KR20220066296A - 벌 백신 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시는, 세균성 질병으로부터 곤충 및 곤충 집단을 치료하고 백신접종하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시는 추가로, 꿀벌 벌집을 예방적으로 면역화하여 부저병에 의한 감염으로부터 보호하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 실시형태에서, 본 개시는 추가로, 꿀벌 벌집을 예방적으로 면역화하여, 파에니바실러스 라르바에에 의해 유발된 아메리칸 부저병에 의한 감염으로부터 보호하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

벌 백신 및 사용 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 2019년 9월 18일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/901,988호에 대한 35 U.S.C. § 119(e)하의 우선권을 주장하고, 그 내용은 이 출원 전체에 참조로 포함된다.

꿀벌은, 꿀 생산뿐만 아니라 수분 서비스를 제공하는 필수 종으로 상업적으로 사용된다. 미국에서, 상업용 양봉가는 약 280만개의 벌집을 운영하고, 꿀벌은 견과류, 딸기, 과일 및 현화 야채 등의 작물을 포함하는 모든 작물의 1/3 이상의 수분을 담당한다. 또한, 꿀벌은 다양한 야생화를 수분시켜 다수의 생태계의 생물 다양성에 기여한다.

불행히도, 최근 몇 년 동안, 꿀벌 콜로니는 심각한 쇠퇴와 콜로니 손실을 겪었다. 예를 들면, 2018년 4월부터 2019년 4월까지의 1년 내에서, 미국에서 상업적으로 운영되는 벌집 280만개 벌집 중의 40% 이상이 사망했고; 이는 미국 양봉가에게만 약 7억 달러의 수익 손실에 해당하며, 수분 곤충의 부족으로 인한 과수원의 소유자 및 기타 농가의 수익 손실은 포함되지 않는다.

꿀벌 콜로니 손실의 주요 원인은 기생충을 포함하는 해충과 병원체, 바이러스 및 세균의 감염이다.

특히 파괴적인 세균성 병원체는 아메리칸 부저병(American Foulbrood; (Afb))이다. 아메리칸 부저병(Afb)은 포자 형성 세균 파에니바실러스 라르바에(Paenibacillus larvae)에 의해 유발되는 세균성 질병이다[참조: Genersch et al., J. Invertebr. Pathol. 103, (2010b)]. 이 질병은 양봉가에게 치명적일 수 있고, 근절하는 것은 곤란하다. 세균은 모든 벌집의 약 50%에 존재하고, 포자는 최대 70년까지 생존할 수 있다. 벌집의 4 내지 20%는 임의의 소정 시간에 임상 증상을 나타내고, 농부와 양봉가 모두 매년 수백만 달러의 경제적 손실을 입는다.

불행히도, 현재, 벌집을 Afb로부터 보호하기 위해 이용할 수 있는 안전하고 효과적인 예방책은 없다. 급성의 경우, 항생제가 벌 치료용으로 승인되었고, 세균의 확산을 제한하기 위해 임상 증상의 초기 단계에서 벌집에 투여할 수 있다. 그러나, 질병을 유발하는 세균이 아니라 포자이기 때문에, 이는 크게 효과가 없다. 따라서, 벌집을 연소하는 것이 질병을 억제하는 유일한 해결책인 경우가 많다.

따라서, 아메리칸 부저병 및 기타 관련 곤충 질병의 제어 및 예방을 위한 안전하고 효과적인 수단이 당해 기술분야에서 필요하다. 본 개시는 이러한 요구를 만족시키고, 또한 관련 이점을 제공한다.

본 개시는, 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei(PA)) 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis(PD))을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 사멸된 비-질병 유발 파에니바실러스 종을 사용한 여왕벌로의 투여 및/또는 백신접종(vaccinating)을 통해, 파에니바실러스 라르바에에 의해 유발된 벌 및 기타 곤충에서 아메리칸 부저병(AFB)을 포함하는 파에니바실러스 종에 의해 유발된 부저병에 대한 면역 반응을 상승시키기 위한, 및/또는 백신접종을 위한, 치료 및/또는 예방하기 위한, 신규한 조성물, 백신 제형 및 방법에 관한 것이다. 일 태양에서, 벌은 꿀벌이다.

당해 기술분야에서 공지된 것과 대조적으로, 본 출원인은, Afb 등의 파에니바실러스 종에 의해 유발되는 질병에 대하여 벌을 치료 및/또는 예방적으로 면역화시키기 위해, 비-질병 병원체로부터의 자극을 적용함으로써 투여 및/또는 면역화를 기재한다. 병원체 및 백신 균주의 특정 일치는 요구되지 않는다.

따라서, 일 태양에서, 본 개시는, 광범위한 일반화된 보호를 제공하기 위해, 질병 병원체 이외의 병원체로부터 유래하는 면역화 자극을 적용하거나 투여함으로써 곤충을 질병으로부터 보호하는 방법을 제공한다.

예시적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 것은, 파에니바실러스 유충(PL)에 의한 감염에 대한 보호를 위해, PD 및 PA 등의 사멸된 파에니바실러스를 조합 또는 단독으로 함유하는 조성물이다. 조성물은 또한, 예를 들면, 꿀벌 사료(feed) 등의 벌 사료를 함유할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 개시는 벌, 예를 들면, 꿀벌의 집단(population)에서 아메리칸 부저병을 예방하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 사멸된 PB 또는 PA 또는 이 둘의 조합으로 이루어진 백신 제형을 여왕벌에게 투여하거나 공급(feeding)하는 것을 포함할 수 있다. 일 태양에서, 약 1.5 × 10⁶ 내지 약 1.5 × 10⁸ 항원 단위/그램의 곤충 먹이(insect food)가 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충에게 제공되거나 공급된다.

일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 것은, PD 또는 PA 또는 이들의 조합 등의 사멸된 파에니바실러스 속 등의 세균 속(bacterial genus)의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 유발 세균 종(non-disease causing bacterial species)의 전체 세포(whole cell) 또는 세포벽 단편, 및 담체를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 조성물이다. 일 태양에서, 조성물은, PD 또는 PA 또는 이 둘의 조합 등의 사멸된 파에니바실러스 등의 세균 속의 적어도 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상의 사멸된 비-질병 유발 세균 종의 전체 세포 또는 세포벽 단편을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 조성물 제형을 위한 비-질병 유발 세균 종의 비제한적 예는 파에니바실러스(Paenibaccilus), 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei; PA) 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis; PD) 속의 종, 또는 이들의 조합이다. 추가 태양에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 사멸된 파에니바실러스 종이 조성물에 포함되고, 여기서 상기 종은 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이다. 추가 태양에서, 조성물 중의 사멸된 파에니바실러스 종은 단독으로 또는 서로 조합하여 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei) 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis)를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진다.

담체의 비제한적 예는 고체 또는 액체 담체일 수 있고, 필요에 따라, 방부제, 곤충 영양소 또는 기타 착색제를 포함할 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 담체는 여왕벌 웨이퍼(wafer) 또는 당 사료 등의 곤충 먹이이다.

일 태양에서, 조성물 중 박테리아 속의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 유발 세균 종의 전체 세포 또는 세포벽 단편은 약 1.5 × 10⁶ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위, 또는 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 10¹⁰ 항원 단위, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10⁹ 항원 단위, 또는 적어도 1.5 × 10⁷ 항원 단위, 또는 적어도 약 1.5 × 10⁸ 항원 단위, 또는 적어도 약 1.5 × 10⁹ 항원 단위, 또는 적어도 약 1.5 × 10¹⁰ 항원 단위의 조성물 또는 먹이의 그램당 용량(dose)당 총 양으로 존재한다.

예시적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 것은, 파에니바실러스 라르바에(PL)에 의한 감염으로부터 벌 유충 및 여왕벌 자손을 보호하기 위해 PD 및 PA 등의 사멸된 파에니바실러스를 조합 또는 개별적으로 함유하는 조성물이다. 조성물은 또한, 예를 들면, 꿀벌 사료 등의 곤충 사료를 함유할 수 있다. 파에니바실러스의 전체 세포 또는 세포벽 단편의 범위는 본 명세서에 제공된 범위에 있다.

다른 실시형태에서, 본 개시는, 예를 들면, 꿀벌 등의 벌의 집단에서 아메리칸 부저병을 예방하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은, 일벌, 유충, 육아벌 및/또는 여왕벌에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물, 및/또는 PD 또는 PA 또는 이들의 조합 등의 사멸된 파에니바실러스를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 백신 제형을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 숙련된 당업자에게 명백한 바와 같이, 여왕벌에게 먹이를 공급하거나, 또는 일벌이나 육아벌이 먹이를 섭취하거나 여왕벌에게 공급할 수 있다. 또한, 벌 유충에게 또한 조성물을 공급할 수 있다. 파에니바실러스의 전체 세포 또는 세포벽 단편의 범위는 본 명세서에 제공된 범위에 있다.

다른 실시형태에서, 본 개시는 벌, 예를 들면, 꿀벌 집단에서 아메리칸 부저병 등의 파에니바실러스 종에 의해 유발된 질병의 치료를 제공한다. 상기 방법은 일벌, 육아벌, 유충 및/또는 여왕벌에게 PD 또는 PA 또는 이들의 조합 등의 사멸된 비-질병 유발 파에니바실러스를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 조성물 또는 제형을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 태양에서, 조성물은 Afb 등의 파에니바실러스 라르바에에 의해 유발된 질병을 치료하기 위한 사멸된 PD 또는 PA를 포함한다. 파에니바실러스의 전체 세포 또는 세포벽 단편의 범위는 본 명세서에 제공된 범위에 있다.

다른 실시형태에서, 본 개시는, 예를 들면, 꿀벌 유충 또는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 치료된 여왕벌의 자손 등의 벌의 집단에서 아메리칸 부저병을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일벌, 육아벌 및/또는 여왕벌에게 PB 또는 PA 또는 이의 조합 등의 사멸된 비-질병 유발 파에니바실러스를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 제형을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 파에니바실러스의 전체 세포 또는 세포벽 단편의 범위는 본 명세서에 제공된 범위에 있다.

또한, 본 명세서에 제공된 것은, PL에 의해 유발되는 것으로 공지된 부저병 등의 파에니바실러스 종에 의해 유발되는 질병에 대한 꿀벌 유충에서 면역 반응을 치료 또는 면역화시키거나 상승시키는 방법이고, 상기 방법은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유효량의 조성물을 육아벌, 일벌 또는 여왕벌 또는 꿀벌 유충에게 투여하고, 이에 의해 여왕벌, 및 여왕벌에 의해 생성된 꿀벌 유충 및 자손을 면역화시키는 것을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 본질적으로 이들로 이루어진다. 일 태양에서, 부저병은 파에니바실라세아에과에 속하는 임의의 종에 의해 유발된다. 이론에 구속되지 않고, 유충에게 전달되는 항원의 검출은 여왕벌의 난소에서 검출될 수 있다. 이는 질병으로부터 유충을 백신접종한다.

이 방법은 PL, PA 및 PD 등의 파에니바실라세아에(Paenibacillaceae)과의 구성원에 의해 유발되는 부저병으로부터, 여왕벌의 유충 및 일벌을 보호하여, 백신 조성물을 섭취한 여왕벌을 통해 부저병에 대해 면역화된 유충의 집단을 제공하는 데 유용하다.

추가로, 본 명세서에서 제공된 것은, 본 명세서에 기재되어 있는 조성물을 일벌 및 여왕벌에게 투여하는 것을 포함하거나, 또는 대안적으로 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 벌, 예를 들면, 꿀벌의 집단에서 Afb 등의 부저병을 치료 및/또는 예방하는 방법이고, 일 태양에서, 상기 조성물은 파에니바실러스 종으로부터의 사멸된 비-질병 전체 또는 단편을 포함하거나, 또는 실질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 여전히 이들로 이루어진다. 또 다른 태양에서, 파에니바실러스의 사멸된 비-질병 종은 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 조성물은 파에니바실러스 알베이 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스, 또는 기타 파에니바실러스, 또는 파에니바실라세(Paenibacillace)과의 세균의 기타 불활성화된 세포 또는 단편과 조합하여 이들 둘의 조합인 파에니바실러스의 사멸된 비-질병 종 중의 하나 또는 둘 다를 포함한다.

이 방법의 일 태양에서, 투여는 일벌, 육아벌, 유충 및/또는 여왕벌에게 적합한 양의 여왕 캔디 또는 당 사료의 웨이퍼를 공급하는 것을 포함하고, 여기서 백신, 조성물 또는 제형의 용량당 투여되는 양은 약 1.5 × 10⁶ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10¹⁰ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10⁹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 1.5 × 10⁷ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 약 1.5 × 10⁸ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 약 1.5 × 10⁹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 약 1.5 × 10¹⁰ 항원 단위/먹이 그램의 파에니바실러스의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 종 또는 이의 단편을 포함한다.

추가로 제공되는 것은, 곤충 백신 및/또는 조성물 및/또는 제형을 제조하는 방법이고, 이는 세균 속의 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개 이상의 사멸된 비-질병 유발 세균 종으로부터, 파에니바실러스 종의 적어도 1개의 사멸된 비-질병 유발 세균 종으로부터의 전체 세포 또는 세포벽 단편을 단리하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 단리된 항원 단위(isolated antigen unit)를, 여왕벌 웨이퍼 또는 젤 등의 곤충 먹이 또는 담체와 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 일 태양에서, 비-질병 유발 세균 종은 파에니바실러스 속의 종, 예를 들면, 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei) 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 또는 이들의 조합이다. 다른 태양에서, 사멸된 파에니바실러스 종은 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 사멸된 파에니바실러스 종은 파에니바실러스 알베이 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스이다.

일 태양에서, 용량당 박테리아 속의 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개 이상의 사멸된 비-질병 유발 세균 종의 전체 세포 또는 세포벽 단편은 약 1.5 × 10⁶ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10¹⁰ 항원 단위/먹이 그램, 또는 약 1.5 × 10⁸ 내지 약 1.5 × 10⁹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 1.5 × 10⁷ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 약 1.5 × 10⁸ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 약 1.5 × 10⁹ 항원 단위/먹이 그램, 또는 적어도 약 1.5 × 10¹⁰ 항원 단위/먹이 그램의 사멸된 비-질병 종의 파에니바실러스 또는 이의 단편으로 제공된다.

또한, 본 명세서에 제공된 것은, 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 치료 및/또는 백신 조성물, 게다가 본 명세서에 기재된 치료 및/또는 백신 조성물의 섭취에 의해 면역화된 여왕벌로부터의 벌 또는 곤충 유충 또는 유충 집단을 제공한다. 조성물 및/또는 제형은 본 명세서에 기재된 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트(kit)로 제공될 수 있다.

본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1A, 패널 1-3 및 도 1B는 꿀벌에서 Afb에 대한 백신접종의 메커니즘을 설명하고, 파에니바실러스 종에 의해 유발된 기타 질병에 대한 백신접종 또는 치료의 예이다. 패널 1) 치료 및 백신접종: 일벌에게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물이 공급된다. 조성물(경구 백신)을 포함하는 종래의 여왕 사료(여왕 캔디)는 일벌 또는 육아벌에 의해 섭취되고, 하악샘의 로열 젤리에 첨가된다. 여왕벌 또는 여왕벌 유충은 일벌과 육아벌이 로열 젤리를 함유하는 조성물(예: 백신)을 공급한다. 패널 2) 백신은 유충과 여왕벌의 지방체에 저장되어 있고, 여왕벌이 완전히 발달하면, 이는 여왕벌의 난소로 운반된다. 전달은 난황 단백질 비텔로게닌(Vitellogenin)에 의해 매개된다. 패널 3)은 유충 처리를 나타낸다. Y 축은 감염 후 72시간의 유충 생존율(%)을 나타낸다. 사멸된 아메리칸 부저병에 의한 여왕벌 백신접종은 병원체에 감염된 더 내성의 유충을 초래한다(회색 막대, 백신: 46% 유충 생존율 대 위약: 23% 유충 생존율, χ² =4.32, p=0.004). 감염이 없는 대조군 조건하에서 유충 생존에 부정적 영향은 없다(흑색 막대, 백신: 35% 유충 생존율 대 위약: 32% 유충 생존율, χ² =3.57, p=0.06. 도 1B는 또한 백신접종의 메커니즘을 그래프로 도시한다.
도 2는 항원으로서 사용되는 세균 단편을 수득하기 위한 예시적 방법을 그래프로 도시한다. 이 도면은 문헌[참조: Lodish, H. (ed) Molecular Cell Biology, Sixth Edition, 2008 W.H. Freeman and Company]으로부터 복제된 것이다.
도 3A 및 3B는 여왕벌에게 파에니바실러스 덴리티포르미스(Paenibacillus denritiformis)를 투여함으로써 여왕벌의 투여 및/또는 예방접종의 결과를 나타낸다. 꿀벌에게 PD를 접종하면, 자손이 PA의 감염으로부터 보호된다(도 3A)(PA에 감염된 경우의 위약(밝은 회색)과 PD(진한 회색) 사이의 생존 회귀의 대비). 도 3B는 PL에 의한 감염의 결과(생존 회귀, PL로 감염된 경우의 위약(밝은 회색)과 PD(진한 회색) 사이의 대비)를 나타낸다. 사멸된 파에니바실러스 종에 의한 여왕벌의 백신접종은 병원체로 감염된 보다 내성이 있는 유충을 초래한다. (PD 대 PA 회색 막대 ± SD, 백신: 4 약 60% 유충 생존율 대 위약: 40% 유충 생존율, p=0.08) 및 (PD 대 PL 회색 막대 ± SD 35% 유충 생존율 대 위약 25% 유충 생존율, p= 0.18). 감염이 없는 대조군 조건하에서 유충 생존에 부정적 영향은 없다(회색 막대 ± SD, 백신: 15% 유충 생존율 대 위약: 5% 유충 생존율, p>0.05).

정의

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 요소를 설명하는 문맥에서 "a" 및 "an" 및 "the" 등의 단수형 관사 및 유사한 지시어는, 본 명세서에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "약"은 당업자에 의해 이해되고 그것이 사용되는 상황에 따라 어느 정도 변화할 수 있다. 용어 "약"이 사용되는 문맥을 고려하면, 당업자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 있는 경우, "약"은 특정 용어의 최대 ±10%를 의미할 것이다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 모든 목적을 위해, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 또한, 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 이의 하위 범위의 조합을 포함한다. 추가로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "예시적"은 "예, 실례 또는 예시로서 기능하는" 것을 지칭하고, "기타 실시형태보다 바람직한" 또는 "유리한" 것은 아니다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 특히, 본 개시는 꿀벌 사육의 분야에서 일상적 기술을 이용한다.

본 명세서에 사용된 용어 "아메리칸 부저병" 또는 "아메리칸 부저병 질병" 또는 "Afb"는 포자 형성 세균 파에니바실러스 라르바에(Paenibacillus larvae)에 의해 유발되는 꿀벌 동배의 치명적 세균 질병을 지칭한다. 파에니바실러스 라르바에는 꿀벌에서 아메리칸 부저병을 유발하기 때문에, 파에니바실러스 라르바에는 본 명세서에서 "질병 유발" 세균 또는 "질병 종"으로 지칭된다.

본 명세서에 사용된 용어 "비-질병 유발" 종 또는 "비-질병 종"은 병원성일 수도 있고 아닐 수도 있지만, 표적화되는 질병을 유발하지 않는 세균의 종을 지칭한다. 예를 들면, 파에니바실러스 라르바에에 의해 유발되는 아메리칸 부저병과 관련하여, 예를 들면, 환경에서 발견될 수 있지만 인간 또는 인간 창상에서 발견되지 않을 수 있는 예시적 비-질병 파에니바실러스 종은, 예를 들면, 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 및 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei) 및 파에니바실러스 덴드리티포르미스(Paenibacillus dendritiformis)는 병원성이고, 유충에 수란병을 유발할 것이지만, 이 질병은 파에니바실러스 라르바에에 의해 유발되는 아메리칸 부저병은 아니고, 따라서 질병을 형성하지 않는 종이다.

본 명세서에 사용된 용어 "꿀벌"은 주로 꿀의 생산 및 저장, 및 밀랍으로부터의 다년생 콜로니 둥지의 구축에 의해 구별되는 아피스(Apis) 속의 구성원인 임의의 벌을 의미한다. 예를 들면, 2종류의 꿀벌, 즉 에이. 멜리페라(A. mellifera) 또는 에이. 세라나 인디카(A. cerana indica)는 종종 양봉가가 유지한다. 꿀벌은 미크라피스(Micrapis) 아속의 아피스 안드레니포르미스(Apis andreniformis) 및 아피스 플로레아(Apis florea), 메가피스(Megapis) 아속의 아피스 도르사타(Apis dorsata), 아피스(Apis) 아속의 아피스 세라나(Apis cerana), 아피스 코스췌브니코비(Apis koschevnikovi), 아피스 멜리페라(Apis mellifera) 및 아피스 니그로신크타(Apis nigrocincta)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "벌 콜로니" 또는 "꿀벌 콜로니"는 벌의 사회적 단위, 예를 들면, 콜로니를 포함하는 꿀벌을 지칭한다. 사회적 단위는 벌에 의해 이용되는 임의의 시스템 조직이 될 수 있고, 이는 그룹 또는 콜로니의 생존을 촉진하는 것을 목적으로 한다. 통상, "벌 콜로니"는 둥지 건설, 먹어 수집 및 번식에 협력하는 수천 마리의 벌로 구성된다. "벌 콜로니"의 각 구성원은 수행해야 할 명확한 임무가 있고, 생존 및 번식을 위해서는 콜로니 전체의 공동의 노력이 필요하다. 콜로니는 통상 늦은 봄과 여름에 걸쳐 단일 여왕, 수천 마리의 일벌, 수백 개의 드론으로 구성된다. 따라서, 벌 콜로니는 "꿀벌의 집단"이다.

통상, "꿀벌 콜로니"는 늦은 봄부터 여름에 걸쳐 피크에 도달하고, 겨울에는 최저점에 도달한다. 콜로니의 사회적 구조는 여왕과 일벌에 의해 유지되고, 효과적 커뮤니케이션 시스템에 의존한다. 사육된 꿀벌은 "벌집" 또는 "꿀벌 벌집"에서 사육된다. 따라서, 용어 "벌집" 또는 "꿀벌 벌집"은 벌의 콜로니, 예를 들면, 꿀벌의 콜로니의 서식지로서 기능하는 구조를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "꿀벌"은 아피스(Apis) 속의 구성원인 임의의 벌이다. 2종류의 꿀벌, 에이. 멜리퍼(A. mellifer), 에이. 세르난 인디카(A. cernan indica), 에이. 안드레니포르미스(A. andrreniformis), 에이. 플로레아(A. florea), 에이. 코스쉐브니코비에(A. koschevnikovie) 및 에이. 니그로신크타(A. nigrocincta)가 이의 예이다.

용어 "유효량" 또는 "~에 유효한 양" 또는 문법적으로 동등한 용어 또는 표현은, 예를 들면, 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해, 여왕벌, 유충, 일벌 또는 육아벌 또는 꿀벌 콜로니에 임의의 수단으로 투여되는 경우, 해당 질병, 예를 들면, 부저병의 치료 또는 예방을 수행하기에 충분한 양을 지칭한다. 통상, 여왕벌과 이의 각각의 알을 치료 및/또는 면역화하기 위한 항원의 유효량은 먹이 용량/그램당 약 1.5×10⁷ 내지 1.5×10¹¹ 및 이들 사이의 범위이다. 일 실시형태에서, "유효량"은, 여왕벌에게 공급할 때에, 여왕벌 및 여왕벌이 생산하는 유충을 백신접종하기에 충분한 조성물의 양을 지칭하고, 따라서 백신접종된 여왕벌의 유충은 백신 미접종 여왕벌의 유충보다 아메리칸 부저병에 의한 감염에 대해 적어도 50%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 15%, 또는 대안적으로 적어도 10%, 또는 적어도 5% 이상 내성이 있다. 이를 측정하기 위해, 하기 프로토콜을 따른다. 여왕벌 제공자에 따라, 여왕벌은 항원을 포함하는 웨이퍼와 함께 여왕벌 케이지에 배치된다. 각 여왕벌에게는 6 내지 10마리의 일벌이 제공되고, 암소에서 약 23 내지 26℃의 주위 온도에서 8일 동안 실험실에 보관된다. 생존은 매일 기록된다. 8일 후, 여왕벌은 케이지 내의 수용자 벌집에 삽입되고(이는 사전에 여왕 세포에 대해 검사되고, 일부가 발견되는 경우는 제거됨), 벌집에 대한 접근을 가능하게 하기 위해, 케이지의 문을 개방한다(케이지의 설계에 따라 상이함). 여왕벌이 해방되는지의 여부를 확인하기 전에, 모든 벌집은 5일 동안 순응하는 것이 허용된다. 그 후, 여왕벌과 알의 존재 여부가 기록된다. 여왕벌 배치로부터 10일 후, 모든 벌집에서 알의 존재를 모니터링한다. 적절한 산란 활동(벌집당 약 60 내지 100개의 알)의 경우, 백신 효능을 연구하기 위한 감염 실험은 여왕벌을 벌집에 배치한 후부터 2주 후에 수행할 수 있다.

각 벌집으로부터, 벌집당 15 내지 30마리의 유충(L1)이 실험실 조건에서 제작되고, 48시간 동안 독성 포자에 노출시키고, 이어서 포자가 없는 새로운 유충 먹이로 옮긴다. 포자는 유충 먹이와 혼합하고, 이는 로얄 젤리 50%, 글루코즈 6%, 프럭토즈 6%, 효모 추출물 1%, 증류수 37%로 구성되어 있다. 새로운 먹이는 2일마다 제공되고(2일차 = 700μl, 4일차 = 800μl, 6일차 = 1000μl, 7일차 = 1000μl, 8일차 = 모니터링 종료), 생존은 매일 모니터링되고; 이는 관찰 중에 사멸 유충이 제거될 것이기 때문이다. 유충은 379 마이크로리터 액적의 유충 먹이(0일차)로 제작되고, 액적당 5마리의 유충이 배치된다. 먹이에 포자가 없는 병행 그룹은 환경 조절로서 기능한다. 상이한 그룹에서 유충의 생존에 기초하여, 백신 효능이 계산될 것이다. [측정 방법을 알려주세요.]

본 명세서에 사용된 용어 "육아벌"은, 로열 젤리를 생산하는 땀샘으로부터 분비되는 일벌 젤리를 일벌 유충에게 공급하는 벌을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "일벌"은 콜로니 여왕벌의 완전한 번식 능력을 결여하는 모든 암컷(진사회적) 벌을 의미한다.

용어 "동배(brood)"는, 총칭하여 동배로서 공지되어 있는 3개 발달 단계를 의미한다. 벌은 알로부터 개시하고, 부화하여 유충(복수)이 된다. 유충은 다리가 없고, 먹기에 특화되어 있다.

용어 "예방적" 또는 "백신"은, 질병, 예를 들면, 꿀벌 질병, 예를 들면, 동배에서 세균 파에니바실러스 유충에 의해 유발되는 부저병을 예방하도록 작용하는 약제를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "백신접종"은, 질병 또는 병태의 발생을 방지(예방적 치료) 또는 동배, 유충, 자손 또는 콜로니에서 질병의 확산을 억제(이의 발달을 지연 또는 정지)하도록, 질병에 대한 면역성을 생성하기 위한 수단, 예를 들면, 파에니바실러스 유충에 대한 면역성을 생성하기 위한 수단을 지칭한다.

용어 "치료"는 여왕벌의 면역 반응을 상승시키고 이어서 이들의 자손에게 전달되는 것을 의미한다.

용어 "면역 반응을 상승시킨다"는 백신 또는 치료가 꿀벌 여왕벌의 난소 또는 발달 중의 난자에서 비질병 유발 항원을 생성하는 것을 의미한다.

"항원/단위"는 비-질병 병원체의 세포 또는 항원성 단편의 수를 의미한다.

용어 "용량"은 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충에게 1회 급식 또는 단위량의 먹이로 제공되는 양을 의미한다.

개시를 수행하기 위한 방식

꿀벌, 특히 아피스 멜리페라(Apis mellifera)는 북미에서 대부분의 상업용 작물의 주요 수분 매개체이고, 세계에서 가장 활발하게 관리되는 수분 매개체이다. 따라서, 꿀벌은 상당한 경제적 영향을 미치고, 따라서 건강한 벌 콜로니를 유지하는 것은 다수의 농업 관행의 중요한 측면이다.

최근, 상업용 꿀벌 콜로니는 세균 파에니바실러스 라르바에(Paenibacillus larvae)에 의해 유발된 아메리칸 부저병(Afb)을 포함하는 동배 질병뿐만 아니라, 증상이 Afb와 유사한 PA 및 PD에 의해 유발된 동배 질병 등의 질병으로 인해 막대한 손실을 입었다.

아메리칸 부저병(Afb)은 벌 콜로니의 파괴적 질병이고, 이는 전염성이고, 치료가 매우 곤란하다. 콜로니 전체를 전멸시킬 수 있다. 종종, Afb에 대한 가장 효과적 치료법은 단순히 모든 벌집과 장비를 태우는 것이다. 다행히도, 본 개시는 꿀벌 여왕벌 및 이들의 자손을 아메리칸 부저병에 대해 치료 및/또는 백신접종하고, 이에 의해 꿀벌 콜로니를 예방적으로 면역화시켜 질병을 예방하기 위한 신규한 조성물 및 방법을 제공한다.

Afb에 대한 꿀벌의 면역화는 동일한 종의 사균, 예를 들면, PL을 접종하여, Afb 등의 PL-유발 질병에 대해 면역화함으로써 달성될 수 있음이 이전에 기재되어 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2018/021529호). 출원인은, 다른 비-질병 유발 세균 종을 사용하여, 아메리칸 부저병에 대해 벌을 예방적으로 치료 및/또는 면역화하기 위한 백신을 제조할 수 있음을 개시했다. 추가로, 이 보호는 병원성 및 비병원성 모두 하나의 파에니바실러스 균주에 의한 백신접종이 또 다른 파에니바실러스 균주에 의한 감염으로부터 보호될 수 있는 다양한 동배 질병에 적용된다. 출원인은 질병 병원체와 백신 균주 사이의 특정 일치가 필요하지 않음을 최초로 개시했다. 이것은 본 개시를, 이러한 것을 고려하거나 개시하지 않는 선행 기술과 구별했다.

비-질병 유발 세균이 숙주 생물을 질병으로부터 방어한다는 것은 예상치 못한 것이다. 질병 유발 병원체는 고도로 특이적 병원성 인자, 예를 들면, 바실러스 티린기엔시스(Bacillus thyringiensis)의 Cry-독소를 갖는다. 이 세균은 다양한 곤충 그룹을 감염시키는 곤충병원성 사상균이지만, 감염성은 생성된 독소의 유형에 따라 상이하다. 예를 들면, Cry-2A는 레피도프테란(Lepidopteran) 숙주만을 감염시키고, Cry4B는 모기를 감염시키고, mCry-3A는 딱정벌레를 감염시킨다. 동일한 세균 종 내에서도 이러한 높은 숙주 특이성은 본 개시의 발견을, 비-질병 유발 세균에 의한 백신접종으로 숙주를 보호할 수 있게 하고, 이는 예상 외이고 신규하다.

따라서, 본 개시의 일 태양은, 질병을 유발하지 않는 파에니바실러스 종으로부터 유래된 치료 및/또는 면역화 자극을 적용함으로써 곤충을 질병으로부터 치료 및/또는 보호하고, 이에 의해 광범위한 스펙트럼의 일반화된 보호를 제공하는 방법이다. 본 명세서에 개시된 백신 제형을 사용하여 보호될 수 있는 곤충의 비제한적 예는, 예를 들면, 아메리칸 부저병의 원인균인 파에니바실러스 유충에 의해 유발되는 감염 및 질병으로부터 보호될 수 있는 벌, 꿀벌(Apis sp.), 땅벌(Bombus sp.)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 자극을 적용하는"은 질병-유발 파에니바실러스 종으로부터 질병을 예방하는 것을 의미한다. 조성물 또는 제형 또는 백신은 동면의 전후에 1년에 1회 또는 수회, 예를 들면, 1년에 1회, 2회, 3회, 또는 그 이상 벌 또는 유충에게 투여될 수 있다. 이는 단일 용량 또는 복수 용량으로 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "속"은 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 통상적인 의미를 갖는다. 일반적으로, 속은 생물의 생물학적 분류에 사용되는 분류학적 랭크로서 정의되고, 생물학적 분류의 계층에서, 속은 종(species) 위에 있고, 과(family) 아래에 있다. 예를 들면, 파에니바실러스 속은 애쉬(Ash et al. 1994)에 의해 분류된 기능적 혐기성의 내생포자-형성 세균이다[참조: 예를 들면, Ash, C., Priest, F. G. & Collins, M.D. (1994). Paenibacillus gen. nov. and Paenibacillus polymyxa comb. nov. In Validation of the Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSB, List no. 51. Int J Syst Bacteriol 44, 852]. 질병 병원체는 감염성 생물학적 인자이고, 이는 숙주에서 질병을 유발하고, 생물의 기능을 방해하는 등의 특정 특징에 의해 특성화되고, 이의 사망을 포함하는 숙주를 심각하게 손상시킨다. 특정 속 또는 속의 복수의 종의 세균에 의한 면역화가 숙주의 감염으로부터 보호하고, 백신 제제에 포함되어 있지 않은 질병 유발 병원체와 조우한 경우, 광범위한 일반화된 보호가 달성된다.

예시적 실시형태에서, 본 개시는 파에니바실러스 라르바에가 아닌 사멸된 파에니바실러스 종, 예를 들면, 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei; PA) 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis; PD)에 의한 여왕벌의 백신접종을 통해, 벌집에서 아메리칸 부저병(AFB)을 치료 및/또는 예방하기 위한 신규 백신 조성물 및/또는 제형 및 방법을 제공한다.

곤충 집단에서 세균성 질병을 예방하기 위한 조성물의 제조

일반적 방법

이 개시는 꿀벌 사육의 분야에서 일상적 기술을 이용한다. 꿀벌 사육에서 용어와 방법을 개시하는 기본 텍스트에는, 예를 들면, 문헌[참조: Queen Rearing and Bee Breeding Harry H. Laidlaw and Robert E. Page (1997)]이 포함된다. 하기 방법은 예시만을 목적으로 하고, 기타 곤충, 질병 및 세균에 보다 광범위하게 적용될 수 있다.

경구 백신의 조제

실시형태에서, 본 개시는 특정 표현형의 생물을 포함하는 조성물을 제공한다. 이 조성물은 백신 제제 중의 종에 의해 유발되는 질병뿐만 아니라, 동일한 속의 다른 종에 의해 유발되는 유사한 질병에 대해서도 보호한다. 다른 종에 의해 유발되는 질병으로부터 보호할 수 있는 이러한 종을 비-질병 생물이라고 한다.

예를 들면, 모든 파에니바실러스(Paenibacillus) 종은 외관이 매우 유사한 유충병을 유발한다. 그러나, 파에니바실러스 라르바에 감염만이 아메리칸 부저병을 유발한다. 다행히도, 본 개시는 파에니바실러스 라르바에 감염 및 기타 세균 동배 감염으로부터 보호하는 능력을 제공한다. 따라서, 용어 "질병-유발" 및/또는 "비-질병 유발"은 표적화된 질병과 관련된 상대적 용어이다. 예를 들면, 원인 물질이 파에니바실러스 라르바에인 아메리칸 부저병과 관련하여, 파에니바실러스 라르바에는 "질병 유발" 세균이다. 이와 관련하여, 기타 파에니바실러스 종, 예를 들면, PA 및/또는 PD는 "비-질병 유발"이다.

실시형태에서, 비-질병 생물을 포함하는 백신 조성물은 실시예 1에 개시된 바와 같이 제조된다. 요약하면, 비-질병 유발 세균은 액체 또는 고체 배지(한천 플레이트, 발효조, 플라스크) 상에서 성장되고, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수집된다. 한편, 액체 또는 고체 배지 모두는 식물 또는 동물 기원일 수 있다.

수집된 세균의 불활성화에 대한 비제한적 예는 포르말린, 2성분 에틸렌이민(BEI) 또는 열 및 압력(오토클레이빙)의 사용이다. 세균을 사멸시키기 위해 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 사멸 후, 세포를 용해하고, 약 10,000g 내지 약 60,000g의 속도로 1 내지 4시간(또는 용적, 크기 및 농도에 따라 그 이상) 동안 원심분리함으로써 거대 단편을 분리할 수 있다. 실시예 1에 개시된 바와 같이, 상청액을 회수하고, 추가로 분별한다. 또는, 전체 세포 조제물을 사용할 수 있다.

상청액은 동결 건조(freeze dried), 동결건조(lyophilized) 또는 용액 상태일 수 있고, 예를 들면, 사료, 스프레이, 주사 등의 상이한 형태로 벌에게 투여될 수 있다. 1가지 투여 방식은 양봉 용품점에서 포장된 상태로 구입하거나, 또는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있는 여왕 캔디의 제조를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.

예시적 실시형태에서, 조성물 및/또는 백신 조제물은 하악샘에 로열 젤리와 함께 백신을 도입하고, 이를 여왕벌에게 공급하는 일벌에게 제공하거나, 또는 병원성 세균 질병(예를 들면, 아메리칸 부저병)에 대해 여왕벌 및 이의 생성되는 동배 유충을 효과적으로 치료 또는 면역화하기 위해 여왕벌에게 직접 제공하고, 예를 들면, 파에니바실러스를 갖는 백신 제제는 3 내지 12개월 동안 아메리칸 부저병으로부터 보호할 수 있다.

조성물의 사용

본 명세서에 개시된 경구 백신 기술은 여왕벌 사료(queen feed)("여왕 캔디"), 여왕벌, 육아벌 또는 일벌에 의해 섭취되고 로열 젤리를 통해 여왕벌 또는 여왕벌 유충에게 공급되는 기타 임의의 벌 사료 또는 보충제를 통해 투여된다. 이는 세대를 초월한 면역 프라이밍의 개념을 기반으로 하고[참조: 예를 들면, Salmela H, Amdam GV, Freitak D (2015) Transfer of Immunity from Mother to Offspring Is Mediated via Egg-Yolk Protein Vitellogenin. PLoS Pathog 11(7):e1005015.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005015.], 이는 여왕벌을 면역시키고, 이어서 항원과 획득한 자연 면역 신호를 알에 전달하고, 이에 의해 새롭게 부화한 유충 및 벌을 유해한 병원체로부터 보호한다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 곤충 면역 시스템은 특정 병원체를 인식하고, 자손 면역을 촉진할 수 있다. 곤충 암컷이 면역 유발제를 발생 중의 난모세포로 전달하면, 면역 프라이밍의 높은 특이성을 달성할 수 있다. 이 전달의 배후에 있는 분자 메커니즘은 난황 단백질 비텔로게닌을 통해 발생한다. 비텔로게닌은 세포벽을 구성하는 세균 또는 세균 단편에 결합하고, 병원체 관련 분자 패턴을 인식하여 면역 프라이밍 신호를 전달한다[참조: 예를 들면, Salmela H, Amdam GV, Freitak D (2015) supra].

이론에 구속되지 않고서, 세균 속 등의 특정 세포벽 마커는 파에니바실러스 종을 공유하는 것으로 믿어진다. 전체 세포 또는 세포벽 단편의 일부로서 이러한 세포벽 마커에 대한 노출은, 세포벽 마커가 유래하는 종뿐만 아니라, 속의 기타 구성원에 대한 면역을 자극한다. 따라서, 속의 1종, 예를 들면, 비질병 유발 종으로부터의 세포벽 마커에 대한 노출은, 속의 기타 질병-유발(병원성) 구성원을 포함하여, 속의 기타 구성원에 대한 면역을 자극한다. 따라서, 예시적 실시형태에서, 적어도 피. 알베이 또는 피. 라르바에를 포함하는 조성물로 면역화하는 것은 피. 알베이에 의한 감염으로부터 및 또한 피. 라르바에에 의한 감염으로부터 보호한다.

일 실시형태에서, 경구 백신의 조성물은 여왕벌에 대한 통상의 사육 관행의 일부로서 전달되지만, 이들로 한정되지 않는다. 여왕벌은 8 내지 10마리의 일벌과 함께 최대 1주 또는 2주 동안 지속할 수 있는 충분한 사료(여왕벌 캔디)가 공급되는 '여왕벌 케이지'에 배치된다. 경구 백신이 여왕벌 캔디에 첨가되고, 여왕벌과 일벌은 3 내지 7일 동안 섭식하고, 그 후 여왕벌은 새로운 벌집에 배치되고, 산란하여 새로운 보호된 벌 콜로니를 생성할 준비를 한다.

또 다른 실시형태에서, 백신은 여왕벌의 선적 박스 내의 여왕 캔디에 배치하거나, 또는 육아벌이 여왕 캔디와 함께 백신을 소비하고, 여왕벌 유충 또는 여왕벌에게 공급되는 로열 젤리와 혼합되는 로열 젤리 땀샘으로 이를 수송하는 육아벌 또는 여왕벌 사육 벌집에 배치된다.

또 다른 실시형태에서, 백신은 여왕벌 사육 벌집에서 유충 사육 단계 동안에 발육 중의 여왕벌 유충에게 공급된다.

실시예

실시예 1

하기 실시예는 유효량의 1종 이상 종의 사멸된 단편화 파에니바실러스를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 예시적 방법을 예시한다.

파에니바실러스 알베이(PA) 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스(PD)(또는 기타 항원)는 여왕벌에 대한 백신 또는 치료제를 제공하기 위해 준비된다. 하기 개시된 방법은 모든 백신 조제물에 걸쳐 균일성을 제공한다.

종자 배양물은 파에니바실러스 알베이(PA) 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스(PD) 또는 기타 파에니바실러스 종의 동결 글리세롤 스톡으로부터 접종된다. 접종된 플레이트를, 암 성장 챔버에서 4 내지 12일 동안 35℃에서 성장시킨다.

파에니바실러스 콜로니는 플레이트를 5mL 빙냉 H₂O로 세척하고, 팔콘 튜브(또는 유리병)에 긁어내어 수확한다. 광학 밀도 및 600nm(OD600)는 표준 방법을 사용하여 측정된다. 동일한 용적의 수확된 세균 배양물과 H₂O를 2회 반복하여 큐벳에서 혼합한다. OD600 판독치를 기반으로, 항원 용액을 목적 농도(적어도 1.5 × 10⁹ 세균 세포/mL)로 제조했다. 세균 용액을 오토클레이빙하거나, 121℃에서 15분 동안 오토클레이빙하여 세균을 사멸시킨다.

항원으로서 사용하는 세균 단편을 수득하는 방법

도 2는 항원으로 사용되는 세균 단편을 수득하는 예시적 방법을 그래프로 도시한다. BugBuster^®는 신선한 또는 동결 세포 펠렛에 사용할 수 있다. 칭량된 원심분리 튜브를 사용하여 10분 동안 10,000 × g에서 원심분리함으로써 액체 배양물로부터 세포를 회수한다. 소규모 추출(1.5ml 이하)의 경우, 원심분리는 1.5ml 튜브에서 14,000 내지 16,000 × g으로 수행할 수 있다. 액체를 경사분리하고, 펠렛을 배출하여, 가능한 많은 액체를 제거한다. 펠렛의 중량을 칭량한다. 세포를 회수한 후, 오토클레이빙하지 않은 경우는 펠렛화하여 + 4℃에서 보관할 수 있다. 세포 펠렛은 습윤 세포 페이스트 1g당 5ml의 시약을 사용하여 피펫팅 또는 온화한 와동에 의해 BugBuster^® 마스터 믹스로 실온에서 재현탁시킨다. 이는 통상 50ml의 배양물당 약 2.5ml에 상당한다. 세포 현탁액을 실온에서 10 내지 20분 동안 느린 설정으로 진탕 플랫폼 또는 회전 믹서에서 배양한다. 1시간 동안 인큐베이팅, 진탕, +25℃. 불용성 세포 파편은 4℃에서 20분 동안 16,000 × g에서 원심분리하여 제거한다. 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다. 정제된 추출물은 아이스 상에서 단기간 보관(2 내지 3시간)하거나, 필요할 때까지 -20℃에서 동결한다. 세포 균질액을 원심분리 튜브로 옮긴다. 원심분리는 하기 도식에 따라 수행되고, 상청액은 새로운 원심분리 튜브로 옮긴다.

사용된 원심분리 단계(4℃에서):

1) 10분 800×g

2) 10분 1500×g

3) 60분 10000xg

4) 3시간 20000×g

각 펠렛에 500μl PBS를 첨가하고, 와동시킨다.

수집된 단편은 웨이퍼 내의 항원으로 사용되어, 여왕벌과 그 자손에게 백신 접종하거나 치료한다.

실시예 2

하기 실시예는 비-질병 유발 파에니바실러스를 사용하여 아메리칸 부저병에 대하여 꿀벌 벌집을 면역화하는 예시적 방법을 예시한다.

비-질병 유발 파에니바실러스의 조성물을 포함하는 하나의 웨이퍼는 적어도 7마리 여왕벌을 백신접종하거나 치료하기 위해 사용된다. 웨이퍼는 80g 여왕벌 캔디(예: 상업용 벌 사료 - Nordzucker), 1× 인산염 완충 식염수(PBS, 1× 희석, pH 6.6 내지 7.2, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 9.5mM 인산염 완충액)에 1.5×10⁸ - 1.5×10¹⁰ 항원을 함유하는 1mL 항원을 함유한다. 항원의 농도는 OD600으로 광도계로 측정된다.

치료 또는 백신접종을 위한 단위는 벌집에 배치되기 전의 꿀벌 여왕벌이다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 여왕벌을 벌집에 도입하기 위해, 여왕벌은 먼저 단독으로 여왕벌 케이지에 배치하고, 여왕 캔디를 공급한다. 이 실시예에서, 벌집에 배치되기 약 1주일 전에, 여왕벌은, 실시예 1에 본 명세서에 개시된 바와 같이 제조된 비-질병 유발 파에니바실러스 항원(들)의 조성물을 포함하는 상업적 벌 사료 웨이퍼를 공급한다.

비-질병 유발 파에니바실러스 항원을 포함하는 여왕 캔디 웨이퍼를 여왕벌에게 공급한 후, 여왕벌을 벌집에 배치한다.

벌집에 배치한 후, 여왕벌은 3 내지 5일 이내에 산란을 개시하고, 동배 생산 기간이 종료될 때까지 계속한다. 여왕벌이 낳은 유충은 아메리칸 부저병(Paenibacillus larvae) 감염에 대해 적어도 30% 이상 내성이 있다.

감염에 대한 내성은 백신접종 및 위약 처리된 벌집 둘 다로부터 부화된(12 내지 36시간) 꿀벌 유충을 실험실의 인공 사육 조건에 접목시킴으로써 결정된다. 이어서, 모든 유충은 살아있는 피. 라르바에 포자로 접종된 먹이로 이루어진 구강 감염 치료를 받거나, 대조군 치료(포자가 없는 먹이)를 받는다. 생존율을 8일 동안 모니터링하고, 면역화된 유충과 면역화되지 않은 유충의 생존율을 비교함으로써 감염에 대한 내성을 측정한다.

실시예 3

도 3A 및 3B는 여왕벌에게 파에니바실러스 덴리티포르미스(Paenibacillus denritiformis)를 투여하여 여왕벌의 투여 및/또는 예방접종의 결과를 나타낸다. PL 감염에 대한 항원 PD의 시험을 위해, 1마리 여왕벌은 8g의 벌 사료 중의 1.5 × 10⁸ CFU의 항원으로 백신접종하고, 1마리 여왕벌은 8g의 벌 사료 중의 항원 없이 위약 대조군으로 사용했다. 여왕벌은 실온(약 23℃) 및 상대습도 60%에서 8일 동안 8마리의 일벌과 함께 여왕벌 케이지(표준)에 유지되었다. 이어서, 이들은 공여자 벌집에 배치되고, 산란시킬 수 있었다. 여왕벌을 벌집에 배치한 지 3주 후, L1 유충을 실험실에 이식하고, 피. 라르바에의 포자로 감염시키고, 포자 없는 유충 먹이는 환경 대조군으로 기능했다. 처리당 여왕벌당 15마리의 유충을 상이한 처리에 이식하고, 실험실에서 8일간의 생존을 모니터링했다. 항원 PD를 PA에 대해 시험하기 위해, 전술한 바와 유사한 프로토콜에 따르지만, 3개의 위약 벌집과 1개 벌집을 항원 PD에 사용하는 것을 제외하고, 모든 벌집을 3회 샘플링했다. 효능: 사멸된 파에니바실러스 종에 의한 여왕벌 백신접종은 병원체에 감염된 후, 보다 내성이 있는 유충을 초래한다(PD 대 PA 회색 막대, 백신: 약 60% 유충 생존율 대 위약: 40% 유충 생존율, p=0.08) 및 (PD 대 PL 회색 막대 35% 유충 생존율 대 위약 25% 유충 생존율, p= 0.18). 감염이 없는 대조군 조건하에서 유충 생존에 악영향은 없다(회색 막대, 백신: 15% 유충 생존율 대 위약: 15% 유충 생존율, p>0.05).

감염된 유충의 사망률은 실험 중의 8일차까지 모니터링되었다. 8일차는, 용화(pupation) 이벤트를 나타내기 때문에, 꿀벌의 발육에서 중요한 시점이다. 꿀벌 번데기의 실험실 처리는, 이들이 매우 부드러운 접촉에도 부서지는 매우 얇은 표피로 둘러싸여 있기 때문에, 매우 번거롭다. 따라서, 용화 이벤트에 대한 감염의 영향의 모니터링은 종료되었다. 또한, 부저병은 5일차까지 벌 유충을 사멸시키고, 따라서 8일차에 벌 유충이 용화하면, 감염에서 살아남았고, 감염의 생존에 대한 모니터링을 무용지물로 되게 한다.

실시형태

일 태양에서, 본 명세서에 제공된 것은, 세균 속의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 유발 세균 종의 전체 세포 및 세포벽 단편 및 담체를 포함하건, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진 조성물이다. 일 태양에서, 담체는 곤충 먹이이다. 일 태양에서, 비-질병 유발 세균 종은 파에니바실러스 속을 포함하고, 이들의 비제한적 예는 파에니바실러스 알베이 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 태양에서, 하나 이상의 사멸된 비-질병 유발 세균 종은 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가 태양에서, 사멸된 비-질병 유발 세균 종은 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei) 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis)를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 담체, 예를 들면, 곤충 먹이 그램당 사멸된 비-질환 유발 종의 전체 세포 또는 세포벽 단편의 약 1.5 × 10⁶ 또는 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, 부저병에 대해 여왕벌 또는 벌 유충을 치료, 백신접종, 면역화 중의 하나 이상의 방법이 제공된다. 일 태양에서, 여왕벌 또는 유충은 꿀벌이다. 기타 벌 종은 본 명세서에 기재되어 있다. 상기 방법은, 본 명세서에 개시된 유효량의 조성물을 일벌, 육아벌, 유충 또는 여왕벌 중 하나 이상, 예를 들면, 꿀벌 여왕벌에게 투여하고, 이에 의해 여왕벌 또는 여왕벌에 의해 생산된 꿀벌 유충을 면역화시키는 것을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 부저병은 파에니바실러스 종에 의해 유발된다. 일 태양에서, 부저병은 피. 라르바에(P. larvae)에 의해 유발된다. 또 다른 실시형태에서, 부저병은 아메리칸 부저병이다. 추가 태양에서, 부저병은 피. 라르바에(P. larvae)에 의해 유발되고, 질병은 아메리칸 부저병이다. 또 다른 추가 실시형태에서, 투여되는 조성물은 사멸된 비-질병 유발 파에니바실러스, 예를 들면, 파에니바실러스 알베이 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스의 하나 이상의 사멸된 전체 세포 또는 세포벽 단편을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지고, 부저병은 아메리칸 부저병이다. 이들 실시형태의 경우, 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충은 용량당 전체 세포 또는 세포벽 단편의 약 1.5 × 10⁶ 또는 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 공급하거나 투여한다. 또 다른 실시형태에서, 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충은, 전체 세포 또는 세포벽 단편의 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위의 적어도 1회, 또는 적어도 2회, 또는 적어도 3회, 또는 적어도 4회, 또는 적어도 5회, 또는 적어도 6회, 또는 적어도 7회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 9회, 또는 적어도 10회 용량(들)을 투여받거나 공급받는다.

또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 것은, 파에니바실러스의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 종의 전체 세포 또는 세포벽 단편을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는 조성물을 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충에게 투여하거나 공급하는 것을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 벌 또는 벌 자손의 집단에서 아메리칸 부저병을 예방하는 방법이다. 이 방법의 일 태양에서, 아메리칸 부저병은 피. 라르바에에 의해 유발된다. 일 태양에서, 여왕벌 및 벌은 꿀벌이다. 여왕벌은 조성물을 직접 공급하거나, 일벌이나 육아벌에 의해 여왕벌에게 공급될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 유충은 본 개시의 조성물을 섭식한다.

일 태양에서, 본 개시는, 먹이 또는 용량의 그램당 PA 또는 PD 또는 이들 둘 다의 전체 세포 또는 세포벽 단편의 약 1.5 × 10⁶ 또는 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5×10¹¹ 항원 단위를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지고, 꿀벌 여왕벌에게 투여하거나 공급하는, 여왕벌 또는 여왕벌 자손의 집단에서 아메리칸 부저병을 예방하는 방법을 제공한다. 일 태양에서, 여왕벌은 먹이 또는 용량 그램당 약 1.5×10⁷ 내지 약 1.5×10¹¹ 항원 단위를 공급받는다. 용량은 꿀벌 여왕벌이 먹을 여왕벌 먹이로 투여할 수 있고, 이에 의해 유충 및 이의 자손을 보호할 수 있다.

이 실시형태의 일 태양에서, 투여되거나 공급되는 파에니바실러스의 사멸된 비-질병 종은 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파에니바실러스이다. 특정 실시형태에서, 파에니바실러스의 사멸된 비-질병 종은 사멸된 파에니바실러스 알베이, 파에니바실러스 덴트리티포르미스, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 여왕벌, 육아벌 또는 일벌에게 투여된다. 이 방법의 일 실시형태에서, 여왕벌은 파에니바실러스의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 종 또는 이의 단편의 용량당 약 1.5 × 10⁶ 또는 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 추가로 이들로 이루어지는, 여왕벌 사료를 공급받는다. 추가 태양에서, 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상에게 투여되거나 공급되는 조성물은 사멸된 파에니바실러스 알베이 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스 전체 세포 또는 세포벽 단편 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 본질적으로 이들로 이루어진다. 추가 태양에서, 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상은 사멸된 비-질환 유발 파에니바실러스의 용량당 전체 세포 또는 세포벽 단편의 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 투여받는다.

방법에서, 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상은 전체 세포 또는 세포벽 단편의 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위의 적어도 1회, 또는 적어도 2회, 또는 적어도 3회, 또는 적어도 4회, 또는 적어도 5회, 또는 적어도 6회, 또는 적어도 7회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 9회, 또는 적어도 10회 용량(들)을 투여받거나 공급받는다.

본 개시의 일 실시형태에서, 제공된 것은, 세균 파에니바실러스의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 유발 세균 종으로부터 전체 세포 및/또는 세포벽 단편을 단리하는 것을 포함하고, 이어서 임의로, 단리된 항원 단위를 곤충 먹이와 혼합하는 것을 포함하는, 곤충 조성물 또는 백신을 제조하는 방법이다. 일 태양에서, 곤충 먹이는 여왕벌 웨이퍼, 당 섭취자(sugar eater), 스피루리나 보충제(spirulina supplement), 선적 컨테이너 내의 여왕벌 캔디, 여왕벌 세포, 곤충 보충제로부터 선택된다. 추가 태양에서, 비-질병 유발 세균 종은 파에니바실러스 속의 종, 예를 들면, 파에니바실러스 알베이 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스, 또는 이들의 조합이다. 또는, 사멸된 파에니바실러스 종 중 하나 이상은 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 사멸된 파에니바실러스 종은 파에니바실러스 알베이 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스 또는 이들의 조합이다.

추가 태양에서, 이 방법은 단리된 전체 세포 또는 세포벽 단편을 제형화하여, 곤충 먹이의 용량당 약 1.5 × 10⁶ 또는 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 제공하는 것을 추가로 포함한다. 추가 태양에서, 본 명세서에 제공된 것은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 조성물이다. 일 태양에서, 조성물은 백신 조성물이다.

추가 태양에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 백신 및 임의로 사용 설명서를 함유하는 키트가 제공된다.

등가물

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 이 기술이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에 예시적으로 기재된 본 기술은, 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 등은 광범위하게 및 제한 없이 읽혀져야 한다. 추가로, 본 명세서에 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용되었고, 제한은 아니고, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 표시 및 설명된 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 청구된 본 기술의 범위 내에서 다양한 수정이 가능한 것이 인식된다.

따라서, 본 명세서에 제공된 재료, 방법 및 예는 바람직한 태양을 나타내고, 예시적이며, 본 기술의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

본 기술은 본 명세서에 광범위하고 일반적으로 설명되었다. 일반적 개시에 포함되는 더 좁은 종 및 하위 속 그룹의 각각은 또한 본 기술의 일부를 형성한다. 여기에는 절제된 자료가 본 명세서에 구체적으로 기재되었는지 여부에 관계없이, 속으로부터 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 수반하는 본 기술의 일반적 설명이 포함된다.

또한, 본 기술의 특징 또는 태양이 마르쿠쉬(Markush) 그룹과 관련하여 설명되는 경우, 당업자는 이에 의해 본 기술이 또한 마르쿠쉬 그룹의 멤버의 임의의 개별 멤버 또는 멤버의 하위 그룹과 관련하여 설명된다는 것을 인식할 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 각각이 참조에 의해 개별적으로 도입된 것과 동일한 정도로 그 전체가 참조에 의해 명시적으로 도입된다. 모순하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.

기타 태양은 다음 특허청구범위 내에서 기재된다.

Claims (32)

1. 세균 속(bacterial genus)의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 유발 세균 종(non-disease causing bacterial species)의 전체 세포(whole cell) 및 세포벽 단편 및 담체를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 담체가 곤충 먹이(insect food)인, 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비-질병 유발 세균 종이 파에니바실러스(Paenibacillus) 속을 포함하는, 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 사멸된 비-질병 유발 세균 종이 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인, 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 사멸된 비-질병 유발 세균 종 파에니바실러스 알베이 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스를 포함하는, 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 곤충 먹이 또는 담체 g당 전체 세포 또는 세포벽 단편의 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 포함하는, 조성물.
7. 일벌 또는 여왕벌에게 먹이를 공급하는 육아벌, 벌 유충 또는 여왕벌 중의 하나 이상으로부터 선택된 벌에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 투여하고, 이에 의해 여왕벌 또는 여왕벌에 의해 생성된 벌 유충을 면역화시키는 것을 포함하는, 부저병(Foulbrood disease)에 대해 여왕벌 또는 벌 유충을 백신접종, 치료 또는 면역화시키는 것 중의 하나 이상의 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 부저병이 파에니바실러스 종에 의해 유발되는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 부저병이 아메리칸 부저병인, 방법.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 파에니바실러스 알베이 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스 중 하나 또는 둘 모두를 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 부저병이 아메리칸 부저병이고, 피. 라르바에(P. larvae)에 의해 유발되는, 방법.
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상에게 용량(dose)당 전체 세포 또는 세포벽 단편의 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 투여하는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상에게, 파에니바실러스의 사멸된 비-질병 유발 종의 전체 세포 또는 세포벽 단편의 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위의 적어도 1회, 또는 적어도 2회, 또는 적어도 3회, 또는 적어도 4회, 또는 적어도 5회, 또는 적어도 6회, 또는 적어도 7회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 9회, 또는 적어도 10회 용량(들)을 투여하는, 방법.
14. 파에니바실러스의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 종의 전체 세포 또는 세포벽 단편을 포함하는 조성물을 여왕벌에게 투여하는 것을 포함하는, 벌, 임의로 꿀벌의 집단(population)에서 아메리칸 부저병을 예방 또는 백신접종(vaccinating)하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 파에니바실러스의 사멸된 비-질병 종이 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 파에니바실러스의 사멸된 비-질병 종이 사멸된 파에니바실러스 알베이 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스, 또는 이들의 조합인, 방법.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가, 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상에게, 파에니바실러스 전체 세포 또는 이의 세포벽 단편의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 종의 용량당 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 포함하는 적합한 양의 여왕벌 사료(queen feed)를 공급하는 것을 포함하는, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 부저병이 아메리칸 부저병이고, 피. 라르바에(P. larvae)에 의해 유발되는, 방법.
19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 파에니바실러스 알베이 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스 중 하나 또는 둘 모두를 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지는, 방법.
20. 제21항에 있어서, 상기 부저병이 아메리칸 부저병인, 방법.
21. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상에게 전체 세포 또는 세포벽 단편의 용량당 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 투여하는 것인, 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 여왕벌, 일벌, 육아벌 또는 유충 중 하나 이상에게 전체 세포 또는 세포벽 단편의 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 적어도 1회, 또는 적어도 2회, 또는 적어도 3회, 또는 적어도 4회, 또는 적어도 5회, 또는 적어도 6회, 또는 적어도 7회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 9회, 또는 적어도 10회 용량(들)으로 투여하는, 방법.
23. 세균성 파에니바실러스(Paenibaccilus)의 적어도 하나의 사멸된 비-질병 유발 세균 종으로부터 전체 세포 또는 세포벽 단편을 단리하는 것을 포함하는, 곤충 조성물 또는 백신의 제조 방법.
24. 제23항에 있어서, 단리된 항원 단위(isolated antigen unit)를 곤충 먹이와 혼합하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 곤충 먹이가 여왕벌 웨이퍼(wafer), 당 섭취자(sugar eater), 스피루리나 보충제(spirulina supplement), 수송 컨테이너(shipping container) 내의 여왕 캔디, 여왕 세포, 곤충 보충제로부터 선택되는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 비-질병 유발 세균 종이 파에니바실러스 속의 종, 임의로 파에니바실러스 알베이 또는 파에니바실러스 덴트리티포르미스 중 하나 또는 둘 다, 또는 이들의 조합인, 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 사멸된 파에니바실러스 종이 파에니바실러스 알베이(Paenibacillus alvei), 파에니바실러스 덴트리티포르미스(Paenibacillus dentritiformis), 파에니바실러스 아밀로리티쿠스(Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실러스 캄피나센시스(Paenibacillus campinasensis), 파에니바실러스 콘드로이티누스(Paenibacillus chondroitinus), 파에니바실러스 춘간게네스(Paenibacillus chungangensis), 파에니바실러스 두사넨시스(Paenibacillus doosanensis), 파에니바실러스 글루카노리티쿠스(Paenibacillus glucanolyticus), 파에니바실러스 휴미쿠스(Paenibacillus humicus), 파에니바실러스 락티스(Paenibacillus lactis), 파에니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus), 파에니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus), 파에니바실러스 마세란(Paenibacillus maceran), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)-유사, 파에니바실러스 마쿠아리엔시스(Paenibacillus macquariensis), 파에니바실러스 모토부엔시스(Paenibacillus motobuensis), 파에니바실러스 파불리(Paenibacillus pabuli), 파에니바실러스 포에니시스(Paenibacillus phoenicis), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 파에니바실러스 포필리아에(Paenibacillus popilliae), 파에니바실러스 풀데운겐시스(Paenibacillus puldeungensis), 파에니바실러스 레지두이(Paenibacillus residui), 파에니바실러스 스텔리페(Paenibacillus stellife), 파에니바실러스 티아미노리티쿠스(Paenibacillus thiaminolyticus), 파에니바실러스 발리두스(Paenibacillus validus), 파에니바실러스 자일라니솔벤스(Paenibacillus xylanisolvens), 또는 이들의 조합으로 이루어진 하나 이상의 그룹으로부터 선택되는, 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 사멸된 파에니바실러스 종이 파에니바실러스 알베이 및 파에니바실러스 덴트리티포르미스인, 방법.
29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 전체 세포 또는 세포벽 단편을, 용량당 약 1.5 × 10⁷ 내지 약 1.5 × 10¹¹ 항원 단위를 제공하도록 제형화하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조성물.
31. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 백신 조성물.
32. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는, 키트(kit).
    

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