DE60119535T2

DE60119535T2 - Herstellung eines rekombinanten proteins in prokaryotischen wirtszellen durch kodonsoptimisierung

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Publication number: DE60119535T2
Application number: DE60119535T
Authority: DE
Inventors: Rolf-Günther Werner; Klaus Bergemann; Friedrich Götz; Andreas Peschel
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-07-21
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2021-07-22
Also published as: CA2414978A1; DK1307569T3; ES2264700T3; ATE325880T1; EP1307569B1; MXPA03000427A; CN101525628B; DE10037111A1; JP2004504847A; JP5044085B2; EP1307569A2; CA2414978C; CN101525628A; WO2002010411A3; DE60119535D1; CN1444655A; AU2001277554A1; WO2002010411A2

Description

Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft vorteilhafte Verfahren zur Herstellung von heterologen Proteinen in prokaryotischen Wirtszellen durch verbesserte Codon-Verwendung und/oder Expression von tRNAs, die für selten vorkommende Codons in der Wirtszelle codieren.
Hintergrund der Erfindung:
Zahlreiche Bakterien, zum Beispiel speziell gram-positive Bakterien, sind bereits als Wirtszellen für die Herstellung von heterologen rekombinanten Proteinen, zum Beispiel sekretierten Proteinen, in einer Endotoxin-freien Umgebung verwendet worden (Literaturstellen 8, 9, 19). Das Bakterium Staphylococcus carnosus (S. carnosus) zum Beispiel, das in der Nahrungsmittelindustrie für die Fermentation von Fleisch und Fisch verwendet wird, ist für diesen Zweck ein geeignetes Bakterium. Es ist frei von Virulenz-Faktoren und proteolytischen Aktivitäten im Überstand und kann große Mengen an Protein sekretieren (10). Darüber hinaus werden nur geringe Mengen an Wirtszellen-codierten Proteinen sekretiert, was es leichter macht, das erzeugte Protein zu reinigen.
Bakterienenzyme (7, 4, 17) sind zum Beispiel bereits rekombinant in S. carnosus produziert und exprimiert worden. Rekombinante S. carnosus-Stämme, die Antigene, wie das Streptococcus-Protein G, auf ihrer Oberfläche exprimieren, sind als Lebendimpfstoffe besonders vielversprechend (5, 12). Zum Beispiel beschreiben Liliquist et al. (5) die Expression von drei verschiedenen heterologen Fibronectin-bindenden Proteinen. Die für die Expression verwendeten Expressionsvektoren umfassen den Promotor, die Signalsequenz und die Propeptid sequenz aus einem S. hyicus-Lipase-Genkonstrukt, das für die Expression in S. carnosus optimiert wurde.
Die Expression von heterologen Proteinen von höheren Eukaryoten in S. carnosus wurde im Stand der Technik ebenfalls beschrieben. Pschorr et al. (20) haben zum Beispiel die Expression der variablen Immunglobulin-Domäne (REIv) in S. carnosus mitgeteilt. Das heterologe REIv wurde als Fusionsprotein exprimiert, das aus einem Amino-terminalen Abschnitt des Prä-Pro-Peptids von S. hyicus-Lipase, einer Hexahistidin-Affinitätsmarkierung, gefolgt von der Erkennungssequenz von IgA-Protease und REIv, besteht. Das Prä-Pro-Peptid von S. hyicus wurde zur Sekretion des heterologen REIv in den Kulturüberstand verwendet.
Ein kritischer Nachteil von zahlreichen bakteriellen Systemen, einschließlich S. carnosus, ist deren Verwendung von seltenen Codons, die sehr verschieden von der Codon-Präferenz in Human-Genen ist. Zum Beispiel führte die Anwesenheit von seltenen Codons in E. coli zur verzögerten und verringerten Expression von rekombinanten Genen (2, 6). In diesem Zusammenhang synthetisierten Ikehara et al. (21) chemisch ein Human-Wachstumshormon (hGH)-Gen für die Expression in E. coli, in dem die verwendeten Aminosäure-Codons hauptsächlich aus jenen ausgewählt waren, die in einem Gen für den Elongationsfaktor Tu von E. coli gefunden werden.
Die EP 373 365 beschreibt die Transfektion von E. coli mit den E. coli-Genen, die für t-RNAs codieren, welche das AGG- und AGA-Codon erkennen und Arginin während der Biosynthese einbauen. Die Codons für AGA und AGG sind normalerweise selten verwendete Codons in E. coli.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, diesen Nachteil des Standes der Technik zu überwinden und ein prokaryotisches Expressionssystem mit verbesserten Eigenschaften für die Expression von rekombinanten Proteinen, wie hGH, in S. carnosus bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird innerhalb des Bereichs der Ansprüche und der Beschreibung der vorliegenden Erfindung gelöst.
Die Verwendung des Singulars oder Plurals in den Ansprüchen oder in der Beschreibung soll auf keinerlei Weise beschränkend sein und auch die alternative Form einschließen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines LipP-hGH-Fusionsproteins in S. carnosus, wie hierin in mehr Einzelheit beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Codon-Verwendung der Wirtszelle für Wirtszellen-Gene bestimmt wird, dass in der Nucleinsäure, die für das heterologe rekombinante Protein in der Wirtszelle codiert, selten vorkommende Codons durch häufige Codons ersetzt werden, wobei die Wirtszelle mit der Nucleinsäure, die für das rekombinante Protein codiert, transformiert wird und die rekombinante Nucleinsäure exprimiert wird. Mit dem Verfahren, das für die hierin bereitgestellte Expression des LipP-hGH-Fusionsproteins in S. carnosus beschriebenen wird, ist es möglich, eine signifikant bessere Expressionsrate der heterologen Proteine im Vergleich zu dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zu erzielen.
Die hierin beschriebenen Verfahren sind auch für die Expression von rekombinanten Proteinen auf der Oberfläche von Prokaryoten besonders vorteilhaft, da die kovalente Verankerung auf der Zellwand von intakten C-Termini abhängt, die bei den sekretierten verkürzten Proteinen abwesend sind, welche nicht durch das hierin beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Mit heterolog ist gemeint, dass das Protein in der prokaryotischen Wirtszelle nicht nativ ist, d.h. als ein der Wirtszelle eigenes Protein auftritt. "Rekombinant" bedeutet durch molekularbiologische Verfahren erzeugt. Ein heterologes rekombinantes Protein kann irgend ein den Fachmann bekanntes Protein sein, wie zum Beispiel Insulin, hGH, tPA, Cytokine, wie zum Beispiel Interleukine (IL), wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL- 15, IL-16, IL-17, IL-18, Interferon (IFN) alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN omega oder IFN tau, Tumornekrosefaktor (TNF), TNF alpha und TNF beta, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 und VEGF. Bei den prokaryotischen Wirtszellen kann es sich um irgendwelche dem Fachmann bekannte Wirtszellen handeln, insbesondere gram-positive und gram-negative Wirtszellen. Bei diesen kann es sich zum Beispiel um Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Proteus mirabilis oder bevorzugt Staphylococcus, wie z.B. insbesondere Staphylococcus carnosus, handeln, wie er aus öffentlichen Sammlungen erhältlich ist, z.B. der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, z.B. Stamm TM300 (DSM 4600, 4601 oder 4602).
Innerhalb des Bereichs des hierin beschriebenen Verfahrens wird zuerst die Verwendung der Codons, d.h. der codierenden Nucleotid-Triplets, bei der Wirtszelle für so viele native Proteine wie möglich in der grundlegenden codierenden Gensequenz analysiert. Die Codon-Häufigkeiten von 51 Genen wurden für den Wirtsorganismus Staphylococcus carnosus-Stamm TM300 (10) mittels Beispiel analysiert und sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt:
Tabelle 1
Es wurde gefunden, dass die codierenden Sequenzen von Staphylococci zum Beispiel einen sehr niedrigen G + C-Gehalt von etwa 30% aufweisen und die A + T-reichen Codons bevorzugt sind. Deshalb wird erfindungsgemäß die Produktion von hGH auf zwei Wegen erhöht: (i) Austauschen von seltenen Codons in der codierenden Gensequenz gegen häufige (siehe auch Beispiel 1) und/oder (ii) Exprimieren von seltenen tRNAs (tRNA = Transfer-RNA; siehe auch Beispiel 2).
Die vorliegende Patentschrift beschreibt auch Verfahren zur Herstellung eines heterologen rekombinanten Proteins, in dem für S. carnosus, wie in Tabelle 1 gezeigt, oder auf ähnliche Weise für jede andere hierin beschriebene Wirtszelle entweder einige oder alle der selten vorkommenden Codons durch häufigere ersetzt werden, zum Beispiel wird gemäß der Analyse in Tabelle 1 das Glu-Codon GAG durch GAA ersetzt oder die Leu-Codons CTC, CTG und CTA werden durch TTA, TTG oder CTT ersetzt.
Die vorliegende Patentschrift beschreibt weiter ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen rekombinanten Proteins in einer prokaryotischen Wirtszelle, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Codon-Verwendung der Wirtszelle für Wirtszellen-Gene bestimmt wird, wobei die Wirtszelle mit der Nucleinsäure, die tRNA oder tRNAs codiert, die für selten vorkommende Codon spezifisch ist/sind, mit der für das rekombinante Protein codierenden Nucleinsäure transformiert wird und die rekombinante Nucleinsäure exprimiert wird (siehe auch Beispiel 2). Der Fachmann kann die seltenen Codons der Wirtszelle durch Analyse der Gene oder der cDNAs (oder durch reverse Transkription der mRNA) bestimmen. Dies wurde zum Beispiel für die Wirtszelle S. carnosus Stamm TM300 (10) in Tabelle 1 vorgenommen. Das hierin beschriebene Verfahren umfasst die Einführung von tRNAs oder dafür codierende Nucleinsäure für eine bis alle der seltenen tRNAs in der Wirtszelle. Da die Wirtszelle mit tRNAs ausgestattet ist, die für seltene Codons spezifisch sind, wird das heterologe rekombinante Protein gemäß der Erfindung in größeren Mengen exprimiert, als es in bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik der Fall ist. Diese überraschend vorteilhafte Eigenschaft des hierin beschriebenen Verfahrens ist auch in Beispiel 2 gezeigt. Dies kann entweder allein oder in Verbindung mit der Substitution von häufigen Codons anstelle von Codons, die bei der Wirtszelle selten sind, in der für das heterologe Protein codierenden Nucleinsäure stattfinden.
Deshalb beschreibt die vorliegende Patentschrift ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in der Nucleinsäure, die für das heterologe rekombinante Protein in der Wirtszelle codiert, selten vorkommende Codons durch häufige Codons ersetzt werden und die Wirtszelle mit tRNA oder tRNAs, die für selten vorkommende Codons codieren, und mit der für das rekombinante Protein codierenden Nucleinsäure transformiert wird.
Die vorliegende Patentschrift beschreibt ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Codons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von weniger als 15% verwendet werden, durch Codons mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von mindestens 15% ersetzt werden; das bevorzugt dadurch gekennzeichnet ist, dass Codons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von 7 bis 12% verwendet werden, durch Codons mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von mehr als 12% ersetzt werden; am meisten bevorzugt dadurch gekennzeichnet ist, dass Codons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von bis zu 7 oder 10% verwendet werden, durch Codons mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von mehr als 7% oder mehr als 10% ersetzt werden. Eine weitere hierin beschriebene bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Codon oder die Codons, die am wenigsten häufig in der Wirtszelle vorkommen, durch das Codon oder die Codons ersetzt wird/werden, die am häufigsten in der Wirtszelle vorkommen. Eine Ausnahme kann sein, wenn die Codons für die Expression absolut wesentlich sind.
Die hierin beschriebene Erfindung ist auf ein Verfahren gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die codierenden Nucleinsäure-Codons, die in S. carnosus mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von weniger als 10% verwendet werden, durch Codons mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von mindestens 10% ersetzt werden.
Das hierin beschriebene Verfahren ist auf Escherichia coli anwendbar, die von öffentlichen Sammlungen, z.B. der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, erhältlich ist, z.B. E. coli Stamm K12 JM107 (DSM 3950). Das hierin beschriebene Verfahren ist auch auf eine Wirtszelle anwendbar, die aus der Gattung Staphylococcus ausgewählt ist, bevorzugt auf Staphylococcus carnosus (siehe auch Beispiele 1 und 2).
Das hierin beschriebene Verfahren ist auch auf die Produktion eines rekombinanten Proteins wie eines Antikörper-Proteins, anwendbar. Mit Antikörper-Protein ist auch ein Fragment gemeint, z.B. ein Fab-Fragment (auf Englisch "Fragment antigen-binding = Fab"), ein F(ab')₂-Fragment, ein Fv-Fragment (auf Englisch: "Fragment variable" = Fragment des variablen Teils) oder ein Einzelketten-Fv (scFv)), Minikörper, Dia-, Tria- und Tetrakörper. Bei dem rekombinanten Protein kann es sich auch zum Beispiel um Insulin, Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPa) oder um ein Human-Protein, ein Wachstumshormon, wie zum Beispiel Human-Wachstumshormon (hGH, siehe Beispiele 1 und 2), handeln.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass G- oder C-reiche Codons durch Codons ersetzt werden, die A oder T enthalten. Dies bedeutet, dass Codons, die mehr G oder C enthalten, durch Codons ersetzt werden, die nun zum Beispiel ein A oder ein T anstelle eines G oder C enthalten; es bedeutet nicht, dass die Codons nun ausschließlich G oder C enthalten müssen (siehe anschließend die bevorzugtesten Ausführungsformen).
In dem hierin beschriebenen Verfahren können alle seltenen gefundenen Codons durch häufige ersetzt werden (siehe z.B. Tabelle 1), und nicht nur jene, die in den nachstehend angegebenen bevorzugten Ausführungsformen angegeben sind.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon GCC durch GCA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon TGC durch TGT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon GAC durch GAT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon GAG durch GAA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon TTC durch TTT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon GGG durch GGT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon CAC durch CAT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon ATA durch ATT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon AAG durch AAA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon CTC durch TTA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon AAC durch AAT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon CCC durch CCA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon CAG durch CAA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon CGG durch CGT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon TCG durch TCA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon ACC durch ACA ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon GTC durch GTT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon TAC durch TAT ersetzt ist.
Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Codon TGA durch TAA ersetzt ist.
Noch ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle mit der Nucleinsäure, die für AGG-tRNA oder AGA-tRNA und mit der für das rekombinante Protein codierenden Nucleinsäure transformiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Nucleinsäure-Molekül, das für ein LipP-hGH-Fusionsprotein codiert, welches die Sequenz der SEQ ID NO: 3 umfasst.
Beispiel 1: Konstruktion eines synthetischen hGH-Gens mit S. carnosus-spezifischer Codon-Verwendung
Als Beispiel für ein Protein wurde Human-Wachstumshormon (hGH) in S. carnosus Stamm TM300 exprimiert.
Der Vergleich der Codon-Verwendung des reifen hGH mit dem in S. carnosus gezeigten zeigte, dass 51% der Codons des reifen hGH, was 27% der Gesamtzahl der Codons darstellt, nur 7% oder weniger der S. carnosus-Codon-Häufigkeit ausmachen (Tab. 2). Eine Enterokinase-Schnittstelle wurde am 5'-Ende der DNA-Sequenz des reifen hGH eingeführt, und das hGH wurde mit S. carnosus-spezifischer Codon-Verwendung synthetisiert. Die Codons in dem synthetischen Gen wurden mit etwa der gleichen Häufigkeit wie in dem S. carnosus-Gen verwendet. Codons, die von S. carnosus mit einer Häufigkeit von weniger als 10% verwendet wurden, wurden nicht verwendet, abgesehen von jenen, die erforderlich waren, um Restriktions-Schnittstellen einzuführen (siehe Tab. 2). Tabelle 2 Zahl der Codons in hGH-cDNA und in der synthetischen hGH-DNA gemäß der Erfindung

¹Zahl der Codons in hGH-cDNA
²Zahl in synthetischer hGH-DNA (gemäß der Erfindung)

Die synthetische hGH-DNA-Sequenz wurde aus überlappenden Oligonucleotiden synthetisiert, die in vitro hybridisiert und ligiert wurden. Das resultierende DNA-Fragment wurde in das E. coli-Plasmid pSL1190 (3) kloniert, durch Sequenzierung verifiziert und in die hGH-Expressionskassette inseriert, um die hGH-cDNA zwischen der NsiI- und PstI-Schnittstelle zu ersetzen (1). Die neue Expressionskassette wurde als BglII-ClaI-Fragment isoliert, in die kompatiblen BamHI- und NarI-Schnittstellen des Staphylococci-Expressionsvektors pTX15 kloniert und durch Protoplasten-Transformation in S. carnosus TM300 transformiert. In dem erhaltenen Expressionsvektor wurde das lip-hGH-Fusionsgen unter der Kontrolle des xyl-Promotors von pTX15 exprimiert. Die Expression wurde nach der Inaktivierung von XylR, dem Repressor des xyl-Promotors, durch Zugabe von 0,5%-iger Xylose zum Nährmedium erhalten. Die in-vitro-Klonierung und Sequenzierung wurden mittels Standardverfahren durchgeführt (1). Die Expression des hGH-Gens wurde als Fusion mit dem lip-Signal- und Propeptid aus Staphylococcus hyicus durchgeführt, das eine Enterokinase-Schnittstelle enthält, welche die Freisetzung des reifen hGH mit dem korrekten N-Terminus aus dem Fusionsprotein ermöglicht (1). Der resultierende Expressionsvektor pTX-LipP-hGH4 ist, abgesehen von der Codonverwendung des reifen hGH, identisch mit dem Vektor pTX-LipP-hGH2. Die S. carnosus-Stämme, die eines der Plasmide enthalten, wurden in einem modifizierten LB-Medium (1% Sojabohnenextrakt, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl), das mit 0,5% Xylose ergänzt war, kultiviert, um den xyl-Promotor der Expressionsvektoren zu aktivieren. Die Verwendung der verbesserten hGH-DNA hatte eine starke Auswirkung auf die Effizienz der Produktion von hGH in S. carnosus. Die Lip-hGH-Ausbeute war mindestens zweifach verbessert, und die Menge an verkürztem Lip-hGH-Protein war signifikant verringert (2, Bahnen 2 und 3). Die verkürzten Lip-hGH-Proteine sind nicht das Ergebnis von extrazellulären proteolytischen Aktivitäten, da das Lip-hGH-Protein in dem S. carnosus-Überstand stabil ist. Die verringerte Anwesenheit der verkürzten Proteine im Überstand von S. carnosus (pTX-LipP-hGH4) zeigt, dass hGH schneller durch die optimierte DNA-Sequenz translatiert wird und so intrazellulären Proteasen weniger Gelegenheit gibt, das Protein zu schneiden, bevor es durch die Cytoplasmamembran hindurch sekretiert wird.
Beispiel 2: Coexpression von t-RNAs, die für seltene Codons in hGH-cDNA spezifisch sind
Das Arginin-Codon AGG ist in S. carnosus-Genen äußerst selten, da es nur in 0,8% der Arginin-Codons verwendet wird. Die entsprechenden tRNA-Gene in S. carnosus sind noch nicht identifiziert worden. Deshalb exprimierten wir E. coli-tRNAs für das AGG-Codon in S. carnosus. Die E. coli-Gene argU und argW, welche die tRNAs für die Codons AGG/AGA und AGG codieren, waren mit ihren natürlichen Promotoren und Terminatoren in die Plasmide pUBS520 oder pSB101 (2, 16) kloniert worden. Die Fragmente wurden als SalI-SpHI- (argU) und Xmal-EcoRI- (argW) Fragmente isoliert und in die entsprechenden Restriktions-Schnittstellen des Shuttle (Transfer)-Vektors pRB572 (4) kloniert. Die resultierenden Plasmide pRBargU und pRBsargW wurden in S. carnosus (pTX-LipP-hGH2) transformiert, die hGH-cDNA exprimieren.
Die Proteinmuster im Überstand der erhaltenen S. carnosus-Stämme sind mit S. carnosus (pTX-LipP-hGH4) mit erhöhter Produktion des Lip-hGH-Proteins und weniger verkürzten Proteinen vergleichbar. Deshalb weist die Expression von seltenen tRNAs gemäß der Erfindung vorteilhafte Eigenschaften für die Herstellung von Human-Proteinen in beispielsweise S. carnosus auf.
Legende bezüglich der Figuren
1. Expression der Lip-hGH-Fusion in den Plasmiden pTX-LipP-hGH2 oder pTX-LipP-hGH4. Die Genfusion ist aus den DNA-Sequenzen, die für das Signalpeptid (SP) und das Propeptid (PP) aus Staphylococcus hyicus-Lipase codieren, und dem hGH-Teil des reifen Proteins (schwarz) aufgebaut und wird vom xyl-Promotor (als graues Dreieck gezeigt) transkribiert. Die hGH-cDNA oder die synthetische DNA-Sequenz wurde zwischen die NsiI- und die PstI-Schnittstelle inseriert. Das 5'-Ende der hGH-DNA-Sequenz wurde so modifiziert, dass es die Enterokinase-Schnittstelle 'DDDDK' codierte, gefolgt von der reifen hGH-Sequenz, wie unterhalb des Gens gezeigt.
2. Nachweis der Lip-hGH-Fusionsproteine im S. carnosus-Überstand. Gleiche Mengen des Überstands wurden mittels SDS-PAGE auf Tris-Glycin-Gelen, die 15% Acrylamid enthielten, aufgetrennt und dann mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Bahnen 1–5 enthalten Überstände von S. carnosus-Stämmen, welche den leeren Kontrollvektor pTX16 (15), ein Derivat von pTX15 (Bahn 1), die Plasmide pTX-LipP-hGH4 mit dem verbesserten hGH-Gen (Bahn 2), pTX-LipP-hGH2 mit der hGH-cDNA (Bahn 3), pTX-LipP-hGH2 plus pRBargU (Bahn 4) und pTX-LipP-hGH2 plus pRBargW (Bahn 5) enthalten. Standard-Proteine und ihre Molekulargewichte (kDa) sind auf der linken Seite gezeigt. Die Überstände wurden durch Fällen mit Trichloressigsäure konzentriert. SDS-PAGE wurde anhand von Standardverfahren aus dem Stand der Technik durchgeführt.
3. Nucleotid- und Aminosäuresequenz des hGH gemäß der Erfindung (LipPhGH4, SEQ ID NO: 3)
Relevante Restriktions-Schnittstellen sind einmal unterstrichen, die Shine-Dalgarno-Sequenz ist zweimal unterstrichen. Die Signalpeptidase 1 und die Enterokinase-Spaltungsstelle sind mit einer gestrichelten Linie unterstrichen. Nur die Regionen zwischen der BglII- und der NdeI-Schnittstelle und zwischen der NsiI- und der PstI-Schnittstelle waren synthetisch erzeugt und optimiert worden. Der Rest besteht aus der ursprünglichen Sequenz des Signal- und Propeptids der Lipase aus Staphylococcus hyicus.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Expression eines LipP-hGH-Fusionsgens in Staphylococcus carnosus, in dem ein Human-Wachstumshormon (hGH)-Gen an die codierende Sequenz des lip-Signal- und Propeptids von Staphylococcus hyicus-Lipase (LipP) fusioniert ist und das eine Enterokinase-Schnittstelle zwischen LipP und hGH umfasst, welche die Freisetzung des reifen hGH mit dem korrekten N-Terminus ermöglicht, und in dem Codons, die für das hGH-Gen codieren und in Staphylococcus carnosus mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von weniger als 10% verwendet werden, durch Codons mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von mindestens 10 ersetzt sind und/oder in dem die Staphylococcus carnosus-Wirtszelle mit tRNA, tRNAs oder dafür codierender Nucleinsäure transformiert ist, welche für Codons codieren, die mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von weniger als 10% verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die G- oder C-reichen Codons von hGH durch Codons ersetzt werden, die A oder T enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Staphylococcus carnosus mit der Nucleinsäure transformiert wird, die für AGG-tRNA oder AGA-tRNA codiert.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Staphylococcus carnosus mit der Nucleinsäure der E. coli-Gene argU und argW transformiert wird, welche die tRNAs für die Codons AGG/AGA und AGG codieren.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in dem das LipP-hGH-Fusionsprotein durch ein Nucleinsäure-Molekül codiert wird, welches die Sequenz SEQ ID NO: 3 umfasst.
Nucleinsäure-Molekül, das für ein LipP-hGH-Fusionsprotein codiert und die Sequenz SEQ ID NO: 3 umfasst.