a las Patentes de Estados Unidos números
4.695.455; 4.695.462; 4.861.595 que se incorporan todas en el
presente documento por referencia. Otro sistema de distribución para
las toxinas de proteínas de la presente invención es la
formulación de la proteína en una matriz de cebo, que después se
puede usar encima y debajo de las estaciones de cebo de insectos
molido. Los ejemplos de tal tecnología incluyen pero no se limitan
a la solicitud de patente PCT WO 93/23998, que se incorpora en el
presente documento por
referencia.
referencia.
Los sistemas basados en virus de ARN de plantas
también se pueden usar para expresar toxina bacteriana. Haciendo
esto, el gen que codifica una toxina se puede insertar en la región
del promotor de recubrimiento que infectará la planta huésped de
interés. La toxina se puede expresar después proporcionando de esta
manera la protección de la planta del daño de insecto. Los sistemas
basados en virus de ARN de plantas se describen en las Patentes de
Estados Unidos números 5.500.360 de Mycogen Plant Sciences, Inc. y
las Patentes de Estados Unidos números 5.316.931 y 5.589.367 de
Biosource Genetics Corp.
Además de producir una planta transformante,
existen otros sistemas de distribución donde puede ser deseable
volver a modificar por ingeniería genética el(los)
gen(es) bacterianos. Por ejemplo, una toxina de proteína se
puede construir mediante fusión conjuntamente con una molécula
atractiva para los insectos como una fuente de alimento con una
toxina. Después de la purificación en el laboratorio tal agente
tóxico con cebo "construido dentro" se puede empaquetar dentro
de alojamientos de trampa de insectos convencionales.
Mutantes. Los mutantes del aislamiento
DAS1529 de la invención se pueden preparar mediante procedimientos
que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo,
un mutante asporógeno se puede obtener mediante etil metano
sulfonato (EMS) mutagénesis de un aislamiento. Los mutantes se
pueden realizar usando luz ultravioleta y nitrosoguanidina mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica.
A continuación están los ejemplos que ilustran
procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no se
deben considerar como limitantes. Todos los porcentajes están en
peso y todas las proporciones de mezcla de disolvente están en
volumen salvo que se indique de otra manera.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Una cepa bacteriana, denominada DAS1529, se
encontró que produce factores que eran inhibidores de crecimiento
de neonatos de insectos lepidópteros, gusano de la mazorca de maíz
(Heliothis zea; CEW), gusano de las yemas del tabaco
(Heliothis virescens; TBW), y Gusano cornudo del tabaco
(Manduca sexta; THW).
DAS 1529 se cultivó en 2% de medio de Proteasa
Peptona No. 3 (PP3) (Difco Laboratorios, Detroit, MI) suplementado
con 1,25% de NaCl o en medio JB suplementado con 0,2% de glucosa. El
cultivo bacteriano se desarrolló a 25ºC durante \sim 40 horas a
150 rpm.
Los factores activos de manera insecticida se
encontraron inicialmente en el caldo de fermentación que se
concentró sobre filtros de corte de peso molecular de 5 kDa. Los
factores que eran lábiles al calor (inactivados mediante
calentamiento a 85ºC durante 20 minutos). Estos datos indicaron que
los factores eran proteináceos. Véase también el final del
Ejemplo 4.
Para identificar los factores activos en los
sedimentos celulares, el cultivo bacteriano se centrifugó a 8000
rpm a 4ºC durante 15 minutos, se lavó una vez con agua destilada
estéril, y se volvió a suspender a 33X del volumen de cultivo
original en agua destilada estéril, y posteriormente a bioensayo de
insectos como se describe más adelante en el Ejemplo 3. Los datos
de bioensayo para la cepa DAS 1529 se resume en la Tabla 4. Los
datos mostraron que el caldo de cultivo y las células bacterianas
DAS 1529 concentradas conferían buena actividad contra CEW (30 a
50% de mortalidad a 33X) y TBW (100% de mortalidad a 33X). Aquellos
factores de toxina en DAS 1529 tenían una significación relativa
para el desarrollo de productos transgénicos comerciales que dirigen
los insectos lepidópteros (por ejemplo, CEW y TBW) en maíz y
algodón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La filogenia molecular se realizó para
determinar la afiliación taxonómica de la cepa DAS 1529. La
secuencia de nucleótidos del ADNr 16S de DAS 1529 se determine y
usó para análisis de similitud y filogenéticos (usando el kit
MicroSeq Kit de ABI). La secuencia se proporciona como la SEQ ID
NO:16. Los resultados de investigación de BLAST son como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Estas mismas secuencias de puntuación superiores
de la investigación BLAST se compararon también usando la rutina
Gap (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48; 443 - 453 (1970)) de GCG
versión 10.2, con los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un número de secuencias relacionadas, que
incluyen las secuencias de puntuación superiores indicadas
anteriormente, también se recortaron y se alinearon como se ha
descrito por Shida et al. (Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 289
- 298, 1997), usando el programa de alineación de secuencias CLUSTAL
W (Thompson, J.D., D. G. Higgins, y T.J. Gibson, Nucleic Acids Res.
22: 4673 - 4680, 1994). Los resultados claramente colocan DAS1529 en
el subgrupo Paenibacillus popilliae/Paenibacillus
lentimorbus del género Paenibacillus identificado por
Pettersson et al. (Int. J. Syst.
Bacteriol. 49: 531 - 540,1999), y son consistentes con los
análisis reseñados anteriormente. Este subgrupo incluye las
especies asociadas a insectos P. popilliae y P.
lentimorbus, así como P. thiaminolyticus,
Paenibacillus sp. T-168 y C-168,
y "Bacillus tipchiralis", que no se conoce que tengan
una asociación a insectos (Pettersson et al., 1999). Como se
ha indicado por Wayne et al. (Int. J. Syst. Bacteriol. 37:
463 - 464, 1987) y Vandamme et al. (Microbiol. Rev. 60: 407 -
438), Las secuencias de ADNr que son mayores que 97% de identidad
no se pueden usar en general para asignar una cepa bacteriana a una
especie particular en la ausencia de información adicional. En el
caso de DAS1529, la actividad insecticida sobre lepidópteros y
evidencia de una tiaminasa no son consistentes con P.
popilliae y P. lentimorbus conocidas, y la asociación
de insectos no es consistente con P. thiaminolyticus
conocida (así como las otras especies del subgrupo).
Como otras cepas de Paenibacillus se
conocen como agentes causantes de la bacteriosis lechosa en larvas
de escarabajos japoneses (Popillia jalonica; Harrison et
al., 2000), la DAS 1529 se ensayó para determinar la actividad
sobre escarabajos June, un pariente de los escarabajos Japoneses. No
se encontró ninguna actividad para los cultivos desarrollados en
medio JB y PP3. El examen microscópico de los cultivos revelaron
bastones igualmente coloreados sin esporulación visible o cristales
parasporales presentes. Los inventores son capaces de mostrar que
DAS 1529 pueden esporular en medio definido y condiciones de cultivo
y dentro de la hemolinfa de Manducca sexta. Se sabe las
cepas de Paenibacillus activas contra el escarabajo japonés
están típicamente asociados con cuerpos de paraspora y parasporales
(Harrison et al., 2000).
Se necesitará un trabajo adicional para
determinar si DAS 1529 pertenece o se debe asignar a una nueva
denominación de especie.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se usaron dos procedimientos de bioensayos de
insectos para obtener los resultados presentados más adelante. Un
formato de 96 pocillos y yb formato de 128 pocillos se usaron para
la selección primaria para determinar la actividad contra insectos
de lepidópteros insectos. Un formato de de incorporación de dieta de
24 pocillos se usó para determinar la actividad específica 24-
(CL_{50}) de la toxina.
Para el formato de 96 pocillos, se dispensó
dieta artificial en placas de microtitulación de 96 pocillos. Cada
pocillo media aproximadamente 0,32 cm y contenía 150 \mul de
dieta artificial. Se aplicaron muestras/toxinas a una tasa de 50
\mul/pocillo para caldo de fermentación, sedimentos celulares, y
toxinas purificadas. El control positivo (Cry1Ac) a dosis
apropiadas y controles negativos (agua, blanco de medio, las cepas
de huésped bacterianos que no expresan la toxina diana) a una dosis
superior se incluyeron. Se dejó que las muestras se secaran durante
aproximadamente 1 - 3 horas de manera que las muestras perdieron su
humedad pero la dieta mantenía su humedad. Algunos huevos de
insecto se dispersaron sobre la superficie de la dieta tratada con
muestra, o una larva de insecto individual se sembró por pocillo. La
placa infestada se sellaron o bien con recubrimiento mylar sobre
hierro o se cubrieron con tapas adherentes con perforaciones. Se
realizaron minúsculos agujeros para aire en el recubrimiento mylar
para asegurar el suministro de aire a los insectos. Las placas se
incubaron a 28ºC durante 5 días y se puntuaron para determinar la
mortalidad y atrofia. Esto se realizó en una base por pocillo,
ignorando el número de larvas por pocillo, a medida que se depositan
con frecuencia múltiples huevos por pocillo. Después se asignaron
puntuaciones de actividad a cada tratamiento: 0 = sin actividad,
larvas sanas como los pocillos de control de agua, 1= se atrofiaron
las larvas, o se atrofiaron con alguna mortalidad, 2 = todas las
larvas estaban muertas.
Las actividades específicas (CL_{50}) de
muestras/toxinas se determinaron mediante el bioensayo de
incorporación de dieta en bandejas Nutrend de
(Nu-Trend^{TM} Container Corp., Jacksonville, FL).
La dieta artificial de insectos se realizó justo antes de usar y
mantener en estado líquido a 55ºC en un baño de agua. Se realizaron
diluciones en serie (\geq 5) mezclando 27 ml de dieta artificial
con no más de 3 ml de muestras/toxinas. Un total de 30 ml de muestra
y mezcla de dieta se agitó en un aparato vortex durante 30 segundos
y después se distribuyeron igualmente en cada bandeja, llenando
\sim 50% del volumen del pocillo. Se dejó que las bandejas se
enfriaran durante al menos 30 minutos antes de la infestación. Se
infectó un ensayo de insecto en cada pocillo, y se selló mylar
transparente sobre la parte superior de cada bandeja para que
contenga los insectos. Se perforaron pequeños agujeros con un
alfiler de insectos en el mylar sobre cada pocillo para la
circulación de aire. En general los ensayos se mantuvieron a 25ºC
durante 6 días pero algunos se pueden haber mantenido a 30ºC
durante 4 días si se necesitan resultados más rápidos. Un conjunto
de controles positivos y negativos se desarrollaron para cada
actividad. Los ensayos se clasificaron en base de mortalidad pero
los datos sobre la atrofia no se registraron. Los procedimientos
estadísticos se usaron para estimar los valores de CL_{50} para
las muestras ensayadas y se expresaron como ng o \mug/ml de
dieta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Los caldos de fermentación de DAS 1529 contenían
actividad insecticida contra especies de lepidópteros, tales como
gusano de las yemas del tabaco, gusano de la mazorca de maíz, y
gusano carnudo del tabaco. La naturaleza de la actividad
insecticida se investigó por la purificación bioquímica y
caracterización. El bioensayo del gusano de la mazorca de maíz,
como se describe en el Ejemplo 3, se usó durante el procedimiento de
purificación para seguir las actividades insecticidas.
Los caldos de fermentación de DAS 1529 se
produjeron usando 2% de PP3 suplementado con 1,25% de NaCl y se
procesó como se describe en el Ejemplo 1. Se concentraron cuatro
litros de caldo usando un cartucho de ultrafiltración espiral
Amicon (Beverly, MA) Tipo S 1 Y 10 (corte de peso molecular de 10
kDa) unido a un dispositivo de filtración Amicon
M-12 de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. El retenido se diafiltró con fosfato de sodio 20 mM, pH
7,0 (Tampón A) y se aplicó a 5 ml/min a una columna de intercambio
aniónico Q cefarosa XL (1,6 x 10 cm). La columna se lavó con 5
volúmenes de lecho de tampón A para retirarlas proteínas no unidas.
La actividad de la toxina se eluyó mediante 1,0 M NaCl en tampón
A.
La fracción que contenía la actividad
insecticida se cargó en alícuotas de 20 ml en una columna de
filtración de gel Macro-Prep SE1000/40 (2,6 x 100
cm) que se equilibró con tampón A. La proteína se eluyó en tampón A
a un caudal de 3 ml/min. Las fracciones con actividad contra el
gusano de la mazorca de maíz se aplicaron a una columna MonoQ (1,0
x 10 cm) equilibrada con 20 mM Tris-HCl, pH 7,0
(Tampón B) a un caudal de 1 ml/min. Las proteínas unidas a la
columna se fluyeron con un gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl en
Tampón B a 2 ml/min durante 60 min. Se recogieron fracciones de dos
mililitros y se determinó la actividad como se describe en el
Ejemplo 1.
Se añadió sólido (NH_{4})_{2}SO_{4}
a las fracciones de proteína activas anteriores hasta una
concentración final de 1.7 M. Después las proteínas se aplicaron a
una columna de fenil-Superosa (1,0 x 10 cm)
equilibrada con 1,7 M (NH_{4})_{2}SO_{4} en 50 mM de
tampón fosfato de potasio, pH 7 (Tampón C) a 1 ml/min. Después de
lavar la columna con 10 mililitros de Tampón C, las proteínas unidas
a la columna se fluyeron con un gradiente lineal de Tampón C a 5
mM fosfato de potasio, pH 7,0 a 1 ml/min durante 120 min. La mayoría
de las fracciones activas determinadas mediante bioensayo se
reunieron y se dializaron durante toda la noche contra el Tampón
A.
La muestra dializada se aplicó a una columna de
Mono Q (0,5 x 5 cm) que se equilibró con Tampón B a 1 ml/min. Las
proteínas unidas a las columnas se eluyeron a 1 ml/min mediante un
gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl en Tampón B. Las fracciones
activas se reunieron y se ajustaron hasta una concentración final de
(NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,7 M. Las proteínas después se
aplicaron a una columna de fenil-Superosa (0,5.0 x 5
cm) equilibrada con Tampón C a 1 ml/min. Las proteínas unidas a la
columna se fluyeron con un gradiente lineal de Tampón C a 5 mM de
fosfato de potasio, pH 7,0 a 0,5 ml/min durante 40 min. Las
fracciones purificadas se reunieron y se dializaron durante toda
una noche contra Tampón A.
El peso molecular de la toxina purificada final
se examinó mediante una columna de filtración de gel Superdex
S-200. La toxina mostró un peso molecular nativo de
aproximadamente 40 kDa. SDS-PAGE de las toxinas
purificadas mostraron una banda predominante de aproximadamente 40
kDa. Esto sugería que la toxina de DAS 1529 nativa (en esta
fracción) era un monómero de aproximadamente 40 kDa.
La toxina purificada se sometió a electroforesis
en 4 - 20% d SDS- PAGE y se realizó una inmunotransferencia a una
membrana de PVDF. La transferencia se sometió a un análisis de
aminoácido y secuenciación de aminoácidos
N-terminal (SEQ ID NO. 17). La investigación de la
base de datos de proteínas (NCBI-NR) que usa la
secuencia como una duda reveló que es un 95% idéntica a la
aproximadamente tiaminasa I de 42 kDa de Bacillus
thiaminolyticus (Campobasso et al., 1998; GENBANK Nº de
acceso 2THIA; SEQ ID NO:18). Las alineaciones parciales de la
secuencia se ilustran en Figura 3, que tendrían la misma alineación
con GENBANK Nº de acceso AAC44156 (precursor de la tiaminasa I;
U17168 es la entrada correspondiente en GENBANK para el ADN, que se
podrían expresar para conseguir una tiaminasa producida y secretada
a partir de la célula bacteriana). La tiaminasa purificada de DAS
1529 se ensayó sobre gusano de mazorca de maíz (CEW), los resultados
se muestran en la Figura 4. Esta toxina no mataba el gusano de
mazorca de maíz (hasta una concentración de 8 mg/cm^{2}) pero
mostró un 95% de inhibición de crecimiento a una concentración tan
baja como 5 ng/cm^{2}. También se encontró que la tiaminasa
purificada no se desactivó mediante la proteinasa K.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
En un intento de clonar la(s)
secuencia(s) de nucleótidos que codifican el(los)
factor(es) producido(s) DAS 1529, se construyó una
genoteca de cósmidos usando el ADN aislado de DAS 1529 y se
seleccionó para la actividad insecticida. Se identificaron seis
clones de cósmidos recombinantes que producían actividad insecticida
contra los neonatos del gusano de mazorca de maíz y gusano de la
yema del tabaco. Tres de los clones de cósmidos produjeron factores
lábiles al calor (cuando se calentó a 85ºC durante 20 minutos) que
daban como resultado mortalidad de insectos. Los otros tres clones
de cósmidos produjeron factores lábiles al calor que eran inibidores
del crecimiento para los insectos. Uno de los cósmidos que
producían mortalidad de insectos, denominados como cósmido SB12,
se eligieron para análisis de secuencia de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN total a partir de DAS1529 con un
kit de purificación de ADN (Qiagen Inc., Valencia, CA). Vector y
preparación, ligamiento, y empaquetado del ADN de inserción
siguiendo las instrucciones del proveedor (Stratagene, La Jolla,
CA). Las inserciones de ADN de DAS 1529 como los fragmentos de ADN
Sau3A I se clonaron en el sitio BamHI del vector
cósmido SuperCos 1. El producto ligado se se empaquetó con el
extracto de empaquetamiento de oro Gigapack® III y se transfectó
en células huésped XL1-Blue MRF'. Los transformantes
se seleccionaron sobre placas de agar LB- kanamicina. La genoteca
de cósmido constaba de 960 colonias cogidas al azar que se
desarrollaron en diez placas de microtitulación de 96 pocillos en
200 \mul de LB- kanamicina (50 \mug/ml) para la selección de la
actividad de insecto y almacenamiento a largo plazo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la selección primaria de clones activos
contra insectos lepidópteros (CEW y TBW), se desarrollaron un total
de 960 clones de cósmido como colonias individuales en cultivos de 2
ml en placas de 96 pocillos. Los cultivos se hicieron girar y se
volvieron a suspender en medio de cultivo original a aproximadamente
una concentración de 10 X y se sometieron a bioensayo. El vector
SuperCos 1 (SB1) se incluyó como un control negativo. Se aislaron
dieciséis clones positivos (SB2 a SB 17) a partir de la primera
ronda de selección. La segunda y tercera ronda de selección se
llevaron a cabo para seleccionar la actividad contra TBW y CEW; un
clon del cósmido (SB 12) que mostraba consistentemente la mayor
actividad se eligió para análisis adicional. La Tabla 5 resume el
espectro de actividad (como se ensayó) del cósmido SB12. (BAW la
rosquilla verde de la remolacha, Spodoptera exigua; ECB es
el taladrador europeo del maíz, Ostrinia nubilalis; SCRWis
gusano de la raíz del maíz del Sur, Diabrotica undecimpucata
howardi.) El caldo del caldo de cultivo de SB 12 de E.
coli no contenía ninguna actividad contra CEW; por lo tanto,
los factores activos en SB12 eran diferentes de los factores activos
en el caldo de cultivo de la cepa DAS
1529.
1529.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación de nucleótidos del cósmido SB12
mostró que contenía una inserción genómica de aproximadamente 34
kb. El análisis de esta secuencia reveló sorprendentemente la
presencia de al menos 10 marcos abiertos de lectura supuestos
(ORF) (véase la Figura 2). Seis de los ORF identificados se
encontró sorprendentemente que tenían algún grado de identidad de
secuencias de aminoácidos (38 - 48%) a tcaA, tcaB,
tcaC, y tccC identificados anteriormente a partir de
Photorhabdus luminescens (Waterfield et al., 2001),
Xenorhabdus nematophilus (Morgan et al., 2001),
Serratia entomophila (Hurst y Glare, 2002; Hurst et
al., 2000), y Yersinia pestis (Cronin et al.,
2001). Los genes de la proteína de TC de Photorhabdus,
Xenorhabdus, y Serratia se ha mostrado que codifican
los factores insecticidas. También era muy interesante que un DAS
1529 ORF tenía \sim 40% una identidad de secuencia d aminoácidos
de Cry1Ac de Bacillus thuringiensis, otro gen
identificado previamente como factor insecticida (Schnepf et
al., 1998; de Maagd et al., 2001). Aquellos hallazgos
tenían implicación significativa en el entendimiento de la
distribución de genes de toxinas en el reino bacteriano y en el
desarrollo de estrategias adicionales para la extracción y
modificación por ingeniería genética de genes de toxinas.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del
cósmido SB 12. Se analizó además el ADN ensamblado de 41.456 pares
de bases de longitud. Se localizaron tres huecos dos en el vector
del cósmido y uno en la inserción. El análisis de la secuencia de
nucleótidos del contiguo más largo aproximadamente 34,000 pares de
bases reveló la presencia de al menos 10 marcos abiertos de lectura
(ORF) supuestos, identificados como codones de partida potenciales
mediante marcos abiertos de lectura extendidos. Este procedimiento
se sabe que identifica de manera equivocada los sitios de partida
de traducción en un 19% (Bacillus subtilis) y 22%
(Bacillus halodurans) en los genomas relacionados con
Paenibacillus (Besemer, J., Lomsadze, A., Borodovsky, M.,
Nucleic Acids Res. 29: 2607 - 2618,2001). Por lo tanto, la calidad
y posición de las bases complementarias al extremo 5' del ARNa de
16S de B. subtilis (revisión en Rocha, E.P.C., Danchin, A.,
Viari, A., Nucleic Acids Res. 27: 3567 - 3576, 1999), la
secuenciación de los aminoácidos N-terminal, y
alineaciones relativas a los genes se consideraron en la
identificación de los sitios de inicio de traducción nativos. Los
ORF supuestos y anotaciones se resumen en la Tabla 6 y se describen
en más detalle a
continuación.
continuación.
\newpage
\global\parskip0.870000\baselineskip
ORF1 comienza con el primer nucleótido del sitio
de clonación para el ADN de DAS1529 en el cómido SB12, y por lo
tanto no está su sitio de inicio de la traducción nativo. ORF1
comparte homología de la secuencia de ADN significativa con ORF3, y
el análisis de comparación de secuencias sugiere que los 18 primeros
pares de bases de ORF1 están truncados, y que los primeros seis
codones codifican los aminoácidos
Met-Val-Ser-Thr-Thr,
como se encuentra en OFR3. El comienzo de la traducción de ORF1 es
presumiblemente similar al de ORF3, desde aproximadamente las bases
9505 a 9523 de la SEQ ID NO:1. Dos secuencias predichas de
aminoácidos se presentan para ORF2, ORF4, y ORF6 (SEQ ID NOs: 19 y
13), basándose en los sitios de inicio de la traducción
alternativos, como se indica anteriormente. Para ORF2, la SEQ ID
NO:5 se ha descrito anteriormente. El sitio de inicio alternativo,
y preferido está en el resto 3295 de ORF1. De este modo, la proteína
resultante desde este sitio de inicio comenzaría en el resto 9 de
aminoácidos de la SEQ ID NO:5 (traducción desde RBS mejor). Del
mismo modo, para ORF4, SEQ ID NO:9 se ha descrito anteriormente. El
sitio de inicio alternativo, y preferido está en el resto 12.852 de
la SEQ ID NO: 1. La proteína resultante tampoco tendría los primeros
ocho aminoácidos de la SEQ ID NO:9 (Comenzando de este modo con el
resto 9 de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 - traducción desde RBS
mejor).
Ejemplo
6
Se determinó el grado de identidad de secuencia
para los dos fragmentos de ORF2 (tcaB1) comparado con ORF4 (tcaB2),
como era eso para ORF1 (tcaA1) comparado con ORF3 (tcaA2). Se
observó una relación de secuencia similar para ambos pares de
ORF.
ORF2 se construyó mediante combinación de dos
fragmentos, debido a un elemento de tipo secuencia de inserción que
se insertó en la naturaleza (aparentemente espontáneamente), y
rompió este ORF. Véase la Figura 2. la localización de esta
inserción se puede determinar analizando/comparando las secuencias
enteras de ADNde SB 12 (SEQ ID NO:1) con la secuencia de la SEQ ID
NO:4, la última de las cuales no refleja (no codifica) la
inserción. Como se indica con paréntesis en la Figura 7, la
secuencia del producto de traducción en 5' antes del resto 490 de
la SEQ ID NO:4 y el producto de traducción de 3' del resto 491 en la
alineación también con ORF4 (SEQ ID NO:8). La secuencia de ADN en
el punto de inserción aparente muestra una repetición directa de 9
pares de bases encontrada de manera común que flanquean los
elementos de inserción (CACCGAGCA, bases 4734 - 4742 y 6071 - 6080
de la SEQ ID NO:1).
Ejemplo
7
En resumen, de acuerdo con los análisis de
vector NTI clustalW, GCG, y/o Blastp, seis de los ORF identificados
(ORF1 a ORF6) tenía 38 - 48% de identidad de secuencia de
aminoácidos con tcaA, tcaB, tcaC, y tccC (previamente
identificados los genes Photorhabdus tc). El ORF7 codificaba
una proteína que compartía \sim 40% de identidad de secuencia de
aminoácidos con Cry1Ac de Bacillus thuringiensis, otro
gen identificado previamente como un factor insecticida. Se generó
un filogramamediante la incorporación de la secuencia de ORF7
(Cry1529) con un gran número de proteínas Cry (Figura
8). Este árbol filogenético sugiere que Cry1529 está
relacionado de manera distante con otras secuencias de P.
popilliae Cry tal como la de Cry18s (Zhang et
al., 1997, Zhang et al., 1998) que están más cerca de
Cry2s; Cry1529 disminuye (remotamente pero no más
cercanamente) en un grupo de proteínas Cry que contienen de
manera común toxinas encontradas en lepidópteros (Cry1,
Cry9), coleópteros (Cry3, Cry8, Cry7),
y dípteros (Cry4), que es un grupo distinto comparado con los
que incluyen toxinas de nematodos Cry5, -12, -13, -14, y -21
y Cry2, -18.
Fue un descubrimiento sorprendente y novedosos
encontrar los genes de proteínas Cry y TC (en la inserción
genómica de SB12) en Paenibacillus. La identificación de
nuevos genes de proteínas Cry y TC tiene relevancia con el
entendimiento de la técnica de Photorhabdus y Xenorhabdus,
y Bacillus thuringiensis, y amplia el ámbito del género de
bacterias en el que los genes de proteínas Cry y TC se han
encontrado. El tamaño de Cry 1529 de longitud completa
identificada en el presente documento corresponde a la toxina del
núcleo de Cry1s; Cry1529 representa una nueva clase de
proteínas de Cry que también tienen implicaciones para
aislar genes cry de Bacillus thuringiensis y
Paenibacillus.
Para verificar que estas observaciones
sorprendentes no eran el resultado de la contaminación de cepas
(es decir, para confirmar que la inserción de 34 kb que
lleva TC y Cry ORF era de hecho del ADN de DAS1529), se
llevó a cabo análisis molecular mediante hibridación de
transferencia de Southern y PCR. Para la validación de PCR,
cebadores específicos de ORF6 (tipo tccC) y ORF7
(Cry1529) (Ejemplo 8, Tabla 8) se usaron para amplificar
ORF6 y ORF7 desde el cósmido SB 12 y ADN total de DAS 1529. Para
ORF6, se realizaron amplificaciones de PCR en un ciclador térmico
PE9600 (Perkin Elmer) con los siguientes parámetros: la
desnaturalización inicial a 95ºC durante 2 minutos; 30 ciclos cada
uno con desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación a
60ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos, y una
extensión final durante 10 minutos a 72ºC. Para ORF7, los
parámetros de amplificación eran los mismos que ORF6, excepto que la
temperatura de hibridación era 55ºC durante 30 segundos y extensión
a 72ºC durante 4 minutos. Los productos de PCR específicos con una
sola banda de tamaños esperados se amplificaron para tanto ORF6 como
ORF7.
La hibridación inicial de transferencia southern
se basó en una secuencia parcial de AND de SB 12 ADN y se llevó a
cabo de acuerdo con el protocolo estándar (Sambrock et al.,
1990). Las muestras de ADN incluían ADN total de DAS1529 de dos
preparaciones independientes, ADN del cósmido SB 12, y una muestra
de ADN de control negativo de NC1 (Photorhabdus). Ambas
muestras de ADN de DAS1529 eran ADNr de 16S confirmó que era de
origen Paenibacillus sp., y se usó uno originalmente para la
construcción de la genoteca de cósmido; la otra era una nueva
preparación. Se digirieron muestras de ADN con EcoRI,
se transfirieron a membrana, y se hibridaron con 180 pares de bases
marcadas del producto de PCR amplificado fuera de SB 12 Roche DIG
System (Roche). Los cebadores de PCR son 5' CCT CAC TAA AGG GAT CAC
ACG G 3' que se hibridaron parcialmente con el vector y ORF1
truncado (comparado con ORF3 de longitud completa), y 5' GGC TAA TTG
ATG AAT CTC CTT CGC 3' que se hibrida a ORF1 truncado (tipo
tcaA) y ORF3 de longitud completa (tipo tcaA). Un
total de tres fragmentos de ADN (0,85, 2,7, y 8,0 kb) que se
hibrida a la sonda PCR se detectaron, 0,85 y 8,0 en el SB12 y 2,7 y
8,0 en los ADN de DAS 1529. No se detectó ninguna señal en el
control negativo. El de 0,85 kb (del fragmento interno de
EcoRI ORF1 al primer sitio de EcoRI en el vector) y
8,0 kb (del primer sitio 5'EcoRI en ORF3 al tercer sitio
EcoRI en ORF1) coincidía con los tamaños calculados de los
fragmentos de ADN diana de SB12. La detección del fragmento del
fragmento de 2,7 kb sugiere la presencia de un sitio EcoRI
de 2,7 kb inmediatamente cadena arriba del sitio EcoRI dentro
de ORF1 en el ADN de DAS 1529. Th. Los resultados muestran que la
inserción de SB12 era del ADN total de DAS 1529 y, basándose en el
análisis de hibridación y de restricción, todas las copias de los
ORF eran responsables de ello.
Ejemplo
8
La mutagénesis de inserción de trasposones al
azar (para interrumpir el ORF individual o un operón entero) y la
expresión heteróloga (que expresa los ORF individuales u operones
completos) se abordaron para aislar el(los)
ORF(s)
individual(es) u operones que confieren las actividades insecticidas en el cósmido SB 12.
individual(es) u operones que confieren las actividades insecticidas en el cósmido SB 12.
Se generó una mutagénesis de Tn a partir del
cósmido SB12 de DAS1529 A Tn usando el GPS-1 Genome
Priming System (New England BioLabs, Beverly, MA) siguiendo las
instrucciones del kit. En resumen, 2 \mul de tampón 10 X GPS, 1
\mul de donante de ADN de pGPS2.1 (0.02 \mug), 1 \mul de
cósmido SB12 (0,1 \mug) y 18 \mul de H_{2}O estéril se
añadieron a un tubo de 0,5 ml. Se añadió un ml de TnsABC
Transposasa; la mezcla se agitó en un aparato Vortex y se hizo
girar brevemente para recoger los materiales en el fondo del tubo.
Esta mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a 37ºC. Se
añadió un \mul de solución de partida y se mezcló pipeteando
arriba y abajo varias veces. La reacción se incubó a 37ºC durante 1
hora y después se inactivó a 75ºC durante 10 minutos. Un \mul de
la mezcla de reacción se diluyó 10 veces con H_{2}O estéril; 1
\mul de la reacción diluida se sometió a electroforesis en 100
\mul de Electro MAX DH5\alpha-E E. coli
(Gibco BRL, Rockville, MD). Después de 1 hora de crecimiento en
medio de SOC a 37ºC, 10 \mul o 100 \mul se sembraron en placas
de agar LB que contenían 20 \mug/ml de Kanamicina y 15 \mug/ml
de cloramfenicol, seguido de la incubación durante toda una noche a
37ºC.
Se sembraron por estría colonias individuales de
la mutagénesis Tn de SB12 en placas de agar LB recientes que
contenían 20 \mug/ml de Kanamicina y 15 \mug/ml de
cloramfenicol. A partir de las estrías, cultivos de 50 ml de LB que
contenía 20 \mug/ml de Kanamicina y 15 \mug/ml cloramfenicol se
inocularon y se desarrollaron a 28ºC, 200 rpm durante 48 horas.
Después las células se recogieron mediante centrifugación a 3500 rpm
durante 20 minutos. Se retiró el sobrenadante y se volvió a
suspender el sedimento en 2,5 ml del sobrenadante del cultivo para
una concentración de 20 X. El sedimento de células concentrado se
ensayó después para determinar la actividad contra el gusano de la
mazorca de maíz. Se aplicaron en superficie cuarenta \mul del
concentrado 20 X a dieta artificial usando 8 pocillos por muestra
en placas de 128 pocillos. Se añadieron larvas del gusano de
mazorca de maíz recientemente incubados y se dejó que se alimentaran
durante 5 días, momento en el que se registraron la mortalidad y
pesos.
Se ensayaron un total de 184 clones para
determinar la pérdida de actividad contra el gusano de la mazorca
de maíz. Los resultados se resumen en la Tabla 7. Los bioensayos de
los clones de Tn revelaron que una inserción de Tn en el gen
Cry1529 que da como resultado la pérdida completa de
actividad. El bioensayo inicial mostró que las actividades de los
clones que llevaban las inserciones de Tn en los genes tc eran
variables. Los análisis posteriores de los clones en los que los
cultivos se normalizaron todos hasta la misma densidad de células
antes del bioensayo no mostró ninguna pérdida de actividad cuando se
compara con SB12. Los resultados del análisis de Tn sugieren ORF7
(Cry1529) es el componente activo de manera insecticida clave
del cósmido SB 12.
Cry1529 (ORF7) y cinco ORF de tc
(véase la Tabla 8 más adelante) se expresaron en el sistema
pET101D®. Véase la Figura 5. Este vector de expresión tiene
todos los atributos de del sistema de expresión pET regulado por T7
(Dubendorff y Studier, 1991; Studier y Moffatt, 1986) y permite la
clonación direccional de un producto de PCR de extremo ciego en un
vector para la expresión regulada de alto nivel, y purificación de
proteína simplificada en E. coli. La amplificación
óptima de PCR empleó la ADN polimerasa de lata fidelidad
PfuTurbo^{TM} que es altamente termoestable y posee una
actividad a prueba de de lectura de la exonucleasa en 3' a 5' para
corregir los errores de incorporación equivocada de nucleótidos
(Stratagene, La Jolla, CA). Cuando se usa la ThermalAce^{TM}
polimerasa (Invitrogen), se introdujeron mutaciones puntuales en los
ORF de tc, que corrigieron mediante el kit de mutagénesis dirigida
al sitio Quick-Change^{TM} XL basada en
PfuTurbo^{TM} (Stratagene). La cepa de E. coli BL21
Star^{TM} (DE3), se usó como un huésped para la expresión ya que
contiene la mutación rne131 (López et al., 1999) que
en general potencia la estabilidad de ARNm y la producción de las
proteínas recombinantes.
Los ORF individuales se amplificaron mediante la
PCR fuera del cósmido SB12 con cebadores específicos de ORF (Tabla
8) en condiciones definidas. Como un requerimiento de clonación
direccional, los cebadores directos de la PCR se diseñaron para que
contuviera la secuencia, CACC, en el extremo 5' para asegurar el par
de bases del producto de la PCR con la secuencia saliente, GTGG, en
el vector pET101.D. Los cebadores inversos cuando se aparean con
cebadores directos amplificarán cada ORF, respectivamente. Las
reacciones de PCR se llevaron a cabo en 50 \mul de mezcla de
reacción que contiene 50 ng del ADN del cósmido SB12, 1 X de tampón
de reacción Pfu (Stratagene), 0,2 mM cada uno de dNPT, 0,25
mM de cada cebador, y 2 U de ADN polimerasa de PfuTurbo
(Stratagene).Las amplificaciones mediante la PCR se realizaron sobre
un ciclador térmico PE9600 (Perkin Elmer) con los siguientes
parámetros: desnaturalización inicial a 95ºC durante 2 minutos, 35
ciclos cada uno con desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos,
hibridación a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2
minutos por kb de ORF, y una extensión final durante 10 minutos a
72ºC.
Los productos de PCR para cada ORF se clonaron
en pET101.D siguiendo las instrucciones del proveedor (Invitrogen).
El ORF clonado se purificó como ADN de plásmido de pET101.D y se
verificó la secuencia. Ya que el análisis de Tn indicó que el ORF7
es el componente clave de SB 12 para el control de las plagas
ensayadas, el análisis bioquímico y y el bioensayo de insectos se
centró en las proteínas de ORF7 expresadas de manera heteróloga.
Para los clones de expresión de ORF7, el análisis de secuencia de
ADN mostró un 100% de concordancia con la secuencia de ADN de SB12
original. La expresión de ORF7 se indujo mediante 0,5 mM IPTG
durante 4 horas de acuerdo con las instrucciones del kit
(Invitrogen).
Las muestras de bioensayo se prepararon células
de E. coli enteras, lisados de células, y toxinas
purificadas. El espectro y actividad específica de ORF7
(Cry1529) se resume en la Tabla 10. Cry1529 es más
activo contra el gusano cornudo del tabaco (Manduca sexta) y
altamente activo (CL_{50} de 10 \mug/ml de dieta) contra el
gusano de la yema del tabaco (Heliothis virescens); se
observó un 100% de mortalidad para ambos insectos. A dosis mayores,
Cry1529 confería alguna mortalidad (20 a 60%) e inhibición de
crecimiento substancial sobre el gusano de la mazorca de maíz
(Heliothis zea), rosquilla verde de la remolacha
(Spodoptera exigua), y gusano cortador negro (Agrotis
ipsilon). Para el taladrador europeo del maíz (Ostrinia
nubilalis), Cry1529 tenía alguna inhibición de
crecimiento a dosis mayores. Para algunas otras especies de
insectos (oruga negra otoñal, grillo de la cápsula del algodonero,
gusano de la raíz de sur, mosquito), no detectó ninguna actividad.
Los valores de CL_{50}de Cry1529 para las colonias de la
polilla negra diamante resistentes (DBMr) y polilla negra diamante
sensibles (DBM) a Cry1A (Cry1Ac) y son > 50
\mug/ml y < 1,0 \mug/ml, respectivamente, sugiriendo una
resistencia cruzada potencial. Cry1529 no confería actividad
detectable sobre gorgojos de hierba, un pariente de los escarabajos
japoneses.
Para ensayar la actividad de otros factores
no-Cry1529 en DAS 1529, un clon de cósmido SB12 inactivado
de Cry1529 tn (tn67) se ensayó contra TBW, CEW, SCRW, ECB,
BW, BAW, THW, y gorgojos de la hierba; no se encontró ninguna
actividad contra estas plagas. Para dirigir la distribución de la no
expresión o baja expresión de tc ORF en la formación de SB 12, se
ensayaron independientemente tc ORF expresados de manera y en
combinación con otros TC de DAS 1529; no se encontró ninguna
actividad contra TBW, CEW, y gorgojos de la hierba. Además, se
expresaron cuatro ORF en forma de un solo operón hasta niveles muy
altos en células de E. coli. Cuando se ensayó in
vitro, las células enteras no contenían ninguna actividad
detectable sobre TBW, CEW, y gorgojos de la hierba. Aunque la
carencia de actividad de gorgojo es algo interesante, estos
resultados no son sorprendente porque Paenibacillus infecta
típicamente un intervalo estrecho de huésped de gorgojos, podría
seguir que el espectro de actividad de las toxinas insecticidas
pudieran ser relativamente estrechas. De este modo, las selecciones
(usando procedimientos conocidos) que implican un intervalo más
amplio de plagas, y tiempo adicional, se requeriría para
identificar las plagas susceptibles. Los resultados presentados en
el presente documento no deben conducir a nadie fuera de reconocer
que las proteínas sujeto TC tienen utilidad como lo hacen otras
proteínas TC de Xenorhabdus, Photorhabdus, y
similares.
Las proteínas solubles se extrajeron con fosfato
de sodio 25 mM pH 8,0, cloruro sódico 100 mM y se analizaron sobre
gel de gradiente NuPAGE al 4 - 12% con 1 X de tampón MES
(Invitrogen). La proteína de ORF7 se purificó usando procedimientos
convencionales y la secuenciación N-terminal reveló
la secuencia esperada: MNSNEPNLSDV. Se realizó un bioensayo con
células enteras de E. coli, con densidad de células
normalizada, que expresan proteínas diana. Véase Figura 6.
La proteína purificada a gran escala de ORF7 se usó para obtener los
valores de CL_{50} para ORF7 mediante un bioensayo in
vitro. El análisis de estabilidad térmica del ORF7 purificado
indicaba que un tratamiento de a 5 minutos a 75ºC es suficiente para
abolir su actividad contra TBW. Véase Tabla 9.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para los genes tc, se usaron clones sin error de
ORF3 y ORF6 como clones intermedios para generar clon de operón tc
que expresa ORF3 (tcaA), ORF4 (tcaB), ORF5
(tcaC), y ORF6 (tccC). Para construir el operón tc en
pET101.D, el fragmento NsiI/SacI que contiene
tcaA parcial, tcaB entero y tcaC, y se
escindió tccC parcial fuera del cósmido SB 12 para reemplazar
la inserción NsiI/SacI en
pET101.D-tcaA; a esto siguió la inserción de un
fragmento de 208 pares de bases SacI de
pET101.D-tccC. Véase Figura 5. Los cuatro
ORF se expresaron a altos niveles mediante la introducción estándar
de IPTG. Para el ORF6 (tccC) expresado en el operón tc, el tamaño
de la proteína expresada era significativamente más pequeño que el
ORF6 predicho por el vector NTI del 5'-la mayoría
ATG (SEQ ID NO:18) y que se expresa de manera independiente. Por lo
tanto, el ORF6 anotado (SEQ ID NO:13) basándose en la presencia de
un ribosoma que se une al sitio de consenso es probablemente la
proteína nativa producida en SB 12 y
DAS1529.
DAS1529.
\vskip1.000000\baselineskip
El espectro de actividad de toxina de
Cry1529 (ORF7) se resume en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Solamente un intervalo limitado de de plagas se
usó en ensayos en un intento inicial para determinar el espectro de
actividad de los ORF de TCs/tc sujeto. Se obtuvieron los siguientes
datos, que usan el operón ORF3-OR6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De nuevo, aunque esta ronda inicial de selección
no reveló la actividad de estas plagas, los expertos en la técnica
no dudarán que las proteínas sujeto son útiles, como son las
correspondientes proteínas de
Photorhabdus/Xenorhabdus. además, véase el
Ejemplo 10, más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Para la selección adicional homólogos de
cry1529 de ORF7 de otras cepas (Paenibacillus u
otros), cebadores de la PCR específicos de genes y degenerados se
diseñaron para amplificar las secuencias de ADN de ORF7 diana de 1
kb. Los cebadores de la PCR se dedujeron de motivos de proteínas
bien conservados (QAANLHL, dominio I, núcleo de bloque 1 para el
cebador director; GPGFTGGD, dominio III, bloque 3 para el cebador
inverso) altamente conservado en proteínas Cry. Los
cebadores se enumeran en la Tabla 12 y se validaron sobre DAS 1529.
Las amplificaciones de la PCR se realizaron sobre un ciclador
térmico PE9600 (Perkin Elmer) con los siguientes parámetros:
desnaturalización inicial a 95ºC durante 2 minutos; 35 ciclos cada
uno con desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación a
47ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos, y una
extensión final durante 10 minutos a 72ºC. Se usaron los pares de
cebadores para seleccionar una colección de cultivo bacteriano (no
B. thuringiensis) mediante PCR. Cinco de 192 cepas (tres
Paenibacillus, un Bacillus, y uno no identificado)
produjeron productos de PCR de tamaños esperados. Estas cepas
también se encontró que tenía actividad CEW de acuerdo con una
selección de bioensayo primario. Sin embargo, el análisis de
secuencia de los amplicones obtenidos a partir de una de estas
cepas. Sin embargo, el análisis de secuencia de los amplicones
obtenido de una de estas cepas usando diferentes cebadores mostró
que los amplicones no se derivaban de un gen cry.
A pesar de esto, y como estas selecciones no
eran exhaustivas, la invención presente incluye procedimientos de
selección de Paenibacillus spp., Bacillus spp.
(incluyendo Bacillus thuringiensis y sphaericus), y
similares para los genes y proteínas de tipo Cry1529. Dada la
naturaleza significativa del descubrimiento de las proteínas
Cry tóxicas para lepidópteros -en Paenibacillus, la
invención presente también incluye procedimientos de selección de
Paenibacillus spp., en general, para las proteínas y genes de
Cry tóxicos para lepidópteros. Se conocen en la técnica
diversos procedimientos de selección, incluyendo técnicas de la PCR
(como se ha ejemplificado anteriormente), sondas y ensayos de
alimentación (donde las células enteras se alimentan a las plagas
diana). Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente,
procedimientos de selección de la invención presente incluyen la
preparación y uso de genotecas de clones (tales como genotecas de
cósmido) en estas selecciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Este ejemplo proporciona evidencia experimental
de la capacidad de las proteínas de DAS 1529TC, expresada aquí con
un único operón (los ORF 3 - 6; tcaA, tcaB, TcaC y tccC; véase
la sección C del Ejemplo 8), para complementar la toxina XptA2
de Xenorhabdus nematophilus Xwi (véase la SEQ ID
NO:49). Se llevaron a cabo dos experimentos independientes para
expresar el operón de TC de DAS 1529 y XptA2 independientemente, o
para coexpresar el gen XptA2 y el operón de TC en las mismas células
de E. coli. Se ensayaron células enteras que expresan
diferentes toxinas/combinaciones de toxinas para determinar la
actividad contra los insectos lepidópteros: gusano de la mazorca de
maíz (Heliothis zea; CEW) y gusano de la yema del tabaco
(Heliothis virescens; TBW). Los datos de ambos experimentos
indican que las proteínas TC de DAS 1529 son capaces de potenciar
la actividad de XptA2 de la proteína de TC de Xenorhabdus
sobre ambas especies de insecto ensayadas.
Expresión del operón de TC se reguló mediante el
promotor de T7/operador de lac en el vector de expresión pET101.D
que lleva un origen de replicación de ColE1 y un marcador de
selección de resistencia a ampicilina (Invitrogen). La descripción
exhaustiva de la clonación y expresión del operón tc se puede
encontrar en la sección C del Ejemplo 8. El gen XptA2 se clonó en
el vector de expresión pCot-3, que lleva un marcador
de selección de resistencia a cloramfenicol y un origen de
replicación compatible con el ColE1. El sistema de expresión del
vector pCot-3 también está regulado por el promotor
de T7/operador de lac. Por lo tanto, los orígenes de
replicación compatibles y los marcadores de selección diferentes
forman la base para la co-expresión del operón de
TC y XptA2 en las mismas células de E. coli. Los ADN de
plásmido que llevan el operón de TC y XptA2 se transformaron en
E. coli, BL21 Star^{TM} (DE3) o bien independientemente o
en combinación. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de
agar LB que contienen 50 mg/ml de carbenicilina para el operón
pET101.D-TC, 50 mg/ml de cloramfenicol para
pCot-3-XptA2, y ambos antibióticos
para el operón
pET101.D-TC/pCot-3-XptA2.
para suprimir la expresión de la toxina basal, se incluyó glucosa a
un concentración final de 50 mM en tanto agar como medio líquido
LB.
Para la producción de toxina, 5 ml y 50 ml de
medio LB que contenía antibióticos y 50 mM glucosa se inocularon
con cultivos de toda una noche que se desarrollaron sobre placas de
agar LB. Los cultivos se desarrollaron a 30ºC sobre un agitador a
300 rpm. Una vez la densidad de cultivo ha alcanzado una D. O de
\sim 0,4 a 600 nm, IPTG a una concentración final de 75 mM se
añadió al medio de cultivo para inducir la expresión génica.
Después de 24 horas, se recogieron las células de E. coli
para análisis en gel de proteína mediante el sistema NuPAGE
(Invitrogen). Los sedimentos de células de 0,5 ml de caldo de
cultivo 1 X se volvió a suspender en 100 ml de 1 X de tampón de
muestra NuPAGE LDS. Después de una breve sonicación y ebullición
durante 5 min, 5 \mul de la muestra se cargaron en 4 a 12% de
gel de gradiente de NuPAGE bis- tris para análisis de perfil de
proteína total total. XptA2 expresado a niveles detectables cuando
se expresan de manera independiente o en la presencia del operón de
TC. Basándose en el análisis de barrido sobre gel mediante un
Densitómetro Personal SI (Molecular Dynamics), XptA2 expresado
aproximadamente 8 X tan alto por sí mismo como cuando se
co-expresa con el operón de TC. Para el experimento
de inducción de 5 ml, existe una expresión casi igual de XptA2.
Como se describe en el Ejemplo 8, los ORF de tc
de DAS 1529 cuando se expresan de manera independiente o como un
operón, no parecían que fueran activos contra TBW y CEW. Los
siguientes experimentos de bioensayo se centraron en determinar si
las proteínas TC de Paenibacillus (DAS1529) (de ORFs
3-6; proteínas de tipo TcaA-, TcaB-, TcaC-, y
TccC-) pueden complementar la actividad de la toxina de proteína TC
de Xenorhabdus TC (XptA2 se ejemplifica). Se prepararon
muestras de bioensayo como células enteras de E. coli
en 4 X de concentrado de células para el experimento de inducción
de 5 ml, tanto las células del operón de XptA2 como XptA2/TC
contenían muy baja pero casi igual cantidad de la toxina de XptA2.
Los datos en la Tabla 13 mostraron que a la concentración de
células 4 X ensayadas, las proteínas TC + Xenorhabdus XptA2
eran activas contra CEW. Esto proporcionó la primera evidencia de
un efecto de complementación de las proteínas TC de DAS 1529 de
Paenibacillus sobre Xenorhabdus XptA2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el segundo experimento de bioensayo, la
cantidad de proteína de XptA2 en las células de XptA2 y las células
de XptA2 + operón de TC se normalizaron basándose en el análisis de
barrido en gel de densitómetro. Como se muestra en la Tabla 14,
XptA2 per se tenía una actividad moderada a 40 X sobre TBW
(H. virescens), pero la actividad caía hasta un nivel
indetectable a y por debajo de 20 X. Sin embargo, cuando se
co-expresaba con las TC, eran muy evidentes altos
niveles de actividad en la presencia de 10 X y 5 X de XptA2, y
todavía era detectable baja actividad a 1,25 X de XptA2. Estas
observaciones indican que existe un efecto de potenciación
significativo de las 1529 proteínas de TC sobre Xenorhabdus
XptA2 contra H. virescens. A las mayores dosis
ensayadas, ni el control negativo ni el operón tc per se
tenían una actividad contra esta plaga.
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Ejemplo
11
Este ejemplo enseña para las modificaciones de
la secuencia de ADN descrita como la SEQ ID NO:14, que codifica la
proteína Cry1529 (descrita como la SEQ ID NO:15) de manera
que las nuevas proteínas codificadas son más resistentes a la
digestión proteolítica por tripsina que es la proteína nativa. La
digestión de proteínas en el intestino de insectos limita el tiempo
de exposición del insecto a una toxina de la proteína. Por lo
tanto, se pueden usar procedimientos para disminuir la
susceptibilidad de una toxina de proteína a la digestión por
proteasa para incrementar la potencia de la proteína.
Para estos ensayos, la enzima tripsina (por
ejemplo, Sigma Chemical nº T1426) e inhibidores de tripsina (por
ejemplo, Sigma Chemical nº T9008) se prepararon como soluciones
madre de 4 mg/ml o 10 mg/ml en 50 mM tampón Tris HCl, pH 8,0. Las
incubaciones de ensayo con diversas concentraciones de tripsina y
proteína Cry1529 se realizaron a 37ºC durante 1 hora, y se
terminaron mediante la adición de un volumen igual de una
concentración igual de inhibidores de tripsina (por ejemplo,
una digestión que recibió 35 ml de 4 mg/ml de solución de tripsina
se terminó mediante la adición de 35 ml de 4 mg/ml de inhibidores
de tripsina). Para un experimento típico, la proteína
Cry1529 se produjo mediante la modificación de manera
apropiada por ingeniería genética de células de E.
coli y se purificó mediante las etapas descritas
anteriormente, que incluían la separación de otras proteínas
mediante pasaje a través de una columna de exclusión por tamaño.
Después de la digestión, se analizaron los productos de proteasa
mediante electroforesis en gel de archilamida estándar seguido de
análisis de inmunotransferencia usando anticuerpo preparado contra
la Cry1529. Los resultados de tal experimento se muestran en
la Figura 9.
La digestión por Tripsina produce dos productos
de proteína principales, el más pequeño es de aproximadamente 50
kDa de tamaño molecular. Se indica que este patrón de digestión es
el mismo que el producido a partir de la digestión por tripsina de
una proteína Cry1529-His6, que es idéntica a
la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa Cry1529
SEQ ID NO:15 excepto para la adición de aminoácidos
KGELNSKLEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH al
extremo carboxi. La región de codificación para
Cry1529-His6 se produjo ligandos la región
de codificación para la proteína nativa Cry1529 en el vector
pET101/D-TOPO® (Invitrogen^{TM}, Carlsbad, CA).
Este clon recombinante se realizó para facilitar la purificación de
la proteína recombinante Cry1529 mediante la unión a un
anticuerpo V5 comercialmente disponible, cuyos epítopes se
representan por la secuencia de aminoácidos GKPIPNPLLGLDSTRTG
(subrayado anteriormente), o mediante esquemas de purificación que
se sirven de los seis restos de histidina (subrayado doble
anteriormente). Los procedimientos para estas manipulaciones se
realizaron de acuerdo con las recomendaciones proporcionadas con el
vector pET101/
DTOPO®.
DTOPO®.
La digestión con Tripsina de la proteína
Cry1529-His6 se encontró que elimina la
actividad en bioensayos de insectos contra insectos lepidópteros.
Se usó el análisis MALDI-TOF para determinar la
secuencia de aminoácidos que componen el extremo N de los péptidos
de 50 kDa, y dos sitios de procesamiento de proteasa se determinaron
correspondientes a restos de aminoácidos 122 (R, Arginina) y 126
(K, Lisina) de la SEQ ID NO:15.
Las modificaciones el primer sitio de escisión
de tripsina en la proteína codificada se realizaron en la secuencia
nativa de ADN (SEQ ID NO:14), usando la metodología de mutagénesis
de Quick-Change® (Stratagene, La Jolla, CA). Tres
tipos diferentes de mutaciones se realizaron en aminoácidos en la
región de 120 a 123 de la SEQ ID NO:15: RARA a HANA, RARA a RARS, y
RARA a QANA. Los cebadores de oligonucleótidos de ADN (enumerados en
dirección 5' a 3' para cada hebra) para estas mutaciones se
enumeran en la Tabla 15 a continuación. Las bases que difieren de
la secuencia native de ADN están subrayadas.
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Comparación de las regiones de codificación de
tipo salvaje y mutadas inducidas por estos cebadores se muestran en
esta tabla. Los restos de aminoácidos pertinentes se muestran en
negrita
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las regiones codificantes separadas, mutadas se
clonaron cada una en el vector pET101/D-TOPO®, que
permite la producción inducible de las proteínas variantes
Cry1529. Se desarrollaron células de E. coli que
contienen las construcciones, y se indujo la expresión de los genes
variantes de Cry1529 mediante procedimientos recomendados
por el proveedor. Las células enteras recogidas se ensayaron después
en ensayos de digestión por tripsina, y se analizaron como antes.
Los resultados típicos se muestran en la Figura 10. Para estos
experimentos, 10 mg de sedimento de células enteras se suspendieron
en 50 mM Tris HCl, pH 8,0, y se digirieron durante 3 horas a 37º en
un volumen final de 1 ml, con 100 ml de 10 mg/ml de tripsina. Las
reacciones se mezclaron ocasionalmente durante la incubación. La
digestión se terminó mediante la adición de 100 \mul de 10 mg/ml
de inhibidores de tripsina y los tubos se almacenaron en tubos.
Estos resultados demuestran que tanto las
proteínas Cry1529 (RARA) como las
Cry1529-His_{6} (RARA) nativas se
digirieron por tripsina para producir un producto principal de
aproximadamente 50 kDa. Cuando la secuencia RARA correspondiente el
sitio de escisión por tripsina se mutó a HANA o QANA, se obtuvo
resistencia substancial a la digestión por tripsina. No se
produjeron péptidos de 50 kDa, y estaban presentes cantidades
fácilmente detectables de las proteínas aparentemente de longitud
completa de Cry1529-His_{6}. La mutación
del sitio RARA para RARS no eliminaron la producción de péptidos de
50 kDa, pero sustancialmente reducen la tasa de escisión de
proteasa. De este modo, Es evidente que los sitios de procesamiento
de proteasa en la proteína Cry1529 disminuye sustancialmente
su susceptibilidad a la digestión por proteasa. Esto permite que
las proteínas residan períodos más largos de tiempo en el intestino
de insecto después de la ingestión, dando como resultado un
incremento de potencia para eliminar los insectos susceptibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Como se ha mostrado anteriormente, la cepa
IDAS 1529 de Paenibacillus produce una proteína extracelular
que es tóxica para diversos insectos Lepidópteros. La filogenia
molecular del gen ribosómico de 16S de esta cepa indica que está lo
más estrechamente relacionada con los miembros del grupo P.
thiaminolyticus-P.
lentimorbus-P. popilliae. También se ha
mostrado que la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus con tiene
tanto los genes del complejo de toxina (de aquí en adelante
denominados genes tc) y un gen de proteína de inclusión
cristalina insecticida novedosos denominado cry1529. En otro
intento para determinar si los homólogos de tc están
presentes miembros del género Paenibacillus, una colección de
cepas Paenibacillus se seleccionó mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y análisis de hibridación. Para los
análisis de la PCR, ADN total aislado de cepas de
Paenibacillus se usó como molde y se seleccionó usando
cebadores de oligonucleótidos específicos para los genes tc
encontrados en la Cepa IDAS 1529 de las especies de
Paenibacillus, Photorhabdus, y especies de
Xenorhabdus. Los productos amplificados obtenidos con los
conjuntos de cebadores tc se clonaron y su secuencia de
nucleótidos se determinó y se comparó con las secuencias de
tc obtenidas a partir de la Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus. Los siguientes ejemplos ilustran cómo se pueden
diseñar oligonucleótidos específicos de tc y uso de la PCR
para la investigación del ADN total de aislamientos
Paenibacillus para las secuencias de ADN que son homólogas a
los genes de tc identificados en la Cepa IDAS 1529 de
especies de Paenibacillus, Photorhabdus, y especies de
Xenorhabdus. Mediante el uso del análisis de la PCR (como se
describe en el presente documento), era (y es) posible identificar
los homólogos de tc en una especie de Paenibacillus
distinta de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus y el grupo
P. thiaminolyticus-P. lentimorbus- P.
popilliae.
Cepas de Paenibacillus sobre placas de
agar nutriente (8 g/l de caldo nutriente, 15 g/l de Bacto agar;
Laboratorios Difco, Detroit, MI) durante 3 - 5 días a 30ºC. Se
recogió una única colonia y inocuó en un matraz de 500 ml con tres
deflectores que contenía 100 ml de caldo nutriente estéril (8 g/l de
caldo nutriente; Laboratorios Difco, Detroit, MI). Después de 24 -
72 horas de incubación a 30ºC sobre un agitador rotatorio a 150 rpm,
los cultivos se dispensaron en botellas de polietileno de 500 ml
estériles y se centrifugaron a 6.500 x g durante 1 hr a 4ºC.
Después de la centrifugación, el fluido sobrenadante se decantó y el
sedimento de células bacterianas se retuvo. Se extrajo el ADN total
a partir de sedimento de células que usan el sistema QIAGEN
Genomic-tip 100/G y conjunto de de tampón de ADN
Geonómico (QIAGEN Inc., Valencia, CA, Estados Unidos) siguiendo el
Protocolo de Muestra y Lisis para las bacterias exactamente como se
describe por el fabricante. El ADN extraído total se solubilizó en
0,5 ml de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM
EDTA, pH 8,0).
\vskip1.000000\baselineskip
Para seleccionar los cebadores de
oligonucleótidos específicos de los genes de tc identificados
previamente a partir de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus,
las secuencias de nucleótidos de tcaA, tcaB, tcdB y tccC
obtenidas a partir de la Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus,
cepa W14 de Photorhabdus, y la cepaXwi de Xenorhabdus
se alinearon usando el programa Align en el paquete de software
Vector NTI (Informax, Inc., Frederick, MD). Las secuencias de
nucleótidos usados para este análisis se enumeran en la Tabla
17.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La alineación de secuencias de nucleótidos de
tcaA1-1529, tcaA2-1529, y
tcaA-W14 identificó dos regiones de
identidad de secuencias de nucleótidos de suficiente longitud para
la selección de los cebadores de la PCR con una degeneración mínima
(mostrado como regiones en casilla en la Figura 10.). Estas dos
regiones se seleccionaron para la síntesis de cebadores específicos
de tcaA, que se denominaron SB 105 y SB 106 (Tablas 18 y
19).
La alineación de secuencias de nucleótidos de
tcaB1-1529, tcaB2-1529, y
tcaB-W14 identificó cuatro regiones de
identidad de secuencias de nucleótidos de suficiente longitud para
la selección de los cebadores de la PCR con una degeneración mínima
(Figura 11.). Estas cuatro regiones se seleccionaron para la
síntesis de cebadores específicos de tcaB, que se
denominaron SB101, SB102, SB 103, y SB104 (Tablas 18 y 19).
La alineación de secuencias de nucleótidos de
tcdB1-W14, tcdB2-W14,
xptC1-Xwi y tcaC-1529 identificó
dos regiones de identidad de secuencias de nucleótidos de
suficiente longitud para la selección de los cebadores de la PCR
con una degeneración mínima (Figura 12.). Estas dos regiones se
seleccionaron para la síntesis de cebadores específicos de
tcaC, que se denominaron SB215 y SB217 (Tablas 18 y 19).
La alineación de secuencias de nucleótidos de
tccC1-W14, tccC2-W14,
tccC3-W14, tccC4-W14,
tccC5-W14, xptB1-Xwi y
tccC-1529 identificó dos regiones de
identidad de secuencias de nucleótidos de suficiente longitud para
la selección de los cebadores de la PCR con una degeneración mínima
(Figura 13.). Estas dos regiones se seleccionaron para la síntesis
de cebadores específicos de tccC, que se denominaron SB212 y
SB213 (Tablas 18 y 19).
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Para la amplificación por PCR que usa conjuntos
de cebadores específicos de tcaA- y tcaB-,
3-5 ul de ADN total de cada una de las cepas de
Paenibacillus se mezclaron con 50 pmoles de cada cebador y 1
X Eppendorf MasterMix (Eppendorf AG; Hamburgo, Alemania) en un
volumen de reacción de 20 ul. Las condiciones de amplificación se
desnaturalizaron a 94ºC durante 3 minutos seguido de 30 ciclos de
desnaturalizaron a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a 52ºC
durante 1,5 minutos, y extensión a 72ºC durante 1,5 minutos, seguido
de una extensión final a 72ºC durante 5 minutos.
Para la amplificación por PCR usando conjuntos
de cebadores específicos de de tcaC- y tccC, aproximadamente
375 ng de ADN total obtenido a partir de cada una de las cepas de
Paenibacillus se mezcló con 50 pmoles de cada cebador y 12,5
ul de tampón Epicentre® FailSafe^{TM} Dand 2,5 U de Epicentre®
FailSafe^{TM}Polimerasa (Epicentre; Madison, WI) en un volumen de
reacción de 25 ul. Las condiciones de amplificación serán
desnaturalización a 96ºC durante 4 minutos seguido de 40 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 64ºC
durante 30 segundos, y extensión a 70ºC durante 30 segundos. Cada
ciclo, la temperatura de hibridación se redujo en 0,5ºC y el tiempo
de extensión se incrementó en 5 segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación por la PCR se
examinaron mediante electroforesis de gel usando 0,8 a 1% de Seakem
LE agarosa (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, ME) en 1
X de tampón TAE. Los productos amplificados se clonaron en el
vector pCR 2.1-TOPO® usando el TOPO TA® Cloning Kit
(Invitrogen^{TM} Life Technologies, Carlsbad, CA) exactamente
como se describe por el fabricante. Las secuencias de nucleótidos
de los productos amplificados totales se determinaron usando M13
directo, M13 inverso, y cebadores de secuenciación específicos de
secuencia tc como se necesita para obtener la secuencia de
cadena doble de cada producto amplificado. La secuenciación de
nucleótidos se realizó usando el kit CEQ Dye Terminator Cycle
Sequencing Quick Start (Beckman Coulter, Fullerton, CA, Estados
unidos) y el Sistema CEQ 2000 XL ADN Analysis (Beckman Coulter)
exactamente como se describe por el fabricante. El paquete de
software Sequencher (v. 4.1.4) (Gene Codes, Ann Arbor, MI) se usó
para construir contiguos de los datos de secuenciación y determinar
una secuencia de consenso para cada producto amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usa la PCR el tcaA-
(combinación de cebador SB105 y SB106) se realizó usando ADN total
obtenido a partir de la recogida de cepas de Paenibacillus,
se observó que el ADN total de una cepa de Paenibacillus
apiarius (NRRL NRS 1438; de aquí en adelante denominada DB482)
produjo un producto amplificado de los tamaños esperados. El
producto amplificado se clonó y se secuenció.
El producto amplificado obtenido usando la
combinación de cebadores de SB105 y SB106 se denominó tcaA2-
DB482. Cuando la secuencia de tcaA2-DB482
(SEQ ID NO:32) se compara con las secuencias de tcaA
obtenidas a partir de la cepaIDAS 1529 de Paenibacillus y
CepaW14de Photorhabdus, se observó que
tcaA2-DB482 tenía la mayor identidad de
secuencia de nucleótidos (90,5% sobre 1.239 nucleótidos) a
tcaA2-1529 (Tabla 20). La secuencia de
aminoácidos deducida codificada por
tcaA2-DB482 (denominada
TcaA2-DB482; SEQ ID NO:33) erá un 89,1% idéntica a
la secuencia de aminoácidos correspondiente de
tcaA2-1529 (denominada
TcaA2-1529; SEQ ID
NO:7).
NO:7).
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Los productos amplificados obtenidos usando la
combinación de cebadores de SB 101 y SB 102 y la combinación de
cebadores de SB103 y SB104 se denominan
tcaB2a-DB482 y tcaB2b-DB482,
respectivamente. Cuando las secuencias de tcaB2a- DB482 (SEQ
ID NO:34) y tcaB2b-DB482 (SEQ ID NO:35) se
compararon con las secuencias de tcaB obtenidas a partir de
la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus y cepaW14de
Photorhabdus, se observó que ambas secuencias tenían la
mayor identidad de secuencias de nucleótidos con
tcaB1-1529 y tcaB2-1529
(Tabla 21). La identidad de secuencias de nucleótidos de
tcaB2a-DB482 y tcaB2b-DB482 a
tcaB2-1529 era 92,6% y 89,8%,
respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducida codificadas
por tcaB2a-DB482 (denominada
TcaB2a-DB482; SEQ ID NO:36)
tcaB2b-DB482 (denominada
TcaB2b-DB482; SEQ ID NO:37) eran 91,2% y 91,1%
idénticas, respectivamente, con la secuencia de aminoácidos deducida
correspondiente de tcaB2-1529 (denominada
TcaB2-1529; SEQ ID NO:9).
Cuando la PCR que usa la combinación de
cebadores específicos de tcaC (SB215 y SB217) se realizó
usando el ADN total obtenido a partir de DB482 se produjo un
producto amplificado del tamaño esperado. El producto amplificado
se clonó y se secuenció.
El producto amplificado obtenido usando la
combinación de cebadores de SB215 y SB217 se denominó
tcaCDB482. Cuando la secuencia de tcaC- DB482 (SEQ ID NO:38) se comparó con las secuencias de tcaC obtenidas a partir de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus, cepa Xwi de Xenorhabdus y cepa W14 de Photorhabdus, se observó que tcaCDB482 tenía la identidad de secuencias de nucleótido mayor (93,5% sobre 2.091 nucleótidos) a tcaC-1529 (Tabla 22). La secuencia de aminoácidos deducida codificada por tcaC-DB482 (denominada TcaC-DB482; SEQ ID NO:39) era 91,1% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de tcaC-1529 (denominada TcaC- 1529; SEQ ID NO: 11).
tcaCDB482. Cuando la secuencia de tcaC- DB482 (SEQ ID NO:38) se comparó con las secuencias de tcaC obtenidas a partir de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus, cepa Xwi de Xenorhabdus y cepa W14 de Photorhabdus, se observó que tcaCDB482 tenía la identidad de secuencias de nucleótido mayor (93,5% sobre 2.091 nucleótidos) a tcaC-1529 (Tabla 22). La secuencia de aminoácidos deducida codificada por tcaC-DB482 (denominada TcaC-DB482; SEQ ID NO:39) era 91,1% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de tcaC-1529 (denominada TcaC- 1529; SEQ ID NO: 11).
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Cuando la PCR que usa la combinación de
cebadores específicos de tccC (SB212 y SB212) se realizó
usando el ADN total obtenido a partir de la colección de cepas de
Paenibacillus, se observó que el ADN total de DB482 producía
un producto amplificado del tamaño esperado. El producto amplificado
se clonó y se secuenció.
El producto amplificado obtenido usando la
combinación de cebadores de SB212 y SB213 se denominó
tccC-DB482. Cuando la secuencia de tccC -
DB482 (SEQ ID NO:40) se comparó con las secuencias de
tccC obtenidas a partir de la cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus, cepa Xwi de Xenorhabdus y cepa W14 de
Photorhabdus, se observó que tccCDB482 tenía la
identidad de secuencias de nucleótido mayor (93,7% sobre 858
nucleótidos) a tccC-1529 (Tabla 23). La
secuencia de aminoácidos deducida codificada por
tccC-DB482 (denominada
TccC-DB482; SEQ ID NO: 41) era 95,5% idéntica a la
secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de
tccC-1529 (denominada TccC- 1529; SEQ ID NO:
13).
Este ejemplo (y otros ejemplos en el presente
documento) ilustran procedimientos para diseñar cebadores de
oligonucleótidos basados en los genes de tc de los tres
géneros de bacterias, y que el uso de estos cebadores para la
selección por la PCR de las cepas de Paenibacillus pueden
identificar homólogos de tc presentes en aquellas cepas.
DB482, que es un aislamiento de Paenibacillus apiarius
(depositada como NRRL B-30670) que se aisló a
partir de larvas de abeja de miel, se mostró que contenía homólogos
de tcaA, tcaB, tcaC, y tccC. El hallazgo de estos
homólogos de tc confirma que la cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus no es única dentro de del género de
Paenibacillus con relación a la posesión de los genes de
tc. Por lo tanto, los expertos en la técnica pueden ahora
usar estos y otros procedimientos para identificar otros homólogos
de tc en otras especies de Paenibacillus tales como
P. chondroitinus, P. alginolyticus, P. larvae, P. validus, P.
gordonae, P. alvei, P. lentimorbus, P. popilliae, P.
thiaminolyticus, P. curdlanolyticus, P. kobensis, P.
glucanolyticus, P. lautus, P. chibensis, P. macquariensis, P.
azotofizans, P. peoriae, P. polymyxa, P. illinoisensis, P.
amylolyticus, P. pabuli, y P. macerans.
Ejemplo
14
Este ejemplo ilustra cómo se puede marcar de
manera radiactiva los fragmentos de ADN como sondas para investigar
el ADN genómico de aislamientos de Paenibacillus para las
secuencias de ADN (teniendo preferiblemente alguna homología con
los ORF de tc detectados primero en IDAS 1529). Los resultados
demuestran que las secuencias homólogas a a dos de los ROF de tc se
detectan en un aislamiento de Paenibacillus apairius,
DB482.
El ADN genómico de diversas cepas de
Paenibacillus (o de E. coli que sirven como control
negativo) se preparó como se ha descrito anteriormente en el
Ejemplo 12, y se digirió con enzimas de restricción para producir
fragmentos múltiples. Una digestión típica contenía 8 mg de ADN en
un volumen total de 400 ml de tampón de reacción como se suministra
por el fabricante de la enzima EcoR I (New England Biolabs,
Beverly, MA). La reacción, que contiene 200 unidades de enzyma, se
incubó durante toda una noche 37ºC, después se colocó sobre hielo.
El ADN digerido se purificó adicionalmente y se concentró mediante
la adición de 30 \muL of 3M de acetato de sodio (pH 5,2) y 750
ml de ice cold etanol al 100% enfriado en hielo, seguido de
centrifugación. El sedimento de ADN se lavó dos veces con etanol al
70%, se secó a vacío, y se volvió a suspender en 50 ml de tampón TE
[10 mM Tris HCl, pH 8,0; 1 mM Ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA)]. Después se analizó una alícuota mediante electroforesis de
gel de agarosa para la seguridad visual de la digestión límite. De
una manera similar, ADN del cósmido SB 12 de IDAS 1529 se digirió
con EcoR I, y y se usó como un control positivo para los
experimentos de hibridación.
Los fragmentos de ADN genómico digeridos con
EcoR I para transferir para análisis de Southern se separaron
por electroforesis mediante 0,7% o 1,2% de geles de agarosa en
tampón TEA (40 mM Tris-acetato, 2 mM EDTA, pH 8,0)
(1 mg de ADN/pocillo). En cada gel, las calles que contenían 1 kb de
Escala de Peso Molecular de ADN de 1 kb (Invitrogen^{TM},
Carlsbad, CA) se usaron para proporcionar patrones de tamaño de peso
molecular. Los 15 tamaños de fragmentos mayores que 500 pares de
bases en esta escala (en kilobases) son: 12,2, 11,2, 10,1, 9,2,
8,1, 7,1, 6,1, 5,1, 4,1, 3,1, 2,0, 1,6, 1,0, 0,52, y 0,50. El ADN en
el gel se tiñó con 50 \mug/ml de bromuro de etidio, el gel se
fotografió, y después el ADN en el gel se despurinó (5 min en 0,2 M
HCl), se desnaturalizó (15 min en 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl), se
neutralizó (5 min en 0,2 M HCl) y se transfirió a membrana de
transferencia de nylon MAGNA de 0,45 micrones (Osmonics,
Westborough, MA) en 2 X SSC (20X SSC contiene 3 M NaCl, 0,3 M
citrato de sodio, pH 7,0). El ADN se entrecruzó con la membrana
mediante luz ultravioleta (Stratalinker®; Stratagene, La Jolla, CA)
y se preparó para hibridación mediante incubación a 60ºC o 65ºC
durante 1 a 3 horas en solución de "Hibridación Mínima"
[contiene 10% p/v de polietilen glicol (Peso Molecular approx.
8000), 7% p/v dodecil sulfato de sodio; 0,6 X SSC, 5 mM EDTA, 100
mg/ml AND de esperma de salmón desnaturalizado, y 10 mM tampón
fosfato de sodio (de un 1M de solución madre que contiene 95 g/l
NaH_{2}PO_{4}\cdot1H_{2}O y 84,5 g/l de
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O)].
Los fragmentos de ADN de los ROF de tc para uso
como sondas de hibridación se prepararon primero mediante la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando el ADN del cósmido
SB12 como molde (véanse los ejemplos previos). Los cebadores
directo e inverso para estas amplificaciones se enumeran
(direcciones 5' a 3' de las hebras de ADN respectivas) en la Tabla
24, más adelante (las bases en letras mayúsculas corresponden a
regiones de codificación de proteína). Se diseña el Conjunto Uno de
Cebadores para amplificar, a partir de ADN del cósmido SB 12, un
fragmento de ADN que incluye todos los ORF de tc que se describe
como la SEQ ID NO:10, y que tiene alguna similitud con el gen
tcaC de Photorhabdus (Tabla 6). El Conjunto Dos de
Cebadores se diseñaron para amplificar, a partir de un fragmento del
cósmido SB 12, un fragmento de ADN que codifica la proteína
descrita como la SEQ ID NO:19. Este fragmento de ADN y la proteína
codificada son algo más largos que la secuencia de ADN de ORF6 de
tc descrito como la SEQ ID NO:12, y la proteína codificada descrita
como la SEQ ID NO:13. Las proteínas descritas como las SEQ ID NO:13
y SEQ ID NO:19 ambas tenían alguna similitud con la proteína
codificada por el gen tccC de Photorhabdus (Tabla 6).
Los productos de PCR amplificados se clonaron en el vector de
clonación pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen^{TM},
Carlsbad, CA), y los fragmentos que contenían los ORF de tc se
liberaron de los clones resultantes mediante digestión con enzimas
de restricción (enumerados en la Tabla más adelante), seguido de
purificación a partir de geles de agarosa usando las columnas
GenElute^{TM} Agarose Spin (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). Los
fragmentos recuperados se concentraron mediante precipitación
usando la Solución Quick-Precip^{TM} Plus de
acuerdo con las instrucciones del proveedor (Edge BioSystems,
Gaithersburg, MD).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los fragmentos de ADN marcados radiactivamente
que usan el kit High Prime Radioactive Labeling (Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante paso a
través de una columna QIAquick® PCR Purification (Qiagen, Inc.
Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
marcado de aproximadamente 100 ng de fragmentos de ADN mediante
estos procedimientos dieron como resultado actividades específicas
de aproximadamente 0.1 \muCi/ng. Estos fragmentos de AND se
desnaturalizaron mediante ebullición durante 5 minutos, después se
añadieron a la mancha de hibridación en solución de Hibridación
mínima y se incubaron durante toda una noche a 60ºC o 65ºC. La
radiactividad emitida se eliminó de la mancha enjuagando a
temperatura ambiente en 2 X SSC, después se eliminó la radiactividad
unida más estrechamente mediante lavado de la mancha durante al
menos una hora a 60ºC o 65ºC en 0,3 X SSC + 0,1% de dodecil sulfato
sódico. Se realizaron al menos dos lavados. La mancha se colocó
sobre una película de rayos X a -80ºC con dos pantallas de
intensificación, y la película expuesta se se desarrolló después de
1 a 3 días de exposición. Las manchas se despojaron de los
fragmentos de ADN hibridados mediante ebullición durante 10
minutos en 0,3 X SSC + 0,1% de SDS, y se reutilizaron una vez o dos
para hibridaciones posteriores.
Los fragmentos distintos que se hibridaron a las
sondas derivadas de los Conjuntos Uno de los Cebadores y Dos se
observaron en el ADN genómico que se obtuvieron a partir de la cepa
DB482 de Paenibacillus apairius. La sonda derivada del
Conjunto Uno de Cebadores (cebadores SB126 y SB127), que detecta las
secuencias homólogas al ORF5 de tc de IDAS 1529, se hibridaron a
los fragmentos de tamaños estimados (en kilobases) de 20, 10.2, y
8.4. Dentro de este intervalo de tamaños moleculares, las
movilidades de los fragmentos de ADN pueden proporcionar solamente
las estimaciones de los tamaños moleculares. La intensidad de señal
para los fragmentos estimados eran de 20 kb y 8,4 kb eran mucho más
intensas que la intensidad de señal para los fragmentos estimados
que eran 10,2 kb. Ya que cada uno de estos fragmentos es al menos
dos veces el tamaño del fragmento de sonda (aproximadamente 4,4
kb), una explicación de estos resultados es que copias múltiples de
los genes que son similares a las sondas de ORF5de tc de IDAS 1529,
y de este modo, son similares al gen tcaC de
Photorhabdus, están presentes en el genoma de la cepa DB482
de Paenibacillus apairius. Sin embargo, otras explicaciones
para este resultado son posibles.
La sonda derivada del Conjunto Dos de Cebadores
(cebadores SB128 y SB129), que detecta las secuencias homólogas al
ORF6 de tc de IDAS 1529 y sus secuencias flanqueantes del extremo
5', se hibridaron a los fragmentes de tamaños estimados (en
kilobases) de 7.8 y 4,5. La intensidad de señal para el fragmento se
estimaba que era de 7,8 kb era mucho más intensa que la intensidad
de señal observada para el fragmento estimado que era 4,5 kb. Una
explicación para este resultado es que la cepa DB482 de
Paenibacillus apairius tenía un único gen similar al RFF6 de
tc de IDAS 1529 y sus secuencias flanqueantes en 5' y de este modo,
es similar al gen tccC de Photorhabdus, y que
EcoR I escinde el gen en dos fragmentos que tienen partes
desiguales de las secuencias de ADN que comprenden el gen. Sin
embargo, otras explicaciones para este resultado son posibles,
incluyendo la presencia de genes múltiples con diferencias
cantidades de homología absoluta con la sonda.
Estos resultados (detección mediante
amplificación por la PCR seguido de análisis de secuencias de ADN)
confirman la presencia de parientes de los genes tcaC y tccC
de Photorhabdus en la cepa de DB482 Paenibacillus
apairius.
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Ejemplo
15
La cepaDAS 1529 de Paenibacillus cepa se
ha mostrado que produce una proteína extracelular que es tóxica
para los insectos Lepidópteros y también se ha mostrado que
contiene un gen cry, denominado cry1529. Ya que esta
cepa produce una proteína extracelular activa de manera insecticida
y proteínas intracelulares activas de manera insecticida, la
invención presente incluye la selección de otras cepas de
Paenibacillus para los agentes activos de manera insecticida
extracelulares (liberados en el fluido sobrenadante del cultivo)
y/o intracelular (asociado a células). Este ejemplo ilustra cómo se
pueden producir caldos de fermentación de cepas de
Paenibacillus, cómo procesar estos caldos, y cómo ensayar las
muestras derivadas de estos caldos para determinar la actividad
insecticida.
Cepas de Paenibacillus se desarrollaron
sobre placas de agar nutriente (8 g/l de caldo nutriente, 15 g/l de
Bacto agar; Laboratorios Difco, Detroit, MI) durante 3 - 5 días a
30ºC. se recogió una única colonia y se inoculó en un matraz de 500
ml con tres deflectores que contenía 100 ml caldo de tristona soja
modificado estéril (triptona 10-g/l, peptona 7 g/l,
proteína hidrolizada de soja 3 g/l, KCl 5 g/l, K_{2}PO_{4} 2,5
g/l; Laboratorios Disco, Detroit, MI). Después de 72 horas de
incubación a 28ºC en un agitador rotatorio 150 rpm, se dispensaron
los cultivos en botellas de 500 ml de polietileno y se centrifugaron
a 4.000 x g durante 45 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación,
the se decantó el fluido sobrenadante y se filtró a través de una
membrana filtrante de 0,22 um (Millipore Corporation, Bedford, MA).
Después se concentró el cultivo filtrado 20 X usando un dispositivo
de filtro de centrifugación Centricon Plus-20 con
una membrana de corte de peso molecular de 5.000 mediante
centrifugación a 4.000 x g. El sedimento de células bacterianas se
volvió a suspender en tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH = 8).
Estas muestras después se ensayaron en bioensayo de insectos para
determinar las actividades insecticidas contenidas en el
sobrenadante procesado y muestras de sedimento de células.
Las especies de insectos incluidas en estos
ensayos fueron Diabrotica undecimpunctata howardi (gusano de
la raíz del maíz del Sur, SCR), Helicoverpa zea (gusano de la
mazorca de maíz, CEW), y Heliothis virescens (gusano de la
yema del tabaco, TBW). La dieta usada artificial para la cría y
bioensayo SCR se ha descrito previamente (Rose, R.L. y McCabe, J.M.
1973. J. Econ. Entomol. 66, 398 - 400). Dieta artificial de
lepidópteros estándar (dieta Stoneville Yellow) se usó para la cría
y bioensayo de ECB, CEW, y TBW. Alícuotas de 40 ul de muestras del
sobrenadante concentrado o de sedimentos celulares se aplicaron
directamente a la superficie de los pocillos (\sim 1,5 cm^{2})
que contiene la dieta artificial. A los pocillos de dieta tratados
se les dejó secar al aire en una caperuza de flujo estéril y cada
pocillo se infestó con un único insecto neonato incubado a partir
de huevos esterilizados en la superficie. Después se sellaron las
bandejas de ensayo, se colocaron en una cámara de crecimiento
humidificada y se mantuvieron a 28ºC durante 3 - 5 días. Las
determinaciones de la mortalidad y peso de larvas se puntuaron
después. Se usaron ocho insectos por tratamiento.
El sobrenadante concentrado y sedimentos de
células de la cepa DB482 tenía actividad insecticida contra SCR,
TBW, y CEW con relación a los tratamientos de control (Tabla 25.) Es
posible que la actividad insecticida asociada a los sobrenadantes
concentrados y sedimentos de células de DB482 son el resultado de
dos factores insecticidas diferentes, uno que está asociado a
células (es decir, de tipo Cry) y otro que se libera
de las células (es decir, de ipo TC). Sin embargo, también es
posible que las actividades insecticidas de tanto el sobrenadante
concentrado como los sedimentos celulares de DB482 son el resultado
de los mismos factores insecticidas presentes en ambas fracciones
celulares.
Este ejemplo ilustra un procedimiento para
seleccionar sobrenadantes de cultivos concentrados y sedimentos de
células a partir de cepas de Paenibacillus para identificar
cepas que poseen actividad insecticida contra insectos Coleópteros
y Lepidópteros. DB482, que es un aislamiento de Paenibacillus
apiarius se mostró en el presente documento que contenía
homólogos de tcaA, tcaB, tcaC, y tccC. El hallazgo de
actividad insecticida en DB482 confirma que la cepa DAS1529 de
Paenibacillus no es única dentro del género
Paenibacillus con relación a la producción de actividades
insecticidas contra insectos Lepidópteros. Por lo tanto, la
invención presente incluye procedimientos usados para identificar
otras cepas de Paenibacillus con actividades insecticidas
contra insectos Lepidópteros en otras especies de
Paenibacillus tales como P. chondroitinus, P.
alginolyticus, P. larvae, P. validus, P. gordonae, P. alvei, P.
lentimorbus, P. popilliae, P. thiaminolyticus, P. curdlanolyticus,
P. kobensis, P. glucanolyticus, P. lautus, P. chibensis, P.
macquariensis, P. azotofixans, P. peoriae, P. polymyxa, P.
illinoisensis, P. amylolyticus, P. pabuli, P. macerans.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Dow AgroSciences LLC
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas de acción pesticida y
polinucleótidos que se pueden obtener a partir de especies de
Paenibacillus
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DAS-101XC2
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/392,633
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-06-28
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/441,647
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-01-21
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33521
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácido nucleicos de la
inserción entera de SB12.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1087
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 3618
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 1205
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 3300
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<212> ADN
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<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1099
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<211> 3627
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 1208
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 4335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 1444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1791
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácido nucleico de ORF7,
que codifica una proteína de tipo Cry.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos codificada
por ORF7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia deácidos nucleicos del
ADNr de 16S de IDAS1529.
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<400> 16
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\newpage
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<210> 17
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos
N-terminal para la toxina purificada de la fracción
de caldo de IDAS1529.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de
tiaminasa I a partir de Bacillus thiaminolyticus.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 953
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Cepa IDAS 1529 de
Paenibacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4482
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Cepa Xwi de Xenorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3051
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> cepa Xwi de Xenorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
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<211> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB212
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i (iosina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB213
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i (iosina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB215
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i (iosina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SB217
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i (iosina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cepa DB482 de Paenibacillus
apairus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 430
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 565
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2091
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 697
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa DB482 de Paenibacillus
apairius
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa W14 de Photorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa W14 de Photorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa W14 de Photorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2748
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa W14 de Photorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa W14 de Photorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2850
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa W14 de Photorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip0,7cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2817
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa W14 de Photorhabdus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2538
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenorhabdus nematophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
Claims (3)
1. Un procedimiento de selección de un cultivo
de aislamiento de Paenibacillus para un gen que codifica una
proteína seleccionada entre el grupo constituido por una proteína de
complejo de toxina, en el que dicho procedimiento comprende al
menos una de las siguientes etapas:
(a) obtener ADN a partir de dicho cultivo y
ensayar dicho ADN para evaluar la presencia de dicho gen; y
(b) obtener proteína producida por dicho cultivo
y ensayar dicha proteína para evaluar la presencia de una proteína
que indica la presencia de una proteína que indica la presencia de
dicho gen en dicho aislamiento,
y al menos una de las siguientes
etapas:
(c) realizar la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) con al menos un cebador que se hibrida en
condiciones de PCR con un polinucleótido que codifica una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41,
(d) inmunorreacción de un anticuerpo con dicha
proteína en la que dicho anticuerpo se une a una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID
NO: 13 y la SEQ ID NO: 41, e
(e) hibridar una sonda de ácido nucleico con
dicho ADN en el que dicha sonda se hibrida en condiciones de
rigurosidad moderada a alta con un polinucleótido que codifica una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41.
2. Una proteína que tiene actividad de toxina
contra un insecto en el que una secuencia de polinucleótidos que
codifica dicha proteína se hibrida en condiciones se rigurosidad
moderada a alta con el complemento de una secuencia de ácido
nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO:
41.
3. Un procedimiento de control de un insecto en
el que dicho procedimiento comprende la etapa de poner en contacto
dicho insecto con una proteína que tiene al menos 90% de identidad
con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por las SEQ ID números: 13, y 41.
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