NO325879B1 - Rekombinant DNA-konstruksjon nyttig for uttrykking av protein og en vektor. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører området genetisk konstruksjon anvendt på bakterielle verter. Oppfinnelsen vedrører spesielt en rekombinant DNA-konstruksjon for produksjon av proteiner i bakterielle verter, og en vektor.

Rekombinant DNA teknologi har muliggjort produksjonen av forskjellige naturlig forekommende og syntetiske proteiner i organismer så som bakterie, sopp, gjær og pattedyrceller. Det innbefatter generelt innskudd av gener som koder for et ønsket protein inn i en vertsorganisme, og anvendelse av vertens cellulære maskineri for å uttrykke genet.

Rekombinant DNA teknologi er i utvikling for å oppnå produksjon av proteiner i kommersielt akseptabelt utbytte. En begrensende faktor ved rekombinant produksjon av proteiner er raten hvorved genet kodende for ønsket protein blir uttrykt. Det er spesielt blitt oppdaget at promoterregionen til et gen er kritisk for transkripsjonsprosessen ved genekspresjon. En effektiv promoter så som trp-promoteren tilstede i E. coli bindes tett til DNA-rettet RNA-polymerase for å initiere transkripsjonen av genet ved dannelse av mRNA. En mindre effektiv promoter så som lac-promoteren binder RNA-polymerase mindre tett og resulterer i en lavere rate av mRNA-dannelse.

Trp-promoteren er blitt anvendt for produksjon av heterologe proteiner på grunn av dets even til effektivt å initiere transkripsjonen. Til tross for effektiviteten er det en ulempe med trp-promoteren at den ikke lett lar seg kontrollere. Trp-promoteren kan ikke undertrykkes fullstendig, dvs. den kan drive transkripsjonen til en fase som er hensiktsmessig for proteinproduksjon før verten er dyrket i kultur. En annen meget anvendt promoter er lac som er mindre effektiv enn trp, men som lettere kan kontrolleres.

For å utvikle mer effektive promotere er funksjonelle komponenter av forskjellige promotere blitt kombinert, blant annet de som er beskrevet i US-PS 5.362.646.1 et eksempel ble deler av bakteriofag T7-promoteren Ai (Pai) kombinert med to lac-operatorer. Spacerregionen mellom såkalte -35 og -10 regionene til bakteriofag T7-promoteren ble erstattet med en modifisert lac-operatorsekvens, og for å kontrollere den resulterende promoterhybriden ble en andre lac operator innført nedstrøms. Det resulterende promoter/operatorsystemet som er inkorporert på de kommersielt tilgjengelige pUHE-plasmidene ble funnet å initiere transkripsjonen effektivt ved induksjon og blir likevel sterkt undertrykket før induksjonen.

En annen promoter beskrevet av Tsung et al (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1990, 87:5940) omfatter den effektive trp -35 regionen, -10 regionen fra den sterkt effektive IppP-5-promoteren (en variant av lpp-promotoren) og en spacer avledet fra lac-promoteren. Denne promoteren ble vist å være så sterkt effektiv når det gjelder å initiere transkripsjonen at den resulterer i celledød. I det forskjellige promotere har muliggjort forbedrede utbytter av proteiner i mikrobielle verter er det fortsatt et behov for promotere som driver produksjonen av kommersielt verdifulle proteiner mer effektivt.

Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en ny rekombinant DNA konstruksjon nyttig for uttrykking av et protein i en bakteriell vert, kjennetegnet ved at den omfatter en kodende region for proteinet operabelt koblet til en kontrollregion omfattende en promoter for å muliggjøre ekspresjon av nevnte protein i verten, hvori promoterregionen omfatter en DNA sekvens valgt fra:

5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'.

Figur 1 illustrerer nukleotidsekvensen og en skjematisk representasjon av en ekspresjonskassett som inkorporerer den rekombinante DNA,konstruksjoner i henhold til oppfinnelsen;

figurene 2 og 3 illustrerer nukleotidsekvensene til DNA-konstruksjoner ifølge oppfinnelsen en annen nukleotidsekvens omfattende en promoter og en operatorregion.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer DNA-sekvenser nyttige for å drive DNA ekspresjon med høy effektivitet i bakterielle verter så som E. coli. Anvendelse av ekspresjonsvektorene omfattende disse sekvensene tilveiebringer et verdifullt middel for å oppnå øket produksjon av uttrykkbare proteiner, både endogene og heterologe. I et aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en ny rekombinant DNA konstruksjon nyttig for uttrykking av et protein i en bakteriell vert. Konstruksjonen omfatter en kodende region for proteinet operasjonelt koblet til en kontrollregion omfattende en promoter for å muliggjøre ekspresjon av nevnte protein i verten, hvori promoteren omfatter en DNA sekvens valgt fra: 5 '-TTGAC AAC AT AAAAAACTTTGTGTT AT ACT-31;

Promoteren ifølge oppfinnelsen og 5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-31 har en felles -35 region av konsensussekvensen TTGACA og en -10 region av sekvensen TATACT. Spacersekvensen, dvs. sekvensen med 18 baser som er mellomliggende, kan være enten sekvensen ACATAAAAAACTTTGTGT eller CTTTATGCTTCCGGCTCG og er fortrinnsvis sekvensen ACATAAAAAACTTTGTGT. Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig i en foretrukket utførelsesform, DNA konstruksjoner hvori DNA kodende for et ønsket protein er koblet operasjonelt under ekspresjonskontrollen til en promoter med sekvensen 5-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'.

Fagfolk innenfor dette området vet at promotoren ifølge oppfinnelsen utgjør et vesentlig element av komponentene som er nødvendige, innenfor den funksjonelle kontrollregionen, for å drive ekspresjon. Disse promoterene kan bli skutt inn ved anvendelse av standardprosedyrer inn i en hvilke som helst egnet ekspresjonsvektor som kan bli replikert i Gram-ve eller +ve bakterier. For å danne en genekspresjonskontrollregion vil foreliggende promoter bli inkorporert med slike andre kontrollelementer som er vanligvis nødvendig for denne ekspresjonen, inkludert et ribosombindingssete og i en utførelsesform ifølge oppfinnelsen, en operator som virker slik at den kontrollerer promoterfunksjonen.

Disse komponentene er nødvendigvis arrangert i forhold til hverandre etter behov for ekspresjon ifølge generelle prinsipper innenfor genekspresjon.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen inkorporerer kontrollregionen til konstruksjonen en operator. Operatorene som kan bli anvendt innbefatter de som er direkte induserbare av kjemiske induseringsmidler og de, så som lac som er de-repressible. Eksempler på egnede operatorer innbefatter E. coli laktose, galaktose, tryptofan og tetracyklin operatorer (se Miller et al. "The Operon", Cold Spring Harbour Laboratory, 1980 og Hillen et al. J. Mol. Biol., 1984,172:185). Foretrukne operatorer er sterkt undertrykkbare slik at ekspresjonen av DNA kodende for regionen kan bli kontrollert. I en spesifikk utførelsesform omfatter kontrollregionen lac-operatoren (fig. 1) som forhindrer ekspresjon av promoteren i fravær av den syntetiske induseren isopropyl-B-S-tiogalaktopyranosid (IPTG) og den naturlige induseren laktose.

Kontrollregionen omfatter videre et ribosombindingssete (RBS)-sekvens for å lette bindingen av ribosomene til mRNA-transkriptet og derved initiere translasjonen av den RNA-kodende region for å danne proteinet. Egnede ribosombindingsseter innbefatter lac og bakteriofag T5.1 en foretrukket utførelsesform er RBS en sekvens avledet fra T5 bakteriofag RBS med sekvensen 5'-ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3'.

Kontrollregionen til konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse er operasjonelt koblet til en kodende region for et endogent eller heterologt protein. Betegnelsen "heterologt protein" refererer til polypeptid eller protein som, selv om det ikke blir naturlig produsert av den bakterille verten, blir uttrykt av denne verten på en egnet måte transformert med DNA-kodende for proteinet; genomisk DNA, cDNA og syntetisk DNA kan bli anvendt for å transformere verten. Proteiner som kan bli produsert ved anvendelse av systemet heri innbefatter, men er ikke begrenset til, hormoner så som paratyroidhormon (PTH), glukagon eller fragmenter derav og beslektede peptider så som GLP-1 og GLP-2; vektsfaktorer så som epidermal vekstfaktor (EGF); og lymfokiner så som interleukin-6 og -8 (IL-6, -8). For å lette isoleringen av den autentiske formen av proteinet, dvs. protein uten et ytterligere N-terminalt Met-residie, kan fusjonsproteiner også bli produsert som blir spaltet etter ekspresjonen. For eksempel kan DNA kodende for et protein av interesse komme etter DNA kodende for et signalpeptid, så som E. coli ytre membranprotein ompA. I dette tilfellet tilveiebringer det uttrykte genet et fusjonsprotein omfattende et N-Met-inneholdende ompA-signalpeptid som blir fulgt av det ønskede proteinet. Signalpeptidet bærer fusjonsproteinet gjennom intermembranen til bakterien hvor signalpeptidet blir spaltet. Andre signalpeptider som kan bli anvendt innbefatter alkalisk fosfatase, E. coli varmestabil enterotoksin II og protein A fra Streptococcus. Alternativt kan et fusjonsprotein bli syntetisert og spaltet i en separat prosedyre for å tilveiebringe ønsket protein. For eksempel kan glutation-S-transferase (GST) bli spaltet fra et ønsket protein med trombin eller faktor Xa.

I en spesifikk utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter den kodende regionen DNA kodende for humant PTH, aminosyresekvensen som er beskrevet av Hendy et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1981, 78:7365). I eksemplene beskrevet heri er DNA-sekvensen kodende for PTH koblet direkte til og i leseramme med DNA kodende for ompA-signalpeptidet.

Foretrukne rekombinante DNA-konstruksjoner illustrert i fig. 1, med Ipp eller lacUV5 spaceren, ble produsert fra enkelt-trådede oligonukleotider syntetisert ifølge fosforamidit-metoden. Den gel-rensede tråden omfattende sekvenser fra Xhol- til EcoRI- restriksjonssetet ble deretter anvendt som et opprinnelig PCR-mål og ble PCR-amplifisert inn i et dobbelttrådet DNA-fragment ved anvendelse av komplementære enkelttrådede DNA-oligonukleotider som hybridiserer spesifikt til endene av hvilke som helst av den opprinnelige oligonukleotidsekvensen som er vist eller dets komplementære tråd. Konstruksjonene er følgelig blitt dannet ved anvendelse av standard gensyntese metodologi, som beskrevet for eksempel av Maniatis et al ("Molecular Clonin" Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) og Innis et al ("PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications").

I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes ekspresjonsvektorer nyttige for produsering av bakterielle vertscelletransformanter som inkorporerer en rekombinant DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen. DNA-konstruksj onene ifølge oppfinnelsen kan bli inkorporert som en "kassett" inn i en vektor, fortrinnsvis en plasmidvektor, ifølge etablerte teknikker. Generelt blir en vektor spaltet ved restriksjonssetene som tilsvarer restriksjonssetene på en av endene på kassetten. Kassetten blir deretter innført ved ligering av endene til komplementære spaltningsseter på vektoren.

Til tross for at bakteriofag-baserte vektorer kan bli anvendt, er plasmidvektorer foretrukket så som pBR322- og pUC-serien av plasmidene. Når inkorporert inn i en egnet vektor kan det resulterende plasmidet bli amplifisert i en vert for å tilveiebringe

mengder som er tilstrekkelige for påfølgende kloningsarbeid. Det er å bemerke at DNA i kodende for det selekterte proteinet blir hensiktsmessig inkorporert på plasmidet med multiple kloningsseter gitt derpå ved anvendelse av standard klonings-/ligeringsmetoder. Et plasmid vil nødvendigvis inkorporere et replikasjonsorigo og vil fortrinnsvis innkorporere en markør så som ampicillin- eller tetracyklinresistensgener

for å muliggjøre seleksjon av transformerte celler. Det er også å bemerke at

> translasjonsstoppkodoner i alle tre leserammer og en riktig posisjonert transkripsjonen termineringsregion vil være nødvendig for tilfredsstillende ekspresjon av ønsket protein. Egnede transkripsjonene terminatorer innbefatter transkripsjonene terminatorer av E. coli trpA-, thr-, his- og phe-genene.

) Når DNA kodende for ønsket protein blir inkorporert i vektoren, blir en selektert bakteriell vert dermed transformert ved anvendelse av standard kalsiumkloirdformidlede transformasjonsteknikker. Egnede bakterielle verter innbefatter gram negative bakterier så som E. coli og salmonella. Det er foretrukket at verten er en kommersielt tilgjengelig

E. coli-stamme og mest foretrukket er JM 101 og derivater derav.

5

Når den kontrollerende regionen til DNA-konstruksj onen omfatter lac-operatoren, som beskrevet i detalj nedenfor, bør den transformerte vertsstammen kunne uttrykke, og fortrinnsvis i noen tilfeller overprodusere, lac 1-produktet slik at promoterfunksjonen og dermed ekspresjonen av proteinet kan bli regulert. Behovet for lacl-overproduksjonen for noen transformanter kan bli oppfylt, ifølge en utførelsesform ifølge oppfinnelsen, ved anvendelse av verter som allerede inneholder lacl^genet ansvarlig for overproduksjon av lacl-produktet. Lacl-overproduserende stammer av E. coli som kan bli anvendt som verter innbefatter JM-serien av stammer tilgjengelig fra Clontech Laboratories Inc., California, USA. Spesifikke vertsstammer som er egnede for anvendelse innbefatter JM 101, JM 105 og JM 107. Alternativt kan lad overproduksjon i transformanten bli oppfylt ved innkorporering av lacl^genet på vektorene ifølge oppfinnelsen. I denne situasjonen vil overproduksjonen av lacl bli formidlet av vektoren, og en hvilken som helst av en mengde kommersielt tilgjengelige bakterielle vertsstammer kan bli anvendt, inkludert E. coli stammene DH1, RR1, C600, CMK603 og EB505. lacl^genet som skal bli inkorporert på vektoren kan bli oppnådd som et 1,2 kb Hindm fragment av plasmid pMMB22 (beskrevet av Bagdasarin et al. (Gene, 1983, 26:273) og deretter innkorporert ikke-distruptivt på et hvilket som helst sete på plasmidvektoren.

For å forsterke stabiliteten av arv av vektorer, spesielt plasmider, fra stammen opprinnelig transformert til dets avkom, kan et fordelingselement (par) som er funksjonelt i E. coli også bli inkorporert på vektoren. Et slikt parelement kan bli frigjort fra pSClOl som et 380bp HincH/Aval fragment og deretter klonet inn i et egnet sete på vektoren.

Etter transformasjonen blir bakterielle verter som inneholder ekspresjonsvektoren dyrket i et dyrkningsmedium som er mest hensiktsmessig for den selekterte verten. For E. coli kan LB keaft eller 2YT medium (gjærekstrakt/trypton) bli anvendt for å dyrke stammene som er foretrukket. Seleksjonspress for plasmidtransformanter bør bli opprettholdt ved å tilveiebringe et cytotoksisk middel som dreper utransformerte vertsstammer. For eksempel bør en transformant med et plasmid inneholdende gen for tetracyklinresistens bli dyrket i medium inneholdende tetracyklin. Mediumkonsentrasjoner av tetracyklin på rundt 5-15 ug/ml er egnet.

Promoteren på konstruksjonen er fortrinnsvis regulerbar gjennom binding av et repressormolekyl til en operator beliggende ved siden av promoteren i kontrollregionen. I en foretrukket utførelsesform blir lacl-genproduktet bundet til en lac-operator beliggende ved siden av promoteren. I dette tilfellet vil binding av lacl-produktet undertrykke promoteren, redusere ekspresjonsnivåene til kodende DNA som står under dets kontroll. For å øke ekspresjonsnivåene blir kjemisk IPTG (isopropyl-fl-D-tiogalaktopyranosid), som binder lacl og derepresserer promoteren, tilsatt til kulturmediet for å derepressere promoteren og indusere ekspresjonen. Det er ønsket at IPTG blir tilsatt til kulturmediet når cellene har nådd midt log vekstfasen.

For å bestemme optimal tetthet hvorved kulturer bør bli dyrket for å realisere maksimalt utbytte av ønsket protein kan forsøk bli utført og proteinnivåer analysert i et tids-forløp eksperiment. Generelt kan tilstrekkelig utbytte av protein bli isolert når cellene når midt log fase, til tross for at større mengder av protein er ventet å akkumulere innenfor omtrent 4-5 timer senere.

Ønsket protein kan bli renset ved teknikker etablert innenfor fagområdet som hensiktsmessig for det proteinet. I en spesifikk utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir uttrykt PTH uttrykt utover det periplasmatiske området og inn i kulturmediet hvor det blir direkte isolert. Når proteinet blir utskilt kan det oppbrukte mediet bli isolert ved anvendelse av biokjemiske teknikker som reflekterer naturen til proteinet med hensyn på dets molekylære størrelse, nettoladning, isoelektrisk punkt osv. Mediet kan først bli konsentrert, for eksempel ved lyofilisering. Når antistoffer er tilgjengelige eller en naturlig ligand for proteinet er tilgjengelig, kan affinitetskolonner bli anvendt. Spesifikke utførelsesformer ifølge oppfinnelsen vil nå bli eksemplifisert med referanse til tegningene.

EKSEMPEL 1

I dets modne form er PTH et 84-aminosyrepeptid som virker i mennesker for å øke blodkalsium og modulere bendannelsen. DNA kodende for humant PTH ble syntetisert ved anvendelse av etablerte teknikker og ifølge aminosyresekvensen publisert av Hendy et al., supra, og inkorporert i konstruksjonene beskrevet nedenfor, som vist i figur 1.

Foretrukne rekombinante DNA-konstruksj oner har inkorporert promoterene nr 1 og nr 2 samt referansepromoterene nr 3 og nr 4, illustrert i tabell 1 og figur 1, som det nå refereres til ble produsert fra et enkelt-trådet oligonukleotid syntetisert ifølge fosforamidit-metoden. Den gel-rensede tråden omfattende sekvenser fra Xhol- til EcoRI- restriksjonssetet ble deretter anvendt som et opprinnelig PCR-mål og ble PCR-amplifisert inn i et dobbelt-trådet DNA-fragment ved anvendelse av komplementære enkelt-trådede DNA-oligonukleotider som hybridiseres spesifikt til endene av hvilke som helst av den opprinnelige oligonukleotidsekvensen vist eller dets komplementære tråd. Konstruksjonene blir følgelig dannet ved anvendelse av standard gensyntesemetodologi, som beskrevet for eksempel av Maniatis ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) og Innis et al ("PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications").

Konstruksjoner ble deretter klonet inn i et pUC18-avledet plasmid som utviser tetracyklinresistens i stedenfor ampicillinresistens. En JM 101 avledet E. coli vertsstamme ble deretter transfektert ifølge etablerte teknikker (se Maniatis et al "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour Laboratory, 1982).

EKSEMPEL 2

Ekspresjon av transformert vert.

Transformanter inneholdende PTH-vektorene ble dyrket over natten ved 30°C i 2YT-medium inneholdende 0,5% glukose og tetracyklin og deretter inokulert i friskt medium av samme sammensetning, med fortsatt dyrking ved 30°C helt til oppnåelse av midt log fase. Kulturene ble deretter indusert (1 mM IPTG) ved 1 times vekstintervaller, alikvoter av kulturen ble tatt ut og fordelt for å produsere prøver av kulturmediet for å identifisere utskilte PTH-produkter ved anvendelse av en standard Allegro-analyse. Resultatene av disse analysene er gitt i tabell 1 nedenfor:

Resultatene av Allegro-analysen indikerer at promoterene inkorporerer 18 bp Ipp- og lacUV5-sekvensene som letter de forsterkede nivåene av heterologt PTH-protein. Promoter nr 1 og nr 2 er sammenlignbar med en promoter nr 3 hvori spaceren ble erstattet med en modifisert lac-operator sekvensen (lacO); og promoter nr 4 hvori -35 og -10 regionene er fra bakteriofag T7 og spaceren er lacO promoteren. Studier med de samme promoterene som uttrykker genet kodende for kloramfenikoll-acetyltransferase (CAT) viste lignende resultater med forsterket ekspresjon for promoterene nr 1 og nr 2. Det ble også bemerket at hver av promoterene som ble studert utvisete forsterket proteinutbytte når kombinert med bakteriofag T5 RBS sammenlignet med lac-avledet

RBS.

Claims (9)

1. Rekombinant DNA konstruksjon nyttig for uttrykking av et protein i en bakteriell vert, karakterisert ved at den omfatter en kodende region for proteinet operabelt koblet til en kontrollregion omfattende en promoter for å muliggjøre ekspresjon av nevnte protein i verten, hvori promoterregionen omfatter en DNA sekvens valgt fra: 5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'.

2. Rekombinant DNA konstruksjon nyttig for uttrykking av et protein i en bakteriell vert ifølge kravl, karakterisert ved at nevnte bakterielle vert er E. coli.

3. Rekombinant DNA konstruksjon ifølge krav 2, karakterisert v e d at nevnte kontrollregion videre omfatter en operator for regulering av ekspresjonen.

4. Rekombinant DNA konstruksjon ifølge krav 3, karakterisert v e d at operatoren er lac operatoren.

5. Rekombinant DNA konstruksjon ifølge krav 4, karakterisert v e d at proteinet er humant PTH.

6. Rekombinant DNA konstruksjon ifølge krav 5, karakterisert v e d at den videre omfatter DNA kodende for OmpA signalpeptidet i leseramme med den kodende regionen for å muliggjøre sekresjon av proteinet til vertens periplasma.

7. Rekombinant DNA konstruksjon ifølge krav 2, karakterisert v e d at kontrollregionen omfatter et T5 ribosom bindingssete som har DNA sekvensen ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC.

8. Rekombinant DNA konstruksjon ifølge krav 2, karakterisert v e d at den har en sekvens som definert i figur 2.

9. Vektor, karakterisert ved at den er nyttig for produsering av bakterielle vertscelletransformanter omfattende en rekombinant DNA konstruksjon ifølge hvilke som helst av de foregående kravene.