JP2000175687A - ネオカルチノスタチン・アポタンパク質合成遺伝子 - Google Patents
ネオカルチノスタチン・アポタンパク質合成遺伝子Info
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- JP2000175687A JP2000175687A JP10358029A JP35802998A JP2000175687A JP 2000175687 A JP2000175687 A JP 2000175687A JP 10358029 A JP10358029 A JP 10358029A JP 35802998 A JP35802998 A JP 35802998A JP 2000175687 A JP2000175687 A JP 2000175687A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 大腸菌で発現するように遺伝子工学的に新規
にデザインしたアポＮＣの合成遺伝子と、この遺伝子の
発現産物であるアポＮＣＳの提供。 【解決手段】 特定の塩基配列を有するネオカルチノス
タチン・アポタンパク質合成遺伝子と、この合成遺伝子
の発現産物であって、特定のアミノ酸配列を有するネオ
カルチノスタチン・アポタンパク質。
にデザインしたアポＮＣの合成遺伝子と、この遺伝子の
発現産物であるアポＮＣＳの提供。 【解決手段】 特定の塩基配列を有するネオカルチノス
タチン・アポタンパク質合成遺伝子と、この合成遺伝子
の発現産物であって、特定のアミノ酸配列を有するネオ
カルチノスタチン・アポタンパク質。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願は、遺伝子工学的に
新規にデザインしたネオカルチノスタチンのアポタンパ
ク質とその遺伝子、並びにこの遺伝子の作成方法に関す
るものである。さらに詳しくは、この出願は、抗腫瘍性
抗生物質ネオカルチノスタチンを構成する新規アポタン
パク質と、このアポタンパク質をコードする新規の遺伝
子、並びにこの遺伝子を作成する方法に関するものであ
る。
新規にデザインしたネオカルチノスタチンのアポタンパ
ク質とその遺伝子、並びにこの遺伝子の作成方法に関す
るものである。さらに詳しくは、この出願は、抗腫瘍性
抗生物質ネオカルチノスタチンを構成する新規アポタン
パク質と、このアポタンパク質をコードする新規の遺伝
子、並びにこの遺伝子を作成する方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ネオカルチノスタチン（neocarzinostat
in：以下「ＮＣＳ」と記載する）は、土壌中より分離さ
れた放線菌Streptomyces carzinostaticus var. F-14か
ら得られた抗腫瘍性抗生物質であり（J. Antibiotics,
Ser.A 18:68-76, 1965）、１９７７年からは急性白血
病、膀胱癌、膵臓癌等に対する癌化学療法剤として臨床
使用されている。
in：以下「ＮＣＳ」と記載する）は、土壌中より分離さ
れた放線菌Streptomyces carzinostaticus var. F-14か
ら得られた抗腫瘍性抗生物質であり（J. Antibiotics,
Ser.A 18:68-76, 1965）、１９７７年からは急性白血
病、膀胱癌、膵臓癌等に対する癌化学療法剤として臨床
使用されている。
【０００３】このＮＣＳは、低分子成分であるクロモホ
ア（chromophore ）とタンパク質成分であるアポタンパ
ク質（以下「アポＮＣＳ」と記載する）からなってお
り、その生物活性はクロモホアが担い、アポＮＣＳは、
熱・光等に対して非常に不安定なクロモホアを安定化す
るなどの役割を果たしている。ＮＣＳの作用機序に関し
ては単離以来詳細に検討され、ＤＮＡ合成阻害、細胞分
裂阻害、ＤＮＡ鎖切断作用等が判明している。また、Ｎ
ＣＳの化学的構造解析も進められ、クロモホアの部分構
造としてナフタレンカルボン酸、アミノ糖、エチレンカ
ルボネートおよびエポキサイドが次々と判明している。
さらに、アポＮＣＳの一次構造も解明されている（Bio
l. Pharm. Bull. 16:26-28, 1993）。
ア（chromophore ）とタンパク質成分であるアポタンパ
ク質（以下「アポＮＣＳ」と記載する）からなってお
り、その生物活性はクロモホアが担い、アポＮＣＳは、
熱・光等に対して非常に不安定なクロモホアを安定化す
るなどの役割を果たしている。ＮＣＳの作用機序に関し
ては単離以来詳細に検討され、ＤＮＡ合成阻害、細胞分
裂阻害、ＤＮＡ鎖切断作用等が判明している。また、Ｎ
ＣＳの化学的構造解析も進められ、クロモホアの部分構
造としてナフタレンカルボン酸、アミノ糖、エチレンカ
ルボネートおよびエポキサイドが次々と判明している。
さらに、アポＮＣＳの一次構造も解明されている（Bio
l. Pharm. Bull. 16:26-28, 1993）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、ＮＣＳ
は既に癌化学療法剤として臨床使用されているが、さら
に有効かつ汎用的な薬剤とするためには、その安定化が
不可欠である。このようなＮＣＳの安定化の一つの手段
は、活性成分であるクロモホアを改変して熱・光等に対
しても安定なものとすることであり、もう一つの手段
は、クロモホアのキャリアとして機能しているアポＮＣ
Ｓを改変し、クロモホアをより一層安定した状態で保持
させることである。
は既に癌化学療法剤として臨床使用されているが、さら
に有効かつ汎用的な薬剤とするためには、その安定化が
不可欠である。このようなＮＣＳの安定化の一つの手段
は、活性成分であるクロモホアを改変して熱・光等に対
しても安定なものとすることであり、もう一つの手段
は、クロモホアのキャリアとして機能しているアポＮＣ
Ｓを改変し、クロモホアをより一層安定した状態で保持
させることである。
【０００５】また、アポＮＣＳの改変は、標的組織に対
してＮＣＳを作用させることや、あるいはクロモホア放
出の制御等、ＮＣＳに対するより高度な機能付加を可能
にするものと期待される。ただし、アポＮＣＳを任意の
構造に改変するためには、改変の結果を簡便かつ正確に
評価するために一定量のアポＮＣＳが必要であり、その
ためには、大腸菌で効率よく発現するアポＮＣＳ遺伝子
が不可欠である。また、このような大腸菌発現遺伝子
は、アポＮＣＳの大量生産をも可能とする。
してＮＣＳを作用させることや、あるいはクロモホア放
出の制御等、ＮＣＳに対するより高度な機能付加を可能
にするものと期待される。ただし、アポＮＣＳを任意の
構造に改変するためには、改変の結果を簡便かつ正確に
評価するために一定量のアポＮＣＳが必要であり、その
ためには、大腸菌で効率よく発現するアポＮＣＳ遺伝子
が不可欠である。また、このような大腸菌発現遺伝子
は、アポＮＣＳの大量生産をも可能とする。
【０００６】この出願の発明は以上のとおりの事情に鑑
みてなされたものであって、大腸菌で発現するように遺
伝子工学的に新規にデザインしたアポＮＣＳの合成遺伝
子と、この遺伝子の発現産物であるアポＮＣＳを提供す
ることを課題としている。
みてなされたものであって、大腸菌で発現するように遺
伝子工学的に新規にデザインしたアポＮＣＳの合成遺伝
子と、この遺伝子の発現産物であるアポＮＣＳを提供す
ることを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するものとして、以下の(1)から(7)の発明を提供
する。 (1) 配列番号１の塩基配列を有するネオカルチノスタチ
ン・アポタンパク質合成遺伝子。
を解決するものとして、以下の(1)から(7)の発明を提供
する。 (1) 配列番号１の塩基配列を有するネオカルチノスタチ
ン・アポタンパク質合成遺伝子。
【０００８】(2) 配列番号１の塩基配列における１以上
の塩基を欠失、置換もしくは付加した塩基配列からなる
ネオカルチノスタチン・アポタンパク質改変遺伝子。 (3) 上記(1)記載の遺伝子の発現産物であって、配列番
号２のアミノ酸配列を有するネオカルチノスタチン・ア
ポタンパク質。 (4) 上記(2)記載の改変遺伝子の発現産物であって、配
列番号２にアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる
ネオカルチノスタチン・改変アポタンパク質。
の塩基を欠失、置換もしくは付加した塩基配列からなる
ネオカルチノスタチン・アポタンパク質改変遺伝子。 (3) 上記(1)記載の遺伝子の発現産物であって、配列番
号２のアミノ酸配列を有するネオカルチノスタチン・ア
ポタンパク質。 (4) 上記(2)記載の改変遺伝子の発現産物であって、配
列番号２にアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる
ネオカルチノスタチン・改変アポタンパク質。
【０００９】(5) 配列番号２の一部配列からなるペプチ
ド。 (6) 前記(3)または(4)のアポタンパク質、もしくは前記
(5)のペプチドを抗原として作成された抗体。 (7) 大腸菌で発現するネオカルチノスタチン・アポタン
パク質合成遺伝子の作成方法であって、(a) 放線菌ゲノ
ムのネオカルチノスタチン・アポタンパク質遺伝子の配
列と大腸菌のコドンデータに基づき、大腸菌で発現可能
なタンパク質をコードするＤＮＡ配列をデザインし、こ
のＤＮＡ配列を複数の断片としとして化学合成し、(b)
各ＤＮＡ断片を各々ＰＣＲ増幅し、(c) 各ＰＣＲ産物を
連結したＤＮＡライブラリーを作成し、(d) このＤＮＡ
ライブラリーを挿入したファジェミドベクターを導入し
た大腸菌にヘルパーファージを感染させた後、抗原とし
てのネオカルチノスタチン・アポタンパク質を提示して
ファージディスプレイを行い、(e) 抗ネオカルチノスタ
チン・アポタンパク質抗体に反応するファージ粒子の選
択と、この粒子へのファージディスプレイを複数回繰り
返して抗体反応性粒子を濃縮し、(f) 濃縮したファージ
粒子から回収したベクターのインサートＤＮＡを単離す
ることを特徴とするネオカルチノスタチン・アポタンパ
ク質合成遺伝子の作成方法。
ド。 (6) 前記(3)または(4)のアポタンパク質、もしくは前記
(5)のペプチドを抗原として作成された抗体。 (7) 大腸菌で発現するネオカルチノスタチン・アポタン
パク質合成遺伝子の作成方法であって、(a) 放線菌ゲノ
ムのネオカルチノスタチン・アポタンパク質遺伝子の配
列と大腸菌のコドンデータに基づき、大腸菌で発現可能
なタンパク質をコードするＤＮＡ配列をデザインし、こ
のＤＮＡ配列を複数の断片としとして化学合成し、(b)
各ＤＮＡ断片を各々ＰＣＲ増幅し、(c) 各ＰＣＲ産物を
連結したＤＮＡライブラリーを作成し、(d) このＤＮＡ
ライブラリーを挿入したファジェミドベクターを導入し
た大腸菌にヘルパーファージを感染させた後、抗原とし
てのネオカルチノスタチン・アポタンパク質を提示して
ファージディスプレイを行い、(e) 抗ネオカルチノスタ
チン・アポタンパク質抗体に反応するファージ粒子の選
択と、この粒子へのファージディスプレイを複数回繰り
返して抗体反応性粒子を濃縮し、(f) 濃縮したファージ
粒子から回収したベクターのインサートＤＮＡを単離す
ることを特徴とするネオカルチノスタチン・アポタンパ
ク質合成遺伝子の作成方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】前記発明(1)のアポＮＣＳ合成遺
伝子は、放線菌ゲノムに存在する野生型アポＮＣＳの遺
伝子塩基配列およびアミノ酸配列、さらにはこれまでに
報告された大腸菌の遺伝子から求められるコドン表デー
タおよび大腸菌のｔＲＮＡ含量データを参考にして、大
腸菌で効率よく発現するようにデザインされている。
伝子は、放線菌ゲノムに存在する野生型アポＮＣＳの遺
伝子塩基配列およびアミノ酸配列、さらにはこれまでに
報告された大腸菌の遺伝子から求められるコドン表デー
タおよび大腸菌のｔＲＮＡ含量データを参考にして、大
腸菌で効率よく発現するようにデザインされている。
【００１１】このアポＮＣＳ合成遺伝子は、配列番号１
に基づき、公知のＤＮＡ合成法により作成することがで
きる。前記発明(2)の改変遺伝子は、配列番号１の塩基
配列における１以上の塩基が欠失または付加、もしくは
他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ配列であ
り、このような改変遺伝子は、前記発明(1)の合成遺伝
子に基づき、公知の方法および市販のミューテーション
キット等を用いて作成することができる。
に基づき、公知のＤＮＡ合成法により作成することがで
きる。前記発明(2)の改変遺伝子は、配列番号１の塩基
配列における１以上の塩基が欠失または付加、もしくは
他の塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ配列であ
り、このような改変遺伝子は、前記発明(1)の合成遺伝
子に基づき、公知の方法および市販のミューテーション
キット等を用いて作成することができる。
【００１２】前記発明(3)のアポＮＣＳは、前記発明(1)
のアポＮＣＳ合成遺伝子の発現産物であって、配列番号
２のアミノ酸配列を有する新規のタンパク質である。こ
のアポＮＣＳは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に
基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、前記
発明(1)のアポＮＣＳ合成遺伝子を用いて組換えＤＮＡ
技術で生産する方法などにより取得することができる。
例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場
合には、アポＮＣＳ合成遺伝子を適当な発現ベクターに
組換えることによって、大腸菌、枯草菌、酵母、動植物
細胞等で、この発明のアポＮＣＳを大量に発現させるこ
とができる。
のアポＮＣＳ合成遺伝子の発現産物であって、配列番号
２のアミノ酸配列を有する新規のタンパク質である。こ
のアポＮＣＳは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に
基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、前記
発明(1)のアポＮＣＳ合成遺伝子を用いて組換えＤＮＡ
技術で生産する方法などにより取得することができる。
例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場
合には、アポＮＣＳ合成遺伝子を適当な発現ベクターに
組換えることによって、大腸菌、枯草菌、酵母、動植物
細胞等で、この発明のアポＮＣＳを大量に発現させるこ
とができる。
【００１３】前記発明(4)の改変アポＮＣＳは、前記発
明(2)のアポＮＣＳ改変遺伝子の発現するタンパク質で
あって、配列番号２のアミノ酸配列における１以上のア
ミノ酸残基が欠失または付加、もしくは他のアミノ酸残
基に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっ
て、前記(3)のアポＮＣＳと同様に、組換えＤＮＡ技術
によって作成することができる。
明(2)のアポＮＣＳ改変遺伝子の発現するタンパク質で
あって、配列番号２のアミノ酸配列における１以上のア
ミノ酸残基が欠失または付加、もしくは他のアミノ酸残
基に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっ
て、前記(3)のアポＮＣＳと同様に、組換えＤＮＡ技術
によって作成することができる。
【００１４】前記発明(5)のペプチドは、配列番号２の
アミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチ
ド断片（例えば、５アミノ酸残基以上）である。これら
のペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用い
ることができる。前記発明(6)の抗体は、前記のアポＮ
ＣＳまたは改変アポＮＣＳ、もしくはそれらの部分ペプ
チドを抗原として、公知の方法によりポリクロ−ナル抗
体またはモノクロ−ナル抗体として得ることができる。
アミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチ
ド断片（例えば、５アミノ酸残基以上）である。これら
のペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用い
ることができる。前記発明(6)の抗体は、前記のアポＮ
ＣＳまたは改変アポＮＣＳ、もしくはそれらの部分ペプ
チドを抗原として、公知の方法によりポリクロ−ナル抗
体またはモノクロ−ナル抗体として得ることができる。
【００１５】
【実施例】以下、実施例を示し、この発明のアポＮＣＳ
合成遺伝子の合成の手順についてさらに詳細かつ具体的
に説明するが、この発明は以下の例に限定されるもので
はない。 Ａ：鋳型ＤＮＡの合成 表１に示した大腸菌遺伝子におけるコドンデータおよび
ｔＲＮＡ含量を参考にし、野生型アポＮＣＳのアミノ酸
一次配列構造を保存しつつ、かつ７つの制限酵素部位を
設けた塩基配列（配列番号３）をデザインした。
合成遺伝子の合成の手順についてさらに詳細かつ具体的
に説明するが、この発明は以下の例に限定されるもので
はない。 Ａ：鋳型ＤＮＡの合成 表１に示した大腸菌遺伝子におけるコドンデータおよび
ｔＲＮＡ含量を参考にし、野生型アポＮＣＳのアミノ酸
一次配列構造を保存しつつ、かつ７つの制限酵素部位を
設けた塩基配列（配列番号３）をデザインした。
【００１６】
【表１】
【００１７】次いで、配列番号３の配列を基に、ＤＮＡ
合成機で正確・精密な合成が可能であるサイズ（１００
塩基前後）となるように５本のオリゴヌクレオチド（配
列番号４−８）をデザインし、それぞれＮ-Ｉ〜Ｖとし
た。 Ｂ：ＰＣＲ増幅 ５本の鋳型ＤＮＡ（Ｎ-Ｉ〜Ｖ）をそれぞれＰＣＲ増幅
するためのプライマー配列（配列番号９−18）をＤＮＡ
合成機を用いて合成した。鋳型ＤＮＡとプライマーセッ
トとの関係は次のとおりである。Ｎ-Ｉ（配列番号９、1
0）、Ｎ-II（配列番号11、12）、Ｎ-III （配列番号1
3、14）、Ｎ-IV（配列番号15、16）、Ｎ-Ｖ（配列番号1
7、18）。
合成機で正確・精密な合成が可能であるサイズ（１００
塩基前後）となるように５本のオリゴヌクレオチド（配
列番号４−８）をデザインし、それぞれＮ-Ｉ〜Ｖとし
た。 Ｂ：ＰＣＲ増幅 ５本の鋳型ＤＮＡ（Ｎ-Ｉ〜Ｖ）をそれぞれＰＣＲ増幅
するためのプライマー配列（配列番号９−18）をＤＮＡ
合成機を用いて合成した。鋳型ＤＮＡとプライマーセッ
トとの関係は次のとおりである。Ｎ-Ｉ（配列番号９、1
0）、Ｎ-II（配列番号11、12）、Ｎ-III （配列番号1
3、14）、Ｎ-IV（配列番号15、16）、Ｎ-Ｖ（配列番号1
7、18）。
【００１８】これらの鋳型ＤＮＡおよびプライマーセッ
トをそれぞれ用いて、２本鎖ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲの反応条件は、変性（94℃：30秒間）、アニーリ
ング（58℃：30秒間）、伸長（７２℃：３０秒間）を３
０サイクルとした。図１は、各ＰＣＲ産物のゲル電気泳
動の結果である。 Ｃ：ＤＮＡライブラリーの作成 上記のＰＣＲ産物である各々の２本鎖ＤＮＡ（Ｎ-Ｉ〜
Ｎ−Ｖライブラリー）を制限酵素で処理し、それぞれの
末端を調製した。すなわち、Ｎ-ＩライブラリーはＨind
IIIとＫpnＩ、Ｎ-IIライブラリーはＮotＩとＫpnＩ、Ｎ
-III ライブラリーはＰstＩとＫpnＩ、Ｎ-IVライブラリ
ーはＮheＩとＫpnＩ、そしてＮ-ＶライブラリーはＳph
ＩとＫpnＩで処理した。
トをそれぞれ用いて、２本鎖ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲの反応条件は、変性（94℃：30秒間）、アニーリ
ング（58℃：30秒間）、伸長（７２℃：３０秒間）を３
０サイクルとした。図１は、各ＰＣＲ産物のゲル電気泳
動の結果である。 Ｃ：ＤＮＡライブラリーの作成 上記のＰＣＲ産物である各々の２本鎖ＤＮＡ（Ｎ-Ｉ〜
Ｎ−Ｖライブラリー）を制限酵素で処理し、それぞれの
末端を調製した。すなわち、Ｎ-ＩライブラリーはＨind
IIIとＫpnＩ、Ｎ-IIライブラリーはＮotＩとＫpnＩ、Ｎ
-III ライブラリーはＰstＩとＫpnＩ、Ｎ-IVライブラリ
ーはＮheＩとＫpnＩ、そしてＮ-ＶライブラリーはＳph
ＩとＫpnＩで処理した。
【００１９】次いで、プラスミドＤＮＡｐＧＥＭ３Ｚｆ
(+) をＨindIIIとＫpnＩで開裂し、この開裂部位にＮ-
Ｉライブラリーを挿入して組換えプラスミドを作成し、
この組換えプラスミドをエレクトロポーレーション法に
より大腸菌ＸＬ１−Ｂlue細胞に導入し、この形質転換
菌を増殖させた後、プラスミドＤＮＡを回収した。回収
したプラスミドＤＮＡをＮotＩで開裂し、１％アガロー
スゲル電気泳動により、直鎖状ＤＮＡ断片を回収・精製
した。すなわち、形質転換菌から回収されたプラスミド
ＤＮＡのうち、Ｎ−ＩライブラリーＤＮＡを保有しない
プラスミドＤＮＡはＮotＩ部位を持たず、従って直鎖状
とならないため、ゲル精製法によりＮ−Ｉライブラリー
を保有するプラスミドＤＮＡのみを回収・精製すること
ができる。
(+) をＨindIIIとＫpnＩで開裂し、この開裂部位にＮ-
Ｉライブラリーを挿入して組換えプラスミドを作成し、
この組換えプラスミドをエレクトロポーレーション法に
より大腸菌ＸＬ１−Ｂlue細胞に導入し、この形質転換
菌を増殖させた後、プラスミドＤＮＡを回収した。回収
したプラスミドＤＮＡをＮotＩで開裂し、１％アガロー
スゲル電気泳動により、直鎖状ＤＮＡ断片を回収・精製
した。すなわち、形質転換菌から回収されたプラスミド
ＤＮＡのうち、Ｎ−ＩライブラリーＤＮＡを保有しない
プラスミドＤＮＡはＮotＩ部位を持たず、従って直鎖状
とならないため、ゲル精製法によりＮ−Ｉライブラリー
を保有するプラスミドＤＮＡのみを回収・精製すること
ができる。
【００２０】次に、精製ＤＮＡ断片をセルフライゲーシ
ョンして環状のプラスミドＤＮＡとした後、エレクトロ
ポーレーション法により大腸菌ＸＬ１−Ｂlue 細胞に導
入し、大腸菌を増殖させた後、プラスミドＤＮＡ（Ｉ−
ライブラリー）を回収した。Ｉ−ライブラリーをＮotＩ
およびＫpnＩで開裂し、この開裂部位にＮ−IIライブラ
リーの２本鎖ＤＮＡを挿入し、上記と同様に大腸菌ＸＬ
１−Ｂlue 細胞に導入し、大腸菌を増殖させた後、プラ
スミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをＰst
Ｉで開裂し、直鎖状となったＤＮＡをゲル精製法により
回収・精製し、環状ＤＮＡとした後、大腸菌で増幅さ
せ、II−ライブラリーとした。以下、同様の操作を繰り
返し、Ｎ−ＩライブラリーからＮ−Ｖライブラリーの各
２本鎖ＤＮＡを連続して有するＶ−ライブラリーを構築
した。 Ｄ：ファージディスプレイ Ｖ−ライブラリーをＢglIIとＫpnＩで処理し、アガロー
スゲル電気泳動によって各ＤＮＡ断片を分画し、約500b
p 長の断片（Ｖ−ライブラリーＢglII／ＫpnＩＤＮＡ断
片）をゲル精製法により回収した。
ョンして環状のプラスミドＤＮＡとした後、エレクトロ
ポーレーション法により大腸菌ＸＬ１−Ｂlue 細胞に導
入し、大腸菌を増殖させた後、プラスミドＤＮＡ（Ｉ−
ライブラリー）を回収した。Ｉ−ライブラリーをＮotＩ
およびＫpnＩで開裂し、この開裂部位にＮ−IIライブラ
リーの２本鎖ＤＮＡを挿入し、上記と同様に大腸菌ＸＬ
１−Ｂlue 細胞に導入し、大腸菌を増殖させた後、プラ
スミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをＰst
Ｉで開裂し、直鎖状となったＤＮＡをゲル精製法により
回収・精製し、環状ＤＮＡとした後、大腸菌で増幅さ
せ、II−ライブラリーとした。以下、同様の操作を繰り
返し、Ｎ−ＩライブラリーからＮ−Ｖライブラリーの各
２本鎖ＤＮＡを連続して有するＶ−ライブラリーを構築
した。 Ｄ：ファージディスプレイ Ｖ−ライブラリーをＢglIIとＫpnＩで処理し、アガロー
スゲル電気泳動によって各ＤＮＡ断片を分画し、約500b
p 長の断片（Ｖ−ライブラリーＢglII／ＫpnＩＤＮＡ断
片）をゲル精製法により回収した。
【００２１】一方、ファージディスプレイ型発現プラス
ミドＤＮＡをＢglIIとＫpnＩで開裂し、この開裂部位に
Ｖ−ライブラリーＢglII／ＫpnＩＤＮＡ断片を挿入し、
エレクトロポーレーション法により大腸菌ＸＬ１−Ｂlu
e 細胞に導入し、大腸菌を増殖させた。次いで、この増
殖させた大腸菌に、定法に従ってヘルパーファージ（例
えば、ＶＳＣＭ１３ファージ）を感染させ、ファージデ
ィスプレイ型としての抗原（アポＮＣＳ）を提示した
後、遠心法および塩析法によりファージ粒子を濃縮し、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に再懸濁した。 Ｅ：パンニング 抗アポＮＣＳモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ用プレー
ト各ウェルに１mg/mlＰＢＳ溶液の濃度で固相化し、抗
体溶液を取り除いた後、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで各ウェル
をブロッキングし、上記のファージ粒子を反応させた。
各ウェルをＰＢＳで１０回洗浄した後、塩酸酸性にし、
ファージを回収した。回収したファージを大腸菌ＸＬ１
−Ｂlue細胞に感染させ、ファージディスプレーさせ、
濃縮・回収の後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に再懸濁し
た。これらのパンニング操作を５回以上行うことによ
り、抗アポＮＣＳモノクローナル抗体と反応するファー
ジを濃縮した。 Ｆ：目的遺伝子のクローン特定 ５回のパンニングを終了したファージを再び大腸菌ＸＬ
−Ｂlue細胞に感染させ、寒天プレート上にコロニーを
形成させ、そのうち５つのシグナルコロニーをランダム
に選択し、増殖させた後、培養液を２つに分け、一方か
らはプラスミドＤＮＡを回収した。また、他方には、培
養液中にＩＰＴＧを添加し、タンパク質を誘導後、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図２）と抗アポ
ＮＣＳモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット
法（図３）により目的タンパク質の生産を確認した。
ミドＤＮＡをＢglIIとＫpnＩで開裂し、この開裂部位に
Ｖ−ライブラリーＢglII／ＫpnＩＤＮＡ断片を挿入し、
エレクトロポーレーション法により大腸菌ＸＬ１−Ｂlu
e 細胞に導入し、大腸菌を増殖させた。次いで、この増
殖させた大腸菌に、定法に従ってヘルパーファージ（例
えば、ＶＳＣＭ１３ファージ）を感染させ、ファージデ
ィスプレイ型としての抗原（アポＮＣＳ）を提示した
後、遠心法および塩析法によりファージ粒子を濃縮し、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に再懸濁した。 Ｅ：パンニング 抗アポＮＣＳモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ用プレー
ト各ウェルに１mg/mlＰＢＳ溶液の濃度で固相化し、抗
体溶液を取り除いた後、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで各ウェル
をブロッキングし、上記のファージ粒子を反応させた。
各ウェルをＰＢＳで１０回洗浄した後、塩酸酸性にし、
ファージを回収した。回収したファージを大腸菌ＸＬ１
−Ｂlue細胞に感染させ、ファージディスプレーさせ、
濃縮・回収の後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に再懸濁し
た。これらのパンニング操作を５回以上行うことによ
り、抗アポＮＣＳモノクローナル抗体と反応するファー
ジを濃縮した。 Ｆ：目的遺伝子のクローン特定 ５回のパンニングを終了したファージを再び大腸菌ＸＬ
−Ｂlue細胞に感染させ、寒天プレート上にコロニーを
形成させ、そのうち５つのシグナルコロニーをランダム
に選択し、増殖させた後、培養液を２つに分け、一方か
らはプラスミドＤＮＡを回収した。また、他方には、培
養液中にＩＰＴＧを添加し、タンパク質を誘導後、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図２）と抗アポ
ＮＣＳモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット
法（図３）により目的タンパク質の生産を確認した。
【００２２】次いで、予想される分子量（２３ＫＤａ）
のタンパク質を発現し、かつ抗アポＮＣＳ抗体に反応す
るクローンについて、インサートＤＮＡの塩基配列を決
定した。すなわち、インサートＤＮＡをｐＧＥＭ３Ｚｆ
(+)のＢglIII／ＫpnＩ部位に挿入してサブクローニング
し、そのインサートＤＮＡの塩基配列を決定した。解析
の結果、クローンｐＮ７２が、目的のアポＮＣＳをコー
ドするアポＮＣＳ合成遺伝子（配列番号１）を保有して
いることが確認された。
のタンパク質を発現し、かつ抗アポＮＣＳ抗体に反応す
るクローンについて、インサートＤＮＡの塩基配列を決
定した。すなわち、インサートＤＮＡをｐＧＥＭ３Ｚｆ
(+)のＢglIII／ＫpnＩ部位に挿入してサブクローニング
し、そのインサートＤＮＡの塩基配列を決定した。解析
の結果、クローンｐＮ７２が、目的のアポＮＣＳをコー
ドするアポＮＣＳ合成遺伝子（配列番号１）を保有して
いることが確認された。
【００２３】この合成遺伝子（ｐＮ７２）は、その成熟
タンパク質コード領域（配列番号１の107−444）の塩基
が、公知の野生型アポＮＣＳ遺伝子（ncsapo3.dnaおよ
びncsA mat.DNA）とは表２に示したとおりに異なってい
る。
タンパク質コード領域（配列番号１の107−444）の塩基
が、公知の野生型アポＮＣＳ遺伝子（ncsapo3.dnaおよ
びncsA mat.DNA）とは表２に示したとおりに異なってい
る。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願に
よって、大腸菌で効率よく発現するアポＮＣＳ合成遺伝
子が提供される。これによって、ネオカルチノスタチン
の活性成分であるクロモホアを安定に保持するするがで
き、しかも組織特異性やクロモホア放出の制御等をも可
能とする改変型アポＮＣＳの作成が可能となる。
よって、大腸菌で効率よく発現するアポＮＣＳ合成遺伝
子が提供される。これによって、ネオカルチノスタチン
の活性成分であるクロモホアを安定に保持するするがで
き、しかも組織特異性やクロモホア放出の制御等をも可
能とする改変型アポＮＣＳの作成が可能となる。
【００２６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 科学技術振興事業団 <120> ネオカルチノスタチンのアポタンパク質合成遺伝子 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <221> CDS <222> (1)..(444) <221> mature part of apoNCS <222> (106)..(444) <400> 1 atg ggt ggc cga tta gca tca tcc gta atc gtg tgg cga aag tgg cgg 48 Met Gly Gly Arg Leu Ala Ser Ser Val Ile Val Trp Arg Lys Trp Arg 1 5 10 15 tgg gca gcg gcg gcg gtg ctg ggc ctg gcg gtg ggc ttt cag acc ccg 96 Trp Ala Ala Ala Ala Val Leu Gly Leu Ala Val Gly Phe Gln Thr Pro 20 25 30 gcg gtg gcg gcc gcg ccg acc gcg acg gtg acc ccg agc agc ggc ctg 144 Ala Val Ala Ala Ala Pro Thr Ala Thr Val Thr Pro Ser Ser Gly Leu 35 40 45 agc gat ggc acg gtg gtg aaa gtg gcg ggc gcg ggc ctg cag gcg ggc 192 Ser Asp Gly Thr Val Val Lys Val Ala Gly Ala Gly Leu Gln Ala Gly 50 55 60 acc gcg tat gat gtg ggc caa tgc gca tgg gtg gat acg ggc gtg ctg 240 Thr Ala Tyr Asp Val Gly Gln Cys Ala Trp Val Asp Thr Gly Val Leu 65 70 75 80 gca tgt aac ccg gcg gat ttt agc agc gtg acc gcg gat gcg aat ggc 288 Ala Cys Asn Pro Ala Asp Phe Ser Ser Val Thr Ala Asp Ala Asn Gly 85 90 95 agc gct agc acc agc ctg acg gtg cgc cgc agc ttt gaa ggc ttt ctg 336 Ser Ala Ser Thr Ser Leu Thr Val Arg Arg Ser Phe Glu Gly Phe Leu 100 105 110 ttt gat ggc acc cgc tgg ggc acg gtg gat tgc acg acg gcg gca tgc 384 Phe Asp Gly Thr Arg Trp Gly Thr Val Asp Cys Thr Thr Ala Ala Cys 115 120 125 cag gtg ggc ctg agc gat gcg gcg ggc aat ggc ccg gaa ggc gtg gcg 432 Gln Val Gly Leu Ser Asp Ala Ala Gly Asn Gly Pro Glu Gly Val Ala 130 135 140 atc agc ttt aac g 445 Ile Ser Phe Asn 145 <210> 2 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Gly Gly Arg Leu Ala Ser Ser Val Ile Val Trp Arg Lys Trp Arg 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala Ala Val Leu Gly Leu Ala Val Gly Phe Gln Thr Pro 20 25 30 Ala Val Ala Ala Ala Pro Thr Ala Thr Val Thr Pro Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Ser Asp Gly Thr Val Val Lys Val Ala Gly Ala Gly Leu Xaa Ala Gly 50 55 60 Thr Ala Tyr Asp Val Gly Gln Cys Ala Trp Val Asp Thr Gly Val Leu 65 70 75 80 Ala Cys Asn Pro Ala Asp Phe Ser Ser Val Thr Ala Asp Ala Asn Gly 85 90 95 Ser Ala Ser Thr Ser Leu Thr Val Arg Arg Ser Phe Glu Gly Phe Leu 100 105 110 Phe Asp Gly Thr Arg Trp Gly Thr Val Asp Cys Thr Thr Ala Ala Cys 115 120 125 Gln Val Gly Leu Ser Asp Ala Ala Gly Asn Gly Pro Glu Gly Val Ala 130 135 140 Ile Ser Phe Asn 145 <210> 3 <211> 464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: HindIII:(2)..(7) BglII:(10)..(15) NotI:(115)..(122) PstI:(193)..(198) NheI:(304)..(309) SphI:(391)..(396) KpnI:(457)..(462) <400> 3 caa gct tga aga tct atg gtg ccg aty agc aty aty cgy aay cgy gtg 48 Gln Ala Xaa Arg Ser Met Val Pro Ile Ser Ile Ile Arg Asn Arg Val 1 5 10 15 gcg aaa gtg gcg gtg ggc agc gcg gcg gtg ctg ggc ctg gcg gtg ggc 96 Ala Lys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Val Leu Gly Leu Ala Val Gly 20 25 30 ttt cag acs ccg gcg gtg gcg gcc gcg ccg acs gcg acs gtg acs ccg 144 Phe Gln Thr Pro Ala Val Ala Ala Ala Pro Thr Ala Thr Val Thr Pro 35 40 45 agc agc ggc ctg agc gat ggc acs gtg gtg aaa gtg gcg ggc gcg ggc 192 Ser Ser Gly Leu Ser Asp Gly Thr Val Val Lys Val Ala Gly Ala Gly 50 55 60 ctg cag gcg ggc acs gcg tat gat gtg ggc cag tgy gca tgg gtg gat 240 Leu Gln Ala Gly Thr Ala Tyr Asp Val Gly Gln Cys Ala Trp Val Asp 65 70 75 80 acs ggc gtg ctg gca tgy aay ccg gcg gat ttt agc agc gtg acs gcg 288 Thr Gly Val Leu Ala Cys Asn Pro Ala Asp Phe Ser Ser Val Thr Ala 85 90 95 gat gcg aay ggc agc gct agc acs agc ctg acs gtg cgy cgy agc ttt 336 Asp Ala Asn Gly Ser Ala Ser Thr Ser Leu Thr Val Arg Arg Ser Phe 100 105 110 gaa ggc ttt ctg ttt gat ggc acs cgy tgg ggc acs gtg gat tgy acs 384 Glu Gly Phe Leu Phe Asp Gly Thr Arg Trp Gly Thr Val Asp Cys Thr 115 120 125 acs gcg gca tgc cag gtg ggc ctg agc gat gcg gcg ggc aay ggc ccg 432 Thr Ala Ala Cys Gln Val Gly Leu Ser Asp Ala Ala Gly Asn Gly Pro 130 135 140 gaa ggc gtg gcg aty agc ttt aay ggt acc cc 464 Glu Gly Val Ala Ile Ser Phe Asn Gly Thr 145 <210> 4 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: BglII:(3)..(8) NotI:(108)..(115) <400> 4 gaagatctat ggtgccgaty agcatyatyc gyaaycgygt ggcgaaagtg gcggtgggca 60 gcgcggcggt gctgggcctg gcggtgggct ttcagacscc ggcggtggcg gccgcgccga 120 <210> 5 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: NotI:(11)..(18) PstI:(89)..(94) <400> 5 aaggaaaaaa gcggccgcgc cgacsgcgac sgtgacsccg agcagcggcc tgagcgatgg 60 cacsgtggtg aaagtggcgg gcgcgggcct gcaggcgggc ac 102 <210> 6 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: PstI:(5)..(10) NheI:(116)..(121) <400> 6 aaaactgcag gcgggcacsg cgtatgatgt gggccagtgy gcatgggtgg atacsggcgt 60 gctggcatgy aayccggcgg attttagcag cgtgacsgcg gatgcgaayg gcagcgctag 120 cac 123 <210> 7 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: NheI:(4)..(9) SphI:(91)..(96) <400> 7 ctagctagca ccagcctgac sgtgcgycgy agctttgaag gctttctgtt tgatggcacs 60 cgytggggca csgtggattg yacsacsgcg gcatgcca 98 <210> 8 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: SphI:(5)..(10) KpnI:(71)..(76) <400> 8 acatgcatgc caggtgggcc tgagcgatgc ggcgggcaay ggcccggaag gcgtggcgat 60 yagctttaay ggtacccc 78 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: HindIII:(4)..(9) BglII:(12)..(17) <400> 9 cccaagcttg aagatctatg gtgc 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: KpnI:(3)..(8) NotI:(14)..(21) <400> 10 ggggtacctc ggcgcggccg cca 23 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme site: NotI:(11)..(15) <400> 11 aaggaaaaaa gcggc 15 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: KpnI:(3)..(8) PstI:(17)..(19) <400> 12 ggggtaccgt gcccgcctg 19 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme site: PstI:(5)..(10) <400> 13 aaaactgcag gcggg 15 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: KpnI:(3)..(8) NheI:(11)..(16) <400> 14 ggggtaccgt gctagcgctg cc 22 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme site: NheI:(4)..(9) <400> 15 ctagctagca ccagcc 16 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sites: KpnI:(3)..(8) SphI:(11)..(16) <400> 16 ggggtacctg gcatgccgc 19 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sits: SphI:(5)..(10) <400> 17 acatgcatgc caggt 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme sits: KpnI:(3)..(8) <400> 18 ggggtaccgt taaag 15
【図１】オリゴヌクレオチドＮ-Ｉ〜ＶのＰＣＲ産物の
ゲル電気泳動の結果である。
ゲル電気泳動の結果である。
【図２】濃縮したファージ粒子の発現するタンパク質の
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であ
る。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であ
る。
【図３】濃縮したファージ粒子の発現するタンパク質
の、抗アポＮＣＳモノクローナル抗体を用いたウェスタ
ンブロット分析の結果である。
の、抗アポＮＣＳモノクローナル抗体を用いたウェスタ
ンブロット分析の結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA03 CA05 DA06 DA08 EA04 GA25 4B064 AG01 AG26 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA50X AA50Y AA90X AB01 AC14 BA24 CA24 CA44 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA11 DA75 EA28 FA72 FA74
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号１の塩基配列を有するネオカル
チノスタチン・アポタンパク質合成遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号１の塩基配列における１以上の
塩基を欠失、置換もしくは付加した塩基配列からなるネ
オカルチノスタチン・アポタンパク質改変遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１記載の合成遺伝子の発現産物で
あって、配列番号２のアミノ酸配列を有するネオカルチ
ノスタチン・アポタンパク質。 - 【請求項４】 請求項２記載の改変遺伝子の発現産物で
あって、配列番号２にアミノ酸配列における１以上のア
ミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列からなるネオカルチノスタチン・改変アポタンパク
質。 - 【請求項５】 配列番号２の一部配列からなるペプチ
ド。 - 【請求項６】 請求項３または４のアポタンパク質、も
しくは請求項５のペプチドを抗原として作成された抗
体。 - 【請求項７】 大腸菌で発現するネオカルチノスタチン
・アポタンパク質合成遺伝子の作成方法であって、(a)
放線菌ゲノムのネオカルチノスタチン・アポタンパク質
遺伝子の配列と大腸菌のコドンデータに基づき、大腸菌
で発現可能なタンパク質をコードするＤＮＡ配列をデザ
インし、このＤＮＡ配列を複数の断片としとして化学合
成し、(b) 各ＤＮＡ断片を各々ＰＣＲ増幅し、(c) 各Ｐ
ＣＲ産物を連結したＤＮＡライブラリーを作成し、(d)
このＤＮＡライブラリーを挿入したファジェミドベクタ
ーを導入した大腸菌にヘルパーファージを感染させた
後、抗原としてのネオカルチノスタチン・アポタンパク
質を提示してファージディスプレイを行い、(e) 抗ネオ
カルチノスタチン・アポタンパク質抗体に反応するファ
ージ粒子の選択と、この粒子へのファージディスプレイ
を複数回繰り返して抗体反応性粒子を濃縮し、(f) 濃縮
したファージ粒子から回収したベクターのインサートＤ
ＮＡを単離することを特徴とするネオカルチノスタチン
・アポタンパク質合成遺伝子の作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10358029A JP2000175687A (ja) | 1998-12-16 | 1998-12-16 | ネオカルチノスタチン・アポタンパク質合成遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10358029A JP2000175687A (ja) | 1998-12-16 | 1998-12-16 | ネオカルチノスタチン・アポタンパク質合成遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000175687A true JP2000175687A (ja) | 2000-06-27 |
Family
ID=18457179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10358029A Pending JP2000175687A (ja) | 1998-12-16 | 1998-12-16 | ネオカルチノスタチン・アポタンパク質合成遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000175687A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004504847A (ja) * | 2000-07-27 | 2004-02-19 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 原核宿主細胞における組換えタンパク質の生産 |
-
1998
- 1998-12-16 JP JP10358029A patent/JP2000175687A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004504847A (ja) * | 2000-07-27 | 2004-02-19 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 原核宿主細胞における組換えタンパク質の生産 |
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